NL8003760A

NL8003760A - Dipeptiden, werkwijzen ter bereiding ervan, alsmede farmaceutische preparaten die de dipeptiden bevatten.

Info

Publication number: NL8003760A
Application number: NL8003760A
Authority: NL
Original assignee: Rhone Poulenc Ind
Priority date: 1979-06-29
Filing date: 1980-06-27
Publication date: 1980-12-31
Also published as: GB2053232A; GB2053232B; DK154435B; IT1198331B; NZ194177A; ZA803885B; IT8023073A0; LU82568A1; DK154435C; SE8004790L; DK277880A; JPH0159277B2; DE3024355A1; FR2460288A1; AU5969980A; CA1251000A; SE448462B; CH648043A5; US4362716A; FR2460288B1

Description

-j 1 *i, N.O. 29.118 -1-

Dipeptiden, werkwijzen ter bereiding ervan» alsmede farmaceutische preparaten die de dipeptiden bevatten.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op nieuwe dipeptiden met de algemene formule 1, werkwijzen ter bereiding ervan, eventueel hun niet-toxische zouten en farmaceutische preparaten, die de nieuwe dipeptiden bevatten.

5 De bacteriewanden, bijvoorbeeld de mycobacteriewanden zijn in hoofdzaak samengesteld uit een peptidoglycaan gevormd uit N-acetyl-muraminezuur waarop peptiden zijn gefixeerd, die de L Ala-D Glu-DAP-keten bevatten. Aan de andere kant zijn de bacteriewanden zeer rijk aan lipiden, waarvan bepaalde vrij en extraheerbaar zijn en andere 10 gebonden zijn aan de struktuur van de wand en worden gevormd door mycolzuren (a-vertakte en β-gehydroxyleerde reuzevetzuren). Het geheel van de bestanddelen van de celwand vormt een covalente struktuur bestaande uit een peptidoglycaan en een arabinogalactaanrayco-laat met elkaar verbonden door fosfodiësterbindingen. Deze bacterie-15 wanden leveren het grootste deel van de biologische eigenschappen van de gehele cellen op, wanneer zij verenigd zijn met een minerale of plantaardige olie en worden toegediend na in suspensie gebracht te zijn in een fysiologische oplossing.

In de Belgische octrooischriften 821.385, 852.34-8 en 852.34-9 20 zijn peptiden beschreven gekoppeld met N-acetylmuraminezuur, die de L Ala-D Glu- of L Ser-D Glu-keten bevatten en die werkzaam zijn als immunologische toevoegsels en als anti-infektiemiddelen.

In het Franse octrooischrift 75.24440, gepubliceerd onder nummer 2.320.107, worden koppelingsprodukten beschreven tussen een vet-25 zuur en een heptapeptidesaccharide geïsoleerd uit een mycobacterie, die een was MD” bevat en die kan worden voorgesteld door formule 2, waarin in het bijzonder NAG N-acetylglucosamine, NAM N-acetylmuraminezuur en R een alkylgroep met 9-17 koolstofatomen voorstellen.

Deze produkten zijn de immunologische toevoegsels van de pro-30 duktie van antilichamen en van de vertraagde hypersensibiliteit, die in staat zijn alleen te werken, dat wil zeggen zonder dat het noodzakelijk is ze toe te dienen in olieachtige oplossing.

Al deze produkten worden gekenmerkt door de aanwezigheid van N-acetylmuraminezuur, dat volgens KASÏÏM0T0 c.s., Tetrahedron Letters, 35 49, (1978) 4-899, beschouwd wordt als verbonden met de immunologische activiteit.

Gevonden werd nu, dat de peptiden met de algemene formule 1, 800 3760 -2- niettegenstaande de afwezigheid van N-acetylmuraminezuur, opmerkelijke ondersteunende en immunolo-stimulerende eigenschappen bezitten. Aan de andere kant kunnen deze verbindingen» die goed gedefinieerd zijn» gemakkelijk verkregen worden met een voldoende zuiver-5 heid, die vereist is voor therapeutische toepassing.

In de algemene formule 1 stelt fi-CO een vetzuurrest voor en stellen de symbolen B^, die gelijk of verschillend zijn» een hydroxyl- of aminogroep voor of een alkoxygroep met 1-4 koolstofa-tomen eventueel gesubstitueerd met een fenyl- of nitrofenylgroep, 10 met dien verstande dat het alanine [NI^-CHCCH^COOH] in de L-vorm en dat het glutaminezuur [nH2-CH(CH2CH2C00H)C00H] of de derivaten ervan (amiden, esters) in de D-vorm zijn.

In de vetzuurrest B-CO, stelt B een waterstofatoom of een alky lgroep met 1-44 koolstofatomen (eventueel gesubstitueerd met een 15 hydroxyl-, fenyl- of cyclohexylgroep), een alkenylgroep met 2-29 koolstofatomen, die meer dan één dubbele binding kan bevatten of een mycolzuurrest, zoals aangetroffen in de struktuur van de bacteriewand van mycobacterien, van Nocardia of corynebacteriën, voor.

Volgens de onderhavige uitvinding kunnen de nieuwe dipeptiden 20 met de algemene formule 1 verkregen worden volgens de methoden, die in het algemeen gebruikt worden in de peptidechemie. De verschillende reacties worden in het werk gesteld na blokkering door geschikte beschermende groepen van de amine- of zuurfunkties, die niet aan de reactie moeten deelnemen en worden eventueel gevolgd door deblokke-25 ring van deze groepen.

In het algemeen kunnen de nieuwe dipeptiden met de algemene formule 1 verkregen worden door inwerking van een zuur met de algemene formule 3i waarin B zoals hiervoor gedefinieerd is of een geactiveerd derivaat van dit zuur, op een dipeptide met de algemene formule 4, 30 waarin de symbolen B^, die gelijk of verschillend zijn, zoals hiervoor gedefinieerd zijn, eventueel gevolgd, als het geval zich voordoet, als funktie van de betekenissen van B^» door vervanging van één of meer van de groepen B^ door een hydroxyl- of aminogroep.

Wanneer in de algemene formule 4 de groepen B^, die gelijk of 35 verschillend kunnen zijn, een aminogroep of een alkoxygroep met 1 -4 koolstofatomen, eventueel gesubstitueerd met een fenyl- of nitrofenylgroep, voorsteilenman de condensatie van het zuur met de algemene formule 3 met het dipeptide met de algemene formule 4 worden uitgevoerd bij aanwezigheid van een condensatiemiddel, zoals dicy-40 clohexylcarbodiimide, door te werk te gaan in een organisch oplos- 800 3 7 60 I i -3- middel, zoals dichloormethaan of dimethylformamide, bij een temperatuur tussen -10 en +30°C.

Wanneer in de algemene formule 4 de groepen elk een hydroxyl-groep voorstellen of één van de groepen een hydroxylgroep en de 5 andere een amino- of alkoxygroep, zoals hiervoor gedefinieerd, voorstellen, is het noodzakelijk het zuur met de formule 3 voorafgaande aan de inwerking ervan op het dipeptide met de algemene formule 4, te activeren.

Als geactiveerd zuur is het bijzonder doelmatig een zuur halo-10 genide of een gemengd anhydride toe te passen, dat in het algemeen in situ bereid wordt door inwerking van een alkylhalogeenformiaat (bij voorkeur isobutylchloorformiaat) op het zuur met de algemene formule 3 bij aanwezigheid van een base.

Wanneer men het zuur met de algemene formule 3 in de vorm van 15 een halogenide, meer in het bijzonder het chloride, toepast, wordt de reactie uitgevoerd in een organisch oplosmiddel, zoals diëthyl-ether of dichloormethaan, bij aanwezigheid van een base (mineraal, zoals natriumhydroxide, of organisch, zoals triethylamine), bij een temperatuur tussen 0 en 30°C. In het algemeen wordt het dipeptide 20 met de algemene formule 4 toegepast in de vorm van een zout, zoals het chloorhydraat,

Wanneer men het zuur met de algemene formule 3 toepast in de vorm van een gemengd anhydride, wordt de reactie uitgevoerd in een organisch oplosmiddel zoals dioxan, tetrahydrofuran, chloroform, to-25 lueen of dimethylformamide of in een waterbevattend organisch mengsel, bij aanwezigheid van een base (mineraal, zoals natriumhydroxide, of organisch, zoals triethylamine), bij een temperatuur tussen -10 en +30°C. In het algemeen wordt het dipeptide met de algemene formule 4 toegepast in de vorm van een zout, zoals het chloorhydraat.

30 De nieuwe dipeptiden met de algemene formule 1, waarin de sym bolen R.J, gelijk of verschillend, een hydroxyl- of aminogroep voorstellen, kunnen verkregen worden uit een dipeptide met de algemene formule 1, waarin één van de symbolen E1 een hydroxyl-, amino- of alkoxygroep voorstelt, zoals hiervoor gedefinieerd en de andere een 35 hydroxyl- of alkoxygroep voorstelt, zoals hiervoor gedefinieerd, volgens de gebruikelijke methoden, die het mogelijk maken een ester-groep in een carboxyl- of carbamoylgroep of een carboxylgroep in een carbamoylgroep om te zetten.

In het algemeen kan de omzetting van een estergroep tot een car-40 boxylgroep worden uitgevoerd door verzeping onder milde omstandighe- O Π Λ T 7 fifl -4- den of door hydrogenolyse, in het bijzonder, wanneer ten minste één van de symbolen een benzyloxy- of nitrobenzyloxygroep voorstelt.

Wanneer men een hydrogenolyse uitvoert door middel van waterstof, gaat men in bet algemeen te werk in een geschikt organisch op-5 losmiddel, zoals azijnzuur (eventueel gemengd met een ander organisch oplosmiddel, zoals methanol) of in een waterbevattend organisch zuur bij aanwezigheid van een katalysator, zoals palladium, bijvoorbeeld palladium-op-kool, door te werk te gaan bij een temperatuur van ongeveer 20°C en onder een druk van 101 kPa, 10 In het algemeen wordt de omzetting van een ester- of een carbox- ylgroep tot een carbamoylgroep uitgevoerd door middel van watervrije ammoniak in oplossing in een organisch oplosmiddel. Wanneer men de ammoniak laat reageren met een verbinding met de algemene formule 1, waarin ten minste één van de symbolen R^ een alkoxygroep voorstelt, 15 zoals hiervoor gedefinieerd, wordt de reactie doelmatig uitgevoerd door te werk te gaan in methanol. Wanneer men de ammoniak laat reageren met een verbinding met de algemene formule 1, waarin ten minste één van de symbolen R^ een hydroxylgroep voorstelt, is het noodzakelijk vooraf de zuurgroep(en) te activeren, in het algemeen in 20 de vorm van een gemengd anhydride in situ bereid door inwerking van een alkylhalogeenformiaat, zoals isobutylchloorformiaat, daarna te werk te gaan onder de hiervoor beschreven omstandigheden voor de inwerking van een geactiveerd derivaat van een zuur met de algemene formule 3, in de vorm van een gemengd anhydride, op het dipeptide 25 met de algemene formule 4.

