DK154435B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af dipeptider, der er l-alanyl-d-glutaminsyre-derivater eller salte deraf - Google Patents

Description

o

DK 154435 B

Den foreliggende opfindelse angår en analogi-fremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte dipeptider, der er L-alanyl-D-glutaminsyre-derivater med den almene formel I 5 R-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO- R1 /T, I I i (I)

CH3 CH2CH2 “ C0 R

10 hvori R betyder en alkylgruppe med 1-19 carbonatomer, der eventuelt er substitueret med en hydroxy-, phenyl- eller cyclohexylgruppe, eller en alkenylgruppe med 2-19 carbonatomer, og symbolerne R^, der kan være ens eller forskellige, betyder en hydroxygruppe eller aminogruppe eller en alkyl-15 oxygruppe med 1-4 carbonatomer, der eventuelt er substi tueret med en phenylgruppe, idet alaninet foreligger i L-form og glutaminsyren og dens derivater foreligger i D-form, eller farmaceutisk acceptable metalsalte deraf eller farmaceutisk acceptable additionssalte deraf med 20 nitrogenholdige baser, og fremgangsmåden er ejendommelig ved det i kravets kendetegnende del anførte.

Bakteriecellevægge, f.eks. mycobakteriecellevægge, består hovedsagelig af et af N-acetylmuraminsyre dannet peptido-25 glycan, til hvilket der er fikseret peptider indeholdende kæden L-Ala-D-Glu-Dap (DAP = 2,6-diaminopimelinsyre). Bakterievæggene er desuden meget rige på lipider, hvoraf visse er frie og eks-traherbare og andre er forbundet med vægstrukturen og består af mycolsyrer (langkædede, a-forgrenede og β-hydroxylerede fedt-30 syrer). De forskellige bestanddele i cellevæggen danner en covalent struktur bestående af et peptidoglucan og et arabinogalactanmycolat, der er forbundet med hinanden ved phosphordiesterbindinger. Disse bakteriecellevægge udviser størstedelen af de hele cellers biologiske egenskaber, når 35 de forenes med en uorganisk eller vegetabilsk olie og indgives suspenderet i en fysiologisk jspløsning.

2

O

DK 154435B

I belgisk patentskrift nr. 821 385, 852 348 og 852 349 beskrives peptider koblet med N-acetylmuraminsyre, hvilke peptider indeholder kæden L- Ala-D-Glu eller L-Ser-D~Glu og er virksomme som immunologiske adjuvanser og som anti-5 infektionsmidler.

I fransk patentskrift nr. 2 320 107, beskrives

produkter fremstillet ved kobling mellem en fedtsyre og et heptapeptidsacharid isoleret fra en mycobakterie indeholdende en voks "D". Disse produkter kan gengives 10 ved følgende formel II

NAG - NAM------NAG - NAM

I *

Ala Ala

Glu Glu (R COOH) (II) I I n

15 DAP ^--DAP

Ala-—-- J * hvori NAG betyder N-acetylglucosamin, NAM betyder N-acetyl- ’ muraminsyre, DAP betyder 2,6-diaminopimelinsyre, og R 20 betyder en alkylgruppe med 9-17 carbonatomer.

Disse produkter er immunologiske adjuvanser for produktion af antistoffer og forsinket hypersensitibilitet og de kan virke alene, dvs. uden at det er nødvendigt at indgive dem i en olieopløsning.

Alle disse produkter er karakteristiske ved nærværelsen af N-acetylmuraminsyre, der ifølge Kasumoto et al., Tetrahedron Letters, 49_r 4899 (1978) anses at have forbindelse med immunologisk aktivitet.

Det har nu vist sig, at peptiderne med formlen I trods fraværelsen af N-acetylmuraminsyre udviser bemærkelsesværdige adjuvansegenskaber og immunostimulerende egenskaber. Forbindelserne med formlen I, der er veldefinerede kan desuden let fremstilles med en sådan renhedsgrad, som kræves til terapeutisk anvendelse.

35

O

3

DK 154435 B

Ved fremgangsmådevariant a) ifølge opfindelsen fremstilles de her omhandlede dipeptider med formlen I ved, at en syre med den almene formel III

R - COOH (III)

5 hvori R har den ovenfor angivne betydning, eller et aktiveret derivat af denne syre, omsættes med et dipeptid med den almene formel IV

H9N - CH - CO - NH - CH - CO - R1 10 | J (IV) CH3 CH2CH2 - CO - R1 15 hvori symbolerne R^· har de ovenfor angivne betydninger, hvorefter man om nødvendigt erstatter gruppen eller • o grupperne Rx med en hydroxy- eller aminogruppe.

Når i formlen IV symbolerne R"*" der kan være ens eller forskellige betyder en aminogruppe eller en alkyloxy-20 gruppe, der eventuelt er substitueret med en phenylgruppe, kan omsætningen mellem syren med formlen III og dipeptidet med formlen IV gennemføres i nærværelse af et kondensationsmiddel, såsom dicyclohexylcarb'odiimid, i et organisk opløsningsmiddel, såsom methylenchlorid eller dimethyl-25 formamid, og ved en temperatur mellem -10 og +30°C.

Når i formlen IV begge symboler R^ betyder en hy-droxygruppe, eller et af symbolerne R^ betyder en hydroxy-gruppe, og det andet betyder en aminogruppe eller en alkyl-oxigruppe som defineret ovenfor, er det nødvendigt at ak- qn tivere syren med formlen III, inden den omsættes med dipeptidet med formlen IV.

Som aktiveret syre er det særligt fordelagtigt at anvende et syrehalogenid eller et blandet anhydrid, der sædvanligvis fremstilles in situ ved, at en syre med 35 formlen III i nærværelse af en base omsættes med et alkylhalogenformiat, fortrinsvis isobutylchlorformiat.

DK 154435B

4

O

Når man anvender syren med formlen III i form af et halogenid, især chloridet, gennemføres reaktionen i et organisk opløsningsmiddel, såsom diethylether eller methylenchlorid, i nærværelse af en base (enten en uorganisk 5 base, såsom natriumhydroxid, eller en organisk base, såsom triethylamin) ved en temperatur mellem 0 og 30°C. Di-peptidet med formlen IV anvendes sædvanligvis i form af et salt, såsom hydrochloridet.

Når man anvender syren med formlen III i form af 10 et blandet anhydrid, gennemføres omsætningen i et organisk opløsningsmiddel, såsom dioxan, tetrahydrofuran, chloroform, toluen eller dimethylformamid, eller i et vandholdigt organisk medium, i nærværelse af en base (enten en uorgaisk base, såsom natriumhydroxid, eller en organisk base, 15 såsom triethylamin) ved en temperatur mellem -10 og +30°C. Dipeptidet med formlen IV anvendes sædvanligvis i form af et salt, såsom hydrochloridet.

De her omhandlede dipeptider med formlen I, hvori symbolerne R1, der kan være ens eller forskellige, 20 betyder en hydroxygruppe, eller en aminogruppe, kan fremstilles ud fra et dipeptid med formlen I, hvori et af symbolerne R betyder en hydroxygruppe, en aminogruppe eller en alkyloxygruppe, og det andet betyder en hydroxygruppe eller en alkyloxygruppe, idet det anvendes sædvanlige 25 metoder enten til omdannelse af en estergruppe til en carboxygruppe eller en carbamoylgruppe eller til omdannelse af en carboxygruppe til en carbamoylgruppe.

Omdannelsen af en estergruppe til en carboxygruppe kan sædvanligvis gennemføres ved forsæbning under 30 milde betingelser eller ved hydrogenolyse, især når mindst ét af symbolerne R^ betyder en benzyloxygruppet Når man gennemfører en hydrogenolyse ved hjælp af hydrogen, gennemføres omsætningen sædvanligvis i et egnet organisk opløsningsmiddel, såsom eddikesyre 35 (eventuelt i blanding med et andet organisk opløsningsmiddel, såsom methanol), eller i et vandholdigt organisk medium, i nærværelse af en katalysator, såsom palladium,

O

DK 154435 B

5 f.eks. palladium på carbon, ved en temperatur nær 20°C og ved et tryk nær 760 mm Hg.

Omdannelsen af en estergruppe eller en carboxy-gruppe til en carbamoylgruppe gennemføres sædvanligvis ved 5 hjælp af vandfri ammoniak opløst i et organisk opløsningsmiddel. Når ammoniak omsættes med en forbindelse med formlen I, hvori mindst ét af symbolerne R^ betyder en alkyloxygruppe, gennemføres omsætningen hensigtsmæssigt i methanol. Når man omsætter ammoniak med en forbindelse 10 med formlen I, hvori mindst ét af symbolerne betyder en hydroxygruppe, er det nødvendigt i forvejen at aktivere syregruppen eller syregrupperne, sædvanligvis i form af et blandet anhydrid fremstillet in situ ved hjælp af et alkylhalogenformiat, såsom isobutylchlorformiat, hvorefter 15 omsætningen gennemføres under de betingelser, der er angivet ovenfor for omsætning af et blandet anhydrid af syren med formlen III med et dipeptid med formlen IV.

Dipeptidet med formlen IV kan fremstilles ifølge kendte metoder, hvorved L-alanin, hvis aminogruppe er 20 beskyttet,kondenseres med D-gLutaminsyre, hvis syregrupper eventuelt er beskyttede, hvorefter beskyttelsesgruppen f©r aminogruppen fjernes.

