DK154436B

DK154436B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af tri-, tetra- og pentapeptider eller salte deraf

Info

Publication number: DK154436B
Application number: DK563181A
Authority: DK
Inventors: Jean Bouchaudon; Gilles Dutruc-Rosset; Daniel Farge; Claude James
Original assignee: Rhone Poulenc Sante
Priority date: 1980-12-19
Filing date: 1981-12-18
Publication date: 1988-11-14
Also published as: NL8105587A; BE891539A; DK154436C; SE8107634L; IT8125703A0; JPS57154151A; GB2089816A; LU83843A1; JPH0337560B2; ZA818737B; NZ199310A; IE812974L; AU555294B2; IE52113B1; CH653039A5; GB2089816B; SE454699B; AU7859081A; IT1142148B; DK563181A

Description

Den foreliggende opfindelse angår en analogifrem¬gangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte tri-, te-tra- eller pentapeptider med den almene formel

hvori RCO-betyder en fedtsyrerest, hvori R betyder en al¬ky lgruppe med 1-25 carbonatomer, der eventuelt er substi¬tueret med en hydroxygruppe, R^ betyder en hydroxygruppe 2 4 eller en aminogruppe, R og R , som kan være ens eller forskellige, betyder et hydrogenatom, en carboxygruppe, en carbamoylgruppe eller en N-carbonylglycyl- eller N-car- 2 4 bonyl-D-alanylgruppe, hvorved R og R ikke samtidigt 3 kan betyde et hydrogenatom, R betyder et hydrogenatom el- ler en glycylrest, hvorved R betyder et hydrogenatom, når2 4 R og R er ens eller forskellige og hver især betyder enN-carbonylglycylgruppe (-CONHCI^COOH) eller en N-carbo¬nyl-D-alanylgruppe

, og m og n, som kan være ens eller forskellige, hver især betyder 1 eller 2, hvor¬ved alaninet, som er forbundet med glutaminsyren, 'fore¬ligger i L-form, glutaminsyren foreligger i D-form, lan-thioninet, når m og n er lig med 1, cystathioninet, nårm og n er forskellige, og homolanthioninet, når m og ner lig med 2, foreligger i D,D-form, L,L-form, DD,LL--form (racemisk formi eller D,L-form (meso-form) eller iform af en L,meso-blanding eller D,meso-blanding, og thia-lysinet, når én af R^ og R4 betyder et hydrogenatom, og m og n er lig med 1, foreligger i L-form, D-form ellerD,L-form, eller et farmaceutisk acceptabelt additions¬salt med en syre, farmaceutisk acceptabelt metalsalt ellerfarmaceutisk acceptabelt additionssalt med en organisk baseog fremgangsmåden er ejendommelig ved det i kravets kende¬tegnende del anførte.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillesde hidtil ukendte peptider med formlen I ifølge sådannemetoder, som sædvanligvis anvendes inden for peptidke¬mien. De forskellige reaktioner gennemføres efter, atman ved hjælp af passende beskyttelsesgrupper har blo¬keret de amino- eller syregrupper, som ikke skal deltagei reaktionen. Efter gennemført reaktion fjernes beskyt¬telsesgrupperne om nødvendigt.

Ved fremgangsmådevariant a) ifølge opfindelsen frem¬stilles de hidtil ukendte forbindelser med formlen Ived, at .et dipeptid med den. almene formel

hvori RCO- betyder en fedtsyrerest som ovenfor defineret, 5

Tidet en eventuel hydroxygruppe er beskyttet, og R betyderen aminogruppe, en alkoxygruppe med 1-4. carbonatomer elleren benzyloxygruppe, omsættes med en forbindelse med den al¬mene formel

2' 4' hvori R og R , som kan være ens eller forskellige, be¬tyder et hydrogenatom, en carboxygruppe, en carbamoyl-gruppe, en C^_^-alkyloxycarbonylgruppe, en benzyloxycar-bonylgruppe eller en N-carbonylglycyl- eller N-carbo- nyl-D-alanylgruppe, som eventuelt er forestret med en 2* 41 alkylgruppe eller en benzylgruppe, hvorved R og R ikkesamtidigt kan betyde et hydrogenatom, m og n, som kan være g ens eller forskellige, hver især betyder 1 eller 2, og Rbetyder en beskyttelsesgruppe,for aminogruppen elleren glycylrest, hvis aminogruppe er substitueret med en g beskyttelsesgruppe, hvorved R betyder en N-beskyttelses-gruppe, når R og R er ens eller forskellige og betyder N-carbonyl-glycol- eller -D-alanyl, hvorefter beskyttelses- 6 *gruppen R eller iden beskyttelsesgruppe, som indgår i grup- 6 ς pen R , erstattes med et hydrogenatom, gruppen R erstattes med en hydroxygruppe, når R5 betyder en alkoxygruppe med 1-4 carbonatomer eller en behzyloxygruppe, eventuelle alkyl- oxycarbonylgrupper eller benzyloxycarbonylgrupper, som udgør eller indgår i R og/eller R , erstattes med carboxygrup- per, og en eventuel O-beskyttelsesgruppe, som indgår i R, fjernes.

Når R og R er forskellige fra en carboxygruppe ogikke indeholder en carboxygruppe, gennemføres kondensationenmed dipeptidet med formlen II sædvanligvis i nærværelse afet kondensationsmiddel, såsom dicyclohexylcarbodiimid, iet organisk opløsningsmiddel, såsom methylenchlorid ellerdimethylformamid, og ved en temperatur på -10 til 30°C.

Det er sædvanligvis nødvendigt at aktivere den friesyregruppe i dipeptidet med formlen II før omsætningen medforbindelsen med formlen III. Det aktiverede derivat af di¬peptidet med formlen II er fortrinsvis et blandet anhydrid,som fremstilles in situ ved omsætning med et alkvlhalogeno-formiat, såsom isobutylchlorformiat. Kondensationen af detaktiverede derivat gennemføres i et organisk opløsningsmid¬del, såsom dioxan, tetrahydrofuran, chloroform, toluen el¬ ler dimethylformamid, eller i et vandholdigt organisk medi¬um i nærværelse af en base (enten en uorganisk base såsomnatriumhydroxid eller en organisk base såsom triethylamin)ved en temperatur på -10 til 30°C.

g

Erstatningen af den aminobeskyttende gruppe R eller g den aminobeskyttende gruppe, som indgår i gruppen R, med et 5 hydrogenatom, erstatningen af gruppen R med en hydroxygrup-pe og erstatningen af de grupper, som udgør eller indgår iR og/eller R , med carboxygrupper kan gennemføres ifølgekendte metoder afhængigt af disse gruppers natur. Det erisær hensigtsmæssigt at vælge grupperne Έ?, R^, R^ og R^på en sådan måde, at erstatningen af disse grupper kan gen- g nemføres i et enkelt trin. R kan f.eks. betyde eller in- 5 deholde en tert.butyloxycarbonylgruppe, R kan betyde en 2’ 4' tert.butyloxygruppe, og R og/eller R kan betyde eller in¬deholde en tert.butyloxycarbonylgruppe, hvorved erstatning¬en af disse grupper kan gennemføres ved hjælp af sur hydro¬lyse. Hydrolysen kan gennemføres i eddikesyre i nærværelseaf saltsyre ved en temperatur nær 20°C.

Beskyttelsesgruppen for en syregruppe kan f.eks. væreen benzylgruppe, og beskyttelsesgruppen for en aminogruppekan være en benzyloxycarbonylgruppe, hvorved disse grupperkan fjernes samtidigt ved hjælp af hydrogenbromid i triflu-oreddikesyre eller ved anvendelse af natrium i flydende am¬moniak. Det kan imidlertid være nødvendigt at fjerne én el¬ler flere af disse beskyttelsesgrupper, uden at de andre‘på¬virkes. I dette tilfælde bør beskyttelsesgrupperne f.eks.vælges på en sådan måde, at de kan erstattes under forskel¬lige hydrolysebetingelser. Beskyttelsesgruppen for en syre¬gruppe kan således være en tert.butylgruppe, som kan fjer¬nes ved hjælp af hydrogenchlorid i eddikesyre, og beskyttelses¬gruppen for aminogruppen kan være en benzyloxycarbonylgrup¬pe, som kan fjernes ved hjælp af hydrogenbromid i trifluor-eddikesyre.

Ved fremgangsmådevariant b) ifølge opfindelsen fremstilles de hidtil ukendte peptider med formlen I, 3 hvori R betyder en glycylgruppe, ved at en .aminosyre medden almene formel

hvori betyder en beskyttelsesgruppe for aminogruppen,omsættes med et tri- eller tetrapeptid med den almene formel

hvori RCO- betyder en fedtsyrerest, scan ovenfor define- ret, idet en eventuel hydroxygruppe er beskyttet, R be¬tyder en hydroxygruppe, en aminogruppe, en C, .-alkoxygrup- 2' 4' pe eller en benzyloxygruppe, R og R , som kan være ens eller forskellige, betyder et hydrogenatom, en carboxygrup- pe, en carbamoylgruppe, en C-^-alkoxycarbonylgruppe, en benzyloxycarbonylgruppe eller en N-carbonylglycyl- eller N-carbonyl-D-alanylgruppe, som eventuelt er forestret med 2' en alkylgruppe eller en benzylgruppe, hvorved R og4' R ikke samtidigt kan betyde et hydrogenatom, og m og n, som kan være ens eller forskellige, hver især betyder 1 eller 2, hvorefter gruppen R^ erstattes med et hydro- genatom, gruppen R erstattes med en hydroxygruppe, når1» R betyder en alkoxygruppe med 1-4 carbonatomer eller en benzyloxygruppe, og eventuelle alkyloxycarbonylgrupper eller benzyloxycarbonylgrupper, som udgør eller indgår2 1 4 1 i R og/eller R erstattes med carboxygrupper, og en eveituel O-beskyttelsesgruppe, som indgår i R, fjernes.

Der arbejdes under de betingelser, som er angivet oven¬for for omsætning af en forbindelse med formlen II med enforbindelse med formlen III.

Dipeptidet med formlen II kan fremstilles ved, atet aktiveret derivat af L-alanin med den almene formel r

12 hvor R betyder en gruppe RCO-, hvori R har den ovenforangivne betydning, eller en beskyttelsesgruppe for amino-gruppen, omsættes med et derivat af D-glutaminsyre medden almene formel

5 hvori R har den ovenfor angivne betydning, og carboxygrup- pen eventuelt er beskyttet. Reaktionen gennemføres under di betingelser, som er angivet ovenfor for omsætning af en foi bindelse med formlen II med en forbindelse med formlen III.

12

Efter erstatning af gruppen R med et hydrogenatom, når12 R betyder en beskyttelsesgruppe for aminogruppen, gennem¬føres derefter omsætning med en syre med formlen R-COOH,hvori R har den ovenfor angivne betydning, hvorpå den even¬tuelt beskyttede carboxygruppe erstattes med en carboxy-gruppe.

Lanthioninderivater, d.v.s. de forbindelser med form¬len III, hvori m og n er lig-med 1, kan fremstilles ifølgeen af følgende metoder.

21 (a) Et lanthioninderivat med formlen III, hvori R og 4' 6 R betyder en carboxygruppe, og R betyder en benzyloxycar- bonylgruppe, kan fremstilles ifølge den metode, som er be¬skrevet af I. Photaki et al., J. Chem. Soc. Perkin I, 2599(1979).

2' (b) Et lanthioninderivat med formlen III, hvori R be- 4' tyder en carboxygruppe, R betyder en carbamoylgruppe, og g R betyder en beskyttelsesgruppe for aminogruppen eller englycylgruppe, hvis aminogruppe er substitueret med enbeskyttelsesgruppe for aminogruppen, og som foreliggeri D,D-form eller L,L-form, kan fremstilles ved at gåud fra tilsvarende lanthionin, hvis fremstilling er beskre¬vet af J. Greenstein og M. Winitz, "Chemistry of the AminoAcids", John Wiley and Sons, 1961, s. 2675. Man fremstillerherved ifølge kendte metoder dibenbenzylesteren af diben-zyloxycarbonyllanthionin, som monoforsæbes ifølge den metode,som er beskrevet af A. Arendt et al., Roczniki Chemii Ann.Soc. Chim. Polonorum, 48, 1305 (1974), [Chem. Abstr., 82,31497 g (1975)], og derefter ved hjælp af ammoniakalskmethanol omdannes til et monoamid med den almene formel

hvori Z betyder en benzyloxycarbonylgruppe. Når dette mono-amid underkastes sur hydrolyse eller hydrogenolyse, fåsmonoamidet af lanthionin.

Når monoamidet af lanthionin omsættes med et kobber-salt, såsom kobber(II)bromid eller basisk kobfoercarbonat,dannes et kompleks, som kan repræsenteres ved følgende for¬mel r hvori aminoresten i α-stilling fra carbamoylgruppen kan acy-leres ved hjælp af en aminosyre med.formlen X eller beskyt¬tes ved omsætning med et alkyl- eller benzylhalogenoformiat.Det således dannede kompleks sønderdeles ved omsætning med hydrogensulfid til dannelse af en aminosyre eller et dipep- 2* 4'

tid med formlen III, hvori R betyder en carboxygruppe, R

/Γ betyder en carbamoylgruppe, og R har den ovenfor angivnebetydning.

2» (c) Et lanthioninderivat med formlen III, hvori R be- 4« tyder en carboxygruppe, R betyder en carbamoylgruppe, og g R betyder en beskyttelsesgruppe for aminogruppen, og somforeligger i meso-form, hvorved det carbonatom, sombærer carbamoylgruppen, foreligger i D-form, kan fremstillesved at gå ud fra mesolanthionin ifølge den metode, som erbeskrevet i belgisk patentskrift nr. 821.385 til fremstil¬ling af diaminopimelamsyre.

2' (d) Et lanthioninderivat med formlen III, hvori R be- 4* tyder fen carbamoylgruppe, R betyder en carboxygruppe, og /r R betyder en beskyttelsesgruppe for aminogruppen el¬ler en glycylrest, hvis aminogruppe er beskyttet meden beskyttelsesgruppe for aminogruppen, kan fremstillesved, at aminogruppen i α-stilling fra carbamoylgruppen iforbindelsen med formlen XV beskyttes ved, at‘forbindelsenmed formlen XV omsættes med et alkyl- eller benzylhalogeno-formiat. Det således dannede kompleks sønderdeles ved om¬sætning med hydrogensulfid til dannelse af et lanthionin- 4' derivat med formlen III, hvori R betyder en carbamoyl- 2' 6gruppe, R betyder en carboxygruppe, og R betyder en be¬skyttelsesgruppe for aminogruppen. Aminogruppen i a-stil-ling fra carboxygruppen kan beskyttes med en beskyttelses¬gruppe eller acyleres ved omsætning med et aktiveret deri¬vat af en aminosyre med formlen X. Efter erstatning af g gruppen R med et hydrogenatom ifølge metoder, som ikke på¬virker resten af molekylet, fås et lanthioninderivat med 4' 2' formlen III, hvori R betyder en carboxygruppe, R betyder g en carbamoylgruppe, og R betyder en beskyttelsesgruppefor aminogruppen eller en glycyl- eller D-alanylrest, hvisaminogruppe er substitueret med en beskyttelsesgruppe .foraminogruppen.

4'

(e) Et lanthioninderivat med formlen III, hvori R

2' betyder en carbamoylgruppe, R betyder en C^_^-alkyloxy-carbonylgruppe, en benzyloxycarhonylgruppe eller en N--carbonylglycyl- eller N-carbonyl-D-alanylgruppe, som even¬tuelt er forestret med en alkylgruppe med 1-4 carbonatomer g

eller med en benzylgruppe, og R betyder en beskyttelses¬gruppe for aminogruppen eller en glycylgruppe, hvisaminogruppe er substitueret med en beskyttelsesgrup¬pe for aminogruppen, kan fremstilles ved, at en ami¬nosyre med formlen VIII

7 hvori R betyder et hydrogenatom eller en methylgruppe,hvorved aminosyren i dette tilfælde foreligger i D-form,

Q

og R betyder en hydroxygruppe, en alkoxygruppe med 1-4carbonatomer eller en benzyloxygruppe, eller en alipha-tisk alkohol med 1-4 carbonatomer eller benzylalkohol om¬sættes med en aminosyre eller et dipeptid med den almeneformel

r g hvori R har den ovenfor angivne betydning, og Y betyder enbeskyttelsesgruppe for aminogruppen, hvorved reaktionen gen¬nemføres under sædvanlige betingelser. Efter gennemført re¬aktion erstattes beskyttelsesgruppen Y med et hydrogenatom,og eventuelt erstattes den estergruppe, som indgår i glycyl-eller D-alanyIresten, med en hydroxygruppe, uden at restenaf molekylet påvirkes. Det er især vigtigt, at gruppen Yvælges på en sådan måde, at denne gruppe kan erstattes med g et hydrogenatom, uden at beskyttelsesgruppen R eller en be- g skyttelsesgruppe, som indgår i gruppen R , påvirkes.

4' (f) Et lanthioninderivat med formlen III, hvori Rbetyder en carbamoylgruppe, betyder en C^^-alkyloxy-carbonylgruppe, en benzyloxycarbonylgruppe eller en even¬tuelt forestret N-carbonylglycyl- eller N-carbonyl-D-ala- g nyirest, og R betyder en glycylgruppe,hvis aminogruppe er substitueret med en beskyttelses¬gruppe for aminogruppen, kan fremstilles ved, at en amino- syre med formlen X omsættes med en forbindelse med denalmene formel

2' hvori R har den ovenfor angivne betydning, og Y betyderen beskyttelsesgruppe for aminogruppen, hvorved reaktionengennemføres under sædvanlige betingelser. Efter gennemførtreaktion erstattes gruppen Y med et hydrogenatom, uden atresten af molekylet påvirkes.

2'

(g) Et lanthioninderivat med formlen III, hvori R

' 4' betyder en carbamoylgruppe, R betyder en C^^-alkyloxy-carbonylgruppe, en benzyloxycarbonylgruppe eller en N-car-bonylglycyl- eller N-carbonyl-D-alanylgruppe, som even- i.

tuelt er forestret med en alkylgruppe med 1-4 carbonatomer

C

eller med en benzylgruppe, og R betyder en beskyttelses¬gruppe for aminogruppen eller en glycyl-rest, hvis amino-gruppe er substitueret med en aminobeskyttende grup¬pe, kan fremstilles ved, at en aminosyre med form¬len VIII eller en aliphatisk alkohol med 1-4 carbonatomereller benzylalkohol omsættes med en aminosyre eller et di¬peptid med den almene formel

g hvori R har den ovenfor angivne betydning, og Y betyder enbeskyttelsesgruppe for aminogruppen, hvorved reaktionen gen¬nemføres under sædvanlige betingelser. Efter reaktionen er¬stattes beskyttelsesgruppen Y med et hydrogenatom, og even¬tuelt erstattes estergruppen i glycyl- eller D-alanylrestenmed en hydroxygruppe, uden at resten af molekylet påvirkes.Det er især vigtigt, at gruppen Y vælges på en sådan måde,at den kan erstattes med et hydrogenatom, uden at beskyttel¬sesgruppen eller beskyttelsesgruppen i gruppen R^ påvir¬kes .

Når aminosyren med formlen VIII omsættes med amino¬syren med formlen XVI eller XVIII, arbejdes der under betin¬gelser, som gør det muligt at skabe en peptidbinding, udenat resten af molekylet påvirkes. Når reaktionen gennemføresmed en aliphatisk alkohol eller benzylalkohol, arbejdes derunder milde forestringsbetingelser, så at beskytteisesgrup- g perne Y og R ikke påvirkes. Der arbejdes især ifølge denmetode, der er beskrevet af V. Bocchi, Synthesis, s. 961(1979) .

9 t (h) Et lanthioninderivat med formlen III, hvori 4' betyder en carbamoylgruppe,R betyder en alkyloxycarbonyl-gruppe, en benzyloxycarbonylgruppe eller en eventuelt for-estret N-carbonylglycyl- eller N-carbonyl-D-alanylrest, og g R betyder en glycylrest, hvis aminogruppe er substi¬tueret med en aminobeskyttende gruppe, kan frem- stilles ved, at en aminosyre med formlen X omsættes med enaminosyre eller et dipeptid med den almene formel

4* hvori R har den ovenfor angivne betydning, og Y betyder enbeskyttelsesgruppe for aminogruppen, hvorved der arbejdesunder sædvanlige betingelser. Derefter erstattes gruppen Ymed et hydrogenatom, uden at gruppen påvirkes.

Forbindelserne med formlerne XVII og XIX kan fremstil¬les ifølge metoder, som sædvanligvis anvendes inden for pep¬tidkemien. til indføring af en aminobeskyttende gruppe, hvor¬ved der gås ud fra et lanthioninderivat med formlen III, 2' 4' hvori én af R og R betyder en carbamoylgruppe, og den an¬den betyder en C^-alkyloxycarbonylgruppe,en benzyloxycarbonylgruppe eller en eventuelt forestret N- g -carbonylglycyl- eller N-carbonyl-D-alanylrest, og R bety¬der en beskyttelsesgruppe for aminogruppen. Derefter erstat- g tes beskyttelsesgruppen R med et hydrogenatom, uden at res¬ten af molekylet påvirkes. Beskyttelsesgrupperne for amino-grupperne i monoamidet af lanthionin bør være forskellige og g valgt på en sådan måde, at fjernelsen af gruppen R ikke på¬virker gruppen Y.

o' (i) Et lanthioninderivat med formlen III, hvori R og 4r 6 R hver især betyder en carbamoylgruppe, og R betyder en be¬skyttelsesgruppe for aminogruppen, kan fremstilles ved, atammoniak omsættes med et blandet anhydrid, fremstillet insitu ved omsætning af et alkylhalogenoformiat med et lan¬thioninderivat med den almene formel

hvori Y betyder en beskyttelsesgruppe, som adskiller sigfra gruppen R , hvorefter beskyttelsesgruppen Y fjernes,uden at resten af molekylet påvirkes.

2

(j) Et lanthioninderivat med formlen III, hvori R

4» 6 og R hver især betyder en carbamoylgruppe, og R betyder en glycylgruppe, hvis aminogruppe er sub¬stitueret med en beskyttelsesgruppe, kan fremstilles ved,at en aminosyre med formlen X omsættes med et lanthionin¬derivat med den almene formel

hvori Y betyder en beskyttelsesgruppe for aminogruppen, hvor¬efter gruppen Y fjernes, uden at beskyttelsesgruppen, som g indgår i gruppen R, fjernes.

21 (k) Et lanthioninderivat med formlen III, hvori R4r og R hver især betyder en CL .-alkyloxycarbonylgruppe ’ g eller en benzyloxycarbonylgruppe, og R betyder en beskyt¬telsesgruppe for aminogruppen, kan fremstilles ved for¬es tring af et lanthioninderivat med den almene, formel

hvori Y betyder en beskyttelsesgruppe, som adskiller sig fra g den ovenfor angivne gruppe R , hvorefter gruppen Y fjernes, uden at resten af molekylet påvirkes.

• 2*

(l) Et lanthioninderivat med formlen III, hvori R

4' og R hver især betyder en C^_^-alkyloxycarbonylgruppeeller en benzyloxycarbonylgruppe, og R^ betyder englycylgruppe, hvis aminogruppe er substi- tueret med en aminobeskyttende gruppe, kan fremstil¬les ved, at en aminosyre med formlen X omsættes med et lan-thioninderivat med den almene formel

13 hvori R betyder en alkylgruppe med 1-4 carbonatomer elleren benzylgruppe, og Y betyder en beskyttelsesgruppe for a-minogruppen, hvorefter gruppen Y fjernes, uden at resten afmolekylet påvirkes.

De derivater af L-lanthionin, som kan anvendes tilfremstilling af forbindelserne ifølge den foreliggende op¬findelse, kan også fremstilles ved at gå ud fra diethyleste¬ren af dibenzyloxycarbonyl-L-lanthionin, hvis fremstillinger beskrevet af D. Harpp et al., J. Org. Chem., 36, 73(1971).

De lanthioninderivater med formlenf Sti, hvori én af2' 4' R og R betyder en carboxygruppe, en carbamoylgruppe, enC-^-alkyloxycarbonylgruppe, en benzyloxycarbonylgruppeeller en eventuelt forestret N-carbonylglycyl- ellerN-carbonyl-D-alanylgruppe, og den anden betyder en carb¬oxygruppe, en CL .-alkyloxycarbonylgruppe eller en benzyl- 6 oxycarbonylgruppe, og R betyder en beskyttelsesgruppe foraminogruppen eller en glycylgruppe, hvis aminogruppe er substitueret med en beskyttelsesgruppe, kanfremstilles ved, at et cysteinderivat med den almene formel

hvori X betyder et hydrogenatom, en beskyttelsesgruppe foraminogruppen eller en glycylrest, hvis amino¬gruppe er substitueret med en beskyttelsesgruppe, og Y be¬tyder en hydroxygruppe, en aminogruppe, en alkoxygruppe med1-4 carbonatomer, en benzyloxygruppe eller en eventuelt for- estret N-glycyl- eller N-D-alanylgruppe, omsættes med enforbindelse med den almene formel

hvori X' betyder et hydrogenatom eller en beskyttelsesgrup¬pe for aminogruppen, hvori Y' har den samme betydning somY ovenfor og kan betyde en anden gruppe end Y, og bety¬der et andet halogenatom end et fluoratom eller en reaktivesterrest, såsom en toluensulfonyl- eller methansulfonyl-gruppe, eller omsættes med en forbindelse med den almeneformel

hvori X' og Y' har de ovenfor angivne betydninger, hvoreftereventuelt én af de aminobeskyttende grupper X eller X' fjer¬nes fra det således dannede lanthioninderivat.