Het dipeptide met de algemene formule 4 kan verkregen worden volgens bekende methoden door condensatie van het L-alanine, waarvan de aminegroep beschermd is, met D-glutaminezuur, waarvan de zuur-groepen eventueel beschermd zijn, gevolgd door eliminering van de be-30 schermende groep van de aminegroep.

Volgens de uitvinding kunnen de nieuwe dipeptiden met de algemene formule 1 verkregen worden door inwerking van een derivaat van het L-alanine met de algemene formule 5* waarin R zoals hiervoor gedefinieerd is, op een derivaat van het D-glutaminezuur met de alge-35 mene formule 6, waarin de symbolen R^, gelijk of verschillend, zoals hiervoor gedefinieerd zijn, eventueel gevolgd, wanneer het geval zich voordoet afhankelijk van de betekenissen van R^, door vervanging van één of beide groepen R^ door een hydroxyl- of aainogroep.

Het is bijzonder doelmatig de zuurgroep van het L-alaninederi-40 vaat met de algemene formule 5 te activeren, in het algemeen in de 800 3 7 60 -5- vorm van een gemengd anhydride in situ bereid voorafgaande aan de inwerking op de verbinding met de algemene formule 6, in het bijzonder wanneer ten minste één van de symbolen R^ een hydroxylgroep voorstelt. Wanneer de zuurgroepen van het D-glutaminezuur beschermd 5 zijn, dat wil zeggen wanneer de symbolen R1, gelijk of verschillend, een aminogroep of een alkoxygroep zoals hiervoor gedefinieerd voorstellen, kan de condensatie van het zuur met de algemene formule 5 met het D-glutaminezuurderivaat met de algemene formule 6 worden uitgevoerd bij aanwezigheid van een condensatiemiddel, zoals dicy-10 clohexylcarbodiimide.

In het algemeen wordt de condensatie van het L-alaninederivaat met de algemene formule 5 met het D-glutaminezuurderivaat met de algemene formule 6 uitgevoerd onder de hiervoor beschreven omstandigheden voor de condensatie van het zuur met de algemene formule 3 met 15 het aminozuur met de algemene formule

Het L-alaninederivaat met de algemene formule 5 kan verkregen worden door inwerking van een zuur met de algemene formule 3 of een geactiveerd derivaat van dit zuur op het L-alanine, waarvan de zuur-groep eventueel beschermd is in de vorm van een ester, gevolgd door, 20 indien het geval zich voordoet, eliminering van de beschermende groep van de zuurgroep.

Wanneer de zuurgroep van het L-alanine beschermd is, wordt de condensatie van het zuur met de algemene formule 5 in bet algemeen uitgevoerd bij aanwezigheid van een condensatiemiddel, zoals dicy-25 clohexylcarbodiimide, door te werk te gaan in een organisch oplosmiddel, zoals dichloormethaan of dimethylformamide, bij een temperatuur tussen -10 en +30°C.

Wanneer de zuurgroep van het L-alanine vrij is, is het noodzakelijk het zuur met de algemene formule 3 voorafgaande aan de inwer-30 king op het L-alanine te activeren. Als geactiveerd derivaat van het zuur met de algemene formule 3, is het bijzonder doelmatig een zuur-halogenide of een gemengd anhydride te gebruiken. Hen gaat dan te werk onder de hiervoor beschreven omstandigheden voor de inwerking van een zuur met de algemene formule 3 op een dipeptide met de alge-35 mene formule 4.

Volgens de uitvinding kunnen de nieuwe verbindingen met de algemene formule 1, waarin de symbolen R^, gelijk of verschillend, een hydroxyl- of aminogroep voorstellen, waarvan ten minste één een hydroxy lgroep is en B zoals hiervoor gedefinieerd is, verkregen worden 40 volgens de peptidesynthese van Merrifield in de vaste fase.

800 37 60 -6-

Volgens de uitvinding kunnen de verbindingen met de algemene formule 1, zoals hiervoor gedefinieerd, verkregen worden onder verwezenlijking van de reeks volgende fasen: 1) fixatie van de a- of jf-carboxylgroep van het D-glutamine- 5 zuur, waarvan de aminogroep beschermd is en waarvan de y~ of a-car-boxylgroep, afhankelijk van het geval, beschermd is in de vorm van een amide of ester, op een geschikte drager, 2) eliminatie van de beschermende groep van de aminegroep zonder te raken aan de binding glutaminezuur-drager en, eventueel, aan 10 de estergroep van de tweede carboxylgroep van het D-glutaminezuur, 3) condensatie van het L-alanine, waarvan de aminegroep beschermd is door een geschikte beschermende groep met het D-glutaminezuur gefixeerd op zijn drager, k) eliminatie van de beschermende groep van de aminegroep van 15 de L-alaninerest zonder te raken aan de binding D-glutaminezuur-drager en, eventueel, aan de estergroep van de tweede carboxylgroep van het D-glutaminezuur, 5) condensatie van het vetzuur met de verkregen dipeptide-dra- ger, 20 6) verbreken van de binding D-glutaminezuur-drager met eventu eel eliminatie van de beschermende groep van de a- of X-carboxyl-groep van het glutaminezuur en 7) afscheiding van het aldus verkregen dipeptide met de algemene formule 1.

25 De dragers, die bijzonder goed geschikt zijn, zijn de gechloor- methyleerde of gehydroxymethyleerde styreen-divinylbenzeencopolyme-ren. Bij voorkeur worden de gechloormethyleerde styreen-divinyl-benzeen (98-2 of 99-1) copolymeren toegepast.

De fixatie van het geschikt beschermende D-glutaminezuur op de 30 gechloormethyleerde drager wordt uitgevoerd volgens de gebruikelijke methoden door het aminozuur in oplossing in een organisch oplosmiddel, zoals ethanol, te laten reageren met de hars bij aanwezigheid van een organische base zoals triethylamine. Het is bijzonder doelmatig het reactiemengsel te verwarmen tot een temperatuur nabij 35 de kooktemperatuur van het oplosmiddel.

De beschermende groepen van de aminegroep en, eventueel één van de zuurgroepen van het D-glutaminezuur moeten zodanig worden gekozen, dat de eliminatie van de beschermende groep van de aminegroep verloopt zonder te raken aan de aminozuur-dragerbinding en aan de be-ifO schermende groep van de zuurgroep.

800 3 7 60 * * -7-

In het algemeen is de zuurgroep van het D-glutaminezuur, die beschermd moet worden, in de vorm van de benzylester, die in zuur milieu geëlimineerd wordt door middel van bijvoorbeeld een mengsel van watervrij waterstofbromide en trifluorazijnzuur en de bescher-5 mende groep van de aminegroep is de tert.butyloxycarbonylgroep, die bijvoorbeeld geëlimineerd wordt door middel van een mengsel van trifluorazijnzuur en dichloormethaan.

Het L-alanine, waarvan de aminegroep beschermd is, bij voorkeur met een tert.butyloxycarbonylgroep, wordt gecondenseerd met de 10 D-glutaminezuur-drager volgens de gebruikelijke methoden, die in de peptidechemie worden toegepast.

In het algemeen wordt de reactie uitgevoerd bij aanwezigheid van een condensatiemiddel, zoals dicyclohexylcarbodiimide, in een organisch oplosmiddel zoals dichloormethaan.

15 De eliminatie van de beschermende groep van de aminegroep van de L-alanylrest wordt uitgevoerd onder de hiervoor aangegeven omstandigheden voor de eliminatie van de beschermende groep van de aminegroep van het D-glutaminezuur.

Het vetzuur wordt gecondenseerd met de aldus verkregen dipepti-20 de-drager volgens gebruikelijke methoden en in het bijzonder volgens de methode, die hiervoor is aangegeven voor de condensatie van het L-alanine met de D-glutaminezuur-drager.

Het verbreken van de binding D-glutaminezuur-drager, die van de benzyleste^aard is, en eventueel de eliminatie van de beschermende 25 groep van de carboxylgroep van het D-glutaminezuur worden in het algemeen gelijktijdig uitgevoerd. Bij voorkeur past men een watervrij mengsel van waterstofbromide en trifluorazijnzuur toe.

Het produkt met de algemene formule 1 wordt van het reactiemeng-sel gescheiden volgens gebruikelijke methoden. De drager wordt ge-30 scheiden door filtratie en het dipeptide met de algemene formule 1 wordt van het filtraat gescheiden na concentratie tot droog en na zuivering volgens fysisch-chemische methoden.

Volgens een variant van de hiervoor beschreven werkwijze is het mogelijk met de D-glutaminezuur-drager het L-alanine te condenseren, 35 waarvan de aminegroep beschermd is door een vetzuurrest, zoals hiervoor gedefinieerd. Onder deze omstandigheden leidt de condensatie van het L-alanine met de D-glutaminezuur-drager direkt tot de verbinding met de algemene formule 1, die gescheiden wordt na verbreking van de binding D-glutaminezuur-drager en eventuele eliminatie kO van de beschermende groep van de zuurgroep van het D-glutaminezuur.

800 3 7 60 -8-

Volgens een andere variant van de hiervoor beschreven werkwijze is het mogelijk op de geschikte drager het dipeptide te fixeren, dat afkomstig is van de condensatie van het L-alanine met het D-glutami-nezuur, gevolgd door het condenseren van het vetzuur met het aldus 5 gefixeerde dipeptide en tenslotte het verkregen produkt te scheiden. Tijdens de fixatie van het dipeptide op de drager is het noodzakelijk de aminegroep van de L-alanylrest en eventueel de a-zuurgroep van het D-glutaminezuur te beschermen door toepassing van bij voorkeur de hiervoor aangegeven beschermende groepen. Onder deze omstan-10 digheden leidt de condensatie van het vetzuur met het op zijn drager gefixeerde dipeptide, waarvan de beschermende groep van de aminegroep is geëlimineerd, direkt tot de verbinding met de algemene formule 1, die na verbreking van de binding D-glutaminezuur-drager en eventuele eliminatie van de beschermende groep van de zuurgroep van 15 het D-glutaminezuur, wordt gescheiden.

De nieuwe dipeptiden met de algemene formule 1 kunnen eventueel gezuiverd worden volgens fysische methoden, zoals kristallisatie of chromatografie.

De nieuwe verbindingen volgens de uitvinding kunnen worden om-20 gezet tot metaalzouten of additiezouten met stikstof bevattende basen afhankelijk van de aard van de substituent R^.

De metaalzouten en de additiezouten met organische basen kunnen verkregen worden door inwerking van de nieuwe verbindingen met de basen in een geschikt oplosmiddel. In het algemeen lost men de verbin-25 ding in water op door toevoeging van de theoretische hoeveelheid base,. waarna men de verkregen oplossing lyofiliseert.

