LU83843A1 - Nouveaux tri-, tetra- et pentapeptides, leur preparation et les medicaments qui les contiennent - Google Patents

Description

> - f )

La présente invention concerne de nouveaux tri-, tétra-* ou pentapeptides de formule générale : ECO-NHCHCO-NHCHCO-E, I l 1 CH, CHoCH_C0-NHCH-Eo 3 2 2 1 2 ? ' (1) Ε,-ΝΞ CH-E.

... 3 4·- éventuellement leurs sels, leur préparation et les médicaments 5 qui les contiennent.

Sarfs la formule générale (l) ECO- représente un reste d'acide gras dans lequel E représente un radical alcoyle contenant 1 à 44. atomes de carbone (éventuellement substitué par uq radical hydroxy, phényle ou cyclohexyle), 10 alcényle contenant 2 à 29 atomes de carbone et pouvant contenir plus d'une double- liaison ou un reste d'acide mycolique tel que rencontré dans.la structure de la paroi bactérienne des mycobactéries, de Nocardia ou de corynébactéries, -* E^ représente un radical hydroxy, amino, alcoyloxy contenant 1 à 13 4 atomes de carbone ou benzyloxy, les symboles Eg et E^, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou un radical carboxy, carbamoyle, alcoyloxy-carbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone, benzyioxycarbonyle, N-carbonylglycyle ou N-carbonyl E alanyle 20 éventuellement estérifié par un radical alcoyle contenant 1 à 4 atomes de carbone ou benzyle, étant entendu que Eg et E^ ne peuvent pas représenter simultanément un atome d'hydrogène, ï Ε^ représente un atome d'hydrogène ou un reste glycyle ou D alanyle, étant entendu que, lorsque Eg et E^, identiques ou différents, 25 représentent chacun un radical N-carbonylglycyle (-CONHCHgCOOH) ou N-carbonyl E alanyle (-C0NHÇHC00H), E^ représente CH3 / un atome d'hydrogène, X représente un atome de soufré ou /y un radical méthylène, m et n, identiques ou différents, j ί représentent chacun un nombre entier égal à 1 ou 2, \Jf Γ t - t i 2 • étant entendu que,_ lorsque X représente un radical méthylène, m et n ne peuvent pas être simultanément égaux à 1, étant entendu que l’alanine liée à l'acide glutamique est sous forme L, l'acide glutamique est sous forme 1, la lanthlonlne, lorsque X représente un atome de soufre et m et n sont égaux à 1, la • 5· cystathionine, lorsque X représente un atome de soufre et m et n sont différents, l'homolanthionine, lorsque X représente un atome de soufre et m et n sont égaux à 2, l'acide diamino-2,7 suhér-ique, lorsque X représente un radical méthylène et l'un des symboles m ou n est'égal, à 1’ et l'autre est égal à 2, sont sous 10 forme D,D ; 1,1 $ 11,LL (racémique) ou 1,1 (méso) ou sous forme r des mélanges l,meso ou Efmeso, et la thialysine, lorsque l'un des symboles Rg ou ^ représente un atome d'hydrogène, X représente un atome de soufre et m et n sont égaux Λ 1, est sous forme 1 ou -1 ou 1,1, 15 Selon la présente Invention, les nouveaux peptides de formule générale (l) peuvent être obtenus selon les méthodes généralement utilisées en chimie peptidique, les différentes réactions sont mises en jeu après blocage, par des groupements protecteurs convenables, de b fonctions amines ou acides qui ne doivent pas 20 participer à la réaction et sont suivies éventuellement du déblocage de ces fonctions.

Selon la présente invention, les nouveaux produits de formule générale (l) peuvent être obtenus par action d'un dipep-tide de formule générale :

R CO - HH CH CO - NH CH CO - RK

* | · F 5 (tt^

25 CH5 CHgCHgCOOH

* dans laquelle R est défini comme précédemment et R^ représente un radical amino, alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone ou benzyloxy, sur un produit de formule générale ï h2r jh-r2 / - λΛ

ta (1II) W

Rg - HH CH-R^ / ' * 1 b 3 4 dans laquelle Rg, R^, X» m et n Bout définis comme précédemment et . Rg représente un groupement protecteur de la fonction amine ou un radical glycyle ou R alanyle dont la fonction amine est substituée par un groupement protecteur de la fonction amine, suivie 5 du remplacement du groupement protecteur représenté ou porté par Rg par un atome d'hydrogène et éventuellement du remplacement du radical R^, lorsqu'il représente un radical alcoyloxy contenant 1 à 4' atomes de carbone ou benzyloxy, par un radical hydroxy et des radicaux alcoyloxycarbonyles contenant 2 à 5 atomes de carbone 10 ou benzyloxyearbonyle, représentés ou portés par Rg et/ou R^»par „ des radicaux carboxy·

Lorsque les symboles Rg 6¾ R^ sont différents d'un radical carboxy ou ne contiennent pas un radical carboxy, la condensation du dipeptide de formule générale (il) est effectuée géné-15 râlement en présence d'jun agent de condensation tel que le dicyclo-hexylcarbodiimide en opérant dans un solvant organique tel que le chlôrure de méthylène ou le diméthylformamide, à une température comprise entre -10 et 30eC.

Généralement il est*nécessaire d'activer la fonction 20 acide libre du dipeptide de formule générale (il) préalablement à son action sur le produit de formule générale (ill). Le préférence, le dérivé activé du dipeptide de formule générale (il) est . xrn anhydride mixte, préparé in situ par action d'un halogénofor-miate d'alcoyle tel que le chloroformiate d'isobutyle. La conden-25 sation du dérivé activé s'effectue dans un solvant organique tel que le dioxanne, le tétrahydrofuranne, le chloroforme, le toluène ou le diméthylformami.de ou en milieu hydro-organique, en présence d'une base (minérale, telle que la soude, ou organique, telle que la triéthylamine), à une température comprise entre 30 -10 et +30°C.

Le remplacement du groupement protecteur de la fonction amine représenté ou porté par Rg par un atome d'hydrogène, du radical R,. par un radioal hydroxy et des radicaux représentés / ou portés par Rg et/ou R^ par des radicaux carboxy'peut être/ j /

. ' T

1 * 1 4 * « effectué selon les méthodes connues en fonction de la nature de ces groupements. Il est particulièrement avantageux de choisir * les radicaux R,,, R^, Rj et Rg de telle manière que leur rempla cement puisse s’effectuer en une seule étape* Far exemple, Rgpeut 5 représenter ou contenir un radical t.butyloxyoarbonyle, R1 peut . représenter un radical t.butyloxy et Rg et/ou R^ peuvent représenter ou oontenir un radical t.butyloxycarbonyle et, dans ces conditions, le remplacement de ces radicaux s’effectue par hydrolyse acide. L’hydrolyse peut être effectuée en opérant dans 10 l’acide acétique en présenoe d’acide chlorhydrique à une température voisine de 20°G.

,· Par exemple encore, le groupement protecteur d’une fonction acide pouvant être un radical benzyle et celui de la fonction amine un radical benzyloxycarbonyle,. 1 ’ élimination 15 simultanée de ces groupements protecteurs peut être effectuée au » moyen d’acide bromhydrique dans l’acide trifluoroacétique ou bien ** * en utilisant le sodium dans l’ammoniac liquide* Cependant, il peut être nécessaire d’éliminer un ou plusieurs de ces groupements protecteurs sans toucher aux autres* Dans ce cas les groupements 20 protecteurs seront choisis, par exemple, de telle manière que leur « remplacement s'effectue dans des conditions différentes d'hydrolyse. Ainsi le groupement protecteur d'une fonction acide pourra être un radical t.butyle éliminable par action de l'acide chlor-' hydrique dans l'acide acétique et le groupement protecteur de la 25 fonction amine un radical benzyloxycarbonyle éliminable par action de l'acide bromhydrique dans l'acide «trifluoroacétique. * Selon la présente invention, les nouveaux peptides de formule générale (i) peuvent être obtenus par aotion d'un dérivé de la L alanine de formule générale t 50 OHj / ' ( 5 * J t dans laquelle E est défini comme précédemment, sur un di-, tri-ou tétrapeptide de formule générale t h2nchco-e1 CHgCHgCO-NHCBÉrEg • Σ (T) (fVn • . vraω4 dans .laquelle E^, Eg, R^, Eg, X, m et n sont définis pomme pré-5 cédemment, suivie du replacement du groupement protecteur représenté ou porté par Rg par un atome d'hydrogène et éventuellement du remplacement du radical E^, lorsqu'il représente un radical alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone ou benzyloxy, par un radical hydroxy, et des radicaux alcoyloxycarbonyles contenant 10 2 à 5 atomes de carboné ou benzyloxycarbonyles représentés ou portés par Rg et/ou B^ par des radicaux carboxy, dans les conditions décrites ci-dessus pour l'action d'un produit de formule générale (il) sur un produit de formule générale (ill).

Selon la présente invention, les nouveaux peptides de 15 formule générale (i) peuvent également être obtenus par action d'un acide de formule générale ï RC0-0H (YI) dans laquelle R est défini comme précédemment sur un tri-, tétra- ou pentapeptide de formule générale't H2NjîHG0-NHÇHC0-R1 CHj CHgOHgCO-KHCE-Rg <p*>.

20 X (VII) 4¾ b6-bhoh-h.

dans laquelle E^, Rg, R^, Rg, X, m et n sont définis comme précédemment, suivie du remplacement du groupement protecteur représenté ou porté par Rg par un atome d'hydrogène et éventuellement / du remplacement du radical R^, lorsqu'il représente un radical/L· % * * ' t » 6 * / alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone on benzyloxy, par nn radical hydroxy et des radicaux alcoyloxycarbonyles contenant 2 à 5 atomes de carbone on benzyloxycaxbonyles représentés on portés par Rg et/on R^ par des radicaux carboxy, en opérant dans 5 les conditions données précédemment pour la condensation du dipep-tide de formule générale (il) sur le produit de formule générale (ill)· Il est également possible d'utiliser l'acide de formule -générale (Vï) sous forme d'halogénure d'acide, de préférence le chlorure, en effectuant la réaction dans un solvant organique tel 10 que l'éther diéthylique ou laß chlorure de méthylène, en présence d'une base (minérale,telle que la soude, ou organique, telle que la triéthylamine) à une température comprise entre 0 et 30°C.

Selon la présente invention, les nouveaux peptides de formule générale (i) dans laquelle les symboles Rg et/ou R^ repré-15 sentent un radical N-carbonylglycyle ou N-carbonyl 3) alanyle éventuellement estérifié par un radical alcoyle contenant 1 à 4 atomes de carbone ou benzyle peuvent également être obtenus par aetion d'un aminoacide libre ou estérifié de formule générale t H9NCEC0-Rft 2 L (TIII) ®7 . 20 dans laquelle Ry représente un atome d'hydrogène ou un radical méthyle, l'aminoacide étant dans ce cas sous forme 3), et Rq représente un radical hydroxy ou alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de oarbone ou benzyloxy, sur un peptide de formule générale s RCO-NHjîHCO -NHCHC0 -R^ CH, CH« CH. CO -HHCH-Rq • X (IX)

Rg-NH-CH-R^ 0 25 dans laquelle R, R^, Rg, X, m et n sont définis comme précédemment et,l'un des symboles R^ ou R^q représentant un radical carboxy, / l'autre représente un atome d'hydrogène ou un radical carboxy,/y : - - t • * «

/ I

/ S .

» 7 carbamoyle, alcoyloxycarbonyle contenant. 1 à 4 atomes de carbone, benzyloxyoarbonyle, N-oarbonylglycyle ou N-carbonyl D alanyle estérifié par un radical alcoyle contenant 1 à 4 atomes de carbone ou benzyle, étant entendu que lorsque B^ et représentent 5 chacun un radical carboxy, Bg représente un groupement protecteur de la fonction amine, suivie éventuellement du remplacement des radicaux et/ou Bq, lorsqu'ils représentent un radical alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone ou benzyloxy, par un radical hydroxy, et/ou des radicaux alcoyloxycarbonyle a contenant 2 à 5 10 atomes de carbone ou benzyloxyoarbonyle représentés ou portés par B^ ou E^q par un radical carboxy, et du remplacement du groupement protecteur représenté ou porté par Bg par un atome d'hydrogène, dans les conditions décrites précédemment pour l'action d'un produit de formule générale (il) sur un produit 15 de formule générale (ill).

Pour obtenir un produit de formule générale (i) dans lequel Bg et B^ sont identiques et représentent un radical N-carbonylglyçyle ou N-carbonyl D alanyle éventuellement estérifié, il est possible d'utiliser un produit de formule générale (IX) 20 dans laquelle B^ et B^q représentent chacun un radical carboxy· Pour obtenir un produit de formule générale (l) dans lequel les symboles Bg et B^ sont identiques ou différente et représentent un radical N-carbonylglycyle ou N-carbonyl D alanyle éventuellement estérifié, il est possible d'utiliser un produit 25 de formule générale (IX) dans laquelle l'un des symboles B^ ou

El0 représente un radical carboxy et l'autre représente un radical alcoyloxycarbonyle contenant 2 à 5 atomes de carbone ou benzyloxy-carbonyle. Dans ces conditions, on fait réagir le produit de formule générale (VIIl) sur le produit de formule générale (iX), 50 puis, après remplacement du radical alcoyloxycarbonyle ou benzyl-oxycarbonyle représenté par B^ ou B^q par un radical carboxy, on fait réagir à nouveau le produit de formule générale (VIII) identique au (ou différent du) produit de formule générale (VIII) / utilisé lors de la première condensation. /Y,

. T

8 ‘ .

! * . * · / —

Selon la présente invention, les nouveaux peptides de formule générale (l) dans laquelle E^ représente un radical glycyle ou S alanyle peuvent également être obtenus par action d'un aminoacide de formule générale :

Ε,.-EHCH COOH

5 " £, « dans laquelle R^ est défini oomme précédemment et représente un groupement protecteur de la fonction amine, sur un tri- ou • t éfcrapeptide de formule générale t EOO-NHCHCO-MÇHCO-E1 CHj CH2CH2C0-HïïÿE-E2 <?Vm X (XI) fan j H2N-CH>R4 10 dans laquelle R, E^, Eg, R^, X, m et n sont définis comme précé- ' demment, Rg et E^ ne pouvant pas être simultanément un radical K-carbonylglycyle ou N-carbonyl D alanyle éventuellement esté-rifié, suivie du remplacement de E^ par un atome d'hydrogène et éventuellement du remplacement de R^, lorsqu'il représente un 15 radical alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone ou benzyloxy, ; par un radical hydroxy et des radicaux alcoyloxycarbonyles conte nant 2 à 5 atomes de carbone ou benzyloxycarbonyles représentés j ou portés par Rg et/ou R^ par des radicaux carboxy, dans les I conditions décrites ci-dessus pour l'action d'un produit de 20 formule générale (il) sur un acide de formule générale (ill)·

Le dipeptide de formule générale (il) peut être obtenu par aotion d'un dérivé activé de la L alanine de formule générale i

tR12-NHJ5HOO-OH

CH, (XII) 5

| dans laquelle R^g représente un radical ECO- dans lequel E est J

I 25 défini comme précédemment, ou un groupement protecteur de la ! ; f « 9 * . ' . .

{ 's, fonotion amine, sus un dérivé de l'acide 3) glutamique de formule générale : H NCHCO-E,.

Ah2oh25oo-oh {Σ1ΙΙ) dans laquelle E^ est défini connne précédemment et la fonction 5 carboxy est éventuellement protégée, dans les conditions décrites ci-dessus pour l'action d'un produit de formule générale (il) sur tua Produit de formule générale (ill), suivie le cas échéant, après remplacement du radical R_jg, lorsqu'il représente un groupement protecteur de la fonction amine, par un atome d'hydrogène, de 10 l'action d'un acide de formule générale (VI) puis du remplacement du groupement carboxy protégé par un radical carboxy.

Les dérivés de la lanthionine, c'est-à-dire les produits de formule générale (ill) ‘dans laquelle X représente un atome de / 4 soufre et m et n sont égaux à 1 peuvent être préparés de la 15 manière suivante : a) Le dérivé de la lanthionine de formule générale (ill), dans laquelle Bg ^4 représentent un radical carboxy et Bg représente un radical benzyloxycarbonyle·, peut être préparé selon la méthode de t, PHOTAEE et coli., J. Chem. .Soc. Perkin I, 2599 (1979).

20 b) ». Le dérivé de la lanthionine de formule générale (ill) dans laquelle Bg représente un radical carboxy, représente un radical carbamoyle et· Bg représente un groupement protectèur de la fonction amine ou un radical glycyle ou D alanyle dont la fonction amine est substituée par un groupement protecteur de la 25 fonction amine, sous forme D,D ou L,L peut être préparé à partir de la lanthionine correspondante dont la préparation est décrite par j, GHEENSTEIH et M. WINITZ, "Chemistry of the Amino Acids", Jo^ïa Wiley and Sons, 1961» P· 2675· A cet effet, on prépare selon les méthodes connues l'ester dibenzylique de la dibenzyloxy-50 c^rbonyllanthionine qui est monosaponifié selon la méthode décrite par A. ARENDT et coll., Eoczniki Chemii Ann. Soc, Chim. Eolonorum, 48, 1305 (1974), [Chem. Abstr., 82, 31497 g (1975)] / puis transformé par action du méthanol ammoniacal en mono ami de Λ de formule générale ï /1/ r « » i > fi \ \ 10

Z-NHCHCOOH

K .

p (XIV) p2 Z-HHCHOQNHg (dans laquelle Z représente un radical benzyloxycarbonyle) qui, après hydrolyse acide ou hydrogénolyse, fournit le mono ami, de 'de la lanthionine.

. , * 5 Par action d'ün sel de cuivre, tel que le "bromure cuivri- .

que ou le carbonate basique de cuivre, sur le monoami de de la • lanthionine, il se forme un complexe qui peut être représenté par la formule : r

HgE pH CONHg k ΗΛ 01-00° (3W) OCO-CH Hl0 I 2 oe2 s

Fz

Hjtrco CK-m2 10 dans laquelle le reste amino en os du groupement- carbamoyle peut être acylé au moyen d'un aminoacide de formule générale (X) ou protégé par action d'un halogénoformiate d'alcoyle ou de benzyle. Le complexe ainsi formé est déplacé par action de l'hydrogène sulfuré pour donner l'amino acide ou le dipeptide 15 de formule générale (ill) dans laquelle Bg représente un radical carboxy, représente un radical carbamoyle et Eg est défini comme ci-dessus.

c)- Le dérivé de la lanthionine de formule générale (ili) - dans laquelle Eg représente un radical carboxy, E^ représente--un / on radical carbamoyle, E£ représente un groupement protecteur de la-/ I --—1--------/

i"' I

' , · i * ^HR| fonction carbamoyle étant sous forme D, peut être préparé à partir de la mésolanthionine selon la méthode décrite dans le brevet belge 621 385-pour préparer l'acide diaminopimélamique.

d)- Le dérivé de la lanthionine de formule générale (ill) dans 5 laquelle Rg représente un radical carbamoyle, représente un w radical carboxy et Rgreprésente un groupement protecteur de la fr · fonction amine ou un reste glycyle ou 3) alanyle dont la fonction amine est protégée par un groupement protecteur de la fonction amine peut être obtenu en protégeait la fonction amine en a du => *10 groupement oarbamoyle du produit dé formule générale (XV) par « action d'un halogénoformiate d'alooyle ou de benzyle. Le complexe ’ ainsi formé est déplacé par action de l'hydrogène sulfuré pour donner le dérivé de la lanthionine de formule générale (ïll) dans laquelle E^ représente un radical carbamoyle) Rg représente un 15 radical carboxy etRg représente un groupement protecteur de la fonction amine. Le radical amino en oc du groupement carboxy peut être protégé par un groupement protecteur ou acylé par action d'un dérivé activé d'un aminoacide de formule générale (x). Après remplacement du radical Rg par un atome d'hydrogène, par des 20 méthodes qui ne touchent pas au reste de la molécule, on obtient le dérivé de la lanthionine de formule générale (ill) dans laquelle E^ représente un radical carboxy, Rg représente un radical carbamoyle et ^représente un groupement protecteur de la fonction amine ou un reste glycyle ou D alanyle dont la fonction amine est subs-25 tituée par un groupement protecteur de la fonction amine.

e)- Le dérivé de la lanthionine de formule générale (ill) dans * laquelle E^ représente un radical carbamoyle, Rg représente un radical alcoyloxycarbonyle contenant 2 à 5 atomes de carbone, benzyloxycarbonyle ou N-carbo rylglycyle ou N-carbonyl E alanyle 30 éventuellement estérifiés par un radical alcoyle contenant 1 à 4 atomes de carbone ou benzyle et Rg représente un groupement protecteur de la fonotion amine ou un radical glycyle ou L alanyle dont la fonction amine est substituée par un groupement protecteur de la / fonotion amine, peut être obtenu, A/ t * 12 par action d'un aminoacide de formule générale (ΥΙΙΐ), ou d'un alcool aliphatique contenant 1 à 4 atomes de carbone ou de l'alcool benzylique, sur un aminoacide ou un dipeptide de formule générale i

Y-HHÿHCOOH

F2 S (XVI) |H2 s6-nhghcom2 5 dans laquelle Rg est défini comme ^ci-dessus et Y représente un groupement protecteur de la fonction amine, en opérant dans les conditions habituelles, suivie du remplacement du groupement protecteur Y par un atome d'hydrogène et éventuellement du groupement ester (porté par le reste glyoyle ou D alanyle) par un * 10 radical hydroxy, sans toucher au reete de la molécule. En particulier, il importe de 'choisir Y de telle manière que son remplacement par un atome d'hydrogène s'effectue sans toucher au groupement protecteur représenté ou porté par Rg.

f)- Le dérivé de la lanthionine de formule générale (ill), dans 15 laquelle R^ représente un radical carbamoyle, Rg représente un radical alcoyloxycarbonyle contenant 1 à 4 atomes de carbone ou benzyloxycarbonyle ou un reste N-carbonylglycyle ou N-carbonyl R alanyle éventuellement estérifié et Rg représente un radical glycyle ou R alanyle dont la fonction amine est substituée par 20 un groupement protecteur de la fonction amine, peut être obtenu par action d'un aminoacide de formule générale (x) sur un produit de formule générale » Y-KHCH-R_ .

r 2 ·· p (xm) |CH2

HgN CH CONHg dans laquelle Rg est défini comme ci-dessus et Y représente un 25 groupement protecteur de la fonction amine,, en opérant dans les / conditions habituelles, suivie du remplacement de Y par un atome' V, d'hydrogène sans toucher au reste de la molécule· j jr * « 13 « g)- le dérivé de la lanthionine de formule générale (ill) dans laquelle Rg représente un radical carbamoyle, R^ représente un radical alcoyloxycarbonyle contenant 2 à 5 atomes de carbone, benzyloxycarbonyleaiN-earbonylglycyle ou N-carbonyl D alanyle 5 éventuellement estérifiés par un radical alcoyle contenant 1à 4 atomes de oarbone ou benzyleet Rg représente un groupement protecteur de la fonction amine ou un reste glycyle ou 1) alanyle dont la fonction amine est substituée par un groupement proteoteur de la fonction amine peut être obtenu par action, -i-- 10 —:— d'un aminoacide' de formule générale (VIII) ou d'un alcool aliphatique contenant'1 à 4 atomes de carbone ou de l'alcool benzyliqûe sur un aminoacide ou un dipeptide de formule générale s Y - NHOHOONHg CHg s4 (mu) ch2 r6-hich-cooh dans laquelle Rg est défini comme ci-dessus et Y représente un grou-15 pement protecteur de la fonction amine, en opérant dans les conditions habituelles, suivie du remplacement du groupement protecteur Y par un atome d'hydrogène et éventuellement du groupement ester porté par le reste glycyle ou D alanyle par un radical hydroxy, sans touoher au reste de la molécule. En particulier, il importe de 20 choisir Y de telle manière que son remplacement par un atome d'hydrogène s'effectue sans toucher au groupement protecteur repré-senté ou porté par Rg.

Lorsque l'on fait réagir l'aminoacide de formule générale (VIIl) sur l'aminoaoice de formule générale (XVl) ou (XYIIl), 25 on opère dans les conditions qui permettent la création d'une liaison peptidique sans toucher au reste de la molécule. Lorsque l'on fait réagir un alcool (aliphatique ou benzyliqûe), on opère dans des conditions douces d'estérification afin de ne pas toucher aux /* groupements protecteurs Y et Rg et plus particulièrement selon la/?/ 30 méthode de V. BOCCHI, Syntteeis, p. 961 (1979). /f

T

·. H

. h)- Le dérivé de la lanthionine de formule générale (ill} danB < laquelle Rg représente un radical carbamoyle, R^ représente un radical alcoyloxycarbonyle ou benzyloxycarbonyle ou un reste N-carbonylglycyle ou N-carbonyl D alanyle éventuellement estérifiéet 5 Rg représente un reste glycyle ou ]) alanyle dont la fonction amine est substituée par un groupement protecteur de la fonction amine , peut être obtenu _:_:_ - ' ' · par action d’un aminoacidé de formule générale (x) sur un aminoaoide ou un dipeptide * de formule générale : Y - NHCHCONH- I 2 F2 · 10 S . (XIX)

K

H.NOES.