Ved fremgangsmådevariant b) ifølge opfindelsen fremstilles de her omhandlede dipeptider med formlen I ved,

25 at et derivat af L-alanin med den almene formel V

R - CO - NH - CH - COOH (V) in3

30 hvori R har den ovenfor angivne betydning, eller af et aktiveret derivat af denne syre, omsættes med et derivat af D-glutaminsyre med den almene formel VI

35

O

DK 154435 B

6 ELN - CH - CO - R1 2 j (VI) CH2CH2 - CO - R1 5 hvori symbolerne R^, som kan være ens eller forskellige, har den ovenfor angivne betydning, hvorefter man om nødvendigt erstatter gruppen eller grupperne R^ me(j hydro-xygruppe eller en aminogruppe.

10 _ Det er særligt hensigtsmæssigt at aktivere syre gruppen i L-alaninderivatet med formlen V, sædvanligvis i form af ét blandet anhydrid fremstillet in situ før omsætningen med forbindelsen med formlen VI, især hvis mindst ét af symbolerne R^ betyder en hydroxygruppe. Når 15 syregrupperne i D-glutaminsyrederivatet med formlen VI er beskyttede, dvs. når symbolerne r\ der kan være ens eller forskellige, betyder en amino- eller alkyloxygruppe, kan omsætningen mellem syren med formlen V og D-glutaminsyrederivatet med formlen VI gennemføres i nærværelse af 20 et kondensationsmiddel, såsom dicyclohexylcarbodiimid.

Omsætningen mellem L-alaninderivatet med formlen V og D-glutaminsyrederivatet med formlen VI gennemføres sædvanligvis under de betingelser, der er angivet ovenfor for omsætningen af syren med formlen III med aminosyren med formlen IV.

L-alaninderivatet med formlen V kan fremstilles ved, at en syre med formlen III, eller et aktiveret derivat af denne syre, omsættes med L-alanin, hvis syregruppe eventuelt er beskyttet i form af en ester, hvorefter 30 beskyttelsesgruppen for syregruppen eventuelt fjernes.

Når syregruppen i L-alanin er beskyttet, fremstilles syren med formlen V sædvanligvis i nærværelse af et kondensationsmiddel, såsom dicyclohexylcarbodiimid, og omsætningen gennemføres i et organisk opløsningsmiddel, såsom methylen-

OO

chlorid eller dimethylformamid, ved en temperatur mellem -10 og + 30°C.

O

DK 154435B

7 Når syregruppen i L-alanin er fri, er det nødvendigt at aktivere syren med formlen III før omsætningen med L--alanin. Som aktiveret derivat af syren med formlen III er det særligt hensigtsmæssigt at anvende et syrehalogenid 5 eller et blandet anhydrid. Omsætningen gennemføres under de betingelser, der er angivet ovenfor for omsætning af en syre med formlen III med et dipeptid med formlen IV.

Ved fremgangsmådevariant c) ifølge opfindelsen fremstilles de her omhandlede forbindelser med formlen I, 10 når mindst et af symbolerne r\ der kan være ens eller forskellige, betyder en hydroxygruppe, ved, at man til en egnet bærer valgt blandt chlormethylerede eller hydroxymethylerede copolymere af styren og divinylbenzen binder a- eller γ-carboxylgruppen i glutaminsyre, hvis 15 aminogruppe er beskyttet, og hvis γ- eller a-carboxyl- gruppe, der ikke skal bindes til bæreren, er beskyttet i form af et amid eller en ester, fjerner beskyttelsesgruppen for aminogruppen, kondenserer L-alanin, hvis aminogruppe er beskyttet, med bærer-D-glutaminsyren, hvorefter 20 beskyttelsesgruppen for aminogruppen i L-alanylgruppen fjernes, og kondenserer fedtsyren til dipeptid-bæreren, spalter dipeptid-bærer-bindingen og om nødvendigt fjerner beskyttelsesgruppen for syregruppen i D-glutaminsyren.

Som bærer anvendes fortrinsvis chlormethylerede copolymere 25 af styren og divinylbenzen (98:2 eller 99:1).

Fikseringen af den på hensigtsmæssig måde beskyttede D-glutaminsyre på den chlormethylerede bærer gennemføres ifølge sædvanlige metoder, idet aminosyren opløst i et organisk opløsningsmiddel, såsom ethanol, om-30 sættes med polymeren i nærværelse af en organisk base, såsom triethylamin. Det er særligt fordelagtigt at opvarme reaktionsblandingen til en temperatur nærhopløsningsmidlets kogepunkt.

Beskyttelsesgruppen for aminogruppen og den even-35 tuelle beskyttelsesgruppe for en af syregrupperne i D- -glutaminsyren bør vælges på en sådan måde, at beskyttel- o

DK 154435 B

δ sesgruppen for aminogruppen kan fjernes uden påvirkning af bindingen mellem aminosyren og bæreren, og uden at beskyttelsesgruppen for syregruppen fjernes.

Den syregruppe i D-glutaminsyren, der skal· be-5 skyttes, foreligger sædvanligvis i form af en benzylester, og denne estergruppe fjernes i surt medium ved hjælp af f.eks. en vandfri blanding af hydrogenbromidsyre og tri-fluoreddikesyre. Beskyttelsesgruppen for aminogruppen er sædvanligvis tert.butoxycarbonyl, og denne beskyttelses-10 gruppe fjernes f.eks. ved hjælp af en blanding af trifluor-eddikesyre og methylenchlorid.

L-alanin, hvis aminogruppe er beskyttet, fortrinsvis med en tert. butoxvcarbonylgruppe, omsættes med den på bæreren fikserede D-glutaminsyre ifølge metoder, 15 der sædvanligvis anvendes indenfor peptidkemien.

Omsætningen gennemføres sædvanligvis i nærværelse af et kondensationsmiddel, såsom dicyclohexylcarbodiimid, i et organisk opløsningsmiddel, såsom methylenchlorid.

2Q Fjernelsen af beskyttelsesgruppen for aminogruppen i L-alanylgruppen gennemføres under de betingelser, der er angivet ovenfor for fjernelsen af beskyttelsesgruppen for aminogruppen.i D-glutaminsyren.

Fedtsyren R-COOH omsættes med det således frem-25 komne, på bæreren fikserede dipeptid ifølge sædvanlige metoder, især ifølge den metode, der er beskrevet ovenfor for kondensation af Ir-alanin med den på bæreren fikserede D-glutaminsyre.

Spaltningen af bindingen mellem D-glutaminsyren 30 og bæreren, hvilken binding er af benzylestertypen, og den eventuelle fjernelse af beskyttelsesgruppen for carboxylgruppen i D-glutaminsyren gennemføres sædvanligvis samtidigt. Der anvendes fortrinsvis en vandfri blanding af hydrogenbromidsyre og trifluoreddikesyre.

35 Den fremstillede forbindelse med formlen I

udvindes fra reaktionsblandingen ifølge sædvanlige metoder. Bæreren fraskilles ved filtrering og dipeptidet med

DK 154435B

9

O

formlen I isoleres efter koncentrering af filtratet til tørhed. Dipeptidet kan derefter renses ved fysisk-kemiske metoder.

De her omhandlede dipeptider med formlen I 5 kan eventuelt renses ifølge fysiske metoder, såsom krystallisation eller chromatografering.

De her omhandlede forbindelser kan omdannes til farmaceutisk acceptable metalsalte eller til farmaceutisk acceptable additionssalte med nitrogenholdige baser af-10 hængigt af naturen af substituenten R^.

Metalsaltene og additionssaltene med nitrogenholdige baser kan fremstilles ved, at de omhandlede forbindelser omsættes med baser i et egnet opløsningsmiddel. Sædvanligvis opløses forbindelsen i vand ved tilsætning 15 af den teoretiske mængde base, hvorefter den fremkomne opløsning frysetørres.

De her omhandlede forbindelser med formlen I er adjuvanser og immunitetsstimulerende stoffer. De forøger overfølsomhedsreaktionerne og/eller produktionen af cir- 20 kulerende antistoffer mod de antigener, som de er indgivet sammen med, og de stimulerer på ikke-specifik måde forsvarsreaktionerne mod visse infektioner (f.eks. infektion hos mus med den intracellulære bakterie Listeria monocytogenes) .

25

In vitro er de aktive i molære koncentrationer _3 på mellem 10 og 10 jj, især ved følgende forsøg: 30 35 o 10

DK 154435 B

- stimulering af syntesen af DNA (mitogen evne) ved metoden ifølge G. Marchal, Ann. Immunol. (Inst.

Pasteur), 125 C, 519 (1974), - stimulering af allogen reaktion (histo- 5 -uforenelighedsreaktion) ved metoden ifølge R.W. Dutton, J. exp. Med., 122, 759 (1966) og A.B. Peck og F.H.

Bach, J. Immunol. Methods, 3, 147 (1973), - stimulering af produktionen af antistoffer ved metoden ifølge P.H. Klesius, Proc. Soc. Biol. Med. (N.Y.) 10 135, 155 (1970) og H. van Dijk og N. Bloksma, J. Immunol.

Methods, 14, 325 (1977), - forøgelse af antallet af phagocytære macrophager ved metoden ifølge J. Michl et al. r j. exp. Med., 144, 1465 (1976) 15 - stimulering af aktiviteten af sur phosphatase og N-acetylglucosamindinase (lysosom-enzymer hos macrophager) uden en forøgelse af lactatdehydrogenase ved metoden ifølge P. Davies et at., J. exp. Med., 139, 1262 (1974).

In vivo udviser de omhandlede forbindelser følgende • 20 egenskaber:

Ved indgivelse til mus forøger de i doser mellem 1 °ζΓ 30 mg/kg den forsinkede hypersensibilitet og produktionen af antistoffer, især ved metoden ifølge T.E.

Miller et al., J. Nath. Cancer Inst., 51, 1669 (1973).