De nieuwe verbindingen volgens de uitvinding zijn ondersteu-ningsmiddelen en stimuleringsmiddelen van de immuniteit! zij verhogen de hypersensibiliteitsreacties en/of de produktie van circuleren-30 de antilichamen ten opzichte van de antigenen, waarmee zij worden * toegediend en zij stimuleren op niet specifieke wijze de verdedi-gingsreacties tegen bepaalde infekties (bijvoorbeeld de infektie van de muis met de intracellulaire bacterie Listeria monocytogenes).

In vitro zijn zij actief bij molaire concentraties, die in het -3 -8 35 algemeen liggen tussen 10-^ en 10 , in het bijzonder bij de volgen de proeven! - stimulering van de ADN-synthese (mitogeen vermogen) volgens de techniek van G. MARCHAL, Ann. Immunol. (Inst. Pasteur), 125 C (1974), 519» 40 - stimulering'van de allogene reactie (histo-onverenigbaarheidsre- 8003760 -9- actie) volgens de techniek van S.W. DUTTON, J. exp. Med., 122, (1966), 759 en A.B. PECK en F.H. BACH, J. Immunol. Methods, 3, (1973)t 147, - stimulering van de antilichaamproduktie volgens de techniek van 5 Ρ.Ή, KLESIÏÏS, Proc. Soc. exp. Biol. Med. (N.Y.), T35 (1970), 155 en H. VAN DIJK en N. BLOKSMA, J. Immunol. Methods, 14 (1977), 325, - vermeerdering van het aantal fagocytaire macrofagen volgens de techniek van J. MICHL c.s., J. exp. Med., 144 (1976), 1465, - stimulering van de zure fosfatase en N-acetylglucosamidinase-acti-10 viteit (lysosomiale enzymen van de macrofagen) bij afwezigheid van een vermeerdering van het melkdeshydrogenase volgens de techniek van P. DAVIES c.s., J. exp. Med., 139 (1974), 1262.

In vivo bij de muis bij doseringen tussen 1 en 30 mg/kg verhogen zij de vertraagde hypersensibiliteit en de antilichaamproduktie 15 in het bijzonder volgens de techniek van T.E. MILLEE c.s., J. Nath. Cancer Inst., 51,, (1973), 1669.

Bij de cavia vermeerderen zij de hypersensibiliteitsreactie en de produktie van antilichamen tegen rundergammaglobuline gekoppeld met dinitrofenolhapteen volgens de techniek van F. FLOC'H c.s., 20 Immunol. Communie., 7 (1978), 41.

Bij de muis stimuleren zij de verdedigingsreacties tegen de in- % fektie van de muis met Listeria monocytogenes bij doseringen tussen 1 en 100 mg/kg volgens de techniek van R.M. FAUVE en B. HEVIN, C.R, Acad. Sci. (D), 285 (1977), 1389.

25 Bij de muis stimuleren zij het elimineringsvermogen van de col- loïdale koolstof door het reticulo-endotheliale systeem volgens de techniek van B.N. HALPERN c.s., Ann. Institut Pasteur, 80 (1951), 582.

Bij het konijn, bij doseringen in het algemeen gelegen tussen 30 0,1 en 3 mg/kg, stimuleren zij de vorming van serumachtige^SnlSVi-rusgroep antilichamen volgens de techniek van G.H. WERNER c.s., Biomedicine, 22, (1975), 440.

Van zeer bijzonder belang zijn de verbindingen met de algemene formule 1, waarin de symbolen R^, gelijk of verschillend, een hy-35 droxyl- of aminogroep of een benzyloxygroep en R een alkanoyl- of alkenoylgroep met 8-20 koolstofatomen, voorstellen.

De volgende voorbeelden, die als niet^^Srkend zijn gegeven, laten zien hoe de uitvinding in de praktijk kan worden gebracht.

De verkregen verbindingen kunnen complexen vormen met alkalime-40 taal- en aardalkalimetaalzouten; het gevolg is, dat de resultaten 8003760 -10- van de elementairanalyse van de verbindingen duidelijk kan afwijken van de theoretische waarden. Evenwel wordt de struktuur van de verbindingen bevestigd door de verhouding C/N, die in overeenstemming is met de theorie, door het gehalte aan aminozuren en door hun 5 homogeniteit bij chromatografie over een dunne laag silicagel. Voorbeeld I.

Aan een oplossing van 12,75 g van het chloorhydraat van benzyl 3 L-alanyl-a-D-glutamaat in 75 cnr 1N natriumhydroxide, voegt men gelijktijdig in 37 minuten 8 g lauroylchloride opgelost in 75 cm3 10 ether en 37»4 cm^ 1N NaOH toe op een zodanige wijze, dat de pH van het reactiemengsel tussen 8 en 9 gehouden wordt. Het mengsel wordt één uur en 20 minuten geroerd. Na het decanteren wordt de waterbe-vattende fase op een pH van 2 gebracht door toevoeging van 60 cm3 3 1N waterstofchloride en driemaal met in totaal 300 cm ethylacetaat 15 geëxtraheerd. De verenigde organische extrakten worden met 25 cm^ water gewassen, met watervrij natriumsulfaat gedroogd en tot droog geconcentreerd onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 45°C. Men verkrijgt op deze wijze 7,4 g van een witte vaste stof, die men aan een chromatografische behandeling onderwerpt over 80 g neutraal si-20 licagel aanwezig in een kolom met een diameter van 2 cm. Men elueert achtereenvolgens met 100 cm^ van een mengsel van ethylacetaat en methanol in de volumeverhouding 8 : 2 en 200 cm^ van een mengsel van ethylacetaat en methanol in gelijke volumeverhouding, waarbij men frakties van 50 cm3 wint. De fraktie 1 wordt tot droog geconcentreerd 25 onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 45°C. Men verkrijgt op deze wijze 2 g benzyl N-lauroyl L-alanyl-a-D-glutamaat, dat bij 130°C smelt. De frakties 2 - 4 worden op dezelfde wijze tot droog geconcentreerd en aan een chromatografische behandeling onderworpen over 100 g neutraal silicagel (0,063 - 0,20 mm) aanwezig in een kolom met 30 een diameter van 2 cm. Men elueert met 250 cm-* aceton onder het win- 3 nen van frakties van 25 ca . De frakties 1 en 2 worden tot droog geconcentreerd onder een verminderde druk* van 2,7 kPa bij 45°C« Men verkrijgt op deze wijze 4,07 g benzyl N-lauroyl L-alanyl-a-D-glutamaat, dat bij 130°C smelt, waarvan de eigenschappen de volgende zijn: 35 Bi = 0,9 [silicagel; n-butanol-pyridine-azijnzuur-water (50/20/ 6/24 in volumedelen)].

Analyse berekend % C 66,10 H 8,63 N 5,71 gevonden C 66,.3 H 8,8 N 5*6.

Het ichloorhydraat van* 'ii-üianyl-a-D -glutamaat kan op de 40 volgende wijze bereid worden: 800 37 60 -11-

Men lost 97,16 g benzyl N-tert.butyloxycarbonyl L-alanyl-a-D-glutamaat op in 970 cm^ van een watervrije oplossing van 1,7N water-stofchloride in azijnzuur. Men roert gedurende 2 uren, daarna voegt men snel 3,8 liter watervrije ether toe en men laat gedurende 2 uren 5 bij 0°C met rust. Het olieachtige neerslag, dat wordt gevormd,wordt fcheiden van de bovenstaande laag door decanteren, wordt opgelost in 500 cm^ aceton; de aldus verkregen oplossing wordt onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C tot droog geconcentreerd. Men verkrijgt op deze wijze 88,9 g van het chloorhydraat van benzyl L-ala-10 nyl-a-D-glutamaat.

Het benzyl N-tert.butyloxycarbonyl L-alanyl-a-D-glutamaat kan bereid worden volgens de methode van E. BRICAS c.s., Biochemistry 9, (1970), 823.

Voorbeeld II, 15 Men voegt 31 cm^ isobutylchloorformiaat toe aan een oplossing, gehandhaafd op een temperatuur van ongeveer 10°C, van 47,75 g lau-rinezuur in 3 liter dioxan en 33»3 cm triëthylamine. Het mengsel wordt gedurende 20 minuten bij 10°C geroerd, daarna voegt men in 10 minuten een tot 10°C gekoelde oplossing van 88,95 g van het chloor- 20 hydraat van benzyl L-alanyl-a-D-glutamaat, in een mengsel van 1 li- 3 3 ter dioxan, 476 cnr water en 476 cm 1N natriumhydroxide toe. Het mengsel wordt één uur bij 10°C geroerd, daarna gedurende 18 uren bij een temperatuur van ongeveer 20°C; het mengsel wordt vervolgens verdund door toevoeging van 4 liter water, op een pH van 2 gebracht 25 door toevoeging van 1N waterstofchloride (ongeveer 475 cm^) en 2 uren op 0°C gehouden. Het verkregen neerslag wordt door filtratie afgescheiden, achtereenvolgens^g^wassen i/a^e5o8ncm^ ether, daarna onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 20°C gedroogd. Het pro-dukt wordt gesuspendeerd in 800 cm^ ether, gedurende één uur geroerd, 30 door filtratie afgescheiden en tweemaal met. in totaal 200 cm^ ether gewassen# Na drogen onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 20°G verkrijgt men 71,79 g benzyl N-lauroyl L-alanyl-a-D-glutamaat, dat bij 130°C smelt.

Rf = 0,77 [silcagel; ethylacetaat-methanol (4/1 in volumedelen)]. 35 Voorbeeld III.

Men voegt druppelsgewijze in 30 minuten 5,49 g lauroylchloride opgelost in 150 cm^ dichloormethaan toe aan een tot ongeveer 5°C gekoeld mengsel van 8,46 g van het chloorhydraat van benzyl L-alanyl-D-glutaminaat in 300 car dichloormethaan en 4,3 cnr triëthylamine.

40 Men roert het reactiemengsel gedurende 2,25 uren bij ongeveer 20OC, 8003760 -12- daarna extraheert men driemaal met in totaal 1^,00 cm3 water. Men concentreert de organische fase tot ongeveer 100 cm^ onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 40°G. Het gevormde neerslag in het concentraat wordt door filtratie afgescheiden en gewassen. Men verkrijgt op 5 deze wijze 5»3 g van een wit poeder, waaraan men 0,8 g van een pro-dukt bereid onder dezelfde omstandigheden toevoegt. Het mengsel wordt in 100 cm^ kokende methanol opgelost en de verkregen oplossing wordt 3 uren bij 0°C met rust gelaten. De gevormde kristallen worden door filtratie afgescheiden en onder een verminderde druk van 0,027 10 kPa bij 50°C gedroogd. Men verkrijgt op deze wijze 4,64 g benzyl N-lauroyl L-alanyl-D-glutaminaat, dat bij 182°C smelt.