2 4 dans laquelle R^ est défini comme ci-dessus et Y représente un groupement protecteur de la fonction amine en opérant dans les conditions habituelles, suivie du remplacement du groupement Y par un atome d’hydrogène sans toucher à 15 Lei produits de formule générale (XVll) et (XIX) peuvent être obtenus selon lee méthodes habituelles utilisées en chimie * peptidique pour l’introduction d’un groupement protecteur de la fonction mine à partir d’un dérivé de la lanthionine,de’ formule-générale (ill) dans laquelle l’un des radicaux Rg et R^ représente 20 un radical carbamoyle, et l’autre représente un radical alcoyloxy-carboryle contenant 2 à 5 atomes de carbone ou benzyloxycarbonyle, ou un reste N-carbonylglycyle ou N-carbonyl 1) alanyle éventuellement estérifié et Rg représente un groupement protecteur de la fonction . amine, suivies du remplacement du groupement protecteur Rg par un 25 atome d’hydrogène sans toucher au reste de la molécule. En particulier les groupements protecteurs des fonctions amines du monoamide ’ de la lanthionine sont différents et choisis de telle maniéré / ' * * ' "—"Ί 15 i) - Le dérivé de la lanthionine de formule générale (ill) dans laquelle Rg et R^ représentent chacun un radical carbamoyle et Rg représente un groupement protecteur de la fonction amine peuvent être obtenus par action de l'ammoniac sur l'anhydride 5 mixte, préparé in situ ' par action d'un halogénoformiate d'alcoyle sur un dérivé de la lanthionine de formule générale : Y-NHCHCOOH.

I · CH2 , * p * |CH2

Rg-NHCHCOOH

dans laquelle Y représente un groupement protecteur différent de .* % Rg, suivie de l'élimination du groupement proteoteur Y sans toucher

10 au reste de la moléculeH

j) - Le dérivé de la lanthionine de formule générale (ill) dans laquelle Rg et R^ représentent chacun un radical carbamoyle.et Rg représente un radical glycyle ou D alanyle dont la fonction amine est substituée par un groupement protecteur peut être obtenu 15 par action d'un aminoacide de formule générale (X) sur le dérivé de la lanthionine de formule générale s Y-NHCHCONEL 1 2

Fs fe (XXI)

K

HgNCHCOHHg - dans laquelle Y représente un groupement protecteur de la fonction amine, suivie de l'élimination du groupement Y sans toucher au 20 groupement protecteur porté par Rg.

k) ~ Le dérivé de la lanthionine de formule générale (ill) ,dans > laquelle Rg et R^ représentent chacun un radical alcoyloxy- carbonyle contenant 2 à 5 atomes de carbone ou benzyloxycarbonyle. et Rg représente un groupement.protecteur de la fonction amine, / 25 peut être obtenu par estérification d'un dérivé de la lanthionine^//' de formule générale : (yg

T

16 · / /

Y-NHCHCOOH

. K

S (3QOX) Γ2

Rg-NHCHCOOH

dans laquelle Y représente un groupement protecteur différent de Rg défini comme ci-dessus» suivie de l’élimination de Y sans toucher au reete de la molécule.

5 l)- Le dérivé de la lanbhionine de formule générale (ill), dans * M t ' laquelle Rg et R^ représentent chacun un radical alcoyloxycarbonyle contenant 2 à 5 atomes de carbone ou benzyloxycarbonyle et Rg représente un radical glycyle ou R alanyle dont la fonction amine est substituée par un groupement protecteur de la fonction amine» 10v peut être obtenu par action d’un aminoacide de formulegénérale (x) sur un dérivé de la lanthionine de formule générale t

Y-NHCHCOOR,-1 O

S (XXIII)

K

HgN CH-COOR15 dans laquelle R^ représente un radical alcoyle contenant 1 à 4 | atomes de carbone ou benzyle et Yreprésente un groupement proteo- j 15 teur de la fonction amine» suivie de l'élimination de Y sans j toucher au reste de la molécule»

Les dérivés de la L lanthionine utilisables pour la préparation des produits selon la présente invention peuvent également être préparés à partir du diester éthylique de la àibenzyl— 20 oxycarbonyl-L lanthionine dont la préparation est décrite par | D. HARPP et coll.» J. Org. Chem», ^6, 73 (1971)· .

Les dérivés de la lanthionine de formule générale (iïl)» i dans laquelle l'un des symboles Rg ou R^ représente un radical , carboxy^aïc£yîàxycarbonyle con enant 2 à 5 atomes de carbone ou 25 benzyloxycarbonyle » N-carbonylglycyle ou H-carbonyl R alanyle / éventuellement estérifié et l'autre représente un radical carboxjvy l! / 17

I I

« % >,À Λ

K

» alcoyloxycarbonyle contenant 2 à 5 atomes de carbone ou benzyloxy-carbonyle et Eg représente un groupement protecteur de la fonction amine ou un reste glycyle ou D alanyle dont la fonction amine est substituée par un groupement protecteur, peuvent être obtenus par - 5 action d'un dérivé de la cystéine de formule générale s x-mpoo-ï (xxit) oh2sh dans laquelle X représente un atome d'hydrogène ou un groupement protecteur de la fonction amine ou un reste glycyle ou 3) alanyle dont la fonction amine est substituée par un groupement protecteur 10 et Y représente un radical hydroxy, amino, alooyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone, benzyloxy, N-glycyle eu N-3) alanyle .éventuellement estérifié, sur un produit de formule générale : X'-HH0HC0-Y' (m) '15 dans laquelle X' représente tua atome d'hydrogène ou un groupement protecteur de la fonction amine, Y' a la même définition que le symbole Y ci-dessus, et peut être différent de Y, et représente un atome d'halogène, autre que le fluor, ou un reste d'ester réactif tel qu'un radical toluène suif onyle ou méthane suifonyle, 20 ou sur un produit de formule générale t x'-mc oo-ï· (ml) Gïïg dans laquelle X' et Y' ont les définitions données ci-dessus, suivie de l'élimination éventuelle de l'un des groupements protec-. teure X ou X' de la fonction amine du dérivé de la lanthionine ainsi 25 obtenu ; .

Généralement la condensation du produit de formule générale (XXIV) sur un produit de formule générale (XXV) ou (XXTl) s'effeotue dans un milieu hydro-organique, telqu'un mélange eau-tétrahydrofuranne^en présence d'une base (minérale, telle que 30 la soude ou la potasse, ou organique, telle qu'un hydroxyde d'ammo- / nium quaternaire) à une température voisine de 0°C. La condensation/^ peut aussi être effectuée^ dans l'ammoniac liquide. /Z' » · 18

La condensation du dérivé de la cystéine de formule générale (XXIV) sur le produit de formule générale (XXV) peut s'accompagner d'une racémisation au niveau de l'atome de carbone asymétrique du produit de formule générale (XXV).

5 Plus particulièrement, la racémisation ne se produit pas lorsque, dans les formules générales (XXXV) et (XXV), représente un atome d'halogène, T' représente un radical hydroxy, T représente un radical hydroxy ou amino, X représente un atome d'hydrogène ou* un radical benzylo'xycarbonyle, t .butyloxycarbonyle , · 10 -t.butyloxycarbonyl -glycyle ou t.butyloxycarbonyl· D alanyle- et · X' représente un atome d'hydrogène ou un radical benzyloxycarbonyle« Pour éviter ou limiter la racémisation, il est avantageux d'opérer dans l'ammoniac liquide·

Les dérivés de la thialysine, c'est-à-dire les produits 15 de formule générale (lll) dans laquelle l'un des symboles Eg ou représente un atome dVhydrogène, X représente un atome de soufre et m et n sont égaux à 1 peuvent être obtenus à partir de la thialysine, dont la préparation est décrite par P. Ξ0ΡΕ et coli·, J. Chem· Soc.

(C), 1098 (1966), selon les méthodes données ci-dessus pour la 20 préparation des dérivés de la lanthionine.

Les dérivés de la cystathionine, c'est-à-dire les produits de formule générale (lll) dans laquelle X représente un atome de soufre, m est égal à 1 et n est égal à 2, les symboles Eg et E^ * étant différents d'un atome d'hydrogène^ peuvent être obtenus à 25 partir des dérivés de la cystathionine dont la préparation est décrite en particulier par K· JOST et coll·, Coll. Czech. Chem.

, Comm., 32, 2485 (1-987) et par Z· PROCEAZKA et coll., Coll· Czech.

Chem. Comm., 45, 1982 (1980), selon les méthodes données ci-dessus pour la préparation des dérivés de la lanthionine. — 30 Les dérivés de l'acide diamino-2,7 subérique, c'est-à-dire les produits de formule générale (lll) dans laquelle X représente un radical méthylène et l'un des symboles m et n est égal à 1 et l'autre est égal à 2, les symboles Eg et R^ étant différents d'un/ atome d'hydrogène, peuvent être obtenus à partir des dérivés de~/ u « ^ / * · .

19 l'acide diamino-2,7 subéïique, dont la préparation est décrite dans J. Org. Chem., 45. 3078 (198Ο), selon les méthodes données ci-dessuB pour la préparation des dérivés de la lanthionine.

L'aminoacide de formule générale (IV) peut être obtenu 5 par action d'un acide de formule générale (VX) ou d'un dérivé activé de cet acide sur la L alanine dont la fonction acide est éventuellement protégée eous forme d'ester, suivie éventuellement du remplacement de la fonction ester par la fonction carboxy, en opérant dans les conditions indiquées ci-dessus pour 1 faction de ''tO. l'acide de formule générale (Vl) sur le peptide de formule générale (YII).

Le peptide de formule générale (V) peut être obtenu par action, dans les conditions habituelles, d'un dérivé de l'acide D glutamique de formule générale (XIII) dont la fonction amine est 15 protégée, et dans laquelle R^ représente un radical amino ou alcoyloxy contenant 1 à <i atomes de carbone ou benzyloxy, sur un produit de formule générale (ill) dans laquelle Rg, ^4» %f m et n sont définis comme précédemment, suivie du remplacement éventuel du radical R,-,' lorsqu'il représente un radical alcoyloxy 5 20 contenant 1 à 4 atomes do carbone ou benzyloxy, par un radical hydroxy et des radicaux «lcoyloxycarbonyles contenant 2 à 5 atomes de carbone ou benzyloxyoirbonyles représentés ou portés par R2 et/ ou R^ par des radicaux ©*rboxy sans toucher au reste de la molécule. Toutefois lorsque forme avec le groupement carbonyle 25 auquel il est lié une fonction ester, et Rg et/ou R^ représentent ’ ou contiennent une fonction ester, il peut être nécessaire que les fonctions esters représentées ou portées par E^ * Rg et/ou R. soient différentes et choisies de telle manière que le rempla-4 cernent de l'un des radicaux Rg ou R^ par un radical carboxy 30 s'effectue sans toucher^ radical R^ et à l'autre radical Rg . ou R^.

Le peptide de formule générale (Vil) peut être obtenu par action, dans les coràitions habituelles, d'un dérivé aotivé , de la L. alanine de formule générale : " /J

35 Eu-«pH-C00H $XX7II) //

OHj U

20 « · » » ί dans laquelle R^ représente un groupement protecteur de la fonction. amine sur un peptide de formule générale (V) dans laquelle R^, Rg, R^, Rg, Xt. m et n sont définis comme précédemment} suivie du remplacement du radical R^ par un atome d'hydrogène 5 et du remplacement éventuel du radical R^, lorsqu'il représente un radical alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone ou benzyl-oxy, par un radical hydroxy et des radicaux alcoyloxycarbonyles contenant 2 à 5 atomes de carbone ou benzyloxycarbonyle par des radicaux carboxy sans toucher au reste de' la molécule· 10 Lorsque .R^, Rg et R^ forment ou contiennent une fonction estert il est possible que ces fonctions soient différentes et • choisies de telle manière que le remplacement d'un des radicaux

Rg ou R^ par un radical carboxy s'effectue sans touoher au radical Rj et à l'autre radical Rg ou R^.

15 Le peptide de formule générale (iX^ dans laquelle Rt R^,

Rgi R^} R10, X} m et n sont définis comme précédemment} peut être obtenu par action# dans les conditions habituelles} d'un dipeptide de formule générale (il) dans laquelle R et R^ sont définis comme précédemment, sur un produit de formule générale (ill) dans 20 laquelle Rg est défini comme précédemment et Rg et R^ ont les définitions données pour R^ et R^q, suivie du remplacement, le cas échéant, des radicaux Rg et/ou R^, lorsqu'ils représentent un radical alcoyloxycarbonyle contenant 2· à 5 atomes de carbone ou benzyloxycarbonyle, par un radical carboxy sans toucher au reste de 25 la molécule.

En particulier,· lorsque R^ forme avec' le groupement carbonyle auquel il est lié taxe fonction ester et Rg et/ou R^ représentent une fonction ester, il peut être nécessaire que les radicaux R^, Rg et R^ soient différente et choisis de telle manière 3Q que le remplacement des radicaux Rg et/ou R^ par un radical carboxy s'effectue sans touoher au radical R^ et éventuellement à l'un des radicaux R0 ou R.,

Le peptide de formule générale (Xi), dans laquelle R^ représente un radical hydroxy, amino ou alcoyloxy contenant 1 à 4 / 35 atomes de carbone ou benzyloxyet.les symboles Rg et R^ sont définisy vf.

• * * .

21

H

comme précédemment, peut être obtenu par action, dans les conditions habituelles, d'un dipeptide de formule générale (il) dans laquelle H et R;, sont définis comme oi-dessus sur un aminoacide de formule générale (ill) dans laquelle Rg et R^ sont définis comme préeé-5 demment et Rg représente un groupement protecteur de la fonction amine, suivie du remplacement de ce groupement protecteur par un atome d'hydrogène sans touoher au reste de la molécule.

Selon l'invention les produits de formule générale (i) * peuvent également être obtenue par action d'un produit de formule 10 générale : k “ R.c“NH0H00-Rc 15 5 _ CHgCHgCO-NHCHCO-Y (XXVIIl) '°VZ2 dans laquelle R^ est défini comme précédemment, R^ représente un groupement protecteur de la fonction amine ou un reste L alanyle dont la fonction amine est substituée par un groupement protecteur 15 de la fonction amine ou par un reste d'acide gras, T est défini comme précédemment et Zg représente un groupement -SH ou un atome d'halogène, autre que fluor, ou un reste d'ester réactif tel qu'un radical toluène suif onyle ou méthanesulfonyle, sur un produit de formule générale : X,-NHCHCO-Y.

.20 dans laquelle représente un atome d'hydrogène ou un groupement protecteur de la fonction «mine ou un reste glycyle ou D alanyle dont la fonction amine est éventuellement substituée par un groupement protecteur de la fonction amine, représente un radical 25 hydroxy, alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone, benzyloxy, N-gl.ycyle ou N-D alanyle—--- éventuellement estérifiés et Z'g a la même définition que Zg, étant entendu que l'un des symboles Zg ou Z'g représente un radical -SH et que, lorsque Z'g représente un radical toluène suif onyle ou méthanesulfonyle, X^ est 50 différent d'un reste glycyle ou R alanyle, dans les conditions décrites précédemment pour l'action d'un produit de formule géné- /

V

22 I β · · I lorsque R^ représente un groupement protecteur de la I fonction amine» du remplacement de ce groupement protecteur par un I atome d'hydrogène sans toucher au reste de la molécule» et de l'ao- I tion d'un dérivé de la I alanine dont la fonction amine est substi- ! 5 tuée par un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la I * fonction amine et, dans ce dernier cas, de l'action de l'acide I de formule générale (Yl) après élimination de ce groupement pro- I tecteur, ! et lorsque R^ représente un reste L· alanyle dont la I 10 fonction amine est substituée par un groupement protecteur de la I · I fonction amine, de l'action d'un acide de formule générale. (VI) l· après élimination de ce groupement protecteur, |i . puis· élimination, le cas échéant, des groupements I. protecteurs représentés ou portée par R^, Y, et Y^ sans toucher 15 au reste de la molécule.

l· La présente invention concerne également un prooédé I de préparation des produits de formule générale (i) par synthèse I, peptidique de Merrifield en phase solide.

I .Le procédé consiste essentiellement à fixer sur un ! 20 support approprié un aminoacide ou un peptide de formule générale : I! r17-nhgh-r0 1 Ψλ I x (xxx) ί :. . hv6-shbh-b4 I; dans laquelle X, m et n sont définis comme précédemment, l'un des |: symboles Rg ou R^ représente un radical carboxy ou N-carbonyl- Γ glycyle ou N-carbonyl R alanyle et l'autre représente un atome |i 25' d'hydrogène ou un radioal carbamoyle, alcoyloxycarbonyle contenant I 2 à 5 atomes de carbone, benzyloxycarbonyle, N-carbonylglycyle ou r N-carbonyl R alanyle estérifié par un radical alcoyle contenant || 1 à 4 atomes de carbone ou benzyle, R^g représente un groupement | protecteur de la fonction amine ou un radical glycyle ou R alanyle |; 30 dont la fonctipn amine est substituée par un groupement protecteur ✓ | de la fonction amine et R^y représente un groupement protecteur de. / |j la fonction amine, étant entendu que les groupements protecteurs/// • r 23

iJ

\ de la fonction amine représentés ou portés par et R.jg sont cLifférentsf puis après déblocage de laH fonction amine protégée par Ε^γ, à condenser : - soit 1 'acide 3) glutamique dont les fonctions amine et a-carboxy 5 sont convenablement protégées, c'est—à—dire le produit de formule * ______ générale jt _ __ _ ______________________ S.o-HHCHCO-E* 18 · L nrr L (XXXI) dans laquelle E^ g représente un groupement protecteur de- la j fonction amine différent de E^ g et E^ représente un radical amino 10 . ou un radical alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone ou benzyloxy, puis, après déblocage de la fonotion amine protégée par le radical E^g sans toucher à R^g, - soit un dérivé de la L alanine de formule générale (XXYIl),. puis, après déblocage de la fonotion amine protégée 15 par R^, étant entendu que R^ est différent de R^g, l'acide de formule générale (Yl), - soit un dérivé de la ΙΓ alanine de', formule générale (iV)' - soit le dipeptide de formule générale : R1 q-HHÇHCO-HHCHCO-Rc CHj lîHgCHgCO-OH (mu) 20 dans laquelle E^ est défini comme précédemment et R^ représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine, étant entendu que, lorsque E^ représente un groupement protecteur de la fonction amine, celui-ci est différent du groupement protecteur R^g du produit de formule générale (XXX), et 25 ensuite £ faire éventuellement réagir l'acide de formule générale (VI), après déblocage de la fonction amine protégée par le radical E^, puis à séparer le produit obtenu de son support et à éliminer si nécessaire les groupements protecteurs des fonctions amines et carboxy.

30 Selon une variante du procédé, il est possible de fixer / sur un support approprié le peptide de formule générale t / / ' * · . ~ i 24 B20-MCHC0-R5 .

CHgCHgCO-NHp-Eg : . (SOIIX) I ï i ' <F*>n .

Ä16-KH-0H-H.

• dans laquelle E^, E^g, X, m et n sont définis comme précédemment» .

1 »un des symboles R« ou R. représente un radical carboxy, H-carbonyl- · i ^ · · j glycyle ou N-carbonyl 3) alanyle et l'autre représente un atome · ! 5 d'hydrogène ou un radical carbamoyle» alcoyloxycarbonyle contenant 2 à 5 atomes de carbone» benzyloxycarbonyle, N-carbonylglyeyle ou N-carbonyl D alanyle estérifié par un radical alcoyle contenant : 1 à 4 atomes de carbone ou benzyle et R2qreprésente un groupement protecteur de la fonction amine» étant entendu que les groupements 10 protecteurs de la fondtion amine représentés ou portés par Rjg et i E2q sont différents» puis» après déblocage de la fonotion amine ! protégée par R2q» de condenser : : - soit un dérivé de la L alanine de formule générale (XXVil), puis ! après déblocage de la fonotion amine protégée par Ε1Λ» l'acide gras l I 15 de formule générale (Vl), ; - soit un dérivé de la L alanine de formule générale (ΠΓ), puis à ! séparer le produit obtenu de son support et à éliminer» si néces- ' saire» les groupements protecteurs des fonotlons amine et carboxy.

'Selon une autre variante du procédé» il est possible de j 20 fixer sur un support approprié le peptide de formule générale s r21 -hhchco-hhohco-r5 j . CHj ijHgCHgCO-NHjîH-Eg ' (nm) I hi6-rh-ch-r4 dans laquelle R^» R^» X» m et n sont définie comme précédemment» j l'un des symboles R2 ou R^ représente un radical carboxy» N-carbo- 1 nylglycyle ou N-earbonyl 3) alanyle et l'autre représente un atome / j | 25 d'hydrogène ou un radical carbamoyle» alcoyloxycarbonyle contenajK/v 1 '' 7/1 * 25 2' ^ *5. gtornes de carbone« benzyloxycarbonyle « E-carbonylglycyle ou h-c***011?1 ® alanyle estérifié par un radical alcoyle contenant J 1 à 4 #1>omes de oarbone ou benzyle, et Rg.j représente un groupe ment protecteur de la fonction amine différent du groupement 5 protec^OM1 de la fonction amine représenté ou porté par R^g, puiSj a£?è8 déblocage de la fonction amine protégée par Rg^, de condensé* l'acide de formule générale (Vl), puis de séparer le produit Obtenu de son support êt d'éliminer, si nécessaire, les groupements protecteurs des fonctions amine, .et carbozy.

jO La synthèse peptidique de Merrifield peut aussi être mise en P©UVTe on fixant sur un support approprié un produit de • formule générale (XXXl) ou (XXXII) dans lesquelles E^ représente un'Sradi*®1 kydroxy » les symboles B^g et R^ sont respectivement définie oomme précédemment et le radical γ-carboxy est protégé, 15 puis, déblocage de ce groupement protecteur puis activation de la inaction acide, en faisant réagir le produit de formule général^ (XXX) dont les fonctions amines et carboxy sont conve-nablemé*^ protégées, puis, le cas échéant selon les significations de E^g R^, un acide de formule générale (Vl) ou le dérivé de gO la Lal^eie formule générale (XXVIl) et,selon la signification de R ,éventuellement l'acide de formule générale (Vl).

Lorsque dans la formule générale (i), l'un des symboles Rg ou représente un radical N-carbonylglycyle ou N-carbonyl 3) alan?·*·® l’autre représente un atome d'hydrogène ou un radi-S5 cal ca:',ox3r> carbamoyle, alcoyloxycarbonyle contenant 2 à 5 atomes de carbone, benzyloxycarbonyle, N-carbonylglycyle ou N-carbWl D alanyle éventuellement estérifié par un radical alcoyl* contenant 1 à 4 atomes de carbone ou benzyle, il est posait·'® de fixer sur un support convenable la glycine ou la jO 3) aian.ne dont la fonction amine est protégée, puis, après / débloc^S® de la fonction amine, de condenser un aminoaoide ou un / peptid* de formule générale : /7 j i " 26

J

** . ' .

\ E -HHGH-E« 4* .· (^)» E^ g"SH CH-R^ dans laquelle R^g, X» m et n sont définis comme précédemment, j l'un des symboles Rg ou R^ représente un radical carboxy et l’autre | représente un atome d’hydrogène ou un radical carbamoyle, alcoyl- » · ; ; 5 oxycarbonyle contenant 2 à 5 atomes de carbone, benzyloxycarbonyle, ; j ! N-carbonylglycyle ou H-carbonyl R alanyle estérifié par un 1 radical alcoyle contenant 1 à 4 atomes de. carbone ou benzyle, et ... Egg représente un groupement protecteur de la fonction amine ; différent de E^g ou un reste d’un R aminoacide de formule générale t !. ; ! Ε„-ΝΞ0Η00-Ες • j 10 CHpCHpCO-OH (™) • ;| il ‘ ; dans laquelle R^ est défini comme précédemment et Rg^ représente j | ! un groupement protecteur de la fonction amine différent de E^· ou i i : un reste d’un L aminoacide de formule générale : Î : Γ i ’ i ! B«.-HHCH-COOH ! ; ,1 L (mra) i 1 ’! • 1-5r dans laquelle Rg^ représente un groupement protecteur de la fonc-! tion amine ou un reste d’acide gras défini précédemment, étant . j entendu que les groupements protecteurs représentés par Egg, Eg^ ] et Rg^ sont différents de R^g et peuvent être éliminés sans toucher | : à ce dernier, puis ‘ , | 20 - lorsque Egg représente un groupement protecteur de la fonction j amine, d’éliminer ce groupement protecteur, puis de condenser : » j .

'· i i - soit un dérivé de l’acide R glutamique de formule générale j ; (XXXVl) dans laquelle Rgj représente un groupement protecteur de il] la fonction amine, puis, après élimination de Rg^, de condenser un • 25 dérivé de la l· alanine de formule générale (XXXVIl) dans laquelle

Eg^ est défini comme précédemment et, lorsque Eg^ représente un / groupement protecteur de la fonction amine, d'éliminer le radical^/ Eg^, puis de condenser l’acide de formule générale (Yl), j U

¥ 27 - soit lin dérivé de l’acide D glutamique de formule générale (XXXVI) dans laquelle Eg^ représente un reste d’un I aminoacide de formule générale (XXXVIl) dans laquelle E^ est défini comme précédemment, et, lorsque Bg^ représente un groupement protecteur de la 5 fonction amine, d * éliminer le radical Rg^ puis de condenser l’acide i gras de formule générale (Yl), - lorsque Rgg représente un reste d’un aminoacide de formule générale (XXXVT) dans laquelle Rg^ représente un groupement protecteur de la fonction amine, d’éliminer ce groupement protecteur, 3 10 puis de condenser un dérivé de la L alanine, de formule générale (XXXVII) dans laquelle Eg^ est défini comme précédemment et, ’ lorsque Eg^ représente un groupement protecteur de la fonction amine, d’éliminer le radical Rg^, puis de condenser l’acide gras : . de formule générale (Yl), et

V

15 - lorsque Rgg représente un reste d*aminoacide de formule-générale (XXXVI) dans laquelle R ’ représente un rèste d’un L aminoacide de formule générale (XXXVIl) dans laquelle Rg^ représente un groupement protecteur de la fonction amine, d’éliminer le radical Eg^ puis de condenser l’acide gras de formule générale (Yl).

