SE448462B - Dipeptider och farmaceutiska kompositioner innehallande desamma - Google Patents

Description

_..._,....._....._._...... ...__ ___... ___..._.... 2 448 462 Dessa produkter är immunolpgiska adjuvantia för alstrande av antikroppar och fördröjd överkänslighet, och de kan verka ensamma, dvs. utan att det är nödvändigt att administrera dem i oljeldsning.

Alla dessa produkter kännetecknas av närvaro av N-acetylmura- minsyra, som enligt Kasumoto et al., Tetrahedron Letters, Eg, ü899 (1978) anses ha samband med immunologisk aktivitet.

Man har nu funnit, att peptiderna med formel I trots frånva- ron av N-acetylmuraminsyra uppvisar anmärkningsvärda adjuvansegen- skaper och immunostimulerande egenskaper. Föreningarna med formel I, vïlkn är väldefinierade, kun dessutom lñLL framställan i sådan run- hetsgrad som erfordras för terapeutisk användning.

I formeln I betecknar symbolen R en alkylgrupp innehållande 1-21 kolatomer (eventuellt substituerad med en hydroxi-, fenyl' eller cyklohexy1gruPP) eller en alkenylgrupp innehållande 2-19 kolatomer, och symbolerna R1, som kan vara lika eller olika, betecknar en hydroxigrupp, en aminogrupp eller en alkyloxigrupp innehållande 1-4 kolatomer, eventuellt substituerad med en fenyl- grupp, varvid alaninen[NH2-CH(CH3)COOHIföreligger i L-form och glutaminsyranfimë-CHKIQCHZGXE)COOH] eller dess derivat (amider, estrar) föreligger i D-form. __ Enligt uppfinningen kan de nya dipeptiderna med formel I fram- ställas enligt sådana metoder som vanligen användes inom peptidke- min. De olika reaktionerna genomföres efter det att man med hjälp av lämpliga skyddsgrupper har blockerat de amino- eller syragrupper som icke skall delta i reaktionen. Efter genomförd reaktion av- lägsnas eventuellt skyddsgrupperna. ' De nya dipeptiderna med formel I kan vanligen framställas ge- nom att en syra med den allmänna formeln R - COOH (111) där R har den ovan angivna betydelsen, eller ett aktiverat derivat av denna syra, omsättes med en dipeptid med den allmänna formeln HQN - CH - CO - NH - CH - CO - H1 (IV) ca; cuzcflz - co - ni m 44s 4s2°a~ 1 I 3., -._ där symbolerna H1, som kan vara lika eller olika, har de ovan angiv- na betydelserna. Beroende på betydelsen av symbolerna R1 ersättas därefter eventuellt den ena av eller båda grupperna R1 med en hydroxi- eller aminogrupp.

¥När i formeln IV symbolerna Bi, som kan vara lika eller oli- ka, betecknar en aminogrupp eller en alkyloxigrupp, eventuellt sub- stituerad med en 'da-I I ' fenylgrupp, kan reaktionen mellan ' syran med formel III och dipeptiden med formel IV genomföras i när- varo av ett kondensationsmedel, såsom dicyklohexylkarbodiimid, in ett organiskt lösningsmedel, såsom metylenkloríd eller dimetylform- amid, och-vid en temperatur mellan -10 och +30°C. z__ i _ När i formeln IV var och en av symbolerna R1 betecknar en *hydroxigrupp, eller en av symbolerna R1 betecknar en hydroxigrupp och den andra betecknar en aminogrupp eller alkyloxígrupp enligt ovan, är det nödvändigt_att aktivera syran med formelflll innan_den iomsättes med dipeptiden med formel IV. ¿ _ Såsom aktiverad syra är det särskilt fördelaktigt att använda 'en syrahalogenid eller en blandad anhydrid, vilken vanligen fram-I ställes in situ genom att en syra med formel III i närvaro av en bas omsättes med ett alkylhalogenoformiat, företrädesvis isobutyl- klorformiat. dNär'man'använder syran med formel III i form av en halogenid, särskilt kloriden, genomföres reaktionen i ett organiskt lösningsmedel, såsom dietyleter eller metylenklorid, i närvaro av en:bas (antingen en oorganisk bas såsom natriumhydroxid eller en organisk bas såsom _trietylamin§ vid en temperatur mellan 0 och 3000. Dipeptiden-medii formel IV användes_vanligen i form av ett salt, såsom nydrokloriden.

När man använder syran med formel III i form av en blandad I itanhydrid, genomföras reaktionen i ett organiskt lösningsmedel, såsom Z dioxan, tetrahydrofuran,-kloroform, toluen eller dímetylformamid, eller i ett vattenhaltigt organiskt medium, i närvaro av en bas » (antingen en oorganisk bas såsom natriumhydrokid eller en organisk ' bas såsom trietylamin) vid en temperatur mellan -10 och +}0OC. Dif peptiden med formel IV användes vanligen i form av ett salt, såsom hydroklozfiden. f i i I i “ ' ,De nya¿dipeotider med formel I, där symbolerna H1, som kan Üvara lika eller,olika§ betecknar en hydroxigrupp eller en aminogrupp, kan framställas utgående från en dipentid med formel I, där en av symbolerna R1 beteoknar enfbydroxígrupp, en amínogrupp eller en ~_alkyloxigrupp ocn_den andra betecknar en hydroxigrupp eller en alkyl- -för omvandling-av en karboxigrupp till en karbamoylgrupp.

K I an. i oxigrupp} varvid man tillämpar vanliga metoder-antingen för omvandling av en esëergrupp till en-karboxigrupp eller en karbamoylgrupp eller' Omvandlingen av en estergrupp till en karboxigrupp kan vanli-g gen genomföras genom förtvälning under milda betingelser eller_genom _hydrogenolys) särskilt när minst ën_av symbolerna R1 betecknar en bensyloxigrupp. _ _ _ _ _ g 'När man genomför en hydrogenolys med hjälp av väte, genomr' föres reaktionen vanligen i ett lämpligt organiskt lösningsmedel, f _såsom_ättiksyra (eventuellt i blandning med ett annat organiskt *td '_lösningsmedel, såsom metanol); eller if ett vattenhaltigt organiskt medium, i närvaro av en katalysator, såsom Palladium, t.ex. palla? dium på kol, vid en temperatur nära 2000 och vid ett tryck närap_ 760 mm Hg§ _if x_ g i , g gi Omvandlingen av en estérgrupp eller en karboxigrupp till en karbamoylgrupp genomföras vanligen med hjälp av vattenfri ammoniak löst i ett organiskt lösningsmedel§ När ammoniak omsättes med enie _förening med formel I, där minst en av symbolerna Bi betecknar ena alkyloxigrupp, genomföres reaktionen lämpligen i metanol. När man omsätter ammoniak med en förening med formel I¿ där minst en av _svmbolerna_Rf_betecknar en hydroxigrupp, är det nödvändigt att i V 1 f, _ __ _ _ förväg aktivera syragruppen eller syragrupperna, vanligen i form ju av en blandad annyaria framstäiia in sivu med hjälp av ett alkylf halogenoformiat, såsom isobutylklorformiat, varefter reaktionen ge- e _nomföres under de betingelser som ovan har angivits för omsättníngg av en blandad anhydrid_av syran med formel_IIl med en dipeptid med i formeln IV; Dipeptiden med formel.IVgkan-framställas enligt kända metoder, varvid L-alanin; vars aminogrupp är skyddad, kondenseras' med 'D-~- iglutaminsyra, vars syragrupper eventuellt är'skyddade; varefter skyddsgruppen för aminogrnppen avlägsnas, 7 g -De nya dipeptioerna med formel I kan även framställas genom att ett derivat av L-alanin med den allmänna formeln ' i _ R - co - NH.- en - coon e_" _çg3 oär R nar den ovan angivna betydelsen, omsättesemeo ett derivat av D-glntaminsyra med den allmänna formeln i * i(V) 'fH¿ug#_cá»;cco~-gni - - “f - : __ _g e ¿ *_g - (VI) to =;_*i°H2C“2=' °°_' 31 w, ;-\ iavlägsnas$"* g ,5r . i där symbolerna Bi, som kan vara lika eller olika,.har de ovan angivna i'betydelserna. 'Beroende på betydelsen av symbolerna R1 ersättes där- efter'eventuellt den ena av eller båda grupperna Bl med en hydroki- grupp“eïIer"en aminogrupp.* r 'Det är särskilt lämpligt att aktivera syragruppen i L-alanin- idvvLyatbt?mcd_Tormol V, vanligen i Form av en blandad anhydrid fram- ”ställd i situ före omsättningen med föreningen med formel VI, sär- skilt om minst en av symbolerna Bl betecknar en hydroxigrupp. När syragrupperna i D-glutaminsyraderivatet VI är skyddade, dvs. när .lsymbolerña5R1, som kan vara lika eller olika, betecknar en amino~ 'eller alkyloxigrupp, kan reaktionen mellan syran med formel V ooh D-glutaminsyraderivatet med formel.VI.gen6mföras i närvaro av ett kondensationsmedel, såsom dicyklokarbodiimid. 7 J I Reaktionen mellan L-alaninderivatet med formeltv och D?gluta~ minsyraderivatet med formel VI genomföres vanligen under de beting- »elser som ovan nar beskrivits för omsättning av syran med formel III med aminosyran med formel IV. _ I _ _ 7 L-alaninderivatet med formel V kan framställas genom att en syra med formel III, eller ett aktiverat derivat av denna syra, eomsättes med L-alanin, vars syragrupp eventuellt är skyddad i form av ester, varefter i förekommande fall skyddsgruppen för syragruppen När syragruppen i L-alanin är skyddad, framställes syran med' formel V vanligen i närvaro av ett kondensationsmedel, såsom dicyklof r hexylkarbodiimid, och reaktionen genomföras i ett organiskt lösnings= medel, säsom'nætylenklorid eller dimetylformamid, vid en temperatur mellan--1o.orh +3o°ö:s V ,_ i r _ I _ il När syragrubpen_i L-alanin är fri, är det nödvändigt att akti- vera syran med formel III före omsättningen med L-alanin. Säsom_ak- tiverat derlvafi"¿visyran med formel lll är det särskilt lämpligt att använda*enisyrahalogenideller en blandad anhydrid. Reaktionen genomföras under de betingelser som ovan har angivits för omsättning av en syra med formel lll med.en dipeptid med formel lv.