Kondensationen af forbindelsen med formlen XXIV meden forbindelse med formlen XXV eller XXVI gennemføres sæd¬vanligvis i et vandholdigt organisk medium, såsom en blan¬ding af vand og tetrahydrofuran, i nærværelse af en base(enten en uorganisk base såsom natriumhydroxid eller kali¬umhydroxid eller en organisk base såsom et kvaternært am¬moniumhydroxid) ved en temperatur nær 0°C. Kondensationenkan også gennemføres i flydende ammoniak.

Kondensationen af cysteinderivatet med formlen XXIVmed forbindelsen med formlen XXV kan efterfølges af en ra-cemisering ved det asymmetriske carbonatom i forbindelsenmed formlen XXV.

Der finder ikke nogen racemisering sted, når i form¬lerne XXIV og XXV Z betyder et halogenatom, Y' betyder en t hydroxygruppe, Y betyder en hydroxygruppe eller en amino-gruppe, X betyder et hydrogenatom, en benzyloxycarbonylgrup-pe, en tert.butyloxycarbonylgruppe, en tert.butyloxycarbo-nylglycylgruppe eller en tert.butyloxycarbonyl-D-alanylgrup-pe, og X' betyder et hydrogenatom eller en benzyloxycarbonyl-gruppe. For at undgå eller begrænse racemiseringen er dethensigtsmæssigt at gennemføre reaktionen i flydende ammoniak,

Thialysinderivater, dvs. forbindelser med formlen III, 2* 4' hvori én af R og R betyder et hydrogenatom, og m og n er lig med 1, kan fremstilles ved at gå ud fra thialysin, hvis fremstilling er beskrevet af D. Hope et al., J. Chem. Soc.

(C), 1098 (1966), hvorved de ovenfor angivne metoder til fremstilling af låntioninderivater tillempes.

Cystathioninderivater, dvs. forbindelser med formlen 2 4 III, hvori m betyder 1, og n betyder 2, og R og R har andre betydninger end hydrogen, kan fremstilles ved at gå ud fra cystathionin, hvis fremstilling især er beskrevet af K. Jost et al., Coll. Czech. Chem. Comm., 32, 2485 (1967) og Z. Pro- chazka et al., Coll. Czech. Chem. Comm., 45, 1982 (1980), hvorved de ovenfor angivne metoder til fremstilling af lan- thioninderivater tillempes.

Peptidet med formlen XI, hvori R betyder en hydroxy- gruppe, en aminogruppe, en alkoxygruppe med 1-4 carbonatom- 2* 41 er eller en benzyloxygruppe, og R og R har de ovenfor an¬givne betydninger, kan fremstilles ved, at et dipeptid med 5 formlen II, hvori R og R har de ovenfor angivne betydninger,under sædvanlige betingelser omsættes med en aminosyre med 2' 4* formlen III, hvori R og R har de ovenfor angivne betyd-fi ninger, og R betyder en beskyttelsesgruppe for aminogrup-pen, hvorefter denne beskyttelsesgruppe erstattes med et hy¬drogenatom, uden at resten af molekylet påvirkes.

De hidtil ukendte peptider med formlen I kan eventueltrenses ved anvendelse af fysiske metoder (såsom krystallisa¬tion eller chromatografi) eller kemiske metoder (såsom dan¬nelse af et salt, krystallisation af dette og efterfølgendesønderdeling).

De hidtil ukendte forbindelser ifølge opfindelsen kanomdannes til additionssalte med syrer eller til metalsalteeller til additionssalte med organiske baser afhængigt afsubstituenternes natur.

Syreadditionssaltene kan fremstilles ved, at de hid-til ukendte forbindelser omsættes med syrer i et egnet op¬løsningsmiddel. Forbindelsen solubiliseres sædvanligvis ivand ved tilsætning af den teoretiske mængde syre, hvoref¬ter den dannede opløsning lyofiliseres.

Metalsaltene eller additionssaltene med organiske ba¬ser kan fremstilles ved, at de hidtil ukendte forbindelseromsættes med uorganiske eller organiske baser i et egnet op¬løsningsmiddel. Forbindelsen solubiliseres sædvanligvis ivand ved tilsætning af den teoretiske mængde base, hvorefterden dannede opløsning lyofiliseres.

De hidtil ukendte forbindelser ifølge opfindelsen eradjuvantia og immunitetsstimulerende stoffer. De forøgeroverfølsomhedsreaktionerne og/eller frembringelsen af cir¬kulerende antistoffer over for de antigener, som de indgivessammen med, og de stimulerer på en ikke-specifik måde for¬svarsreaktionerne mod visse infektioner (f.eks. infektionerhos mus fremkaldt af den intracellulære bakterie Listeriamonocytogenes).

I DK fremlæggelsesskrift nr. 148.809 beskrives etlactoyl-tetrapeptid, der udviser immunostimulerende egen¬skaber. Forbindelserne fremstillet ved fremgangsmådenifølge opfindelsen, der adskiller sig væsentligt fra desåledes kendte forbindelser ved, at en diaminopimelin-syrerest er erstattet med en rest af lanthionin, cysta-thionin, homolanthionin eller thialysin, udviser en over¬legen virkning knyttet til en mere specifik virkning iforhold til de kendte forbindelser.

Af ganske særlig interesse er de forbindelser medformlen I, hvori RCO- betyder en fedtsyrerest, hvori R be¬tyder en alkylgruppe med 2-21 carbonatomer.

In vitro er de hidtil ukendte forbindelser virksommei molære koncentrationer mellem 10 og 10 Mf isasr ved følg¬ende forsøg.

Stimulering af DNA-syntesen (mitogen evne) ifølge denmetode, som er beskrevet af G. Marchal, Ann. Immunol. (Inst.Pasteur), 125 C, 519 (1974).

Stimulering af frembringelsen af antistoffer ifølgeden metode, som er beskrevet af P.H. Klesius, Proc. Soc.

Exp. Biol. Med. (N.Y.), 135, 155 (1970) og H. van Dijk ogN. Bloksma, J. Immunol. Methods, 14, 235 (1977).

Øgning af antallet af fagocytære makrofager ifølgeden metode, som er beskrevet af J. Michl et al., J. Exp.

Med., 144, 1465 (1976).

Øgning af den cytostatiske aktivitet hos makrofagernei et peritonealt exsudat over for tumorceller.

In vivo udviser de hidtil ukendte forbindelser følg¬ende egenskaber.

Ved indgift til mus i doser på mellem 1 og 30 mg/kgforøger forbindelserne den forhalede overfølsomhed og frem¬bringelsen af antistoffer, især ved forsøg ifølge den metode,som er beskrevet af T.E. Miller et al., J. Nat. Cancer Inst.,51, 1669 (1973).

Ved indgift til mus i doser på mellem 1 og 100 mg/kgstimulerer de hidtil ukendte forbindelser forsvarsreaktion¬erne mod infektioner fremkaldt af Listeria monocytogeneseller Klebsiella pneumoniae, når forsøget gennemføres ifølgeden metode, som er beskrevet af R.M. Fauve og B. Hevin, C.R.Acad. Sci (D), 285, 1589 (1977).

Hos mus stimulerer de hidtil ukendte forbindelser dy¬renes evne til at fjerne kolloidt kulstof via det reticulo-endoteliale system, når forsøget gennemføres ifølge den me¬tode, som er beskrevet af B.N. Halpern et al., Ann. Insti¬tut Pasteur, 8j3, 582 (1951) .

Forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse kandanne komplekser med alkalimetaller eller jordalkalimetal-ler. Som en følge heraf kan de fremkomne elementæranalyse-værdier for de fremstillede forbindelser adskille sig be¬tydeligt fra de teoretiske værdier. Forbindelsernes strukturbekræftes imidlertid ved hjælp af forholdet C/N eller C/S,som stemmer overens med det teoretiske forhold, ved hjælpaf indholdet af aminosyrer og ved hjælp af homogenitetenved tyndtlagschromatografi på silicagel.

Hydrolyse til bestemmelse af forholdet mellem amino-syrerne gennemføres med en blanding af lige volumendelekoncentreret saltsyre og vandfri eddikesyre ved 96°C i 5timer ifølge den metode, som er beskrevet af I. Photaki, J. Chem. Soc., Perkin I, 2599 (1979). Disse hydrolysebetin¬gelser, som ikke medfører racemisering af lanthionin, erutilstrækkelige til fuldstændigt at bryde amidbindingen mel¬lem fedtsyren og alaninet.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres i defølgende eksempler, idet fremgangsmådevariant a) belysesi eksempel 1, 2, 4, 5, 7-11, 13-16 og 18-20, og fremgangs¬mådevariant b) belyses i eksempel 3, 6, 12 og 17.

Eksempel 1 3 o 1 cm Isobutylchlorformiat sættes til en til -5 C af¬kølet opløsning af benzyl-N- (N-lauroyl-L-alanyl)-<x-D-glu- 3 3 tamat i en blanding af 200 cm tetrahydrofuran og 1,1 cm triethylamin. Reaktionsblandingen omrøres i 40 minutter ved -5°C, hvorefter der tilsættes en til 0°C afkølet opløsning 3 af 2,7 g Να-benzyloxycarbonyl-L-lanthionin i 158 cm 0,1N natriumhydroxidopløsning. Reaktionsblandingen omrøres ved0°C i 20 minutter og derefter ved ca. 20°C i 16 timer. Te-trahydrofuranet afdampes under formindsket tryk (20 mm Hg, 2.7 kPa) ved 50°C. Det fremkomne koncentrat gøres surt til 3 en pH-værdi på 2 ved tilsætning af ca. 30 cm IN saltsyre 3 og ekstraheres tre gange med ialt 300 cm ethylacetat. De 3 organiske faser forenes, vaskes med 50 cm af en mættet na-triumchloridopløsning, tørres over vandfrit natriumsulfatog koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2.7 kPa) ved 40°C. Den fremkomne remanens udrives i 200 cm-3ether, fraskilles ved filtrering og tørres under formind¬sket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 20°C. Der fås herved 2,25g af et amorft pulver, til hvilket der sættes 0,45 g af etlignende produkt opnået ved en anden fremstilling. Den frem¬komne blanding chromatograferes på 50 g neutralt silicagel(0,04-0,063 mm) i en kolonne med diameteren 2,3 cm. ilan op- 3 løser herved 2,70 g produkt i 200 cm kogende ethylacetat,og til den fremkomne opløsning sættes 5 g neutralt silica¬gel (0,04-0,063 mm). Den fremkomne blanding inddampes tiltørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C,og den herved fremkomne remanens anbringes i silicagelkolon- 3 nen. Der elueres successivt med 300 cm af en blanding af ethyl- 3 acetat og cyclohexan i volumenforholdet 2:8, 150 cm af enblanding af ethylacetat og cyclohexan i volumenforholdet 3 1:1, 750 cm af en blanding af ethylacetat og cyclohexan i 3 volumenforholdet 3:1, 1,2 1 ethylacetat, 850 cm af en blan¬ding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 9:1 og 3 250 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volu- menforholdet 8:2, og der opsamles fraktioner med volumen3 50 cm . Fraktionerne 51-70 forenes og koncentreres til tør¬hed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C.

3

Remanensen udrives i 200 cm ether, fraskilles ved filtre- 3 ring, vaskes to gange med ialt 100 cm ether og tørres under formindsket tryk (0,3 mm Hg, 0,04 kPa) ved 50°C. Der fås herved 1,86 g N^-[O^-benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-y-D-glu-£ tamyl]-N -benzyloxycarbonyl-L,L-2,6-diamino-4-thia-pimelin-syre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,45 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af én blanding afethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 9:1 som elue-ringsmiddel.

2 1

Gennem en opløsning af 1,8 g N -[0 -benzyl-N-(N-lau- g royl-L-alanyl)-y-D-glutamyl]-N -benzyloxycarbonyl-L,L-2,6--diamino-4-thia-pimelinsyre i 50 cm trifluoreddikesyre le¬des en strøm af hydrogenbromid i 5,5 timer. Reaktionsblan¬dingen gennemblæses derefter med nitrogengas i 10 minutter.Efter fjernelse af et let, uopløseligt stof ved filtreringkoncentreres reaktionsblandingen til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPal ved 50Ο(3. Den fremkomne remanens 3 udrives i 50 cm ethylacetat, fraskilles ved filtrering og 3 vaskes to gange med ialt 60 cm ether. Der fås herved 1,06g af et amorft, meget hygroskopisk pulver, som opløses i 3 50 cm af en vandfri opløsning af 1,9 N saltsyre i eddike¬syre. Den fremkomne opløsning koncentreres til tørhed un¬der formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Remanen- 3 sen opløses i 5 cm vandfri eddikesyre, og den fremkomneopløsning hældes i 1 liter ether. Det herved dannede bund- 3 fald fraskilles ved filtrering, vaskes med 100 cm ether,tørres under formindsket tryk (0,3 mm Hg, 0,04 kPa) ved Λ 20°C og opløses i 10 cnr vand. Den herved fremkomne opløs¬ning størkner efter 0,5 time. Dec forendes derefter med 500 3 cm vand. Det herved dannede bundfald fraskilles ved fil- 3 3 trering, opløses i 5 cm eddikesyre og sættes til 800 cm ether. Det således dannede nye bundfald fraskilles ved fil¬trering, vaskes tre gange med ialt 300 cm3 ether og tørres under formindsket tryk (0,3 mm Hg, 0,04 kPa) ved 50°C. Her- 2 ved fås 380 mg N -[N-(N-lauroyl-L-alanyl)-y'-D-glutamyl]--L,L-2,6-diamino-4-thia-pimelinsyre indeholdende 2,1% vand.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,25 ved tyndtlags-chromatografi på silicagel med anvendelse af en blanding afn-butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet50:20:6:24 som elueringsmiddel.

Analyse:

Beregnet, %: C 52,87 H 7,85 N 9,48 S 5,43

Fundet,. %: C 49,5 H 7,9 N 8,7 S 5,2

Sulfataske, %: 2,1

Efter hydrolyse i en blanding af lige volumendele kon¬centreret saltsyre og vandfri eddikesyre i 5 timer ved 96°Cviser en analyse ved hjælp af BIOTRONIK autoanalysator til¬stedeværelse af følgende aminosyrer:

Lan 1,00 (teoretisk = 1) meso-Lan 0 (teoretisk = 0)

Glu 1,02 (teoretisk = 1)

Na-Benzyloxycarbonyl-L-lanthionin kanfremstilies ifølgeden metode, som er beskrevet af I. Photaki et al., J. Chem.Soc. Perkin I, 2599 (1979).

Benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-a-D-glutamat kan fremstil¬les ifølge en af følgende to metoder.

(a) Til en opløsning af 12,75 g benzyl-L-alanyl-a-D- 3 -glutamat-hydrochlorid i 75 cm IN natriumhydroxidopløs¬ning sættes samtidigt i løbet af 37 minutter en opløsning 3 3 af 8 g laurylchlorid i 75 cm ether og 37,4 cm IN natri¬umhydroxidopløsning, hvorved tilsætningen gennemføres på ensådan måde, at reaktionsblandingens pH-værdi holdes på 8-9.Blandingen omrøres i 1 time og 20 minutter. Efter dekante¬ring gøres vandfasen sur til en pH-værdi på 2 ved tilsætning 3 af 60 cm IN saltsyre, hvorpå den ekstraheres tre gange3 med ialt 300 cm ethylacetat. De organiske ekstrakter fore- 3 nes, vaskes med 25 cm vand, tørres over vandfrit natrium¬sulfat og koncentreres til tørhed under formindsket tryk(20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 45°C. Herved fås 7,4 g af et hvidtfast stof, som chromatograferes på 80 g neutralt silicageli en kolonne med diameteren 2 cm. Der elueres først med 100 3 cm af en blanding af ethylacetat og methanol i volumenfor- 3 holdet 8:2 og derefter med 200 cm af en blanding af ethyl¬acetat og methanol i volumenforholdet 1:1, og der opsamlesfraktioner med volumen 50 cm . Fraktion 1 koncentreres tiltørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 45°C.Der fås herved 2 g benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-ct-D-glutamatmed et smeltepunkt på 130°C. Fraktionerne 2-4 forenes ogkoncentreres til tørhed, og remanensen chromatograferes på100 g neutralt silicagel (0,063-0,20 mm) i en kolonne med 3 diameteren 2 cm. Der elueres med 250 cm acetone, og der op- 3 samles fraktioner med volumen 25 cm . Fraktionerne 1 og 2koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 45°C. Herved fås 4,07 g benzyl-N-lauroyl-L-ala-nyl-a-D-glutamat med et smeltepunkt på 130°C.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,9 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding af n-butanol, pyridin, eddikesyre og vand- i volumenforholdet50:20:6:24 som elueringsraiddel.

Analyse:

Beregnet, %: C 66,10 H 8,63 N 5,71

Fundet, %: C 66,3 H 8,8 N 5,6 (b) 31 cm"3 isobutylchlorformiat sættes til en til 10°Cafkølet opløsning af 47,75 g laurinsyre i S 1 dioxan og 33,3 3 cm trxethylamin. Reaktionsblandingen omrøres i 20 minutterved 10°C, hvorefter der i løbet af 10 minutter tilsættes entil 10°C afkølet opløsning af 88,95 g benzyl-L-alanyl-a-D- 3 -glutamat-hydrochlorid i en blanding af 1 1 dioxan, 476 cm 3 vand og 476 cm IN natriumhydroxidopløsning. Reaktionsblan¬dingen omrøres i 1 time ved 10°C og derefter i 18 timer veden temperatur nær 20°C. Derpå fortyndes reaktionsblanding¬en ved tilsætning af 4 1 vand. Den fremkomne blanding gøressur til en pH-værdi på 2 ved tilsætning af ca. 475 cm INsaltsyre, og får derpå lov til at stå ved 0°C i 2 timer. Det dannede bundfald fraskilles ved filtrering, vaskes med 5003 3 cm vand og med 500 cm ether og tørres under formindskettryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 20°C. Produktet suspenderes i 3 800 cm ether. Suspensionen omrøres i 1 time, hvorpå bund- 3 faldet frafiltreres og vaskes to gange med ialt 200 cm ether.Efter tørring under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved20°C fås 71,79 g benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-a-D-glutamat medet smeltepunkt på 130°C.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,77 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding afethylacetat og methanol i volumenforholdet 4:1 som eluerings-middel.

Benzyl-L-alanyl-a-D-glutamat-hydrochloridet kan frem¬stilles på følgende måde.

97,16 g benzyl-N-tert.butyloxycarbonyl-L-alanyl-a-D- 3 -glutamat opløses i 970 cm af en vandfri opløsning af 1,7N saltsyre i eddikesyre. Opløsningen omrøres i 2 timer, hvor¬efter der hurtigt tilsættes 3,8 1 vandfri ether, og den frem¬komne blanding henstilles ved 0°C i 2 timer. Det dannedeolieagtige bundfald fraskilles fra den ovenstående væske veddekantering og opløses i 500 cm acetone. Den således frem¬komne opløsning koncentreres til tørhed under formindskettryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Herved fås 88,9 g ben-zyl-L-alanyl-a-D-glutamat-hydrochlorid.

Benzy1-N-tert.butyloxycarbonyl-L-alanyl-a-D-glutamatkan fremstilles ifølge den metode, som er beskrevet af E.Bricas et al., Biochemistry 9_, 823 (1970).

Eksempel 2 2,6 cm^ isobutylcfoTorformiat sættes til en til -5°Cafkølet opløsning af 9,12 g tert.buty1-N-(N-lauroyl - L-ala- 3 nyl)-α-D-glutamat i en blanding af 440 cm tetrahydrofuran 3 og 2,8 cm triethylamin. Reaktionsblandingen omrøres ved-5°C i 20 minutter, hvorefter der tilsættes en til 2°C af- g kølet opløsning af 6,82 g N -benzyloxycarbonyl-2(L),6(D,L)- 3 -diamino-4-thia-pimelamsyre i en blanding af 20 cm N na- 3 triumhydroxidopløsning og 172 cm vand.

Reaktionsblandingen omrøres i 5 minutter ved 0°C ogderpå i 20 timer ved ca. 20°C. Tetrahydrofuranet afdampesunder formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Detfremkomne koncentrat afkøles til 0°C og gøres surt til en 3 pH-værdi på 2 ved tilsætning af ca. 23 cm IN saltsyre. Det dannede bundfald fraskilles ved filtrering, vaskes med 100 3 3 cm IN saltsyre og derefter to gange med ialt 400 cm vand samt tørres i den fri luft. Herved fås 11,8 g af et svagt grønfarvet pulver, som chromatograferes på 250 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm) i en kolonne med diameteren 4 cm.

3

Herved opløses dette pulver i 150 cm eddikesyre, og tilden fremkomne opløsning sættes 20 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm). Den fremkomne blanding inddampes til tørhed un¬der formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C, og den fremkomneremanens anbringes i silicagelkolonnen. Der elueres førstmed 1 1 af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volu¬menforholdet 98:2 og derpå med 3,2 1 af en blanding af e-thylacetat og eddikesyre i volumenforholdet, og der opsamles 3 fraktioner med volumen 100 cm . Fraktionerne 17-42 forenesog koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Den fremkomne remamens udrives i 150 cm^ ether, 2 fraskilles ved filtrering og tørres. Herved fås 6,3 g N --[0^-tert.buty1-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-Y-D-glutamyl]-N^-benzyloxycarbonyl-2(L),6(D,L)-diamino-4-thia-pimelamsyre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,83 ved tyndtlags-chromatografi på silicagel med anvendelse af en blanding afeddikesyre og ethylacetat i volumenforholdet 3:1 som elue-ringsmiddel og en Rf-værdi på 0,63 ved tyndtlagschromatogra-fi på silicagel med anvendelse af en blanding af n-butanol,pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet 50:20:6:24som elueringsmiddel.

Masse-spektrometri: M = 779 (teoretisk = 779).

6,3 g N2-[O^-tert.butyl-N-(N-lauroyl-L-alanylH-D-glu- g tamyl]-N -benzyloxycarbonyl-2(L),6(D,L)-diamino-4-thia-pi-melamsyre opløses i en til 0°C afkølet blanding af 27,5 cnr 3 af en 35% opløsning af hydrogenbromid i eddikesyre, 9 cm 3 diethylphosphit og 14 cm diethylsulfid. Reaktionsblanding¬en omrøres i 1 time og 15 minutter og hældes derpå i 2 1vandfri ether afkølet til 0°C. Den fremkomne blanding om¬røres i 2 timer, hvorpå det dannede bundfald fraskilles vedfiltrering, vaskes fire gange med ialt 1,2 1 ether og tørresunder formindsket tryk (0,3 mm Hg, 0,04 kPa). Der fås her¬ved 7,5 g af et hygroskopisk, lyst beigefarvet pulver, somchromatograferes på 300 g neutralt silicagel (0,04-0,063mm) i en kolonne med diameteren 4 cm. Herved opløses dettepulver i en blanding .af 100 cm methanol og 4 cm ammoniak(d = 0,92), og til den fremkomne opløsning sættes 16 g neu¬tralt silicagel (0,04-0,063 mm). Den fremkomne blandinginddampes til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7kPa) ved 50°C, og den fremkomne remanens anbringes i sili-cagelkolonnen. Der elueres med 1,53 1 af en blanding af me¬thanol og ethylacetat i volumenforholdet 8:2, og der opsam- 3 les fraktioner med volumen 30 cm . Fraktionerne 35-51 for¬enes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Den fremkomne remanens udrives i100 cm2 ether, fraskilles ved filtrering og tørres ved 40°C under formindsket tryk (0,3 mm Hg, 0,04 kPa). Herved fås 4,05 g N^-[N-(N-lauroyl-L-alanyl)-y-D-glutamyl]-2(L),6(D,L)-dia-mino-4-thia-pimelamsyre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,41 ved tyndtlags-chromatografi på silicagel med anvendelse af en blanding afn-butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet50:20:6:24 som elueringsmiddel.

Masse-spektrometri: M = 589 (teoretisk = 589).

Analyse:

Beregnet, %: C 52,95 H 8,03 N 11,88 S 5,44

Fundet, %: C 48,6 H 7,4 N 10,9 S 4,9

Udgangsforbindelsen tert.butyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)--α-D-glutamat kan fremstilles på følgende måde.