Hf = 0,80 [silicagel; ethylacetaat-methanol (1/1 in volumedelen)]

Analyse: berekend %·, C 66,23 H 8,85 N 8,58 gevonden : C 66,1 H 8,8 N 8Λ.

15 Het chloorhydraat van benzyl L-alanyl-D-glutaminaat kan op de volgende wijze bereid worden:

Men lost 5*2 g benzyl N-tert.butyloxycarbonyl L-alanyl-D-gluta-minaat op in 60 car van een watervrije oplossing van 1,7N waterstof-chloride in azijnzuur. Men roert gedurende één uur, waarna men het 20 reactiemengsel in 300 cm^ ether giet. Men decanteert de etherfase.

Men voegt één liter ether toe aan de achterblijvende gom, die men fijnwrijft, men decanteert opnieuw de ether bevattende fase en men neemt het residu op met 200 cm^ methanol. De verkregen oplossing wordt onder een verminderde druk van 2,7 kPa en daarna 0,027 kPa bij 25 50°C gedroogd. Men verkrijgt op deze wijze 4,3 g van het chloorhydraat van benzyl L-alanyl-D-glutaminaat in de vorm van een schuim.

Het benzyl N-tert.butyloxycarbonyl L-alanyl-D-glutaminaat kan bereid worden volgens de methode van S. KUSUM0T0 c.s., Buil. Chem.

Soc. Japan, 49, (1976), 533.

30 Voorbeeld IV.

Men lost 3,7 g benzyl N-lauroyl L-alanyl-D-glutaminaat op in een mengsel van 1 liter methanol, 400 cm azijnzuur en 40 cm water. Men voegt 3,7 g palladium-op-kool toe (3# palladium) en men laat een langzame waterstofstroom gedurende 2 uren doorstromen. Men filtreert 35 bet reactiemengsel en het filtraat wordt verdund door toevoeging van 3 liter water. Men scheidt het onoplosbare bestanddeel door filtra--tie en droogt onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C. Men verkrijgt op deze wijze 2,3 g N-lauroyl L-alanyl-D-glutamine, dat bij 170 - 172°C smelt.

40 Hf = 0,83 [silicagel; methanol].

8003760 -13-

Analyse: berekend 96: C 60,12 Η 9»33 N 10,52 gevonden i C 60,1 H 8,8 N 10,5.

Voorbeeld V.

Men lost 500 mg benzyl N-lauroyl L-alanyl-a-D-glutamaat op in 3 5 25 cm van een mengsel van methanol, azijnzuur en water in de volu-meverhouding 25*1*1. Men voegt 500 mg palladium-op-kool (396 palladium) toe, waarna men een langzame waterstofstroom gedurende 2 uren laat doorstromen. Men filtreert het reactiemengsel en het filtraat wordt onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij ^5°C gedroogd. Men 10 verkrijgt op deze wijze ^60 mg van een wit-crèmeachtige vaste stof, waaraan men 690 mg van een produkt onder dezelfde omstandigheden be- 3 reid toevoegt. Het mengsel wordt opgelost in 10 cm kokende methanol en aan de aldus verkregen oplossing voegt men 5 cm^ water toe. Na 20 uren rust bij ongeveer 20°C worden de verschenen witte kristallen 15 door filtratie afgescheiden, met 5 cm·^ van een mengsel van methanol en water in de volumeverhouding 2:1 gewassen en daarna onder een verminderde druk van 0,027 kPa bij 50°C gedroogd. Men verkrijgt op deze wijze 770 mg N-lauroyl L-alanyl-D-glutaminezuur, dat bij 138 - 142°C smelt.

20 Rf s 0,6l [silicagel; n-butanol-pyridine-azijnzuur-water (50/20/ 6/2b in volumedelen)].

Analyse: berekend %: C 59.98 Η 9.06 N 6,99 0 23.97 gevonden i C 59.7 H 9*0 N 7.3 0 2^,1.

Voorbeeld VI, 3 o

25 Men voegt 2,5^ cm isobutylchloorformiaat toe aan een op 0 C

3 gehouden oplossing van 3,9 g laurinezuur in 156 cm watervrije tolueen en 2,7 cm^ triëthylamine. Het mengsel wordt gedurende 20 minuten bij 0°C geroerd, daarna voegt men een tot 0°C gekoelde oplossing van 6,7 g van het chloorhydraat van benzyl L-alanyl-D-isoglutaminaat in 3 3 30 52 cm water en 2,7 cm triethylamine toe. Het reactiemengsel wordt gedurende 65 uren bij een temperatuur van ongeveer 20°C geroerd. Men verkrijgt een reactiemassa met een gelatineus uiterlijk, waaraan men 150 cm^ ethylacetaat toevoegt. Het neerslag wordt door filtratie afgescheiden, met 30 cm^ water gewassen en daarna gedroogd. Men ver-35 krijgt 7,6 g benzyl N-lauroyl L-alanyl-D-isoglutaminaat in de vorm van een wit poeder. De waterbevattende fase van het voorafgaande filtraat wordt tweemaal met in totaal 100 cm^ ethylacetaat geëxtraheerd, deze ethylacetaatfase wordt verenigd met de organische fase van het 3 3 filtraat, met 125 cm 0,1N waterstofchloride en 120 cm water gewas- bQ sen, met magnesiumsulfaat gedroogd en daarna onder een verminderde finn t 7 -14- druk van 2,7 kPa bij 50°C tot droog geconcentreerd. Men verkrijgt 1,5 g benzyl N-lauroyl L-alanyl-D-isoglutaminaat. Het produkt (7,6 g 3 en 1,5 g) wordt herkristalliseerd uit 120 cm methanol. Men verkrijgt op deze wijze 6,6 g benzyl N-lauroyl L-alanyl-D-isoglutami-5 naat, dat bij 169°C smelt.

Kf a 0,15 [silicagel; ethylacetaat].

Het chloorhydraat van benzyl L-alanyl-D-isoglutaminaat kan bereid worden volgens de methode van S. KUSUMOTO, Buil. Chem. Soc.

Japan 49 (1976), 533.

10 Voorbeeld VII.

Men lost 6,6 g benzyl N-lauroyl L-alanyl-D-isoglutaminaat op in z 330 cnr azijnzuur. Men voegt 6,6 g palladium-op-kool (3% palladium) toe, daarna laat men een langzame stroom waterstofgas gedurende 2 uren doorstromen. Na filtratie van het reactiemengsel giet men het 15 filtraat in 3 liter water. Na 2 uren bij 0°C met rust gelaten te zijn wordt het verschenen neerslag door filtratie afgescheiden, twee-maal met in totaal 80 cm water gewassen en daarna gedroogd. Men verkrijgt op deze wijze 5»16 g produkt, waaraan men 0,5 g van een onder analoge omstandigheden verkregen produkt toevoegt. Dit mengsel wordt 3 20 in 90 cm kokende methanol opgelost en aan de verkregen oplossing 3 voegt men 45 cm water toe. Na 2 uren op een temperatuur van ongeveer 20°C te zijn gehouden worden de verschenen kristallen door fil- 3 tratie afgescheiden, tweemaal met in totaal 60 cm water gewassen en onder een verminderde druk van 2,7 kPa gedroogd. Men verkrijgt op de-25 ze wijze 5*1 g N-lauroyl L-alanyl-D-isoglutamine, dat bij 163°C smelt.

fif s 0,l8[silicagel; ethylacetaat-methanol (4/1 in volumedelen)]. Analyse: berekend %i C 60,12 Η 9»33 N 10,52 gevonden : C 60,2 H 9*5 N 10,9.

30 Voorbeeld VIII.

3 o

Men voegt 0,53 cm isobutylchloorformiaat toe aan een op -10 C

gehouden oplossing van 2 g benzyl N-lauroyl L-alanyl-a-D-glutamaat 3 3 in 20 cm chloroform en 0,57 cm triethylamine. De oplossing wordt gedurende 15 minuten bij -10°C tot -2°C geroerd, waarna men een 35 stroom ammoniak door het reactiemengsel gedurende ongeveer 6 uren laat stromen. Men laat vervolgens gedurende 68 uren bij ongeveer 20°C met rust. Men concentreert het reactiemengsel tot droog onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C. Men neemt het residu op met 50 cm^ kokende isopropanol. Een zeer luchtig onoplosbaar bestand-40 deel wordt door filtratie afgescheiden. Na afkoeling van het fil- 8003760 -15- traat gedurende 2 uren tot 0°C wordt het verschenen neerslag door filtratie afgescheiden en daarna gedroogd. Men verkrijgt 0,69 g N-lauroyl L-alanyl-D-glutamamide, dat bij 226 - 228°C smelt.

Rf s 0,75[silicagel; ethylacetaat-methanol (1/1 in volumedelen)]. 5 Analyse: berekend % : C 60,2? H 9i61 N 14,06 gevonden : C 5913 H 9»6 N 14-,1.

Voorbeeld IX.

3 o

Men voegt 0,79 cm isobutylchloorformiaat toe aan een op -5 C

gehouden oplossing van 1,09g 5-fenylvaleriaanzuur in een mengsel van 3 3 10 50 car tetrahydrofuran en 0,86 cm triethylamine. Het mengsel wordt gedurende 35 minuten bij een temperatuur van ongeveer -5°C geroerd, daarna voegt men een tot 0°G gekoelde oplossing van 2,1 g van het chloorhydraat van benzyl L-alanyl-a-D-glutamaat in 50 cm^ tetrahydrofuran, 10 cm^ water en 1,72 cm^ triethylamine toe. Het reactie-15 mengsel wordt gedurende 20 uren bij ongeveer 20°C geroerd en daarna tot droog geconcentreerd onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij o 3 40 C. Het verkregen residu wordt in 100 cm water opgelost en de verkregen oplossing wordt op een pH van 2 gebracht door toevoeging van een oplossing van 1N waterstofchloride. Het verschenen neerslag 3 20 wordt door filtratie afgescheiden, tweemaal met in totaal 50 cm water en tweemaal met in totaal 50 cm^ ether gewassen. Na drogen verkrijgt men op deze wijze 1,9# g benzyl N-(5-fenylvaleryl) L-alanyl-a-D-glutamaat, dat bij 128°C smelt.

fif = 0,72 [silicagel; n-butanol-pyridine-azijnzuur-water (50/ 25 20/6/24 in volumedelen)].

Voorbeeld X.

Men lost 1,8 g benzyl N-(5-fenylvaleryl) L-alanyl-a-D-glutamaat in 100 cm^ azijnzuur op. Men voegt 1,8 g palladium-op-kool (3# palladium) toe en men laat een waterstofstroom gedurende 4 uren door-30 stromen. Men filtreert het reactiemengsel. Het filtraat wordt tot droog geconcentreerd onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 6o°C. Het residu wordt opgenomen met 100 cm^ kokende ethylacetaat; het onoplosbare bestanddeel wordt door filtratie verwijderd. Het verkregen filtraat wordt verdund door toevoeging van 400 cm^ diisopropylether.