¿De:nya'föreningar~~ med forme1.I, där symbolerna R1, som kan vara lika eller olika, betecknar en hydroxigrupp eller en aminogrupp, varvid minst en av dessa symboler betecknar en hydroxigrupp, och där, ÅR har den ovan ahgívna'betydelsen, kan framställas enligt* »Merrifields'peptidsyntes i fast fas. ' :¿ïDesSa föreningar medïformel I kan härvid framställas genom att man_i tur och ordning genomför följande steg. 448 462-: o (1)g På en lämplig bårare7fixeras N-.eller_J'fikarboxvlgrup- r - pen i D-glufaminsyran, vars aminogrupp är skyddad och Vars J' - eller 11 fkarboxylgrupp vid behov är skyddadi form av amid eller ester. i I (2) Man avlägsnar skyddsgruppen för aminogruppen utan attipå- verka bindningen mellan glutaminsyran ooh bäraren och utan att av; I lägsna den eventuella estergruppen från D-glutaminsyrans andra'¿ 'karboxylgrupp; I. ”(3) *L-alanin,_vars aminogrupp är skyddad med en lämplig skydds- grupp, omsättes med den på bärarenofixerade§D-glutaminsyran.H I (H) Man avlägsnar-skyddsgruppen för aminogruppen i Lfalanín- resten utan att påverka-bindningen mellan D-glutaminsyran och bära- ren och utan atfi avlägsna den evenfiuellaïestergruppen från D-glufia- minsyrans andra kaPboxylgrupp,r _ f e H (5)' En fettsyra R-COOH omsättes med den erhållna; på bararen fixerade-dipeptiden;_ 7 7 1 o _ (6) Bindningen mellan D-glutaminsyran och bäraren spjälkas under eventuellt avlägsnande av skyddsgruppen. iförd' -ieller f -kax-b- oxylgrunpen i Dëglutaminsyran. g 7 * _* 7 (7) Man isolerar den sålunda erhållna dipeptiden med formel i Särskilt lämpliga bärare är klormetylerade'eller hydroxíme§y~* lerade sampolymerer av styren och divinylbensen. Företradesvis7“ 7 användes klormetylerade sampolymerer av styren och divinylbensen'_ (98:2 eller §9:1);' ï _ _ 7 _ 7 _ Fixeringen av den på lämpligt sätt¿skyddade D-glutaminsyran på den klormetylerade bäraren genomföres enligt vanliga metoder; i varvid aminosyran löst i efitïorganiskt lösningsmedel, såsom etanol, omsättes med polymeren i närvaro av en organisk bas, såsom trietvlås amin; Det är_särskilt fördelaktigt att värma reakfiionsblandningen till en temperatur nära lösningsmedletsikoktemperatur. I i Skyddsgruppen för aminogruppen och den eventuella skyddsgrup- pen för en av7syragrupperna i D-glutamínsyran bör väljas på sådant sätt,.att skyddsgruppen får aminogrunpen kan avlägsnas utan påverkan på bindningen mellan aminosyran och bäraren och uran att skyddsgrup-7 pen för syragruppen avlägsnas; dy i l i Den syragrupp i D-glutaminsyran, som bör skyddas, föreligger" ivanligen í form av bensylester, och denna estergrupp avlägsnas i surt medium med hjälp av t.ex. en vattenfri blandning av bromväte- -' syra och trífluorättiksyral Skyddsgruppen'för.aminogruppen är vanfl ligen t=butoxikarbonyl,-ooh denna skyddsgrupp avlägsnas t.ex. med, I: 44a¶4e2 ;_7 a i -hjälp av en blandning av-trifluorättiksyra och metylenklorid.

L-alanin, vars aminogrupp-är skyddad, företrädesvis med en t- butoxikarbonylgrupp¿ omsättes med den nå-bäraren fixerade D-glutamin- ¶syran“enligt metoder som vanligen användes inom peptidkemin.

Reaktionen genomföras vanligen i närvaro av ett kondensations- r medel, såsom dicyklohexylkarbodiimid, i ett organiskt lösningsmedel, såsom metylenklorid; 1 r _ _ 1 Avlägsnandet av skyddsgrupnen för aminogruppen i L-alanylres- ten genomföres under de betingelser som ovan har angivits för av- lägsnande av skyddsgrunpen för aminogruppen i D-glutaminsyran, _ ¿Fettsyran R-COOH omsättes med den sålunda erhållna, pä.Uärareni f ¿fixerade dipeotiden enligt mnfliga_metoder, särskilt enligt den metod f-som ovan beskrivits för kondensation av L-alanin med den på bäraren .fixeradeiD-gïutaminsyran- aSpjälkningeniav bindningen mellan D-glutaminsyran och bäraren, *V vilken bindning är av typen bensylester¿ och det eventuella avlägs- nandet av skyddsgruppen för karboxylgruppen i D-glutaminsyran genom- ' föres vanligen samtidigt.f Man använder företrädesvis en vattenfri blandning av bromvätesyra och trifluorättiksyra. ¶ a Den erhållna föreningen med formel I utvinnes ur reaktions- blandningen enligt vanliga metoder. Bäraren avskiljes genom filtre- ring, och dipeptiden med formel I isoleras efter koncentrering av i'»filtratet till torrhet. Dipeptiden kan sedan renas enligt fysika- iisk-kemisika metoder; a i ¶ e ut Enligt en variant av det ovan beskrivna förfarandet är det' möjligt att omsätta den på bäraren fixerade D-glutaminsyran med L- alanin, vars aminogrupp är skyddad med en sådan fettsyrarest som ovan har definieratsÅ_ Under dessa betingelser leder reaktionen mel- lan L-alaninen och den på bäraren fixerade D-glutaminsyran direktf till den önskade föreningen med formel I, vilken utvinnes efter __ av spjälkning av bindningen mellan D-glutaminsyran och bäraren och even-_ tuellt avlägsnande av skyddsgruppen för syragruppen i D-glutaminsyran. 7 7 Enligt en annan variant av det ovan beskrivna förfarandet är ¿'det möjligt att på en lämplig bärare fixera en dipeptid erhållen genom omsättning av L-alanin med D-glutaminsyra, varefter den sålun- da fixerade dipeptiden_omsättes med en fettsyra R-CODH. Slutligen Üutvinnes den sålunda framställda;föreningen med.formel I. När di- peptiden fixeras på_bäraren, är det nödvändigt att skydda aminogrup- 'pen i L-alanylresten och eventuellt c{ -syragruppen i D-glutaminsyran, 'varvid man företrädesvissanvänderïde ovan angivna skyddsgrupperna. 1_44ß 4ö2aHs“ 1 8 Reaktionen mellan fettsyran och den på bäraren fixerade dipeptiden, vars skyddsgrdpp för aminogrnppen har avlägsnats, leder under dessa betingelser direkt till den önskade föreningen med formel I, vilken .utvinnes efter spjälkning av bindningen mellan D-gldtaminsyran och bäraren och eventuellt avlägsnande av skyddsgrnppen för syragruppen i Dfglutaminsyranf- -d _ _ _ f ' l I --De nya dipeptiderna med formel I kan eventuellt renas enligta fysikaliska metoder¿ såsom kristallisation eller kromatografi. ¶ De nya föreningarna enligt uppfinningen kan omvandlas tillit metallsalter eller till additionssalter med kvävehaltiga baser bero- ende på naturen av snbstitnenten R1;ö_ ¶ _ _ >¿za:' Metallsalterna och addítionssalterna-medekvävehaltiga baser kan framställas genom att de nya föreningarna omsättes med baser in ett lämnligt lösningsmedel-i Vanligen solnbiliserar man föreningen i vatten genom tillsättning av den teoretiska mängden bas, varefter den erhållna lösningen lyofiliseras. I V De nya föreningarna_enligt'uppfinningen är adjuvantia ochi immunitetsstimulerande ämnen. De ökar överkänslighetsreaktionerna ' och/eller alstringen av cirkulerande antikroppar gentemot de anti? 7 _¿gener,-tillsammans.med vilka de administreras, och de stimulerar på ett_icke#specifikt sätt försvarsreaktionerna mot vissa infektioner ' (t.ex§ infektioner hos möss framkallade av den intracellulära bakte- rien Listeria monocytogenes). ' U In vitro är de nya föreningarna verksamma i molära koncentra- ciöner mellan 1o'3 och 1o'8 M, särskilt vid följande försök.

Stímulering av DNA-syntesen (mitogen förmåga) enligt den metod som har beskrivits av G. Marchal¿ Ann; Immunol. (lnst. Pasteur), 125 c, 519 (197A).¿ d /Sfiihuleringjav den allogena reaktionen”(histo-inkompabilitets*ii reaktionen) enligt den metod som har beskrivits av R.W. Dutton, J. exp. Med., låg, 759 (1966) och A.B; Peck och F.H. Bach, J. Immunol.

Methods, Q,-147 (1973).; e l o - od; 7 :Stímulering av alstringen av antikropbar enligt den metod som har beskrivits av P}H.JKlesius, Proc;iSoc. exp.-Biol. Med. (N.Y.), 135, 1551(197d),och-H, Van Dijk och N; Bloksma, J. Immunol. Methods,a li; 325 <1977>.o¶7af* - - 5 iökning av antalet fagocytära makrofager enligt den metod som' A har beskrivits avÄJ. Michl et'al,, J. exp. Medg, lïfl, lH65:(1976); astimuleringfiav aktiviteten av surt fosfatas och N-aoetylw 7 glukosamidinas (lysosomenzymer i makrofagerna) utan ökning av laktatsi \_° M.. .. aa44s 462; f à dehydrogenas, enligt den metod som har beskrivits av P. Davies et ai., J..eXp. Med., ggg, 1262 (197u). ' _ In vivo uppvisar de nya föreningarna följande egenskaper.

Vid administrering till möss i doser mellan 1 och 30 mg/kg_ ökar föreningarna den fördröjda överkänsligheten och alstringen av antikroppary särskilt vid försök enligt den metod som har beskrivits av T.E. Miller et air, J. Nath. cancer Inst., 53; 1669 (1973).

Hos marsvin ökar de nya föreningarna överskänslighetsreaktio- nen ooh alstringen av antikroppar mot nötkreaturs-gammaglubulin 1 -kopplat med haptenet dinitrofenol, när försök genomföras enligt den ,metod som har beskrivits av F. Eloc'h et al., Immunol. Communic., 1, 41r(1978)- _ _ 1 1 Vid administrering till möss i doser mellan 1 och 100 mg/kg istimulerar de nya föreningarna försvarsreaktionerna mot infektioner framkallade av Listeria monocytogenesg när försök genomföras enligt den metod.som.har beskrivitsyav R.M. Fauve och B. Hevin, C.R. Acad. oss-L. (Dhlêëëy, 1589 (1977).