20 lorsque dans la formule générale (i), E^ représente un reste glycyle ou D alanyle, l’introduction d’un tel radical peut être effectuée à n’importe quel stade de la synthèse de Merrifield.

Par exemple il est possible de fixer sur un support approprié le produit de formule générale (XXX) dans laquelle R^g représente un 25 groupement protecteur de la fonction amine différent 'de Ε^γ, puis d’éliminer B^ sans toucher à E^ et de condenser un dérivé de la glycine ou de là E alanine dont la fonction amine est substituée par un groupement protecteur de la fonction amine différent de Ε^γ puis, après élimination de B^, de condenser le produit de formule 30 générale (XXXI) ou (XXXIl) dans les conditions indiquées précédemment, ou bien il est possible de fixer sur un support approprié le produit de formule générale (XXX) dans laquelle E^g représente un · groupement protecteur de la fonction amine, puis de condenser un produit de formule générale (XXXl) ou (XXXIl). dans'les conditions .

35 indiquées précédemment, puis après élimination de E^g de condenser/ la glycine ou la D alanine dont la fonction amine est substituée/// par un groupement protecteur. · \J[ 28 ί

Les supports qui conviennent particulièrement bien sont les copolyüières styrène-divinylbenzène chlorométhylés ou hydroxy-méthylés. De préférence le copolymère styrène-divinylbenzène (98-2 . ou 99-1) chlorométhylé est utilisé.

5 La fixation des peptides de formule générale (XXX)* (XXXI) , (XXXII), (XXXIIl) ou (XXXIV) sur le support chlorométhylé s'effectue selon les méthodes habituelles, en particulier en faisant réagir le peptide de formule générale (XXX), (XXXI), (XXXII) , (XXXIIl) ou (XXXIY) en solution dans un solvant organique $ 10 tel que l'éthanol et en présence d'un accepteur d'acide tel que la triéthylamine. Il est particulièrement avantageux de chauffer le mélange réactionnel jusqu'à une température voisine de la température d'ébullition du mélange réactionnel.

Les groupements protecteurs des fonctionst amines des 15 peptides de formule générale (XXX), (XXXl), (XXXIl), (XXXIIl) ou (XXXIV) doivent être choisis de telle manière que leur élimination s'effectue sans toucher à la liaison peptide-support. En particulier les radicaux Ε^γ, R^g, E^, Rgg et Rg,j doivent être différents du radical E^g et être tels que leur élimination s'effectue sans 20 toucher au groupement protecteur E^ et à la liaison peptide- -support.

Généralement les fonctions esters représentées ou portées par Eg, R^ ou R^ sont choisies de telle manière que, lors de la I coupure de la liaison peptide-support, les radicaux Eg, R^ ou R^ i 25 puissent être soit conservés, soit transformés en radicaux carboxy ou carbamoyle selon que la coupure est une hydrolyse acide, une alcoolyse ou une ammonolyse.

Plus particulièrement la liaison peptide-support, qui est de nature benzylique, est coupée par traitement au moyen d'un I30 mélange acide bromhydrique-acide trifluoroacétique en régénérant une fonction acide.

Les nouveaux peptides de formule générale (i) peuvent être j éventuellement purifiés par des méthodes physiques (telles que la cristallisation ou la chromatographie) ou chimiques (telles que / , ,,—.— 29

J

Les nouveaux produits selon l'invention peuvent être transformés en. sels d'addition avec les acides ou en sels métalliques ou en sels d'addition avec les bases organiques selon la nature des substituants.

5 Les sels d'addition avec les acides peuvent être obtenus par action des nouveaux produits sur des acides dans un solvant approprié. Généralement on solubilise le produit dans l'eau par addition de la quantité théorique d'acide puis ôn lyophilise la solution obtenue.

10 Les sels métalliques ou les sels d'addition avec les bases organiques peuvent être obtenus par action des nouveaux composés sur , des bases minérales ou organiques dans un solvant approprié.

Généralement on solubilise le produit dans l’eau par addition de la quantité théorique de base puis on lyophilise la solution 15 obtenue.

Les nouveaux composés selon la présente invention sont des adjuvants et des stimulants de l'immunité ! ils augmentent les réactions d'hypersensibilité et/ou la production d'anticorps circulants vis-à-vis des antigènes avec lesquels ils sont adminis-20 très et ils stimulent de manière non spécifique des réactions de défense contre certaines infections (par exemple l'infection de la souris par la bactérie intracellulaire Listeria monocytogenes) · J)'un intérêt tout particulier sont les produits de formule générale (i) dans laquelle ECO- représente un reste d'acide 25 gras dans lequel H représente un radical alcoyle contenant 2 à 21 atomes de carbone, éventuellement substitué par un radical hydroxy, E.J représente un radical hydroxy ou amino, les symboles Rg et R^, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou . un radical carboxy, carbamoyle, N-carbonylglycyle ou N-carbonyl 30 D alanyle, étant entendu que Rg et R^ ne peuvent pas représenter simultanément un atome d'hydrogène, R^ représente un atome d'hydrogène ou un reste glycyle ou R alanyle, étant entendu que,lorsque Rg et R^, identiques ou différents, représentent ch^^m^/^ c 50

«B

• » · * b % (_ .

1*· un radical M-carbonylglyeyle ou M-carbonyl D alanyle, représente un atome d’hydrogène, X représente un atome de soufre, m et n, identiques ou différents, représentent chacun un nombre entier égal à 1 ou 2, étant entendu que l'alanine liée à l'acide 5 glutamique est sous forme L, l'acide glutamique est sous forme S, la lanthionine, lorsque m et n sont égaux à 1, la cystathionine, lorsque m et n sont différents, l'homolanthionine, lorsque m et n I. · sont égaux à 2» hont sous forme D,D ; L,L ; DD,LL (racémique) ou D,L (méso) ou sous forme des mélanges L, méso ou D, méso, et 10 la thialysine, lorsque l'un des symboles Eg ou E^ représente un atome d'hydrogène, est. sous forme L ou D ou D,L.

In vitro, ils sont actifs à des concentrations molaires généralement comprise^ entre 10 ^ et 10~®, en particulier dans les tests suivants : 15 - "stimulation de la synthèse de l'ADN (pouvoir mitogène) selon la technique de G. MARQUAI, Ann. Immunol. (inst. Pasteur), 125 C.

519 (1974) - stimulation de la production d'anticorps selon la technique de P.H. KLESIÏÏS, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. (N.Y.), J^, 155 (1970) et 20 E. YM DIJK et N. BL0KSMA, J. Immunol. Methods, V£, 525 0977) - augmentation du nombre de macrophages phagocytaires selon la technique de J. MICH! et coil., J. exp. Med., 144. 14^5 (1970 - augmentation de l'activité cytostatique des macrophages d'un exsudât péritonéal vis-à-vis des cellules tumorales.

25 In vivo, chez la souris, à des doses comprises entre 1 . et JO mg/kg, ils augmentent l'hypersensibilité retardée et la production d'anticorps en particulier selon la technique de ' . — „„„y .31 ' .

"·

Chez la souris, ils stimulent les réactions de défense contre l’infection soit à Listeria monocytogenes, soit à Klebsiella pneumoniae à des doses comprises entre 1 et 100 mg/kg selon la technique de E.M. FAUVE et B. BEVIN, C.E. Acad. Sei. (D), 5 285, 1589 (1977).

Chez la souris, ils stimulent le pouvoir d’élimination ' du carbone ‘colloïdal par.le système réticulo-endothélial suivant la technique de B.N. HALPERN et coll., Ann. Institut Pasteur, 80, 582 (1951).

10 Les exemples suivants, donnés à titre non limitatif, illustrent la présente invention.

Les produits selon la présente invention peuvent former des complexes avec les métaux alcalins ou alcalino-terreux ; il en résulte que les résultats de l'analyse élémentaire des 15 produits peuvent sensiblement s'écarter des valeurs théoriques. Cependant la structure des produits est'confirmée par le rapport C/N ou C/S qui est en accord avec la théorie, par la teneur en acides aminés, et par leur homogénéité en chromatographie sur couche mince de silicagel.

20 Les conditions d'hydrolyse utilisées pour déterminer le rapport des acides aminés entre eux [acide chlorhydrique concentré -acide acétique anhydre (1-1 en volumes) à 96°C pendant 5 heures selon la méthode de I. PH0TAKI, J; Chem. Soc., Perkin 1, 2599 • (1979)] sont des conditions qui ne racémisent pas la lanthionine 25 mais sont insuffisantes pour'rompre entièrement la liaison ami de / entre l'acide gras et l'alanine.

a» » 32

On ajoute 1 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à -5°C, de 3»9 g de H-(N-lauroyl L alanyl.)-α-D glutamate de benzyle dans un mélange de 200 cm3 de tétrahydro-5 fur arme et de 1,1 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 4^ minutes à -5eC, puis on ajoute une solution refroidie à 0eC de 2,7 g de Noc-benzyloxycarbonyl L lanthionine dans 138 cm3 de soude 0,1 N. Le mélange réactionnel est agité pendant 20 minutes à 0°G, puis pendant 16 heures à 20°C environ. On évapore le tétra-10 hydrofuranne par concentration sous pression réduite'(20 mm de meroure ? 2,7 kPa) à 50°C ; le concentrât est acidifié à pH 2 » par addition d'environ 30 om3 d'aoide chlorhydrique 1 N, extrait ' 3 fois par 300 om3 au·total d'acétate d'éthyle. Les phases orga niques réunies sont lavées avec 30 cm3 d'une solution saturée de 13 chlorure de sodium, s,échées sur sulfate de sodium anhydre et concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 40°C. Le résidu obtenu est trituré dans 200 cm3 d'éther,· séparé par filtration et séché sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 20eC. On obtient ainsi 2,25 g de poudre 20 amorphe à laquelle on ajoute 0,45 8 d'un produit similaire obtenu dans une autre préparation. Ce mélange est chromatographié sur 50 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm) contenus dans une colonne de 2,3 cm de diamètre. Pour cela, on dissout les 2,70 g de produit dans 200 om3 d'acétate d'éthyle bouillant et à la solution obtenue, 25 on ajoute 5 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On évapore à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure $ 2,7 fcPa) à 50°C et le résidu ainsi obtenu est chargé sur la colonne de silice. On élue successivement avec 300 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-cyclohexane (2-8 en volumes), 150 cm3 d'un mélange acétate 30 d'éthyle-cyclohexane (1-1 en volumes), 750 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-cyclohexane (3-1 en volumes), 1,2 litre d'acétate d'éthyle, 850 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (9-1 en volumes) et 250 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique 1(8-2 en volumes) en recueillant des fractions de 50 cm3· Les / 35 fractions 51 à 70 sont réunies, concentrées à seo sous pressioiv //

V

«I * 33 réduite (20 mm de mercure ; 2,7 KPa) à 50®C-. Le résidu est trituré dans 200 cm3 d'éther, séparé par filtration, lavé 2 fois par 100 cm3 au total d'éther et séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure $ 0,04 KPa) à 50eC. On obtient ainsi 1,86 g d'acide 2p ί g 5 N {0 -benzyl N-(N-lauroyl L alanyl) γ-D glutamyl] N-benzylozy-carbonyl L,L diamino-2,6 thia-4 pimélique.

If = 0,45 [silicagel ; acétate d'éthyle - acide acétique (9-1 en volumes)] 2 r -1

Pans une solution de 1,8 g d'acide N -|0 -benzyl N- 6 10 (U-lauroyl L alanyl) γ-L glutamyl] N -benzyloxycarbonyl L,L diami-no-2,6 thia-4 pimélique dans 50 cm3 d'acide tri fluor acétique, on 9 envoie un courant d'acide bromhydrique pendant 5 heures 1/2. Ensuite, le mélange réactionnel est purgé avec de l'azote pendant' 10 minutes, débarrassé d'un léger insoluble par filtration et 15 concentré à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 50°C. Le résidu obtenu est trituré dans 50 cm3 d'acétate d'éthyle, séparé par filtration et lavé 2 fois par 60 cm3 au total d'éther. On obtient ainsi 1,06 g d'une poudre amorphe trèshygroscopique que l'on dissout dans 50 cm3 d'une solution 20 anhydre d'acide chlorhydrique 1,9 N dans l'acide acétique. Cette solution est concentrée à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7. KPa) à 50°C. Le résidu est dissous dans 5 cm3 d’acide acétique anhydre et jeté dans 1 litre d'éther. Le précipité ainsi formé est séparé par filtration, lavé avec 100 cm3 d'éther, 25 séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure ; 0,04 kPa) à 20°C et dissous dans 10 cm3 d'eau. La solution ainsi obtenue se gélifie au bout de l/.2 heure ; elle est alors diluée par 500 cm3 d’eau. Le précipité ainsi formé est séparé par filtration, dissous dans 5 cm3 d'acide acétique et jeté dans 800 cm3 d'éther.

3Qs le nouveaii précipité ainsi formé est séparé par filtration, lavé 3 fois avec 300 cm3 au total d'ether et séché sous pression réduite (0_,3 mm de mercure ; 0,04 KPa) à 50°C. On obtient ainsi |80 mg d'acide N^-[N-(N-lauroyl L alanyl)-γ-D glutamyl] L,L 'diamino-2,6 thia-4 pimélique contenant 2,1 5^ d'eau. _ / 3g Ef = 0,25 [silicagel ; n.butanol - pyridine - acide/ /.

acétique - eau (50-20-6-24 en volumes)] » » » 1 » - 1' 34

Analyse : Cale. # C 52,87' H 7,85 H 9>48 S 5,43 49,5 7,9 0,7 5,2

Cendres sulfuriques ï 2,1 %

Après hydrolyse dans un mélange acide chlorhydrique 5 concentré - acide acétique anhydre (1-1 en volumes) pendant 5 heures à 96°0, l'analyse sur autoanalyseur BIOTEONIK révèle la présence des acides aminés suivants :

Lan 1,00 (théorie = 1) m.éso Lan 0 (théorie » 0) - 10 Glu 1,02 (théorie = 1)

La Noc-benzyloxycarbonyl L lanthionine peut être préparée * ^ selon la méthode de I. ΡΗ0ΤΑΚΙ et coli., J. Chem. Soc. Perfcin I, 2599 (1979).

: Le .N-lauToyl'L. alanyl-a-’L glutamate de benzyle peut 15 être préparé selon 1,'une des deux méthodes suivantes : a) A une solution de 12,75 S de chlorhydrate de L alanyl-a-D glutamate de benzyle dans 75 cm3 de soude 1 N, on ajoute simultanément .en 57 minutes, 8 g de chlorure de lauroyle dissous dans 75 cm3 d'éther et 37,4 cm3 de soude 1 N de façon à 20 maintenir le pH du mélange réactionnel compris entre 8 et 9· Le mélange est agité pendant 1 heure 20 minutes. Apres décantation, la phase aqueuse est acidifiée à pH 2 par addition d'acide chlorhydrique 1 N (60 cm3) et extraite 3 fois par 300 cm3 au total d'acétate d'éthyle. Les extraits organiques réunis sont · 25 lavés par 25 cm3 d'eau, séchés sur du sulfate de sodium anhydre et concentrés à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 hPa) à 45° 0. On obtient ainsi 7,4 S à'un solide blanc que l'on chromatographie sur 80 g de gel de silice neutre contenus dans une colonne de 2 cm de diamètre. On élue successivement par 100 cm3 30 d’un mélange acétate d'éthyle - méthanol (8-2 en volumes) et 200 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle - méthanol (1-1 en volumes), en recueillant des fractions de 50 cm3. La fraction t est concentrée à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 45°C. On obtient ainsi 2 g de N-lauroyl L alanyl-oc-D glutamate 35 de benzyle fondant à 130°C. Les fractions 2 à 4 sont de même /

~~...... " " “1 “ “F

35 • * η B · neutre (0,063-0,20 mm) contenus dans une colonne de 2 cm de diamètre· On élue par 230 cm3 d'acétone en recueillant des fractions de 25 cm3. Les fractions 1 et 2 sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 45°C. On obtient 5 ainsi 4 »07 g de N-lauroyl L alanyl-oc-3) glutamate de benzyle fondant à 130°C dont les caractéristiques sont les suivantes : = 0,9 [silicagel ; n.butanol - pyxidine - acide acétique - eau (50-20-6-24 en volumes)]

Analyse Cale. $> C 66,10 H 8,63 N 5»71 10 Tr. 66,3 8,8 5 »6 b) On ajoute 31 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une • solution, maintenue à une température voisine de 10°C, de 47»75 g d'acide laurique dans 3 litres de dioxanne et 33»3 cm3 de triéthyl-amine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à 10°C, puis on 15 ajoute en 10 minutes une solution, refroidie à 10°C, de 88,95 S de chlorhydrate de L alanyl-a-L glutamate de benzyle, dans un mélange de 1 litre de dioxanne, de 476 cm3 d'eau et de 476 cm3 de soude 1 N. Le mélange réactionnel est agité pendant 1 heure à 10°0, puis pendant 18 heures à une température voisine de 20eC ; 20 il est ensuite dilué par addition de 4 litres d'eau, acidifié à pH 2 par addition d'acide chlorhydrique 1 N (environ 475 cm3) et conservé pendant 2 heures à 0°C. Le précipité obtenu est séparé par. filtration, lavé successivement par 500 cm3 d'eau et 500 cm3 d'éther, puis séché sous pression réduite (20 mm de 25 mercure j 2,7 kPa) à 20°0. Le produit est mis en suspension dans 800 cm3 d'éther, agité pendant 1 heure, séparé par filtration et lavé 2 fois par 200 cm3 au total d'éther. Après séchage sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 20°C, on obtient 71 »79 g de N-lauroyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle fondant à 30 130°C.

Ef = 0,77 [silicagel ; acétate d'éthyle - méthanol (4-1 en volumes)]. /

Le chlorhydrate de L alanyl-a-L glutamate* de benzyle^ / peut être préparé de la façon suivante î /j// y .

* » » « * · -y Ί» 36

On dissout 97» 16 g de H-t.butyloxycarbonyl L alanyl-a-L glutamate de benzyle dans 970 cm3 d'une solution anhydre d'acide chlorhydrique 1,7 E dans l'acide acétique. On agite pendant 2 heures, puis on ajoute rapidement 3»® litres d'éther anhydre et 5 on laisse reposer pendant 2 heures à 0°C. Le précipité huileux qui s'est formé, séparé du surnageant par décantation, est dissous dans 300 cm3 d'acétone ; la solution ainsi obtenue est concentrée à sec sous pression réduite (2Q mm de mercure ; 2,7 kPa) à 30°C.

On obtient ainsi 88,9 g de chlorhydrate de L alanyl-a-L glutamate 10 -def benzyle. * ’ , Le ET-t. butyloxycarbonyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle peut être préparé selon la méthode de E. BRICAS et coll.,. Biochemistry 2» 823 097Q)· EXEMPLE 2 - .. .» 13 On ajoute £,6 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution maintenue à -5eC, de 9» 12 g de H-(N-lauroyl L alanyl) α-D glutamate de t.butyle.dans un mélange de 440 cm3 de tétra-hydrofuranne et de 2,8 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à -5°C, puis on ajoute une solution refroidie à 20 2*0 de 6,82 g d'acide N^-benzyloxycarbonyl diamino-2 (L), 6 (D,L) thia-4 pimélamique dans un mélange de 20 cm3 de soude N et 172 cm3 d'eau.

Le mélange réactionnel est agité pendant 3 minutes à 0°C, puis pendant 20 heures à 20°C environ. On évapore le tétrahydro-23 furanne par concentration sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 EPa) à 50eC ; le concentrât est refroidi à 0eC, acidifié à pH 2 par addition d'acide chlorhydrique 1 H (23 cm3 environ).

Le précipité formé est séparé par filtration, lavé par 100 cm3 d'acide chlorhydrique 0,1 N. puis 2 fois par 400 cm3 au total d'eau 30 et séché à l'air libre. On obtient ainsi 11,8 g d'une poudre légèrement colorée en vert que l'on chromatographie sur 230 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm) contenus dans une colonne de 4 cm de diamètre. Pour cela, on dissout les 11,8 g de poudre dans / .150 cm3 d'acide acétique et à la solution obtenue, on ajoute 20 gjf f 37 ” Μ / * > de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On évapore à sec-le mélange sous pression réduite (20 -mm de mercure) à 50°C et le résidu ainsi obtenu est chargé sur la colonne de silice. On élue successivement avec 1 litre d'un .mélange acétate d'éthyle - acide 5 acétique (98-2 en volumes) et 3»2 litres d'un mélange acétate d'éthyle - acide acétique (9-1 en volumes) en recueillant des fractions de 100 cm3. Les fractions 17 à 42 sont réunies, concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C.

Le résidu obtenu est trituré.dans 150 cm3 d'éther, séparé par * 10 filtration et séché. On obtient ainsi 6,3 g d'acide H^-[0^-t.butyl N-(H-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] N^-benzylorycarbonyl ' diamino-2(L), 6 (D,L) thia-4 pimélamique.

Êf — 0,83 [silicagel $ acide acétique - acétate d'éthyle (3-1 en volumes)] 15 fif = 0,63 [silicagel ; n.but&nol - pyridine - acide acétique - eau (50-20-6-24 en volumes)]

Spectrométrie de masse » tt=779 (théorie = 779)

On dissout 6,3 g d'acide N^-[0^-t.butyl N-(N-lauroyl 6 L alanyl)-y L glutamyl] N -benzyloxycarbonyl diamino-2(L), 6(D,L) 20 thia-4 pimélamique dans un mélange refroidi à 0°C de 27,5 cm3 d'acide bromhydrique en solution à 35 $ dans l'acide acétique, 9 cm3 de diéthylphosphite et 14 cm3 de diéthylsulfure. On agite le milieu réactionnel pendant 1 heure 1/4, puis on le verse dans 2 litres d'éther* anhydre refroidi à 0°C. On agite le mélange pen-25 dant 2 heures ; le précipité obtenu est séparé par filtration, lavé 4 fois par 1,2 litre au total d'éther et séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure*; 0,04 kPa). On obtient ainsi 7,5 S ’ d'une poudre beige clair, hygroscopique, que l'on chromatographie sur 380 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm) contenus dans 30 une colonne de 4 cm de diamètre. Pour cela, on dissout les 7,5 8 de poudre dans un mélange de 100 cm3 de méthanol et 4 cm3 d'ammoniaque (d = 0,92) et; à la solution ainsi obtenue, on ajoute 16 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On évapore à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 35 50°C et le résidu ainsi obtenu est chargé sur la colonne de silice. On élue avec 1,53 litre d'un mélange méthanol - acétate / d'éthyle (8-2 en volumes) en recueillant des fractions de 30 cm54 / » * *1 38 «

Les fractions-35 à 51 sont réunies, concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 50eC. Le résidu obtenu est trituré dans 100 cm3 d’éther, séparé par filtration et séché à 40°C sous pression réduite (0,3 mm de mercure ; 0,04 kPa).

5 On obtient ainsi 4»05 g d'acide N^-[lT-(N-lauroyl L alanyl)-γ-D glutamyl] diamino-2(L), 6 (L,L) thia-4 pimélamique.

Ef = 0,41 [Silicagel ; n.butanol - pyridine - acide acétique -eau (50-20-6-24 en volumes)]

Spectrométrie de masse * M s 589 (théorie = 589) · 10 Analyse - : Cale 0 52,95 H 8,03 N 11,88 S 5,44 - 48,6 * 7,4 10,9 4,9

Le N-(N-lauroyl L alanyl) a-3î glutamate de t.butyle peut être préparé de la façon suivante :

On dissout 55 S de N-(N-lauroyl L alanyl)-L glutamate 15 de a-t.butyle et de γ-benzyle dans 4»7 litres de t.butanol. On ajoute 55 6 de palladium sur noir (à 3 $> de palladium), puis on fait passer un lent courant d'hydrogène pendant 7 heures. Après filtration, on concentre à sec le milieu réactionnel sous pression réduite (20 mm de mercure î 2,7 kPa - puis 0,3 mm de mercure ; 20 0,04 kPa) à 50°C. On obtient ainsi 47,1 g d'huile épaisse que l'on dissout dans 500 cm3 d'une solution saturée de bicarbonate de sodium. Cette solution est extraite 2 fois par 500 cm3 au total d'acétate d'éthyle, la phase acétate d'éthyle est lavée avec 200 cm3 d'une solution saturée de bicarbonate de sodium« Les 25 phases' aqueuses réunies sont acidifiées à pH 3-4 par addition d'acide citrique, extraites 3 fois par 600 cm3 au total d'acétate d'éthyle. Cette dernière phase organique est séchée sur sulfate de sodium et concentrée à sec sous pression réduite (20 -mm de mercure; 2,7 kPa) à 50eC. On obtient ainsi 36,5 S de N-(N-lauroyl L alanyl) 30 oc-L glutamate" de t.butyle sous forme d'une huile cristallisant à 20eC.

Ef : 0,67 [silicagel ; acétate d'éthyle - acide acétique (9.-1 en volumes)] /

Spectrométrie de masse : M = 456 (théorie = 456) /!/ % - 39 1 » Μ

Le $f_(H_iauroyl L alanyl) 5 glutamate de cc-t.butyle et de γ-benzyle |,eut être préparé de la façon suivante ï

On écoute 23,2 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, malvenue vers -7ec, de 48 g de N-lauroyl L alanine dans 5 un mélange de 300 cm3 de tétrahydrofuranne et de 24» 9 cm3 de triéthylamine% i,e mélange est agité pendant 20 minutes vers -7eC> puis on ajouté une solution de 80 g de I) glutamate de α-t.butyle et de γ-benzyle 330 Cm3 de tétrahÿdro fur arme· Le mélange réac tionnel est a&ité pendant 30 minute* à une température voisine de 10 Q°C, puis pendant -jg heures à une température.voisine de 20°C 5 ’ . il est ensuit^ filtré. Le filtrat eèt concentré à sec sous pres sion réduite (20 mm de mercure ; 2,7 k£a) à 45eC· L’huile résiduelle obtenu® est reprise par 1,5 litre d'acétate d'éthyle, refroidi vers 5°G, -lavé, successivement paS 400 cm3 d’une solution saturée - 15 .et glacée’ d'acide oitrique, 4 fois 1,2 litre au total d’une solution saturée de bicarbonate de *odium et 30Ö cm3 d’une solu- « tion saturée <de chlorure de sodium. Après séchage sur sulfate de sodium, la ph^gg organique est concentrée à sec sous pression réduite (20 de mercure ; 2,7 kPaY à 45eC. On obtient 79 g 20 d'huile jaune pâle qui est chromato^raphiée sur une colonne de 8 cm de diamè’-tj.g contenant 2,4 kg à* silice neutre (0,063-0»2 mm).