35 Na 2 uren bij 0°C met rust te zijn gelaten worden de verschenen kristallen door filtratie afgescheiden en gedroogd. Men verkrijgt op deze wijze 0,66 g N-(5-fenylvaleryl) L-alanyl-D-glutaminezuur, dat tussen 135°C en 140°C smelt (pasteuze smelting).

Rf s 0,55 [silicagel; n-butanol-pyridine-azijnzuur-water (50/ 40 20/6/24 in volumedelen)].

8003760 -16-

Analysei berekend %i C 60,31 H 6,93 N 7^0 gevonden : C 60,3 H 7,1 N 7,^*

Voorbeeld XI.

3 o

Men voegt 3»6 cur isobutylchloorformiaat toe aan een op -1 C

3 5 gehouden oplossing van 3»95 g octaanzuur in 140 cm tetrahydrofuran 3 en 3,8 cm triethylamine. Het mengsel wordt gedurende 20 uren bij -1°C geroerd, daarna voegt men een tot 0°C gekoelde oplossing van 9,45 g van het chloorhydraat van benzyl L-alanyl-a-D-glutamaat in een mengsel van 54,8 cm^ 1N natriumhydroxide en 30 cm^ water toe, 10 Het reactiemengsel wordt één uur bij -1°C geroerd en daarna gedurende 20 uren bij ongeveer 20°C. Het mengsel wordt op een pH van 1 gebracht door toevoeging van 1N waterstofchloride. Het tetrahydrofuran wordt onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 45°C verdampt, daarna wordt het concentraat geëxtraheerd met 100 cm^ ethylacetaat. De 15 aldus verkregen organische fase wordt tweemaal met in totaal 50 cm^ 1N waterstofchloride en 25 cm^ van een verzadigde oplossing van na-triumchloride gewassen en onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 45°C tot droog geconcentreerd. Men verkrijgt op deze wijze 10 g van een lichtgele olie, die aan een chromatografische behandeling onder-20 worpen wordt aan een kolom met een diameter van 2,5 cm, die 200 g neutraal silicagel (0,063 - 0,20 mm) bevat. Men elueert met ethylacetaat onder het winnen van frakties van 100 cm^« De verenigde frakties 7-9 worden onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 45°C tot droog geconcentreerd. Het verkregen residu wordt fijngewreven in 25 100 cm^ van een mengsel van ether en petroleumether (kookpunt 35 -60°C (1/4 in volumedelen), door filtratie afgescheiden en gedroogd. Men verkrijgt op deze wijze 3,27 g benzyl N-octanoyl L-alanyl-a-D-glutamaat in de vorm van een wit poeder.

Hf = 0,56[silicagel; ethylacetaat-methanol (8/2 in volumedelen)]. 30 Voorbeeld XIX.

Men voegt 3,6 cm^ isobutylchloorformiaat toe aan een op 0°C ge- 3 houden oplossing van 7,03 g palmitinezuur in 140 cm tetrahydrofuran en 3,8 cm^ triethylamine. Het mengsel wordt gedurende 20 minuten bij 0°C geroerd, daarna voegt men een tot 0°C gekoelde oplossing toe van 35 9,45 g van het chloorhydraat van benzyl L-alanyl-a-D-glutamaat in 2 7 een mengsel van 54,8 cnr 1N natriumhydroxide en 30 cnr water. Het reactiemengsel wordt gedurende één uur bij 0°C geroerd en daarna 18 uren bij ongeveer 20°C; vervolgens wordt het mengsel op een pH van . 1 gebracht door toevoeging van 70 cm^ 1N waterstofchloride. Het ge-40 vormde neerslag wordt door filtratie afgescheiden, vijfmaal met in 8003760 -17- 3 · .

totaal 200 cm water gewassen en gedroogd. Men verkrijgt op deze wijze 12,11 g van een wit poeder, dat aan een chromatografische behandeling wordt onderworpen over een kolom met een diameter van 2,5 cm, die 200 g neutraal silicagel (0,063 - 0,20 mm) bevat. Men elueert 3 3 5 achtereenvolgens met 200 cnr ethylacetaat, 300 cm van een mengsel van ethylacetaat en methanol in de volumeverhouding 9*1» 1,6 liter van een mengsel van ethylacetaat en methanol in de volumeverhouding 8:2, kOO cw? van een mengsel van ethylacetaat en methanol in de vo-lumeverhouding 6:½ onder het winnen van frakties van 100 cm . De ver-10 enigde frakties 5-23 worden onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij ^5°C tot droog geconcentreerd. Men verkrijgt op deze wijze 5»18 g van een vaste stof, die men in 50 cm3 kokende ether gedurende 30 minuten fijnwrijft. Na afkoelen tot een temperatuur van ongeveer 20°C wordt het onoplosbare bestanddeel door filtratie afgescheiden» 3 15 driemaal met in totaal 75 cm ether gewassen en daarna gedroogd. Men verkrijgt op deze wijze 2,9½ g benzyl N-palmitoyl L-alanyl-a-D-glu-tamaat.

Rf = 0,77 [silicagel; ethylacetaat].

Voorbeeld XIII.

20 Men voegt 0Λ8 cm^ isobutylchloorformiaat toe aan een op -5°C

3 gehouden oplossing van 1,12 g arachidonzuur in kO cm tetrahydrofuran en 0,52 cm3 triethylamine. Het mengsel wordt gedurende 35 minuten tussen -5°C en -8°C geroerd, daarna voegt men een tot 0°C gekoelde oplossing toe van 0,93 g van het chloorhydraat van L-alanyl-D-gluta- 3 3 25 minezuur in een mengsel van 20 cm tetrahydrofuran, 15 cm water en 3 1,55 cm triethylamine. Het reactiemengsel wordt gedurende eén uur geroerd bij een temperatuur van ongeveer -30°C en daarna gedurende 20 uren bij een temperatuur van ongeveer 20°C; het mengsel wordt vervolgens verdund door toevoeging van 50 cm^ water, op een pH van 2 ge-30 bracht door toevoeging van een oplossing van 1N waterstofchloride in water en driemaal met in totaal 75 cm^ ether geëxtraheerd. De verenigde ether bevattende fasen worden onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 30°C tot droog geconcentreerd. Men verkrijgt op deze wijze 2,5 g van een gele olie, die aan een chromatografische behande-35 ling wordt onderworpen over een kolom met een diameter van 2,½ cm, die 50 g neutraal silicagel (0,0½ - 0,063 mm) bevat. Men elueert met ethylacetaat. Men verkrijgt op deze wijze 0,32 gN-arachidonoyl L-alanyl-D-glutaminezuur, dat bij 90°C smelt (pasteuze smelt).

Sf = 0,70 [silicagel; n-butanol-pyridine-azijnzuur-water (50/ kO 20/6/2½ in volumedelen)].

800 J760 -18-

Het chloorhydraat van L-alanyl-D-glutaminezuur kan bereid worden volgens de methode van H. NGUYEN-HUY c.s., Eur. J. Biochem., 66, (1976), 79.

Voorbeeld XIV.

5 Men voegt 0,48 cm^ isobutylchloorformiaat toe aan een op -10°C

gehouden oplossing van 0,94 g palmitinezuur in 40 cra^ tetrahydrofu-ran en 0,52 cm^ triethylamine. Het mengsel wordt gedurende 50 minuten tussen -6°C en -8°C geroerd, daarna voegt men een tot 0°C gekoelde oplossing toe van 0,^3 g van het chloorhydraat van L-alanyl- 10 D-glutaminezuur in een mengsel van 20 cm^ tetrahydrofuran, 15 cm^ 3 water en 1,55 cm triethylamine. Het reactiemengsel wordt gedurende één uur bij een temperatuur van ongeveer -6°C geroerd en daarna 20 uren bij een temperatuur van ongeveer 20°C; het mengsel wordt vervolgens op een pH van 2 gebracht door toevoeging van een waterbevat-15 tende oplossing van 4N waterstofchloride en verdund door toevoeging van 300 cm^ water. Het gevormde neerslag wordt door filtratie afgescheiden, driemaal met in totaal 150 cm3 ether gewassen en gedroogd.

Men verkrijgt op deze wijze 1,08 g van een wit poeder, dat men op-3 lost in 120 cm kokende ethylacetaat en warm filtreert. Na 20 uren 20 bij ongeveer 4°C met rust te zijn gelaten scheidt men het gevormde neerslag door filtratie af, wast dit tweemaal met in totaal 20 cm^ ethylacetaat en droogt aan de lucht. Men verkrijgt op deze wijze 0,93 g van een wit poeder, dat men oplost in 15 cm3 azijnzuur en warm filtreert. Na 64 uren bij ongeveer 4°C met rust te zijn gelaten 25 wordt het gevormde neerslag door filtratie afgescheiden, tweemaal met in totaal 20 cm^ ethylacetaat gewassen en onder een verminderde druk van 0,027 kPa bij 50°C gedroogd. Men verkrijgt op deze wijze 0,5 g N-palmitoyl L-alanyl-D-glutaminezuur, dat bij 155°C smelt.

Rf = 0,62 [silicagel; n-butanol-pyridine-azijnzuur-water (50/ 30 20/6/24 in volumedelen)].

Analyse: berekend C 63,13 H 9,71 N 6,14 gevonden : C 63,0 H 9,3 N 6,2.

Voorbeeld XV.