Hos möss stimulerar de nya föreningarna djurens förmåga att aavlägsna kolloidalt kol via det retikulofendoteliala systemet, när försök genomföras enligt den metod som har beskrivits av B.N.

Halpern et al¿, Ann. Institut Pasteur, §Q, 582 (1951).

' Vid administrering till kaniner i doser mellan 0,1 och 3 mg/ kg stimnlerar de nya föreningarna bildningen av serumantikroppar ymot influensavirus, när-försök genomföras enligt den metod som har beskrivits av G.H. Werner et al¿, Biomedioine, gg, UNO (1975).

Föreningarna enligt föreliggande uppfinning skiljer sig från förut kända föreningar med samma typ av verkan genom att -de icke innehåller N-aoetylmuraminsyra, som hittills har an- setts ha samband med den immunologiska verkan; se Kasumoto et tga1,¿Tetrahe&r0n Letters, gg, 4á99aç197s).a _ Jämförande försök har genomförts med dels föreningar enligt föreliggande uppfinning och dels N-acetylmuramyl - L e _-alanyl - D +_isoglutamin, ofta kallad “muramyldipeptid" (MDP). lpenna kända förening beskrivas 1 us 4o1ss 052. 1 us 4 153 6s4r ,beskrives estrarahärrörande från=MDP; MDP,är.den mest aktiva 'föreningen av dessa *kända föreningar och ~de. föreningar som beskrivas 1 Usa4»oe2fv35; gAv« försöksresnlta¿en; framgår iatt föreningarna enligt- Ér.448:462 iglialífl 7 V in rd vd- é 10 uppfinningen har en annan aktivitetsprofil än MDPÄ Föreningarna enligt unpfinningen inverkar framför allt på. den cellulära immuniteten oéh är verksamma mot infektioner där T-lymfoeyter *deltager i 'försvarereaktípnerna (infektíoner~ framkallade av Lisferia,nmónocyto§enes)} 'under _det att -MDP framför allt inverkar på den humorala antikroppimmuniteten och är verksam "mdt_inEektioner där makrofager spelar en viktig rell i för- svarsmekanismen (infektíóner framkallade- av vKlebsialla pneu- moniae);': f: I lir/ I 7 . ' 7 Am ett alldeles särskilt intresse är de föreningar med *formeln l,_därKsymbólerna R1, som han vara lika eller ßlika,' betecknar en hydroxigrupp} en aminogrupp eller en bensyloxie grupp, ochn därf symbolen R-CO beteeknar en- alhanoyl- :eller x alkenoylgrupp innehållande 8+20 kolatomer. _UppfiñÉíngen illustreras genom följande, icke begränsande exempel. * ¶ ¶ d i _De framställda föreningarna kan bilda komnlex med alkalimetal- ler och alkaliska¶jordartsmetaller. Till följd härav kan de erhåll-a na elementaranalysvärdena för de framställda föreningarna skilja sig avsevärt från de teoretiska värdena. Föreningarnas struktur har emellertid-bekräftats med hjälp av förhållandet C/N, som öVerens~ l stämmer med det*fieoretíska förhållandet, med hjälp av halten aminc- asyror och med hjälp av homogeniteten vid bunnskiktskrqmatografi på silikagel. ,. .p ' mwüysà' Beräknat, %=* G 'pa'följandedsätt{ H 448 462__,, Exenpel 1; Till en lösning av 12,75 g hydroklorid av_bensylr.

L-alanyl¿NV-D-glutamat i 15 cmå 1N natriumhydroxidlösning sätter man aantidigt nå en tid av 37 minuter dels en lösning avö8 g lauroylklorid i'T5.çm5¿eter och dela 3T,U"om3 1N~natriumhydroxidlösning, varvid.reak- tionsblandningens pH-värde hållas mellan 8 och 9. Reaktionsblandningen 7omröres*$edan“ünderj1 timma och 20 minuter. Efter dekantering surgöres d_vattenfasen till pHi2 genom tillsättning av 60 cm; 1N saltsyra, varpå den extraheraš tre gänger'med totalt 300 cm; etylacetat. De förenade >organiskaiextrakten tvättas med 25 cm3'vatten, torkas över vattenfritt I- natriumsulfat och koncentreras till torrhet under förminskat tryck ' ;(2o mm Hgš vid h5°c, 'Men erhåller härvid 7,u g av ett vitt feet ämne, d~vilket krenatograferas på 80 g neutralt silikagel i en kolonn ned dia- metern 2 cm:1 Man eluerarjförst med l00*cm3 av en blandning av etyl- aoetat och nbtanol-i volymförhållandet 8:2 och därefter med 200 cmñ lav,en ölandning av etylacetat och metanol i volymförhållandet 1:1 samt üppaamlar fraktioner med volymen 50 cm5.- Fraktion 1 koncentreras I till torrhet under förminskat tryck (20 nm Hg) vid HSOC. Man erhåller_ dehärvid 2 g öenay1#N~lauroyI-L-alanyI4flflßglutamat med en smältpunkt av 130QC.*“Fraktionerna"2-4 koneentreras till torrhet, och den härvid erhållna återštoden kromatograferaä på 100 g neutralt silikagel (0,063- 0¿20 mmf i en kolonn med diametern 2 cm._ Man eluerar med 250 cmše "aoeton ooh uppsamlar fraktioner med volymen 25 cmš. Fraktionerna 1 och 2 konçentreras till torrhet *under förminskat tryck (20 mm Hg) _vid h5°c¿ieMen erhåller härvid u,o7 g beneyi-N-iaureyi-L-elenyi-Q f D-glutamat med en smältpunkt_av 130OC¿i 7 Produkten ger ett Rftvärde av 0,9 vid tunnskiktskromatografi ”e på silikagel med användning av en blandning av n-butanol, pyridin, dättiksyra och vatten i volymförhâllandet 50:20;6:2ü såsom eluerings- medel._' ll ~^-6_6;f1-0- H- = 8,630 No 5,71' ' runnet, %= -fc.ï»66,5i fn = 8,8 _f. N. 05,6 _ Hydrokloridenav bednsyl-L-alanyl-eQ-D-glutamat kan framställas 'll 'Il Il Man löser 97;16tg bensyl-N-tfbutyloxikarbonyl-L-alanyl- 4 D-glutamat i 970 cmï av en vattenfri löaning av 157 N väteklorid i ättikayraç ReaktionšfilandningentOmröres under två timmar, varefter man snabbt tillaätter¿É,8 liter vattenfri eter och låter den resulte- rande_blandningen vila.vid 000 nnder två timmar§ eDen bildade oljiga fällningen avskiljes_från den överstående vätskan genom dekantering och löses i 500 cnš aceton; 'De dhärvid erhållna lösningen koncent- \ _ 448 462 g __ _ _ , _ g _ g , g 1 7 reras till torrhet under förminskat tryck (20 mm Hg) vid 5000. Härš vid erhålles 88,9 g hydroklorid av bensyl-Lfalanyl-flfD-glutamat; I 1 Bensvl-Nëtebutyloxikarbonyl*L-alanyl-Gl»D-glutamat kan fram- lställas enligt den metod som har beskrivits av E. Bricas et al.,1 Biçchemistry g; 823 (1970). g kr .

- Exempel 2. ,Man sätter 31 cm: isobutylklorformiat till en lös- aning av U7,75 g laurinsyra i 3 liter dioxan och 33,3 cmš trietylamin,a vilken lösning hâlles vid en temperatur nära 10oC¿ Reaktionsbland- T ningen omröres under 20 minuter vid 1000; varefter man på en tid av _ '10 minuter tillsätter en till 1000 kyld lösning av 88,95 g hydroklorid av bensyl+L+alanyl-M ?D¥glutamat i en blandning av 1_liter dioxan¿jf' #75 cm3 vatten och 476'cm3 in naurïumnydrøxidlöening. Reaktionsbland- ningen Qmröres under 1 timme vid 1000 och d'refter under 18 timmar' vid en temperatur nära 2000. .Reaktionsblandningen utspädes.därefter genom tillsättning av H liter vatten, eurgöres till pH'2 genom till- sättning av ca U75icm3»1N salteyra och hålles under 2 timmar vid 000. _ Den bildade fällningenfavskiljes genom filtrering, tvättas med 500 3 0 icmc vatten och med 500 cm; eter och~torkas"under förminskat tryckt (20 mm Hg) vid 2000. Den erhållna produkten suspenderas i 800 cmñi. eter, omröres under 1 timme;*avskiljes genom filtrering och tvättas två gånger med totalt 200 cmš eter. aEfter torkning under förminškat tryck (20 mm Hg) vid 2o°c erhåller man 71,79 g bensyi-N<1auroyiåL¿_' alanyl-M¿-D-glutamat med en smältpunkt av 13000. _ _>_¿_ A Produkten ger ett Ef-värde av 0,77 vid tunnákiktskromatografi på silíkagel med användning av en blandning av etylacetat och metanol i volvmförhållandet 4:1 $åSom_elueringsmedel¿_l Ä _ Exempel 3. _En lösning av 5,u9 g_1auroy1k1qrid i 150 cm3 mety- lenklorid sättee droppe för droppe på en tid av 30_minuter till en 'till_5QC kyld blandning av 8,46 g hydroklorid av bensyl-L-alanyl~Df_í~ _glutamat, 300lcm3 metylenklorid och ü,3 cmj trietylamin. Reaktions- blandningen omröres under 2 timmar och 15 minuter vid ca-2000, varefë ter den extraheras tre gånger med totalt 1500 cm; vatten; Den orga-7 niska fasen koncentreras till en volym av ca 100 cm3'under förminskat? tryck (20 mm Hg) vid ÄOQC. ”Den i koncentratet bildade fällningen av- skiljes genom filtrering och torkas. cMan erhåller härvid 5,3 ggav ett vitt pulver, vilket man förenar med 0,8 g“av en produkt framställd egunderoeamma.betingelser; :Den erhållna blandningen löses i 100 cmšc kokande metanol, och den resulterande lösningen får stå vid OQO under 1 , tre timmar. De bildade kristallerna avskiljes genom filtrering och- _ 'tork¿s'undergförminskat tryek.(p,2 mm Hg) vid 5o°c. Man erhåller här- n, fm _ í 60 cm ,stoden_upptages i 200 cm vras till torrhet under förminskat tryck (först 20 mm Hg och sedan '~glutamat'ií25fcm volymförnållandet 25:1:1. -Efter tillsättning av 500 mg palladium på 44a.4e2s_i 13 ' 5 ^ 1 vid Ä,64 g bensyl-N-lauroyl-L-alanyl-Dvglutamat med en smältpunkt av -18290. f - , > Produkten ger ett Rfevärde av 0,80 vid tunnskiktskromatografi på silikagel med användning av en blandning av lika volymdelar etylfl acetat och metanol säsom elueringsmedel. 'mlnysi Beräknat, %; o ;66,23 'H = 8,85 N 8,58 " Funnefgiz: eo =s6,1 en = 5,8; N 5,14 i , Hydrokloriden av bensyl-L-alanylrD-glutamat kan framställas på följande sätt;_ " ' 5 ' 5 ' Il Man löser 5,2 g bensyl-N-t-butyloxikarbonylfLÄalanyl-Deglutamat 3 av en vattenfri lösning HV 1,7 N väteklorid i ättiksyra¿i Efter omrörning under en timme hälles reaktionsblandningen i 300 cm3 eter, _Eterfasen dekanteras. Till det kvarvarande gummit sätter man 1 liter eter._ Efter rivning dekanteras eterfasen på nytt, och åter- 3 metanol, Den erhållna lösningen koncentre- 0,2 mm Hg) vid ÉOQC. Man erhåller härvid 4,3 g hydroklorid av bensyl- L-alanyl-Dšglntamat i form av en marängliknande produkt. 5 Bensyl-N~tÅbutyloxikarbonyl-L-alanyl-D-glutamat kan framstäl- las enligt den metod som har beskrivits av S. Kusumoto et al;, Bull.