On élue successivement par 3 litres cL'un mélange de cyclohexane -acétate d'éthyle (85-15 en volumes)*, 2,4 litres d’un mélange de cyclohexane -, acétate d'éthyle (80-Φ en volumes), 15,6 litres 25 d'un mélange cyclohexane - acétate d'éthyle (75-25 en volumes), 2,4 litres d'"^n mélange de cyclohexân® — acétate d’éthyle (70—30 en volumes), 2,4 litres d'un mélange de cyclohexane - acétate . d'éthyle (65-5*35 en volume^, 3 litre? d'un mélange de cyclohexane -acétate d'étl^yie (60-40 en volumes)* 4»2 litres d'un mélange de '30 cyclohexane -5. acétate d'éthyle (50-?0 en volume^ et 4»2 litres d’un mélange de cyclohexane - acéts'Q d'éthyle (4Ο-6Ο en volumes) en recueillant des fractions de 60Ccm3. Les fractions 34 à 60 réunies sont -concentrées à sec sous Pression réduite (20 mm de mercure; 2,7 &pa)% 40°a On obtient ainsi'5 δ de N-(N-lauroyl L alanyl)-3) ' 35 glutamate de α-t.butyle et de γ-beisyle sous forme d'huile jaune. /

Ef _-o,55 [silicagel ; - acétate d'éthyle/V

(1--1 en volumes)] IJ/ /f • « • 4°

Le B-glutamate de α-t.butyle et de γ-benzyle peut être préparé de la façon suivante :

On ajoute en 15 minutes, 49 cm3 d'acide sulfurique (d » 1,83) à une suspension, refroidie vers 13°C, de 64 g de 5 D glutamate de γ-benzyle dans 500 cm3 de dioxanne. A la solution ainsi obtenue, maintenue vers 13°C, ou fait passer un courant d'isobutène pendant 40 minutes ; .ensuite le milieu réactionnel est conservé à 20°C pendant 16 heures, puis de nouveau, on y fait passer tin courant d'isobutène pendant 4 heures et on laisse au 10 repos pendant 20 heures. On ajoute alors,en 10 minutes, le mélange réactionnel à un mélange de 2,6 litres de soude U et de 4» 15 litres-d'éther, refroidi vers 0eC. On sépare la phase organique, on • extrait la phase aqueuse avec 1 litre d'éther. Les phases organiques ainsi obtenues sont réunies, séchées sur sulfate de sodium 15 et concentrées sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) I , à 32eG. On obtient ainsi SO g de S glutamate de oc-t.butyle et de a γ-benzyle, contenant environ 20 % de dioxanne et 10 $ d'alcool 1 benzylique. Une concentration sous pression plus faible ou à I température plus élevée diminue le rendement. Ce produit ainsi I 20 obtenu doit être utilisé dans les quelques jours qui suivent l'isolement.

1 Le N-lauroyl L alanine peut être préparé selon la I méthode de E. JTOGEEMANN et coli·, J. Amer. Chem. Soc. 2â> 172 I (1956).

I 25 Le .3) glutamate de γ-benzyle peut être préparé selon I la méthode de P. LEFBANCIER et E:. ERICAS, Bull. Soc. Chim. France, I 1965. 3668.

9 L'acide N^-benzyloxycarbonyl diamino-2(L), 6(B,L) thia-4 fl pimélamique peut être préparé de la façon suivante : 9 30 ~On ajoute 24»3 g de potasse en pastilles dissous dans 9 280 cm3 d'éthanol anhydre dans une solution de 25»35 g de 9 . L cystéine, chlorhydrate, hydrate, dans 280 cm3 de diméthyl- [1 formamide. A la bouillie ainsi obtenue, on ajoute 56,65 g de H N-benzyloxycarbonyl· 0-p.toluènesuifonyl L,L sérinamide dissous dans / II 35 280 cm3 d'éthanol anhydre. On agite le mélange réactionnel pendant/· 41 5 heures à 20°G, ensuite on filtre l'insoluble, on le lave 2 fois par 60 cm3 au total d'éthanol. Leô filtrats réunis sont concentrés à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 KPa) à 60°C. Le résidu semi-cristallisé ainsi obtenu est repris par 300 cm3 d'eau .5 tiédie à 50eC, l'insoluble est séparé par filtration, le filtrat est refroidi à 0eC, acidifié à pH 6-7 par addition de 5»5 em3 d'acide acétique anhydre et conservé à 0eC pendant 20 heures· L'insoluble est séparé par filtration, lavé successivement 2 fois par 200 cm3 au total d'eau, 2 fois par 120 cm3 au total 10 d'éthanol et 100 cm3 d'oxyde d'isopropyle, séché sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 50°C· On obtient 27 g d'acide N^-benzyloxyoarbonyl diamino-2(l)*, 6(d,L) thia-4 pimé-lamique fondant avec décomposition vers 185eC.

Rf = 0,50 [silicagel î n.butanol - pyridine - acide 15 acétique - eau (50-20-6-24 en volumes)] -,

Spectrométrie de masse : M « 341 (théorie « 341) 20° ^ = +^°’ (ac^e chlorhydrique N ; c * 1)

Après hydrolyse dans un mélange acide chlorhydrique ' concentré - acide acétique anhydre (1-1 en'volumes) pendant 5 heures 20 à 96°C, l'analyse sur autoanalyseur BI0TR0NIK révèle la présence des acides aminés suivants :

Lan 0,45 (théorie =0,5) méso Lan 0,55 (théorie =0,5)

Le N-benzyloxycarbonyl 0-p.toluènesulfonyl D,L sérinamide 25 peut être préparé selon la méthode de L. ΒΕΝ0ΙΤ0Ν et coll·, J.

Chem. Soc. p. 824 (19^4)· EXEMPLE 3 -

On ajoute 0,53 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à -5°C, de 720 mg de N-t.butyloxycarbonyl-30 glycine dans un mélange de 60 cm3 de tétrahydrofuranne et de 0,57 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à -5°G, -puis on ajoute une solution refroidie à 0°0 de 2,55 g d'acide ‘ N2-[N-(H-lauroyl L alanylJ-y-L glutamyl] diamino-2(L),6(L,L) thia-4 pimélamique dans- 50 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité 35 pendant quelques minutes à 0°0, puis pendant 18 heures à 15®C

environ. On évapore le tétrahydrofuranne par concentration sou^V

- 42 »* i»t .

* l pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 45°C f le concentrât est acidifié à pH 2 par addition de 1 cm3 d'acide acétique, extrait 3 fois par 90 cm3 au total d'acétate d'éthyle. Les phases organiques réunies sont lavées par 10 cm3 d'eau, séchées sur 5 sulfate de sodium et concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 45°C· Le résidu obtenu est trituré dans 50 cm3 d'éther et séché sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 20°C. On obtient ainsi 2,72 g de poudre orangée que l'on chromatographie sur 115 g de gel de silice neutre 10 (0,04-0,063 mm) contenusdans une colonne de 2,5 cm de diamètre. * , Pour cela, on dissout 1¾ 2,72 g de poudre dans 40 cm3 d'acide acétique eij à la solution obtenue, on ajoute 12 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On évapore à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 fcPa) à 55°C et le résidu ainsi 15 obtenu est chargé sur la colonne de silice. On élue successivement avec 1,68 litre d'un mélange acétate d'éthyle - acide acétique (9-1 en volumes) et 1,5 litre d'un mélange acétate d'éthyle -acide acétique (8-2 en volumes) en recueillant des fractions de 60 cm3« Les fractions 14 à. 53 sont réunies, concentrées à sec 20 sous pression réduite (20 mm de mercure $ 2,7 kPa) à 50°0. Le résidu obtenu est trituré dans 50 cm3 d'éther, séparé par filtration et séché sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 20°C. On obtient ainsi 1,8 g d'acide N2-[îT-(N-lauroyl L alanyl)- c γ-L glutamyl] N -t .butylosycarbonylglycyl diamino-2(L), 6(L,l) 25 thia-4 pimélamique ·

Ef as 0,43 [silicagel ; n.butanol - pyridine - acide acétique - eau (50-20-6-24 en volumes)]

On dissout 1,8 g d'acide N2-[N-(N-lauroyl L alanyl)-γ-L glutamyl] N^-t.butyloxycarbonylglycyl diamino-2(L), 6(L,L) 30 thia-4 pimélamique dans 36 cm3 d'une solution anhydre d'acide chlorhydrique 1,7 N dans l'acide acétique. On agite le mélange réactionnel pendant 2 heures, puis on le débarrasse d’un très léger insoluble par filtration ; dans le filtrat, on ajoute 15 cm3 d'éther et on agite pendant 1 /4 d'heure. Le précipité / 35 apparu est séparé par filtration, lavé 3 fois par 60 cm3 au/1/ 1- *ß 43 total d'éther, séché sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 20°C. On obtient ainsi 1,44 g de poudre que l'on dissout dans 25 cm3 d'eau. On ajoute successivement 0,5 cm3 de triéthyl-amine et 0,5 cmj d'acide acétique. Après 1/4 d'heure de repos dans 5 un "bain à 0eC, on sépare le précipité formé par filtration, le lave 2 fois par 10 cm3 au total d'eau et le sèche sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 20°C. On obtient ainsi 1,18 g de poudre que l'on chromatographie sur 42 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm) contenue dans une colonne de 2,5 cm 10 de diamètre. Pour cela, on dissout les 1,18 g de poudre dans 50 cm3 de méthaaol contenant 0,25 cm3 d'ammoniaque concentrée et â la solution obtenue, on ajoute 5 g de gel de silice neutre ( (0,04-0,063 mm). On évapore à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure $ 2",7 kPa) à 50°C et le résidu ainsi-.obtenu est 15 chargé sur la colonne de silice. On élue avec du méthanol en recueillant des fractions de 3(0 cm3· Les fractions 14 à 26 sont réunies, concentrées à seo sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 5°eC. On obtient ainsi ·630 mg d'acide N^-[N-(N-laur oyl L alanyl)-γ-D glutamyl] N^-glycyl diamino-2(L), 6(D,L) thia-4 pimélamique.

20 Ef = 0,30 [silicagel ; n.butanol - pyridine - acide acétique - eau (50-20-6-24 en volumes)]

Analyse î Cale $ C 52,00 H 7,79 N 12,99 S 4,96

Tr. 49,1 7,7 12,0 4,6

Après hydrolyse dans un mélange acide chlorhydrique 25 concentré - acide acétique anhydre (1-1 en volumes) perdant 5 heures à 96eC, l'analyse sur autoanalyseur BI0TE0NIK révèle la présence des acides aminés suivants-:

Glu = 0,92 (théorie = 1)

Gly = 1,03 (théorie s 1)

T

30 Lan =0,55 (théorie =0,5) méso Lan =0,45 (théorie =0,5)

On ajoute 0,3 cm3 de ohloroformiate dfisobutyle à une solution, maintenue à -5°C, de 1,05 g de N-(N-lauroÿl L alanyl)-35 α-D glutamate de t.butyle dans un mélange de 45 cm5 de tétrahydro/ furanne ^t de 0,32 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité/ï/ % i 0 ! t » Μ » » - • 44 pendant 20 minutes à -5°C» puis on ajoute une solution refroidie à 0°C de 1 g de chlorhydrate de N^-benzyloxycarbonyl diamino-2 (mélange D et L), 6(ii) thia-4 pimélamoyl-glycine dans un mélange de 4*6 cmj de soude 1 N, 25 cm5 d*eau et 17 cm3 de tétrahydrofuranne.

5 Le mélange réactionnel est agité pendant quelques minutes à 0°C, puis pendant 20 heures à 20eC environ, ensuite on acidifie à pH 3 par addition de 2,-5 cm3 d'acide chlorhydrique 1 H. On évapore le tétrahydrofuranne par concentration sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50° C. Le concentrât est dilué par addition de 25 cm3 10 d'eau ; le précipité apparu eft séparé par filtration, lavé 3 fois par 15 cm3 au total d'eau distillée et séché sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 20°C. On obtient ainsi 1,82 g de ' poudre que l'on chromatographie sur 91 g de gel de silice (0,04-0,063 ®m) contenus dans une colonne de 2,5 cm de diamètre· On élue'" i 15 successivement par 200 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle - acide acétique (95-5 en volumes), 240 cm3 d’un mélange acétate d'éthyle -acide acétique (9-1 en volumes), 240 cm3 d'un mélange acétate à.'éthyle - acide acétique (8-2 en volumes) et 200 cm5 d'acétate d'éthyle - acide acétique (l-l en volumes) en recueillant des 20 fractions de 40 cm3. Les fractions 16 à 21 sont réunies, concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 20°C. On obtient ainsi 510 mg de N2-[01-t.butyl E-(N-lauroyl L alanyl)-y-I) glutamyl] N^-benzyloxycarbonyl diamino-2 (mélange L et L), 6(l) thia-4 pimélamoyl-glycine.

25 Ef = 0,76 [silicagel ; n.butanol - pyridine - acide acétique - eau (50-20-6-24 en volumes)]

On dissout 470 mg de N2-[0^-t.butyl N-(N-lauroyl L ala-nyl)-y-D glutamyl] N^-benzyloxycarbonyl diamino-2- (mélange L et L) , 6(L) thia-4 pimélamoyl-glycine dans 5 cm3 d'acide bromhydrique en 50 solution à 33 $ dans l'acide acétique. On agite le mélange réactionnel pendant 40 minutes à 20°C, le purge pendant 10 minutes par un barbotage d'azote et le concentre à sec sous pression réduite (20 mm de mercure î 2,7 kPa puis 0,3 mm de mercure $ 0,04 KPa) à 50°C. Le résidu obtenu est trituré dans 20 cm3 d'éther, séparé 55 par filtration, lavé par 5 cm3 d'éther et séché sous pression / réduite (20 mm de 'mercure j 2,7 KPa) à 20°C. On obtient ainsi /}/ 53Ο mg de poudre orangée que l'on dissout dans 20 cm3 d'eau. l'j// 45 • Μ • te A cette solution, on ajoute 0,2 cm3 de triéthylamine puis 0,2 cm3 d'acide acétique. On refroidit le milieu'réactionnel à 0°C pendant 15 minutes. Le précipité ainsi formé est séparé par filtration, lavé 5 fois par 10 cm3 au total d'eau et séché sous pression 5 réduite (0,3 mm de mercure } 0,04 hPa) à 20°C. On obtient 360 mg de poudre que l'on chromatographie sur 36 g de gel de silice « (0,04-0,063 mm) contenus dans une colonne de 2,5 cm de diamètre.

On élue avec du méthanol en recueillant des fractions de 5 cm3.

Les fractions 5 à 16 sont réunies, concentrées à sec sous pression 10 réduite (0,3 mm de mercure ; 0,04 kPa) à 50°0· On obtient ainsi . 160 mg de JST2-[îï-(lI-lauroyl L alanyl)-y-2) glutamyl] diamino-2 (mélange D et L)., 6(L) thia-4 pimélamoyl-glyoine,

Hf = 0,26 [silicagel ; n.butanol - pyridine - acide ' acétique - eau (50-20-6-24 en volumes)] 15 Analyse : Calu. # C 52,00 H 7,79 N 12,99 S 4,96

Tr. 47,1 7,3 11,4 4,6

Après hydrolyse dans un mélange acide chlorhydrique concentré - acide acétique anhydre (1-1 en volumes) pendant 5 heures à 96°C, l'analyse sur autoanalyseur ΒΙ0ΤΕ0ΝΙΚ révèle 20 la présence des acidës aminés suivants :

Glu = 1,00 (théorie .= 1)

Gly =1,02 (théorie = 1)

Lan - 0,<a>m&rle _ ,j méso Lan = Of37) 25 Une fraction supplémentaire de 90 mg de N2-[N-(ïï-1 auroy 1 L alanyl)-y-I> glutamyl] diamino-2 (mélange L et L), 6 (L)thia-4 pimélamoyl-glycine peut être obtenue de la façon suivante ï s les fractions 3 et 4 sont réunies, concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 50®C et chromato-30 graphiées sur 22 g de gel de silice (ô,04-0,063 mm) contenus dans une colonne de 2,5 cm de diamètre.- On élue avec du méthanol en recueillant des fractions de 5 cm3· On réunit les fractions 7 à 18, les concentre à sec sous pression réduite (20 mm de mercure } / . 2,7 kPa) à 50°C et les sèche sous pression réduite (0,3 mm de / 35 mercure ; 0,04 kPa) à 50°C. //.

46 * · It » ·

Le N^-benzyloxycarbonyl Ai ami no-2 (mélange 3) et L), 6(L) thia-4 pimélamoyl-glycine peut être préparé de la façon suivante s 2 6

On dissout 2 g de N-t .butyloxycarbonyl N -benzyloxy-5 carbonyl diamino-2 (mélange 3) et L), 6(L) thia-4 pimélamoyl-glyci-nate de t.butyle dans 20 cm3 d'une solution anhydre d'acide chlorhydrique 1,65^'N dans l'acide acétique. On agite pendant 2 heures à 20°G. Ensuite, on ajoute au méLaage réactionnel 50 cm3 . d'éther. On obtient un précipité blanc que l'on sépare par fil-10 tration, lave 2 fois par 20 cm3 au total d'éther et sèche sous » pression réduite (0,3 mm de mercure ; 0,04 k?a) à 20°C. On obtient ainsi 1,13 8 de ohlorhydrate de N^-benzyloxycarbonyl diamino-2 (mélange D et L), 6(l) thia-4 pimélamoyl-glycine.

Rf = 0,38 [silioagel j n.butanol - pyridine - acide 15 acétique - eau (50-20-6-24 en volumes)]

Après hydrolyse dans un mélange acide chlorhydrique concentré - acide acétique anhydre ( 1 —1 en volumes) pendant 5 heures à 96°C, l'analyse sur autoanalyseur BIQTRONIK révèle la présence des acides aminés suivants : 20 lan * °’55}(théorie . 1) méso Lan = 0,34j

Gly « 1,00 (théorie » 1) 2 6

Le N -t,butyloxycarbonyl N -benzyloxycarbonyl diamino-2 (mélange B et L), 6(L) thia-4 pimélamoyl-glycinate de t.butyle 25 peut être préparé de la façon suivante :

On ajoute 255 mg de potasse en pastilles dissous dans 9 cm3 d'éthanol anhydre dans une solution de 1,14 8 de N-benzyl-oxycarbonyl L cystéinamide dans 9 cm3 de diméthylformamide.' Cette / solution ainsi obtenue est ajoutée dane une suspension de 1,99 8 30 de N-t .butyloxycarbonyl 0-p. toluène suif onyl L séryl-glycinate de t.butyle dans 9 cm3 d'éthanol. On agite le mélange réactionnel pendant 4 heures à 20°C. On obtient ainsi une solution jaune pâle que l'on concentre à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 fcPa) à 60eC. Le résidu obtenu est trituré dans 50 cm3 d'eau, j 35 conservé à 5°C pendant 46 heures, séparé par filtration, lavé paaiy 47 .

>y 10 cm3 d'eau et séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure ; 0,04 k3?a) à 20°C. On obtient ainsi 2,1 g de N -t .butyloxycarbonyl N^-benzyloxycarbonyl diamino-2 (mélange D et L), 6(L) thia-4 pimélamoyl-glycinate de t.butyle sous forme de poudre blanche· 5 Rf = 0,72 [silicagel ; acétate d'éthyle].

Spectrométrie de masse = M = 554 (théorie = 554)

Après hydrolyse dans un mélange acide chlorhydrique concentré - acide acétique anhydre (1-1 en volumes) pendant 5 heures à 96e0, l'analyse sur autoanalyseur BI0TR0NIK révèle la 10 présence des acides aminés suivants :

Lan = 0,59") , méso Lan = 0,34J ^théorie 58 1)

Gly a 1,00 (théorie a 1) 1

Le N-t.butyloxycarbonyl O-p.toluènesulfonyl L séryl-15 glycinate de t.butyle peut être préparé de la façon suivante :

En 3 minutes, on ajoute par petites portions 3 »09 6 de chlorure de p. toluène suif onyle à une solution refroidie à -6eC de 2,58 g de N-t.. butyloxycarbonyl L séryl-glycinate de t.butyle dans 9 cm3 de pyridine. On maintient le mélange réactionnel pen-20 dant 2 heures à -6°C, ensuite on le verse sur 60 g de glace pilée et conserve le mélange pendant 20 heures à 4*C. Le précipité ainsi obtenu est séparé par filtration, lavé 5 fois par 100 cm3 au total d'eau, séché sous pression réduite (20 mm de mercure) à 20°C et recristallisé dans 100 cm3 d'éthanol. On obtient ainsi 25 2,54 8 de N-t .butyloxycarbonyl O-p.toluènesulfonyl L séryl-glycinate de t.butyle fondant à 180-182°C.

Rf* = 0,91 [[silicagel j acétate d'éthyle]]

Le N-t .butyloxycarbonyl L séryl-glycinate de t.butyle peut être préparé de la façon suivante ï 30 Dans une solution refroidie à 5eC» de 6,16 g de N-t.butyl oxycarbonyl L sérine et de 3»95 8 de glycinate de t.butyle dans 100 cm3 de chlorure de méthylène, on ajoute 6,61 g de dicyolô-; hexylcarbodiimide. On agite le mélange réactionnel pendant 30 minutes à 5°C, puis pendant 18 heures à 20eC environ. Le / i "· · - • 48 • lavé 2 fois par 40 cm3 au total de chlorure de méthylène. Les phases organiques réunies sont lavées successivement 3 fois par 90 cm3 au total d'une solution saturée de bicarbonate de sodium, 2 fois par 60 cm3 au total d'eau, séchées sur sulfate de sodium 5 .et concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 20°C. On obtient ainsi 10,22 g d'huile que l'on chromatographie sur 100 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm) . contenus dans une colonne de 3>4 cm de diamètre. On élue succes-

Isivement avec 500 cm3 d'un mélange cyclohexane - acétate d'éthyle 10 (1-1 en volumej») et 600 cm3 d'un mélange cyclohexane - acétate d'éthyle (1-3 en volumes) en recueillant des fractions de 100 cm3.

* «

Les fractions 5 à 8 sont réunies, concentrées à sec sous pression réduite (20 mm· de mercure ; 2,7 KPa) à 50°0. On obtient ainsi 2,64 g de N-t.butyloxycarbonyl L séryl-glycinate de t.butyle sous • 15 forme d'huile cristallisant lentement.

Rf s 0,68 [silicagel ; acétate d'éthyle] EXEMPLE 5 -

On ajoute 1,3 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à -10°C, de 4» 56 g de N-(U-lauroyl L alanyl)- 9 20 a-D glutamate de t.butyle dans un mélange de 230 cm3 de tétra-hydrofuranne et de 1,4 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 25 minutes à -10eC, puis on ajoute une solution refroidie à 0°C de 3»78 g de chlorhydrate d'acide N2-benzyloxycarbonyl diamino-2 (L), 6 (L,!) thia-4 pimélamique dans 100 cm3 de soude 0,1 N.

25 Le mélange réactionnel est agité pendant 5 minutes à 0°C, puis pendant 18 heures à 20°C environ. On évapore le tétra-hydro fur arme par concentration sous pression réduite (20 mm de - mercure } 2,7 kPa) à 50°C ; le concentrât est acidifié à pi 2 par addition d'environ 15 cm3 d'acide chlorhydrique 1 N. On sépare par 30 décantation l'huile formée dans lemélange réactionnel et la triture dans 200 cm3 d’éther. On obtient un solide amorphe que l'on sépare par filtiration, lave 3 fois avec 600 cm3 au total d'éther. On agite très fortement le produit obtenu dans .100 cm3 d'acétate .

d'éthyle bouillant, puis après refroidissement à 20°C, on ajout^/ > / 49 100 cm3 d’éther» refroidit la suspension à 0°C pendant 1/4-d’heuxe, sépare l’insoluble par filtration. Après lavage avec 100 cm3 d’éther, séchage sous pression réduite (20 mm de mercure $ p 2,7 kPa) à 20°C, on obtient 5,15 8 d’acide N-benzyloxycarbonyl 5 N^-[o^-t .butyl (Ji-lauroyl L alanyl)-Y-D glutamyl] diamino-2 (h), 6(D,l) thia-4 pimélamique ·

Hf e 0,69 [silicagel ; acétate d’éthyle - acide acé-, tique (3-1 en volumes)]

Spectrométrie de masse » M = 779 (théorie = 779) - 10 On dissout 5 8 d’acide N^-benzyloxycarbonyl N^-[0^-t.

.butyl U-OCT-lauroyl L· alanyl)-Y-2) glutamyl] diamino-2(L), 6(3),L) thia-4*pimélamique dans 30 cm3 d’acide bromhydrique en solution à 28 i» dans l’acide acétique. On agite le mélange réactionnel pendant 3 heures, le filtre pour le débarrasser d’un léger inso-15 lubie et le concentre à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa, puis 0,3 mm de mercure ; 0,04 hPa) à 50°C.