55 g (α-tert.butyl) (y-benzyl)-N-(N-lauroyl-L-alanyl)--D-glutamat opløses i 4,7 1 tert.butanol. Der tilsættes 55g palladium-på-carbon (indeholdende 3% palladium), hvorefteren langsom hydrogengasstrøm ledes gennem blandingen i 7 tim¬er. Efter filtrering koncentreres reaktionsblandingen tiltørhed under formindsket tryk (først 20 mm Hg, 2,7 kPa ogderefter 0,3 mm Hg, 0,04 kPa) ved 50°C. Herved fås 47,1 g 3 af en tyk olie, som opløses i 500 cm af en mættet natrium-hydrogencarbonatopløsning. Den fremkomne opløsning ekstrahe- 3 res to gange med ialt 500 cm ethylacetat. Ethylacetatfasen 3 vaskes med 200 cm af en mættet natriumhydrogencarbonatop¬løsning. Vandfaserne forenes, gøres sure til en pH-værdi på 3-4 ved tilsætning af citronsyre og ekstraheres tre gange3 med ialt 600 cm ethylacetat. Den herved fremkomne organiskefase tørres over natriumsulfat og koncentreres til tørhedunder formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Hervedfås 36,5 g tert.butyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-a-D-glutamati form af en olie, som krystalliserer ved 20°C.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,67 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding afethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 9:1 som elue¬ringsmiddel .

Masse-spektrometri: M = 456 (teoretisk = 456).

Udgangsforbindelsen (a-tert.butyl) (y-benzyl)-N-(N--lauroyl-L-alanyl)-D-glutamat kan fremstilles på følgendemåde.

23,2 ciri isobutylchlorformiat sættes til en til -7°C

afkølet opløsning af 48 g N-lauroyl-L-alanin i en blanding 3 3 ~ af 300 cm tetrahydrofuran og 24,9 cm triethylamin. Blan¬dingen omrøres i 20 minutter ved -7°C, hvorefter der til¬sættes en opløsning af 80 g (α-tert.butyl) (y-benzyl)-D- 3 -glutamat i 330 cm tetrahydrofuran. Den fremkomne reaktions¬blanding omrøres i 30 minutter ved en temperatur nær 0°Cog derefter i 16 timer ved en temperatur nær 20°C. Reak¬tionsblandingen filtreres derefter, og filtratet koncentre¬res til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa)ved 45°C. Den tilbageblevne olie optages i 1,5 1 ethylace-tat, afkøles til 5°C og vaskes med 400 cm^ af en mættet ogisafkølet citronsyreopløsning, fire gange med ialt 1,2 1 af 3 en mættet natriumhydrogencarbonatopløsning og med 300 cmaf en mættet natriumchloridopløsning. Efter tørring over na¬triumsulfat koncentreres den organiske fase til tørhed underformindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 45°C. Der fås her¬ved 79 g af en lysegul olie, som chromatograferes i en ko¬lonne med diameteren 8 cm indeholdende 2,4 kg neutralt sili-cagel (0,063-0,2 mm). Der elueres successivt med 3 1 af enblanding af cyclohexan og ethylacetat i volumenforholdet85:15, 2,4 1 af en blanding af cyclohexan og ethylacetat ivolumenforholdet 80:20, 15,6 1 af en blanding af cyclohexanog ethylacetat i volumenforholdet 75:25, 2,4 1 af en blan¬ding af cyclohexan og ethylacetat i volumenforholdet 70:30, 2,4 1 af en blanding af cyclohexan og ethylacetat i volumen¬forholdet 65:35, 3 1 af en blanding af cyclohexan og ethyl¬acetat i volumenforholdet 60:40, 4,2 1 af en blanding af cy¬clohexan og ethylacetat i volumenforholdet 50:50 og 4,2 1af en blanding af cyclohexan og ethylacetat i volumenforhol- 3 det 40:60, og der opsamles fraktioner med volumen 600 cm .Fraktionerne 34-60 forenes og koncentreres til tørhed underformindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 40°C. Der fås her¬ved 55 g (a-tert.butyl) (y-benzyl)-N-(N-lauroyl-L-alanyl)- -D-glutamat i form af en gul olie.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,55 ved tyndtlagschro¬ma tograf i på silicagel med anvendelse af en blanding af ligevolumendele cyclohexan og ethylacetat som elueringsmiddel.

Udgangsforbindelsen (α-tert.butyl) (γ-benzyl)-D-gluta¬mat kan fremstilles på følgende måde.

I løbet af 15 minutter sættes 49 cm svovlsyre (d =1,83) til en til 13°C afkølet suspension af 64 g y-benzyl--D-glutamat i 500 cm dioxan. Den således fremkomne opløs¬ning holdes ved en temperatur på 13°C, og gennem opløsningenledes en strøm af isobuten i 40 minutter. Reaktionsblanding¬en holdes derefter ved 20°C i 16 timer, hvorefter der på nyledes en strøm af isobuten gennem blandingen i 4 timer, ogderpå får blandingen lov til at hvile i 20 timer. I løbet af10 minutter sættes reaktionsblandingen derefter til en til0°C afkølet blanding af 2,6 1 N natriumhydroxidopløsning og 4,5 1 ether. Den organiske fase fraskilles, og vandfasen ek-straheres med 1 1 ether. De således fremkomne organiske faseiforenes, tørres over natriumsulfat og koncentreres under for¬mindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 32°C. Herved fås 80 g(α-tert.butyl) (y'-benzyl)-D-glutamat indeholdende ca. 20%dioxan og 10% benzylalkohol. En koncentrering under laveretryk eller højere temperatur mindsker udbyttet. Det såledesfremkomne produkt bør anvendes inden for nogle døgn efterisoleringen.

N-lauroyl-L-alanin kan fremstilles ifølge den metode,som er beskrevet af E. Jungermann et al., J. Amer. Chem.

Soc. 78, 172 (1956).

γ-Benzyl-D-glutamat kan fremstilles ifølge den metode,som er beskrevet af P. Lefrancier og E. Bricas, Bull. Soc.Chim. France, 1965, 3668.

g N -Benzyloxycarbonyl-2(L),6(D,L)-diamino-4-thia-pime-lamsyre kan fremstilles på følgende måde.

En opløsning af 24,3 g kaliumhydroxidpastiller i 280 3 cm vandfri ethanol sættes til en opløsning af 25,35 g L- 3 -cystein-hydrochlorid-hydrat i 280 cm dimethylformamid. Tilden således fremkomne grød sættes en opløsning af 56,65 g N-benzyloxycarbonyl-0-p-toluensulfonyl-D,L-serinamid i 2803 cm vandfri ethanol. Reaktionsblandingen omrøres i 5 timerved 20°C, hvorefter der frafiltreres et uopløseligt stof/ 3 som vaskes to gange med ialt 60 cm ethanol. Filtraterneforenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk(20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 60°C. Den herved fremkomne halvkry¬stallinske remanens optages i 300 cm3 vand opvarmet til 50°C.Et uopløseligt stof fraskilles ved filtrering, og filtratetafkøles til 0°C, gøres surt til en pH-værdi på 6-7 ved til¬sætning af 5,5 cm3 vandfri eddikesyre og holdes ved 0°C i20 timer.

Det uopløselige stof fraskilles ved filtrering, vas- 3 kes to gange med ialt 200 cm vand, to gange med ialt 120 3 3 cm ethanol og derefter med 100 cm isopropylether samt tør¬res under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Der g fås 27 g N -benzyloxycarbonyl-2(L),6(D,L)-diamino-4-thia--pimelamsyre, som smelter ved 185°C under sønderdeling.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,50 ved tyndtlags-chromatografi på silicagel med anvendelse af en blanding afn-butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet50:20:6:24 som elueringsmiddel.

Masse-spektrometri: M = 341 (teoretisk = 341).

ttX) 436 = +6° (N HCl' C =1) ·

Lan 0,45 (teoretisk = 0,5) meso-Lan 0,55 (teoretisk = 0,5) N-Benzyloxycarbonyl-0-p-toluensulfonyl-D,L-serinamidkan fremstilles ifølge den metode, som er beskrevet af L.Benoiton et al., J. Chem. Soc. s. 824 (1964).

Eksempel 3

0,53 cm3 isobutylchlorformiat sættes til en til -5°C

afkølet opløsning af 720 mg N-tert.butyloxycarbonylglycin i 3 3 en blanding af 60 cm tetrahydrofuran og 0,57 cm triethyl- amin. Reaktionsblandingen omrøres ved -5°C i 20 minutter,hvorefter der tilsættes en til 0°C afkølet opløsning af2,55 g N2-[N-(N-lauroyl-L-alanyl)-y'-D-glutamyl3-2(L) ,6- 3 (D,L)-diamino-4-thia-pimelamsyre i 50 cm vand. Reaktions-blandingen omrøres i nogle minutter ved 0°C og derefter i18 timer ved ca. 15°C. Tetrahydrofuranet afdampes underformindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 45°C. Det fremkom¬ne koncentrat gøres surt til en pH-værdi på 2 ved tilsæt- 3 ning af 1 cm eddikesyre og ekstraheres tre gange med ialt 3 90 cm ethylacetat. De organiske faser forenes, vaskes med 3 10 cm vand, tørres over natriumsulfat og koncentreres tiltørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 45°C.

3

Den fremkomne remanens udrives i 50 cm ether og tørres un¬der formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 20°C. Der fåsherved 2,72 g af et orangefarvet pulver, som chromatografe-res på 115 g neutralt silieagel (0,04-0,063 mm) i en kolonnemed diameteren 2,5 cm. Herved opløses dette pulver i 40 3 cm eddikesyre, og til den fremkomne opløsning sættes 12 gneutralt silieagel (0,04-0,063 mm). Den fremkomne blandinginddampes til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7kPa) ved 55°C, og remanensen anbringes i silicagelkolonnen.Der elueres først med 1,68 1 af en blanding af ethylacetatog eddikesyre i volumenforholdet 9:1 og derefter med 1,5 1af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforhol- 3 det 8:2, og der opsamles fraktioner med volumen 60 cm .Fraktionerne 14-53 forenes og koncentreres til tørhed underformindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Remanensen 3 udrives i 50 cm ether, fraskilles ved filtrering og tørresunder formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 20°C. Hervedfås 1,8 g N2-[N-(N-lauroyl-L-alanyl)-y-D-glutamyl]-N^-tert.-butyloxycarbonylglycyl-2(L),6(D,L)-diamino-4-thia-pimelam-syre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,43 ved tyndtlagschro-matografi på silieagel med anvendelse af en blanding af n-butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet 50:-20:6:24 som elueringsmiddel.

1,8 g N2-[N-(N-lauroyl-L-alanyl)-γ-D-glutamyl]-N^- -tert.butyloxycarbonylglycyl-2(L),6(D,L)-diamino-4-thia- 3 -pimelamsyre opløses i 36 cm af en vandfri opløsning af1/7 N saltsyre i eddikesyre. Reaktionsblandingen omrøresi 2 timer, hvorefter et meget let, uopløseligt stof fraskil- 3 les ved filtrering. Til filtratet sættes 15 cm ether, hvor¬på blandingen omrøres i 15 minutter. Det dannede bundfaldfraskilles ved filtrering, vaskes tre gange med ialt 60cm ether og tørres under formindsket tryk (20 mm Hg, '2,7kPa) ved 20°C. Herved fås 1,44 g af et pulver, som opløses 3 i 25 cm vand. Til den fremkomne opløsning sættes først 0,5 3 3 cm triethylamin og derpå 0,5 cm eddikesyre. Efter 15 mi¬nutters hvile i et bad ved 0°C fraskilles det dannede bund¬fald ved filtrering, hvorpå bundfaldet vaskes to gange med 3 ialt 10 cm vand og tørres under formindsket tryk (20 mmHg, 2,7 kPa) ved 20°C. Herved fås 1,18 g af et pulver, somchromatograferes på 42 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm) i en kolonne med diameteren 2,5 cm. Herved opløses dette 3 3 pulver i 50 cm methanol indeholdende 0,25 cm koncentreret ammoniak, og til den fremkomne opløsning sættes 5 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm). Den fremkomne blanding inddampes til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C, og remanensen anbringes i silicagelkolonnen. Der elue- res med methanol, og der opsamles fraktioner med volumen 3 30 cm . Fraktionerne 14-26 forenes og koncentreres til tør¬hed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C.Herved fås 630 mg N^-[N-(N-lauroyl-L-alanyl)-/-D-glutamyl]--N -glycyl-2(L),6(D,L)-diamino-4-thia-pimelamsyre.

Produktet giver en Rf-wærdi på 0,30 ved tyndtlags-chromatografi på silicagel med anvendelse af en blanding afn-butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet50:20:6:24 som elueringsmiddel.

Analyse:

Beregnet, %: C 52,00 H 7,79 N 12,99 S 4,96

Fundet, %: C 49,1 H 7,7 N 12,00 S4,6

Efter hydrolyse i en blanding af lige volumendele kon¬centreret saltsyre og vandfri eddikesyre i 5 timer ved 96°C

Viser en analyse ved hjælp af BIOTRONIK autoanalysator til¬stedeværelse af følgende aminosyrer:

Glu = 0,92 (teoretisk = 1)

Gly = 1,03 (teoretisk = 1)

Lan = 0,55 (teoretisk = 0,5)meso-Lan = 0,45 (teoretisk = 0,5)

Eksempel 4 0,3 cia isobutylchlorformiat sættes til en til -5°Cafkølet opløsning af 1,05 g tert.butyl-N-(N-lauroyl-L-ala- 3 nyl)-α-D-glutamat i en blanding af 45 cm tetrahydrofuran og0,32 crn triethylamin. Reaktionsblandingen omrøres ved -5°Ci 20 minutter, hvorefter der tilsættes en til 0°C afkøletopløsning af 1 g N^-benzyloxycarbonyl-2(blanding af D og L),- 6(L)-diamino-4-thia-pimelamoyl-glycin-hydrochlorid i 3 3 en blanding af 4,6 cm IN natriumhydroxidopløsning, 23 cm 3 vand og 17 cm tetrahydrofuran. Reaktionsblandingen omrøresi nogle minutter ved 0°C og derpå i 20 timer ved ca. 20°C,hvorpå den gøres sur til en pH-værdi på 3 ved tilsætning af 3 2,5 cm IN saltsyre. Tetrahydrofuranet afdampes under for¬mindsket tryk (20 mm Hg) ved 50°C. Det fremkomne koncentrat 3 fortyndes ved tilsætning af 25 cm vand. Det· dannede bund¬fald fraskilles ved filtrering, vaskes tre gange med ialt 3 15 cm destilleret vand og tørres under formindsket tryk(20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 20°C. Der fås herved 1,82 g af etpulver, som chromatograferes på 91 g silicagel (0,04-0,063 mm) i en kolonne med diameteren 2,5 cm. Der elueres succesivt 3 med 200 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i 3 volumenforholdet 95:5, 240 cm af en blanding af ethylacetat 3 og eddikesyre i volumenforholdet 9:1, 240 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 8:2 og 2003 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumen- 3 forholdet 1:1, og der opsamles fraktioner med volumen 40 cm .Fraktionerne 16-21 forenes og koncentreres til tørhed underformindsket tryk (20 mm Hg) ved 20°C. Herved fås 510 mg N^--[0^-tert.butyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-^-D-glutamyl]-N^--benzyloxycarbonyl-2 (blanding af D og L),6 (L) -diamino-4-thia--pimelamoy1-glycin.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,76 ved tyndtlags-chromatografi på silicagel med anvendelse af en blanding afn-butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet50:20:6:24 som elueringsmiddel.

470 mg N2- [01-tert.butyl-N- (N-lauroyl-L-alanyl) -y-

C

-D-glutamyl]-N-benzyloxycarbony1-2-(blanding af D og L),6- 3 (L)-diamino-4-thia-pimelamoyl-glycin i 5 cm af en 33% op¬løsning af hydrogenbromid i eddikesyre. Reaktionsblandingenomrøres ved 20°C i 40 minutter, hvorefter nitrogengas boblesgennem blandingen i 10 minutter. Reaktionsblandingen kon¬centreres derpå til tørhed under formindsket tryk (først20 mm Hg, 2,7 kPa og derpå 0,3 mm Hg, 0,04 kPa) ved 50°C.

3

Remanensen udrives i 20 cm ether, fraskilles ved filtre^- 3 ring, vaskes med 5 cm ether og tørres under formindskettryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 20°C. Der fås herved 530 mg af 3 et orangefarvet pulver, som opløses i 20 cm vand. Til den 3 fremkomne opløsning sættes 0,2 cm triethylamin og derefter0,2 cm eddikesyre. Reaktionsblandingen afkøles til 0°C i15 minutter. Det herved dannede bundfald fraskilles ved fil- 3 trering, vaskes fem gange med ialt 10 cm vand og tørresunder formindsket tryk (0,3 mm Hg, 0,04 kPa) ved 20°C. Her¬ved fås 360 mg af et pulver, som chromatograferes på 36 gsilicagel (0,04-0,063 mm) i en kolonne med diameteren 2,5cm. Der elueres med methanol, og der opsamles fraktioner 3 med volumen 5 cm . Fraktionerne 5-16 forenes og koncentre¬res til tørhed under formindsket tryk (0,3 mm Hg, 0,04 kPa)ved 50°C. Herved fås 160 mg N2-[N-(N-lauroyl-L-alanyl)-/--D-glutamyl]-2(blanding af D og L),6(L)-diamino-4-thia-pi-melamoyl-glycin.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,26 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding af n-butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet50:20:6:24 som elueringsmiddel.

Analyse:

Beregnet, %: C 52,00 H 7,79 N 12,99 S 4,96

Fundet, %: C 47,1 H 7,3 N 11,4 S 4,6

Efter hydrolyse i en blanding af lige volumendele kon¬centreret saltsyre og vandfri eddikesyre i 5 timer ved 96°Cviser en analyse ved hjælp af BIOTRONIK autoanalysator nær¬værelse af følgende aminosyrer:

Yderligere 90 mg N2-[N-(N-lauroyl-L-alanyl)-y-D-glu-tamyl]-2(blanding af D og L),6(L)-diamino-4-thia-pimelamoyl--glycin kan fremstilles på følgende måde.

Fraktionerne 3 og 4 forenes og koncentreres til tørhedunder formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C, og re¬manensen chromatograferes på 22 g silicagel (0,04-0,063 mm) i en kolonne med diameteren 2,5 cm. Der elueres med metha- 3 nol, og der opsamles fraktioner med volumen 5 cm . Fraktion¬erne 7-18 forenes og koncentreres til tørhed under formind¬sket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C, og remanensen tør¬res under formindsket tryk (0,3 mm Hg, 0,04 kPa) ved 50°C.

C

N -Benzyloxycarbony1-2(blanding af D og L),6(L)-di-amino-4-thia-pimelamoyl-glycin kan fremstilles på følgendemåde.

2 6 2 g tert.buty1-N -tert.butyloxycarbonyl-N -benzyloxy-carbonyl-2(blanding af D og L),6(L)-diamino-4-thia-pimela- 3 moyl-glycinat opløses i 20 cm af en vandfri opløsning af1,65 N saltsyre i eddikesyre. Reaktionsblandingen omrøresved 20°C i 2 timer, hvorefter der tilsættes 50 cm2·ether.Herved fås et hvidt bundfald, som fraskilles ved filtrering, 3 vaskes to gange med ialt 20 cm ether og tørres under for¬mindsket tryk (0,3 mm Hg, 0,04 kPa) ved 20°C. Herved fås g 1,13 g N -benzyloxycarbony1-2(blanding af D og L),6(L)-di-amino-4-thia-pimelamoy1-glycin-hydrochlorid.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,38 ved tyndtlags-chromatografi på silicagel med anvendelse af en blanding afn-butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet50:20:6:24 som elueringsmiddel.

Udgangsforbindelsen tert.buty1-NA-tert.butyloxycarbo-

C

nyl-N -benzyloxycarbony1-2(blanding af D og L),6(L)-diamino--4-thia-pimelamoyl-glycinat kan fremstilles på følgende må¬de.

3

En opløsning af 253 mg kaliumhydroxidpastiller i 9 cmvandfri ethanol sættes til en opløsning af 1,14 g N-benzyl- 3 oxycarbonyl-L-cysteinamid i 9 cm dimethylformamid. Den herved fremkomne opløsning sættes til en suspension af 1,98 g tert.butyl-N-tert.butyloxycarbonyl-O-p-toluensulfonyl-L- 3 -seryl-glycinat i 9 cm ethanol. Reaktionsblandingen omrø¬res i 4 timer ved 20°C. Herved fås en lysegul opløsning,som koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mmHg, 2,7 kPa) ved 60°C. Den fremkomne remanens udrives i50 cin vand, holdes ved 5°C i 48 timer, fraskilles ved fil- 3 trering, vaskes med 10 cm vand og tørres under formindsket tryk (0,3 mm Hg, 0,04 kPa) ved 20°C. Herved fås 2,1 g tert.-2 6 butyl-N -tert.butyloxycarbonyl-N -benzyloxycarbony1-2(blan¬ding af D og L),6(L)-diamino-4-thia-pimelamoyl-glycinat iform af et hvidt pulver.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,72 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af ethylacetat somelueringsmiddel.

Masse-spektrometri: M = 554 (teoretisk = 554).

Udgangsforbindelsen tert.butyl-N-tert.butyloxycarbo-nyl-O-p-toluensulfonyl-L-seryl-glycinat kan fremstilles påfølgende måde.

Til en til -6°C afkølet opløsning af 2,58 g tert.bu- 3 ty 1-N-tert.butyloxycarbonyl-L-seryl-glycinat i 9 cm pyridmsættes 3,09 g p-toluensulfonylchlorid i små portioner i lø¬bet af 3 minutter. Reaktionsblandingen holdes ved -6°C i 2timer og hældes derpå på 60 g knust is. Den fremkomneblanding holdes ved 4°C i 20 timer. Det dannede bundfaldfraskilles ved filtrering, vaskes fem gange med ialt 100cm^ vand, tørres under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 20°Cog omkrystalliseres i 100 cm ethanol. Herved fås 2,54 gtert.butyl-N-tert.butyloxycarbonyl-O-p-toluensulfonyl-L-se-ryl-glycinat med et smeltepunkt på 180-182°C.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,91 ved tyndtlags-chromatografi på silicagel med anvendelse af ethylacetatsom elueringsmiddel.

Udgangs forbindeIs en tert.butyl-N-tert.butyloxycarbo¬ny 1-L-sery 1-glycinat kan fremstilles på følgende måde.

Til en til 5°C afkølet opløsning af 6,16 g N-tert.bu¬ty loxycarbonyl-L-serin og 3,93 g tert.butylglycinat i 100 3 cm methylenchlorid sættes 6,81 g dicyclohexylcarbodiimid.Reaktionsblandingen omrøres i 30 minutter ved 5°C og derpåi 18 timer ved ca. 20°C. Det dannede bundfald af dicyclo-hexylcarbamid fraskilles ved filtrering og vaskes to gange 3 med ialt 40 cm methylenchlorid. De organiske faser forenes, 3 vaskes tre gange med ialt 90 cm af en mættet natriumhydro- 3 gencarbonatopløsning og to gange med ialt 60 cm vand, tør¬res over natriumsulfat og koncentreres til tørhed under for¬mindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 20°C. Der fås herved10,22 g af en olie, som chromatograferes på 100 g neutraltsilicagel (0,04-0,063 mm) i en kolonne med diameteren 3,4 3 cm. Der elueres først med 500 cm af en blanding af cyclo- hexan og ethylacetat i volumenforholdet 1:1 og derpå med3 600 cm af en blanding af cyclohexan og ethylacetat i volu¬menforholdet 1:3, og der opsamles fraktioner med volumen 100 3 cm . Fraktionerne 5-8 forenes og koncentreres til tørhed un¬der formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Herved fås 2,64 g tert.butyl-N-tert.butyloxycarbonyl-L-seryl-gly-cinat i form af en olie, som langsomt krystalliserer.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,68 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af ethylacetat somelueringsmiddel.

Eksempel 5 1,3 cm3 isobutylchlorformiat sættes til en til -10°Cafkølet opløsning af 4,56 g tert.butyl-N-(N-lauroyl-L-ala- 3 nyl)-α-D-glutamat i en blanding af 230 cm tetrahydrofuran 3 og 1,4 cm triethylamin. Reaktionsblandingen omrøres ved -10°C i 25 minutter, hvorefter der tilsættes en. til 0°C af- 2 kølet opløsning af 3,78 g N -benzyloxycarbonyl-2(L),6(D,L)- 3 -diamino-4-thia-pimelamsyre-hydrochlorid i 100 cm 0,1 Nnatriumhydroxidopløsning.