25 Hos marsvin forøger de hypersensibilitetsreaktionen og produktionen af antistoffer mod okse-gammaglobolin koblet med naptenet dinitrophenol ved metoden ifølge F. Floc'h et al., Immunol. Communic., ]_, 41 (1978).

Hos mus stimulerer de forsvarsreaktionerne mod 30 infektion med Listeria monocyctogenes i doser mellem 1 og 100 kg/kg ved metoden ifølge R.M. Fauve og B. Hevin, C.R. Acad. Sci. (D), 285, 1589 (1977).

Hos mus stimulerer de det reticulo-endotheliale systems evne til fjernelse af kolloidt carbon ved metoden 35 ifølge B.N. Halpern et al., Ann. Institut Pasteur, 80, 582 (1951).

o

DK 154435B

11 ν·.ι4Λ

Hos kaniner stimulerer de i doser på mellem 0,1 og 3 mg/kg dannelsen af serum-antistoffer mod influenzavirus ved metoden ifølge G.H. Werner et al., Biomedicine, 22, 440 (1975).

5 Af ganske særlig interesse er de forbindelser med formlen I, hvori symbolerne R1, der kan være ens eller forskellige, betyder en hydroxygruppe, en aminogruppe eller en benzyloxygruppe, og hvori symbolet R betyder en alkyl-eller alkenylgruppe med 7-19 carbonatomer.

40 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres ved de følgende eksempler.

De fremstillede forbindelser kan danne komplekser med alkalimetaller og jordalkalimetaller. Som følge heraf kan de opnåede elementæranalyseværdier for de frem-15 stillede forbindelser adskille sig betydeligt fra de teoretiske værdier. Forbindelsernes struktur er imidlertid bekræftet ved hjælp af forholdet C/N, der stemmer overens med det teoretiske forhold, ved hjælp af indholdet af aminosyrer og ved hjælp af homogeniteten ved tyndtlagschromatografi 20 på silicagel.

Eksempel· 1.

Til en opløsning af 12,75 g O^-benzyl-L-alanyl-a-D- 3 -glutamat-hydrochlorid i 75 cm IN natriumhydroxidop-25 løsning sættes samtidig i løbet af 37 minutter dels én op- 3 løsning af 8 g lauroylchlorid i 75 cm ether og dels 3 37,4 cm IN natriumhydroxidopløsning, idet reaktionsblandingens pH-værdi holdes mellem 8 og 9. Reaktionsblandingen omrøres derefter i 1 time og 20 minutter. Efter 30 dekantering gøres vandfase sur til en pH-værdi på 2 ved 3 tilsætning af 60 cm IN saltsyre, hvorefter den ekstraheres 3 tre gange med ialt 300 cm ethylacetat. De forenede organiske 3 ekstrakter vaskes med 25 cm vand, tørres over vandfrit natriumsulfat og koncentreres til tørhed under formindsket 35 tryk (20 mm Hg) ved 45°C. Der fås herved 7,4 g af et hvidt fast stof, der chromatograferes på 80 g neutralt

DK 154435 B

12

O

silicagel i en søjle med en diameter på 2 cm. Der elueres 3 først med 100 cm af en blanding af ethylenacetat og 3 methanol i volumenforholdet 8:2 og derefter med 200 cm af en blanding af ethylacetat og methanol i volumenforholdet 5 1:1 og opsamles fraktioner med et volumen på 50 cm^. Frak tionen 1 koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 45°C. Der fås herved 2 g benzyl-N-lauroyl--L-alanyl-a-D-glutamat med et smeltepunkt på 130°C.

Fraktionerne 2-4 koncentreres til tørhed, og den herved 10 fremkomne remanens chromatograferes på 100 g neutralt silicagel (0,063-0,20 mm) i en søjle med en diameter på 3 2 cm. Der elueres med 250 cm acetone og opsamles fraktioner 3.

med et volumen på 25 cm . Fraktionerne 1 og 2 koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 45°C. Der 15 fås herved 4,07 g o^.-benzyl-L-lauroyl-L-alanyl-a-D-glutamat med et smeltepunkt på 130°C.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,9 ved tyndt-lagschromatografi på silicagel under anvendelse af en ; blanding af n-butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumen-20 forholdet 50:20:6:24 som elueringsmiddel.

Analyse: Beregnet, %: C = 66,10, H = 8,63, N = 5,71

Fundet, %: C = 66,3, H = 8,8, N = 5,6 25 0^-Benzyl-L-;alariyl-a-D-glutamat-hydrochlorid kan fremstilles på følgende måde.

97,16 g o1-benzyl-N-tert.-butyloxycarbonyl-L-

-alanyl-D-glutamat opløses i 970 cm af en vandfri 1,7 N

opløsning af hydrogenchlorid i eddikesyre. Reaktions- 30 blandingen omrøres i 2 timer, hvorefter man hurtigt tilsætter 3,8 liter vandfri ether og lader deh fremkomne blanding henstå ved 0°C i to timer. Det dannede olieagtige bundfald skilles fra den ovenstående væske ved dekantering og 3 opløses i 500 cm acetone. Den herved fremkomne opløsning 35 koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Herved fås 88,9 g benzyl-L-alanyl-a-D-glutamat--hydrochlorid.

V

O

DK 154435 B

13

Benzyl-N-tert.butyloxycarbonyl-L-alanyl-a-D--glutamat kan fremstilles ifølge metoden, der beskrives af E. Bricas et al., Biochemistry 9, 823 (1970).

5 Eksempel 2.

3 31 cm isobutylchlorformiat sættes til en opløsning 3 af 47,75 g laurinsyre i 3 liter dioxan og 33,3 cm tri- ethylamin, hvilken opløsning holdes ved en temperatur nær 10°C. Reaktionsblandingen omrøres i 20 minutter ved 10 10°C, hvorefter der i løbet af 10 minutter tilsættes en til 10°C afkølet opløsning af 88,95 g O^-benzyl-L-alanyl- -a-D-glutamat-hydrochlorid i en blanding af 1 liter dioxan, 3 3 476 cm vand og 476 cm IN natriumhydroxidopløsning. Reaktionsblandingen omrøres i en time ved 10°C og derefter i 15 18 timer ved en temperatur nær 20°C. Reaktionsblandingen fortyndes derefter ved tilsætning af 4 liter vand, gøres 3 sur til en pH-værdi på 2 ved tilsætning af ca. 475 cm IN saltsyre og holdes i 2 timer ved 0°C. Det dannede 3 bundfald fraskilles ved filtrering, vaskes med 500 cm

O

20 vand og med 500 cm ether og tørres under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 20°C. Det fremkomne produkt suspenderes 3 i 800 cm ether, omrøres i 1 time, fraskilles ved fil- 3 trering og vaskes to gange med ialt 200 cm ether. Efter tørring under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 20°C fås 25 71,79 g 01-benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-a-D-glutamat med et smeltepunkt på 130 C.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,77 ved tyndtlags-chromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding af ethylacetat og methanol i volumenforholdet 4:1 som 30 elueringsmiddel.

Eksempel 3.

3

En opløsning af 5,49 g lauroylchlorid i 150 cm methylenchlorid sættes dråfeevis i løbet af 30 minutter 35 til en til 5°C afkølet blanding af 8,46 g benzyl-L- 3 -alanyl-D-glutammat-hydrochlorid, 300 cm methylenchlorid 3 14

DK 154435 B

O

og 300 cm triethylamin. Reaktionsblandingen omrøres i 2 timer og 15 minutter ved ca. 20°C, hvorefter den ekstra- 3 heres tre gange med ialt 1500 cm vand. Den organiske fase 3 koncentreres til et volumen på ca. 100 cm under formindsket 5 tryk (20 mm Hg) ved 40°C. Det i koncentratet dannede bundfald fraskilles ved filtrering og tørres. Der fås herved 5,3 g af et hvidt pulver, der forenes med 0,8 g af et produkt, der er fremstillet under de samme betingelser. Den 3 fremkomne blanding opløses i 100 cm kogende methanol, og 10 den fremkomne opløsning henstilles ved 0°C i 3 timer. De dannede krystaller fraskilles ved filtrering og tørres under formindsket tryk (0,2 mm Hg) ved 50 C. Der fås herved 4,64 g benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-D-glutaminat med et smeltepunkt på 182°C.

15 Produktet giver en Rf-værdi på 0,80 ved tyndt- lagschromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding af lige volumendele ethylacetat og methanol som eluerings-middel.

20 Analyse: Beregnet, %: C - 66,23, H = 8,85, N = 8,58 Fundet, %: C = 66,1, H=8,8, N = 8,4

Benzyl-L-alanyl-D-glutaminat-hydrochlor.id kan fremstilles på følgende måde.

25 5,2 g benzyl'-N-tert.butyloxycarbonyl-L-alanyl- 3 -D- glutamxnat opløses i 60. cm af en vandfri 1,7 N op- ή løsning af hydrogenchlorid i eddikesyre. Efter omrøring 3 i 1 time udhældes reaktionsblandingen i 300 cm ether. Etherfasen dekanteres. Til det tilbageværende gummiagtige 30 stof sættes 1 liter ether. Efter udrivning dekanteres ether-fasen på ny, og remanensen optages i 200 cm methanol.

Den fremkomne opløsning koncentreres til tørhed under formindsket tryk (først 20 mm Hg og derefter 0,2 mm Hg) ved 50°C. Der fås herved 4,3 g benzyl-L-alanyl-D-glutaminat-35 -hydrochlorid i form af et marengslignende produkt.

15

O

DK 154435 B

Benzyl-N-tert.butyloxycarbonyl-L-alanyl-D-glutaminat kan fremstilles ifølge metoden der beskrives af S. Kusumoto et al., Bull. Chem. Soc. Japan, 49_, 533 (1976).