Le résidu ainsi obtenu est trituré dans 400 cm3 d’éther, séparé par filtration et repris dans 1,5 litre d’eau sous forte agitation; il se solubilise instantanément dans l’eau, puis au bout de 20 quelques minutes, il précipite. On le sépare par filtration, le lave successivement avec 50 cm3 d’eau, 50 cm3 d’éther, 50 cm3 d’acétate d’éthyle et 50 cm3 d’éther et le sèche sous pression réduite (0,3 mm de mercure ; 0,04 kPa) à 50°C. On obtient ainsi 3,2 g d’acide N^-[ïï-(N-lauroyl L alanyl)-y-3) glutamyl] diamino-2(L), 25 6(3),L) thia-4 pimélamique fondant avec décomposition vers 176°C.

Rf * 0,32 [Silicagel ; n.butanol - pyridine - acide acétique - eau (50-20-6-24 en volumes)]

Analyse ï Cale. # C 52,95 H 8,03 N 11,87 S 5,44 49,7 7,7 11,0 5,1 / 30 Cendres sulfuriques : 3,9 ^ //

I*» B

50 '

Après hydrolyse dans un mélange acide chlorhydrique concentré - acide acétique anhydre (1-1 en volumes) pendant 5 heures à 96°C, l'analyse sur autoanalyseur BI0IR0NIK révèle la présence des acides aminés suivants : 5 Lan = 0,55 (théorie = 0,5) méso Lan a 0,50 (théorie = 0,5)

Glu s 1,00 (théorie =1 )

Le chlorhydrate de l'acide N2-benzyloxycarbonyl diamino-2 (L), 6(D,L) thia-4 pimélamique peut être préparé de la façon .

= 10 suivante : 2 6 - A une solution de. 37 £ d'acide E-benzyloxycarbonyl N -t .butyloxycarbonyl diamino-2 (L), 6(D,L) thia-4 pimélamique dans 100 cm3 d'acide acétique anhydre, on ajoute 500 cm3 d'une solution anhydre d'acide chlorhydrique 1,65 N dans l'acide acétique. On 15 agite pendant 2 heures à une température voisine de 20eC.

Ensuite, on concentré à sec le mélange réactionnel sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa, puis 0,3 mm de mercure ; 0,04 kPa) à 50°C. Le résidu obtenu est trituré 4 fois dans 2 litres au total d'éther, séparé par filtration, lavé 3 fois par 20 600 cm3 au total d'éther et séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure ; 0,04 k-Pa) à 20°C. On obtient ainsi 19,1 g de chlorhydrate de l'acide N2-benzyloxycarbonyl diamino-2(L), 6(D,L) thia-4 pimélamique ·

Rf = 0,48 [silicagel ; n.butanol - pyridine - acide 25 acétique - eau (50-20-6-24 en volumes)] [a]j* = -22,8° (acide chlorhydrique N ; c = 1)

Après hydrolyse dans un mélange acide chlorhydrique . concentré - acide acétique anhydre (l-1 en volumes) pendant 5 heures à 96°C, l'analyse sur autoanalyseur BI0TR0NIK révèle la présence 30 des acides aminés suivants :

Lan a 0,5 (théorie =0,5) méso Lan = 0,5 (théorie =0,5) ; - 2 6- 1'acide E-benzyloxycarbonyl R -t.butyloxycarbonyl / diamino-2(L), 6(D,L) thia-4 pimélamique peut être préparé de laf1 / 35 façon suivante : / Jf 51

H

« * >4 s

On ajoute 16,8 g de potasse en pastilles dissous dans 190 cm3 d’éthanol anhydre dans une solution de 25»5 g de N-benzyl-oxycarbonyl L cystéine dans 190 cm3 de diméthylformamide. A la solution ainsi obtenue, on ajoute 35»8 g de N-t.butyloxycarbonyl 5 0-p.toluènesulfonyl LL sérinamide dissous dans 190 cm3 de diméthylf ormamide · On agite le mélange réactionnel pendant 18 heures à 20°C ; ensuite on le concentre à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa, puis 0,3 mm de mercure ; 0,04 kPa) à 60°C. Le résidu ainsi obtenu est repris par 250 cm3 5 10 d’eau, extrait 3 fois-par 600 cm3 au total d’acétate d'éthyle:,*, -acidifié à pH 3 par environ 48 g d'acide citrique, La phase aqueuse ainsi obtenue est extraite 3 fois par 600 cm3 au total • d'acétate d'éthyle. Les phases organiques réunies sont lavées par 100 cm3 d'une solution saturée de chlorure de sodium» séchées sur 15 sulfate de sodium et concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2*,7 kPa) à 50°C. On obtient ainsi 37 g d’acide N2-benzyloxycarbonyl N^-t.butyloxycarbonyl diamino-2(L), 6(D,L) thia-4 pimélamique sous forme d'huile orangée,

Rf = 0,49 [silicagel j acétate d'éthyle - acide acé-20 tique (9-1 ©a volumes)]

Rf ss 0,52 [silicagel ; n.butanol - pyridine - acide acétique -eau (50-20-6-24 en volumes)

Le N-benzyloxycarbonyl L cystéine peut être préparé selon la méthode de V. FOYE et coll·, J, Am. Pharm, Ass, 46, 25 273 (1957).

Le N-t .butyloxycarbonyl 0-p. toluène suif onyl LL séri-namide peut être préparé de la façon suivante :

En 20 minutes, on ajoute par petites portions 67,5 g de chlorure de p. toluène suif onyle à une solution refroidie entre 30 -20°C et -10°C de 67 g N-t .butyloxycarbonyl LL sérinamide dans 280 cm3 de pyridine. On maintient le mélange réactionnel pendant 1 heure 1/2 à une température comprise entre -10°C et -5°C, puis on l'abandonne à 20°0 pendant 2 heures 1/2. On le verse ensuite / sur 550 g d'un mélange eau-glace. Le précipité blanc ainsi obtepft/ 52 • y % « 9 *Λ I est séparé par filtration, lavé 4 fois par 1,2 litre au total I d'eau, séché à l'air, lavé 2 fois par 400 cm3 au total d'éther et séché sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 k3?a) à 50°C. On obtient ainsi 73,3 g de N-t.butyloxycarbonyl 0-p.toluène-5 sulfonyl DL sérinamide fondant à 161°C.

Ef = 0,82 [Silicagel ; acétate d'éthyle - acide acétique (9-1 en volumes)]

Le N-t .butyloxycarbonyl SL sérinamide peut être préparé de la façon suivante ï 10 * Dans une solution’de 217 g de N-t.butyloxycarbonyl DL· sérinate de méthyle dans 2,'17 litres de méthanol, refroidie à 0°C, on fait passer un courant d'ammoniac pendant 7 heures ; on laisse ensuite le mélange réactionnel au repos pendant 13. heures à 20°C, puis de nouveau après avoir refroidi vers 0°C, on fait 13 passer un courant d'çmmoniac pendant 6 heures et on laisse au repos à 20°G pendant 18 heures. On concentre le mélange réactionnel sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kEa) à 30°C.

Le résidu ainsi obtenu est repris par 1,3 litre d'éther, les cristaux obtenus sont séparés par filtration, lavés 3 fois par I 20 1,5 litre au total d'éther et séchés à l'air. On obtient ainsi 158 g de N-t.butyloxycarbonyl DL sérinamide fondant à 115-116°C.

Le N-t.butyloxycarbonyl DL· sérinate de méthyle peut être préparé selon la méthode de N. BOGGS et coli., J. Org. Chem., M> 2262 (1979).

25 EXEMPLE 6 - , On ajoute 0,28 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une 'solution, maintenue à -10°C, de 382 mg de N-t.butyloxycarbonyl ; 9 glycine dans un mélange de 32 cm3 de tétrahydrofuranne et de 0,3 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes 30 à -10eC, puis on ajoute une solution refroidie à 0°0 de 1,28 g j d'acide N^-[N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] diamino-2(L), 6(D,L) thia-4 pimélamique dans un mélange de 4>54 om3 de soude 1 N et 32 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant / 5 minutes à 0°C, puis pendant 70 heures à 20°C environ. On évaporé/

V

53 » * • « le t ét r ahy dr o fur arme par concentration sous pression réduite (20 sim de mercure ; 2,7 kPa) à 50°C, le concentrât est acidifié à pH 2 par addition d'environ 5 cm3 d'acide chorhydrique 1 N, extrait 3 fois par 90 cm3 au total d'acétate d'éthyle. les 5 phases organiques réunies sont séchées sur sulfate de sodium et concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 50°0. On obtient ainsi 1,7 g de poudre blanche que l'on chromatographie sur 50 g de gel de silice néutre (0,04-0,0é3 mm) contenus dans une colonne de 2,4 cm de diamètre. On 10 élue successivement avec 120 cm3 d’acétate d'éthyle, 560 cm5 d'un mélange acétate d'éthyle - acide acétique (95-5 en volumes),-. 1,12 litre d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (90-10 en volumes) et 480 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (80-20 en volumes) en recueillant des fractions de 15 40 cm3. les fractions^25 à 57 sont réunies, concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure j 2,7 kPa) à 50e0. Le résidu obtenu est trituré 3 fois dans 90 cm3 au total d'éther, séché sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 50°C.

2 6 r

On obtient 490 mg d'acide N -(t.butyloxycarbonylglycyl) N -[N- 20 (u-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] diamino-2 (l), 6(D,L) thia-4 pimélamique.

Rf * 0,48 [silicagel j n.butanol - pyridine - acide acétique - eau (50-20-6-24 en volumes)]

Rf « 0,24 [silicagel ; acétate d'éthyle- acide 25 acétique (3-1 en volumes)] 0n dissout 490 mg d'acide N -(t.butyloxycarbonylglycyl) N^-[N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] diamino-2(L), 6(D,L) thia-4 pimélamique dans 10 cm3 d'une solution anhydre d'acide chlorhydrique 1,65 N dans l'acide acétique. On agite pendant 30 2 heures 1 /4 à une température voisine de 20°C. Ensuite, le

mélangé réactionnel est filtré pour le débarrasser d'un léger insoluble et est concentré à sec sous pression réduite (20 ma de/ mercure ; 2,7 hPa) à 50°C. Le résidu ainsi obtenu est trituré' A

54 » * % • · dans 50 cm3 d'acétate d'éthyle, séparé par filtration, lavé 3 fois par 150 cm3 au total d'éther. On obtient ainsi 0,42 g fie poudre blanche que l'on chromatographie sur 24 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm) contenus dans une colonne de 1,6 cm de diamètre.

5 On élue avec de l'acide acétique en recueillant des fractions de 10 cm3. Les fractions 24 à 45 sont réunies, concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 45°C. Le résidu obtenu est trituré dans 50 cm3 d'acétate d'éthyle, séparé par filtration, lavé 3 fois par 90 cm3 au total d'éther et séché 10 sous pression réduite (0,3 mm de mercure £rt0,04 kPa) à 50°C. .

On.obtient ainsi 200 mg de chlorhydrate d'acide N^-glycyl ïT-[n-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl) diamino-2(L), 6(D,L) thia-4 pimélamique.

Rf = 0,29 [silicagel ; n.butanol - pyridine - acide 15 acétique - eau (50-20-6-24 en volumes)]

Analyse î Cale, fo C 49,22 H 7,62 Cl 5,19 N 12,30 S 4,69

Tr. 45,6 7,5 4,6 11,5 4,6

Spectrométrie de masse î M = 646 (théorie pour la base = 646).

20 Après hydrolyse dans un mélange acide chlorhydrique concentré - acide acétique anhydre (1-1 en volumes) pendant 5 heures à 96°C, l'analyse sur autoanalyseur BI0TR0NIK révèle la présence des acides aminés suivants s

Lan =*0,59 (théorie = 0,5) 25 méso Lan = 0,43 (théorie = 0,5)

Glu =0,97 (théorie = 1 )

Gly = 1,00 (théorie =1 ) s EXEMPLE 7 - , On ajoute 0,65 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une JO solution, maintenue à -10°C, de 2,28 g de N-(N-lauroyl L ala- nyü)-a-D glutamate de t.butyle dans un mélange de 125 cm3 de tétrahydrofuranne et de 0,7 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 40 minutes à -10°C, puis on ajoute une solution 2 refroidie à 0°C de 1,9 g de chlorhydrate de N -benzyloxycarbonyl / 35lanthioninediamide dans un mélange de 5 cm3 de soude 1 N et 50 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant 20 minutes// f

1 ' »I

‘ t 55 vers 0°C, puis pendant 70 heures à 20eC environ. Le précipité apparu dans le mélange réactionnel est séparé par filtration, lavé successivement par 25 cmj A*#au, 25 cm3 d’éthanol et 50 cm3 d’oxyde d’isopropyle et séché sou# pression réduite (20 ma de 5 mercure ; 2,7 kPa) à 20°C. On obtient ainsi 2,9 g de N2-[01-t. hutyl N-(N-ïauroyl L alanyl)-y-I) glutamyl] N -benzyloxycarbonyl L lanthioninediamide.

fif = 0,41 [Silicagel ; acétate d’éthyle - acide acétique ^ (9-1 en volumes)] - 10 On dissout 4,4 g de Ν2-|θ -^t.hutyl N-(N-lauroyl L ala- .

nyl)—γ-Ρ glutamyl] B —henzyloxycarhonyl L lanthioninediamide dans 44 cm3 d’acide bromhydrique en solution à 35 dans l’acide acétique. On agite le mélange réactionnel pendant 4 heures à 20°C, ensuite on le purge pendant 1/2 heure avec de l’azote et on le 15 concentre à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 hPa) à 50eC. Le résidu ainsi obtenu e*t trituré dans 50 cm3 d’oxyde d’isopropyle et séparé par filtration. Cette opération est répétée 2 fois, puis on agite le solide laus 50 cm3 d’acétone pendant une heure, le sépare par filtration, le lave 2 fois par 10 cm3 20 au total d’acétone et le sèche s?us pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 20°C. On obtient ainsi 3,24 g de bromhydrate de N2-[N-(N-lauroyl L alanyl)-y-3 glutamyl] L lanthioninediamide sous forme de poudre crème.

Ef s 0,47 [ silicagel ; n.butanol - pyridine - acide 25 acétique - eau (50-20-$"24 en volumes)]

Analyse s Cale. £ C 46,63 H 7,3β Br 11,93 N 12,55 S 4,79

Tr. fè 42,0 7,? 1-0,1 11,1 4,4 , Après hydrolyse dans Φ mélange acide chlorhydrique concentré - acide acétique anhy^e (l-1 en volumes) pendant 50 5 heures à 96°C, l’analyse sur iûtôanalyseur BIOTBONIK révèle la présence des acides aminés suivants :

Glu = 0,87 /théorie = 1)

Lan ss 0,88 théorie = 1) méso Lan = 0,12 théorie = 0) 2 - / 35 Le chlorhydrate de U'henzyloxycarhonyl L lanthionine*./

Ai ami de peut ftre préparé de la façon suivante : / Jr : ·» > * * i 56 2 6

On dissout 9*56 g de N -benzyloxycarbonyl H -t.butyloxy- carbonyl L· lanthioninediand.de dans 190 cm3 d'une solution anhydre d'acide chlorhydrique 1,7 N dans l'acide acétique.· On agite le mélange réactionnel pendant 1 heure à 20°C, le purge pendant 5 1/2 heure avec un courant d'azote et le verse sur 950 cm3 d'oxyde d'isopropyle. Après 1 heure 1/2 d'agitation, on sépare le précipité blanc apparu par filtration, le lave 2 fois par 200 cm5 au total d'oxyde d'isopropyle et le sèche sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 20°C. On obtient ainsi 7,93 g de 10 chlorhydrate de N^-benzyloxycarbonyl L· lanthioninediamide · 2 6

Le N -benzyloxycarbonyl N -t.butyloxycarbonyl L· lanthio- » . ninediamide peut être préparé de la façon suivante :

On ajoute 14,4 cm3rde chloroformiate d'isobutyle dans 2 une solution, maintenue à -10°C, de 27,7 S de N -benzyloxycarbonyl g 15 N -t.butyloxycarbonyl L lanthionine dans 480 cm3 de tétrahydro-furanne et 13,5 cm3 de triéthylamine· La solution est agitée pendant 20 minutes à -10°C, puis on fait passer un courant d'ammoniac dans le mélange réactionnel pendant environ 3 heures vers -10°C. On concentre à sec le mélange réactionnel sous pression 20 réduite (20 mm de mercure ; '2,7 kPa) à 45°0. Le résidu pâteux est repris par un mélange de 500 cm3 de solution aqueuse à 7 % de carbonate de potassium et 230 cm3 d'acétate d'éthyle. L'insoluble est séparé par filtration, la phase organique est séparée par décantation, la phase aqueuse est extraite par 30 cm3 d'acétate 25 d'éthyle. Les phases organiques réunies sont lavées 3 fois par 130 cm3 au total d'eau, séchées sur sulfate de sodium et concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 45°0.

•s

Le résidu obtenu est agité pendant 1/2 heure dans 30 cm3 d'oxyde , d'isopropyle, séparé par filtration, lavé 2 fois par 50 cm3 30 au total d'oxyde d'isopropyle et séché sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 20°C. On obtient ainsi 9,1 g de 2 6 N -benzyloxycarbonyl N -t.butyloxycarbonyl L lanthioninediamide fondant à 120°C.

S Rf = 0,61 [silicagel ; acétate d'éthyle - acide'acé- / ’ 55 tique (9-1 en volumes)] /r

T

57 » » % • « 2 6

Le N-benzyloxycarbonyl N -t .butyloxycarbonyl L· lanthio- nine peut être préparé de la façon suivante ï 2 A une suspension de 16,5 B de N -benzyloxycarbonyl L lanthionine et de 10,2 g de carbonate de sodium dans un mélange 5 de 100 cm3 d'eau et 300 cm3 de dioxanne, on ajoute 11,6 g de -** .carbonate de di t.butyle en solution dans 100 cm3 de dioxanne.

Le mélange réactionnel est agité pendant 69 heures à une température voisine de 20eC· L'insoluble est séparé par filtration et le dioxanne du filtrat est éliminé par concentration sous pression 10 réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 45°C. A la solution aqueuse . * résiduelle, on ajoute 150 cm3 d'une solution'saturée d'acide a citrique et 150 cm3 d'acétate d'éthyle. La phase organique est séparée par décantation puis la phase aqueuse est extraite 2 fois par 150 cm3 au total d'acétate d'éthyle. Les phases organiques sont v 15 réunies, lavées par 100 cm3 d'eau, séchées sur sulfate de sodium-et concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 £Pa) à 45eC.' On obtient ainsi 27,7 B de N^-benzyloxycarbonyl N^-t.butyloxycarbonyl L lanthionine sous forme d'huile jaune.

EXEMPLE 8 - 20 On ajoute 0,4 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution maintenue à -8e0, de 1,41 g de N-(N-lauroyl L alanyl)- OC-D glutamate de t.butyle dans un mélange de 67 cm3 de tétrahydro- furanne et de 0,43 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 25 minutes à -7°0, puis on ajoute une solution refroidie 7 25 à 0°C de 1,1 g d’acide N -benzyloxycarbonyl L,L diamino-2,7 thia-4 subéramique dans un mélange de 3» 1 cm3 de soude 1N et - 27 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant 10 minutes , à -.7eC, puis pendant 20 heures à 20°C environ. Ensuite, il est concentré à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) 30 à 45°C. Le réeidu obtenu est dissous dans JO cm3 d*'eau, acidifié à pH‘ 2 par addition de Jf8 cm3 d'acide chlorhydrique 1 N. Le précipité formé est séparé par filtration, lavé 2 fois par - > 100 cm3 au total d'eau et séché sous pression réduite (20 mm de mercure:.; 2,7 kPa, puis 0,3 mm de mercure ; 0,04 kPa) à 20°O. On 35 obtient ainsi 2,9 S de poudré que l'on chromatographie but 90 8 f de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm) contehus dans une colonxufV de 2,5 cm de diamètre. Pour cela, on dissout les 2,9 g de poudre/' ' 5ö ft t i dans .un mélange de 30 cm3 d’acide acétique et 15 cm3 d’acétate d'éthyle et à la solution obtenue, on ajoute 9 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On évapore à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 50°C et le 5 résidu ainsi obtenu est chargé sur la colonne de silice. On élue avec 2,9 litres d'un mélange acétate d'éthyle - acide acétique (95-5 en volumes) en recueillant des fractions de 50 cm3. Les fractions 17 à, 55 sont réunies, concentrées à sec sous pression · \ réduite (20 mm de mercure ; 2*7 kPa,) à 50°C. Le résidu obtenu est r 10 trituré dans 100 cm3 d'éther, séparé par filtration, lavé 2 fois } par 10, cm3 au total d'éther et séché sous pression réduite (20 mm ide mercure s 2,7 kPa) à 20°0. On obtient ainsi 1/2 g d'acide , N^-[0^ -t .butyl N-(lî-lauroyl L alanyl)-y-I) glutamyl] N^-benzylory- carbonyl L,L diamino-2,7 thia-4 subéramique.

15 If s 0,59’ [Silicagel ; acétate d’éthyle - acide acétique (4-1 en volumes)]

On dissout 1,2 g d'acide N^-[0^-t.butyl N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl]N^-benzylozycarbonyl L,L-diamino->2,7 thia-4 subéramique dans 12 cm3 d'acide bromhydrique en solution à 20 35 i° dans l'acide acétique. On agite le mélange réactionnel pen- dant 2 heures à 20°C, le concentre à sec sous pression réduite H (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 50°C, le reprend par 20 cm3 d'acétate d'éthyle, le concentre à. nouveau à sec sous pression réduite H (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 50°C, le triture dans un mélange de H 25 100 cm3 d’éther et 10 cm3 d'acétate d'éthyle, le sépare par I " filtration et le lave 4 fois par 80 cm3 au total d'éther. Après H séchage sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 20°C, 9 on obtient 950 mg de poudre brune que l'on chromatographie sur 40 g

Ide gel de silice neutre (0,04-0,063 mm) contenus dans une colonne 30 de 2 cm de diamètre. Pour cela, on dissout les 950 mg de poudre dans un mélange de 30 cm3 de méthanol et 0,4 cm3 d'ammoniaque concentré (d = 0,92) et à la solution obtenue, on ajoute 3 g de gel de silice.neutre(0,04-0,Ο63 mm). On évapore à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure $ 2,7 kPa) à 50eC et le / 35 résidu ainsi obtenu est chargé sur la colonne de silice. On élui 59 ' » • * . . - successivement avec 260 cm3 d'un mélange n.butanol - acide acétique (4-1 en volumes) et 320 cm3 de méthanol en recueillant des fractions de 20 cm3. les fractions 14 à 29 sont réunies, concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) 5 à, 55eC. le résidu obtenu est trituré dans 100 cm3 d’éther, séparé par filtration, lavé 3 fois par 60 cm3 au total d’éther et séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure ; 0,04 kPa) à 50°C. On obtient ainsi 450 mg d'acide E^-[N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] L,L diamino-2,7 thia-4 subéramique.

10 Rf =? 0,33 [silicagel ; n.butanol - pyridine - acide acétique - eau (50-20-6-24 en volumes)] épectrométrie de masse : M * 603 (théorie = 603)

Analyse s Cale. % C 53,71 H 8,18 N 11,60 S 5,31 Tr. £ 49,5 7,6 10,3 4,93 15 * L'acide N'-benzyloxycarbonyl diamino-2(h), 7(L) thia-4 subéramique peut .être préparé de la façon suivante ï » A une solution refroidie à -40°C de 720 mg de L cystine dans 90 cm3 d’ammoniac, on ajoute du sodium jusqu'à ce que l'on ait une solution bleue persistante* (environ 36Ο mg de sodium). Ensuite, 20 on ajoute successivement quelques mg de chlorure d'ammonium pour décolorer le milieu réactionnel et 2 g de N-benzyloxycarbonyl L oc-aminofy-bromobutyrate de méthyle. On agite le mélange réactionnel pendant I./4 d'heure à -35°C, puis on y ajoute 25 5M3 de méthanol refroidi vers -35°0 et on l'abandonne pendant 18 heures 25 à 20eC. On le concentre à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45eC. le résidu obtenu est dissous dans 50 cm3 d'eau.

Cette solution est acidifiée à pH 5-6 par addition de 6,5 cm3 d'acide acétique 1 N. Le précipité formé est séparé par filtration, lavé 3 fois par 60 cm3 au total d'eau et séché sous pression * 30 réduite (0,3 mm de mercure) à 20°C. On obtient ainsi 600 mg d'acide -benzyloxycarbonyl diamino-2(L), 7 (l) thia-4 subéramique fondant à 240-244°C.

Ef =*0,40 [silicagel 5 n.butanol - pyridine - acide acétique - eau (50-20-6-24 en volume^)] 35 - Spectrométrie de masse : M = 355 (théorie = ,355)

Un deuxième jet de 600 mg d'acide N'-benzyloxycarbonyl diamino-2(L), 7(L) thia-4 subéramique peut être obtenu da la / 1 y» / • façon suivante : le filtrat obtenu ci-dessus est concentré à 5 cm4/ (60 sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 KPa) à 50° C. Le précipité apparu dans le concentrât est séparé par filtration, lavé 2 fois par 4 cm3 au total d'eau et séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure ; 0,04 kPa) à 20°C.