Reaktionsblandingen omrøres i 5 minutter ved 0°C ogderpå i 18 timer ved ca. 20°C. Tetrahydrofuranet afdampesunder formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Detfremkomne koncentrat gøres surt til en pH-værdi på 2 ved 3 tilsætning af ca. 15 cm IN saltsyre. Den dannede olie . 3 fraskilles ved dekantering og udrives l 200 cm ether. Derfås et amorft fast stof, som fraskilles ved filtrering og 3 vaskes tre gange med ialt 600 cm ether. Det fremkomne pro- 3 dukt omrøres meget kraftigt i 100 cm kogende ethylacetat,hvorefter der afkøles til 20°C og tilsættes 100 cm ether.Den fremkomne suspension afkøles til 0°C i 15 minutter, ogdet uopløselige stof fraskilles ved filtrering, vaskes med 3 100 cm ether og tørres under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 20°C. Der fås 5,15 g N-benzyloxycarbonyl-N-[0^-tert.butyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)~y-D-glutamyl]-2(L),-6(D,L)-diamino-4-thia-pimelamsyre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,69 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding afethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 3:1 som elue¬ringsmiddel .

Masse-spektrometri: M = 779 (teoretisk = 779).

5 g N3-benzyloxycarbonyl-N^-[O^-tert-butyl-N-(N-lau- royl-L-alanyl) -y-D-glutamyl]-2 (1,),6 (D,L) -diamino-4-thia-pi- 3 melamsyre opløses 1 30 cm af en 28% opløsning af hydrogen-bromid i eddikesyre. Reaktionsblandingen omrøres i 3 timer,hvorefter den filtreres til fjernelse af et let, uopløseligtstof. Filtratet koncentreres under formindsket tryk (først20 mm Hg, 2,7 kPa og derpå 0,3 mm Hg, 0,04 kPa) ved 50°C.

3

Den herved fremkomne remanens udrives i 400 cm ether, fra¬skilles ved filtrering og optages i 1,5 1 vand under kraftigomrøring. Remanensen solubiliseres øjeblikkeligt i vandet,men efter nogle minutter sker der igen en udfældning. Bund¬faldet fraskilles ved filtrering, vaskes successivt med 50 3 3 3 3 cm vand, 50 cm ether, 50 cm ethylacetat og 50 cm ether samt tørres under formindsket tryk (0,3 mm Hg, 0,04 kPa) ved50°C. Der fås herved 3,2 g N^-[N-(N-lauroyl-L-alanyl)-y-D--glutamyl]-2(L),6(D,L)-diamino-4-thia-pimelamsyre, som smel¬ter ved 176°C under sønderdeling.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,32 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding af n-butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet50:20:6:24 som elueringsmiddel.

Analyse:

Beregnet, %: C 52,95 H 8,03 N 11,87 S 5,44

Fundet, %: C 49,7 H 7,7 N 11,0 S 5,1

Sulfataske, %: 3,9

Lan = 0,55 (teoretisk = 0,5) meso-Lan = 0,50 (teoretisk = 0,5)

Glu = 1,00 (teoretisk = 1) 2 N -Benzyloxycarbonyl-2(L),6(D,L)-diamino-4-thia-pi- melamsyre-hydrochloridet kan fremstilles på følgende måde.

2 6

Til en opløsning af 37 g N -benzyloxycarbonyl-N -tert.- butyloxycarbonyl-2(L),6(D,L)-diamino-4-thia-pimelamsyre i 3 3 100 cm vandfri eddikesyre sættes 500 cm af en vandfri op- løsning af 1,65 N saltsyre i eddikesyre. Reaktionsblandingenomrøres i 2 timer ved en temperatur nær 20°C og koncentreresderefter til tørhed under formindsket tryk (først 20 mm Hg, 2,7 kPa og derpå 0,3 mm Hg, 0,04 kPa) ved 50°C. Remanensenudrives fire gange i ialt 2 1 ether, hvorpå den fraskilles 3 ved filtrering, vaskes tre gange med ialt 600 cm ether og tørres under formindsket tryk (0,3 mm Hg, 0,04 kPa) ved 20°C.

2

Herved fås 19,1 g N -benzyloxycarbonyl-2(L),6(D,L)-diamino--4-thia-pimelamsyre-hydrochlorid.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,48 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding af n-butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet50:20:6:24 som elueringsmiddel.

[a]^1 = -22,8° (N HC1, c = 1).

Efter hydrolyse i en blanding af lige volumendele kon¬centreret saltsyre og vandfri eddikesyre i 5 timer ved 96°Cviser en analyse ved hjælp af BIOTRONIK autoanalysator nær-. værelse af følgende aminosyrer:

Lan = 0,5 (teoretisk =0,5) meso-Lan = 0,5 (teoretisk =0,5) 2 6 N -Benzyloxycarbonyl-N -tert.butyloxycarbony1-2(L),-6(D,L)-diamino-4-thia-pimelamsyre kan fremstilles på følgendemåde.

En opløsning af 16,8 g kaliumhydroxidpastiller i 190 3 cm vandfri ethanol sættes til en opløsning af 25,5 g N-ben- 3 zyloxycarbonyl-L-cystein i 190 cm dimethylformamid. Til densåledes fremkomne opløsning sættes en opløsning af 35,8 gN-tert.butyloxycarbonyl-O-p-toluensulfonyl-DL-serinamid i 3 190 cm dimethylformamid. Reaktionsblandingen omrøres i 18timer ved 20°C og koncentreres derefter til tørhed under for¬mindsket tryk (først 20 mm Hg, 2,7 kPa og derpå 0,3 mm Hg,0,04 kPa) ved 60°C. Remanensen optages i 250 cm^ vand, og den 3 fremkomne opløsning ekstraheres tre gange med ialt 600 cmethylacetat og gøres sur til en pH-værdi på 3 med ca. 40 gcitronsyre. Den fremkomne vandfase ekstraheres tre gange med 3 ialt 600 cm ethylacetat. De organiske faser forenes, vas- 3 kes med 100 cm af en mættet natriumchloridopløsning, tørres over natriumsulfat og koncentreres til tørhed under formind¬sket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Herved fås 37 g2 6 N-benzyloxycarbonyl-N -tert.butyloxycarbonyl-2(L),6(D,L)--diamino-4-thia-pimelamsyre i form af en orangefarvet olie.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,49 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding afethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 9:1 som elue-ringsmiddel og en Rf-værdi på 0,52 ved tyndtlagschromatogra-fi på silicagel med anvendelse af en blanding af n-butanol,pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet 50:20:6:24som elueringsmiddel.

N-Benzyloxycarbonyl-L-cystein kan fremstilles ifølgeden metode, som er beskrevet, af W. Foye et al., J. Am. Pharm.Ass. 46, 273 (1957).

N-Tert.butyloxycarbonyl-O-p-toluensulfonyl-DL-serin-amid kan :fremstilles på følgende måde.

Til en til en temperatur på mellem -20 og -10°C af¬kølet opløsning af 67 g N-tert.butyloxycarbonyl-DL-serin- 3 amid i 280 cm pyridin sættes 67,5 g p-toluensulfonylchlo-rid i små portioner i løbet af 20 minutter. Reaktionsblan¬dingen holdes i 1,5 timer ved en temperatur på mellem -10og -5°C, hvorefter den holdes ved 20°C i 2,5 timer. Reak¬tionsblandingen hældes derpå på 550 g af en blanding af isog vand. Det herved dannede hvide bundfald fraskilles vedfiltrering, vaskes fire gange med ialt 1,2 1 vand, tørres i 3 luft, vaskes to gange med ialt 400 cm ether og tørres un¬der formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Hervedfås 73,3 g N-tert.butyloxycarbonyl-O-p-toluensulfony1-DL--serinamid med et smeltepunkt på 161°C.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,82 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding afethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 9:1 som elue-ringsmiddel.

N-Tert.butyloxycarbonyl-DL-serinamid kan fremstillespå følgende måde.

Gennem en til 0°C afkølet opløsning af 217 g methyl--N-tert.butyloxycarbonyl-DL-serinat i 2,17 1 methanol ledesen strøm af ammoniak i 7 timer. Reaktionsblandingen får der- på lov til at hvile i 15 timer ved 20°C, hvorpå den på nyafkøles til 0°C. Derefter ledes en strøm af ammoniak gennemreaktionsblandingen i 6 timer, hvorefter blandingen fårlov til at hvile ved 20°C i 18 timer. Reaktionsblandingenkoncentreres derpå under formindsket tryk (20 mm .Hg, 2,7kPa) ved 50°C. Remanensen optages i 1,5 1 ether. De dannedekrystaller fraskilles ved filtrering, vaskes tre gange medialt 1,5 1 ether og tørres i luften. Herved fås 158 g N--tert.butyloxycarbonyl-DL-serinamid med et smeltepunkt på115-116°C.

Methyl-N-tert.butyloxycarbonyl-DL-serinat kan frem¬stilles ifølge den metode, som er beskrevet af N. Boggs etal., J. Org. Chem., _44, 2262 (1979).

Eksempel 6

0,28 cm^ isobutylchlorformiat sættes til en til -10°C

afkølet opløsning af 382 mg N-tert.butyloxycarbonylglycin i 3 3 en blanding af 32 cm tetrahydrofuran og 0,3 cm triethyl-amin. Den fremkomne blanding omrøres i 20 minutter ved -10°C,hvorefter der tilsættes en til 0°C afkølet opløsning af 1,28g N^- [N- (N-lauroyl-L-alanyl) -/-D-glutamyl]-2 (L) , 6(D,L)-di- 3 amino-4-thia-pimelamsyre i en blanding af 4,34 cm IN na- 3 triumhydroxidopløsning og 32 cm vand. Reaktionsblandingenomrøres i 5 minutter ved 0°C og derpå i 70 timer ved ca.

20°C. Tetrahydrofuranet afdampes under formindsket tryk(20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Det fremkomne koncentrat gøres 3

surt til en pH-værdi på 2 ved tilsætning af ca. 5 cm IN

3 saltsyre og ekstraheres tre gange med ialt 90 cm ethylace- tat. De organiske faser forenes, tørres over natriumsulfat og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Herved fås 1,7 g af et hvidt pulver, som chromatograferes på 50 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm) i.en kolonne med diameteren 2,4 cm. Der elueres successivt3 3 med 120 cm ethylacetat, 560 cm af en blanding.af ethylace-tat og eddikesyre i volumenforholdet 95:5, 1,12 1 af enblanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 3 90:10 og 480 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 80:20, og der opsamles fraktioner med3 volumen 40 cm . Fraktionerne 25-57 forenes og koncentrerestil tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved50°C. Remanensen udrives tre gange i ialt 90 on ether og tørres under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C.

2 6Herved fås 490 mg N -(tert.butyloxycarbonylglycyl)-N -[N- -(N-lauroyl-L-alanyl)-y-D-glutamyl]-2(L),6(D,L)-diamino-4- -thia-pimelamsyre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,48 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding af n-butanol, pyridin, éddikesyre og vand i volumenforholdet 50:-20:6:24 som elueringsmiddel og en Rf-værdi på 0,24 ved tyndt-lagschromatografi på silicagel med anvendelse af en blandingaf ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 3:1 som elu-eringsmiddel.

2 6490 mg N -(tert.butyloxycarbonylglycyl)-N -[N-(N-lau¬royl-L-alanyl) -y-D-glutamyl]-2(L),6(D,L)-diamino-4-thia-pi- 3 me lamsyre opløses i 10 cm af en vandfri opløsning af 1,65 N salt¬syre i eddikesyre. Reaktionsblandingen omrøres i 2,25 timerved en temperatur nær 20°C, filtreres derefter til fjernelseaf et let,uopløseligt stof og koncentreres til tørhed underformindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Remanensen 3 udrives i 50 cm ethylacetat, fraskilles ved filtrering ogvaskes tre gange med ialt 150 cm ether. Herved fås 0,42 gaf et hvidt pulver, som chromatograferes på 24 g neutraltsilicagel (0,04-0,063 mm) i en kolonne med diameteren 1,6cm. Der elueres med eddikesyre, og der opsamles fraktioner 3 med volumen 10 cm . Fraktionerne 24-45 forenes og koncentre¬res til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa)ved 45°C. Remanensen udrives i 50 cm^ ethylacetat, fraskil- 3 les ved filtrering, vaskes tre gange med ialt 90 cm etherog tørres under formindsket tryk (0,3 mm Hg, 0,04 kPa) ved50°C. Herved fås 200 mg N^-glycyl-N^-[N-(N-lauroyl-L-alanyl)--y-D-glutamyl]-2(L),6(D,L)-diamino-4-thia-pimelamsyre-hydro-chlorid.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,29 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding af n- ^butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet50:20:6:24 som elueringsmiddel.

Analyse:

Beregnet, %: C 49,22 H 7,62 Cl 5,19 N 12,30 S 4,69

Fundet, %: C 45,6 H 7,5 Cl 4,6 N 11,5 S 4,6

Masse-spektrometri: M = 646 (teoretisk for basen = 646).

Efter hydrolyse i en blanding af lige volumendele kon¬centreret saltsyre og vandfri eddikesyre ved 96°C,i 5 timerviser en analyse ved hjælp af BIOTRONIK autoanalysator nær¬værelse af følgende aminosyrer:

Lan = 0,59 (teoretisk =0,5)meso-Lan = 0,43 (teoretisk =0,5)

Glu = 0,97 (teoretisk = 1)

Gly = 1,00 (teoretisk = 1)

Eksempel 7 0,65 cm isobutylchlorformiat sættes til en til -10°Cafkølet opløsning af 2,28 g tert.butyl-N-(N-lauroyl-L-ala- 3 nyl)-a-D-glutamat i en blanding af 125 cm tetrahydrofuran3 og 0,7 cm triethylamin. Reaktionsblandingen omrøres i 40 minutter ved -10°C, hvorefter der tilsættes en til 0°C af- 2 kølet opløsning af 1,9 g N -benzyloxycarbonyl-L-lanthionin- 3 diamid-hydrochlorid i en blanding af 5 cm IN natriumhy- 3 droxidopløsning og 50 cm vand. Reaktionsblandingen omrøresi 20 minutter ved 0°C og derpå i 70 timer ved ca. 20°C. Det dannede bundfald fraskilles ved filtrering, vaskes succes- 3 3 3 sivt med 25 cm vand, 25 cm ethanol og 50 cm isøpropyle- ther og tørres under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 20°C. Herved fås 2,9 g N^-[O^-tert.butyl-N-(N-lauroyl- 6 -L-alanyl)-y-D-glutamyl]-N -benzyloxycarbonyl-L-lanthionin-diamid.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,41 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel méd anvendelse af en blanding afethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 9:1 som elue-ringsmiddel.

4,4 g N^-[0^-tert.butyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-y-D- £ -glutamyl]-N-benzyloxycarbonyl-L-lanthionindiamid opløses i

O

44 cm af en 35% opløsning af hydrogenbromid i eddikesyre. Reak¬tionsblandingen omrøres i 4 timer ved 20°C, hvorefter nitro¬gengas bobles gennem blandingen i 0,5 time. Reaktionsblan¬dingen koncentreres derpå til tørhed under formindsket tryk(20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Remanensen udrives i 50 cm3 i-sopropylether og fraskilles ved filtrering. Denne fremgangs¬måde gentages to gange, hvorefter det faste stof omrøres i50 cm3 acetone i 1 tire, fraskilles ved filtrering, vaskes to gange 3 med ialt 10 cm acetone og tørres under formindsket tryk(20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 20°C. Herved fås 3,24 g N^-[N-(N--lauroyl-L-alanyl)-y-D-glutamyl]-L-lanthionindiamid-hydro-bromid i form af et flødefarvet pulver.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,47 ved tyndtlagschro¬ma tograf i på silicagel med anvendelse af en blanding af n--butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet 50:-20:6:24 som elueringsmiddel.

Analyse:

Beregnet, %: C 46,63 H 7,38 Br 11,93 N 12,55 S 4,79

Fundet, %: C 42,0 H 7,0 Br 10,1 N 11,1 S 4,4

Efter hydrolyse, i en blanding af lige volumendele kon¬ centreret saltsyre og vandfri eddikesyre ved 96°C i 5 timerviser en analyse ved hjælp af BIOTRONIK autoanalysator nær¬værelse af følgende aminosyrer:

Glu = 0,87 (teoretisk = 1)

Lan = 0,88 (teoretisk = 1) meso-Lan = 0,12 (teoretisk =0) 2 N -Benzyloxycarbony1-L-lanthionindiamid-hydrochloridet kan fremstilles på følgende måde.

2 6 9,56 g N-benzyloxycarbonyl-N -tert.butyloxycarbonyl- 3 -L-lanthionindiamid opløses i 190 cm af en vandfri opløsningaf 1,7 N .saltsyre i eddikesyre. Reaktionsblandingen omrøresi 1 time ved 20°C, hvorpå en nitrogengasstrøm ledes gennemblandingen i 0,5 time. Reaktionsblandingen hældes derefter 3 i 950 cm isopropylether. Efter omrøring i 1,5 timer fraskil¬les det dannede hvide bundfald ved filtrering. Bundfaldet 3 vaskes to gange med ialt 200 cm isopropylether og tørres un- der formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 20°C. Herved fås2 7,95 g N -benzyloxycarbonyl-L-lanthionindiamid-hydrochlorid.

2 g N -Benzyloxycarbonyl-N -tert.butyloxycarbonyl-L-lan- thionin-diamid kan fremstilles på følgende måde.

14,4 cm^ isobutylchlorformiat sættes til en til -10°C

2 6 afkølet opløsning af 27,7 g N -benzyloxycarbonyl-N. -tert.- 3 butyloxycarbonyl-L-lanthionin i 480 cm tetrahydrofuran og 3 13,5 cm triethylamin. Reaktionsblandingen omrøres i 20 mi¬nutter ved -10°C, hvorefter en strøm af ammoniak ledes gen¬nem reaktionsblandingen i ca. 3 timer ved en temperatur nær-10°C. Reaktionsblandingen koncentreres derefter til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 45°C. Den 3 dejagtige remanens optages i en blanding af 500 cm af en 7% 3 vandig opløsning af kaliumcarbonat og 250 cm ethylacetat.

Det uopløselige stof fraskilles ved filtrering, den organiskefase fraskilles ved dekantering, og vandfasen ekstraheres 3 med 50 cm ethylacetat. De organiske faser forenes, vaskes 3 tre gange med ialt 150 cm vand, tørres over natriumsulfatog koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 45°C. Remanensen omrøres i. 0,5 time i 50 cni i-sopropylether, fraskilles derefter ved filtrering, vaskes to 3 gange med ialt 50 cm isopropylether og tørres under formind¬sket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 20°C. Herved fås 9,1 g2 6 N -benzyloxycarbonyl-N -tert.butyloxycarbonyl-L-lanthionin- diamid med et smeltepunkt på 120°C.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,61 ved tyndtlagschro- matografi på silicagel med anvendelse af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 9:1 som elue- ringsmiddel.

2 6 N -Benzyloxycarbonyl-N -tert.butyloxycarbonyl-L-lan- thionin kan fremstilles på følgende måde.

2

Til en suspension af 16,5 g N -benzyloxycarbonyl-L- -lanthionin og 10,2 g natriumcarbonat i en blanding af 1003 3 cm vand og 300 cm dioxan sættes en opløsning af 11,6 g di- 3 -tert.butylcarbonat i 100 cm dioxan. Reaktionsblandingenomrøres i 69 timer ved en temperatur nær 20°C. Det uopløseli¬ge stof fraskilles ved filtrering, og dioxanet fjernes .

fra filtratet ved koncentrering under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 45°C. Til den tilbageblevne vandige op- 3 løsning sættes 150 cm af en mættet citronsyreopløsning og 3 150 cm ethylacetat. Den organiske fase fraskilles ved dekan- 3 tering, og vandfasen ekstraheres to gange med ialt 150 cm 3 ethylacetat. De organiske faser forenes, vaskes med 100 cmvand, tørres over natriumsulfat og koncentreres til tørhedunder formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 45°C. Hervedfås 27,7 N-benzyloxycarbonyl-N-tert.butyloxycarbonyl-L--lanthionin i form af en gul olie.

Eksempel 8 0,4 cm3 isobutylchlorformiat sættes til en til -8°Cafkølet opløsning af 1,41 g tert.buty1-N-(N-lauroyl-L-ala- 3 nyl)-a-D-glutamat i en blanding af 67 cm tetrahydrofuran og0,43 cm triethylamin. Reaktionsblandingen omrøres i 25 mi¬nutter ved -7°C, hvorefter der tilsættes en til 0°C afkølet 7 · opløsning af 1,1 g N -benzyloxycarbonyl-L,L-2,7-diamino-4- 3 -thia-suberamsyre i en blanding af 3,1 cm IN natriumhy- 3 droxidopløsning og 27 cm vand. Reaktionsblandingen omrøresi 10 minutter til -7°C og derefter i 20 timer til ca. 20°C,hvorpå den koncentreres til tørhed under formindsket tryk(20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 45°C. Remanensen opløses i 30 cm3vand, og den fremkomne opløsning gøres sur til en pH-værdi 3 på 2 ved tilsætning af 3,8 cm 1 N Saltsyre. Det dannedebundfald fraskilles ved filtrering, vaskes to gange med ialt 3 100 cm vand og tørres under formindsket tryk (først 20 mmHg, 2,7 kPa og derpå 0,3 mm Hg, 0,04 kPa) ved 20°C. Hervedfås 2,9 g af et puver, som chromatograferes på 90 g neutraltsilicagel (0,04-0,063 mm) i en kolonne med diameteren 2,5 3 cm. Herved opløses dette pulver i en blanding af 30 cm ed- 3 dikesyre og 15 cm ethylacetat, og til den fremkomne opløs¬ning sættes 9 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm). Den frem¬komne blanding inddampes til tørhed under formindsket tryk(20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C, og remanensen anbringes i sili-cagelkolonnen. Der elueres med 2,9 1 af en blanding af ethyl¬acetat og eddikesyre i volumenforholdet 95:5, og der opsamles 3 fraktioner med volumen 50 cm . Fraktionerne 17-55 forenesog koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Remanensen udrives i 100 cm^ ether, fraskilles 3 ved filtrering, vaskes to gange med ialt 10 cm ether ogtørres under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 20°C,Herved fås 1,2 g N^-[0^-tert.buty1-N-(N-lauroyl-L-alanyl)- 7 -y-D-glutamyl]-N -benzyloxycarbonyl-L,L-2,7-diamino-4-thia--suberamsyre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,59 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding afethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 4:1 som elue-ringsmiddel.

1,2 g N^-[O^-tert.butyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-y-D-7 -glutamyl]-N -benzyloxycarbonyl-L,L-2,7-diamino-4-thia-su- 3 beramsyre opløses i 12 cm af en 33% opløsning af hydrogen- bromid i eddikesyre. Reaktionsblandingen omrøres i 2 timer ved 20°C og koncentreres derpå til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Remanensen optages i 20 cm ethylacetat, hvorefter der på ny koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C.

Den herved fremkomne remanens udrives i en blanding af 1003 3 cm ether og 10 cm ethylacetat, fraskilles ved filtrering 3 og vaskes fire gange med ialt 80 cm ether. Efter tørringunder formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 20°C fås 950mg af et brunt pulver, som chromatograferes på 40 g neutraltsilicagel (0,04-0,063 mm) i en kolonne med diameteren 2 cm.

3

Herved opløses dette pulver i en blanding af 30 cm metha- 3 nol og 0,4 cm koncentreret ammoniak (d = 0,92), og til denfremkomne opløsning sættes 3 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm). Den fremkomne blanding inddampes til tørhed un¬der formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C, og denfremkomne remanens anbringes i silicagelkolonnen. Der elue- 3 res først med 260 cm af en blanding af n-butanol og eddi- 3 kesyre i volumenforholdet 4:1 og derefter med 320 cm me- 3 thanol, og der opsamles fraktioner med volumen 20 cm . Frak¬tionerne 14-29 forenes og koncentreres til tørhed under for¬mindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 55°C. Remanensen ud-3 rives i 100 cm ether, fraskilles ved filtrering, vaskes 3 tre gange med ialt 60 cm ether og tørres under formindskettryk (0,3 mm Hg, 0,04 kPa) ved 50°C. Herved fås 450 mg N^--[N-(N-lauroyl-L-alanyl)-y-D-glutamy1]-L,L-2,7-diamino-4--thia-suberamsyre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,33 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding af n--butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet50:20:6:24 som elueringsmiddel.

Masse-spektrometri: M = 603 (teoretisk = 603).

Analyse:

Beregnet, %: C 53,71 H 8,18 N 11,60 S 5,31

Fundet, %: C 49,5 H 7,6 N 10,3 S 4,93 7 N -Benzyloxycarbonyl-2(L),7(L)-diamino-4-thia-suberam-syre kan fremstilles på følgende måde.