Men voegt 1,95 cm^ isobutylchloorformiaat toe aan een op 25°C 35 gehouden oplossing van 5,19 g docosaanzuur in een mengsel van 150 cm^ tetrahydrofuran en 2,1 cm^ triethylamine. Het mengsel wordt gedurende 20 minuten bij 25°C geroerd, daarna voegt men een oplossing toe van 5,69 g van het chloorhydraat van benzyl L-alanyl-a-D-glutamaat in een mengsel van 33 cm^ 1N natriumhydroxide en 17 cm^ water. Het 40 reactiemengsel wordt gedurende 30 minuten bij 30°C geroerd en daarna 8003760 -19- gedurende 18 uren bij ongeveer 20°C. Vervolgens voegt men 100 cm^ water toe en brengt men de pH op 1 door toevoeging van 35 cwP 1N waterstof chloride. Men verkrijgt een neerslag, dat men door filtratie 3 afscheidt, driemaal met in totaal 75 cm water wast en onder een 5 verminderde druk van 0,04 kPa bij 20°C droogt. Men verkrijgt op deze wijze 6,53 g van een wit poeder. Men lost 6 g van dit poeder op in 50 car tetrahydrofuran, dat 20 g neutraal silicagel (0,04 - 0,063 mm) bevat. Men concentreert het mengsel tot droog onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C en men brengt het geheel op een ko-10 lom met een diameter van 3»5 cm, die 180 g neutraal silicagel (0,04 - 0,063 mm) bevat. Men elueert achtereenvolgens meti - 13ΟΟ cm^ van een mengsel van cyclohexaan en ethylacetaat in gelijke volumeverhouding, •2 - 600 car ethylacetaat, 15 - 500 cm^ van een mengsel van ethylacetaat en tetrahydrofuran in de volumeverhouding 95*5» - 900 cm^ van een mengsel van ethylacetaat en tetrahydrofuran in de volumeverhouding 9ί1» 3 - 800 car van een mengsel van ethylacetaat en tetrahydrofuran in de 20 volumeverhouding 8:2, - 1000 cm^ van een mengsel van ethylacetaat en tetrahydrofuran in de volumeverhouding 6:4, - 900 cm^ van een mengsel van ethylacetaat en tetrahydrofuran in de volumeverhouding 4:6, 3 25 - 500 cm van een mengsel van ethylacetaat en tetrahydrofuran in de volumeverhouding 2:8, en - 600 cra^ tetrahydrofuran onder het winnen van frakties van 100 cm^. De frakties 17 tot 68 worden verenigd en onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C tot droog geconcentreerd. Men verkrijgt op deze 30 wijze 3»31 g benzyl N-docosanoyl L-alanyl-a-D-glutamaat.

Rf a 0,5½ [silicagel; ethylacetaat-tetrahydrofuran (8/2 in vo-lumedelen)].

Voorbeeld XVI.

3 o

Men voegt 3 cm isobutylchloorformiaat toe aan een op -5 C ge- 35 houden oplossing van 3»605 g 3-cyclohexaanpropionzuur in een mengsel 3 3 van 100 cm tetrahydrofuran en 3»23 cm triethylamine. Het mengsel wordt gedurende 20 -minuten bij -^C geroerd, daarna voegt men een tot 5°C gekoelde oplossing toe van 7»96 g van het chloorhydraat van benzyl L-alanyl-a-D-glutamaat in een mengsel van 46,2 cm^ 1N natri-40 umhydroxide en 13*8 cm^ water. Het reactiemengsel wordt gedurende 10 8003760 -20- minuten bij 0°C geroerd en daarna gedurende 2 dagen bij ongeveer 20°C. Men verdampt vervolgens het tetrahydrofuran onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C. Het concentraat wordt tweemaal geëxtraheerd met in totaal 80 cm^ ether, op een pH van 1 gebracht 3 5 door toevoeging van 50 cnr 1N waterstofchloride. De olie, die gedecanteerd wordt van het reactiemilieu, wordt viermaal met in totaal x 200 cnr ethylacetaat geëxtraheerd. De verenigde organische fasen worden gewassen met 25 cm^ van een verzadigde oplossing van natriumchlo-ride en met watervrij magnesiumsulfaat gedroogd. Na concentratie 10 tot droog onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C verkrijgt men een olie, die spontaan kristalliseert. Deze kristallen (7'3 g) worden opgelost in 40 cm^ azijnzuur, dat 20 g neutraal silicagel (0,04 - 0,063 mm) bevat. Men concentreert het mengsel tot droog en men brengt het geheel op een kolom met een diameter van 2,5 cm, die 15 30 g neutraal silicagel (0,04 - 0,063 mm) bevat. Men elueert met ethylacetaat onder het winnen van frakties van 100 cm^. De vierde fraktie wordt onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 45°C tot droog geconcentreerd. Men verkrijgt op deze wijze 1,86 g benzyl N-(3-cyclohexylpropionyl) L-alanyl-a-D-glutamaat, dat bij 126 - 128°C 20 smelt. De frakties 3 en 5 worden verenigd en tot droog geconcentreerd. De amorfe vaste stof wordt aan een chromatografische behandeling onderworpen over een kolom met een diameter van 2,5 cm, die 68 g neutraal silicagel (0,04 - 0,063 mm) bevat. Men elueert achtereenvolgens met 520 cm van een mengsel van cyclohexaan en ethylace-25 taat in de volumeverhouding 1:1 en 520 cm^ ethylacetaat onder het winnen van frakties van 40 cm^. De frakties 11 tot 28 worden verenigd en onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 45°C tot droog geconcentreerd. Men verkrijgt op deze wijze 1,37 g benzyl N-(3-cy-clohexylpropionyl) L-alanyl-a-D-glutamaat, dat bij 128 - 130°C smelt. 30 Hf = 0,14 [silicagel; ethylacetaat].

Voorbeeld XVII.

Men voegt 4,3 cnT* isobutylchloorformiaat toe aan een op -6°C

gehouden oplossing van 7,59 g N-(3.5.5-trimethylhexanoyl) L-alanine 3 3 in een mengsel van 400 cm tetrahydrofuran en 4,63 cnr triëthylamine. 35 Het mengsel wordt gedurende 20 minuten bij -6°C geroerd, vervolgens voegt men een tot 3°C gekoelde oplossing toe van 9»06gvan het chloor-

X

hydraat van benzyl α-D-glutamaat in een mengsel van 66,2 cnr 1N natriumhydroxide en 14 cm^ water. Het reactiemengsel wordt gedurende 15 minuten bij -5°C geroerd en daarna gedurende 66 uren bij ongeveer 40 18°C; het mengsel wordt vervolgens op een pH van 1 gebracht door toe- 8003760 -21- voeging van 75 cm^ 1N waterstofchloride. Men verdampt de tetrahydro-furan onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C. Het concen-traat wordt vijfmaal met in totaal 200 cnr ethylacetaat geextraheerd.

De verenigde ethylacetaatfasen worden met ^fO cm^ 0,1 N waterstof-5 chloride gewassen en met magnesiumsulfaat gedroogd. Na filtratie en concentratie tot droog onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C, verkrijgt men 14,8 g olie, die men oplost in 50 cm^ ethylacetaat, dat 30 g neutraal silicagel (0,0*t - 0,063 mm) bevat. Men concentreert het mengsel onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 10 50°C tot droog en men brengt het geheel op een kolom met een diameter van 2,8 cm, die 280 g neutraal silicagel (Ο,ΟΑ- - 0,063 mm) bevat. Men elueert achtereenvolgens met 2 liter cyclohexaan, 1 liter van een mengsel van cyclohexaan en ethylacetaat in de volumeverhouding 95*5» 1,5 liter van een mengsel van cyclohexaan en ethylacetaat in 15 de volumeverhouding 90:10, 5 liter van een mengsel van cyclohexaan en ethylacetaat in de volumeverhouding 80:20, 1,5 liter van een mengsel van cyclohexaan en ethylacetaat in de volumeverhouding 70:30 en 3,5 liter van een mengsel van cyclohexaan en ethylacetaat in de volumeverhouding 50:50 onder het winnen van frakties van 50Q cm^. De 20 frakties 23 - 29 worden verenigd en onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C tot droog geconcentreerd. Men verkrijgt op deze wij- · ze 10,86 g benzyl N-(3.5*5-trimethylhexanoyl) L-alanyl-a-D-glutamaat in de vorm van een olie, die kristalliseert.

fif = 0,37 [silicagel; ethylacetaat].

25 Het N-(3.5»5-trimethylhexanoyl) L-alanine kan op de volgende wijze bereid worden:

Men voegt 6,5 cm^ isobutylchloorformiaat toe aan een op -5°C

gehouden oplossing van 7,912 g 3.5*5-trimethylhexaanzuur in een meng-3 3 sel van 125 cm tetrahydrofuran en 7 cm triethylamine. Het mengsel 30 wordt gedurende 20 minuten bij -5°C geroerd, daarna voegt men een tot 5°C gekoelde oplossing toe van ^,495 g L-alanine in 50 cm^ 1N natriumhydroxide. Het reactiemengsel wordt gedurende 10 minuten bij 0°C geroerd en daarna gedurende 18 uren bij ongeveer 25°C. Men verdampt vervolgens de tetrahydrofuran onder een verminderde druk van 35 2,7 kPa bij 50°C. Het concentraat wordt tweemaal met in totaal ^0 cm3 ether geextraheerd, op een pH van 1 gebracht door toevoeging van 55 cm^ 1N waterstofchloride. Het olieachtige precipitaat, dat ontstaat, wordt vijfmaal met in totaal 250 cm^ ethylacetaat geëxtraheerd. De ethylacetaatfasen worden verenigd, met 25 cm^ van een ver-40'zadigde oplossing van natriumchloride gewassen en met magnesiumsul- 8003760 -22- faat gedroogd. Na filtratie en concentratie onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C tot droog verkrijgt men 11,79 g olie, die men oplost in 40 cm3 ethylacetaat, dat 20 g neutraal silicagel (0,063 - 0,20 mm) bevat. Men concentreert het mengsel onder een ver-5 minderde druk van 2,7 kPa bij 50°C tot droog en men brengt het geheel op een kolom met een diameter van 3 cm, die 120 g neutraal silicagel (0,063 - 0,20 mm) bevat. Men elueert achtereenvolgens met 600 cm^ cyclohexaan, 300 cm·'’ van een mengsel van cyclohexaan en 3 ethylacetaat in de volumeverhouding 95*5, 300 cm van een mengsel 10 van cyclohexaan en ethylacetaat in de volumeverhouding 90:10, 300 3 cm van een mengsel van cyclohexaan en ethylacetaat in de volumever- houding van 80:20, 700 cnr van een mengsel van cyclohexaan en ethyl- 3 acetaat in de volumeverhouding van 50:50, 300 cm ethylacetaat en 300 cm·'* van een mengsel van ethylacetaat en methanol in de volume-15 verhouding 90:10 onder het winnen van frakties van 100 cm^. De verenigde frakties 17 - 28 worden tot droog geconcentreerd onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 45°C. Men verkrijgt op deze wijze 10,16 g olie, die men oplost in 25 cm^ ether. Door toevoeging van 150 cnr petroleumether verkrijgt men een olie, die men door decante-20 ren afscheidt. Na drogen onder een verminderde druk van 0,027 kPa verkrijgt men 7,59 g N-(3.5.5-trimethylhexanoyl) L-alanine.

Rf = 0,43 [silicagel; ethylacetaat].