5 Le N-benzyloxycarbonyl L a-amino γ-hromobutyrate de méthyle peut être préparé selon la méthode de Z. PEOCHAZKA et colÎL., Coll. Czech. Chem. Commun. 1982 (1980)· EXEMPLE 9

On ajoute 2,64 cm3 de chloroformiate d'isohutyle à une 10 solution, maintenue à -5°C, de 8 g de N-('N-lauroyl L alanyl) L isoglutamine dans un mélange de 200 cm3 de tétrahyârofuranne, de 400 cmj de diméthylformamide et de 2,8 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à -5°C, puis on ajoute une solution refroidie à 59C de 7»56 g de chlorhydrate d'acide N2-hen-15 z.yloxycarbonyl diamirto-2(L), 6(D,L) thia-4 pimélamique dans un mélange de 20 cm3 de soude H et de 80 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant quelques minutes vers 0°C, puis pendant 18 heures à 20°C environ. Ensuite, le tétrahydrofuranne est éliminé par concentration sous pression réduite (20 .mm de 20 mercure ; 2,7 kPa) à 50°C. Le concentrât est débarrassé d'un léger insoluble par filtration et dilué par 2 litres d'eau et 45 cm3 d'acide chlorhydrique N. Le précipité formé est séparé par filtration, lavé 2 fois par 4°0 cm3 au total d'eau et séché à l'air libre. On obtient ainsi 16,1 g de poudre crème que l'on chromato-25 graphie sur 450 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm) contenus dans une colonne-de 5 cm de diamètre. Pour cela, on dissout les 16,1 g de poudre dans 100 cm3 d'acétate d'éthyle tiédi à 50°C et à la solution obtenue, on ajoute 30 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On évapore à sec le mélange sous pression réduite 30 (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 50°C et le résidu ainsi_obtenu est chargé sur la colonne de silice. On élue successivement avec

1,5 litre d'un mélange acétate d'éthyle - acide acétique (1-1 en volumes), 750 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle - acide acé- , tique (4-6 en volumes) et 750 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle 35 acide acétique (.3-? en volumes) en recueillant des fractions d)S M

? I I *' • » 61 50 cm3. Les fractions 20 à 60 sont réunies, concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 lcPa) à 50*0. Le résidu obtenu est trituré dans 500 cm3 d'acétate d'éthyle, séparé par filtration et lavé par de l'éther. On obtient ainsi 7,1 g 5 d'acide N^-[N-(N-lauroyl L alanyl) L isoglutaminyl] N^-benzylory-carbonyl diamino-2(L), 6 (D,L) thia-4 pimélamique.

Ef = 0,24 [silicagel j acétate d'éthyle - acide acétique (7-5 eu volumes)].

On dissout 7 g d'acide N^-[N-(N-lauroyl L alanyl) 10 3) isoglutaminyl] N^-benzyloxycarbonyl diamino-2(L), 6(L,L) thia-4 pimélamique dans un mélange de 50 cm3 d'acide bromhydrique en solution à 35 $ dans l'acide acétique et de 50 cm3 d'acide acétique. On agite le mélange réactionnel pendant 1 heure à 20°C, le concentre à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 15 2,7 kPa) à 45°Ci Le résidu obtenu est trituré dans 100 cm3 d'acétate d'éthyle, séparé par filtration, lavé 2 fois par . 100 cm3 au total d'acétate d'éthyle ety3 fois par 150 3m3 au total d'éther. Après séchage sous pression réduite (0,3 mm de mercure ; 0,04 £Pa) à 20°C, on obtient 8,14 g de poudre rose que 20 l'on dissout dans 500 cm3 d'eau. Après 1/2 heure d'agitation, le prépipité apparu est séparé par filtration, lavé successivement 2-fois par 100 cm3 au total d'eau, 5 fois par 250 cm3 au total d'éther et séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure ; 0;04 kPa) à 20eC. On obtient ainsi 5,47 g d'acide N^-[N-(N-lauroyl 25 L alanyl) 3) isoglutaminyl] diamino-2(L), 6 (L,L) thia-4 pimélamique .

Ef « 0,39 [silicagel ; n.butanol - pyridine - acide acétique - eau (50-20-6-24 en volumes)].

Spectrométrie de massé : M = 588 (théorie * 588) 30 Analyse : Cale. % 0 53,04 H 8,22 N 14,27 S 5,45 Tr. $> 50,0 8,1 13,1 5,0

Le N-lauroyl L· alanyl-D isoglutamine peut être préparé de la façon suivante : ’ ‘ -

On dissout 6,6 g de N-lauroyl L alanyl-D isoglutaminate 35 de benzyle dans 330 cm3 d'acide acétique. On ajoute 6,6 g de palladium sur noir (à 3 $ de palladium) puis on fait passer un / lent courant d'hydrogène pendant 2 heures. Après filtration du/7/ 62 i " · il · mélange réactionnel, on verse le filtrat dans 3 litres d'eau.

Après 2 heures de repos à 0°C, le précipité apparu est séparé par filtration, lavé 2 fois par 80 cm3 au total d'eau, puis séché.

On obtient ainsi 5»16 g de produit auquel on ajoute 0,5 g d'un 5 produit obtenu dans des conditions analogues. Ce mélange est dissous dans 5? cm3 de méthaaol bouillant et à la solution obtenue on ajoute 45 cm3 d'eau. Après 2 heures de repos à une température voisine de 20°C, les cristaux apparus sont séparés par filtration, lavés 2 fois par 60 cm3 au total d'eau et séchés 110 sous pression'réduite (20 mm de mercure ; 2,7 fcPa). On obtient ainsi 5» 1 g de N-lauroyl L alanyl-L isoglutamine fondant à 163°C.

_Rf = 0,18 [-silicagel ; acétate d'éthyle - méthanol . „ _ (4-1 en volumes)]

Analyse : Cale. $ = C 60,12 H 9,33 H 10,52 15 Tr. = 60,2 9,5 10,9

Le N-lauroyl L alanyl-L isoglutaminate" de benzyle peut être préparé de la façon suivante :

On ajoute 2,54 cm3 de chloroformiate d’isobutyle dans une solution, maintenue à 0°C, de 3,9 g d'acide laurique dans 20 156 cm3 de toluène anhydre et 2,7 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à 0°C, puis on ajoute une solution, refroidie à 0°C, de 6,7 g de chlorhydrate de L alanyl-L isogluta-minate de benzyle dans 52 cm3 d'eau et 2,7 cm3 de triéthylamine.

I' Le mélange réactionnel est agité pendant 65 heures à une tempé- 25 rature voisine de 20°C. On obtient une masse réactionnelle d'aspect gélatineux à laquelle on ajoute 150 cm3 d'acétate d'éthyle. Le précipité est séparé par filtration, lavé par 30 cm3 d'eau puis séché. On obtient 7,6 g de N-lauroyl L alanyl-L isoglutaminate de benzyle sous forme d'une poudre blanche* La phase aqueuse du 30 filtrat précédent est extraite 2 fois par 100 cm3 au total d'acétate d'éthyle, cette phase acétate d'éthyle est réunie avec I la .phase organique du filtrat, lavée par 125 cm3 d'acide chlor hydrique 0,1 N, 120 cm3 d'eau, séchée sur. sulfate de magnésium puis concentrée à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) 35 à. 50°C. On obtient à nouveau 1,5 g de N-lauroyl L alanyl-L iso- / glutaminate de benzyle. Le produit (.7,6 g et 1,5 g)est /y 63

1 ' I

i t recristalliaé dans 120 cm3 de méthanol. On obtient ainsi 6,6 g de IF-lauroyl L alanyl-B isoglutaminate de benzyle fondant à 169°C.

Rf - 0,13 [silicagel ; acétate d'éthyle]

Le chlorhydrate de L alanyl-B isoglutaminate de benzyle 5 peut être préparé selon le procédé de S. KiïSUMOŒO, Bull. Chem.

Soc. Japon £2» 533 (1976).

EXEMPLE 10 -

En opérant comme à l'exemple 2, mais à partir de N-(N- lauroyl L alanyl}' a-B glutamate de t.butyle et d'acide N^-benzyl- 10 oxycarbonyl L,L diamino-2,6 thia-4 pimélamique, on obtient l'acide - - N^-[n-(N-lauroyl 1 alanyl)-γ-D glutanyl] L,L diamino-2,6 thia-4 pimélamique qui, en opérant des les conditions de l'exemple 3» fournit l'acide N^-[U-(N-lauroyl L alanyl)-γ-Β glutamyl] N^-glycyl L,L diamino-2,6 thia-4 pimélamique.

15 L'acide N^-bfenzyloxycarbdnji L,L diamino-2^6 thia-4 pimélamique peut être préparé de la façon suivante : A une solution de 3 cm3 d'éthanol et 0,33 om3 de soude . 4 R» on ajoute 25Q mg de chlorhydrate de N^-benzyloxycarbonyl L,L diamino-2,6 thia-4 pimélamate dé méthyle. On agite le mélange 20 réactionnel pendant 1 heure 1/4 ; ensuite, on ajoute 0,65 cm3 d'acide chlorhydrique N et 3 cm3 d'eau pour amener le pH à la neutralité. Après 2 heures de repos 1 20eC, le précipité apparu est séparé par filtration, lavé successivement par 2 cm3 d'éthanol et 2 cm3 d'acétone et séché sous pression réduite (20 mm de 25 mercure ; 2,7 3cPa) à 20°C. On obtient ainsi 60 mg d'acide 6 N -benzyloxycarbonyl L,L diamino-2,6 thia-4 pimélamique.

Rf * 0,53 [silicagel ; n.ïutanol - pyridine - acide acétique - eau (50-20-6-2* en volumes)]

Spectrométrie de masse ï ï. = 341 (théorie = 341 ) 30 Le N^-benzyloxycarbonyl L,L diamino-2,6 thia-4 pimélamate de méthyle peut être préparé de la façon suivante : 2 6 A une solution de 1,4 g dt N -trityl N -benzyloxycarbonyl L,L diamino-2,,6 thia-4 pimélamate à* méthyle dans 6 cm3 d'acétone-, on ajoute 0,25 cm3 d'acide chlorhydrique concentré (d = 1,19) et / 35 on agite pendant 2 minutes. Ensuite* on ajoute 12 cm3 d'oxyde // V.

64 » t % • * d'isopropyle. L’huile relarguée est séparée par décantation, dissoute* dans 5 cm3 d'acétone et relarguée par addition de 20 cm3 d'ozyde d'isopropyle. Cette huile, séparée par décantation est redissoute dans 5 cm3 de méthanol. Â cette solution, on ajoute de 5 l'acétate d'éthyle jusqu'à ce que l'on obtienne un louche persistant. Le précipité ainsi formé, est séparé par filtration, lavé 2 fois par 10 cm3.au total d'acétate d'éthyle et séché sous pression réduite (20 mm de mercure } 2,7 kPa) à 20°C. On obtient ainsi 400 mg de chlorhydrate de-H -benzyloxycarbonyl L,L diamino-10 2,6 thia-4 pimélamate de méthyle.

Ef - 0,70 [silicagel ; n.butanol-- pyridine - acide acétique - eau (50-20-6-24 en volumes)]

Spectrométrie de masse : M » 355 (théorie = 355)

Le N -trityl N-b enzylozycarbonyl L,L diamino-2,6 thia-4 15 pimélamate de méthyle peut être préparé de la façon suivante î

On ajoute Q,56 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution maintenue à -6°C, de 2,6 g d'acide 0 -méthyl N -trityl N^-benzylorycarbonyl L,L diamino-2,6 thia-4 pimélique dans un mélange de 26 cm3 de chloroforme et de 0,6 cm3 de triéthylamine· 20 Le mélange est agité pendant 20 minutes vers -6°C, puis on ajoute une solution refroidie à 0°C de cm3 de chloroforme ammoniacal (l,4 N). Le mélange réactionnel est agité pendant 1 heure vers 0eC, puis pendant 25 heures à 20°C environ, puis lavé par 50 cm3 d'eau et séché sur sulfate de sodium. Après concentration à sec sous 25 pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 40eC, on obtient

- 2 A

2,9 g. de N -trityl K -benzyloxycarbonyl L,L diamino-2,6 thia-4 pimélamate de méthyle sous forme d'huile jaune.

Ef = 0,82 [silicagel ; n*butanol - pyridine - acide ,. acétique - eau (50-20-6-24 en volumes)] 1 26

30 * L'acide 0 - méthyl N -trityl H -benzyloxycarbonyl L,L

diamino-2,6 thia-4 pimélique peut être préparé selon la méthode de I. PHOTAKl et coli., J.C.S. ΡΕΒΣΙΝ I 2599 (1979). / / 65

' 1 I

* » EXEMPLE 11 -

On ajoute 0,91 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une *#· * solution maintenue à -7°G, de 3»43 g à© E-(lî-lauroyl L alanyl) a-L glutamate de benzyle dans un mélange de 140 cm3 de tétra-5 hydrofuranne et de 0,98 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à -7eC, puis on ajoute une solution refroidie à 2°C de 2,64 g de chlorhydrate d'acide N^-benzyloxycarbonyl L,L diamino-2,6 thia-4 pimélamique dans un mélange de 14 om3 de soude N et 53 cm3 d'eau, 10 Le mélange réactionnel est agité pendant 2 minutes à -5°C, puis pendant 20 heures à 20°C environ. Le mélange réactionnel est « - · acidifié "par addition de 5 cm3 d'acide chlorhydrique-4If· On évapore le tétrahydrofuranne ^.ar concentration sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 50°C. Le concentrât est extrait 15 5 fois par 300 cm3 au total d'acétate, d'éthyle. Les phases orga niques réunies sont lavées par 20 cm3 d'eau, et 20 cm3 d'une solution saturée de chlorure de podium, et concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 50°C. On obtient ainsi 5»58 g d'une poudre blanche que l'on' chromatographie sur 100 g de gel de 20 silice neutre (0,04-0,063 mm) contenus dans une colonne de 2,5 cm de diamètre. Four cela, on dissout les 5*58 g de poudre dans 50 cm3 d'acide acétique et à la solution obtenue, on ajoute 15 g de gel de silice neutre (0,04-0,065 mm). On évapore à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure) à 5°°C et le résidu ainsi 25 ' obtenu est chargé sur la colonne de silice. On élue successivement avec 360 cm3 d'acétate d'éthyle, 360 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (98-2 en volumes),. 3^0 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (95-5 en volumes), et 880 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (90-10 en volumes) en 50 recueillant des fractions de 40 cm3. Les fractions 27 à 49 sont g yicpa) réunies, concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure;/ à 50eC. Le résidu huileux obtenu est trituré dans un mélange de 45 cm3 d'éther et 15 cm3 d'éther de pétrole, séparé par filtration et séché. On obtient ainsi 2,52 g d'acide H^-[0^-benzyl N-(N-lauroyl 35 L alanyl)-γ-L glutamyl] N^-benzyloxycarbonyl L,L diamino-2,6 thia-4 pimélamique. /

Rf = 0,50 [silicagel; acétate d'éthyle-acide acétique/ (9-1 en volumes)] /Jf 66 *

» * I

• »

On dissout 2,5 g d'acide Ν^-[θ^ -benzyl N-(N-lauroyl • If alanyl)-γ-L glutamyl] N^-benzyloxycarbonyl L,L diamino-2,6 thia-4 pimélamique dans un mélange de 7 cm3 de méthanol et 6,75 cm3 de soude IN.

5 On agite le mélange réactionnel pendant 80 minutes.

On élimine un léger insoluble par filtration. Au filtrat, on ajoute 10 cm3 d'eau et on acidifie par addition de 8 cm3 d'acide chlorhydrique 1N. Il se forme un précipité huileux. On extrait l'ensemble 4 fois avec 80 cm3 au total d'acétate d'éthyle. Les 10 phases -organiques réunies sont lavées par 3 cm3 d'eau, séchées sur sulfate de sodium et concentrées à sec sous pression réduite-(20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à~50°0. On obtient ainsi une huile que l'on triture dans 50 cm3 d'éther, sépare par filtration et sèche sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 fcPa) à 20°C.

15 On obtient ainsi 2,18 g d'acide N^-[N-(N-lauroyl L alaayl)-y-]) glutamyl] N^-benzyloxycarbonyl L,L diamino-2,6 thia-4 pimélamique.

Ef = 0,47 [Silicagel ; n.butanol-pyridine-acide açétique-eau (50-20-6-24 en volumes)].

Spectre de masse ? M » 723 ^théorie * 723) 20 On dissout 2,13 g d'acide N -[N-(N-lauroyl L alanyl)- γ-L glutamyl] N -benzyloxycarbonyl L,L diamino-2,6 thia-4 pimélamique dans un mélange de 8,5 cm3 d'acide bromhydrique en solution à 33 $ dans l'acide* acétique et 8,5 cm3 d'acide acétique.

On agite lemélange réactionnel pendant 2 heures, le concentre à sec 25 sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 50°C. Le résidu ainsi obtenu est trituré dans 100 cm3 d’éther, séparé par filtration et repris dans 600 cm3 d'eau sous forte agitation $ 11 se solubilise instantanément dans l'eau, puis au bout de quelques minutes, il précipite. Après 1 heure, on le sépare par 30 filtration, le lave 5 fois avec 250 cm3 au total d'eau et le sèche sous pression réduite (0,3 mm de mercure ; 0,04 £Pa) à 60e0. On obtient ainsi 1,33 g d'acide N^-[N-(N-lauroyl L alanyl)- / y-L glutamyl] L,L diamino-2,6 thia-4 pimélamique. /y r 67 i l • « ·*>

Ef' = 0,30 [silicagel ; n.butano 1 -pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes)

Ef = 0,43 [silicagel ï acide acétique]

Analyse : Calo. $> C 52,95 H 8,03 N 11,88 S 5,44 5 Tr. 51,1 8,0 11,1 4,8

Spectre de masse : M = 589 (théorie = 589) p L'acide N -benzyloxycarbonyl L,L diamino-2,6 thia-4 pimé- lamique peut être préparé selon l'une des méthodes suivantes. : a) On dissout 5,48 g d'acide N^-benzyloxycarbônyl N^-t.buty- 10 loxycarbonyl L,L diaminor2,6 thia-4 pimélamique dans 50 cm3 d'une . „ __ solution anhydre d'acide chlorhydrique 1,7 N dans l'acide acétique.

On agite pendant 1 heure, puis on ajoute 500 cm3 d'éther anhydre et . on agite pendant 3/4 d'heure. Le précipité qui s'est formé est séparé par filtration, lavé 2 fois par 60 cm3 au total d’éther 15 et séché sous pression «réduite (0,3 mm de mercure ; 0,04 kPa) à 20°C. On obtient ainsi 2,98 g de chlorhydrate de l'acide 2 N -benzyloxycarbonyl L,L diamino-2,6 thia-4 pimélamique.

Ef = 0,47 [silicagel j n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24’ en volumes)] 20 Après hydrolyse, dérivâtisation et chromatographie sur colonne capillaire optiquement active, on obtient î L lanthionine 95,7 9^ (théorie = 1) D lanthionine <0,5 $ (théorie * 0) méso lanthionine 4,3 ^ (théorie = 0) 2 6 25 . L'acide H -benzyloxycarbonyl N -t.butyloxycarbonyl , L,L diamino-2,6 thia-4 pimélamique peut être préparé de la manière suivante : A une solution maintenue vers -75°C de 4 g de di t.butyl-, oxycarbonyl L cystinamide dans 200 cm3 d'ammoniac, on ajoute par 30 petites portions du sodium jusqu'à l'obtention d'une coloration bleue persistante pendant quelques minutes. Ensuite, on ajoute successivement du chlorure d'ammonium jusqu'à décoloration du milieu réactionnel et 4,7 g d'acide L a-benzyloxycarbonylamino ß-chloropropionique · Le mélange réactionnel est abandonné pendant 35 18 heures à 20eC environ. Le solide crème ainsi obtenu est repris . J par 80 cm3 d'eau ; la solution aqueuse est acidifiée à pE 2 par // addition d'une solution saturée d'acide citrique, extraite 5 fois/'

Μ I

• % 6a par ISO cm3 au total d'acétate d'éthyle. Les phases organiques réunies sont lavées avec 20 cm3 d'eau, séchées sur sulfate de '-sodium et concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure $ 2,7 kPa) à 50°G. Ou obtient ainsi 7»5 S d'huile jaune 5 que l'on chromatographie sur 125 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue avec de l'acétate d'éthyle en recueillant des fractions de 40 cm3· Les fractions J à 16 sont réunies, concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure j 2,7 kPa) à 50eC. -L'huile obtenue est dissoute dans 50 cm3 d'acétate 10 d'éthyle, extraite 4 fois par 200 cm3 au total d'une solution déci-noxmale de soude. Les phases aqueuses réunies sont acidifiées à pH 2 par addition d'une solution saturée d'acide citrique, extraites 4 fois par 100 cm3 au total d'acétate d'éthyle; Les phases organiques réunies sont séchées sur sulfate de sodium et 15 concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure- $ 2,7 kPa) à 50°C. On obtient ainsi 2,5 g d'acide N^-benzyloxy-carbonyl H -t.butyloxycarbonyl L,L diamino-2,6 thia-4 pimélamique·

Ef = 0,62 [silicagel ; acétate d'éthyle—acide acétique (9-1 ôn volumes)] Λ 20 Le di 't.butyloxycarbonyl L cystinamide peut être prépare de la manière suivante. :

On ajoute 16,6 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution maintenue à -5°C de 25 g de di t.butyloxycarbonyl L cystine · dans un mélange de 500 cm3 de tétrahydrofuranne et de 15»9 cm3 de 25 triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à -5°C» puis on ajoute 125 cm3 d'une solution de chloroforme ammoniacal 1,4 ^ en 1/4 heure. Ensuite en maintenant la température du mélange réactionnel vers -5°C, on sature pendant 1 /2 heure par un courant de gaz ammoniac anhydre, puis on agite pendant 20 heures à 20°C 3° environ. On ajoute 100 cm3 de tétrahydrofuranne, on filtre l'insoluble, on le lave 6 fois par 2,25 litres au total d'eau, puis par 1 litre d'acétate d'éthyle et sèche à l'air libre. On obtient ainsi 16,98 g de di t.butyloxycarbonyl L cystinamide. / Ef s 0,85 [silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau/

35 (5Ο-2Ο-6-24 en volumes)] /Z

Ef » 0,77 [silicagel ; méthanol]. / // / t '* l 69 k) On ajoute 950 mg de..chlorhydrate d'acide 0^- méthyl N -benzylorycarbonyl L,L diamino-2,6 thia-4 pimélique dans 11 cm3 d'éthanol ammoniacal 2,3 N et la solution obtenue est conservée pendant 70 heures vers 20°C. Ensuite, on élimine un léger inso-5 lubie par filtration et concentre à sec le filtrat sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 50°C. Le résidu obtenu est trituré dans 20 cm3 d'acétone, séparé par filtration et séché sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 20°C. On obtient ainsi 0,18 g d'acide N -benzyloaycarbonyl L,L diamino-2,6 , 10- thia-4 pimélainique.

Ef = 0,62 [silicagel ? n.butanol - pyridine. - acide : acétique - eau (50-20-6-24 en volumes)]

Spectrométrie de masse * M * 341 (théorie = 341) L'acide 0^- méthyl N^-benzylosycarbonyl L,L diamino-2,6 1-5 thia-4 pimélique peut être préparé de la façon suivante ï 1 P - A une solution de 3 g d'acide 0 - méthyl N -trityl ÎT -benzyloxycarbonyl L,L diamino-2,6 thia-4 pimélique dans 13 cm3 d'acétone, on ajoute 0,52 cm3 d'acide chlorhydrique concentré (d « 1,19) et on agite pendant 2 minutes. Ensuite-on verse le 20 mélange réactionnel dans 25 cm3 d'éther. L'huile relarguée est séparée par décantation et triturée dans un mélange de 5 cm3 d'acétone et 25 cm3 d'éther. Le solide blanc formé est séparé-par filtration, dissous dans 5 cm3 de méthanol et précipité à nouveau par addition de 50 cm3 d'acétate d*éthyle et 25 cm3 d'éther. Après 25 filtration, lavage par 20 cm3 d'éther et séchage sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 20°C, on obtient 1 g de chlorhydrate d'acide O1- méthyl N^-benzyloxycarbonyl L,L diamino- 2,6 thia-4 pimélique. /

Ef = 0,64 [silicagel ; n.butanol - pyridine - acide / .3Ö acétique - eau (50-20-6-24 en volumes)] /y - \

* · I

70 TüTRMPLE 12 -

En opérant comme dans 1 ’ exemple 3 mais à partir de H-t.butyloxycarbonylglycine et d’acide N -[E-(N-lauroyl I alanyl)-γ-l glutamyl] 1,1 diamino-2,6 thia-4 pimélamique, on obtient 5 l’acide N^-[N-(N-lauroyl 1 alanyl)-γ-D glutamyl] lï2-glycyl L,L diamino-2,6 thia-4 pimélamique.

On ajoute 1,95 cm3 de chlorofomniate d’isobutyle à une • solution maintenue à -7°C,··· de 6,84 S de N-(N-lauroyl 1 alanyl) -- 10 a-1 glutamate de t.butyle dans un mélange de 330 cm3 de tétra-hydrofuranne et de 2,1 cm3 de triéthylamine. le mélange est agité pendant' 20 minutes à -7°C, puis on ajoute une «solution refroidie à 10®C de 5» 11 g d’acide N^-benzylorycarbonyl diamino-2 (l), 6 (l) · thia-4 pimélamique dans un mélange de 15 cm3 de soude N et 15 130 cm3 d’eau. *

Le mélange réactionnel est agité pendant 5 minutes à 0°C, puis pendant 24 heures à 20eC environ. On évapore le tétrahydro-furanne par concentration sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 50°C ; le concentrât est refroidi à 0°C, acidifié à 20 pH 2 par addition d’acide chlorhydrique 1N. Le précipité formé est séparé par filtration, lavé par 50 cm3 d’acide chlorhydrique 0,1 N puis 2 fois par 200 cm3 au total d’eau et séché à l’air libre. On obtient ainsi 10 g d’acide N2-[o1-t.butyl N-(N-lauroyl 1 alanyl)-γ-D glutamyl] N -benzyloxycarbonyl diamino-2 (l), 6 (l) 25 thia-4 pimélamique.