6 Eksempel 4.

3,7 g benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-D-glutamdnat opløses 3 i en blanding af 1 liter methanol, 400 cm eddikesyre og 3 40 cm vand. Efter tilsætning af 3,7 g palladium på carbon (3% palladium) ledes en langsom hydrogengasstrøm 10 gennem reaktionsblandingen i 2 timer. Derefter filtreres reaktionsblandingen, og filtratet fortyndes ved tilsætning af 3 liter vand. Det uopløselige stof fraskilles ved filtrering og tørres under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Der fås herved 2,3 g N-lauroyl-L-alanyl-D-glutamin 15 med et smeltepunkt på 170-172°C.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,83 ved tyndtlags-chromatografi på silicagel under anvendelse af methanol som elueringsmiddel.

20 Analyse: Beregnet, %: C = 60,12, H = 9,33, N = 10,52 Fundet, %: C = 60,1, H = 8,8, N = 10,5

Eksempel 5.

500 mg 01-benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-a**D-glutamat op- 3 25 løses i 25 cm af en blanding af methanol, eddikesyre og vand i volumenforholdet 25:1:1. Efter tilsætning af 500 mg palladium på carbon (3% palladium) ledes en langsom hydrogengasstrøm gennem reaktionsblandingen i 2 timer. Reaktionsblandingen filtreres derefter, og filtratet koncentreres 30 til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 45°C. Der fås herved 460 mg af et flødehvidt fast stof, til hvilket der sættes 690 mg produkt fremstillet på samme måde.

3

Blandingen opløses i 10 cm kogende methanol, og til den 3 herved fremkomne opløsning sættes 5 cm vand. Efter 20 35 timers henstand ved ca. 20°C fraskilles de dannede hvide krystaller ved filtrering, hvorefter de .vaskes med

O

3 16

DK 154435 B

5 cm af en blanding af ethanol og vand i volumenforholdet 2:1 og tørres under formindsket tryk (0,2 mm Hg) ved 50°C. Der fås herved 770 mg N-lauroyl-L-alanyl-D-glutamin-syre med et smeltepunkt på 138-142°C.

5 Produktet giver en Rf-værdi på 0,61 ved tyndt- lagschromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding af N-butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet 50:20:6:24 som elueringsmiddel.

10 Analyse: Beregnet, %: C = 59,98, H = 9,06, N = 6,99, O = 23,97

Fundet, %: C = 59,7, H = 9,0, N = 7,3, O = 24,1

Eksempel 6.

2,54 cm^ isobutylchlorformiat sættes til en til 0°C

3 15 afkølet opløsning af 3,9 g laurinsyre i 156 cm vandfri 3 toluen og 2,7 cm tnethylamin. Reaktionsblandingen omrøres

i 20 minutter ved 0°C, hvorefter der tilsættes en til 0°C

afkølet opløsning af 6,7 g benzyl-L-alanyl-D-isoglutaminat- 3 3 -hydrochlorid i 52 cm vand og 2,7 cm triethylamin. Reak- 20 tionsblandingen omrøres i 65 timer ved en temperatur nær 20°C. Der fås herved en reaktionsmasse med et gelatineagtigt 3 udseende, til hvilken der sættes 150 cm ethylacetat. Det 3 dannede bundfald fraskilles ved- filtrering, ^vaskes med 30 cm vand og tørres. Der fås herved 7,6 g benzyl-L-lauroyl-L-25 -alanyl-D-isoglutaminat i form'af. e.t. .hvidt’pulver. Vandfasen fra det ovennævnte filtrat ekstraheres to gange med ialt 3 100 cm ethylacetat. Den fremkomne ethylacetatfase forenes med filtratets organiske fase, hvorefter de forenede 3 organiske faser vaskes med 125 cm 0,1N saltsyre og med 3 30 120 cm vand, tørres over magnesiumsulfat og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C.

Der fås herved yderligere 1,5 g benzyl-N-lauroyl-L-alanyl- -D-isoglutaminat. Produktet (7,6 g + 1,5 g) omkrystålliseres 3 fra 120 cm methanol. Herved fås 6,6 g benzyl-N-lauroyl-35 -L-alanyl-D-isoglutaminat med et smeltepunkt på lé9°C.

17

O

DK 154435 B

Produktet giver en Rf-værdi på 0,13 ved fyndtlags-’ chromatografi på silicagel under anvendelse af ethyl-acetat som elueringsmiddel.

Hydrochloridet af benzyl-L-alanyl-D-isoglutamat 5 kan fremstilles ifølge metoden, der beskrives af S. Kusumoto, Bull. Chem. Soc. Japan, £9, 533 (1976).

Eksempel 7.

6,6 g benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-D-.isoglutaminat opløses 3 to i 330 cm eddikesyre. Efter tilsætning af 6,6 g palladium på carbon (3% palladium) ledes en langsom hydrogengasstrøm gennem reaktionsblandingen i 2 timer. Efter filtrering af reaktionsblandingen udhældes filtratet i 3 liter vand.

Efter 2 timers henstand ved 0°C fraskilles det dannede 3 15 bundfald ved filtrering, vaskes to gange med ialt 80 cm vand og tørres. Der fås herved 5,16 g af et produkt, til hvilket der sættes 0,5 g af et produkt fremstillet på 3 samme måde. Den fremkomne blanding opløses i 90 cm kogende methanol, og til den herved fremkomne opløsning 3 20 sættes 45 cm vand. Efter 2 timers henstand ved en temperatur nær 20°C fraskilles de dannede krystaller ved filtrering, 3 vaskes to gange med ialt 60 cm vand og tørres under formindsket tryk (20 mm Hg). Der fås herved 5,1 g N--lauroyl-L-alanyl-D-isoglutamin med et smeltepunkt på 25 1 63°C.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,18 ved tyndtlags-chromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding af ethylacetat og methanol i volumenforholdet 4:1 som elueringsmiddel.

30

Analyse: Beregnet, %: C = 60,12, H = 9,33, N = 10,52 Fundet, %: C = 60,2, H = 9,5, N = 10,9

Eksempel 8.

3 35 0,53 cm isobutylchlorformiat sættes til en til -10°C afkølet opløsning af 2 g 01-benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-· 3 3 -a-D-glutamat i 20 cm chloroform og 0,57 cm triethylamin.

O

DK 154435 B

18

Reaktionsblandingen omrøres i 15 minutter ved en temperatur mellem -10 og -2°Cf hvorefter en ammoniakstrøm ledes gennem reaktionsblandingen i ca. 6 timer. Reaktionsblandingen henstår derefter ved ca. 20°C i 68 timer, hvor-5 efter den koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Remanensen optages i 50 cm^ kogende isopropanol. Et meget let, uopløseligt stof fraskilles ved filtrering. Efter afkøling af filtratet i 2 timer til 0°C fraskilles det dannede bundfald ved filtrering 10 hvorefter det tørres. Der fås 0,69 g N-lauroyl-L-alanyl- -D-glutam-N1-amid med et smeltepunkt på 226-228°C.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,75 ved tyndtlags-chromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding af lige volumendele ethylacetat og methanol som eluerings-15 middel.

Analyse: Beregnet, %: C = 60,27 H = 9,61 N = 14,06

Fundet, %: C = 59,3 H = 9,6 N = 14,1 .

20 Eksempel 9.

3 0,79 cm isobutylchlorformiat sættes til en til -5°C til afkølet opløsning s£ 1,09 g 5-phenylvalerianesyre 3 3 i en blanding af 50 cm tetrahydrofuran og 0,86 cm triethylamin. Reaktionsblandingen omrøres i 35 minutter 25 ved en temperatur nær -5°C, hvorefter der tilsættes en til 0°C afkølet opløsning af 2,1 g 0^-benzyl-L-alanyl-a-D- 3 3 -glutamat-hydrochlorid i 50 cm tetrahydrofuran, 10 cm 3 vand og 1,72 cm triethylamin. Reaktionsblandingen omrøres i 20 timer ved ca. 20°C og koncentreres derefter til tørhed 30 under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 40°C. Remanensen 3 opløses i 100 cm vand, og den fremkomne opløsning gøres sur til en pH-vardi på 2 ved tilsætning af IN saltsyre.

Det dannede bundfald fraskilles ved filtrering, vaskes to 3 3 gange med ialt 50 cm vand og to gange med ialt 50 cm 35 ether. Efter tørring fås der 1,98 g 0^-benzyl-N-(5-phenyl- valeryl)-L-alan.yl-a-D-glutamat med et.smeltepunkt på 128 C.

19

O

DK 154435 B

Produktet giver en Rf-værdi på 0,72 ved tyndt-lagschromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding af n-butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet 50:20:6:24 som elueringsmiddel.

5

Eksempel 10.

1,8 g O^-benzyl-N-(5-phenylvaleryl)-L-aXanvl-a-D- 3 -glutamat opløses i 100 cm eddikesyre. Efter tilsætning af 1,8 g palladium på carbon (3% palladium) ledes en hydrogen-10 gasstrøm gennem reaktionsblandingen i 4 timer. Reaktions-blandingen filtreres derefter, og filtratet koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 6Q°C.

3

Remanensen optages i 100 cm kogende ethylacetat, og et uopløseligt, stof fjernes ved filtrering. Filtratet for- 3 15 tyndes ved tilsætning af 400 cm isopropylether. Efter 2 timers henstand ved 0°C fraskilles de dannede krystaller ved filtrering, hvorefter de tørres. Der fås herved 0,66 g N-(5-phenylvaleryl)-L^alanyl-D-glutaminsyre, der smelter (overgår til en pasta) ved en temperatur mellem 135 og 20 140°C.