Til en til -40°C afkølet opløsning af 720 mg L-cystein 3 i 90 cm ammoniak sættes natrium, indtil at der fås en hold¬bar blå opløsning (ca. 360 mg natrium). Derefter tilsættesnogle mg ammoniumchlorid til affarvning af reaktionsmediet,og derpå tilsættes 2 g methyl-N-benzyloxycarbonyl-L-a-ami-no-y-brombutyrat. Reaktionsblandingen omrøres i 15 minutterved -35°C, hvorefter der tilsættes 25 cin methanol afkølettil -35°C. Den fremkomne blanding får lov til at stå ved20°C i 18 timer. Reaktionsblandingen koncentreres derpå tiltørhed under formindsket tryk (20 mm Hg) ved 45°C. Remanen- 3 sen opløses i 50 cm vand. Den fremkomne opløsning gøres sur 3 til en pH-værdi på 5-6 ved tilsætning af 6,5 cm IN eddike¬syre. Det dannede bundfald fraskilles ved filtrering, vas- 3 kes tre gange med ialt 60 cm vand og tørres under formind¬sket tryk (0,3 mm Hg) ved 20°C. Herved fås 600 mg N^-benzyl-oxycarbonyl-2(L),7(L)-diamino-4-thia-suberamsyre med etsmeltepunkt på 240-244°C.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,40 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding af n--butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet50:20:6:24 som elueringsmiddel.

Masse-spektrometri: M = 355 (teoretisk = 355).

7

Yderligere 600 mg N -benzyloxycarbonyl-2(L),7(L)-di- amino-4-thia-suberamsyre kan fås på følgende måde.

Det ovenfor fremkomne filtrat koncentreres til et vo-lumen på 5 cm under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa)ved 50°C. Det i koncentratet dannede bundfald fraskilles 3 ved filtrering, vaskes to gange med ialt 4 cm vand og tør¬res under formindsket tryk (0,3 mm Hg, 0,04 kPa) ved 20°C.

Me thyl-N-benzyloxycarbonyl-L-a-amino-y'-brombu tyratkan fremstilles ifølge den metode, der er beskrevet af Z.Prochazka et al., Coll. Czech. Chem. Commun. 45, 1982 (1980).

Eksempel 9 Λ

2,64 cin isobutylchlorformiat sættes til en til -5°C

afkølet opløsning af 8 g N-(N-lauroyl-L-alanyl)-D-isogluta- 3 3 min i en blanding af 200 cm tetrahydrofuran, 400 cm dime- 3 thylformamid og 2,8 cm triethylamin. Reaktionsblandingenomrøres i 20 minutter ved -5°C, hvorefter der tilsættes entil 5°C afkølet opløsning af 7,56 g N^-benzyloxycarbonyl-2- (L),6(D,L)“diamino-4-thia-pimelamsyre-hydrochlorid i en 3 3 blanding af 20 cm N natriumhydroxidopløsning og 80 cm vand.

Reaktionsblandingen omrøres i nogle minutter ved 0°C og der¬på i 18 timer ved ca. 20°C. Derefter fjernes tetrahydrofuran-et ved koncentrering under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7kPa) ved 50°C. Koncentratet befries for et let, uopløseligtstof ved filtrering og fortyndes derpå med 2 1 vand og 45 3 cm N saltsyre. Det dannede bundfald fraskilles ved filtre- 3 ring, vaskes to gange med ialt 400 cm vand og tørres i denfrie luft. Herved fås 16,1 g af et flødefarvet pulver, somchromatograferes på 450 g neutralt silicagel (0,04-0,063mm) i en kolonne med diameteren 5 cm. Herved opløses dettepulver i 100 crn"^ ethylacetat opvarmet til 50°C, og til denfremkomne opløsning sættes 30 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm). Den fremkomne blanding inddampes til tørhed un¬der formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C, og rema¬nensen anbringes i silicagelkolonnen. Der elueres successivtmed 1,5 1 af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i vo- 3 lumenforholdet 1:1, 750 cm af en blanding af ethylacetat og 3 eddikesyre i volumenforholdet 4:6 og 750 cm af en blandingaf ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 3:7, og der opsamles frak- 3 tioner med volumen 50 cm . Fraktionerne 20-60 forenes ogkoncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Remanensen udrives i 500 cin ethylacetat, fraskilles ved filtrering og vaskes med ether. Herved fås 6 27,1 g N-[N-(N-lauroyl-L-alanyl)-D-isoglutaminyl]-N -ben- zyloxycarbonyl-2(L),6(D,L)-diamino-4-thia-pimelamsyre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,24 ved tyndtlagschro- matografi på silicagel med anvendelse af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 7:3 som elue- ringsmiddel.

6 27 g N -[N-(N-lauroyl-L-alanyl)-D-isoglutaminyl]-N -ben- zyloxycarbonyl-2(L),6(D,L)-diamino-4-thia-pimelamsyre opløses 3 i en blanding af 50 cm af en 33% opløsning af hydrogenbro- 3 mid i eddikesyre og 50 cm eddikesyre. Reaktionsblandingenomrøres i 1 time ved 20°C og koncentreres derpå til tørhedunder formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 45°C. Remanen- 3 sen udrives i 100 cm ethylacetat, fraskilles ved filtrering, vas- 3 kes to gange med ialt 100 cm ethylacetat og tre gange med 3 ialt 150 cm ether samt tørres under formindsket tryk (0,3mm Hg, 0,04 kPa) ved 20°C. Herved fås 8,14 g af et rosafar- 3 vet pulver, som opløses i 500 cm vand. Efter 0,5 times om¬røring fraskilles det dannede bundfald ved filtrering, hvor-på det vaskes to gange med ialt 100 cm vand og fem gange 3 med ialt 250 cm ether og tørres under formindsket tryk (0,3mm Hg, 0,04 kPa) ved 20°C. Herved fås 5,47 g N®-[N-(N-lau¬royl-L-alanyl) -D-isoglutaminyl]-2(L),6(D,L)-diamino-4-thia--pimelamsyre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,39 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding af n--butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet 50:-20:6:24 som elueringsmiddel.

Analyse: Masse-spektrometri: M = 588 (teoretisk = 588) .

Analyse:

Beregnet, %: C 53,04 H 8,22 N 14,27 S 5,45Fundet, %: C 50,0 H 8,1 N 13,1 S 5,0 N-Lauroyl-L-alanyl-D-isoglutamin kan fremstilles på følgende måde.

6/6 g benzyl-N-lauroyl-L-alanyl^D-isoglutaminat oplø^ 3 ses i 33© cm eddikesyre. Efter tilsætning af 6,6 g palla-dium-på—oarhon (3% palladium) ledes en langsom strøm afhydrogengas gennem opløsningen i 2 timer. Efter filtreringaf reaktionsblandingen hældes filtratet i 3 1 vand. Efter 2timers hvile ved 0°C fraskilles det dannede bundfald ved 3 filtrering, hvorpå det vaskes to gange med ialt 80 cm vandog tørres. Herved fås 5,16 g af et produkt, til hvilket sæt¬tes 0,5 g af et produkt opnået under analoge betingelser.

3

Produktblandingen opløses i 90 cm kogende methanol, og til 3 den fremkomne opløsning sættes 45 cm wand. Efter 2 timershvile ved en temperatur nær 20°C fraskilles de dannede kry¬staller ved filtrering, hvorpå de vaskes to gange med ialt 3 60 cm vand og tørres under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7kPa). Herved fås 5,1 g N-lauroyl-L-alanyl-D-isoglutamin medet smeltepunkt på 163°C.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,,i8 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse mf én blanding afethylacetat og methanol i volumenforhaldet 4:1 som eluerings-middel.

Analyse:

Beregnet, %: C 60,12 H 9,33 N 10,152

Fundet, S: C 60,2 H 9,5 N 10·,3

Benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-D-isocpiutaminat kan fremstil¬les på følgende måde.

2,54 cm^ isobutylchlorformiat saÉttes til en til 0°C

3 afkølet opløsning af 3,9 g laurinsyre ii 156 cm vandfri to- 3 luen og 2,7 cm triethylamin. Blandingen omrøres i 20 minut¬ter ved 0°C, hvorpå der tilsættes en tlil 0°C afkølet opløs¬ning af 6,7 g benzyl-L-alanyl-D-isogluitaminat-hydrochlorid3 3 i 52 cm vand og 2,7 cm triethylamin. Reaktionsblandingenomrøes i 65 timer ved en temperatur nær 20°C. Herved fås enreaktionsmasse med gelatinøst udseende,, og til denne masse 3 sættes 150 cm ethylacetat. Bundfaldet fraskilles ved fil- 3 trering, vaskes med 30 cm vand og tørres. Herved fås 7,6 gbenzyl-N-lauroyl-L-alanyl-D-isoglutaminat i form af et hvidt pulver. Det dannede filtrats vandfase ekstraheres to gange3 med ialt 100- cm ethylacetat. Denne ethylacetatfase fore- 3 nes med filtratets organiske fase, vaskes med 125 cm 0,1 3 N saltsyre og med 120 cm vand, tørres over magnesiumsulfat og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm

Hg) ved 50°C. Herved fås yderligere 1,5 g benzyl-N-lauroyl- -L-alanyl-D-isoglutaminat. Produktet (7,6 g plus 1,5 g) 3 omkrystalliseres i 120 cm methanol. Herved fås 6,6 g ben-zyl-N-lauroyl-L-alanyl-D-isoglutaminat med et smeltepunktpå 169°C.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,13 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af ethylacetat som e-lueringsmiddel.

Benzyl-L-alanyl-D-isoglutaminat-hydrochloridet kanfremstilles ifølge den metode, som er beskrevet af S. Kusu-moto, Bull. Chem. Soc. Japon A9_, 533 (1976).

Eksempel 10

Ved at arbejde på samme måde som i eksempel 2 men. gåud fra tert.butyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-α-D-glutamat og g N -benzyloxycarbonyl-L,L-2,6-diamino-4-thia-pimelamsyre2 fremstilles N -[N-(N-lauroyl-L-alanyl)-y-D-glutamyl]-L ,L- -2,6-diamino-4-thia-pimelamsyre, som på samme måde som i 2 eksempel 3 omdannes til N -[N-(N-lauroyl-L-alanyl)-y-D-glu- g tamyl]-N -glycyl-L,L-2,6-diamino-4-thia-pimelamsyre.

C

N -Benzyloxycarbonyl-L,L-2,e-diamino^-thia-pimelam- syre kan fremstilles på følgende måde.

3 3

Til en opløsning af 3 cm ethanol og 0,33 cm 4 N na- g triumhydroxidopløsning sættes 250 mg methyl-N -benzyloxy- c arbony1-L,L-2,6-diamino-4-thia-pimelamat-hydrochlorid.

Reaktionsblandingen omrøres i 1 time og 15 minutter, hvor- 3 3 efter der tilsættes 0,65 cm N saltsyre og 3 cm vand til indstilling på en neutral pH-værdi. Efter 2 timers hvile ved 20°C fraskilles det dannede bundfald ved filtrering, hvorpå 3 3 det vaskes med 2 cm ethanol og med 2 cm acetone samt tør¬res under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 20°C.

C

Herved fås 60 mg N -benzyloxycarbonyl-L,L-2,6-diamino-4- -thia-pimelamsyre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,53 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding af n--butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet50:20:6:24 som elueringsmiddel.

Masse-spektrometri: M = 341 (teoretisk = 341).

g

Methyl-N -benzyloxycarbonyl-L,L-2,6-diamino-4-thia- -pimelamat kan fremstilles på følgende måde.

2 6

Til en opløsning af 1,4 g methyl-N -trityl-N -benzyl- 3 oxycarbonyJL— L,L-2,6-diamino-4-thia-pimelamat i 6 cm ace- 3 tone sættes 0,25 cm koncentreret saltsyre (d = 1,19), hvor¬på blandingen omrøres i 2 minutter. Derefter tilsættes 12 3 cm isoprqpylether. Den udsaltede olie fraskilles ved dekan- 3 tering, opløses i 5 cm acetone og udsaltes ved tilsætning 3 af 20 cm isopropylether. Olien fraskilles ved dekanteringog opløses på ny i 5 cm methanol. Til den fremkomne opløs¬ning sættes ethylacetat, indtil der fås len bestandig u-klarhed. aet således dannede bundfald fraskilles ved fil- 3 trering, vaskes to gange med ialt 10 cm ethylacetat ogtørres under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 20°C.

C

Herved fås 400 mg methyl-N -benzyloxycarbonyl-L,L-2,6-dia- mino-4-thia-pimelamat-hydrochlorid.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,70 ved tyndtlagschro- matografi på silicagel med anvendelse af en blanding af n- -butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet 50:20:6:24 som elueringsmiddel.

Masse-spektrometri: M = 355 (teoretisk = 355).

2 6

Methyl-N -trityl-N -benzyloxycarbonyl-L,L-2,6-diamino- -4-thia-pimelamat kan fremstilles på følgende måde.

0,56 cm3 isobutylchlorformiat sættes til en til -6°C

12 6 afkølet opløsning af 2,6 g O -methyl-N -trityl-N -benzyloxy- carbonyl-Li/Ii-2/6-diamino-4-thia-pimelinsyre i en blanding af3 3 26 cm chloroform og 0,6 cm triethylamin. Reaktionsblanding¬en omrøres i 20 minutter ved -6°c, hvorefter der tilsættes31 cin ammoniakalsk chloroform (1,4 N) afkølet til 0°C. Re-aktionsblandingen omrøres i 1 time ved 0°C og derpå i 25timer ved ca. 20°C, hvorpå den vaskes med 50 cm3 vand, tør- res over natriumsulf.at og koncentreres til tørhed under for¬mindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 40°C. Herved fås 2,92 6 g methyl-N -trityl-N -benzyloxycarbonyl-L,L-2,6-diamino-4--thia-pimelamat i form af en gul olie.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,82 ved tyndtlagscb.ro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding af n--butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet50:20:6:24 som elueringsmiddel.

0'L-Methyl-N^-trityl-N^-benzyloxycarbonyl-L,L-2,6-di-amino-4-thia-pimelihsyre kan fremstilles ifølge den metode,som er beskrevet af I. Photaki et al., J.C.S. Perkin I 2599(1979).

Eksempel 11 0,91 cirT isobutylchlorformiat sættes til en til -7°Cafkølet opløsning af 3,43 g benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-a- 3 -D-glutamat i en blanding af 140 cm tetrahydrofuran og 0,98 3 cm triethylamin. Reaktionsblandingen omrøres i 20 minutter ved -7°C, hvorefter der tilsættes en til 2°C afkølet opløs- 2 ning af 2,64 g N -benzyloxycarbonyl-L,L-2,6-diamino-4-thia- 3 -pimelamsyre-hydrochlorid i en blanding af 14 cm N natrium- 3 hydroxidopløsning og 53 cm vand.

Reaktionsblandingen omrøres i 2 minutter ved -5°C ogderpå i 20 timer ved ca. 20°C, hvorpå den gøres sur ved til- 3 sætning af 5 cm 4 N saltsyre. Tetrahydrofuranet afdampesunder formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Det 3 fremkomne koncentrat ekstraheres fem gange med ialt 300 cm 3 ethylacetat. De organiske faser forenes, vaskes med 20 cm 3 vand og med 20 cm af en mættet natriumchloridopløsning samtkoncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Der fås herved 5,58 g af et hvidt pulver,som chromatograferes på 100 g neutralt silicagel (0,04-0,063mm) i en kolonne med diameteren 2,5 cm. Herved opløses dette 3 pulver i 50 cm eddikesyre, og til den fremkomne opløsningsættes 15 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm). Den fremkomneblanding inddampes til tørhed under formindsket tryk (20 mmHg) ved 50°C, og remanensen anbringes i silicagelkolonnen.

3 3

Der etaer es successivt med 360 cm eÆhylacetat, 360 cm afen blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet98:2, 360 cm af en blanding af^ethyilacetat og eddikesyre ivolumesnforholdet 95:5 og 880 cm af en blanding af ethylace¬tat og eddikesyre i volumenforholdet 590:10, og der opsamles 3 fraktioner med volumen 40 cm . Fraktionerne 27-49 forenes og koncentreres til tørhed under formÉindsket tryk (20 mm

Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Den fremkomne oolieagtige remanens ud- 3 3 rives i en blanding af 45 cm ether 3®g 15 cm petroleums- ether, hvorefter den fraskilles ved filtrering og tørres.

6 1

Der fås herved 2,52 g N - [O -benzyl-N- (N-lauroyl-L-alanyl)-2 -Ϋ-D-gtatamy 1 ] -N -benzyloxycarbonyl-l<„L-2,6-diamino-4-thia--pimelaimsyre.

Broduktet giver en Rf-værdi på (30,50 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding afethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 9:1 som elue-ringsmMdel.

2,5 g N®- [O^-benzyl-N- (Ν-lauroyIL— L-alanyl)-y-D-gluta- 2 myl]-N -benzyloxycarbonyl-L,L-2,6-diumino-4-thia-pimelamsyre 3 3 opløses i en blanding af 7 cm methanol og 6,75 cm 1 N na-triumhyodroxidopløsning.

Reaktionsblandingen omrøres i BD minutter, hvorefteret let,uopløseligt stof fjernes ved filtrering. Til filtrat- 3 et sættes 10 cm vand, hvorpå den fremkomne blanding gøres 3 sur ved tilsætning af 8 cm IN saltsyre. Herved dannes etolieagtfgt bundfald. Hele blandingen ekstraheres fire gange med 3 ialt 80 cm ethylacetat. De organiske faser forenes, vaskes3 med 3 ca vand, tørres over natriumsuLLfat og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Der fås herved en olie, som udrives i 50 cm^ ether, fraskilles ved filtrering og tørres under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 20°C. Herved fås 2,18 g N6-[N-(N- 2 -lauroyl-L-alanyl) -y'-D-glutamyl] -N -bøenzyloxycarbonyl-L,L--2,6-d±amino-4-thia-pimelamsyre.

Produktet giver en Rf-værdi på CD,47 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding af n--butanol, pyridin, eddikesyre og vand .i volumenforholdet 50:20:6:24 soia elueringsmiddel.

Masse-spektrometri: M = 723 (teoretisk = 723).

2,13 gN^-[N-(N-lauroyl-L-alanyl)-y-D-glutamyl]-N^- -benzyioxycarbonyl-L,L-2,6-diamino-4-thia-pimelamsyre Op- 3 løses i en blanding af 8,5 cm af en 33% opløsning af hydro- 3 genbromid i eddikesyre og 8,5 cm eddikesyre. Reaktionsblan¬dingen omrøres i 2 timer og koncentreres derpå til tørhedunder formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Rema- 3 nensen udrives i 100 cm ether, fraskilles ved filtrering 3 og optages i 600 cm vand under kraftig omrøring. I vandetsker en øjeblikkelig solubilisering, hvorefter der dannes etbundfald i løbet af nogle minutter. Efter 1 time fraskillesbundfaldet ved filtrering, hvorpå det vaskes fem gange med 3 ialt 250 cm vand og tørres under formindsket tryk (0,3 mmHg, 0,04 kPa) ved 60°C. Herved fås 1,33 g N*5-[N-(N-lauroyl--L-alanyl)-y-D-glutamyl]-L,L-2,6-diamino-4-thia-pimelamsyre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,30 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding af n--butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet50:20:6:24 som elueringsmiddel og en Rf-værdi på 0,43 vedtyndtlagschromatografi på silicagel med anvendelse af eddi¬kesyre som elueringsmiddel.

Analyse:

Beregnet, %: C 52,95 H 8,03 N 11,88 S 5,44

Fundet, %: C 51,1 H 8,0 N 11,1 S 4,8

Masse-spektrometri: M = 589 (teoretisk = 589).

2 N -Benzyloxycarbonyl-L,L-2,6-diamino-4-thia-pimelam-syre kan fremstilles ifølge en af de følgende metoder: p c (a) 5,48 g N-benzyloxycarbonyl-N-tert.butyloxy-car- 3 bonyl-L,L-2,6-diamino-4-thia-pimelamsyre opløses i 50 cm afen vandfri opløsning af 1,7 N saltsyre i eddikesyre. Reak¬tionsblandingen omrøres i 1 time, hvorefter der tilsættes 3 500 cm vandfri ether, og omrøringen fortsættes i 45 minut¬ter. Det dannede bundfald fraskilles ved filtrering, vaskes 3 to gange med ialt 60 cm ether og tørres under formindsket Λ tryk (0,3 mm Hg, 0,04 kPa) ved 20°C. Herved fås 2,98 g N--benzyloxycarbonyl-L,L-2,6-diamino-4-thia-pimelamsyre-hy-drochlorid.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,47 ved tyndtlagsch.ro- matografi på silicagel med anvendelse af en blanding af n- -butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet 50:203(6:24 som elueringsmiddel.

Hfter hydrolyse, derivatisering og chromatografi på en optisk aktiv kapillærkolonne fås 3*5,7% L-lanthionin (teoretisk = 1), <0,5% D-lanthionin ((teoretisk = 0) og 4,3% meso-lanthionin (teoretisk = 0) .

2 6 M -Benzyloxycarbonyl-N -tert.hutyloxycarbonyl-I^L-^^-diamino^-thia-pimelamsyre kan fremstilles på følgendemåde.

Til en til -75°C afkølet opløsning af 4 g di-tert.bu-tyloxyoarbonyl-L-cystinamid i 200 cm^ ammoniak tilsættesnatrium i små portioner, indtil der fås en blå farve, som erbestandig i nogle minutter. Derefter’tilsættes successivtammoniumchlorid indtil affarvning af ireaktionsmediet, og.der-på tilsættes 4,7 g L-a-benzyloxycarbmiylamino-3-chlorpropion-syre. Iteaktionsblandingen får lov till at stå i 18 timer vedca. 20¾. Det herved dannede flødefarvede faste stof optages 3 i 80 cm vand. Den vandige opløsning -gøres sur til en pH- værdi på 2 ved tilsætning af en mættet citronsyreopløsning 3 og eksitraheres fem gange med ialt 15J0 cm ethylacetat. De 3 organiske faser forenes, vaskes med SO cm vand, tørres overnatriumsulfat og koncentreres til tørhed under formindskettryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Herved fås 7,5 g af engul olie, som chromatograferes på 125 g neutralt silicagel(0,04-0,063 mm). Der elueres med ethylacetat, og der opsam-les fraktioner med volumen 40 cm . Erektionerne 7-16 fore¬nes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Den fremkomne olie opløses i 50 3 cm ethylacetat, og opløsningen ekstrahere?fire gange med 3 ialt 2000 cm af en 0,1 N natriumhydroxidopløsning. Vand¬faserne forenes, gøres sure til en pø-værdi på 2 ved tilsæt¬ning af en mættet citronsyreopløsning og ekstraheres fire 3 gange med ialt 100 cm ethylacetat. De organiske faser for¬enes, tørres over natriumsulfat og koncentreres til tørhedunder formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Herved • 2 6fås 2,5 g N -benzyloxycarbonyl-N -tert.butyloxycarbonyl- -L,L-2,6-diamino-4-thia-pimelamsyre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,62 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding afethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 9:1 som elue-ringsmiddel.

Di-tert.butyloxycarbonyl-L-cystinamid kan fremstillespå følgende måde.

16,6 cm^ isobutylchlorformiat sættes til en til -5°C

afkølet opløsning af 25 g di-tert.butyloxycarbonyl-L-cystein 3 3 i en blanding af 500 cm tetrahydrofuran og 15,9 cm tri- ethylamin. Reaktionsblandingen omrøres i 20 minutter ved -5°C, hvorefter der i løbet af 15 minutter tilsættes 125 3 cm af en 1,4 N opløsning af ammoniak i chloroform. Denfremkomne reaktionsblandings temperatur holdes ved -5°C,og blandingen mættes i 0,5 time ved hjælp af en strøm afvandfri ammoniakgas. Blandingen omrøres derefter i 20 timerved ca. 20°C. Der tilsættes 100 cm^ tetrahydrofuran. Detuopløselige stof frafiltreres, vaskes seks gange med ialt2,25 1 vand og derpå med 1 1 ethylacetat samt tørres i denfrie luft. Herved fås 16,98 g di-tert.butyloxycarbonyl-L--cystinamid.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,85 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding af n--butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet50:20:6:24 som elueringsmiddel og en Rf-værdi på 0,77 vedtyndtlagschromatografi på silicagel med anvendelse af metha¬nol som elueringsmiddel.

X 6 (b) 950 mg 0-methyl-N-benzyloxycarbonyl-L,L-2,6-di- 3 amino-4-thia-pimelinsyre-hydrochlorid sættes til 11 cm afen 2,3 N opløsning af ammoniak i ethanol. Den fremkomne op¬løsning holdes ved 20°C i 70 timer. Et let,uopløseligt stoffjernes derefter ved filtrering, og filtratet koncentrerestil tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved50°C. Remanensen udrives i 20 cm-3 acetone, fraskilles vedfiltrering og tørres under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7kPa) ved 20°C. Herved fås 0,18 g N^-benzyloxycarbonyl-L,L--2,6-diamino-4-thia-pimelamsyre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,62 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding af n--butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet50:20:6:24 som ielueringsmiddel.

Masse-spekitrometri: M = 341 (teoretisk = 341).

1 6 O -Methyl—W -benzyloxycarbonyl-L,L-2,6-diamino-4-thia- -pimelinsyre kam fremstilles på følgende måde.