Hf = 0,65 [silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (5Ο-2Ο-6-24 en volumes)]

Ef = 0,72 [silicagel ; acétate d’éthyle-acide acétique (3-1 en volumes)] 30 On dissout 5 g d’acide N2-[0^-t.butyl N-(N-lauroyl 1 alanyl)-γ-l glutamyl] N^-benzyloxycarbonyl diamino-2(l), 6(l) thia-4 pimélamique dans 22 cm3 d’acide bromhydrique en solution / à 35 dans l’acide acétique. On agite le mélange réactiom^^^

I » I

• à 71 pendant l/2 heure avec un agitateur à ultra sons, puis on le verse dans 1 litre d'éther anhydre refroidi à 0eC. On agite le mélange pendant 1 heure ; le précipité obtenu est séparé par filtration, lavé 4 fois par 400 cm3 au total d'éther, et dissous dans 100 cm3 5 de méthanol, A la solution obtenue, on ajoute 5 cm3 d'ammoniaque (d = 0,92). On concentre à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 50°C. On obtient ainsi 4»36 g de poudre blanche, que l'on chromatographie sur 200 g de gel de silice neutre „ (0,04-0,063 um) contenus dans une colonne de 3,5 cm de diamètre.

10 On élué avec un mélange méthanol-ammoniaque(d = 0,9^> (999,5-0,5 en volumes) en recueillant des fractions de 30 cm3. Les fractions 25 à 39 sont réunie.s, concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 5°°C. On obtient ainsi 2,8 g de poudre blanche que l'on chromatographie sur 100 g de gel de silice neutre 15 (0,04-0,063 mm) contenu^ dans une colonne de 3 cm de diamètre. Pour cela, on dissout les 2,8 g de poudre dans 30 cm3 de méthanol contenant 0,3 cm3 d'ammoniaque (d = 0,92) par litre et, à la solution ainsi obtenue, on ajoute 3 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On évapore à sec le mélange sous pression réduite 20 (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 50°C et le résidu ainsi obtenu est chargé sur la colonne de silice. On élue avec un mélange méthanol-ammoniaque(d = 0,9¾ (999»5—0»5 eu. volumes) en recueillant des fractions de 13 cm3. Les fractions 13 à.23 sont réunies, concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 50°C.

Λ 25 On obtient ainsi 0,71 g d'acide N -[N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl)] diamino-2(L), 6(L) thia-4 pimélamique.

Rf = 0,35 [silicagel j n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (5Ο-2Ο-6-24 eu volumes)]

Analyse : Üalc. # C .52,95 H 8,03 N 11,87 S 5,44 30 Œr. 50,2 7,8 11,6 5,3 .

Cendres sulfuriques = 7,3 % /

Spectre de masse : M = 589 (théorie = 589)· /7/ f x

» » I

• % f 72 L'acide N^-benzyloxycarbonyl diamino-2(L), 6(l) thia-4 pimélamique peut être préparé de la façon suivante î A une solution maintenue vers -70°C de 17,93 g de N-benzyloxycarbonyl L cystéinamide dans 570 cm3 d ' ammoniac, 5 on ajoute 12,6 cm3 d'une solution méthanolique 5,6 ΪΓ de méthylate de sodium et ensuite par petites portions en l'espace de 10 minutes, 11,3 g· de chlorhydrate d'acide D α-amino ß-chloropropionique.

Le mélange réactionnel est agité pendant 10 minutes vers -60°C, puis abandonné pendant 20 heures à 20°C environ. Le résidu ainsi . 10 obtenu est repris par 200 cm3*d'eau ; la phase aqueuse est débar» v . rassée d'un insoluble par filtration, extraite 2* fois par 400 cm3 au total d'acétate d'éthyle, acidifiée à pH 2 par addition d'acide chlorhydrique 10N, extraite 2 fois par 400 cm3 au total d'acétate d'éthyle, concentrée à un volume de 170 cm3 sous pression réduite 15 (20 mm de mercure ; 2,J kPa) à 50°G, amenée à pH 5-6 par addition de triéthylamine et refroidie à 0°C pendant 2 heures. L'insoluble apparu dans la phase aqueuse est séparé par filtration, lavé - ' 3 fois par 150 cm3 au total d'eau et séché successivement à l'air libre et sous pression réduite (0,3 Mm de mercure ; 0,04 KPa) à 20 50°C. On obtient ainsi 8,88 g d'acide N^-benzyloxycarbonyl diamino-2(L), 6(l) thia-4 pimélamique· '· Ef = 0,48 [silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes)] [a]^ = -20° (soude H ; c « 1) 25· .. Spectrométrie de masse ï M = 341 (théorie = 341 )

Après hydrolyse, dérivatisation et chromatographie sur colonne capillaire optiquement active, on obtient : méso Lan 100 ^ (théorie = 1) L Lan <0,5 # (théorie = 0) / 30 3) .Lan <0,5 $ (théorie = 0) /1 / f * l » 73 EXEMPTAI 1A -

On ajoute 1,92 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution maintenue à -10eC, de 6,66 g de M-(N-lauroyl L alanyl) α-D glutamate de t.butyle dans un mélange de 320 cm3 de tétra-5 bydrofuranne et de 2 cm3 de triéthylamine* Le mélange est agité pendant 20 minutes à -10°C, puis on ajoute une solution refroidie à 10®6 de 5 g d'acide N^-benzyloxycarbonyl L,L diamino-2,6 thia-4 pimél§miq.ue dans un mélange de 14,6 cm3 de soude N et 120 cm3 d’eau% .*··'.

10 Le mélange réactionnel est agité pendant 5 minutes à 0°C, puis pendant 20 heures à 20®C environ. On évapore le tétrahydro-furana% par concentration sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 à 50°C ; le concentrât est dilué avec 200 cm3 d'eau, acidifié à pH 2 par addition d'acide chlorhydrique 11T (25 cm3 15 environ). A la suspension ainsi obtenue, on ajoute 500 cm3 d’acétate d'éthyle. Après agitation du mélange, on sépare l'insoluble par filtration et on le sèche sous pression réduite (0,3 mm de me toure ; 0,04 kPa) à 20°C. On obtient ainsi 2,55 g de poudre auxquels on joint 4,45 g obtenus de la façon suivante s,dans le 20 filt^sat, on sépare la phase organique, on la sèche sur sulfate de sodiua et la concentre à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 hPa) à 50°C. te résidu obtenu est repris par 200 cm3 d'ac%‘tate d'éthyle. La solution jaune pâle ainsi obtenue est refroidie à 0°C pendant 1 heure. le précipité formé est séparé 25 par filtration, lavé 2 fois par 200 cm3 au total d'éther et séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure ; 0,04 fcPa) à 20°C.

Les 7/ g de poudre ainsi obtenus sent chromatographiés sur 140 g de *g%l de silice neutre (0,04-0,063 mm) contenus dans une colonne de 3n2 cm de diamètre. Pour cela, on dissout les 7 g de poudre 30 dans 50 cm3 d’acide acétique et à la solution obtenue, on ajoute H g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On évapore à sec le mélaj&ge sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 50°C et 1^ résidu ainsi obtenu est changé sur la colonne de silice. .

On é^Lue successivement avec 2,15 litres d'un mélange acétate / 35 d'ét^hyie-acide acétique (9-1 en valûmes), 0,3 litre d'un mélangé^

If ;. i» « * I * « · ] ß 74 acétate d'éthyle-acide acétique (l-1 en volumes) en recueillant des fractions de 50 cm3. Les fractions .10 à 49 sont réunies, concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 fcPa) à 50eC.

5 le résidu huileux obtenu est repris par 100 cm3 ; d'acétate d'éthyle.. La solution obtenue est refroidie à 0eC pendant 1 heure. Le précipité formé est séparé par filtration, lavé 2 fois par 100 cm3 au total d'éther et séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure ; 0,04 hPa) à 20°C. 0n obtient ainsi 10 3,4 g d'acide N^-[0^-t.butyl N-(H-.lauroyl L alanyl)-Y-L glutamyl] H^-benzyloxycarboriyl L,L diamino-2, 6 thia-4 pimélamique.

Ef = 0,63 [silicagel ; acétate d'éthyle-acide acétique (3-1 en volumes).

On dissout 3»4 S d'acide Η^-Γθ^-t.butyl N-(N-lauroyl 6 b 15 " 1 alanyl)-y-D glutamyl] U -benzyloxycarbonyl L,L diamino-2,6 thia-4 pimélamique dans un mélange de 17 cm3 d'acide brombydrique en solution à 35 $ dans l'acide acétique et 10 cm3 d'acide acétique.

On agite le milieu réactionnel pendant 2 heures et le concentre à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 hPa) à 55°C.

20 Le résidu huileux obtenu est trituré dans 30 cm3 d'acétate d'éthyle, séparé par filtration, lavé 2 fois par 60 cm3 au total d'éther et séché sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 hPa) à 20°C.

On obtient ainsi 4 S de poudre beige que l'on chromatographie sur 90 g de gel de silice neutre (O,04-0,063 mm) contenus dans une 25 colonne de 3 cm de diamètre. Four cela, on dissout les 4 g de poudre dans 50 cm3 de méthanol auquel on ajoute 7 cm3 d ' ammoniaque (d = 0,92) et 8 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On évapore à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kFa) à 50°C et le résicLu ainsi obtenu est chargé sur la 30 colonne de silice. On élue avec un mélange méthanol-ammoniaque (d = 0,92)(999,5-0,5 en volumes) en recueillant des fractions de 10 cm3. Les fractions 13 à 24 sont réunies, concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 hPa) à 50°0. Le | résidu pâteux est trituré dans 100 cm3 d'éther, séparé par / | 35 filtration et séché sous pression réduite (20 mm de mercure %*/ \ 75 • » 4 » · chromatographie sur 90 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm) contenus dans une colonne de 3 cm de diamètre. Pour cela, on dissout les 2,4 g de poudre dans 30 cm3 de méthanol auquel on ajoute 4 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On évapore à 5 sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mèrcure ; 2,7 EPa) à 50°C et le résidu ainsi obtenu est chargé sur la colonne de silice. On élue avec un mélange méthanol-ammoniaque (d « 0,92) (999»5-0,5 en volumes) en recueillant des fractions de 5 cm3·

Les fractions 22 à 50 sont réunies, 'concentrées à sec sous pression 4 * 10 réduite (20 mm de mercure $ 2,7 kPa) à 50eC. Le résidu obtenu est trituré dans 50 cm3 d'éther, séparé par filtration et séché sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 fcPa) à 50β0· On obtient ainsi 1,54 8 de poudre. 1 g de cette poudre est mis en suspension dans 50 cm3 d'eau. On dissout la poudre en amenant le 15 pH du mélange à 1,8 par addition d'acide chlorhydrique 0,1 N (40 cm3). Ensuite, on amène le pE à 3»6 par addition de 20 cm3 de soude. 0,1 N. Le précipité apparu est séparé par filtration, lavé par 30 cm3 d'eau et séché à l'air libre, puis sous pression réduite (0,3’ mm de mercure ; 0,04 hPa) à 50eC. On obtient ainpi p 20 0,66 g d'acide N -[N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] L,L diamino-2,6 thia-4 pimélamique.

Ef = 0,36 [silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes)]

Analyse : Cale. # C 52,95 H 8,03 N 11,87 S 5,44 25 Ir. 52,0 8,2 11,5 5,4

Spectre de masse M = 589 (théorie a 589) L’acide N -benzyloxycarbonyl L,L diamino-2,6 thia-4 pimélamiqiie peut être préparé de la façon suivante : A une solution maintenue vers -75e0 de 2,54 g de 30 N-benzyloaycarbonyl L cystéinamide dans 80 cm3 d'ammoniac, on ajoute 1,72 cm3 d'une solution 5,8 E de méthylate de sodium dans le méthanol. Ensuite, on ajoute 1,6 g de chlorhydrate d'acide L a-amino ß-chloropropionique. Le milieu réactionnel est abandonn^ pendant 18 heures à 20°C environ. Le résidu solide obtenu est // 4 76

·» I

• » repris par 50 cm3 d'eau, la phase aqueuse est débarrassée d-'uii insoluble par filtration, extraite 5 fois par 60 cm3 au total d’acétate d’éthyle, acidifiée à pH 3“4 par addition d'acide citrique et refroidie à 0°C. Après 2 heures de repos à 0eC, le 5 précipité apparu est séparé par filtration, lavé par 10 cm3 d'eau, 3 fois par 30 cm3 au total d'acétate d'éthyle et 3 fois par 30 cm3 au total d'éther, séché sous pression réduite (20 mm de . ✓ mercure ; 2,7 fcPa) à 20°C. On obtient ainsi 0,83 S d'acide ^ H^-benzyloxycarbonyl L,1 diamino-2,6 thia-4 pimélamique.

10 -Ef = Or,54 [silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau

(50-20-6-24 en volumes)J

Après hydrolyse, dérivatisation et chromatographie sur colonne capillaire optiquement active, on obtient : L Lan : 99»2 $> v (théorie ! 1) 15 Méso Lan : 0,8 % (théorie : 0) L Lan : <0,5 $ (théorie : 0) EXEMPLE 15 -

On ajoute 0,53 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution maintenue à -5eC, de 1,88 g de N-(N-lauroyl L alanyl) 20 oc-D glutamate de t .butyle dans tm mélange de 100 cm3 de tétra- hydrofurarine et de 0,58 cm3 de triéthylamine« Le mélange est agité pendant 20 minutes à -5°0, puis on ajoute une solution refroidie à 2eC de 1,5 S d'acide N^-t.butyloxycarbonylglycyl L,L diamino-2,6 thia-4 pimélamique dans un mélange de 4»1 cm3 de soude N et 25 35 cm3 d'eau.

Le mélange réactionnel est agité pendant 5 minutes à 10°C, puis pendant 20 heures à 20eC environ. On évapore le tétra-hydrofuranne par concentration sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 KPa) à 50°C ; le concentrât est refroidi à 0°C, 30 acidifié à pH 2 par addition d'acide chlorhydrique 1-N (7 cm3 environ)·

Le mélange réactionnel est extrait 3 fois par 200 cm3 au total d’acétate d'éthyle. Les phases organiques réunies sont I séchées soir sulfate de sodium et concentrées à sec sous pression / 35 réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 50°C. On obtient ainsi une / huile qui, triturée dans 100 cm3 d'éther, dorme une poudre (2,1 Âty 1 Œ 77 I » * • ‘ que l'on chromatographie but 60 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm) contenus dans une colonne de 2,2 cm de diamètre.

Pour cela, on dissout les 2,1 g de poudre dans 20 cm3 d'acide acétique et à la solution obtenue, on ajoute 4 S de gel de silice 5 neutre (0,04-0,063 mm). On évapore à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°G et le résidu ainsi obtenu est chargé sur la colonne de silice. On élue avec un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (9-1 en volumes) en recueillant des < fractions de 20 cm3. Les fractions 13 à 42 sont réunies, concen-10 trées à-sec sous pression réduite (20 mm de mercure*; 2,7 kPa) ' à 50°C. Le résidu obtenu est trituré dans 200 cm3 d'éther, séparé par filtration et séché. On obtient ainsi 1,3 g d'acide Ν^-[θ^-t .butyl N-(N-lauroyl L alanylJ-y-D glutamyl] N^-t.butyloxy-carbonylglycyl L,L diamino-2,6 thia-4 pimélamique.

15 Ef *= 0,49 [silicagel ; acétate d'éthyle-acide acétique (8-2 en volumes)]

On dissout 1,3 g d'acide N^-[0^-t.butyl N-(N-lauroyl L alanyl)-Y-D glutamyl] N^-t.butyloxycarbonylglycyl L,L diamino-2,6 thia-4 pimélamique dans 30 cm3 d'une solution anhydre d'acide 20 chlorhydrique 1,7 N dans l'acide acétique. On agite le mélange réactionnel pendant 1 heure, puis on le débarrasse d'un très léger insoluble par filtration, le concentre à sec sous pression réduite . (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 50“C. Le réaidu ainsi obtenu est trituré dans 50 cm3 d'acétate d'éthyle, -séparé par filtration, 25 lavé successivement par 30 cm3 d'acétate d'éthyle et 2 fois par 60 cm3 au total d'éther et séché. On obtient ainsi 0,9 g de poudre que l'on chromatographie sur 30 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm) contenus dans une colonne de 2,1 cm de diamètre. On élue avec de l'acide acétique en recueillant des fractions de 10 cm3* 30 Les fractions 13 à 20 sont réunies, concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kEa) à 50°C. Le résidu obtenu est trituré dans 50 cm3 d'acétate d'éthyle, séparé par filtration, lavé par 30 cm3 d'éther et séché. On obtient ainsi 0,79 S de poudre / que l'on dissout dans 40 cm3 d'eau. On amène la phase aqueuse àyn/ 78 ί ; » » * * îi* pH 3»5 pan addition de 6 cm3 de soude 0,1 N. Le précipité apparu est séparé par filtration, lavé par 20 cm3 d'eau et séché sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 hPa) à 50°C. On obtient ainsi 0,59 S d'acide ïï^-[N-(H-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] 5 N^-glycyl L,L diamino-2,6 thia-4 pimélamique.

Ef ss 0,34 [silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes)] ✓ Analyse Cale. % C 51 »99 H 7,79 N 12,99 S 4,96 - . Tr. 49,9 8,-0 12,8 4,9 ’ .10 Cendres sulfuriques : 0,9 $ L'acide N8-t.butyloxycarbonylglycyl diamino-2(L), 6(L) ! thia-4 pimélamique peut être préparé de la façon suivante : '

A une solution maintenue vers -75°C de 4,6 g de di t.butyl-oxycarbonylglycyl L cyst inami de dans 400 cm3 d'ammoniac, on ajoute 15 par petites portions, du sodium jusqu'à l'obtention d'une colo-ration bleue persistante pendant quelques minutes. Ensuite on ajoute successivement du chlorure d'ammonium jusqu'à décoloration du mélange réactionnel et 2,66 g de chlorhydrate d'acide L a-amino ß-chloropropionique.Le mélange réactionnel est agité pendant 20 2 heures vers -75°C, puis abandonné pendant 18 heures à 20°C

environ. La pâte blanche ainsi obtenue est triturée dans 100 cm3 d’éthanol et filtrée. Le filtrat est concentré à sec sous pression réduite (20-mm de mercure $ 2,7 hPa) à 50°C. Le résidu huileux est trituré dans 50 cm3 d'acide acétique et filtré. Le filtrat est 25 concentré à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 50°C. Cette opération est répétée 2 fois avec 60 cm3 au total de méthanol. On obtient ainsi 10,5 g de résidu huileux que l'on chromatographie sur 250 g de gel de ‘silice neutre (0,04-0,063 mm) contenus dans une colonne de 3,5 cm de diamètre. Pour cela, on 30 dissout les 10,5 g de résidu dans 50 cm3 de méthanol et à la solution obtenue, on ajoute 20 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On évapore à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 50°C et le résidu ainsi obtenu ; est chargé sur-la colonne de silice. On élue successivement ave97/ f • · # 79 1,15 litre d'un'mélange acétate d'éthyle-méthanol (1-1 en volumes), 850 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-méthanol (2-8 en volumes), en recueillant des fractions de 50 cm3· Les fractions 26 à 33 sont réunies, concentrées à sec sous pression réduité (20 mm de mercure ; 5 2,7 kPa) à 50°C. Le résidu obtenu est trituré dans 50 cm3 d'acétate d'éthyle, séparé par filtration, lavé par 20 cm3 d'acétate d'éthyle et séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure ; 0,04 hPa) à 50°C. On obtient ainsi 2 g d'acide H^-t.butyloxy-carbonylglycyl diamino-2(L), 6(L) thia-4 pimélamique · 10 Ef « 0,41 [ silicagel j n»bu±anol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes)] [a]^° = -9e (soude N ; c = 1)

Après hydrolyse, dérivâtisation et chromatographie sur » colonne capillaire optiquement active, on obtient : 15 L Lan : 95,5 $ (théorie = 1) 3) Lan ï <0,5 $ (théorie = 0) Méso Lan : 4*5 $ (théorie = 0)

Le di-t.butyloxycarbohylglycyl L cystinamide peut être préparé de la façon suivante: 20 On ajoute 13 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à -5*0, de 17,6 g de t.butyloxycarbonylglycine dans un mélange de 1,7 litre de tétrahydrofuranne et de 14 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes vers -5°0, puis on ajoute une solution refroidie vers 5eC de 20 g de bromhy-25 drate de L cystinamide dans un mélange de 100 cm3 de soude 1N et de 1 litre d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant quelques minutes vers 0eC, puis pendant 18 heures à 20°C environ. Ensuite le tétrahydrofuranne est éliminé par concentration sous- pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 50°C. Le concentrât est 30 acidifié à pH 3 par addition d'acide citrique et extrait 3 fois par 1,5 litre au total d'acétate d'éthyle. La phase acétate d'éthyle est séchée sur sulfate de sodium et concentrée à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 hPa) à 50eC. Le résidu obtenu est . repris par 700 cm3 d'éther, séparé par filtration, lavé 2 fois par /

V

• » 9 • · 80 200 cm3 au total d'éther. On "obtient, ainsi 19 g 4e poudre. 15 g de cette poudre sont chromatographiés sur 600 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm) contenus dans une colonne de 4»8 cm de diamètre. Pour cela, on dissout les 15 g de produit dans 100 cm3 5 de méthanol et à la solution obtenue, on ajoute 15 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On évapore à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure } 2,7 hPa) à 50 eC et le résidu ainsi obtenu-est chargé sur la colonne de silice. On élue succes-v sivement avec 2,1 litres d'un mélange acétate d'éthyle-acide acé- * . 10 tique (97-3 en volumes), 1,9 litres d'un mélange acétate d'éthyle-- acide acétique (96-4 en volumes)·, 850 cm3 d’un mélange acétate * d'éthyle-acide acétique (95-5 en volumes), 1,7 litre d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (94-6 en volumes), 850 cm3 d'un * mélange acétate d'éthyle-acide acétique (9-1 en volumes), 900 cm3 15 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (8-2 en volumes) et 950 cm3 d’un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (1-1 en volumes) en recueillant des fractions de 50 cm3. Les fractions 150 à 182 sont réunies, concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 50°C. Le résidu huileux obtenu est trituré 20 dans 400 cm3 d’éther, séparé par filtration, lavé 2 fois par 200 cm3 au total d'éther et séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure ; 0,04 kPa) à 50°C. On obtient ainsi 7»5 g de. di-t.butyloxycarbonylglycyl L cystinamide.

Rf * 0,38 [silicagel ; acétate d'éthyle-acide acétique 25 (9-1 en volumes)] EXJiiMPT'Tn 16 — * ’ On ajoute 1,15 °m3 4e chloroformiate d'isobutyle à une solution maintenue à -6°C de 3»51 g de N-(N-lauroyl L alanyl) L isoglutamine dans un mélange de 260 cm3 de diméthylformamide 30 et de 1,23 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à -6°C, puis on ajoute une solution refroidie à 5eC de 3 g d'acide N^-benzyloxycarbonyl diamino-2(L), 6 (D,L) thia-4 / pimélamique dans un mélange de 8,8 cm3 de soude N et ?0 cm3 d'eau./ 81 ' > » • · /

Le mélange réactionnel est agité pendant 10 minutes à 5°C, puis pendant 24 heures à 20°C environ. On le débarrasse d'un léger insoluble par filtration, le dilue avec 700 cm3 d'eau et l'acidifie à pH 2 par addition d'acide chlorhydrique 4H" (environ 5 6 cm3). Le précipité apparu est séparé par filtration, lavé succes sivement par 100 cm3 d'acide chlorhydrique 0,1 N et 3 lois par 600 cm3 au total d'eau et séché à l'air libre. On obtient ainsi 5j6 g de poudre blanche que l'on chromatographie .sur 168 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm) contenus dans une colonne de 10 3,5 cm de diamètre. Pour cela, on dissout les 5»6 S de poudre -5 dans 30 cm3 d'acide acétique et à la solution obtenue, on ajoute 12 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm) .‘On évapore-¾ sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure-; 2,7 £Pa) à 50°C et le résidu ainsi obtenu est chargé sur la colonne de silice.

15 On élue successivement avec un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (7-3 en volumes) en recueillant des fractions de 100 cm3·

Les fractions 13 à 38 sont réunies, concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 hPa) à 50°C. Le résidu'obtenu est trituré dans 100 cm3 d'éther, séparé par filtration et séché. On 20 obtient ainsi 3»3 g d'acide N2-[N-(N-lauroyl L alanyl) 3) iso- g glutaminyl] N -benzyloxycarbonyl diamino-2(L), 6(D,L) thia-4 pimélamique.

On dissout 2,25 g d'acide N2-[N-(N-lauroyl L alanyl)-D isoglutaminyl] N^-benzyloxycarbonyl diamino-2(L), 6(d,L) thia-4 25 pimélamique dans 16 cm3 d'acide bromhydrique en solution à 35 $ dans l'acide acétique. On agite le mélange réactionnel pendant 35 minutes avec un agitateur à ultra-sons, puis on le verse dans 1,5 litre d'éther. On agite le mélange pendant 2 heure s.. La précipité obtenu est séparé par filtration, lavé 3 fois par 150 cm3 30 au total d'éther, et dissous dans 350 cm3 d'eau. La phase aqueuse est neutralisée à pH 7 par addition d'ammoniaque 0,1 H. Âpres 16 heures de repos à 20eC, le précipité apparu est séparé par ) . filtration, lavé successivement 2 fois par 100 cm3 au total d'eau, / par 100 cm3 d'éther, 50 cm3 d'acétone, 50 cm3 d'acétate d'éthyle^/ 82 11 » » · 50 cm3 de méthanol et 50 cm3 d’éther et séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure ; 0,04 kPa) à 20°C. On obtient ainsi 0,8 g de poudre auquel on joint 0,3 g de poudre obtenue dans un essai similaire et que l'on chromatographie sur 55 g de gel de 5 silice neutre (0,04-0,063 mm) contenus dans une colonne de 2,5 cm de diamètre. Pour cela, on dissout les 1,1 g de poudre dans 20 cm3 d'acide acétique et à la solution obtenue, on ajoute 3 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On évapore à sec le ^ mélange sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 hPa) à 50°C 10 et le résidu ainsi obtenu est chargé sur la colonne de silice.