Produktet giver en Rf—værdi på 0,55 ved tyndtlags-chromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding af n-butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet 50:20:6:24 som elueringsmiddel.

25

Analyse: Beregnet, %: C = 60,31, H = 6,93, N = 7,40 Fundet, %: C = 60,3, H = 7,1* N = 7,4

Eksempel 11.

3 ' 30 3,6 cm isobutylchlorformiat sættes til en til -1°C afkølet opløsning af 3,95 g octansyre i 140 cm^ 3

tetrahydrofuran og 3,8 cm triethylamin. Reaktionsblandingen omrøres i 20 minutter ved -1°C, hvorefter der tilsættes en til 0°C afkølet opløsning af 9,45 g 01-benzyl-L-alanyl-35 -α-D-glutamat-hydrochlorid i en blanding af 54,8 cm^ IN

3 natriumhydroxidopløsning og 30 cm vand. Reaktionsblandingen

O

20

DK 154435 B

omrøtes i 1 time ved -1°C og derefter i 20 timer ved ca. 20°G. Reaktionsblandingen gøres derefter sur til en pH-værdi på 1 ved tilsætning af IN saltsyre. Tetrahydrofuranet afdampes under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 45°C, hvor- 3 5 efter koncentratet ekstraheres med 100 cm ethylacetat. Den herved fremkomne organiske fase vaskes to gange med ialt 3 3 50 cm IN saltsyre og med 25 cm af en mættet natriumchlorid-opløsning, hvorefter den koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 45°C. Der fås herved 10 g af to en lysegul olie, der chromatograféres på en søjle med en diameter på 2,5 cm indeholdende 200 g neutralt silicagel (0,063-0,20 mm). Der elueres med ethylacetat og opsamles frak- 3 tioner med et volumen på 100 cm . Fraktionerne 7-9 forenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) 15 ved 45°C. Remanensen udrives i 100 cm3 af en blanding af ether og petroleumsether (kogepunkt 35-60°C) i volumenforholdet 1:4. Bundfaldet fraskilles ved filtrering og tørres. Der fås 3,27 g O^benzyl-N-octanoyl-L-alanyl-agD-glutamat i form af et hvidt pulver.

20 Produktet giver en Rf-værdi på 0,56 ved tyndtlags- chromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding af ethylacetat og methanol i volumenforholdet 8:2 som elu-eringsmiddel.

25 Eksempel 12.

3,6 cm3 isobutylchlorformiat sættes til en til 0°C

3 afkølet opløsning af 7,03 g palmitinsyre i 140 cm tetra- 3 hydrofuran og 3,8 cm triethylamin. Reaktionsblandingen omrøres i 20 minutter ved 0°C, hvorefter der tilsættes en 30 til 0°C afkølet opløsning af 9,45 gO^-benzyl-L-alanyl-a- 3

-D-glutamat-hydrochlorid i en blanding af 54,8 cm IN

3 natriumhydroxidopløsning og 30 cm vand. Reaktionsblandingen omrøres i en time ved 0°C og derefter i 18 timer ved en temperatur nær 20°C, hvorefter den gøres sur til en pH-35 -værdi på 1 ved tilsætning af 70 cm IN saltsyre. Det dannede bundfald fraskilles ved filtrering, vasket fem gange med ialt

O

3 21

DK 154435 B

50:0 cm . vand o.g tørres. Der fås herved 12,11 g af et hvidt pulver, der chromatograferes på en søjle med en diameter på 2,5 cm indeholdende 20 g neutralt silicagel (0,063- 3 -0,20 mm). Der elueres først med 200 cm ethylacetat, der- 3 5 efter med 300 cm af en blanding af ethylacetat og methanol i volumenforholdet 9:1, derefter med 1,6 liter af en blanding af ethylacetat og methanol i volumenforholdet 8:2 og til 3 slut med 400 cm af en blanding af ethylacetat og methanol i volumenforholdet 6:4, og der opsamles fraktioner med et 3 10 volumen på 100 cm . Fraktionerne 5-23 forenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 45°C. Der 3 fås herved 5,18 g af et fast stof, der udrives i .50 cm kogende ether i 1/2 time. Efter afkøling til en temperatur nær 20°C fraskilles det uopløselige stof ved filtrering, 15 hvorefter det vaskes tre gange med ialt 75 cm^ ether og tørres. Der fås herved 2,94 g O^-benzyl-N-palmitoyl-L-'alanyl--a-D-glutamat.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,77 ved tyndtlags-chromatografi på silicagel under anvendelse af ethylacetat 20 som elueringsmiddel.

Eksempel' 13.

0,48 cm^ isobutylchlorformiat sættes en til -5°C

3 afkølet opløsning af 1,12 g arachidonsyre i 40 cm tetra- 3 25 hydrofuran og 0,52 cm triethylamin. Reaktionsblandingen om røres i 35 minutter ved en temperatur mellem -5 og -8°C, hvorefter der tilsættes en til 0°C afkølet opløsning af 0,93 g 3 L-alanyl-D-glutaminsyre-hydrochlorid i en blanding af 20 cm 3 3 tetrahydrofuran, 15 cm vand og 1,55 cm triethylamin. Reak- o

30 tionsblandingen omrøres i 1 time ved en temperatur nær -3 C

og derefter i 20 timer ved en temperatur nær 20°C. Reaktions- 3

blandingen fortyndes derefter ved tilsætning af 50 cm vand, gøres sur til en pH-værdi på 2 ved tilsætning af IN

3 saltsyre og ekstraheres tre gange med ialt 75 cm ;ether. De for-35 enede etherfaser koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 30°C. Der fås herved 2,5 g af en gul olie,

DK 154435B

O

22 der chromatograferes på en søjle med en diameter på 2,4 cm indeholdende 50 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm). Der elueres med ethylacetat. Herved fås 0,32 g N-arachidonoyl--L-alanyl-D-glutaminsyre, der smelter (overgår til en pastg) 5 ved en temperatur nær 90°C.

Produktet giver en Rf—værdi på 0,70 ved tyndtlags-chromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding af n-butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet 50:20:6:24.

10 L-alanyl-D-glutaminsyre-hydrochlorid kan fremstilles ifølge metoden, der beskrives af H. Nguyen-Huy et al., Eur.

J. Biochem.1 66, 79 (1976).

Eksempel 14.

3 “ ~~ 15 0,48 cm isobutylchlorformiat sættes til en til o 3 -10 C afkølet opløsning af 0,94 g palmitinsyre i 40 cm 3 tetrahydrofuran og 0,52 cm triethylamin. Reaktionsblandingen omrøres i 50 minutter ved en temperatur mellem -6 og -8°C, hvorefter der tilsættes en til 0°C afkølet opløsning af 0,93 g 3 20 L-alanyl-D-glutaminsyre-hydrochlorid i en blanding af 20 cm 3 3 tetrahydrofuran, 15 cm vand og 1,55 cm triethylamin. Reaktionsblandingen omrøres i 1 time ved en temperatur nær -6°C og derefter i 20 timer ved en temperatur nær 20°C. Reaktionsblandingen gøres derefter sur til en pH-værdi på 2 ved til- 3 25 sætning af 4N saltsyre og fortyndes ved tilsætning af 300 cm vand. Det dannede bundfald fraskilles ved filtrering, vaskes 3 tre gange med ialt 150 cm ether og tørres. Der fås herved 3 1,08 g af et hvidt pulver, der opløses i 120 cm kogende ethylacetat. Opløsningen filtreres i varmen. Efter 20 timers 30 henstand ved ca. 4°C fraskilles det dannede bundfald ved 3 filtrering, hvorefter det vaskes to gange med ialt 20 cm ethylacetat og tørres i luften. Der fås herved 0,93 g af 3 et hvidt pulver der opløses i 15 cm kogende ethylacetat. Opløsningen filtreres i varmen. Efter 64 timers henstand ved 35 ca. 4°C fraskilles det dannede bundfald ved filtrering, hvor- 3 efter det vaskes to gange med ialt 20 cm ethylacetat og

DK 154435 B

23 o tørres under formindsket tryk (0,2 mm Hg) ved 50°C. Herved fås 0,5 g N-palmitoyl-L-alanyl-D-glutaminsyre med et smeltepunkt på 155°C.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,62 ved tyndtlags-5 chromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding af n-butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet 50:20:6:24 som elueringsmiddel.

Analyse: Beregnet, %: C = 63,13, H = 9,71, N = 6,14 10 Fundet, %: C = 63,0, H = 9,3, N = 6,2

Eksempel 15.

3 1,95 cm isobutylchlorformiat sættes til en opløsning 3 af 5,19 g docosansyre i en blanding af 150 cm tetrahydro- 3 15 furan og 2,1 cm triethylamin, hvilken opløsning holdes ved 25°C. Reaktionsblandingen omrøres i 20 minutter ved 25°C, hvorefter der tilsættes en opløsning af 5,69 g® -benzyl-L- 3 -alanyl-a-D-glutamat-hydrochlorid i en blanding af 33 cm 3 IN natriumhydroxidopløsning og 17 cm vand. Reaktionsblandingen 20 omrøres i 30 minutter ved 30°C og derefter i 18 timer ved ca. 20°C. Der tilsættes derefter 100 cm^ vand, og reaktions-blandingen gøres sur til en pH-værdi på 1 ved tilsætning 3 af 35 cm IN saltsyre. Herved dannes et bundfald, der fra- 3 skilles ved filtrering, vaskes tre gange med ialt 75 cm 25 liter vand og tørres under formindsket tryk (0,3 mm Hg) ved 20°C. Herved fås 6,53 g af et hvidt pulver. 6 g af dette 3 pulver opløses i 50 cm tetrahydrofuran indeholdende 20 g neutralt silicagel (0,04*0,063 mm). Den fremkomne blanding koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) 30 ved 50°C. Remanensen anbringes på en søjle med en diameter på 3,5 cm indeholdende 180 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm).