Chem. Éoc{ Japan, Eg, 533 (1976)§ 4 , I 1 Exempel H. Man löser 5,7 g bensyl-N-lanroyl-L-alanyl-D-gluta- 3 3 mat i en ölandning av 1 liter metanol, 400 cm ättiksyra och Ä0 cm- fvatten. 'Efter tillsättning av },7 g palladium på kol (3% palladiuml ledes en långsam vätgasström genom reaktionsblandningen under en tídi iav 2 timmar.5 Därefter filtreras reaktionsblandningen, och filtratet utspädes genom tillsättning av 3 liter vatten. Det olösliga ämnet i avskiljes genom filtrering och torkas under förminskat tryck (20 mm *Hgö vid SOQC, 'Man erhåller.härvid 2,3 g N-lauroyl-L-alanyl-D-gluta- min med en smäitpunkt av 170-172°c. _ 7 .Produkten ger ett.Rf~värde av 0,83 vid tunnskiktskromatografi på silikagel med användning av metanol såsom elueringsmedel.

Analys: ^Beräknat,i%= c = 60,12 .H = 9,33 N = 10,52 ' in 7 Funnet,'%;< dc-=,6o,1i, H = 8,8 N = 10,5 cEâempel 5.. Man löser 500 mg-bensyl-N~lauroyl-L-alanyllofl-D-> 3 av en blandning av metanol, ättiksyra och vatten i ,kol (3%'palladium) ledes en längsam vätgasström genom reaktionsbland- ningen under en tid av 2 timmari ,Reaktionsblandníngen filtreras där-, ilefter, och filtratet koncentreras till torrhet-under förminskat trycki 44so462ii\ 0-14 (20 mm Hg) vid u5°c.a man erhåller härvid 460 mg av ett gräddvítt: fast ämne; till vilket man sätter 690 mg produkt framställd på samma sätt. ÜBlandníngen löses i 10 cmš kokande.metanol, och till den härvid 5 0erhållna-lösningen'sättes'5 cm: vatten. Efter 20 timmars vila.vid, ca 2000 avskiljesade.bildade vita kristallerna genom filtrering, var- på de tvättas med 5 cmš av en blandning_av metanol och vatten i volymf förhållandet 2:1 och torkaS'under förminskat tryck (0,2 mm Hg) vid_ _ l5o°C.' Man erhåller härvid 770 mg N-lagrayl-L-alanyl-D-glutaminsyra medlen smäiupunkt av 158¿i429C.' lProdukten ger ett Rfjvärde av 0,61 vid tunnskiktskromatografí lepå_silikagel_med"användning av en.blandning av N-bntanol,_pyridin,a "ättiksyra onh vatten *i volymforhållandet_50:20:6:2N såsom eluerings-0 medel," ll ll ll Ana1ys=.Beräknat§ %:l Cl 59,98 eHe :9,o6_ N '6,99 _o se Famnet, z; ¿ ,ce f59,7i.eHe 9,oe N 7¿3 Q 124,1 Exemnel 6. ¶Man sätter 2,5Ä cmš isebutylklorformiat till en 1 u' n n u - | till 000 kyldïlösning av 3,9 g lanrinsyra i.156;om3 vattenfri toluen;._. 'odh 2,7 cmšftrietylamin, Reaktionsblandningen omröres under 20 mif never vid o°c, varefter man ci11säc:ef_en tili o°c kyla lösning av 6,7 g hyåroklorid av bensyl-L-alanyl-D-isoglutamat i 52 cm3 vatten ~ och 2,7¶cm3;trietylamin, Reaktionsblandningen omröres'nnder 65 timmar vid en temneratür nära 20°C.> Man erhåller härvid en reaktíonsmassam meå gelatinöst ntseende, till vilken man sätter 150 cmšeetylacetat.

Den bildade fällningen avskiljes genom filtrering, tvättas med 30 cmš vatten och torkas; 0Man erhåller härvid 7:6 Q bensy1-L-lauroyl-L- alanyl~D+isoglutamatJí form av ett vitt pnlverl Vattenfasen av det ovan erhållna_filtratetçektraheras två.gånger med totalt 100 cmš etylacetat;. Den erhållna etylacetatfasen förenas med.filtratets orga- :niska fas, varpå de förenade organiska faserna tvättas med 125 cmš 10,lN,saltsyra och med 120 cmš vatten, torkas över magnesiumsulfat och koncentreras till torrhet under förminskat tryck (20 mm Hg) vid 5OoC. 0 Man erhåller härvid ytterligare l,5 g bensyl-N-lauroylFL-alanyl-D? I ' 4:- j , isoglutamat. Produkten (1,0 g"+ 1,5 g)_omkristalliseras i 120 cmš. e metanol. ~Härvid erhålles 6,6 g bensyl¥N-lanroyl-Lšalanyl-D-isogluta-_ mat med en smältpnnkt av 1699C.7 7 0 0 .

Produkten ger ett Rf-värde av 0,13;vidftunnskiktskromatografi på silikagel med.användningïav'etylacetat_sâsom'elueringsmedel. I Hydrokloriden av bensvl-Låalanyl-D-ieoglutamat kan framstäl- - las enligt den metod som har beskrivits av S; Knsumoto, Bull. Chem; _soc; Japan, gg, 533_(1976). _ ' ' Qav- i fu ai , TS 44an452 ¿ lExempel 7. Man löser 6,6 g bensylfN-1anroyl4L-alanyl-D-iso- glutamat i 550 cm; ättiksyra, fEfter tillsättning av 6,6 g palladium på kol (5% palladiuml ledes en långsam vätgasström genom reaktions- blandningen under 2 timmar. Efter filtrering av reaktionsblandningen .hälles ilftratet i 5 liter vattent lEfter 2 timmars vila vid 000 av- eskiljes den bildade fällningen genom filtrering, tvättas två gånger smed totalt 80 cmš vatten och torkas, Man erhåller härvid 5,16 g av¿ en produkt, till vilken man sätter 0,5 g av en prodnkt erhâllen på samma sätt. lDen resulterande blandningen löses i 90 cmš kokande . . _ . 3 Q metanol, och till den härvid erhållna lösningen sättes H5 cml vatten.