12 6

Til en opløsning af 3 g O -methyl-N -trityl-N -benzyl- 3 oxycarbonyl-L,L-2,6-diamino-4-thia-pimelinsyre i 13 cm ace- 3 tone sættes 0,5:2 cm koncentreret saltsyre (d = 1,19), hvor¬på den fremkomne blanding omrøres i 2 minutter. Reaktions- 3 blandingen hældes derefter i 25 cm ether. Den udsaltede olie fraskilles ved dekantering og udrives i en blanding af3 3 5 cm acetone og 25 cm ether. Det dannede hvide faste stof 3 fraskilles ved filtrering, opløses i 5 cm methanol og ud- 3 3 fældes på ny ved tilsætning af 50 cm ethylacetat og 25 cm 2 ether. Det faste stof frafiltreres, vaskes med 20 cm ether og tørres under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved o 16 20 C. Herved fås 1 g 0 -methyl-N -benzyloxycarbonyl-L,L-2,6- -diamino-4-thia-pimelinsyre-hydrochlorid.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,64 ved tyndtlagschro¬ma tograf i på silicagel med anvendelse af en blanding af n--butanol, pyridim„ eddikesyre og vand i volumenforholdet50:20:6:24 som eltmeringsmiddel.

Eksempel /ff 1,95 cm3 isobutylchlorformiat sættes til en til -7°Cafkølet opløsning af 6,84 g tert.butyl-N-(N-lauroyl-L-ala-nyl)-a-D-glutamat i en blanding af 330 cm3 tetrahydrofuranog 2,1 cm triethylamin. Reaktionsblandingen omrøres i 20minutter til -7°<C, hvorefter der tilsættes en til 10°C af- c kølet opløsning af 5,11 g N -benzyloxycarbonyl-2(D),6(L)- 3

-diamino-4-thia-pimelamsyre i en blanding af 15 cm N

3 natriumhydroxidopløsning og 130 cm vand.

Reaktionsblandingen omrøres i 5 minutter ved 0°Cog derpå i 24 timer ved ca. 20°C. Tetrahydrofuranet af¬dampe s under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C.Det fremkomne koncentrat afkøles til 0°C og gøres surt tilen pH-værdi på 2 ved tilsætning af 1 N saltsyre. Det danne- 3 de bundfald fraskilles ved filtrering, vaskes med 50 cm 3 0,1 N saltsyre og derpå to gange med ialt 200 cm vand samt 2 1 tørres i den frie luft. Herved fås 10 g N -[0 -tert.butyl- g -N- (N-lauroyl-L-alanyl) -jf-D-glutamyl] -N-benzyloxycarbonyl--2(D),6(L)-diamino-4-thia-pimelamsyre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,65 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding af n--butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet50:20:6:24 som elueringsmiddel og en Rf-værdi på 0,72 vedtyndtlagschromatografi på silicagel med anvendelse af enblanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet3:1 som elueringsmiddel.

5 g N^-[O^-tert.buty1-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-y-D-glu- g tamyl]-N -benzyloxycarbonyl-2(D),6(L)-diamino-4-thia-pime- 3 lamsyre opløses i 22 cm af en 35% opløsning af hydrogenbro-mid i eddikesyre. Reaktionsblandingen omrøres i 0,5 timeved hjælp af en ultralydomrører og hældes derefter illvandfri ether afkølet til 0°C. Den fremkomne blanding omrø¬res i 1 time. Det dannede bundfald fraskilles ved filtrering, 3 vaskes fire gange med ialt 400 cm ether og opløses i 100 3 3 cm methanol. Til den fremkomne opløsning sættes 5 cm ammo¬niak (d = 0,92). Den fremkomne blanding koncentreres tiltørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Derfås herved 4,36 g af et hvidt pulver, som chromatograferespå 200 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm) i en kolonne meddiameteren 3,5 cm. Der elueres med en blanding af methanolog ammoniak (d = 0,92) i volumenforholdet 999,5:0,5, og 3 der opsamles fraktioner med volumen 30 cm . Fraktionerne 25-39 forenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 ima Hg) ved 50°C. Herved fås 2,.8 g af et hvidt pulver,som chromatograferes på 100 g neutralt silicagel (0,04- 0,063 mm) i en kolonne med diameteren 3 cm. Herved opløses 3 3 dette pulver i 50 cm methanol indeholdende 0,5 cm ammo¬niak ((<d = 0,92) pr. liter, og til den fremkomne opløsningsættes 3 g neutralt silicagel (0,04-0,,063 mm). Den frem¬komne iblanding inddampes til tørhed under formindsket tryk(20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C, og remanensen anbringes isilicagelkolonnen. Der elueres med en blanding af methanol og ammoniak (d = 0,92) i volumenforholdet 999,5:0,5, og der 3 opsamles fraktioner med volumen 15 cm .. Fraktionerne 13-23forenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk(20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Herved fås 0,71 g N^-[N-(N-lauroyl-L-alanyl) -f-D-glutamyl] -2 (D) ,,65-(L) -diamino-4-thia--pimelamsyre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,35 ved tyndtlagschroma-tografi på silicagel med anvendelse af en blanding af n--butan©!, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet50:203©:24 som elueringsmiddel.

Analyse:

Beregnet, %: C 52,95 H 8,03 m 11,87 S 5,44

Fundet,, %: C 50,2 H 7,8 1 11,6 S 5,3

Sulfataske, %: 7,3.

Masse-spektrometri: M = 589 (teoretisk = 589).

6 IN -Benzyloxycarbonyl-2(D),6(L)-diamino-4-thia-pimelam-syre kan fremstilles på følgende måde«.

Til en til -70°C afkølet opløsning af 17,93 g N-ben-zyloxyearbonyl-L-cysteinamid i 570 cm ammoniak sættes 12,6 3 cm af en 5,6 N opløsning af natriummethylat i methanol. Der¬efter tilsættes i løbet af 10 minutter 11,3 g D-2-amino-£--chlorpropionsyre-hydrochlorid i små portioner. Reaktionsblan¬dingen omrøres i 10 minutter ved -60¾ og får derpå lov tilat stå ved ca. 20°C i 20 timer. Remanensen optages i 200 cm^vand. Vandfasen befries for et uopløseligt stof ved filtre- 3 ring, og filtratet ekstraheres to gange med ialt 400 cmethylaeetat, gøres surt til en pH-værdi på 2 ved tilsætning 3 af 10 N saltsyre, ekstraheres to gange med ialt 400 cm • 3 ethylaeetat, koncentreres til et volumen på 170 cm under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C, indstillespå en pH-værdi på 5-6 ved tilsætning af triethylamin ogafkøles til 0°C i 2 timer. Det i vandfasen dannede uopløse¬lige stof fraskilles ved filtrering, vaskes tre gange med 3 ialt 150 cm vand og tørres først i fri luft og derefterunder formindsket tryk (0,3 mm Hg, 0,04 kPa) ved 50°C. Her- g ved fås 8,88 g. N -benzyloxycarbonyl-2(D),6(L)-diamino-4--thia-pimelamsyre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,48 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding af n--butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet50:20:6:24 som elueringsmiddel.

[a]p° = -20° (N NaOH, c = 1).

Masse-spektrometri: M = 341 (teoretisk = 341).

Efter hydrolyse, derivatisering og chromatografi påen optisk aktiv kapillærkolonne fås 100% meso-Lan (teoretisk= 1), <0,5% L-Lan (teoretisk = 0) og <0,5% D-Lan (teoretisk= 0).

Eksempel 13 1,92 cm3 isobutylchlorformiat sættes til en til -10°Cafkølet opløsning af 6,66 g tert.butyl-N-(N-lauroyl-L-ala- 3 nyl)-a-D-glutamat i en blanding af 320 cm tetrahydrofuran 3

og 2 cm triethylamin. Reaktionsblandingen omrøres i 20minutter ved -10°C, hvorefter der tilsættes en til 10°C

g afkølet opløsning af 5 g N-benzyloxycarbonyl-L,L-2,6-dia- 3 mino-4-thia-pimelamsyre i en blanding af 14,6 cm N natri- 3 umhydroxidopløsning og 120- cm vand.

Reaktionsblandingen omrøres i 5 minutter ved 0°C ogderpå i 20 timer ved ca. 20°C. Tetrahydrofuranet afdampesunder formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Det 3 fremkomne koncentrat fortyndes med 200 cm vand og gøres 3

surt til en pH-værdi på 2 ved tilsætning af ca. 25 cm IN

3 saltsyre. Til den fremkomne suspension sættes 500 cm ethyl-acetat. Efter omrøring af den fremkomne blanding fraskil¬les det uopløselige stof ved filtrering, hvorpå det tørresunder formindsket tryk (0,3 mm Hg, 0,04 kPa) ved 20°C. Her- veS fås 2,55 g af et pulver, til hvilket der sættes 4,45 gprodukt opnået på følgende måde. Den organiske fase fra¬skilles fra filtratet, tørres over natriumsulfat og kon¬centreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7kPa;) ved 50°C. Remanensen optages ii 200 cm^ ethylacetat.

Den herved fremkomne lysegule oplosning afkøles ved 0°C i1 time. Det dannede bundfald fraskiilles ved filtrering, 3 vaskes to gange med ialt 200 cm Other og tørres under for¬mindsket tryk (0,3 mm Hg, 0,04 kPa)) ved 20°C. Den såledesfremkomne totale produktmængde (7 cg) chromatograferes på140 g neutralt silicagel (0,04-0,G£3 mm) i en kolonne meddiameteren 3,2 cm. Herved opløses cdet pulverformige produkt 3 i 50 cm eddikesyre, og til den fremkomne opløsning sættes14 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm) . Den fremkomne blan¬ding inddampes til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C, og remanensen anbringes i silicagelkolon-nen. Der elueres først med 2,15 leaf en blanding af ethyl¬acetat og eddikesyre i volumenforholdet 9:1 og derpå med 0,31 af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenfor- 3 holdet 1:1, og der opsamles fraktioner med volumen 50 cm .Fraktionerne 10-49 forenes og koncentreres til tørhed underformindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kRa) ved 50°C.

3

Den fremkomne olieagtige remanens optages i 100 cm ethylacetat. Den fremkomne opløsning afkøles ved 0°C i 1 time. Det dannede bundfald fraskilles ved filtrering, vas- 3 kes to gange med ialt 100 cm ether og tørres under for¬mindsket tryk (0,3 mm Hg, 0,04 kPa) ved 20°C. Herved fås 3,4 g N^- [0^-tert.butyl-N- (N-lauroyl-L-alanyl) -/"-D-gluta-

Q

myl3-N -benzyloxycarbonyl-L,L-2,6-fliamino-4-thia-pimelamsy-re.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,63 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding afethylacetat og eddikesyre i volumenforhbldet 3:1 som elue-ringsmiddel.

3,4 g N^-[0^-tert.butyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-y-D- g -glutamyl] -N -benzyloxycarbonyl-L,L-2,6-diamino-4-thia-pi- 3 melamsyre opløses i en blanding af 17 cm af en 35% opløs- 3 ning af hydrogenbromid i eddikesyre og 10 cm eddikesyre.Reaktionsblandingen omrøres i 2 timer og koncentreres der¬på til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa)ved 55°C. Den fremkomne olieagtige remanens udrives i 30 3 cm ethylacetat, fraskilles ved filtrering, vaskes to gange 3 med ialt 60 cm ether og tørres under formindsket tryk (20mm Hg, 2,7 kPa) ved 20°C. Herved fås 4 g af et beigefarvetpulver, som chromatograferes på 90 g neutralt silicagel(0,04-0,063 mm) i en kolonne med diameteren 3 cm. Herved op- 3 løses dette pulver i 50 cm methanol, og til den fremkomne 3 opløsning sættes 7 cm ammoniak (d = 0,92) og 8 g neutraltsilicagel (0,04-0,063 mm). Den fremkomne blanding inddampestil tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved50°C, og remanensen anbringes i silicagelkolonnen. Der elue-res med en blanding af methanol og ammoniak (d = 0,92) ivolumenforholdet 999,5:0,5, og der opsamles fraktioner med 3 volumen 10 cm . Fraktionerne 13-24 forenes og koncentrerestil tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved50°C. Den dejagtige remanens udrives i 100 cm^ ether, fra¬skilles ved filtrering og tørres under formindsket tryk(20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 20°C. Herved fås 2,4 g af et pulver,som chromatograferes på 90 g neutralt silicagel (0,04-0,063mm) i en kolonne med diameteren 3 cm. Herved opløses dette 3 pulver i 30 cm methanol, og til den fremkomne opløsning sæt¬tes 4 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm). Den fremkomneblanding inddampes til tørhed under formindsket tryk (20 mmHg, 2,7 kPa) ved 50°C, og remanensen anbringes i silicagel¬kolonnen. Der elueres med en blanding af methanol og ammoniak(d = 0,92) i volumenforholdet 999,5:0,5, og der opsamlesfraktioner med volumen 5 cm . Fraktionerne 22-30 forenes ogkoncentreres'til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Remanensen udrives i 50 cm^ ether, fra¬skilles ved filtrering og tørres under formindsket tryk (20mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Herved fås 1,54 g af et pulver.

3 1 g af dette pulver suspenderes i 50 cm vand. Pulveret op¬løses ved, at blandingens pH-værdi indstilles på 1,8 ved 3 tilsætning af 40 cm 0,1 N saltsyre. Derefter indstilles 3 pH-Værdien på 3,6 ved tilsætning af J20 cm 0,1 N natriumhy¬droxidopløsning. Det dannede bundfalld fraskilles ved fil- 3 trering, vaskes med 30 cm vand og ctørres i fri luft ogderpå under formindsket tryk (0,3 mm Hg, 0,04 kPa) ved50°C. Herved fås 0,66 g N2-[N-(N-lauroyl-L-alanyl)-y-D-glu-tamyl] -L,L-2, 6-diamino-4-thia-pimelamsyre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,36 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding af n--butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet50:2036:24 som elueringsmiddel.

Analyse:

Beregnet, %: C 52,95 H 8,03 NJ11,87 S 5,44

Pundet, %: C 52,0 H 8,2 N.11,5 S 5,4

Masse-spektrometri: M = 589 (teoretisk = 589).

N^-Benzyloxycarbonyl-L,L-2,6-diamino-4-thia-pimelam- syre kan fremstilles på følgende måde.

Til en til -75°C afkølet opløsning af 2,54 g N-benzyl- 3 3 oxycarbonyl-L-cysteinamid i 80 cm ammoniak sættes 1,72 cmaf en 5,8 N opløsning af natriummethylat i methanol. Deref¬ter tilsættes 1,6 g La-amino-|3-chlorpropionsyre-hydrochlo-rid. Reaktionsblandingen får lov til at stå ved 20°C i 18timer. Den fremkomne faste remanens optages i 50 cm3 vand,og vandfasen befries for et uopløseligt stof ved filtrering, 3 ekstraheres tre gange med ialt 60 cm ethylacetat, gøres surtil en pH-værdi på 3-4 ved tilsætning af citronsyre og af¬køles til 0°C. Efter 2 timer hvile ved 0°C fraskilles det dannede bundfald ved filtrering, hvorpå det vaskes med 10 3 3 cm vand, tre gange med ialt 30 cm ethylacetat og tre gan- 3 ge med ialt 30 cm ether samt tørres under formindsket tryk(20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 20°C. Herved fås 0,83 g N -benzyl-oxycarbonyl-L,L-2,6-diamino-4-thia-pimelamsyre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,54 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding af n--butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet50:20:6:24 som elueringsmiddel.

Efter hydrolyse, derivatisering og chromatografi påen optisk aktiv kapillærkolonne fås 99,2% L-Lan (teoretisk= 1), 0,8% meso-Lan (teoretisk = 0) og <0,5% D-Lan (teoretisk = 0).

Eksempel 14 3 o

0,53 citr isobutylchlorformiat sættes til en til -5°C

afkølet opløsning af 1,88 g tert.butyl-N-(N-lauroyl-L-ala- 3 nyl)-α-D-glutamat i en blanding af 100 cm tetrahydrofuran 3 og 0,58 cm triethylamin. Reaktionsblandingen omrøres i 20minutter ved -5°C, hvorefter der tilsættes en til 2°C af- g kølet opløsning af 1,5 g N -tert.butyloxycarbonylglycyl- -L,L-2,6-diamino-4-thia-pimelamsyre i en blanding af 4,1 3 3 cm N natriumhydroxidopløsning og 35 cm vand.

Reaktionsblandingen omrøres i 5 minutter ved 10°C og derpå i 20 timer ved ca. 20°C. Tetrahydrofuranet afdampes under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Det fremkomne koncentrat afkøles til 0°C og gøres surt til en 3 pH-værdi på 2 ved tilsætning af ca. 7 cm IN saltsyre.

Reaktionsblandingen ekstraheres tre gange med ialt 3 200 cm ethylacetat. De organiske faser forenes, tørres overnatriumsulfat og koncentreres til tørhed under formindskettryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Herved fås en olie, som 3 ved rensning i 100 cm ether giver 2,1 g af et pulver, som chromatograferes i 60 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm) i en kolonne med diameteren 2,2 cm. Herved opløses dette3 pulver i 20 cm eddikesyre, og til den fremkomne opløsningsættes 4 g neutralt silicagel (0,04-0,63 mm). Den fremkomneblanding inddampes til tørhed under formindsket tryk (20 mmHg) ved 50°C, og remanensen anbringes i silicagelkolonnen.Der elueres med en blanding af ethylacetat og eddikesyre ivolumenforholdet 9:1, og der opsamles fraktioner med volumen 3 20 cm . Fraktionerne 13-42 forenes og koncentreres til tør¬hed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C·.

3

Remanensen udrives i 200 cm ether, fraskilles ved filtre- 2 1 ring og tørres. Herved fås 1,3 g N -[0 -tert.butyl-N-(N-lau- g royl-L-alanyl)-y-D-glutamyl]-N -tert.butyloxycarbonylgly-cyl-L,L-2,6-diamino-4-thia-pimelamsyre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,49 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 8:2 som elue-ringsmiddel.

1/3 g N^-[O^-tert.butyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-y-D- g -glutamyl]-N -tert.butyloxycarbonylglycyl-L,L-2,6-diamino- 3 -4-thia-pimelamsyre opløses i 30 cm af en vandfri opløs¬ning af 1/7 N saltsyre i eddikesyre. Reaktionsblandingenomrøres i 1 time, hvorefter den befries for et meget let,uopløseligt stof ved filtrering. Filtratet koncentreres tiltørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C.

3

Remanensen udrives i 50 cm ethylacetat, fraskilles ved fil- 3 trering, vaskes med 30 cm ethylacetat og to gange med ialt 3 60 cm ether samt tørres. Herved fås 0,9 g af et pulver,som chromatograferes på 30 g neutralt silicagel (0,04-0,063mm) i en kolonne med diameteren 2,1 cm. Der elueres med 3 eddikesyre, og der opsamles fraktioner med volumen 10 cm .Fraktionerne 13-20 forenes og koncentreres til tørhed underformindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Remanensen 3 udrives i 50 cm ethylacetat, fraskilles ved filtrering, vas- 3 kes med 30 cm ether og tørres. Herved fås 0,79 g af et pul- 3 ver, som opløses i 40 cm vand. Vandfasens pH-værdi indstil- 3 les på 3,5 ved tilsætning af 6 cm 0,1 N natriumhydroxidop¬løsning. Det dannede bundfald fraskilles ved filtering, vas- 3 kes med 20 cm vand og tørres under formindskat tryk (20 mmHg, 2,7 kPa) ved 50°C. Herved fås 0,59 g N^-[N-(N-lauroyl--L-alanyl)-y-D-glutamyl]-N^-glycyl-L,L-2,6-diamino-4-thia--pimelamsyre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,34 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding af n--butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet50:20:6:24 som elueringsmiddel.

Analyse:

Beregnet, %: C 51,99 H 7,79 N 12,99 S 4,96

Fundet, %: C 49,9 H8,0 N 12,8 S 4,9

Sulfataske, %: 0,9 g N-Tert.butyloxycarbonylglycy1-2(L),6(L)-diamino-4--thia-pimelamsyre kan fremstilles på følgende måde.

Til en til -75°C afkølet opløsning af 4,6 g di-tert.- 3 butyloxycarbonylglycyl-L-cystmamid i 400 cm ammoniak sæt¬tes natrium i små portioner/ indtil der fås en blå farve,som er bestandig i nogle minutter. Derefter tilsættes am-moniumchlorid indtil affarvning af reaktionsblandingen,hvorefter der tilsættes 2,66 g La-amino-3-chlorpropionsyre--hydrochlorid. Reaktionsblandingen omrøres i 2 timer ved-75°C og får derpå lov til at stå i 18 timer ved ca. 20°C.

3

Den herved fremkomne hvide pasta udrives i 100 cm ethanol,hvorpå blandingen filtreres. Filtratet koncentreres tiltørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C.

3

Den olieagtige remanens udrives i 50 cm eddikesyre, hvorpåblandingen filtreres. Filtratet koncentreres til tørhed un¬der formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Denne 3 procedure gentages to gange med ialt 60 cm methanol. Hervedfås 10,5 g af en olieagtig remanens, som chromatograferespå 250 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm) i en kolonne 3 med diameteren 3,5 cm. Herved opløses remanensen i 50 cmmethanol, og til den fremkomne opløsning sættes 20 g neu¬tralt silicagel (0,04-0,063 mm). Den fremkomne blanding ind¬dampes til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa)ved 50°C, og remanensen anbringes i silicagelkolonnen. Derelueres først med 1,15 1 af en blanding af ethylacetat og 3 methanol i volumenforholdet 1:1 og derpå med 850 cm af enblanding af ethylacetat og methanol i volumenforholdet 2:8, 3 og der opsamles fraktioner med volumen 50 cm . Fraktionerne26-33 forenes og koncentreres til tørhed under formindskettryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Remanensen udrives i 50 3 cm ethylacetat, fraskilles ved filtrering, vaskes med 20 3 cm ethylacetat og tørres under formindsket tryk (0,3 mmHg, 0,04 kPa) ved 50°C. Herved fås 2 g N^-tert.butyloxycar-bonylglycyl-2(L),6(L)-diamino-4-thia-pimelamsyre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,41 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding af n--butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet50:20:6:24 som elueringsmiddel.

[a]^° = -9° (N NaOH, c =1) .

Efter hydrolyse, derivatisering og chromatografi i en optisk aktiv kapillærkolonne fås 95,5% L-Lan (teoretisk= 1), <0,5% D-Lan (teoretisk = 0) og 4,5% meso-Lan (teo¬retisk = 0) .

Di-tert.butyloxycarbonylglycyl-^L-cys tinamid kan frem¬stilles på følgende måde.

13 cm3 isobutylchlorformiat sættes til en til -5°Cafkølet opløsning af 17,6 g tert.butyloxycarbonylglycin i 3 en blanding af 1,7 1 tetrahydrofuran og 14 cm triethyla-min. Blandingen omrøres i 20 minutter ved -5°C, hvorefterder tilsættes en til 5°C afkølet opløsning af 20 g L-cystin- 3 amid-hydrogenbromid i en blanding af 100 cm IN natrium¬hydroxidopløsning og 1 1 vand. Reaktionsblandingen omrøresi nogle minutter ved 0°C og derefter i 18 timer ved ca.

20°C. Tetrahydrofuranet fjernes derpå ved koncentrering un¬der formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Koncen¬tratet gøres surt til en pH-værdi på 3 ved tilsætning afcitronsyre og ekstraheres tre gange med ialt 1,5 1 ethyl-acetat. Ethylacetatfasen tørres over natriumsulfat og kon¬centreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7kPa) ved 50°C. Remanensen optages i 700 cm3 ether, fraskil- 3 les ved filtrering og vaskes to gange med ialt 200 cm ether.

Herved fås 19 g af et pulver. 15 g af dette pulver chroma- tograferes på 600 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm) i en kolonne med diameteren 4,8 cm. Herved opløses 15 g af 3 produktet i 100 cm methanol, og til den fremkomne opløsningsættes 15 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm). Den frem¬komne blanding inddampes til tørhed under formindsket tryk(20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C, og remanensen anbringes påsilicagelkolonnen. Der elueres successivt med 2,1 1 af enblanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 97:3, 1,9 1 af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i 3 volumenforholdet 96:4, 850 cm af en blanding af ethylacetatog eddikesyre i volumenforholdet 95:5, 1,7 1 af en blandingaf ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 94:6, 850 3 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumen- 3 forholdet 9:1, 900 cm af en blanding af ethylacetat og ed- 3 dikesyre i volumenforholdet 8:2 og 950 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 1:1, og der 3 opsamles fraktioner med volumen 50 cm . Fraktionerne 150-182 forenes og koncentreres til tørhed under formindskettryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Den olieagtige remanens 3 udrives i 400 cm ether, fraskilles ved filtrering, vaskes 3 to gange med ialt 200 cm ether og tørres under formindskettryk (0,3 mm Hg, 0,04 kPa) ved 50°C. Herved fås 7,5 g di--tert.butyloxycarbonylglycyl-L-cystinamid.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,38 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding afethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 9:1 som elue-ringsmiddel.