3

Der elueres succesivt med 1300 cm af en blanding .af lige 3 volumendele cyclohexan og ethylacetat, 600 cm ethylacetat, 3 500 cm af en blanding af ethylacetat og tetrahydrofuran i 3 35 volumenforholdet 95:5, :9<0Q cm af en blanding af ethylacetat 3 og tetrahydrofuran i volumenforholdet 9:1, 800 cm af en

O

24

DK 154435B

blanding af ethylacetat og tetrahydrofuran i volumenforholdet 3 8:2, 1000 cm af en blanding af ethylacetat og tetrahydrofuran i volumenforholdet 6:4, 900 cm^ af en blanding af 3 ethylacetat og tetrahydrofuran i volumenforholdet 4:6, 500 cm 5 af en blanding af ethylacetat og tetrahydrofuran i volumen- 3 forholdet 2:8 og 600 cm tetrahydrofuran. Der opsamles 3 eluatfraktioner med et volumen på 100 cm . Fraktionerne 17-68 forenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Herved fås 3,31 g 0^-beazyl-N-doco-10 sanoyl-L-alanyl-a-D-glutamat.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,54 ved tyndtlags-chromatografi på silicagel under anvendelse af en blanding af ethylacetat og tetrahydrofuran i volumenforholdet 8:2 som elueringsmiddel.

15

Eksempel 16.

3 - - o

3 cm isobutylchlorformiat sættes til en til -5 C

afkølet opløsning af 3,605 g 3-cyclohexylpropionsyre i en 3 3 blandihg af 100 cm tetrahydrofuran og 3,23 cm triethylamin. 20 Reaktionsblandingen omrøres i 20 minutter ved -5°C, hvorefter der tilsættes en til 5°C afkølet opløsning af 7,96 g 0^- -benzyl-L-alanyl-a-D-glutamat-hydrochlorid i en blanding af 3 3 46,2 cm IN natriumhydroxidopløsning og 13,8 cm vand. Reaktionsblandingen omrøres i 10 minutter ved 0°C og derefter i 25 2 timer ved. ca. 20°C. Tetrahydrofuranet afdampes derefter under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Koncentratet 3 ekstraheres to gange med ialt 80 cm ether og gøres surt 3 til en pH-værdi på 1 ved tilsætning af 50 cm IN saltsyre.

Den fra reaktionsblandingen dekanterede olie ekstraheres 3 30 fire gange med ialt 200 cm ethylacetat. De organiske 3 faser forenes, vaskes med 25 cm af en mættet natriumchlorid-opløsning og tørres over vandfrit magnesiumsulfat. Efter koncentrering til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C fås en olie der krystalliserer spontant. De fremkomne 3 35 krystaller (7,3 g) opløses i 40 cm eddikesyre indeholdende 20 g neutralt silicagel (0,04^0,063 mm) . Den fremkomne

O

25

DK 154435 B

blanding koncentreres til tørhed, og remanensen anbringes på en søjle med en diameter på 2,5 cm indeholdende 50 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm). Der elueres med ethyl- 3 acetat og opsamles fraktioner med et volumen på 100 cm .

5 Den fjerde fraktion koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 45°C. Der fås herved 1,86 g 0^-benzyl--N-(3-cyclohexylpropionyl)-L-alanyl-a-D-glutamat med et smeltepunkt på 126-128°C. Fraktionerne 3 og 5 forenes og koncentreres til tørhed. Det fremkomne amorfe faste stof 10 chromatograferes på en søjle med en diameter på 2,:5 cm indeholdende 68 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm). Der elueres 3 først med 520 cm af en blanding af lige volumendele cyclo- 3 hexan og ethylacetat og derefter med 520 cm ethylacetat og 3 opsamles fraktioner med et volumen på 40 cm . Fraktionerne 15 11-28 forenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 45°C. Der fås herved 1,37" g (i^-benzyl-N--(3-cyclohexylpropionyl)-L-alanyl-a-D-glutamat med et smeltepunkt på 128-130°C. Produktet giver en Rf-værdi på 0,14 ved tyndtlagschromatografi på silicagel under anvendelse af 20 ethylacetat som elueringsmiddel.

Eksempel 17.

3 4,3 cm isobutylchlorformiat sættes til en til -6°C afkølet opløsning af 7,59 g N-(3,5,5-trimeth^lhexanoyl)- 3 25 -L-alanin i en blanding af 400 cm tetrahydrofuran og 4,53 3 cm triethylamin. Reaktionsblandingen omrøres i 20 minutter ved -6°C, hvorefter der tilsættes en til 3°C afkølet opløsning af 9,06 g .O^-benzyl-a-D-glutamat-hydrochlorid i en blanding af 3 3 66,2 cm IN natriumhydroxidopløsning og 14 cm vand. Reak- 30 tionsblandingen omrøres i 15 minutter ved -5°C og .derefter i 66 timer ved ca. 18°Cf, hvorefter den gøres sur til pH- 3 -værdi på 1 ved tilsætning af 75 cm IN saltsyre. Tetra- hydrofuranet afdampes under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Koncentratet ekstraheres fem gange med ialt 200 cm^ 3 35 ethylacetat. Ethylacetatfaserne forenes, vaskes med 40 cm 0,1N saltsyre og tørres over magnesiumsulfat. Efter filtrering og koncentrering af filtratet til tørhed under formindsket tryk

O

DK 154435 B

26 (20 mm Hg) ved 50°C fås 14,8 g af en olie, der opløses i 3 50 cm ethylacetat indeholdende 30 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm). Blandingen koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Remanensen anbringes 5 på en søjle med en diameter på 2,8 cm indeholdende 280 g neutralt silicagel (0,04-063 mm). Der elueres succesivt med 2 liter cyclohexan, 1 liter af en blanding af cyclohexan og ethylacetat i volumenforholdet 95:5, 1,5 liter af en blanding af cyclohexan og ethylacetat i volumenforholdet 90:10, 10 5 liter af en blanding af cyclohexan og ethylacetat i volumenforholdet 80:20, 1,5 liter af en blanding af cyclohexan og ethylacetat i volumenforholdet 70:30 og 3,5 liter af en blanding af cyclohexan og ethylacetat i volumenforholdet 3 50:50, og der opsamles fraktioner med et volumen på 500 cm .

15 Fraktionerne 23-29 forenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Herved fås 10,86 g 0^--benzyl-N-(3,5,5-trimethyIhexanoyl)-L-alanyl-a-D-glutamat i form af en olie, der krystalliserer.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,37 ved tyndtlags-20 chromatografi på silicagel under anvendelse af ethylacetat som elueringsmiddel.

N-(3,5,5-trimethyIhexanoyl)-L-alanin kan fremstilles på følgende måde.

6,5 cm^ isobutylchlorformiat sættes til en til -5°C

25 afkølet opløsning af 7,912 g 3,5,5-trimethylhexansyre i en 3 3 blanding af 125 cm tetrahydrofuran og 7 cm triethylamin. Reaktionsblandingen omrøres i 20 minutter ved -5°C, hvorefter der tilsættes en til 5°C afkølet opløsning af 4,495 g 3 L-alanin i 50 cm IN natriumhydroxidopløsning. Reaktions-30 blandingen omrøres i 10 minutter ved 0°C og derefter i 18 timer ved ca. 25°C. Tetrahydrofuranet afdampes under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Koncentratet ekstraheres 3 to gange med ialt 40 cm ether og gøres surt til en pH-værdi 3 på 1 ved tilsætning af 55 cm IN saltsyre. Det dannede olie- 3 35 agtige bundfald ekstraheres fem gange med ialt 250 cm ethylacetat. Ethylacetatfaserne forenes, vaskes med 25 cm 3

O

27

DK 154435 B

af en mættet natriumchloridopløsning og tørres over magnesiumsulfat. Efter filtrering og koncentrering af filtratet til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C fås 3 11,79 g af en olie, der opløses i 40 cm ethylacetat inde-5 holdende 20 g neutralt silicagel (0,063-0,20 mm). Den fremkomne blanding koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C, og remanensen anbringes på en søjle med en diameter på 3 cm indeholdende 120 g neutralt silicagel 3 (0,063-0,20 mm). Der elueres succesivt med 600 cm cyclo- 3 10 hexan, 300 cm af en blanding af cyclohexan og ethylacetat 3 i volumenforholdet 95:5, 300 cm af en blanding af cyclohexan 3 og ethylacetat i volumenforholdet 90:10, 300 cm af en blanding af cyclohexan og ethylacetat i volumenforholdet 80:20, 3 700 cm af en blanding af cyclohexan og ethylacetat i volumen- 3 3 15 forholdet 50:50, 300 cm ethylacetat og 300 cm af en blanding af ethylacetat og methanol i volumenforholdet 90:10, og der 3 opsamlet fraktioner med et volumen på 100 cm . Fraktionerne 17-28 forenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 45°C. Der fås herved 10,16 g af en olie, 3 3 20 der opløses i 25 cm ether. Efter tilsætning af 150 cm petroleumsether fås en olie, der fraskilles ved dekantering.

Efter tørring under formindsket tryk (0,2 mm Hg) fås 7,59 g N- (3,5, S-trimethy'lhexanoyl) ^-L^alanin.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,43 ved tyndtlags- 25 chromatografi på silicagel under anvendelse af ethylacetat som elueringsmiddel.

Eksempel '18 .