Efter 2 timmars vila vid en temperatur nära 2000 avskiljes de bildade kristallerna genom filtrering, tvättas två gånger med totalt 60 cm3 . vatten och torkas under förminskat_tryck (20 mm Hg); Man erhåller härvid 5,1 g N-lauroyl-L-alanyl-D-isoglutamin med en smältpunkt av 16300. V o ¿ . av f 'g ' Produkten ger ett Rf-värde av 0,18 vid tunnskiktskromatografi .på silikagel med användning av en blandning av etylaoetat och metanol i volymförhållandet Uil såsom elueringsmedel. 5 Analys: Beräknat, %; c -060,12 H = 9,33 N 19,52 se ' Funnefi, %: c '6o,2 H = 9,5 _ Na o1o,9 '"l . Exempel 8. Man sätter 0,53 cmš isobutylklorformiat till en ll ll ätill -10°0 kyld lösning ava2ng.bensylfN-lauroyl-L-alanyl-qgíhgluta- ' mat i 20 cm3 kloroform och 0,57*cm§'trietylamin. Reaktionsblandningen omröres under 15 minuter vid en temperatur mellan -10 och -200, varef- fter en ammoniakström ledes genom reaktionsblandningen'nnder ca 6 tim- "mar. Reaktionsblandningen får sedan vila vid ca 20°C under 68 timmar, varpå den koncentreras till torrhet under förminskat tryck (20 mm Hg)_ l vid 5090. Återstoden upptages i 50 cmš kokande isopropanol. Ett 7-mycket lätt olösligt ämne avskiljes genom filtrering. Efter kylning 'av filtratet under 2 timmar vid 000 avskiljes den bildade fä1lningen_ genom filtrering, varpå den torkas. Man erhåller 0,69 g N-lauroyl- - L-alanyl-Deglutamamid med en smältpnnkt av 226-22800. nProdukten ger ett Rf-värde av 0,75 vid tunnskiktskromatografi lpå silikagel med användning av en blandning av lika volymdelar etyl~ acetat och metanol såsom elueringsmedel. _ ' “ Analys: Beräknat, %; ac = 60,27 H' 9,61- N 14,065 ' Funnet,ï%¿ c 59,3 'H = 9,6-' N 1A,1 n r Exempel 9. Man.sättero0,79 cmš isobutylklorformiat till e till -500 kyld lösning av 1,09 g 5-fenylvaleriansyra i en blandning u il "av 50 cmš tetrahydrofuran'0oh_0,8É cmš trietylamin. Reaktionsbland~ i44se462í> a lt lt~ 0 0 4>:16]e iningen Qmrfires under 55 minuter vid en temperatur nära -5°0¿ varefter man tillså§ter_en till 000 kyld lösning av 2,1 g hydroklorid_avlbensyl- L-alanyl-ä-D-glutamat i_50 cmš tetrahydrofuran, 10 cmš vatten och 1¿72 cm3.trietylamin.= Reaktiónsblandningen omröres under 20 timmar* vid çai20§C och koneentreras sedan till torrhet under förminskata tryck (20;mm Hg) vid HÖOC. Äterstoden löses -i 100 cmš vatten, pehi den erhållna lösningen Surgöres till pH 2 genom tillsättning av 1N,Üi saltsyra.i Den bildade fällningenaavekiljes genom filtrering, tvättas ' två gånger med tótalt 50 dmš vatten och två gånger med totalt 50>em3 eter§a_Efter torkning erhåller man l;98 g bensyl¥N¥(5-fenylvaleryllë 0L-alanyl-ä-D-glntam¿t=ned en smältpnnkr av 12ß°c.Å 0 " aPróHukten ger ett Rf-varde av 0,72 vid tunnskiktskromatografi 'på silikagel med användning av en blandning av n-butanol, pyridin, _ ättiksyra och vatten i vqlymförhällandeta50:20:6:2Ä såsom éluerinšslï * medel. ' "” * a5_Ä:*a.e _i _. I I Exempel 10; fMan löser 1;8 g bensy1-N-(5jfenylvaleryl)-L- alanyl-N *D-glutamat i 100 cm5 ättiksyra. Efter tillsättning av 1,8 g palladium på kel (3%.palladïum) ledeg en våtgasström genom reak- tionsblandningen under Ä timmar. 'fieaktienšblandningen filtreras äär- nefter,~Qehifiltratetrkoncentreraš till torrhet under förminskat tryck 3 '(20 mm Hg) viå 60oC¿:Återstoden'upptages i 100 cm kókande etylacetat¿ 1 och det ólösliga ämnet avlägsnas genom filtrering. Filtratet utafiä-' ides genom tillsättning av Ä00 cmj isdpropyleter. Efter 2 timmar: vila vid 0oC.avškiljes de bildade kristallerna genqm filtrering, Varpa de "torkas. Man erhåller härvid 0,66 g N-(5Äfenylvaleryl)-L-alanjl-D-1I glutaminsyra, som smälter (övergar~till en pasta) vid en temperatur' 0 mellan 135 den 1u0°c[ in 0 0 ' ' I 0 I Prófiukten ger ett Rf-värde av 0,55.vid tunnskiktskromatografí nå silikagel med användning-av en blandning av n-butanol, pyridin,. I ättíksvra och vatten i volymförhållandet 50:20:6:2à såsóm eluerings- medel, " * * Analys; _ Beräknat, _72; *c 60,31 n- _6e,t95 N = 7,40 _ Funnet,a%=_ 0 0 f6o,3 »H 37,1 taN = 7,4 0 Exempel 11; man sätten 3,6 @m3_istbutylk1orf0rniat till en' tuill -1°c kyld lösning av 3,95 g_oktansyrnvi lëo cm5 tetranydrofuran Il U 7 ech §¿8-cm3~trietylamin,a Reaktionsblandningen omrörea under 20 minu-* iter vid -1°C,,varefter_man tillsätter en vill o°c kyld lösning avn 9,Ä5 g hydroklorid av bensål-Lfalanyl-d -D4glntamat i en_blandning,i av 5H,8acm3 1N natrinmhydroxidlösning och 30 em; vatten; Reaktifinër f-. blandningen omröres under 1 timme vid -1°C'ÖCh-Seaafl under 20-timmar ff: hä itiii c°o kyla lösning av 7;o3.gapa1mitinsyra 1 1uo cm _ tillsättning av 70 cm 'jes genom filtrering, tvättas fem gånger med totalt 500 cm in l* owman-sz. :_ vid ca 2000. Reaktionsblandningen.surgöres sedan till pH 1 genom ' ftillsättning av 1N saltsyra. Tetrahydrofuranen avdunstas under för- * minskat tryck (20 mm Hg) vid 4500, varefter koncentratet extraherasgj med 100 cm; etylacetat. Den härvid erhållna organiska fasen tvättas- två gånger med totalt 50 @m3.1 3 N saltsyra och med 25 cm av en mättad natriumkloridlösning,-varpå den koncentreras till torrhet under före . minskat tryck (20 mm Hg) vid 4590. Man erhåller härvid 10 g av envf ljusgul olja, vilken kromatograferas på en kolonn med-diametern 2,5V cm innehållande 200 g neutralt silikagel (0,065-0,20 mm). Man elue- rar med etylacetat och uppsamlar fraktioner med volymen 100 cm3.» "f" Fraktionerna 7-9 förenas och koncentreras till torrhet under förmins- kat tryck (20 mm Hg) vid Å5°C. Återstoden rives i 100 cm5 blandning av eter och petroleumeter (kokpunkt 55-6000) i volymför- av en ' hållandet 1:4. 'Fällningen avskiljes genom filtrering och torkas.