Voorbeeld XVIII,

Men voegt in 1 uur en 10 minuten 27,5 g 2-n-pentyl-3-hydroxy-25 nonanoaa^^ccinimide opgelost in 644 cm^ 1,2-dimethoxyethaan toe aan een op 7°C gehouden oplossing van 27,8 g van het chloorhydraat van benzyl L-alanyl-a-D-glutamaat in een mengsel van 245 cm^ water en 22,9 cm^ triëthylamine. Het reactiemengsel wordt gedurende 20 uren bij 20°C bewaard en daarna gedurende 5 uren bij 60°C. Men verdampt 30 vervolgens het 1,2-dimethoxyethaan onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50®0; het concentraat wordt op een pH van 1 gebracht door toevoeging van 150 cm^ 1N waterstofchloride en wordt vijfmaal met in totaal 1,5 liter ethylacetaat geëxtraheerd. De verenigde organische fasen worden driemaal met in totaal 750 cm^ water gewassen, 35 net natriumsulfaat gedroogd en onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 60°C tot droog geconcentreerd. Men verkrijgt op deze wijze 38,6g olie, die men in 200 cm^ ethylacetaat oplost. Men voegt 13 g dicy-elohexylamine toe. Na een rustperiode van 20 uren bij 4°C wordt de gevormde witte vaste stof door filtratie afgescheiden, tweemaal met 4Q in totaal 40 cnr ethylacetaat en tweemaal met in totaal 200 cm 800 3760 -23- ether gewassen en onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 20°C gedroogd. Men verkrijgt op deze wijze 22,4 g van een wit poeder, waaraan men 1,9 g, verkregen bij een soortgelijke werkwijze, toe- 3 voegt. Men lost dit mengsel op in 500 cm water; men voegt aan de wa- 3 3 5 terbevattende oplossing 200 cm ethylacetaat en 150 cnr van een verzadigde oplossing van citroenzuur toe. Men scheidt de organische fase af, extraheert de waterbevattende fase tweemaal met in totaal 3 400 cm ethylacetaat. De verenigde ethylacetaatfasen worden tweemaal met in totaal 200 cm^ water gewassen, met natriumsulfaat gedroogd en 10 onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 60°C tot droog geconcentreerd. Men verkrijgt op deze wijze 17,4 g benzyl N-(2-n-pentyl-3-hydroxynonanoyl) L-alanyl-a-D-glutamaat, in de vorm van een beige pasta.

Rf = 0,25 [silicagel; ethylacetaat].

15 Het 2-n-pentyl-3-hydroxynonanoaat van succinimide kan op de vol gende wijze bereid wordeni

Men voegt in 40 minuten 27 g dicyclohexylcarbodiimide opgelost in 300 cm*’ 1.2-dimethoxyethaan toe aan een op 0°C gehouden oplossing van 29,1 g 2-n-pentyl-3-hydroxynonaanzuur en 14,1 g N-hydroxysuccin-20 imide in 300 cm^ 1.2-dimethoxyethaan. Het reactiemengsel wordt 3 uren bij 0°C geroerd en vervolgens 21 uren bij 4°C bewaard. Het gevormde neerslag wordt door filtratie afgescheiden en tweemaal met in totaal 3 100 cm 1.2-dimethoxyethaan gewassen. Het filtraat wordt onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C tot droog geconcentreerd. Het 25 concentraat wordt opgenomen met een mengsel van 300 cm^ diisopropyl-ether en 3 cm^ azijnzuur. Na 2 uren bewaren bij 20°C wordt het gevormde neerslag door filtratie afgescheiden en tweemaal met in to- 3 taal 40 cm diisopropylether gewassen. Het filtraat wordt onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C tot droog geconcentreerd. Men 30 verkrijgt op deze wijze 42,6 g 2-n-pentyl-3-hydroxynonanoaat van succinimide in de vorm van een gele olie.

Het 2-n-pentyl-3-hydroxynonaanzuur kan bereid worden volgens de methode van E. LEDEBEB c.s., Buil. Soc. Chim. 1932 , 413.

Voorbeeld XIX.

35 Aan een oplossing van 6,07 g benzyl N-tert.butyloxycarbonyl-α- 3 D-glutamaat in 70 cm ethanol voegt men 12,5 g gechloormethyleerd styreen-divinylbenzeen (98-2) copolymeer toe, dat 1,2 milliëquivalent chloor per gram bevat. Men roert het reactiemengsel gedurende 15 minuten bij 28°C. Men voegt vervolgens 2,25 cm^ triethylamine toe 40 en men roert het reactiemengsel gedurende 65 uren bij ?8°C. Het po- ft η n * 7 fi o -2k- lymeer wordt gefiltreerd, achtereenvolgens driemaal met in totaal 300 cm ethanol en driemaal met in totaal 300 cnr dichloormethaan gewassen en daarna onder een verminderde druk van 2,7 kPa hij 40°C ge-droogd. Men verkrijgt op deze wijze 17 g 0 -benzyl N-tert.butyloxy-5 carbonyl-D-glutamyl-polymeer. Het alanine wordt gecondenseerd met Λ het 0 -benzyl N-tert.butyloxycarbonyl-D-glutamyl-polymeer door de volgorde van de volgende handelingen uit te voeren in een reactor, die van een roerinrichting en in de bodem van een glasfritfilter is voorzien.

10 1) Men voert drie opeenvolgende wasbehandelingen van het poly meer uit met telkens 100 cm^ dichloormethaan. Elke toevoeging van oplosmiddel wordt gevolgd door een roerbehandeling gedurende 3 minuten en daarna een centrifugebehandeling.

2) De beschermende tert.butyloxycarbonylgroep van het glutamine- 3 15 zuur wordt vervolgens verwijderd door toevoeging van 100 cm van een mengsel van trifluorazijnzuur en dichloormethaan in de volumeverhou-ding 1:1, gevolgd door roeren gedurende 20 minuten en tenslotte centrifugeren.

3) De hars wordt dan achtereenvolgens gewassen met: 20 a) driemaal 100 cm'* dichloormethaan, b) driemaal 100 cm^ methanol, c) driemaal 100 cm^ dichloormethaan, onder roeren gedurende 3 minuten na elke toevoeging van oplosmiddel en telkens centrifugeren.

25 4) Men neutraliseert vervolgens het polymeer door toevoeging van 100 cm^ van een mengsel van dichloormethaan en N-methylmorfoli-ne in de volumeverhouding 9:1» roeren gedurende 10 minuten gevolgd door centrifugeren.

5) De hars wordt vervolgens gewassen met: 3 30 driemaal 100 cnr dichloormethaan, onder gedurende 3 minuten roeren na elke toevoeging van oplosmiddel en telkens centrifugeren.

6) Men voegt dan achtereenvolgens toe: a) 3*78 g N-tert.butyloxycarbonyl-L-alanine opgelost in 50 35 cm^ dichloormethaan en men roert gedurende 10 minuten; b) 4,13 g dicyclohexylcarbodiimide opgelost in 50 cm^ dichlocr-methaan, men roert gedurende 20 uren en centrifugeert.

7) Men wast de hars achtereenvolgens met: 3 a) driemaal 100 cm dichloormethaan, 40 b) driemaal 100 cm^ azijnzuur, 8003760 -25- c) driemaal 100 cm^ dichloormethaan, onder roeren gedurende 5 minuten na elke toevoeging van oplosmiddel en telkens centrifugeren.

-1

Men verkrijgt op deze wijze het 0 -benzyl N-(tert.butyloxycar-5 bonyl-L-alanyl)-D-glutamyl-polymeer.

Het heptadecaanzuur wordt gecondenseerd met het dipeptide-poly-meer onder herhaling van de bewerkingen 1, 2» 3i 4, 5» 6 en 7· De bewerking nummer 6 wordt als volgt gemodificeerd:

Men voegt achtereenvolgens toe: 10 a) 5»4 g heptadecaanzuur opgelost in 50 cm^ dichloormethaan en men roert gedurende 10 minuten; 3 b) 4,13 g dicyclohexylcarbodiimide opgelost in 50 cm dichloormethaan, men roert gedurende 20 uren en centrifugeert.

A

Men verkrijgt op deze wijze het 0 -benzyl-N-(N-heptadecanoyl-L-15 alanyl)-D-glutamyl-polymeer.

Dit polymeer wordt gesuspendeerd in 100 cm^ trifluorazijnzuur, dat aanwezig is in een reactor, die voorzien is van een roerinrich-ting en in de bodem van een glasfritfilterDoar deze suspensie laat men gedurende 90 minuten een stroom waterstofbromide gaan. Vervol-20 gens centrifugeert men de hars en wast men driemaal met in totaal 300 cm^ azijnzuur onder roeren gedurende 3 minuten na .elke teevee— - " ging van azijnzuur en telkens centrifugeren. De filtraten worden verenigd en tot droog geconcentreerd onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C.

25 Het aldus verkregen residu wordt gesuspendeerd in 30 cm^ ethyl- acetaat, door filtratie gescheiden, tweemaal met in totaal 60 cm^ ether gewassen en gedroogd. Men verkrijgt op deze wijze 1,97 g vaste stof, die men aan een chromatografische behandeling onderwerpt over een kolom met een diameter van 2,2 cm, die 40 g neutraal sili-30 cagel (0,04 - 0,063 am) bevat.

Men elueert achtereenvolgens met 350 cm^ van een mengsel van 3 cyclohexaan en ethylacetaat in de volumeverhouding 1:1, 400 cm 3 ethylacetaat, 700 cm van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volumeverhouding 95*5, 950 cm^ van een mengsel van ethylace- 3 35 taat en azijnzuur in de volumeverhouding 90:10, 750 cm van een mengsel van ethylacetaat en azijnzuur in de volumeverhouding 80:20 en 1,6 liter azijnzuur onder het winnen van frakties van 50 cm^. De verenigde frakties 65 - 94 worden tot droog geconcentreerd onder een verminderde druk van 2,7 kPa bij 50°C. Men verkrijgt op deze wijze 40 0,88 g N-heptadecanoyl-L-alanyl-D-glutaminezuur.

8003760 9 -26-

Hf = 0,61 [silicagel; n-butanol-pyridine-azijnzuur-water (50/ 20/6/24 in volumedelen)].

Analyse: berekend C 63,80 H 9185 N 5,95 gevonden : C60,1 H 9»3 N 5,8.

5 Zwavelzuuras : 5,6$.

De onderhavige uitvinding heeft eveneens betrekking op farmaceutische preparaten» die ten minste één verbinding volgens de uitvinding tezamen met één of meer verenigbare en farmaceutisch aanvaardbare verdunningsmiddelen of versnijdingsmiddelen bevatten. Deze 10 preparaten kunnen gebruikt worden als ondersteuningsmiddelen van vaccins of als niet specifieke stimuleringsmiddelen van anti-infek-tie- en anti-tumorimmuniteit.

Gebruikt als ondersteuningsmiddelen van vaccins worden de verbindingen volgens de uitvinding tegelijkertijd en langs dezelfde 15 weg toegediend als het antigeen (virusachtig» bacterieachtig, parasitair of van andere aard)waartegen men^het geïmmuniseerde individu (mens of huisdier) de cellulaire immuniteitsreacties (hypergevoeligheid van het vertraagde type) of de produktie van circulerende of plaatselijke antilichamen wenst te verhogen.