I løbet af 1 time og 10. minutter sættes en . opløsning 3 30 af 27,5 g succinimid-2^n^pentyl-3-hydroxynonanoat li 644 cm 1,2-dimethoxyethan til en til 7°C afkølet opløsning af 27,8 g O^-benzyl-L-alanyl-a-D-qjLutamat-hydrochlorid i en blanding af 3 3 245 cm vand og 22,9 cm triethylamin. Reaktionsblandingen holdes ved 2Q°C i 20 timer og derefter ved 60°C i 5 timer.

35 Derefter afdampes 1,2-dimethoxyethanet under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C, og koncentratet gøres surt til en 3 28

DK 154435 B

O

pH-værdi på 1 ved tilsætning af 150 cm IN saltsyre og ekstraheres fem gange med ialt 1,5 liter ethylacetat.

3

De organiske faser forenes, vasket tre gange med ialt 750 cm vand, tørres over natriumsulfat og koncentreres til tørhed 5 under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 60°C. Herved fås 3 38,6 g af en olie, der opløses i 200 cm ethylacetat. Til den fremkomne opløsning sættes 13 g dicyclohexyia^i-11/ hvorefter blandingen henstår ved 4°C i 20 timer. Det dannede hvide faste stof fraskilles ved filtrering, vaskes to gange med 3 3 10 ialt 40 cm ethylacetat og to gange med ialt 200 cm ether og tørres under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 20°C. Der fås herved 22,4 g af et hvidt pulver, til hvilket der sættes 1,9 g produkt fremstillet på lignende måde. Blandingen 3 opløses i 500 cm vand, og til den fremkomne opløsning sættes •3 3 15 200 cm·1 ethylacetat og 150 cm af en mættet citronsyreopløs ning. Den organiske fase fraskilles, og vandfasen ekstra- 3 heres to gange med ialt 400 cm ethylacetat. Ethylacetatfaserne 3 forenes, vaskes to gange med ialt 200 cm vand, tørres over natriumsulfat ocr koncentreres til tørhed under formindsket 20 tryk (20 mm Hg) ved 60°C. Herved fås 17,4 g 0^-feensyl-N-(2--n-pentyl-3-hydroxynonanoyl)-L-alanyl-a-D-glutamat i form af en beigefarvet pasta.

Produktet giver en Rf’-værdi på 0,25 ved tyndtlags-chromatografi på silicagel under anvendelse af ethylacetat 25 som elueringsmiddel.

Succinimid-n-pentyl-3-hydroxynonanoat kan fremstilles på følgende måde.

I løbet af 40 minutter sættes en opløsning af 27 g 3 dicyclohexylcarbodiimid i 300 cm 1,2-dimethoxyethan til 30 en til 0°C afkølet opløsning af 29,1 g 2-n-pentyl-3-hydroxy- 3 nonansyre og 14,1 g N-hydroxysuccinimid i 300 cm 1,2--dimethoxyethan. Reaktionsblandingen omrøres ved 0°C i 3 timer og holdes derefter ved 4°C i 21 timer. Det dannede bundfald fraskilles ved filtrering og vaskes to gange med 35 ialt 100 cm 1,2-dimethoxyethan. Filtratet koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C.

3 29

DK 154435 B

O

Koncentratet optages i en blanding af 300 cm isopropylether og 3 cm^ eddikesyre. Efter 2 timer ved 20°C fraskilles det dannede bundfald ved filtrering og vaskes to gange med ialt 3 40 cm isopropylether. Filtratet koncentreres til tørhed under 5 formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Der fås herved 42,6 g succinimid-2-n-pentyl-3-hydroxynonanoat i form af en gul olie.

2-n-pentyl-3-hydroxynonansyre kan fremstilles ifølge metoden, der beskrives af E. Lederer et al.. Bull. Soc. Chim.

10 1952, 413.

Eksempel 19.

Til en opløsning af 6,07 g O^-benzyl-N-tert.butyloxy- 3 carbonyl-a-D-glutamat i 70 cm ethanol sættes 12,3 g af en 15 chlormethyleret copolymer af styren og divinylbenzen (98:2) indeholdende 1,2 milliækvivalenter chlor pr. g. Reaktionsblandingen omrøres i 15 minutter ved 28°C. Derefter 3 tilsættes 2,25 cm triethylamin, og reaktionsblahdingen omrøres 1 2 3 65 timer ved 78°C. Polymeren frafiltreres, vaskes tre gange 3 3 20 med ialt 300 cm ethanol og tre gange med ialt 300 cm methylenchlorid og tørres under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 40°C. Der fås herved 17 g O^-benzyl-N^tert.butyloxycarbo- nyl-D-glutamyl-polymer. Denne polymer omsættes med alanin, 2 idet de nedenfor angivne operationer gennemføres.1 en 25 reaktionsbeholder forsynet med en omrører og ved.bunden med et filter af frittet glas.

(1) Man gennemfører tre på hinanden følgende vaskninger 3 af polymeren, hver gang med 100 cm methylenchlorid. Efter hver tilsætning af opløsningsmiddel omrøres blandingen i 30 3 minutter, hvorefter polymeren frafiltreres.

(2) Beskyttelsesgruppen tert.butyloxycarbonyl for 3 glutaminsyren fjernes derefter ved tilsætning af "1Q0 cm af en blanding af lige volumendele trifluoreddikesyre og methylenchlorid. Efter omrøring i 20 minutter frafiltreres 35 polymeren.

O

DK 154435 B

30 (3) Polymeren underkastes succesivt følgende vask- ninger: (a) tre gange 100 cm^ methylenchlorid, 3 (b) tre gange 100 cm methanol, 5 (c) tre gange 100 cm^ methylenchlorid.

Efter hver tilsætning af opløsningsmiddel omrøres blandingen i 3 minutter, hvorefter polymeren frafiltreres.

(4) Polymeren neutraliseres ved tilsætning af 3 100 cm af en blanding af methylenchlorid og N-methylmorpho-ΐθ lin i volumenforholdet 9:1. Efter omrøring i 10 minutter frafiltreres polymeren.

3 (5) Polymeren vaskes tre gange med 100 cm methylenchlorid hver gang. Efter hver tilsætning af opløsningsmiddel omrøres blandingen i 3 minutter, hvorefter polymeren fra- 15 filtreres.

(6) Til polymeren sættes.· først (a) en opløsning 3 af 3,78 g N-tert.butyloxycarbonyl-L-alanin i 50 cm methylenchlorid, hvorefter blandingen omrøres i 10 minutter, og derefter (b) en opløsning af 4,13 g dicyclohexylcarbodi- 3 20 imid i 50 cm methylenchlorid hvorefter blandingen omrøres i 20 timer. Derefter frafiltreres polymeren.

(7) Polymeren underkastes succesivt følgende vask- ninger: (a) tre gange 100 cm^ methylenchlorid, 25 (b) tre gange 100 cm^ eddikesyre, 3 (c) tre gange 100 cm methylenchlorid.

Efter hver tilsætning af opløsningsmiddel omrøres blandingen i 3 minutter, hvorefter polymeren frafiltreres.

Der fås herved O^-benzyl-N-(tert.butyloxycarbonyl-30 -L-alanyl)-D-glutamyl-polymer.

Den således fremkomne dipeptid-polymer omsættes med heptadekansyre, idet man gentager de ovenfor angivne trin 1, 2, 3, 4, 5, 6 og 7, dog med følgende ændring af trin 6.

35 Der tilsættes først (a) en opløsning af'5,4 g 3 heptadekansyre i 50 cm methylenchlorid og omrøres i 10 minutter og tilsættes derefter (b) en opløsning af 31

DK 154435B

0 3 4/13 g dicyclohexylcarbodiimid i 50 cm methylenchlorid og omrøres i 20 timer. Derefter frafiltreres polymeren.

Der fås herved en O^-benzyl-N-(N-heptadekanoyl- -L-alanyl)-D-glutamyl-polymer.

3 5 Denne polymer suspenderes i 100 cm trifluoreddike- syre i en reaktionsbeholder, der er forsynet med en omrører og ved bunden med et filter af frittet glas. Gennem den fremkomne suspension ledes en strøm af hydrogenbromid i 90 minutter. Efter frafiltrering af polymeren vaskes denne 3 to tre gange med ialt 300 cm eddikesyre. Efter hver tilsætning af eddikesyre omrøres blandingen i 3 minutter, hvorefter polymeren frafiltreres. Filtraterne forenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C, 3

Den således fremkomne remanens suspenderes i 30 cm 15 ethylacetat. Efter filtrering vaskes det .frafiltrerede stof to gange med ialt 60 cm ether og tørres. Der fås herved 1,97 g af et fast stof, der chromatograferes på en søjle med en diameter på 2,2 cm indeholdende 40 g neutral silicagel (0,04-0,063 mm).

3 20 Der elueres succesivt med 350 cm af en blanding af 3 lige volumendele cyclohexan og ethylacetat, 400 cm ethyl- 3 acetat, 700 cm af en blanding af ethylacetat og eddike- 3 syre i volumenforholdet 95:5, 950 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 90:10, 750 3 25 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i .volumenforholdet 80:20 og 1,6 liter eddikesyre og opsamles fraktioner 3 med et volumen på 50 cm . Fraktionerne 65-94 forenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Herved fås 0,.88 g N-heptadekanoyl-L-alanyl-D-30 -glutaminsyre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,61 ved tyndtlags-chromatografi på silicagel under anvendelse af en iblanding af n-butanol, pyridin, -eddikesyre og vand i volumenforholdet 50:20:6:24 som elueringsmiddel 35 Analyse: Beregnet, %: C = 63,80, H = 9,85, N = 5/95 Fundet, %: C =60,1, H = 9,3, N = 5,18

Sulfataske: 5,6%.