Man erhåller 3,27 g bensyl-N-oktanoyl-L-alanyl-N -D-glutamat i form '-av ett vitt pulver.. 1Produkten ger ett Rf-värde av 0,56 vid tunnskiktskromatografi på silikagel med användning av_en_blandning av etylacetat och metanol i vclymförhållandet 8:2 såsom elueringsmedel. 7 .._ _ I Exempel 12. .Man sätter },6fcm3_isobutylklorfgrmiat till en I och 3,8 cm: trietylamin.- Reaktionsblandningen omröres under 20 minu- ter vid_OOQ, varefter man tillsätter en till OOC kyld lösning av_Å 9,45~g.hydroklorid av bensyl-L-alanyl-K-Ihglutamat i en blandning av V 5 1 c c '54,8 g cm. IN natriumhydroxidlösning och 30 cmš vatten.. Reaktions-7 -blandningen omröres under 1 timme vid.0°C och sedan under 18 timmar vid en temperatur nära ÉOQC, varpå den surgöres till pH 1 genom 3 1N saltsyra. Den bildade fällningen avskil- 3 vatten och torkas. Man erhåller härvid 12,11 g'av ett vitt pulver, vilket. 1 kromatograferas på en kolonn med diametern 255 cm innehållande 20'g neutralt silikagel (0,063-0,20 mm). Man eluerar först med 200 cmš etylacetat, därefter med 300 cm av en blandning av etylacetat och metanol i volymförhållandet 9:1, därefter med 1,6 liter av en bland- ning av etvlacetat och metanol i volymförhållandet 8;2 och slutligen fmed #00 cm: av en blandning av etylacetat och metanol i volymförhål- landet 6:Ä,-och man uppsamlar fraktioner med volymen 100 cmš. Frak-- tionerna_5-25 förenas och-koncentreras till torrhet under förminskat -tryck rzofimm Hg; vid A590, *Man erhåller härvid 5,18 g av ett fast 'ämne; vilket rives.i 50 cm; kokande“eter'under å timme. Efter kyl- tetrahydrbfuran* :rp44a4ê2s 18 ning till en temperatnr nära ÉOOC avskiljes det olösliga ämnet genem' filtrering; varpå det tvättas tre gånger med totalt 75 cmš eter och e torkas. Man erhåller härvid 2,9H*g.bensyl-Nfpalmitoyl-Lfialanyl-- 1» s D-glutamat.W' 5 Produkten ger ett Rfevärde av 0,71_vid tunnskiktskromatografi på ailikagel med användning av etylacetat såsom elueringsmedel.. _ lExëmpel*13.ï Man sätter 0,U8 cmš isobutylklorformiat till en till ?5?C kyld lösning av 1,12 g arachidonsyra isÄO cmz tetrahydroj furan dch.Ö,52 cm§°trietylamin. Reaktionsblandningen omröres underï N 55 minnter vid en temperatur mellan -5 och 38°O,_varefter man till- s sätter en till C90 kyld lösning av 0,Q3 g hydroklorid av L-alanylfl, D-glutaminsyra i en blandning av 20 cmš tetrahydrofuran, 15 cmš vat4 ten och 1,55 cmš trietylamin. 'Reaktionsblandningen omröres under 1 “timme vid en temperatur nära #300 och sedan under 20 timmar vid en, temperatur nära 2000.: Reaktionsblandningen utspädes därefter genom ~tillsättning av 5O1cm5 vatten, eurgöres till pH 2 genom tillsättning av en 1N vattenlösning av väteklorid Qeh extraheras tre gånger med totalt 75 cmš eter.' De förenade eterfaserna koncentreras till terr- het under förminskat tryck (20 mm Hg) vid_309C,l Man erhåller härvid 2,5 g av en"gnl dlja, vilken kromatograferas på en kólonn med dia- metern 2;4'cm innehållande 50 g neutralt silikagel.(Q,0H¥0,065 mm).5 Man elnerar med etylacetat;l,Härvid ernålles 0,32 g N-arachidonoyl~»a L-alanyl+D¥glutaminayra, som smälter (övergår till en pasta) vid enfd temperatur nära QOOC. f _ _ Produkten ger ett Ef-värde av 0,f0 vid tunnskiktskromatografi på silikagel med användning av en blandning av n-bntanol, pyridin, il ättiksyra och vatten i volvmförhållandet 50:20:6:2H. 57 Hydrokloriden av L~alanyl-D-glutaminsyra kan framställas 7 enligt den metod som har beskrivits av H. NguyenšHuy et al,, Eur.Z J. Bi0chem.' gg, 79 (1976). se p 5 e H Exempel lü; eMan sätter O,§8~cmšfisobutylklorfermiat till en 5 till -IOOC kyld lösning av 0,9Ä g palmitínsyra i HQ cmš tetrahydro~ fnran-och 0,52 cm: trietylamin._ Reaktionsblandningen omröres under 50 minuter¿vid en temperatur mellan 46 pch -8°C, varefter man till- sätter en till o°C kyla lösning av 0,93 g hydrnklqrid av L-a1any1- D-glutaminsyra iden blandning av 20 cmš tetrahydrofuran, 15 cm vatten oeh l,55'cm5ttrietylamin.f Reaktionsblandningen omröres under* 1 timme vid en temperatur nära -6°G och därefter under 20 timmar vid en temperatur nära 20°C.e Reaktionsblandningenxsurgöres_därefter _till pH Qsgenemftillsättning av en ÄN vattenlösning av väteklørid 'ln å» w 53. Å-X ',_medel. _ï9 w 4-62 'eoeh'utspädes,genom tïllsättning av 300 cmš vatten) Den bildade fäll- ningen avskiljes genom filtrering, tvättas tre gånger med totalt 150 omš eter oth torkas,, Man erhåller härvid 1,08 giav ett vitt pulver, vilket löses i 120 cmš kokande etylacetat. Lösningen filtreras i värme. Efiter 20 timmars vila vid ca ROC avskiljes den bildade fäll- ningen genom filtrering, varpå den tvättas tvâ gånger med totalt 200 cmš esyiaqetat och torkas i luft. Man erhåller härvid 0,95 g avsett Wivitt-pulver, vilket man löser i,15 cmš kokande etylacetat. Lösningen filtrerasši värme. Efter 6ü timmars vila vid ca H00 avskiljes den *bildade fâllningen genom filtrering, varpå den tvättas två gånger lmed totalt 20 cm? etylacetat ooh torkas under förminskat tryck' (0,2 mm Hg) vid 50°C.~ Härvid erhålles 0,5 g N-palmitoyl-L-alanyl- D-glutamifisyra med en smältpunkt av 15500. I * _ _ 5 Produkten ger ett Rf-värde av 0,62 vid tunnskiktskromatografi på silikagel med användning av en blandning av n-butanol, pyridin, ättiksyra och vatten i volymförhållandet 50:20:6:2H såsom eluerings- 'Analys: Éeräknat,'%: :C '63,l3: H,= 9,71 N ='6,1üV L 3 Funfieïs %= ,0 *'53=0 - H 59,3 N = 6,2 se Exempel 15. Man sätter 1,95 cm3 isobutylklorformiat till en lösning_avf5,19 g dokosansyra i en blandning av 150 cm: tetrahydro- furan och 2,1 cmš trietylamin, vilken lösning hålles vid 25°C. Reak- itionsblandningen omröres under 20 minuter vid 2500, varefter man till- sätter en lösning av 5,69 g hydroklorid av bensyl-L-alanyl-N-{Pglu-g tamat i en blandning av.33 cm3.1N natriumhydroxidlösning och 1] om) vatten. Reaktionsblandningen omröres under 30 minuter vid 3000 och sedan under-18 simmar vid aa 2o°c.' Man tillsätter sedan 100 cm5, vatten och surgör reaktionsblandningen till pH.1 genom tillsättning av 35 cm; lN saltsyra., Härvid erhålles en.fällning, vilken avskil- jes genom filtrering, tvättas tre gånger med totalt 75 cm3 vatten och torkas under förminskar tryck (9,3 mm Hg) vid 2o°c. iflärvia er-, hålles 6,53 g av ett vitt pulver. Man löser 6_g av detta pulver ii. -50 cm3 tetrahydrofuran innehållande 20 g neutralt silikagel (0,0U- 0,063 mm)Q >Den erhållna blandningen koncentreras till torrhet under förminskat tryck (20 mm Hg) vid 5000. Återstoden anbringas på en Wkolonn, med diametern 3,5 cm innehållande 180 g neutralt silikagel (0,0Ä-0,063 mm), -Man eluerar med i tur-och ordning 1300 cmz av en' blandning av lika_volymdelar_cyk1ohexan och etylacetat, 600 om g ,etylacetat,j500.cm3 av en blandning av etylacetat och tetrahydrofuran ' i volymförhållandet 95:5,,900-cmå.av en blandning av etylaoetat och = 01448 f1ß2 20"' tetnenšdnofufan i voiymförnållanaet*9=i,t8o0 cn3 av en blandning aåfl etylacetat och tetrahydrofuran i volymförhållandet 8:2, 1000 cmš att en blandning av etylacetat och tetrahydrofuran i volymförhållandet, _ Giü; 900 cmš av en blandning av etylacetat och tetranydrofuran>i_fiolym- Q -D-glutamat. förhållandet u:6,"50oecm3 av en blandning av etylanetat och tetnanyq- *är rofuran i vQlymförhållandett2:8 och 600 cm? tetrahydrofuran. }Man ¿ uppsamlàr eluatfraktioner med volymen 100 cmš. Fraktíonerna 17fÉ8 fi) förenas och koncentrerás till torrhet unåer förminskat tryck (20 nm Hg) vid 50qC¿ Härvid erhålles 5,31 g bensyl-N-dokosanoyl-L~alanyl¿ Produkten ger ett rF-värde av 0,541viå_tnnnskiktskromatoêrafi_ 5 på silikage1Ûmed'användníng av en_blandning2av etylacetat och tetra- 7 - hydroïuran i volymförhâllandet 8:2 såsom elueringsmedel¿ 7 ,ExenpeI,16.~lMan-sätter 3*cm5-isobntylklorformíat till en* till -500 kyld lösning av 5,605 g 3-cyklohexanpropionsyra i en bland- ¶ ning av 100 cmš tetrahydroïuran och 3,23 cmz trietylamin. Reektionsf blandningen omröres under 20 minuter vid -590; varefter man tíllsät- I ter en till 500 kyld lösning av 7,96 g hydroklorid av bensyl-L-elaf .W nyl-N*IFglütamat i en blandning ar 46,2 cm3 1N«natríumhydrodilöening och 15,8hcm5lVattenÅ Reaktionšblandningen omröres'under 10 minnterf 1 vid 090 och sedan under 2 timmar vid ca 20°C.l Tetrahydroïuranen av- ecentrateteektraheras två gånger med totalt 80 cm dunstaé därefter under förninskat tryck (20 mn Hg) vid 5000. >Kon* M _ _ _ 3 eter och Suräores ltill pH 1 genom tíllsättning ev 50 cmš 1N saltsyra. Den från reak- tionsblandningen dekanterade oljan extreheras fyra gånger med tdtelt -2OOlcm3 etylacetat, De.organíske faserna förenas, tvättas med 25 cm3 av en mättád natrïumkloridlöšning och torkas över Vattenfritt magnesiunenlfat,. Efter koncentrering till torrhetÛunder_förminSkat tryck (20 mm Hg) vid 5000 erhåller man en*olja, Vilken krístalliserar spnntant.-5 De erhållna kristallerna (7,3 g) löses i no cm3 ättik- 0 syra innehållande 20fg neutralt šilíkagel (0,0H40,063lmm).* Den re-_ 5sulterande blandningen koncentreras till torrhet, och återstoden anj 5 bringas på en kolonn med diametern 2,5 cmiínnehållande 50 g neutralt ll: silíkagel (0¿0Ué0,065 mm). Man elnerar med etylacetat och uppsamlar fraktioner med volymen 100 cmzt Den.fjär0e fraktíonen koncentreras _ till tnrnnefi under förminskat tryck (20 nn Hg) vid u5°c. Man ennäl- - el “ ler härvic'1,86-gebenšy1LN;(5-cyklohexylpropionyl)-L-alanyl-okfD45 7 1 glutamat med en smältpunkt av 126-128ëCÅ Fraktíonerná 3 och 5 före~' nas och koncentreras till torrhet. Det erhållna amorfa fasta ämnet kromatograferas på en kolpnn med Qiametern 2,5 cm ínnehållànde568,g ka' 7-tnentraltlsílikagel (0;0Ä-0,063 mm).¶ Man eluerar först med 520 cme 210 e 4443 462 3 av en bíandning.av lika_Vo1ymdelar cyklohexan och etjlacetat och där- ¿efter med 520'cm3 etylacetat och uppsamlar fraktioner med volymen U0 cm3.¿ Fraktionerna 11-28 förenas och koncentreras till torrhet under förmineget-e;yeka(2o mm Hg) via n5°c.» Men erhåller härviq 1,57,ga ben§yl;N:@}fcyklohexylpropionyl)-L-alanylfflfD-glutamat,medeenfsmält- 'punkt[ev,l2ß-l5c°c.e Produkten ger ett Rf-värde av 0,14 vid tunnekikte- kromatografi på sllikagel med användning av etylacetat såsom,eluerings- medel. _ _ f:¿*, e e ¶ , 0 e 7 ¶ _ 1 _l 4 Exempel 17,e Man sätter §,3 cmšeisobutylklorformiat till en still ~69C kyld lösning av 7,59 g N-(3,5,5-trimetylhexanoyl)-LÄa1anin fíïen blandning ny H00 cm; tetrahydrofuran och H,63 cm: tríetylamln.