Eksempel 15 1,15 cm^ isobutylchlorformiat sættes til en til -6°Cafkølet opløsning af 3,51 g N-(N-lauroyl-L-alanyl)-D-iso- 3 glutamin i en blanding af 260 cm dimethylformamid og 1,23cm^ triethylamin. Blandingen omrøres i 20 minutter ved -6°C,hvorefter der tilsættes en til 5°C afkølet opløsning af 3 g g N -benzyloxycarbonyl-2(L),6(D,L)-diamino-4-thia-pimelamsyre 3 i en blanding af 8,8 cm N natriumhydroxidopløsning og 70cm^ vand.

Reaktionsblandingen omrøres i 10 minutter ved 5°C ogderpå i 24 timer ved ca. 20°C. Efter fjernelse af et let,uopløseligt stof ved filtrering fortyndes reaktionsblanding- 3 en med 700 cm vand, og den gøres sur til en pH-værdi på 2 3 ved tilsætning af ca. 6 cm 4 N saltsyre. Det dannede bund- 3

fald fraskilles ved filtrering, vaskes med 100 cm 0,1 N

3 saltsyre og tre gange med ialt 600 cm vand samt tørres ifri luft. Herved fås 5,6 g af et hvidt pulver, som chromato¬graf eres på 168 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm) i enkolonne med diameteren 3,5 cm. Herved opløses dette pulver 3 i 30 cm eddikesyre, og til den fremkomne opløsning sættes12 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm). Den fremkomne blan¬ding inddampes til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C, og remanensen anbringes i silicagelkolon-nen. Der elueres med en blanding af ethylacetat og eddike¬ syre i volumenforholdet 7:3, og der opsamles fraktioner med 3 volumen 100 cm » Fraktionerne 13-38 forenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved o 3 50 C. Remanensen udrives i 100 cm ether, fraskilles ved 2 filtrering og tørres. Herved fås 3,3 g N -[N-(N-lauroyl-L--alanyl)-D-isoglutaminyl]-N -benzyloxycarbonyl-2(L),6(D,L)--diamino-4-thia-pimelamsyre.

2,25 g N -[N-(N-lauroyl-L-alanyl)-D-isoglutaminyl]--N^-benzyloxycarbonyl-2(L),6(D,L)-diamino-4-thia-pimelam- 3 syre opløses i 16 cm af en 35% opløsning af hydrogenbromidi eddikesyre. Reaktionsblandingen omrøres i 35 minutter vedhjælp af en ultralydomrører og hældes derpå i 1,5 1 ether.Den fremkomne blanding omrøres i 2 timer. Det dannede bund¬fald fraskilles ved filtrering, vaskes tre gange med ialt3 3 150 cm ether og opløses i 350 cm vand. Vandfasen neutrali¬seres til en pH—værdi på 7 ved tilsætning af 0,1 N ammoniak-opløsning. Efter 16 timers hvile ved 20°C fraskilles det dan nede bundfald ved filtrering, hvorpå det vaskes to gange med 3 3 3 3 ialt 100 cm vand, med 100 cm ether, 50 cm acetone, 50 cm 3 3 ethylacetat, 50 cm methanol og 50 cm ether samt tørres un¬der formindsket tryk (0,3 mm Hg, 0,04 kPa) ved 20°C. Hervedfås 0,8 g af et pulver, til hvilket der sættes 0,3 g af etpulver opnået ved et lignende forsøg. Pulverblandingen chro-matograferes på 55 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm) ien kolonne med diameteren 2,5 cm. Herved opløses pulverblan- 3 dingen (1,1 g) i 20 cm eddikesyre, og til den fremkomne op¬løsning sættes 3 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm). Denfremkomne blanding inddampes til tørhed under formindskettryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C, og remanensen anbringesi silicagelkolonnen. Der elueres med en blanding af metha¬nol, ethylacetat og ammoniak (d = 0,92) i volumenforholdet 3 65:35:0,25, og der opsamles fraktioner med volumen 50 cm .Fraktionerne 7-13 forenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Remanensen 3 udrives i 30 cm ether, fraskilles ved filtrering, vaskes 3 3 med 5 cm vand,, tre gange med ialt 15 cm methanol og tre 3 gange med ialt 30 cm ether samt tørres under formindsket tryk (0,3 ram Hg, 0,04 kPa) ved 50°C. Herved fås 0,41 g N2--[N-(N-lauroyl-L-alanyl)-D-isoglutaminyl]-2(L),6(D,L)-di-amino-4-thia-pimelamsyre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,60 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding afpyridin, ethylacetat, eddikesyre, vand og methanol i volu¬menforholdet 30:40:6:10:10 som elueringsmiddel.

Analyse:

Beregnet, %: C 53,04 H 8,21 N 14,27 S 5,44

Fundet, %: C 51,1 H 7,9 N 13,6 S 5,4

Masse-spektrometri: M = 588 (teoretisk = 588).

Eksempel 16

0,55 cm isobutylchlorformiat sættes til en til -8°C

afkølet opløsning af 73,2 mg N-tert.butyloxycarbonylglycin 3 3 i en blanding af 120 cm tetrahydrofuran og 0,58 cm tri- ethylamin. Reaktionsblandingen omrøres i 20 minutter ved -8°C, hvorefter der tilsættes en til 4°C afkølet opløsning af 2,46 g N2-[N-(N-lauroyl-L-alanyl)-D-isoglutaminyl]-2(L),- 3 6(D,L)-diamino-4-thia-pimelamsyre i en blanding af 4,18 cm 3 1 N natriumhydroxidopløsning og 120 cm vand. Reaktionsblan¬dingen omrøres i 5 minutter ved 0°C og derpå i 20 timer vedca. 20°C. Tetrahydrofuranet afdampes under formindsket tryk(20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Koncentratet gøres surt tilen pH-værdi på 2 ved tilsætning af 4 N saltsyre. Det dannede bundfald fraskilles ved filtrering, vaskes fire gange med 3 3 ialt 200 cm vand og 3 gange med ialt 150 cm ethylacetat samt tørres under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved20°C. Herved fås 2,25 g af et hvidt pulver, som chromatogra-feres på 112 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm) i en ko¬lonne med diameteren 3,2 cm. Der elueres først med 1 1 afen blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet20:80 og derpå med 1 1 eddikesyre, og der opsamles fraktion- 3 er med volumen 25 cm . Fraktionerne 41-80 forenes og kon¬centreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7kPa) ved 50°C. Remanensen udrives i 100 cm3 ether og tørresunder formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Herved fås 1,04 g N^-[N-(N-lauroyl-L-alanyl)-D-isoglutaminyl]-N*’--(tert.butylDxycarbonylglycyl)-2(L),6(D,L)-diamino-4-thia--pimelamsyre«.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,57 ved tyndtlagschro- matografi på silicagel med anvendelse af en blanding af n- -butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet 50:20:6:24 som elueringsmiddel og en Rf-værdi på 0,69 ved tyndtlagschromatografi på silicagel med anvendelse af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 2:8 som elueringsmiddel.

2 0,88 g N -[N-(N-lauroyl-L-alanyl)-D-isoglutaminyl]--N^-tert.butyloxycarbonylglycyl-2(L),6(D,L)-diamino-4-thia- 3 -pimelamsyre opløses i 12 cm af en vandfri opløsning af 1,6 N saltsyre i eddikesyre. Reaktionsblandingen omrøres i 3 35 minutter og hældes derpå i 120 cm ether. Den fremkomneblanding omrøres i 1 time. Det dannede bundfald fraskilles 3 ved filtrering, vaskes tre gange med ialt 60 cm ether ogtørres under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 20°Co 3

Det fremkomne pulver opløses i 70 cm vand. Den vandige op¬løsnings pH-værdi indstilles på 5-6 ved tilsætning af 0,1N ammoniakopløsning. Efter 0,5 times hvile fraskilles det dannede bundfald ved filtrering, hvorpå det vaskes tre gan- 3 3· ge med ialt 60 cm vand, tre gange med ialt 60 cm ether, to gan- 3 3 ge med ialt 40 cm ethylacetat og to gange med ialt 40 cm ether samt tørres under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 20°C. Herved fås 0,55 g af et hvidt pulver, som chromatograferes på 25 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm) i en kolonne med diameteren 1,6 cm. Der elueres med eddike- 3 syre, og der opsamles fraktioner med volumen 10 cm . Frak¬tionerne 58-72 forenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Remanensen3 udrives i 50 cm ether, fraskilles ved filtrering, vaskes 3 tre gange med ialt 60 cm ether og tørres under formindskettryk (0,3 mm Hg, 0,04 kPa) ved 50°C. Herved fås 300 mg N^--[N-(N-lauroyl-L-alanyl)-D-isoglutaminyl]-N^-glycyl-2(L),-6(D,L)-diamino-4-thia-pimelamsyre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,33 ved tyndtlagschro- matografi på silicagel med anvendelse af en blanding af n--butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet50:20:6:24 som elueringsmiddel.

Analyse:

Beregnet, %: c 52,07 H 7,96 N 15,18 S 4,96

Fundet, %: C 50,5 H 8,0 N 14,1 S 4,9

Eksempel 17 1 cm^ isobutylchlorformiat sættes til en til -8°C af¬kølet opløsning af 3,38 g benzyl-O-acetyl-D-lactoyl-L-alanyl- 3 -a-D-glutamat i en blanding af 160 cm tetrahydrofuran og 3 1,12 cm triethylamin. Reaktionsblandingen omrøres i 20 mi¬nutter ved -8°C, hvorefter der tilsættes en til 2°C afkølet 2 opløsning af 3,02 g N -benzyloxycarbonyl-L,L-2,6-diamino- 3 -4-thia-pimelamsyre i en blanding af 16 cm N natriumhydro- 3 xidopløsning og 60 cm vand.

Reaktionsblandingen omrøres i 5 minutter ved -8°C ogderpå i 20 timer ved ca. 20°C. Tetrahydrofuranet afdampesunder formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Detfremkomne koncentrat afkøles til 0°C, gøres surt til en 3 pH-værdi på 2 ved tilsætning af ca. 6 cm 4 N saltsyre og 3 ekstraheres fem gange med ialt 300 cm ethylacetat. De or- 3 ganiske faser forenes, vaskes med 40 cm vand og med 20 3 cm af en mættet natriumchloridopløsning, tørres over na¬triumsulfat og koncentreres til tørhed under formindskettryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Herved fås 5,68 g afen olie, som chromatograferes på 100 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm) i en kolonne med diameteren 3 cm. Der elue- 3 3 res successivt med 400 cm ethylacetat, 360 cm af en blan¬ding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 98:2, 3 320 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volu- 3 menforholdet 95:5 og 280 cm af en blanding af ethylacetatog eddikesyre i volumenforholdet 9:1, og der opsamles frak- 3 tioner med volumen 40 cm . Fraktionerne 23-34 forenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Herved fås 5,06 g N^-[O^-benzyl-N-(0- 2 -acetyl-D-lactoyl-L-alanyl)-y-D-glutamyl]-N -benzyloxycar- < bonyl-L,L-2,6-diamino-4-thia-pimelamsyre i form af en olie.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,67 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding af n--butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet50:20:6:24 som elueringsmiddel og en Rf-værdi på 0,23 vedtyndtlagschromatografi på silicagel med anvendelse af enblanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet9:1 som elueringsmiddel.

3,16 g Ν'**-[O^-benzyl-N-(O-acetyl-D-lactoyl-L-alanyl)-2 -y-D-glutamyl]-N -benzyloxycarbonyl-L,L-2,6-diamino-4-thia- 3 -pimelamsyre opløses i en blanding af 13 cm af en 35% opløs- 3 ning af hydrogenbromid i eddikesyre og 11 cm eddikesyre.Reaktionsblandingen omrøres i 2 timer, hvorpå der tilsættes 3 500 cm ether. Den fremkomne blanding får lov til at hvilenatten over. Det dannede bundfald fraskilles ved filtrering, 3 vaskes tre gange med ialt 150 cm ether og tørres under for¬mindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 20°C. Herved fås 2,22 C 1 g N -[O -benzyl-N-(O-acetyl-D-lactoyl-L-alanyl)-y-D-gluta-myl]-L,L-2,6-diamino-4-thia-pimelamsyre i form af et hydro-skopisk pulver..

Produktet giver en Rf-værdi på 0,83 ved tyndtlagschro- matografi på silicagel med anvendelse af en blanding af iso- propanol og vand i volumenforholdet 6:4 som elueringsmiddel.

2,20 g N6-[01-benzyl-N-(O-acetyl-D-lactoyl-L-alanyl)- -y-D-glutamyl]-L,L-2,6-diamino-4-thia-pimelamsyre opløses 3 3 i en blanding af 14 cm methanol og 14 cm IN natriumhydro¬xidopløsning. Reaktionsblandingen omrøres i 2 timer, hvor¬efter den neutraliseres til en pH-værdi på 7 ved tilsætningaf 1 N saltsyre og koncentreres under formindsket tryk (20mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Remanensen optages i 3 cm^ vand 3 og gøres sur med 3,5 cm 4 N saltsyre. Den herved fremkomneopløsning chromatograferes på en "Sephadex G-10"-kolonne meden højde på 2 a og en diameter på 2,2 cm. Der elueres med 3 vand, og der opsamles fraktioner med volumen 5 cm . Frak¬tionerne 57-69 forenes, lyofiliseres og tørres under for¬mindsket tryk (0,3 mm Hg, 0,04 kPa) ved 60°C. Herved fås 900 g mg N -[N-(N-D-lactoyl - L-alanyl)-γ-D-glutamyl]-L,L-2,6-di- amino-4-thia-pimelamsyre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0/75 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding af iso-propanol og vand i volumenforholdet 6:4 som elueringsmiddel.Analyse:

Beregnet, %: C 42,58 H 6,10 N 14,60 S 6,69

Fundet, %: C 39,7 H6,4 N 13,2 S 6,4

Benzyl-O-acetyl-D-lactoyl-L-alanyl-a-D-glutamat kan fremstilles på følgende måde.

5,5 cm3 isobutylchlorformiat sættes til en til -6°C

afkølet opløsning af 5,61 g O-acetyl-D-mælkesyre i en blan-3 3 ding af 425 cm tetrahydrofuran og 6 cm triethylamin. Reak¬tionsblandingen omrøres i 20 minutter ved -6°C, hvorefterder tilsættes en til 3°C afkølet opløsning af 14,66 benzyl- 3 -L-alanyl-a-D-glutamat-hydrochlorid i en blanding af 85 cm 3 N natriumhydroxidopløsning og 42 cm vand.

Reaktionsblandingen omrøres i nogle minutter ved 0°Cog derpå i 18 timer ved ca. 20°C. Blandingen gøres sur til 3 en pH-værdi på 2 ved tilsætning af ca. 50 cm IN saltsyre.Tetrahydrofuranet afdampes under formindsket tryk (20 mmHg, 2,7 kPa) ved 50°C. Til koncentratet sættes 100 cm3 ethyl- 3 acetat og 35 cm IN saltsyre. Den organiske fase fraskil- 3 les, og vandfasen ekstraheres tre gange med ialt 150 cm e-thylacetat. Alle de organiske faser forenes, vaskes med 50 3 cm af en mættet natriumchloridopløsning, tørres over natri¬umsulfat og koncentreres til tørhed under formindsket tryk(20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Herved fås en olie, som chro¬ma tograf eres på 550 g neutralt silicagel (0,03-0,2 mm) ien kolonne med diameteren 5 cm. Der elueres successivt med 3 500 cm af en blanding af ethylacetat og methanol i volumen- 3 forholdet 98:2, 700 cm af en blanding af ethylacetat og me- 3 thanol i volumenforholdet 95:5, 400 cm af en blanding af 3 ethylacetat og methanol i volumenforholdet 9:1 og 600 cmaf en blanding af ethylacetat og methanol i volumenforholdet 3 8:2, og der opsamles fraktioner med volumen 100 cm . Frak¬tionerne 13-22 forenes og koncentreres til tørhed under for¬mindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Herved fås 8,78 g benzyl-O-acetyl-D-lactoyl-L-alanyl-a-D-glutamat i form afen olie.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,63 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding af eddi¬kesyre og ethylacetat i volumenforholdet 9:1 som eluerings-middel.

Eksempel H8 0,91 cm2 isobutylehlorformiat sættes til en til -8°Cafkølet opløsning af 3,04 g benzyl-N-(N-octanoyl-L-alanyl)- 3 -α-D-glutamat i en blanding af 140 cm tetrahydrofuran og 3 0,98 cm triethylamin. Reaktionsblandingen omrøres i 20 minutter ved -8°C, hvorefter der tilsættes en til 2°C af- 2 kølet opløsning af 2,64 g N -benzyloxycarbonyl-L,L-2,6-dia- 3 mino-4-thia-pimelamsyre i en blanding af 14 cm N natrium- 3 hydroxidopløsning og 53 cm vand. Reaktionsblandingen om¬røres i 5 minutter ved 0°C og derpå i 4 timer ved ca. 20°C.Tetrahydrofuranet afdampes under formindsket tryk (20 mmHg, 2,7 kPa) ved 50°C. Det fremkomne koncentrat afkøles til0°C, gøres surt til en pH-værdi på 2 ved tilsætning af ca.

3 5 cm 4 N saltsyre og ekstraheres fem gange med ialt 300 3 3 cm ethylacetat. De organiske faser forenes, vaskes med 25 cm vand og 3 med 25 cm af en mættet natriumchloridopløsning, tørres overnatriumsulfat og koncentreres til tørhed under formindskettryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Herved fås 5,18 g af etlyst beigefarvet pulver, som chromatograferes på 100 g neu¬tralt silicagel (0,04-0,063 mm) i en kolonne med diameteren 3 3 cm. Der elue'res successivt med 160 cm ethylacetat, 360 3 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumen- 3 forholdet 97:3, 720 cm af en blanding af ethylacetat og ed- 3 dikesyre i volumenforholdet 95:5 og 680 cm af en blandingaf ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 9:1, og der 3 opsamles fraktioner med volumen 40 cm . Fraktionerne 15-48forenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk(20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Remanensen udrives i 100 cnrether, fraskilles ved filtrering og tørres. Herved fås 3,33g N6-[O^-benzyl-N-(N-octanoyl-L-alanyl)-γ-D-glutamyl]-N2- -benzyloxycarbonyl-L,L-2,6-diamino-4-thia-pimelamsyre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,37 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding afethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 9:1 som elue-ringsmiddel.

Masse-spektrometri: M = 757 (teoretisk = 757).

3,33 g N®-[O^-benzyl-N- (N-octanoyl-L-alanyl)-y'-D-glu-2 tamyl]-N -benzyloxycarbonyl-L ,1.-2,6-diamino-4-thia-pimelam- 3 3 syre opløses i en blanding af 33 cm methanol og 9,7 cm 1 N natriumhydroxidopløsning. Reaktionsblandingen omrøres i60 minutter, hvorpå methanolet delvis afdampes under for¬mindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Det fremkomne 3 koncentrat fortyndes med 30 cm vand og gøres surt til enpH-værdi på 1 ved tilsætning af 1 N saltsyre. Den fremkomneblanding får lov til at hvile i 18 timer, hvorved der dannesen olie på væggene. Denne olie fraskilles ved dekantering, 3 vaskes to gange med ialt 40 cm vand og tørres under for¬mindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 20°C. Herved fås 2,86g olie, som chromatograferes på 77 g neutralt silicagel(0,04-0,063 mm) i en kolonne med diameteren 3 cm. Herved 3 opløses olien i 30 cm eddikesyre, og til den fremkomneopløsning sættes 8 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm). Denfremkomne blanding inddampes til tørhed under formindskettryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C, og remanensen anbringespå silicagelkolonnen. Der elueres successivt med 80 cm afen blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 3 9:1, 80 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre 3 i volumenforholdet 8:2 og 280 cm af en blanding af ethyl¬acetat og eddikesyre i volumenforholdet 1:1, og der opsam- 3 les fraktioner med volumen 40 cm . Fraktionerne 5-11 fore¬nes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Remanensen udrives i 40 cm^ e-thylacetat, fraskilles ved filtrering og tørres. Herved fås1,94 g af et pulver, som chromatograferes på 80 g neutraltsilicagel (0,04-0,063 mm) i en kolonne med diameteren 3,5 3 cm. Herved opløses pulveret i 30 cm eddikesyre, og til denfremkomne opløsning sættes 6 g neutralt silicagel (0,04-0,063 \ mm). Den fremkomne blanding inddampes til tørbed under fpr~mindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C, og remanensenanbringes på silicagelkolonnen. Der elueres først med 600 3 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumen- 3 forholdet 8:2 og derpå med 400 cm af en blanding af ethyl¬acetat og eddikesyre i volumenforholdet 7:3, og der opsamles 3 fraktioner med volumen 40 cm . Fraktionerne 7-25 forenesog koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mmHg, 2,7 kPa) ved 50°C. Remanensen udrives i 30 cm^ ether, g fraskilles ved filtrering og tørres. Herved fås 1,44 g N - 2 -[N-(N-octanoyl-L-alanyl)-γ-D-glutamyl]-N -benzyloxycarbo-nyl-L,L-2,6-diamino-4-thia-pimelamsyre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,52 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding af n--butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet50:20:6:24 som elueringsmiddel.

1,4 g N^-[N-(N-octanoyl-L-alanyl)-Y-D-glutamyl]-N^“-benzyloxycarbonyl-L,L-2,6-diamino-4-thia-pimelamsyre op- 3 løses i en blanding af 5,6 cm af en 33% opløsning af hydro- 3 genbromid i eddikesyre og 5 cm eddikesyre. Reaktionsblan¬dingen omrøres i 2 timer ved 28°C og koncentreres derpå tiltørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C.Remanensen udrives i 60 cm ether. En olie afsættes på væg¬gene, og denne olie fraskilles ved dekantering, udrives i 3 50 cm ether, fraskilles på ny ved dekantering og opløses i 3 200 cm vand. Den fremkomne vandige opløsning.koncentrerestil tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved55°C. Herved fås en olie, som chromatograferes på 80 g neu¬tralt silicagel (0,04-0,063 mm) på en kolonne med diameteren3 cm. Der elueres med en blanding af methanol, ethylacetatog ammoniak (d = 0,92) i volumenforholdet 75:25:0,5, og der 3 opsamles fraktioner med volumen 20 cm . Fraktionerne 15-21forenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk(20 mm Hg, 2,7 kPa.) ved 50°C. Herved fås 460 mg af et hvidt 3 pulver. 360 mg af dette pulver opløses i 5 cm vand og chro-matograferes på en "Sephadex G-10"-kolonne med en højde på2 m og en diameter på 2,2 cm. Der elueres med vand, og der 3 opsamles fraktioner med volumen 5 cm . Fraktionerne 68-84forenes, lyofiliseres og tørres under formindsket tryk (0,3mm Hg, 0,04 kPa) ved 60°C. Herved fås 300 mg [N-(N-octanoyl- -L-alanyl) -γ-d f-glutamyl ] -L ,L- 2,6-diamino-4-thia-pimelamsy-re.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,25 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding af n--butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet50:20:6:24 som elueringsmiddel.

Analyse:

Beregnet, %: C 49,52 H 7,37 N 13,12 S 6,01

Fundet, %: C 45,3 H 7,4 N 11,7 S 5,7

Sulfataske, %: 1.

Benzyl-N-octanoyl-L-alanyl-a-D-glutamat kan fremstil¬les på følgende måde.

3,6 cm^ isobutylchlorformiat sættes til en til -1°C

3 afkølet opløsning af 3,95 g octansyre i 140 cm tetrahydro- 3 furan og 3,8 cm triethylamin. Reaktionsblandingen omrøresi 20 minutter ved -1°C, hvorefter der tilsættes en til 0°Cafkølet opløsning af 9,45 g benzyl-L-alanyl-a-D-glutamat- 3 -hydrochlorid i en blanding af 54,8 cm IN natriumhydroxid- 3 opløsning og 30 cm vand. Reaktionsblandingen omrøres i 1time ved -1°C og derpå i 20 timer ved ca. 20°C, hvorpå dengøres sur til en pH-værdi på 1 ved tilsætning af 1 N salt¬syre. Tetrahydrofuranet afdampes under formindsket tryk(20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 45°C, og det fremkomne koncentrat 3 ekstraheres med 100 cm ethylacetat. Den organiske fase vas- 3 3 kes to gange med ialt 50 cm IN saltsyre og med 25 cm afen mættet natriumchloridopløsning samt koncentreres til tør¬hed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 45°C.Herved fås 10 g af en lysegul olie, som chromatograferes påen kolonne med diameteren 2,5 cm indeholdende 200 g neutraltsilicagel (0,063-0,20 mm) . Der elueres med ethylacetat, og 3 der opsamles fraktioner med volumen 100 cm . Fraktionerne7-9 forenes og koncentreres til tørhed under formindskettryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 45°C. Remanensen udrives i100 cm^ af en blanding af ether og petroleumsether (koge- punkt = 35-60°C) i volumenforholdet 1:4, fraskilles vedfiltrering og tørres. Herved fås 3,27 g benzyl-N-octanoyl--L-alanyl-a-D-glutamat i form af et hvidt pulver.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,56 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding afethylacetat og methanol i volumenforholdet 8:2 som eluerings-middel.