32

O

DK 154435 B

1 - Adjuvansvirkning på retarderet hypersensibilitet (HSR) og produktion af antistoffer mod røde blodlegemer fra får (GRM) hos mus_

Prøve ifølge Mackaness 5 Den anvendte metode er inspireret af metoden beskrevet af T.E, Miller et al., J. Nat. Cancer Inst., 51, 1669 (1973).

OF^-Hunmus på 20-22 g (6-7 uger) fordeles tilfældigt i de forskellige forsøgsbure (8-10 mus/dosis og 30 kontroldyr).

10 på dagen Jn immuniseres musene subcutant ved nakkens υ . 7 basis med en suspension indeholdende 10 GRM (Institut Pasteur Production) i 0,1 ml isotonisk phosphatpuffer, hvortil der sættes 0,1 ml af fortyndinger af forbindelsen, der skal undersøges.

Q

15 På dagen Jg modtager musene 10 GRM i 0,05 ml i den venstre pote og et lige så stort volumen fortyndingsmiddel i den højre pote. Forskellen i tykkelse af poterne i 1/100 mm måles med et semi-elektronisk apparat (H. van Dijk et al., J. Immunol. Methods L2, 261 (1976)).

20 På dagen aflives musene ved dekapitation, og seraene fra hver serie blandes i lige dele til dannelse af en pool, og indholdet af antistof i hver pool bestemmes ved hæmolyse-metoden. 50 μΐ serum (i fortyndinger i forholdet 1:2) + 25 μΐ GRM-suspension med 0,5% Mayer-puffer 25 med 0,1% gelatine. Der tilsættes 25 μΐ komplement i overskud (marsvine-serum, 1/20). Der inkuberes i 30 min. ved' 37°C, og hæmolysen registreres efter en nat ved 4°C ved tælling af antallet af blodlegemer, som udviser denne reaktion, hvilket giver en titer udtrykt 30 ved log2 til den reciprokke værdi af den højeste fortynding, der giver 100% hæmolyse.

Adjuvansaktiviteterne af peptiderne er sammenfattet i tabel I. Resultater, som viser en klar effekt, er understreget.

35

DK 154435B

33

O

Tabel I

Retarderet hypersensibilitet (HSR) og hæmolytiske antistoffer (Ac HE) over for røde blodlegemer fra får hos mus.

5 ___________

Eksempel Kontroller % HSR1 og Ac HE-tite£_————1^ nr. HSR „ ___________ -"dosis af forbindelse, mg/kg __^^_1/lCEg,,____ _^ ^ ^_ 1 og 2 86,3 104,3121,7 ,/^ 97,2 ./

10 9 s' 8 s^VQ

3 61,85 135,6 87,1 139,2 (med Fisunds adjuvans) 15 4 72,8 119.1 X U4f5/l03.e / ^^/^ 13 /^12 5 77,0 122, δ/*" 135,6 >/* 106,0 12 y' 12 s' y^12 82,6 13196,2113,7/" 14 17 s' "Li s' 14 77,0 ^y*^ 110,4/ 1*24,0/^^ 92,3^/ 25 12 ./^ 11 11 s' 12 8 ' 106,7 ^y 117,ΐ/' 123,Η/^ 107,(/ ^y^ 9 s' 10 10 10 30 10 117,1 ~y^ 86,3/^ 111,|/ 78,5 / ^y^ 9 10 ,/^ 10 /^9 14 87,7 ^s^ 123,1/^ 127/9/ 129,4 ^y^ 12 15 12 13 35 ^y^_^/^_,^/^_ % HSR = HSR i % af kontrol-HSR.

34

DK 154435 B

O

2 - Beskyttelse mod bakterieinfektioner. Modstandsdygtighed hos mus mod infektion med Listeria monocytogenes .

Ved dette forsøg, som er beskrevet af Mackaness, 5 J. Exp. Med. 116, 381 (1962), er bakterien normalt en intracellulær parasit i makrofager. De sidstnævnte er imidlertid i stand til at nedbryde mikroorganismerne, når de er "aktiveret" på passende måde.

CD,-Hunmus på 18-20 g (Charles River) podes intravenøst -J- 1 10 på dagen JQ med en normalt letal dosis bakterier (ca. 2 x 104 kim, ca. 4 x DL5Q). Den anvendte stamme er stammen EGD (Mackaness).

Dødeligheden noteres hver dag indtil forsøgets afslutning (dagen J^). Dette tidspunkt svarer til lidt mere end 2 gange den gennemsnitlige levetid af kontroldyrene.

15 Resultaterne viser: - antallet af overlevende mus'på dagen J^q i forhold til antallet af mus i serien, - den procentiske forøgelse af den gennemsnitlige overlevelsestid af de behandlede mus i forhold til kontrolserien.

20 Resultaterne, der opnås med peptiderne, er sam menfattet i tabel II.

25 30 35

35 DK 154435 B

O

Eksempel Dosis Indgivelses Overlevende %Overlevelse i nr. mg/kg vej dyr på dagen forhold til kon- -tidspunkt J10 trol 5 1 og 2 ' ΪΟ 07Ϊ0 ΤΪ6 3 i.p;J. 1/10 113 1 0/10 93 0 1/20 100 (kontrol) 4 Ϊ0 ' 3 i.p.;J, 0/10 84 10 1 0/10 93 0 1/10 106 2/20 100 (kontrol) ς 10 2/10 113 3 1/10 ;84 1 ' i,p;J, 1/10 94 0 X 2/20 100 (kontrol) 10 i.p? J-. og 3/15 139 2 x 5/15 144 0 Q 2/30 100 (kontrol) 10 1/10 105 3 i. V,.; Jn-1 1/10 100 1 1/10 123 20 7 0 2/20 .100 (kontrol) _ __ __ o 36

DK 154435B

Modstandsdygtighed mod infektion med Klebsiella pneumoniae.

Ved denne metode, der er beskrevet og anvendt af Chedid et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 1_A, 2089 (1977) til påvisning af aktivitet af MDP (muramyldipeptid), 5 fremkalder bakterien en voldsom septikæmi efter i.v.

eller i.p. injektion, men dødeligheden er mere udbredt tidsmæssigt ved intramuskulær infektion.

Beskrivelse af metoden.

10 Stamen Klebsiella Pneumoniae, serotype 2 (I.P. 7823) fremkalder efter intramuskulær indpodning i en dosis på 5 10 kim i løbet af nogle dage en dødelighed på 80-100% hos OF2-mus (IFFA-CREDO) på 18-20 g.

Resultaterne angives og analyseres på samme måde 15 som resultaterne af infektion af mus med Listeria mono-cytogenes.

De opnåede resultater er sammenfattet i tabel III.

20 25 30 35

DK 154435 B

O

37

Tabel HI

Eksempel Dosis Indgivelses- Overlevende dyr %Overlevelse mg/kg måde på dagen J,„ i forhold til nr* -tidspunkt kontrol 2.5 2/15 93 _ 0,5 s.c.? J-l 1/15 42 q 4/30 100 (kontrol) ΙΟ- 4ΤΪ5 Til 2.5 s.c.; J-3 3/15 119 10 14 0 og J—1 6/30 100 (kontrol) 2.5 s.c.; J-3 5/15 158 0,5 og J-l 2/15 92 0 4/30 100 (kontrol) 15 20 25 30 35

Claims (2)

1. 2. I i ' '
2. 30 CH3 CH2CH2 “ CO - R hvori symbolerne R1 har den ovenfor angivne betydning, hvorefter man om nødvendigt omdanner gruppen eller grupperne R1 til en hydroxygruppe eller aminogruppe, hvorefter 35 den fremkommende forbindelse isoleres, eventuelt i form af et farmaceutisk acceptabelt metalsalt eller additionssalt med en nitrogenholdig base, eller DK 154435B O b) et derivat af L-alanin med den almene formel R - CO - NH - CH - COQH ^ CH^ 5 ** hvori R har den ovenfor angivne betydning, eller et aktiveret derivat af denne syre, omsættes med et derivat af glutamin- syre med den almene formel H„N - CH - CO - R1 (VI) 10 * ' 1 ch2ch2 - CO - R hvori symbolerne R^ har den ovenfor angivne betydning, hvorefter man om fornødent omdanner gruppen eller grupperne R1 til en hydroxygruppe eller aminogruppe, hvor-15 efter den fremkomne forbindelse isoleres, eventuelt i form af et farmaceutisk acceptabelt metalsalt eller additionssalt med en nitrogenholdig base, eller c) når mindst ét af symbolerne R^- betyder en hydroxygruppe, man til en egnet bærer valgt blandt chlormethylerede og hydroxymethylerede copolymere af styren og divinylbenzen binder a- eller /-carboxylgruppen i glutaminsyre, hvis aminogruppe er beskyttet, og hvis eller a-carboxyl-gruppe, der ikke skal bindes til bæreren, er beskyttet ^ i form af et amid eller en ester, fjerner beskyttelses gruppen for aminogruppen, kondenserer L-alanin, hvis aminogruppe er beskyttet, med bærer-D-glutaminsyren, hvorefter beskyttelsesgruppen for aminogruppen i L-alanyl-gruppen fjernes og kondenserer fedtsyren med formlen 3Q R-COOH, hvori R har den ovenfor angivne betydning til dipeptid-bæreren, spalter dipeptid-bærer-bindingei^ og om nødvendigt fjerner beskyttelsesgruppen for syregruppen i D-glutaminsyren, hvorefter det fremkomne produkt fraskilles, eventuelt i form af et farmaceutisk acceptabelt __ metalsalt eller additionssalt med en nitrogenholdig base. oo