Beaktlonsblandningen omröres under 20 minuter rid f6°C; varefter man tillsätter:enstilll3oC,kyld_lösníng av 9,06 g hydroklorid am hensyl- 'OK-D~glutamatei;en blandning av 66;2 cmš 1N natrïumhydroxidlösníng _ och 14"cm?fvatten. =Reaktlonsblandningen_omröres'under_15 minnter 7 vid -5QC och sedan under 66 timmar vid ca 18?C, varefter den_surgöres till pH 1 genom tillsättníng av 75 cm; 1N saltsyra. Tetrahydrofura- men avdunstas under förminskat tryck_(20 mm Hg)_vid 5000. Koncentra- tet extraheras fem gånger med totalt 200 cmšletylacetat. Etylacetat- e U 3 _ e en 'W ïaserna förenas, tvättasfimed H0 cm É0,lN saltsyra och torkas öVer fmagnesïumsnlfat, Efter filtrering och koncentrering av filtratet till terrnet neger förmineketdeeyek (20 mm Hg) vid 5o°c erhåller men "1U,8 g av en olja, vilken man loser i 50 cmšeetylacetat innehållande I jofgenefitraltdsilíkggel (0;QÅè0;06§ mm). Blandningen koncentreras ,till torrhet under förminskat tryck (20 mm Hg) yid 5000. *Återstoef M den anhringas på en kqlonn med dlametern 2,8 cm innehållande 280 g _ neutralt-sílíkagel5(Qe0UfO;O§3lmm)Å Man eluerar med i tur och ord- lning.Zeliter-cyklohexan;_l liter av en.blandning av cyklohexan och eeuy1eeetafi_l{velymförnållenaefie95;5,_1,5 llter av en blandning av e.cyklohexan_och]etylacetat¿i_volymförhållandet 90:10, 5 liter ar en blandning av Qyklohexan Och etylacetat i volymförhållandet 80:20, >1,5eliterflav_en.blanfiningfavtcykloheXan_och etylacetat l volymförhål- landet-T0;50 och 3;5 liter av en;bl§pdning av cyklohexan och etyl- ~acetat;ifvolymförhållandet 50:ÉQ¿ och man uppsamlar fraktioner med volymen 500 cm5.e Fraktionerna 23~29 förenas och koncentreras till dee'uerrhez;under fermlneket tryeg¿(2o mm Hg) vid_5o°c.f Härvid erhålles 10,86, g bensyl-NA-(ï-Z;,.5ßfterimetylhexanoyl)-L-alanyl-CÅ-D-glutamat i form av en.olja som krlstallíserar. ,fÉrodukten ger§ett Rfevårde ar 0,37 vid tunnskíktskromatografie 'j spå síllkagel med användning av etylacetat såsom elueríngsmedel, ' kyld lösning av 7;9i2 g 3,5Q5-trimetylhexansyra i en blandning av '5OC kyld lösning av H,Ä95 g L-alanin i 50 cm ,- _ 'i 22 'N-(};5šöftrimetylhexanovl)FL-alanin kan framställas på föl-» jande sätt; V ' " - ' *" ^ ' Man sätter 6,5-cm; isobutylklorformiat till en till *5°C^ 3 125.om3°tetrahydrofuran och 7 cm trietylamin¿ Reaktionsblandningen omröres under 20 minuter vid -590, varefter man tillsätter en till 5 1N natriumhydroxidlös- aning._ Reaktionsblandningen omröres under 10 minuter vid 000 ooh se- * dan under lö timmar_vid ca 2500. Tetrahydrofuranen avdunstas under eförminskat'trvckg(20 mm Hg) vid 50°C¿ Koncentratetlextraheras två gånger med totalt H0 cm3 eter och surgöres till pH,1 genom tillsätt- i ,ning av 55 cm5:1Nisaltsyra. 2Den bildade oljiga fällningen extraheras g2fem«gånger_med totalt 250 cm; etylacetat. Etylacetatfaserna förenas, 3 tvättas med 25 omg av en mättad natriumkloridlösning och torkas över magnesiumsulfat¿ Efter filtrering och koncentrering av filtratet till '~torrhet under förminskat tryck (20 mm.Hg) vid 5000 erhåller man 1i,79 'g-av en olja, vilken löses i Ä0 cmz etylacetat innehållande 20 g neutralt silikagelj(0,065F0,20 mm);7 Den erhållna blandningen kon-f { nentreras till torrhet under förminskat tryck (20 mm Hg) vid 5000, 7 0: ooh återstoden anbringas på en kolonñ med diametern 3 cm innehållandee 120 ggrieutai-ait siiikagel -(o,o63r-o',2oimm)r. Man einer-armen i tur pen ordning 600 om; cyklohefian¿ 500 cmj av en blandning av cyklohexan och etylacetat i volymförhållandet 95§5, 300 cmš av en blandning av cyklohexan och etylacetat i volymförhållandet 90:10, 300 cmš av en 7 blandning av cyklohexan_oeh etylacetat i volymförhållandet 80É20; _700 cm; av en blandning av cyklohexan och etylacetat i vo1ymförhål~ dlandet 50:50, 300 cm; etylacetat och 300 om år U5°C¿< Man erhåller härvid 10,16 g av en olja, vilken löses i 25 cm ,olja, vilken avskíljes genom dekantering. Efter torkning under för- ihexanoyl)-Lëalanin; 3 av en blandning av ¿ etylacetat och metanol i volymförhållandet 90:10; och man uppsamlar fraktioner med volymen i00Wçm3. _Fraktionerna 17-28 förenas och 7 koncentreras till torrhet-under förminskat tryck (20 mm Hg) vid » 0 0 7 3 eter{ 'Efter tillsättning av ISO cm57petroleumeter, erhålles en f!! minskat tryck (0,2 mm Hg) erhåller man 7¿59 gfN-(§;5,5-trimetyl- FJ 'Produkten ger ett Rfëvårde av 0,Ä3 vid tunnskíktskromatografi -pâ silikagel med användning av etylacetat såsom elueringsmedel. ',f _ Exempel 18. På en tid av 1 timme ooh 10 minuter sätter manug en lösning av 27,5 g suocinimid-2-n-pentvl-3-hydroxinonanoat i 644 cm; 1,2-dimetoxietan till en till 700 kyld lösning av 27,8 g hydro- KFN eklorid av_bensyl-L-alanyl4c(ÄD-glutamat i en blandning av 2H5 om .vatten enn 22,9 nn: firieuyiamin. nneaktionsbiandningen nåiies vid 7'"Etylaoetatfaserna förenas; tvättas två gånger-med totalt 200 cm. ivatten, torkas över natrinmsnlfat och koncentreras till torrnetïunder - förminskat tryok (20 mm Hg) vid 60q¿f Härvid erhålles 17,Ä g ben- 'syl-N?(2-n-pentyl-5-hvdroxínonanoyl)-L-alanyl-M,-D-glutamat i form . _ foljande sått.5 023m 1 i 448 4620, 3 2090 under 20_timmar ooh sedan vid 6090 under 5 timmar. Därefter_ avdunstast1,2-dimetoxietanen under förminskat tryck (20 mm Hg) víd_ ii50?C, ooh koncentratet surgöres till pH_1 genom tillsättning av ii50fem5 1N“saltsyra och extraheras fem gånger med totalt 1,5 liter _ etylacetat.= De organiska_faserna förenas, tvättas tre gånger med .

I _totalt-7S0_om3 vatten;'torkas över natrínmsulfat och koncentrerasrr tfiiiiffiorfhèt:nndengförminskat tryck (20 mm Hg) vid 6o°c. Härvid ¿ernållest58¿6 g av en olja, vilken löses i 200 cm; etylacetat.' _ Till den ernållna lösningen sattes ijig dicyklohexylamin, varpå 'biananingen'får stå vid-Ä°C under 20 timmar. Det bildade vita fasta tämnet avskiljesygenom filtrering, tvättas två gånger med totalt H0 I- cm; etylacetat och två gånger med totalt 200 cm; eter samt torkas under förninskat tryck (20 mn Hg) vid 2o°c. Man erhåller nänyidgv' g22,H g av ett vitt pulver, till vilket man sätter 1,9 g produkt ¿ erhållen på liknande sätt. Blandníngen löses i 500 cm3 vatten, .och till den.erhållna lösningen sättest20O cmš etylacetat och l5Q cmj av en mättad citronsvralösning. Den organiska fasen avskiljes; 3 etylacetatl och vattenfasen extraheras två gånger med totalt H00 cm ' 0 I 3 ut av en beigefärgad pasta.fi '”' 'ÜiProdnkten ger ett Ef-värde av 0,25 vid tunnskiktskromatografi på silikagel med användning av etylacetat såsom elueríngsmedel[ Succinimid-2-nepentyl-5-hydroxinonanoat kan framställas på _ På_en tid av H0'minuter sätter man en lösning-av 27 g di- 0 @yk1nnexy1kanbodiiniq_i0390 çm3 1,2-aimetoxietan till en till o°c _ kv1d_lösning av 29,1 g Eçnrpentyl-Bfhydroxinonansyra och-1§,1 g N-hydroxisuccinímid i 300 cm: 1,2~dímetoxietan. Reaktionsblandning- _en omröres vid 09C'nnder 3 timmar oçh_hålles därefter vid H00 under 21 timmar., Den bildade fällningen,avskiljes genom filtrering och , tvättas två gånger med totalt 100 cm37l,2-dimetoxietan. Filtratet tj koncentreras till torrhet under förminskat tryck (20 mm Hg) vid 5000.

-'Koncentratet'upptages i en.blandning av 300'cm3 isopropyleter och gns'cn3_äfitiksyna;¿tEffién~tyå_cimm¿n»yia 2o°cgavski1¿es den bildade 0 nfäiiningen genom fiifirering och tvättas två gånger med totalt fio_nn3t 4434620 r (24 Äisopropyleter._tfiiltratetfkonoentreras till torrhet under förminskat tryck (20 mm Hg) Vid 5000, Man erhåller härvid 42§6 g succinímidfi' (2-n-nentyl-3-hydroxinonanoat i form av en gul olja.l 12-nšpentyl-34hydroxinonansyra kan framställas enligt den me- tod som har beskrivits av E; Lederer et ai,, Bull, soe§ cnim,e;g§¿, H13. t » r _g_r_. j_-._ de t e 5 I '~ I _» t *Exempel 19.0 Till en lösning av 6,07_g.bensyl#N-t-butyloxi- karbonyl-Ab-D-glutamat i 70 cmz etanol sätter man 12,5 gvav en klor- fin metylerad sampolymerrav styren och divinylbensen (98:2) innehållande iel,2gmilliekVivalenter klor per g. iReaktionsblandningen omröres under (15 minuter vid 2690, Därefter tillsättes 2,25ocm3 triecylamin, och -reaktionsblandningen omröres under 65 timmar vid 7800. Polymeren avfiltreras, tvättas tre gånger med totalt 300bcm5 etanol och tre tgånger med totalt 300'cm3rmetylenklorid samt torkas under förminskat tryck (20 mm-Hg) vid 0090; *Man erhåller härvid 17 g 01-bensyl-N- tfbutyloxikarbonyl-Dfglutamyl-polymer. 'Denna polymer omsättes med ~' alanin; varvid de nedan angivna operationerna genomföres i en reaktor försedd_med enlomrörare ooh vid basen med ett filter av frittat g glas. ik 7 ' in _1 __* ut _ V l g ll ((1) Man genomför tre på varandra följande tvättníngar av I polymeren,7Wæfie gång med 100 cmš metylenklorid. Efter varje tillit sättning av lösningsmedel omröres blandningen under 5 minuter, Vare på polymeren avfiltreras- 0' ,_ _ 1 , (2) Skyddsgruppen-t-butyloxikarbonyl for glutaminsyran av: - lägsnas därefter genom tillsättning av 100 cmš av en blandning at *(0) _tre*gânger 100 cm3 metylenklorid.l lika volymdelar triflüorättiksyra och metylenklorid. Efter omrör- ning under 20 minuter avfiltreras polymeren. 7. *(3) fPolymeren underkastas i tur och ordning följande tvätt- ningar: 3 (a) tre.gånger 100 om ii 3 ,metylenklorid;“ (b) tre gånger l00 cm lmetanol; 0 Efter_varje-tillsättníng av lösningsmedel omröres blandning- (I: en under 3fminuter¿ Varpå fiolymeren avfiltreras; fe(Ä) rPolymeren neutraliseras genom tillsättning av 100 cm; av en blandning av_metylen$lorid och N-metylmorfolin i volfimförhål-_ (_ är landet 9:1. Efter omrörning under 10 minuter avfiltreras polymeren. _f1lt (5) Polymeren tvättas tre gånger med_100'cm§ metylenklorid e ' varje gång. Efter varje tíllsättning ay lösningsmedel omröres bland~, ningen under 3.minnter¿ rarpâlpolymeren avfiltreras. *(6) Till_polymeren sättes först (a) en lösning av 3;78«g - v, ._ i .Ü ,.__, _ _>_ ,_1___. fm A 0-glutamyl-polvmer.: meren r in 25 448 462 r gN-tfbutyloxikarbonvl-0-alanin i 50 cmš metylenklorid, varpå blandning-se gen_omrörés under 10 minuter, och sedan (b) en lösning av Ä,13 g di-- cyklohexylkarbodiimid_i 50 cm3 metylenklorid, varpå blandningen om- -röres-under 20 timmar{ Därefter.avfiltreras polymeren; -g~(7)_~Polymerenïunderkastas i tur och ordning följande tvätt- ~ningar§“ r r r g (a) tre gånger 100 cm3'metylenklorid; (b)r tre gånger l00"cm5'ättiksyra;' I (c) itre gånger 100 cmš metylenklorid.