Eksempel 193 1 cm-3 isobutylchlorformiat sættes til en til 10°C af¬kølet opløsning af 5,047 g benzyl-N-(N-docosanoyl-L-alanyl)- 3 -α-D-glutamat i en blanding af 160 cm tetrahydrofuran og3 1,12 cm triethylamin. Reaktionsblandingen omrøres i 20 mi¬nutter ved 10°C, hvorefter der tilsættes en til 2°c afkølet 2 opløsning af 3,023 g N -benzyloxycarbonyl-L,L-2,6-diamino- 3 -4-thia-pimelamsyre i en blanding af 16 cm N natriumhydro- 3 xidopløsning og 60 cm vand.

Reaktionsblandingen omrøres i 16 timer ved ca. 20°C, hvorpå den gøres sur til en pH-værdi på 1 ved tilsætning af 3 3 6 cm 4 N saltsyre og ekstraheres fem igange med ialt 300 cm 3 ethylacetat. De organiske faser forenes, vaskes med 30 cm 3 vand og med 30 cm af en mættet natriumchloridopløsning, tørres over natriumsulfat og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°Cfc Herved fås 7,7 g af et fast stof, som chrbmatograferes på 150 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm) i en kolonne med diameteren 3,5 3 cm. Herved opløses pulveret i 60 cm eddikesyre, og til denfremkomne opløsning sættes 20 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm). Den fremkomne blanding inddampes til tørhed un¬der formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C, og rema¬nensen anbringes på silicagelkolonnen. Der elueres succes-3 3 sivt med 240 cm ethylacetat, 320 cm af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 98:2, 640 ciri af en blanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenfor- 3 holdet 95:5, 360 cm af en blanding af ethylacetat og eddi- 3 kesyre i volumenforholdet 9:1, 440 cm af en blanding afethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet 8:2 og 400 3 cm eddikesyre, og der opsamles fraktioner med volumen 403 cm . Fraktionerne 11-60 forenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Herved fås 4,51 g N^-[O^-benzyl-N-(N-docosanoyl-L-alanyl)-γ-D-2 -glutamyl]-N -benzyloxycarbonyl-L,L-2,6-diamino-4-thia-pi-melamsyre i uren form.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,72 (hovedplet) vedtyndtlagschromatografi på silicagel med anvendelse af enblanding af ethylacetat og eddikesyre i volumenforholdet9:1 som elueringsmiddel.

4,4 g N6-[C^-benzyl-N-(N-docosanoyl-L-alanyl)-γ-D-2 -glutamyl]-N -benzyloxycarbonyl-L,L-2,6-diamino-4-thia-pi- 3 melamsyre opløses i en blanding af 220 cm methanol og 10,1 3 cm IN natriumhydroxidopløsning. Reaktionsblandingen om- 3 røres i 2 døgn og hældes derefter i en blanding af 670 cm "3 vand og 13 cm 1 N saltsyre. Det dannede bundfald fraskil- 3 les ved filtrering, vaskes fem gange med ialt 125 cm vandog tørres under fomindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved20°C. Der fås herved 2,1 g flødefarvet pulver, som opløses 3 i en blanding af 8 cm af en 33% opløsning af hydrogenbromid 3 i eddikesyre og 8 cm eddikesyre. Reaktionsblandingen om¬røres i 3 timer ved 20°C. Det dannede uopløselige stof fra- 3 skilles ved filtrering, vaskes fem gange med ialt 12,5 cm 3 3 eddikesyre samt med 5 cm ether og 5 cm petroleumsether(kogepunkt = 35-60°C) og tørres under formindsket tryk (20mm Hg, 2,7 kPa) ved 20°C. Herved fås 1,66 g af et flødefar¬vet pulver. Filtraterne forenes og koncentreres til tørhed un¬der formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 20°C. Remanen- 3 sen optages tre gange i ialt 150 cm ether, og blandingenkoncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 30°C. Remanensen optages i en blanding af 25cm^ ether og 25 cm^ petroleumsether (kogepunkt = 35-60°C).Det faste stof fraskilles ved filtrering, vaskes to gangemed ialt 20 cm^ petroleumsether (kogepunkt = 35-60°C) ogtørres under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 20°C.Den totale pulvermængde (1,66 g plus 0,55 g) hældes i 500 3 cm vand under kraftig omrøring. Efter 1 times omrøring fra¬ skilles bundfaldet ved filtrering, hvorpå det vaskes tre 3 gange med ialt 150 cm vand og tørres under formindsket tryk(20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 20°C. Herved fås 1,52 g af et fløde¬farvet pulver, som chromatograferes på 45 g neutralt sili-cagel (0,04-0,063 mm) i en kolonne med diameteren 2 cm.

3

Herved opløses pulveret i 60 cm eddikesyre opvarmet til60°C, og til den fremkomne opløsning sættes 5 g neutraltsilicagel (0,04-0,063 mm). Den fremkomne blanding inddampestil tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved50°C, og remanensen anbringe på silicagelkolonnen. Der elu-eres med eddikesyre, og der opsamles fraktioner med volumen 3 30 cm . Fraktionerne 11-27 forenes og koncentreres til tør¬hed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C.Herved fås 720 mg af et rosafarvet pulver, som chromatogra-feres på 36 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm) i en kolon- 3 ne med diameteren 2 cm. Pulveret opløses herved i 30 cmeddikesyre, og til den fremkomne opløsning sættes 3 g neu¬tralt silicagel (0,04-0,063 mm). Den fremkomne blanding ind¬dampes til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7kPa) ved 50°C, og remanensen anbringes på silicagelkolon¬nen. Der elueres med en blanding af ethylacetat og eddikesyrei volumenforholdet 2:8, og der opsamles fraktioner med vo- 3 lumen 40 cm . Fraktionerne 12-29 forenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C.

3 3

Remanensen udrives i en blanding af 25 cm ether og 25 cmpetroleumsether (kogepunkt = 35-60°C), fraskilles ved fil¬trering og tørres under formindsket tryk (0,3 mm Hg, 0,04kPa) ved 20°C. Herved fås 220 mg N^-[N-(N-docosanoyl-L-ala-nyl)-γ-D-glutamyl]-L,L-2,6-diamino-4-thia-pimelamsyre.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,32 ved tyndtlagsch.ro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding af n--butanol, pyridin, eddikesyre og vand i volumenforholdet50:20:6:24 som elueringsmiddel og en Rf-værdi på 0,60 vedtyndtlagschromatografi på silicagel med anvendelse af eddi¬kesyre som elueringsmiddel.

Masse-spektrometri: M = 729 (teoretisk = 729).Benzyl-N-docosanoyl-L-alanyl-a-D-glutamat kan fremstil- «* les på følgende måde.

3 1/95 cm isobutylchlorformiat sættes til en opløsning 3 af 5/19 g docosansyre i en blanding af 150 cm tetrahydro- 3 furan og 2,1 cm triethylamin, hvilken opløsning holdes ved25°C. Reaktionsblandingen omrøres i 20 minutter ved 25°C/hvorefter der tilsættes en opløsning af 5,69 g benzyl-L-ala- 3

nyl-a-D-glutamat-hydrochlorid i en blanding af 33 cm IN

3 natriumhydroxidopløsning og 17 cm vand. Reaktionsblanding¬en omrøres i 30 minutter ved 30°C og derpå i 18 timer vedca. 20°C. Der tilsættes 100 cm^ vand, og reaktionsblandingengøres sur til en pH-værdi på 1. Herved fås et bundfald, som 3 fraskilles ved filtrering, vaskes tre gange med ialt 75 cmvand og tørres under formindsket tryk (0,3 mm Hg, 0,04 kPa)ved 20°C. Herved fås 6,53 g af et hvidt pulver. 6 g af dette 3 pulver opløses i 50 cm tetrahydrofuran indeholdende 20 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm). Den fremkomne blanding koncentreres til tørhed under formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C, og remanensen anbringes på en kolonne med diameteren 3,5 cm indeholdende 180 g neutralt silicagel (0,04-0,063 mm). Der elueres successivt med 1300 cm af en blanding af cyclohexan og ethylacetat i volumenforholdet3 3 1:1, 600 cm ethylacetat, 500 cm af en blanding af ethyl- 3 acetat og tetrahydrofuran i volumenforholdet 95:5, 900 cmaf en blanding af ethylacetat og tetrahydrofuran i volumen- 3 forholdet 9:1, 800 cm af en blanding af ethylacetat og te- 3 trahydrofuran i volumenforholdet 8:2, 1000 cm af en blan¬ding af ethylacetat og tetrahydrofuran i volumenforholdet 3 6:4, 900 cm af en blanding af ethylacetat og tetrahydrofu- 3 ran i volumenforholdet 4:6, 500 cm af en blanding af ethyl- 3 acetat og tetrahydrofuran i volumenforholdet 2:8 og 600 cmtetrahydrofuran, og der opsamles fraktioner med volumen 100 3 cm . Fraktionerne 17-68 forenes og koncentreres til tørhedunder formindsket tryk (20 mm Hg, 2,7 kPa) ved 50°C. Hervedfås 3,31 g benzyl-N-docosanoyl-L-alanyl-a-D-glutamat.

Produktet giver en Rf-værdi på 0,54 ved tyndtlagschro-matografi på silicagel med anvendelse af en blanding afethylacetat og tetrahydrofuran i volumenforholdet 8:2 somelueringsmiddel.

Adjuvansegenskaberne og de immunostimulerende egen¬skaber af forbindelserne med formlen I i sammenligningmed det fra DK fremlæggelsesskrift nr. 148.809 kendte lac-toyl-tetrapeptid fremgår af de følgende forsøgsbeskrivel¬ser og -resultater.

Det fremgår af resultaterne, at forbindelserne medformlen I udviser bemærkelsesværdige egenskaber, idet degenerelt udviser ringe stimulerende aktiviteter på ikke--specifikke funktioner (mitogen aktivitet hos muse-milt-celler), medens de viser sig at være aktive ved specifikkeantigen-reaktioner (udskillelse af antistoffer eller cyto-statisk aktivitet af makrofager in vitro, infektioner invivo). Forbindelserne med formlen I har, selv om de har etmere begrænset aktivitetsspektrum, den fordel takket værederes virkningsspecificitet, at sekundære virkninger, derskyldes en "generel" stimulering af immunsystemet, undgåseller begrænses.

Det er interessant at bemærke, at forbindelsen ifølgeDK 148.809, selv om den har en høj aktivitet in vitro, ikkemedfører en væsentlig forøgelse af dannelsen af antistofferrettet mod et specifikt antigen (røde blodlegemer fra får).Tilsvarende muliggør den, selv om den er aktiv over for in¬fektion med Klebsiella pneumoniae, ikke en effektiv beskyt¬telse mod en infektion med Listeria monocytogenes (en bak¬terie, som formerer sig i makrofager).

Det må betragtes som overraskende, at erstatning afen 2,6-diaminopimelinsyrerest, som i den kendte forbindelse,med f.eks. en lanthioninrest, som i forbindelserne med form¬len I, giver en overlegen virkning knyttet til en virknings-specificitet.

1-Mitogen aktivitet in vitro på muse-miltceller.

Den anvendte metode er en tilpasning af metoden beskre¬vet af O. Marchal, Ann. Immunol. (Institut Pasteur), 125 C,519 (1974).

Miltceller fra hunlige Balb/C-mus på 7-8 uger dyrkes 5 i en mængde på 2,5 x 10 pr. hul i en mikrotiterplade i 0,2 ml RPMI-164O-medium indeholdende 0,1% kvægserumalbumin-5 og 5 x 10 M 2-mercaptoethanol og forskellige fortyndingeraf forbindelsen, der skal undersøges. De inkuberes i 48 ti¬mer ved 37°C i en luft/C00-ovn (med 10% CO_). Der tilsæt-3 z z tes 0,5yuCi H-methyl-thymidin (7 Ci/mM) ved de sidste 24 ti¬mers inkubering. Cellerne høstes ved hjælp af et MASH Il-ap¬parat, og radioaktiviteten inkorporeret i DNA måles i envæskescintilationstæller SL 4000.

Resultaterne udtrykkes i cpm (tællinger pr. minut) sva¬rende til gennemsnittet af mindst 3 huller pr. fortyndingaf den undersøgte forbindelse, og de er sammenfattet i ta¬bel I.

Tabel I

2 - Aktivitet på udskillelse af specifikke antistofferin vitro_

Den anvendte metode er inspireret af metoderne be¬skrevet af P.H. Klesius, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. (N.Y.)135, 155 (1970) og H. Van Dijk og N. Blosma, J. Immunol.Methods 14, 325 (1977) .

O

CBA-Hunmus på 7-8 uger immuniseres med 2 x 10 rødeblodlegemer fra får (GEM) ad intraperitoneal vej.

4 Dage senere fjernes milten fra hver mus aseptisk,formales med 20 ml Hank's opløsning + 0,1% kvægserumal-bumin og filtreres på en sigte (60^,um) . Cellesuspensionernefra 5 mus blandes, og de levende celler tælles efter farv¬ning med trypanblåt ved hjælp af en cytograf. Efter fortyn- 7 ding og kontrol indstilles suspensionen til 10 levendeceller pr. ml i RPMI-1640-medium (Eurobio) tilsat 0,1%kvægserumalbumin, 1% glutamin (200 iriM), 40^ug/ml genta-mycin, 1 g/liter NaHCOg og HEPES-puffer til en pH-værdipå 7.

Til 1 ml cellesuspension sættes 1 ml medium indehold¬ende fortyndingen af forbindelsen, der skal undersøges, iFalcon-rør, som inkuberes i en ovn ved 37°C i 24 eller 48timer.

Derefter måles de hæmolytiske antistoffer (anti-GRM),som er udskilt af cellerne, ved blanding af 1 ml af denovenstående væske med 0,5 ml komplement fortyndet til 1/15 g og 0,5 ml GEM-suspension med 4 x 10 /ml.

Efter 1 time i et vandbad ved 37°C tilsættes 2 mlMayer-puffer, og mængden af frigjort hæmoglobin måles vedbestemmelse af den optiske tæthed med et spektrofotometerved 542 nm.

Virkningen af forbindelsen på udskillelsen af anti¬stoffer udtrykkes ved den procentiske hæmolyse i kulturerindeholdende forbindelsen i forhold til kontrolkulturer,og resultaterne er sammenfattet i tabel II.

Tabel II

3 - Cytostatisk aktivitet af peritoneale makrofager framus mod tumor cel ler._._

Bg-D'2-F^-mus (Ch. River, Frankrig) med en alder på8-9 uger modtager intraperitonealt 1,5 ml thioglycolat--bouillon.

4 dage senere udtages de peritoneale makrofager, 5 vaskes og fordeles m-d 2 x 10 pr. hul i 0,2 ml RPMI-1640--medium indeholdende 2% kalvefosterserum. Efter 4 timersinkubering ved 37°C vaskes hullerne 2 gange. Der tilsættesderefter 0,1 ml medium og 0,1 ml medium indeholdende for¬tyndingerne af forbindelsen, der skal undersøges.

Efter 24 timer vaskes lagene af makrofager på ny, 3 og der tilsættes 3 x 10 Pg^g-tumorceller i 0,2 ml, sombringes i kontakt med makrofagerne i 24 timer. I de sidste 3 6 timer af inkuberingen tilsættes 0,5yuCi H-JUdR pr. hul.Radioaktiviteten opsamles ved hjælp af en MASH-prøveopsam-ler.

De opnåede resultater, som er sammenfattet i tabelIII, angiver den procentiske specifikke aktivitet i forholdtil en kontrolprøve.

Tabel III

4 - Retarderet hypersensibilitet (HSR) og hæmolyfciskeantistoffer mod røde blodlegemer fra får (GRM) hos mus_

Prøve ifølge Mackaness.

Den anvendte metode er inspireret af metoden beskrevetaf T.E. Miller et al., 3. Nat. Cancer Inst., 51, 1J.669(1973) .

OF^-Hunmus på 20-22 g (6-7 uger) fordeles tilfæl¬digt i de forskellige fmrsøgsbure (8-10 mus/dosis og 30 kon-troldyr).

På dagen immuniseres musene subcutant ved nakkensbasis med en suspension indeholdende 107 GRM (Institut Pa¬steur Production) i 0,1 ml isotonisk phosphat puf faer, hvor¬til der sættes 0,1 ml af fortyndinger af forbindélsen, derskal undersøges.

o På dagen Jg modtager musene 10 GRM i 0,05 ml i denvenstre pote og et lige så stort volumen fortyndingsmid¬del i den højre pote. Forskellen i tykkelse af poterne i1/100 mm måles med et semi-elektronisk apparat ( vanDijk et al., J. Immunol. Methods 12, 261 (1976)).

På dagen aflives musene ved dekapitation, ogseraene fra hver serie blandes i lige dele til dannelseaf en pool, og indholdet af antistof i hver pool bestem¬mes ved hæmolyse-metoden. 50^ul serum (i fortyndinger iforholdet 1:2) + 25^ul GRM-suspension med 0,5% Mayer——puf¬fer med 0,1% gelatine. Der tilsættes 25^ul komplement ioverskud (marsvine-serum, 1/20). Der inkuberes i 30 min.ved 37°C, og hæmolysen registreres efter en nat ved 4°Cved tælling af antallet af huller, som udviser denne reak¬tion, hvilket giver en titer udtrykt i hæmolyse-enheder(U.HE/ml) i forhold til en kontrol-hæmolysereaktion.

Resultaterne er sammenfattet i tabel IV.

Tabel IV

Tabel IV (fortsat)

5-Modstandsdygtighed hos mus mod infektion med Listeriamonocytogenes._

Ved dette forsøg, som er beskrevet af Mackaness, J. Exp. Med. 116, 381 (1962), er bakterien normalt enintracellulær parasit i makrofager. De sidstnævnte erimidlertid i stand til at nedbryde mikroorganismerne, nårde er "aktiveret" på passende måde.

CD^-Hunmus på 18-20 g (Charles River) podes intra¬venøst på dagen JQ med en normalt letal dosis bakterier(ca. 2 x 104 kim, ca. 4 .x DL5q) · Den anvendte stamme erstammen EGD (Mackaness).

Dødeligheden noteres hver dag indtil forsøgets af¬slutning (dagen J1Q) . Dette tidspunkt svarer til "lidt mereend 2 gange den gennemsnitlige overlevelsestid a'f kontrol¬dyrene.

Resultaterne viser: - antallet af overlevende mus på dagen i forhold tilantallet af mus i serien, - den procentiske forøgelse af den gennemsnitlige overlevel¬sestid af de behandlede mus i forhold til kontrolserien.

Resultaterne er sammenfattet i tabel V.

Tabel V

Tabel V (fortsat)

Modstandsdygtighed hos mus mod infektion med Klebsiellapneumoniae. .j_

Ved denne metode, der er beskrevet og anvendt afChedid et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 7£, 2089 (1977)til påvisning af aktivitet af MDP (muramyldipeptid), frem¬kalder bakterien en voldsom septikæmi efter i.v. eller i.p.injektion, men dødeligheden er mere udbredt tidsmæssigtved intramuskulær infektion.

Beskrivelse af metoden.

Stammen Klebsiella Pneumoniae, serotype 2(I.P. 7823) fremkalder efter intramuskulær indpodning i en 5 dosis på 10 kim i løbet af nogle dage dødelighed på 80--100% hos OFχ-mus (IFFA-CREDO) på 18-20 g.

Resultaterne angives og analyseres på samme mådesom resultaterne af infektion af mus med Listeria mono¬cytogenes .

De opnåede resultater er sammenfattet i tabel VI.

Tabel VI

Claims

PATENTKRAV. Analogifremgangsmåde til fremstilling af et tri-,tetra- eller pentapeptid med den almene formel

hvori RCO- betyder en fedtsyrerest, hvori R betyder en alkylgruppe med 1-25 carbonatomer, der eventuelt er sub- stitueret med en hydroxygruppe, R betyder ert hydroxygrup- 2 4 pe eller en aminogruppe, R og R , som kan være ens eller forskellige, betyder et hydrogenatom, en carboxygruppe, en carbamoylgruppe eller en N-carbonylglycyl- eller N- 2 4 -carbonyl-D-alanylgruppe, hvorved R og R ikke samtidigt 3 kan betyde et hydrogenatom, R betyder et hydrogenatom el- 3 ler en glycylrest, hvorved R betyder et hydrogenatom,når R og R er ens eller forskellige og hver især bety¬der en N-carbonylglycyl- eller N-carbonyl-D-alanylgruppe,og m og n, som kan være ens eller forskellige, hver isærbetyder 1 eller 2, hvorved alaninet, som er forbundet medglutaminsyren, foreligger i L-form, glutaminsyren fore¬ligger i D-form, lanthioninet, når m og n er lig med 1,cystathioninet, når m og n er forskellige, og homolanthio-ninet, når m og n er lig med 2, foreligger i D,D-form, L,L-form, DD,LL-form (racemisk form) eller D,L-form (meso- -form) eller i form af en L,meso-blanding eller D,meso- 2 4 -blanding, og thialysinet, når én af R og R betyderet hydrogenatom, og m og n er lig med 1, foreligger iL-form, D-form eller D,L-form, eller et farmaceutisk ac¬ceptabelt additionssalt med en syre, farmaceutisk accep¬tabelt metalsalt eller farmaceutisk acceptåbelt additions-salt' med’ en organisk base, kendetegnet ved, at (a) et dipeptid med den almene formel

hvori RCO- betyder en fedtsyrerest som ovenfor defineret, ide 5 en eventuel hydroxygruppe er beskyttet, og R betyder en amingruppe, en alkoxygruppe med 1-4 carbonatomer eller en benzyl-oxygruppe, omsættes med en forbindelse med den almene formel

21 4' hvori R og R , som kan være ens eller forskellige, bety¬der et hydrogenatom, en garboxygruppe, en carbampylgruppe,en C^_£-alkyloxycarbonylgruppe, en benzyloxycarbonylgrup-pe eller en N-carbonylglycyl- eller N-carbonyl-B-^alanyl- gruppe, som eventuelt er forestret med en alkylgruppe el- 2* 4* ler en benzylgruppe, hvorved R og R ikke samtidigt kanbetyde et hydrogenatom, m og n, som kan være ens eller g forskellige, hver især betyder 1 eller 2, og R betyder en beskyttelsesgruppe for aminogruppen eller en glycyl- rest, hvis aminogruppe er substitueret med en beskyttelses- gruppe, hvorved R betyder en N-beskyttelsesgruppe, når R og R er ens eller forskellige og betyder N-carbonyl-gly- cyl- eller -D-alanyl, '-hvorefter beskyttelsesgruppen R^ eller 6 den beskyttelsesgruppe,, som indgår i gruppen R , erstattes 5 med et hydrogenatom, gruppen R erstattes med en hydroxy- 5 gruppe, når R betyder en alkoxygruppe med 1-4 carbonatomereller en benzyloxygruppe, eventuelle alkyldxycarbonylgruppereller benzyloxycarbonylgrupper, som udgør elleriindgår i 2' 4* R og/eller R , erstattes med carboxygrupper, og en eventuelO-beskyttelsesgruppe, som indgår i R, fjernes eller (b) når R betyder en glycylgruppe, en aminosyremed den almene formel ri;l-nhch2co-oh (X) hvori R^ betyder en beskyttelsesgruppe for aminogruppen,omsættes med et tri- eller tetrapeptid med den almene formel

hvori RCO- betyder en fedtsyrerest som ovenfor defineret, idet i · en eventuel hydroxygruppe er beskyttet, R betyder en hydr¬oxygruppe, en aminogruppe, en C, ,-alkoxygruppe eller en ben-2' 4' zyloxygruppe, R og R , som kan være ens eller forskellige, betyder et hydrogenatom, en carboxygruppe, en carbamoylgrup- pe, en C^_^-alkyloxycarbonylgruppe, en benzyloxycarbonylgrup- pe eller en N-carbonylglycyl- eller N-carbonyl-D-alanylgrup- pe, som eventuelt er forestret med en alkylgruppe eller en 2' 4' benzylgruppe, hvorved R og R ikke samtidigt kan betydeet hydrogenatom, og m og n, som kan være ens eller forskelli¬ge, hver især betyder 1 eller 2, hvorefter gruppen R^^ er- 1» stattes med et hydrogenatom, gruppen R erstattes med en 1» hydroxygruppe, når R betyder en alkoxygruppe med 1-4 car- bonatomer eller en benzyloxygruppe, eventuelle alkyloxycarbo- nylgrupper eller benzyloxycarbonylgrupper, som udgør eller2' 4 · indgår i R og/eller R erstattes med carboxygrupper, ogen eventuel O-beskyttelsesgruppe, som.indgår i R, fjernes. hvorefter det fremkomne produkt isoleres, eventuelt i formaf et farmaceutisk acceptabelt additionssalt med en syre,farmaceutisk acceptabelt metalsalt eller farmaceutisk accep¬tabelt additionssalt med en organisk base.