20 De verbindingen worden toegediend bij relatief geringe dose ring (in de ordegrootte van mg), gemengd met het antigeen en langs dezelfde weg (intramusculair, subcutaan, intraveneus, intranasaal, oraal). Indien noodzakelijk kunnen het produkt en het antigeen geëmulgeerd zijn in een geschikt olieachtig versnijdingsmiddel of op-25 genomen in liposomen.

Als niet specifieke immunostimuleringsmiddelen worden zij toegediend bij doseringen tussen 0,1 en 50 mg/kg langs parenterale (intraveneus, subcutaan, intramusculair), intranasale, orale, rectale of eventueel intratumorale weg.

30 Als vaste preparaten voor orale toediening kunnen tabletten, pillen, poeders of granules gebruikt worden. In deze preparaten is het werkzame produkt gemengd met één of meer verdunningsmiddelen zoals saccharose, lactose of amidon. Deze preparaten kunnen eveneens andere verbindingen bevatten dan de verdunningsmiddelen, bijvoor-35 beeld een glijmiddel, zoals magnesiumstearaat.

Als vloeibare preparaten voor orale toediening kan men farmaceutisch aanvaardbare emulsies, oplossingen, suspensies, siropen of elixers gebruiken, die inerte verdunningsmiddelen bevatten, zoals water of paraffineolie. Deze preparaten kunnen verbindingen anders 40 dan de verdunningsmiddelen bevatten, bijvoorbeeld bevochtigingsmid- 8003760 -27- delen, zoetstoffen of aroma’s,

De preparaten voor parenterale toediening kunnen steriele water-bevattende oplossingen, suspensies of emulsies zijn. Als drager in deze laatstgenoemde gevallen kan men polyethyleenglycol, propyleen-5 glycol, plantaardige oliën, in het bijzonder olijfolie en injekteer-bare organische esters, bijvoorbeeld ethyloleaat, toepassen. Deze preparaten kunnen eveneens toevoegsels bevatten, in het bijzonder be-vochtigingsmiddelen, emulgeermiddelen of dispergeermiddelen.

De sterilisatie kan op verschillende wijzen plaats hebben, bij-10 voorbeeld met behulp van een bacteriologisch filter, door het opnemen in het preparaat van steriliserende middelen of door verhitting. Zij kunnen eveneens bereid worden in de vornyfran vaste preparaten, die steriel gemaakt worden door bijvoorbeeld bestraling, die kunnen worden opgelost in steriel water of gedispergeerd in elk ander ste-15 riel injekteerbaar milieu, eventueel op het tijdstip van toepassing.

De preparaten voor intranasale toediening kunnen steriele water-bevattende oplossingen, suspensie of emulsies zijn, die eventueel verenigd kunnen zijn met een verenigbaar drijfmiddel.

De preparaten voor rectale toediening zijn suppositoria, die 20 naast het werkzame produkt versnijdingsmiddelen kunnen bevatten, zoals cacaoboter of suppo-cire.

De volgende voorbeelden, die niet beperkend zijn, lichten een preparaat volgens de uitvinding toe.

Voorbeeld A.

25 Men bereidt volgens de gebruikelijke techniek een langs intra veneuze weg toe te dienen oplossing met de volgende samenstelling: benzyl N-lauroyl L-alanyl-a-D-glutamaat 0,5 g injekteerbare opgeloste stof 5 cm^.

Voorbeeld B, 30 Men bereidt volgens de gebruikelijke techniek een langs intra veneuze weg toe te dienen oplossing met de volgende samenstelling: N-palmitoyl L-alanyl-a-D-glutaminezuur 0,5 g 3 injekteerbare opgeloste stof 5 cm .

8003760

Claims

1. Dipeptide met de algemene formule 1, waarin R-CO een vetzuur-rest voorstelt en de symbolen R^, gelijk of verschillend, een hydroxyl- of aminogroep of een alkoxygroep met 1-4 koolstofatomen 5 (eventueel gesubstitueerd met een fenyl- of nitrofenylgroepfoorstel lerpet dien verstande, dat het alanine in de L-vorm en dat het glutaminezuur en zijn derivaten in de D-vorm zijn, alsmede de me-taalzouten en additiezouten met stikstof bevattende basen.

2. Dipeptide volgens conclusie 1, met het kenmerk, 10 dat R een waterstofatoom of een alkylgroep met 1-4 koolstofatomen (eventueel gesubstitueerd met een hydroxyl-, fenyl- of cyclohexyl-groep), een alkenylgroep met 2-29 koolstofatomen,die meer dan één dubbele binding kan bevatten of een mycolzuurrest voorstelt,

3. Werkwijze ter bereiding van een dipeptide, met het 15kenmerk , dat men een verbinding met formule 1, waarin de symbolen de bij conclusie 1 vermelde betekenissen bezitten, op een op zichzelf bekende wijze bereidt.

4. Werkwijze ter bereiding van een dipeptide, met het kenmerk , dat men een verbinding met formule 1, waarin de sym- 20 bolen de bij conclusie 1 vermelde betekenissen bezitten bereidt, doordat men een zuurmet de algemene formule 3» waarin R gedefinieerd is zoals in conclusie 1 of 2, of een geactiveerd derivaat van dit zuur, laat inwerken op een dipeptide met de algemene formule 4, waarin de symbolen R^ gedefinieerd zijn zoals in conclusie 1, daarna 25 eventueel, indien het geval zich voordoet, de groep(en) R1 vervangt door een hydroxyl- of aminogroep en het verkregen produkt eventueel in de vorm van een zout isoleert.

5. Werkwijze ter bereiding van een verbinding volgens conclusie 1 of 2, waarin de groepen R^, gelijk of verschillend, een hydroxyl- 30 of aminogroep voorstellen, met het kenmerk, dat men een verbinding volgens conclusie 1 of 2, waarin één van de symbolen R^ een hydroxyl-, amino- of alkoxygroep voorstelt en het andere symbool een hydroxy- of alkoxygroep voorstelt, behandelt volgens bekende methoden, die de omzetting van een estergroep tot een carboxyl- of 35 carbamoylgroep of een vo.oraf geactiveerde carboxylgroep tot een car-bamoylgroep mogelijk maken.

6. Werkwijze volgens conclusie 5« met het kenmerk, dat men de omzetting van de estergroep tot de carboxylgroep uitvoert door hydrogenolyse bij aanwezigheid van een katalysator.

7. Werkwijze volgens conclusie 5i met het kenmerk, 8003760 -29- da t men de omzetting van de estergroep of de vooraf geactiveerde carboxylgroep tot de carbamoylgroep uitvoert met behulp van watervrije ammoniak opgelost in een organisch oplosmiddel.

8. Werkwijze ter bereiding van een verbinding volgens conclu-5 sie 1 of 2, met het kenmerk, dat men een L-alaninede- rivaat met de algemene formule 5i waarin B gedefinieerd is zoals in conclusie 1 of 2, of een geactiveerd derivaat van dit zuur laat reageren met een D-glutaminezuurderivaat met de algemene formule 6, waarin de symbolen B^ gedefinieerd zijn als in conclusie 1, vervol-10 gens eventueel, indien het geval zich voordoet, de groep(en) B^ vervangt door een hydroxyl- of aminogroep en het verkregen produkt eventueel in de vorm van een zout isoleert.

9. Werkwijze ter bereiding van een dipeptide volgens conclusie 1 of 2, waarin de symbolen B^, identiek of verschillend, een hydroxyl-15 of aminogroep voorstellen, waarvan ten minste één een hydroxylgroep is en B gedefinieerd is zoals in conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat men op een geschikte drager de a- of Y-carboxyl-groep van het D-glutaminezuur, waarvan de aminegroep beschermd is en waarvan de Y~ of α-carbonzuurgroep afhankelijk van het geval be-20 schermd is in de vorm van een amide of ester fixeert, de beschermende groep van de aminegroep verwijdert zonder te raken aan de binding" ' D-glutaminezuur-drager, het L-alanine, waarvan de aminegroep beschermd is condenseert met D-glutaminezuur-drager, daarna de beschermende groep van de aminegroep van de L-alanylrest verwijdert, ver-25 volgens het vetzuur condenseert met de dipeptide-drager, de binding D-glutaminezuur-drager verbreekt en, indien het geval zich voordoet, de beschermende groep van de zuurgroep van het D-glutaminezuur verwijdert en het verkregen produkt isoleert.

10. Werkwijze volgens conclusie 9* met het ken- 30. e r k , dat men als drager een gechloormethyleerd of gehydroxy-methyleerd styreen-divinylbenzeencopolymeer toepast.

11. Werkwijze volgens conclusie 9» met het kenmerk, dat men als beschermende groep van de aminegroep van het D-glutaminezuur de tert.butyloxycarbonylgroep toepast en dat de a- 35 zuurgroep van het D-glutaminezuur beschermd is in de vorm van het amide of de benzylester.

12. Werkwijze volgens conclusie 9» met het kenmerk, dat men als beschermende groep van de aminegroep van het L-alanine de tert.butyloxycarbonylgroep toepast, deze beschermende 40 groep verwijdert, vervolgens het vetzuur condenseert en het verkre- «003760 -30- gen produkt isoleert,

13. Werkwijze volgens conclusie 9i met het kenmerk, dat men de aminegroep van het L-alanine beschermt met een vetzuurrest, het aldus beschermde L-alanine condenseert en vervolgens 3 het verkregen dipeptide isoleert. Werkwijze ter bereiding van een dipeptide zoals gedefinieerd in conclusie 9» met het kenmerk, dat men op een geschikte drager het dipeptide afkomstig van de condensatie van het L-alanine met het D-glutaminezuur fixeert, vervolgens het vetzuur 10 condenseert met het aldus gefixeerde dipeptide en het verkregen produkt isoleert. 15» Farmaceutisch preparaat, gekenmerkt door de aanwezigheid van ten minste één verbinding met formule 1, waarin de symbolen de bij conclusie 1 of 2 vermelde betekenissen bezitten in 13 zuiver toestand of tezamen met één of meer verenigbare en farmaceutisch aanvaardbare verdunningsmiddelen of toevoegsels,

16. Werkwijze ter bereiding van een farmaceutisch preparaat, met het kenmerk, dat men één of meer verbindingen met formule 1, waarin de symbolen de bij conclusie 1 of 2 vermelde bete-20 kenissen bezitten, in een voor een dergelijke toepassing geschikte vorm brengt, ****** 8003760 1_ R—CO — NH—CH—CO — NH — CH—CO— R< l I CH3 CH^CH^—CO—R1 NAG—NAM==NA6—NAM I II Aid Ala Glu Glu (R COOhJ I I v Jn DAP DAP _ Ala" fn jL L· R—COOH HgN—CH—CO—NH—CH—CO — CH3 CHjCHg—CO—R1 L· — R —CO—NH—CH—COOH H-N—CH—CO—R, CH3 CH2CH2—CO— R1 8003760