Efter varje tillsättning av lösningsmedel omröres blandningen - under 3_minuter¿ varpå polymerenuavfíltreras. ~« Man erhåller härvid 01-bensyl¥N#(t-butyloxikarbonyl¿Ljalanyl)- en sålunda erhållna dipeptid~polymeren omsättes med heptaff_r ¶dekansyra,*varvid man upprepar de ovan angivna stegen 1, 2, 3; 4, 0 5; 6 och Z,-dock med följande modifiering av steg 6. I Man tillsätter först_(a) en lösning av 5,U g heptadekansyra 0 i 50 cm; metylenklorid och omrör under 10 minuter och tillsätter' .sedan (b) en lösning av 4,15 g dicyklohexylkarbodiimid i 50_cm5 imetylenklorid och omrör under 20 timmar. Därefter avfiltreras poly- Man erhåller härvid-0i-bensyl-N-(N-heptadekanoyl-L-alanyl)~ _ [ DÉglutamyl4polymer} ' Denna polymer-suspénderas i 100 cmš trifluorättíksyra i'en reaktor försedd med en omrörare och vid basen med ett filter avd "frittat glas. Genom den_erhållna suspensionen leder man en ström* av vätebromid under 90 minuter. Efter avfíltrering av polymeren tvättas denna tre gånger med totalt 300 cmš ättiksyra. Efter varje . tillsättníng av ättiksyrafomröres blandningen under 3 minuter¿ varpå-- polymeren avfilteras. Filtraten förenas och koncentreras till torr- het~unaer förminskat tryak (ao mm Hg) vid 5000. d Den sålunda erhållna återstoden suspenderas i 30 cmš etyl- acetat§ *Efter*filtrering_tvättas det avfiltrerade ämnet tvâ gånger med totalt 6o_çm3_eter apn_rorkas; Man erhåller härvid 1,97 g 0 av ett fast ämne, vilketÉkÉomatograferas på en kolonn med diametern -2¿2 cm innehållande 40~g neutralt siiikagel (o,ou-0,065 mm). 7 Man eluerar med i tur och ordning 350'cm3 av.en blandning av “lika volymdelar cyklohekan och etylacetat,¿H007cm5 etylacetat, 700~f “omš av en blandning av etylacetatvoeh ättiksyra i volymförhållandet ' 95:5, 950 çmš av en blandning av etylacetat och ättiksyra i volym- Jr e~44s 462% 26, förhållandet 90i10, 750 cm; av en blandning av etylaoetat och ättik- syra i volymförhållandet 8Ö:20 och 1,6 liter ättiksyra samt uppsamlar fraktioner med volymen 50 cmj; Fraktionerna 65-94 förenas och kon- centeereras till torrhet under förminskat tryck (20 mm Hg) vid BÖQC, Härvid erhålles 0,88 g N-heptadekanoyl-I-alanyl-Drglutaminsyra.1t Produkten ger ett Rf-vårde av 0,61 vid tunnskiktskromatografi på silikagel med användning.av en blandning av n-butanol, pyridin, ättiksyra och vatten i volymförhållandet 50:20:6;2ü såsom-eluerings- medel. i i ' ll ll Il 5,95 ,5,8 9,85 N i 9=5 N -Analys: Beräknat, %: C 63,80 pH '6o,1 - H ll ll ll Funnet, %:i _ C Sulfataska:,5,6% p' p p p -Föreliggande*uppfinning avser även farmaceutiska kompositio- ner, vilka innehåller minst en förening enligt uppfinningen i kombi- nation med ett eller flera kombinerbara och farmaceutiskt godtagbara I utspädningsmedel eller utdrygningsmedell Dessa kompositioner kan an- vändas antingen såsom vaccinadjuvantia eller såsom medel för icke- specifik stimulering av antiinfektiös och antitumoral immunitet: iNär föreningarna enligt uppfinningen användes såsom vacein-, e adjuvantia, adiministreras de på samma gång som och på samma sätt", som det antigen (virusantigen, bakterieantigen, parasitantigen eller antigen av annan-natur), mot vilket man hos_den.immuniserade indivi- den (människa eller husdjur) önskar öka de eellulära immunitetsreak- tionerna (överkänslighet av fördröjd typ) eller alstringen av oirkuf lerande eller lokala antikroppar. _ I 7 _ 7 De nya föreningarna administreras i relativt låga doser (av storleksordningen mg) i blandning med antigenet, och administre- ringen kan ske intramuskulärt, subkutant, intravenöst, intranasalt _eller'oralt., Om så erfordras kan den nya föreningen och antigenet emulgeras i ett lämpligt oljigt utdrygningsmedel och införas i lipo-I somerna. __' i U år g, _ När de nya föreningarna användes såsom icke-specifika immu- i = nostimulerande medel, administreras deii doser mellan 0,1 och 50.mg/, kg, varvid administreringen genomföres parenteralt (intravenöst, 1subkutant, iñtramuskulärt), intranasalt, oralt, rektalt eller even- in tue11t*intratumora1t., I _, i *Såsom fasta kompositioner för oral administrering kan man an- vända tabletter, pillerg pulver eller granuler. I dessa komposi- tioner är den aktiva föreningen blandad med ett eller flera utspäde ningsmedel, såsom saekaros, laktos eller stärkelse. Dessa komposié 'vä få? xp ' va. injicerbar'lösning i i4 4ß s4 ß2 s _ f fftioner kan även innehålla andra ämnen än utspädningsmedlen,_t.ex. ett smörjmedelg såsom magnesiumstearat. 7 n ' Såsom flytande kompositioner för oral administrering kan man använda farmaceutiskt godtagbara emulsioner, lösningar, suspensioner, siraner eller elixir innehållande inerta utspädningsmedel, såsom vat- ten eller:paraffino1ja,¿ Dessa kompositioner kan även innehålla and- ra ämnen än utspädningsmedlen; t.ex. vätmedel, färgämnen och aromati- iseringsmeäelÅ *e_ Kompositioner för parenteral administrering kan vara sterila _vattenlösningar¿ suspensíoner eller emulsioner. Såsom vehikel kan man i de sistnämnda fallen använda nolyetylenglykol, propylenglykol, vegetabliška oljor, särskilt-olivolja; och injicerbara organiska est- rar¿ t.ex; etyloleat~f_Dessa kompositioner kan även innehålla olika_ ntillsatsmedel, särskilt vätmedel, emulgermedel eller dispergermedel. n Steriliseringen kan genomföras på flera sätt, t.ex. medg hjälp-av ett bakteriologiskt filter, genom att man inblandar sterili- seringsmedel i kompositionen eller genom upphettning.i Man kan även framställa fasta kompositioner, vilka göres sterila t.ex, genom be- 'strålning och vilka kan lösas i sterilt vatten eller dispergeras i ïnägot annat injicerbart sterilt medium, eventuellt.vid användningsf etiiifäiiet. ' i n i n n '¿Kompositioner för intranasal administrering kan utgöras avi sterilanvattenlösningar;'suspensioner eller emulsioner, vilka even-_ tuellt kan innehålla ett kombinerbart drivmedel. 7 V _ Kompositioner för rektal administrering utgöres av supposi-' torier, vilka förutom den aktiva.föreningen kan innehålla utdryg- iningsmedel, såsom kakansmör eller suppositorievax. n e .¿ De nedan angivna, icke begränsande exemplen illustrerar kom-H l positioner enligt'uppfinningen. i i i iExempel A._ Man.framställer på vanligt sätt en lösning avsedd gför intravenös administrering, vilken lösning har följande samman~ sättning:e¥ ' bensyl4L-lauroyl-N-alanyL-Ä-®-glutamat - ' e 9,5 g e n i5 »cm I l Ekempel B. nMan-framställer på vanligt sätt en lösning av- sedd för intravenös administrering, vilken lösning har följande sam- efmansättningí N-palmitoyli-i-Ln-alanylålifln~D-glutaminsyrai i n n i' 0,5 å ' g injicerbar lösning: enn =.e , . f n e 5 koma'

Claims (2)

'i i, 'ir44lßl462 i 11,28 i. d männa formeln 7 ,P'a t e n tik r atv gy

1. Ny dipeptid, kgä n n e t e c k n a df a v natt den har den all- .1 V': V (I) - K : l n-m;nn;w-co c fi»¿%ez lgdyfiäme-Co-ni¿f - 1 _ o à a där anm1flen.n1xmeddwm en aikylgrupp innehållafiae 1-21.k01at0mer' (eventuellt šubstítuerad med en~hydroniF, fenyl- eller cyklohexyl- grnppleller en alfienylgrnpp innehållande 2-19 kolatomer, och där :symbolerna R1, eon kan vara lika eller olika, betecknar en hydroxi-I _grupp, en aminogrupp eller en alkyloxigrupp innehållande 1-4 kol- ~atomer (eventuellt snbstituerad ned en fenylgrupp), varvid alaninen' _föreligger i L-form och glutaminsyran och dess derivat föreligger i D-form, samt metallsalter därav och additionssalter.därav med kvävehaltiga baser. I ' ” l ” '

2. Läkemedel med adjüvansverkanioch icke-specifit immunstimulerande verkan, klä n n ett e clk n a t .a v- att det består av, såsom. aktiv komponent, en dipeptid med den allmänna formeln R ; co _ nu f.cnf- co - mur- CH -.GQ H H1* ,a”e (I) 1 *cH¿ i' f r°“2C“2 * Co ' 31, a ' Öär_SW&ßleHIšb?Uflfl§E$ en alkylgrupp_innehâ1lande_1-21 kolatomer (eventuellt subetiterad med en hydroxi-, fenyl- eller cyklohexyl-i .gruppleller en alkenylgrupp innehållande 2-19 kolatomer, och där *tion med ett eller flera konbinerbara och farmaceutiskt godtagbara symbolerna R1, som kan vara:lika eller olika, betecknar en hydroxi- gruPP, en aminogruPP eller en alkyloxigrnpp innehållande 1-4 kolf atomer (eventuellt substiterad med en fenylgrupp), varvid alaninen föreligger i L-form och glutaminsyran och dess derivat föreligger i D-form, eller ett metallsalt därav eller ett additionssalt därav * . Z i med en kvävenaltig bas, antingen i rent tillstånd eller i kombina- utspädningsmedel eller tillsatsmedel, såsom sackaros, laktos, stäre kelse, magnesiumstearat, vatten, polyetylenglykol, propylenglykol,à *vegetabiliska oljor ocñ injicerbara organiska eetrar.