, On élue avec un mélange méthanol-aeétate d'éthyle-ammoniaque (da 0,92) (65-35-0,25 en volumes) en recueillant des fractions de 50 cip3· Les fractions 7 à, 13 sont réunies, concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 50°C. Le résidu 15 obtenu est trituré déçus 30 cm3 d'éther, séparé par filtration, lavé successivement par 5 cm3 d'eau, 3 fois par 15 cm3 au total de méthanol et 3 fois par 30 cm3 au total d'éther et séché sous pression réduite (0,3 de mercure ; 0,04 kPa) à 50°C. On obtient ainsi 0,41 g d'acide N2-[N-(N-lauroyl L alanyl) D isoglutaminyl] 20 diamino-2(L), 6(D,L) thia-4 pimélamique.

Rf = 0,60 [silicagel ; pyridine-acétate d'éthyle-acide acétique-eau-méthanol (30-40-6-10-10 en volumes)]

Analyse : Cale. % C 53,04 H 8,21 N 14,27 S 5,44

Tr. 51,1 7,9 13,6 ’ 5,4 25 Spectre de masse : M = 580 (théorie = 588) EXEMPLE 17 -

On ajoute 0,55 cm3 de chloroformiate d'îsobutyle à une solution, maintenue à -8°C, de 73,2 mg de N-t.butyloxycarbonyl glycine dans un mélange de 120 cm3 de tétrahydrofuranne et de 30 0,58 cm3 de triéthylamine. Le mélange est -agité pendant 20 minutes à -8°C, puis on ajoute une solution refroidie à 4°C de 2,46 g j d'acide N2-[ïï-(N-lauroyl L alanyl) L isoglutaminyl] diamino-2(L), 6(DjL) thia-4 pimélamique dans un mélange de 4,18 cm3 de soude / j 1 E et 120 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant/ /* 83 ' .

• 5 minutes à 0°C, puis pendant 20 heures à 20°C environ. 0n*-évapore le tétrahydrofuranne par concentration sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 50eC. Le concentrât est acidifié à pH 2 par addition d'acide chlorhydrique 4 N. Le 5 précipité apparu est séparé par filtration, lavé successivement 4 fois par 200 cm3 au total d'eau et 3 fois par 130 cm3 au total d'acétate d'éthyle et séché sous pression réduite (20 mm de ^ mercure ; 2,7 kPa) à 20°G. On obtient ainsi 2,23 g de poudre V blanche que l'on chromatographie sur 112 g de gel de silice . v 10 neutre (0,04-0,063 mm) contenus dans une colonne de 3»2 cm de diamètre. On élue successivement aveo 1 litre d'un mélange ' acétate d'éthyle-acide acétique (20-80 en volumes) et 1 litre d'acide acétique en recueillant des fractions de 23 cm3· Les fractions 41 à 80 sont réunies^ concentrées à sec sous pression 13 réduite (20 mm de mercure ; 2,7 k3?a) à 50°C. Le résidu obtenu est trituré dans 100 cm3 d'éther, séché sous pression réduite * (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 50°C. On obtient 1,04 g d'acide N -[N-(N-lauroyl L alanyl) D is0glutaminy 1] N-(t .butyloxyearbonyl-glycyl) diamino-2(L), 6(3),L) thia-4 pimélamique.

20 Ef s 0,57 [silicagel ; n.butanol -* pyridine - acide acétique- eau (50-20-6-24 en volumes)]

Ef « 0,69 [silicagel ; acétate d'éthyle - acide acétique (2-8 en volumes)]

On dissout 0,88 g d'acide N^-[N-(N-lauroyl L alanyl 3) 25 .lsoglutaminyl] N^-t .butyloxyoarbonyl diamino-2(b), 6(3),L) thia-4 pimélamique dans 12 cm3 d'une solution anhydre d'aoide chlorhydrique 1,6 N dans l'acide acétique. On agite pendant 35 minutes.

On verse le milieu réactionnel dans 120 cm3 d'éther, on agite pendant 1 heure. Le précipité formé est séparé par filtration, 30 lavé 3 fois par 60 cm3 au total d'éther et séché soub pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 20°C. La poudre ainsi obtenue est dissoute dans 70 cm3 d'eau. On amène le pH de cette solution à 5-6 par addition d'ammoniaque 0,1 N. Après 1 /2 heure / de repos, on sépare le précipité formé par filtration, le lave^/ 84 Μ » • » successivement 3 fois par 60 cm3 au total d'eau, 3 fois par 60 cm3 au total d'éther, 2 fois par 40 cm3 au total d'acétate d'éthyle et 2 fois par 40 cm3 au total d'éther et le sèche sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 20°C. On obtient 5 ainsi 0,53 S de poudre blanche que l'on chromatographie sur 23 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm) contenus dans une colonne de 1,6 cm de diamètre· On élue avec de l'acide acétique en ^ recueillant des fractions de 10 cm3. les fractions 58 à 72 sont réunies, concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 10 2,7.kEa) à 50°C. Le résidu obtenu.est trituré dans 50‘cm3 d'éther, séparé par filtration, lavé 3 fois par 60 cm3 au total d'éther et séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure $ 0,04 KPa) à 50°C.

g 0n obtient ainsi 300 mg d'acide N -[N-(N-lauroyl L alanyl) 3) iso-glutaminyl] N^-glycyl diamino~2(L), 6(D,L) thia-4 pimélamique· . Y · 15 ftf = 0,33 [silicagql ; n.butanol -’pyridine - acide acétique - eau (50-20-6-24 en volumes)]

Analyse ï Cale. C 52,07 H 7,9$ H 15,18 S 4,-96

Tt. 50,5 8,0 14,1 4,9 20 On ajoute 1 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une

solution maintenue à -8°C, de 3,38 g de 0-acétyl D lactoyl-L

alanyl - α-D glutamate de benzyle dans un mélange de 160 cm3 de tétrahydrofuranne et de 1,12 cm3 de triéthylamine · Le mélange est , agité pendant 20 minutes à -8°C, puis on ajoute une solution 2 25 refroidie à 2°C de 3,02 g d'acide N -benzyloxycarbonyl L,L diamino- 2.6 thia-4 pimélamique dans un mélange de 16 cm3 de soude N et 60 cm3 d'eau.

Le mélange réactionnel est agité pendant 5 minutes à -8°C, puis pendant 20 heures à 20°C environ. On évapore le tétrahydro-30 furanne par concentration sous pression réduite (20 mm de mercure ·τ 2.7 KPa) à 50°0 ; le concentrât est refroidi à 0°C, acidifié à pi 2 par addition d'âcide chlorhydrique 4 N (6 cm5 environ), extrait /

5 fois par 300 cm3 au total d'acétate d'éthyle. Les phases orga-y,/ niques réunies sont lavées successivement par 40 cm3 d'eau /H

Ψ 85 * » * I » * et 20 cm3 d'une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de sodium, concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure î 2,7 kPa) à 50°C. On obtient ainsi 5»88 g d'huile que l'on-chromatographie sur 100 g de gel de silice neutre (0,04-5 0,063 mm) contenus dans une colonne de 3 cm de diamètre. On élue successivement avec 400 cm3 d’acétate d'éthyle, 360 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle - acide acétique (98-2 en volumes), 320 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle - acide acétique (95-5 en volumes) et'280 cm3. d'un mélange acétate d'éthyle - acide acétique * 10 (9-1 en volumes), en recueillant des. fractions-de 40- cm3. le s , fractions 23 à 34 sont réunies, concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 50eC. On obtient- ainsi 5,06 g d'acide. H^-[O1-benzyl N-(0-acétyl D lactoyl L alanyl)-y-D glutamyl] Ef^-benzyloxycarbonyl L,I diamino-2,6 thia-4 pimélamique 15 sous forme d'hüile. · t

Ef » 0,67 [silicagel ; n.butanol - pyridine - acide acétique -eau (50-20-6-24 en volumes)]

Rf = 0,23 [silicagel j acétate d'éthyle - acide acétique (9-1 en volumes)] 6l 20 On dissout 3» 16 g d'acide N -[O -benzyl N-(0-acétyl I) lac toyl I alanyl)-Y-3) glutamyl] N^-benzylosycarbonyl 1,1 diamino-2,6 thia-4 pimélamique dans un mélange de 13 cm3 d'acide bromhydrique en solution à 35 $ dans l'acide acétique et de 11 cm3 d'acide acétique. On agite le milieu réactionnel pendant 2 heures, puis on y 25 ajoute 5OO cm3 d'éther et on laisse reposer une nuit. le précipité apparu est séparé par filtration, lavé 3 fois par 150 cm3 au total d'éther et séché sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 20°C. On obtient ainsi 2,22 g d’acide N -[0 -benzyl N-(0-acétyl D lactoyl I alanyl)-y-I) glutamyl] 1,1 diamino-2,6 thia-4 pimélamique 30 sous forme de poudre hygroscopique.

Rf * 0,83 [silicagel ; isopropanol - eau (6-4 en volumes)^^^^^ .

86 ' * 6 1

On dissout 2,20 g d'acide N -[O -benzyl N-(0-acétyl D lactoyl L alanyl) γ-D glutamyl] L,L diamino-2,6 thia-4 piméla-mique dans un mélange de 14 cm3 de méthanol et de 14 cm3 de soude 1N. On agite le mélange réactionnel pendant 2 heures. On le neutra-5 lise à'pH 7 par addition d'acide chlorhydrique 1N, on le concentre sous pression réduite (20 mm de mercure j 2,7 kPa) à 50°C, on le reprend par 3 cm3 d'eau et on l'acidifie avec 3»5 cm3 d'acide chlorhydrique 4N. la solution ainsi obtenue est chromatographiée sur une colonne de Sephadex G-10 de 2 mètres de hauteur et 2,2 cm '10 de diamètre. On élue avec de l'eau en recueillant des fractions de 5 cm3. Les fractions 57 à 69 sont réunies, lyophilisées et séchées sous pression réduite (0,3 mm de mercure ; 0,04 üPa) à 60aC. On obtient ainsi 900 mg d'acide lactoyl L alanyl) - Y~L glutamyl] L,L diamino-2,6 thia-4 pimélamique.

15 Ef = 0,75 [silicagel $ isopropanol - eau ' ·.· * (6-4 en volumes)]

Analyse t Cale. $ C 42,58 H 6,10 N 14,60 S 6,69 ®r. 39,7 6,4 13,2 6,4 L'O-acétyl 3) lactoyl-L-alanyl-oc-3) glutamate de benzyle 20 peut être préparé de la façon -suivante :

On ajoute 5,3 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution maintenue à -6°0, de 5,61 S d'acide 0-acétyl 3) lactique dans un mélange de 425 cm3 de tétrahydrofuranne et de 6 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à -6eC, puis i 25 on ajoute une solution refroidie à 3eC de 14,66 g de chlorhydrate de L alanyl-a-D glutamate de benzyle dans un mélange de 85 cm3 de soude N et 42 cm3 d'eau.

Le mélange réactionnel est agité pendant quelques minutes à 0°C, puis pendant 18 heures à 20eC environ. On acidifie 30 le mélange, à pH 2 par addition d'acide chlorhydrique 1 N (50 cm3 environ). On évapore le tétrahydrofuranne par concentration sous pression réduite (20 mm de mercure $ 2,7 kPa) à 50*C. Au concentrât, on·ajoute 100 cm3 d'acétate d'éthyle et 35 cm3 d'acide chlorhydriquk -----------------^ 1;

* * (T

• * 87 3 fois par 1$0 cm3 au total d'acétat.e d’éthyle. Toutes les phases organiques sont réunies, lavées par 50 cm3 d'une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de sodium et concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 50°C.

5 On obtient une huile que l'on chromatographie sur 550 g de gel de silice .neutre (0,03-0,2 mm) contenus dans une colonne de 5 cm de diamètre. On élue successivement avec 500 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle - méthanol (98-2 en volumes), 700 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle - méthanol (95 - 5 en volumes), 400 cm3 d'un mélange * *' 10 acétate d'éthyle - méthanol (9-1 en volumes), 600 cm3 d'un, mélange.

, acétate d'éthyle - méthanol (8-2 en volumes) en recueillant des fractions de 100 cm3· Les fractions 13 à 22 sont réunies, concen-J trées à sec tous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 KPa) à 4 50°0. On obtient ainsi 8,78 g de 0-acétyl D lactoyl-L alanyl-a-L 15 glutamate de benzyle sous forme d'huiïe.

Ef = 0,63 [silicagel ; acide acétique - acétate d'éthyle (9-1 en volumes)] EXEMPLE 19 -

On ajoute 0,91 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une 20 solution maintenue à -8°C, de 3,04 g de N-(N-octanoyl L alanyl) a-D glutamate de benzyle dans un mélange de I40 cm3 de tétra- hydrofuranne et de 0,98 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à -8eC, puis on ajoute une solution refrbidie à 2 2°C de 2,64 ? d'acide N -benzyloxycarbonyl L,L diamino-2,6 thia-4 25 pimélamique dans un mélange de 14 cm3 de soude N et 53 cm3 d'eau.

Le mélange réactionnel est agité pendant 5 minutes à 0°C, puis pendant 4 heures à 20°C environ. On évapore le tétrahydro-• furanne par concentration sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à ; le concentrât est refroidi à 0°C, acidifié à 30 · pH 2 par addition d'acide chlorhydrique 4 N (5 cm3 environ), extrait 5 fois par $00 cm3 au total d'acétate d'éthyle. Les phases organiques riunies sont lavées successivement par 25 cm3 d'eau et 25 cm3 d'une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur _ 7 sulfate de sîdium et concentrées à sec sous pression réduite /

35 (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 50°C. On obtient ainsi 5» 18 g d'un&A

88 ,

t · I

• ft poudre "beige clair que l'on chromatographie sur 100 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm) contenus dans une colonne de 3 cm de diamètre. On élue successivement avec 160 cm3 d’acétate d’éthyle, 36Ο cm3 d’un mélange acétate d'éthyle - acide acétique 5 (97-3 en volumes), 720 cm3 d’un mélange acétate d'éthyle - acide acétique (95-5 en volumes) et 680 cm3 d’un mélange acétate d'éthyle-âcide acétique (£-1 en volumes) en recueillant des fractions de 40 cm3. Les fractions 15 à 48 sont réunies, concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 50°C. Le résidu 10 obtenu est trituré dans 100 cm3 d'éther, séparé par filtration et , séché. On obtient ainsi 3>33 g d'acide N -[0 -benzyl R-(N-octanoyl L alanyl)-y-D glutamyl] H^-benzylorycarbonyl L,L diamino-2,6 thia-4 pimélamique. ·

Rf = 0,37 [silicagel ; acétate d'éthyle - acide acétique 15 (9-1 en volumes)]

Spectrométrie de masse ï M = 757 (théorie = 757)

On dissout 3»33 g d'acide R °-[0‘-benzyl R-(R-oetanoyl L alanyl)-y-D glutamyl] N^-benzyloxycarbonyl L,L diâmino-2,6 thia-4 4 pimélamique dans un mélange de 33 cm3 de méthanol et de 9>7 cm3 20 de soude 1 R. On agite le milieu réactionnel pendant-60 minutes.

On évapore en partie le méthanol par concentration sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 50°C. Le concentrât est dilué par 38 cm3 d'eau-, acidifié à pH 1 par addition d'acide chlorhydrique 1 R. On laisse reposer pendant 18 heures. Une huile 25 décante sur les parois ; elle est séparée par décantation, lavée 2 fois par 48 cm3 au total d'eau et séchée sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 KPa) à 20°C. On obtient ainsi 2,86 g , . d'huile que l'on chromatographie sur 77 S de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm) contenue dans une colonne de 3 cm de diamètre. Pour 30 cela, on dissout les 2,86 g d'huile dans 30 cm3 d'acide acétique et à la solution obtenue, on ajoute 8 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On évapore à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 RPa) à 50°C*et le résidu ainsi obtenu est chargé sur la colonne de silice. On élue successivement avec / 35 80 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle - acide acétique (9-1 en // volumes), 80 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle - acide acétique^' 89.

I t » I · (8-2 en volumes), 280 <SHi3 d'un mélange acétate d'éthyle - acide -acétique (1-1 en volumes) en recueillant des fractions de 40 cm3.

Les fractions 5 à 11 sont réunies, concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure $ 2,7 kPa) à 50°C. Le résidu· est trituré 5 dans 40 cm3 d'acétate d'éthyle, séparé par filtration et séché.

On obtient ainsi 1,94 g de poudre que l'on chromatographie sur 80 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm) c.ontenus dans une colonne de 3» 5 cm de diamètre. Pour cela, on dissout les 1,94 g de poudre dans 30 cm3 d'acide acétique et à la solution obtenue, 10 on ajoute 6 g de gel de silice neutre (0it04-0,*063 mm). On évapore à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 50°0 et le résidu ainsi obtenu est chargé sur la colonne de silice. On élue successivement avec 600 cm3 d'un mélangé acétate d'éthyle -* acide acétique (8-2 en volumes) et 400 cm3 d'un mélange acétate 15 d'éthyle - acide acétique (7-3 en volumes) en recueillant des fractions de 40 cm3. Les fractions 7 à 25 sont réunies, concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 £Pa) à 50°C.

Le résidu obtenu est trituré dans 30 cm3 d'éther, séparé par filtration et séché. On obtient ainsi 1,44 g d'acide N^-[N-(N-octa-20 noyl L alanyl)-y-D glutamyl] N2-benzyloaycarbonyl L,L diamino-2,6 thia-4 pimélamique.

Rf s 0,52 [silicagel ; n.butanol - pyridine - acide acétique - eau (5Ο-2Ο-6-24 en volumes)]

On dissout 1,4 g d'acide H^-[lT-(N-octanoyl L alanyl)-y-D

25 glutamyl] N2-benzyloxycarbonyl L,L diamino-2,6 thia-4 pimélamique dans un mélange de 5*6 cm3 d'acide bromhydrique en solution à 33 $ dans l'acide acétique et de 5 cm3 d'acide acétique. On agite le - mélange réactionnel pendant 2 heures à 28°C, le concentre à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ;2,7 kPa) à 50°C. Le „ d'éther 30 résidu obtenu est trituré dans 60 cm^. Une huile décante sur les parois, elle est séparée par décantation, retriturée dans 50 cm3 d'éther, séparée à nouveau par décantation, dissoute dans 200 cm3^ d'eau. Cette phase aqueuse est concentrée à sec sous pression / y j Ί 9\ ! I 90 j réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à’ 55° C· On obtient ainsi une ! huile que l'on chromatographie sur 80 g de gel de silice neutre ! (0,04-0,063 mm) contenus dans une colonne de 3 cm de diamètre.

On élue avec un mélange méthanol - acétate d'éthyle - ammoniaque 5 (d = 0,92)(75-25-0,5 en volumes) en recueillant des fractions de 20 cm3> Les fractions 15 à 21 sont réunies, concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure 5 2,7 kPa) à 50eC. On obtient ainsi 460 mg de poudre blanche. 360 mg -de cette poudre » . sont dissous dans 5 cm3 d'eau et chromatographiés sur une colonne 10 de Sephadex G-10de 2 mètres de hauteur et 2,2 cm de diamètre. On “élue avec de l'eau en recueillant des fractions de 5 cm3. Les fractions 68 à 84 sont réunies, lyophilisées et séchées sous pression réduite (0,3 mm de mercure ; 0,04 kPa) à 60eC. On obtient I ainsi 300*mg d'acide N^-[N-(N-oetanoyl 1 alanyl)-y-]) glutamyl] 15 Ii,h diamino-2,6 thia-4 pjLmélamique.

Hf = 0,25 [silicagel ; n.butanol - pyridine - acide acétique -eau (5Ο-2Ο-6-24 en volumes)]

Analyse ï Cale. % C 49,52 H 7,57 N 13,12 ‘ S 6,01

Tr. 45,3 7,4 11,7 5,7 20 Cendres sulfuriques : 1

Le N-o et anoyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle peut être préparé de la façon suivante :

On ajoute 3,6 cm3 de chloroformiate d'isobutyle dans une solution, maintenue à -1°C, de 3,95 g d'acide octanoïque dans 25 HO cm3 de tétrahydrofuranne et 3,8 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à -1 °C, puis on ajoute une I solution, refroidie à 0eC, de 9,45 g de chlorhydrate de L alanyl- a-D-glutamate de benzyle dans un mélange de 54,8 cm3 de soude 1 N et 30 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant 1 heure · 30 à -1°C puis pendant 20 heures'à 20°C environ. Il est ensuite acidifié à pH 1 par addition d'acide chlorhydrique 1 N. Le tétrahydrofuranne est évaporé sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kEa) à 45°C, puis le concentrât est extrait par 100 cm3 / d'acétate d'éthyle. La phase organique ainsi obtenue est lavée Z’/ 35 2 fois par 50 cm3 au total d'acide chlorhydrique 1 N et par /j/ y.

I 1 i i « · 91 25 cm3 d'une solution saturée de chlorure de sodium et concentrée à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 fcPa) à 45eC·

On obtient ainsi 10 g d'une huile jaune pâle qui est chromâtogra-phiée sur une colonne de 2,5 cm de diamètre contenant 200 g de gel 5 de silice neutre (0,0é3-0,20 mm). On élue avec de l'acétate d'éthyle en recueillant des fractions de 100 cm3. Les fractions 7 à 9 réunies sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 45°C. Le résidu obtenu est trituré .dans 100 cm3 d'un mélange éther - éther de pétrole (P.E. = 35-60°C) 10 ( 1-4 en volumes), séparé par filtration et séché. On obtient ^ - ainsi 3,27 g de N-octanoyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle sous forme d'une poudre blanche.

* Hf s 0,56 [silicagel ; acétate d'.éthyle - méthanol 8*t2 en volumes)] 15 EXEMPLE 20 -

On ajoute 1 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution maintenue à 10°C, de 5»047 g de N-(N-docosanoyl L alanyl) <x-D glutamate de benzyle dans un mélange de 160 cm3 de tétrahydro^ furanne et de 1,12 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité 20 pendant 20 minutes à 10°C, puis on ajoute une solution refroidie à 2 2°C de 3,023 g d'acide N -benzyloxycarbonyl L,L diamino-2,6 thia-4 pimélamique dans un mélange de 16 cm3 de soude N et 60. cm3 d'eau.

Le mélange réactionnel est agité pendant 16 heures à 20°C environ. On acidifie le mélange réactionnel à pH 1 par addition 25 de 6 cm3 d'acide chlorhydrique 4 N, on l'extrait 5 fois par 300 cm3 au total d'acétate d'éthyle. Les phases organiques réunies sont lavées successivement par 30 cm3 d’eau et 30 cm3 d'une solu- * tion saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de sodium et concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure; 30 2,7 kPa) à 50°C. On obtient ainsi 7»7 g de solide que l'on chroma tographie sur'150 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm) contenus dans une colonne de 3»5 cm de diamètre. Pour cela, on dissout les / 7,7 g de poudre dans 60 cm3 d'acide acétique et à la solutio^^/

I

f '> 92 obtenue, on ajoute 20 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm).

On évapore à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de . mercure } 2,7 kPa) à 50°C et le résidu ainsi obtenu est chargé sur la colonne de silice. On élue successivement avec 240 cm3 5 d'acétate d'éthyle, 320 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle -acide acétique (98-2 en volumes), 640 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle - acide acétique (95-5 en volumes), 3^0 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle - a,cide acétique (9-1 en volumes), 440 cm3 y''' ' * d'un mélange acétate d'éthyle - acide acétique (8-2 en volumes) 10 et 400 cm3 d'acide acétique en recueillant des fractions de 40 cm3*

Les fractions 11 à. 60 sont réunies, concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 50eC. On obtient 6 1

ainsi 4*51 g d'acide H -[o -benzyl N-(N-docosanoyl L alanyl)-y-D

glutamyl] N^-benzylorycarbonyl L,L diamino-2,6 thia-4 pimélamique ·* 15 impur.

(tâche principale) = 0,72 [silicagel ; acétate d'éthyle -acide acétique (9-1 en voluines)l On dissout 4»4 g d'acide N -[θ'-benzyl N-(lT-docosanoyl 1 alanyl)-y-D glutamyl]N -benzylorycarbonyl 1,1 diamino-2,6 20 thia-4 pimélamique dans un mélange de 220 cm3 de méthaaol et 10,1 cm3 de soude 1 N. On agite le mélange réactionnel.pendant 2 jours, le verse sur un mélange de 67Ο cm3 d'eau et 13 cm3 d'acide chlorhydrique 1 N ; le précipité obtenu est séparé par filtration, lavé 5 fois par 123 cm3 au total d'eau et séché sous 25 pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 KPa) à 20eC. On obtient ainsi 2,1 g de poudre crème que l'on dissout dans .un mélange de 8 cm3 d'acide bromhydrique en solution à 33 $ dans l'acide acétique et de 8 cm3 d'acide acétique. On agite le mélange réactionnel , pendant 3 heures à 20°G. L'insoluble formé est séparé par filtra- 30 tion, lavé successivement 3 fois par 12,3 cm3 au total d'acide acétique, par 5'cm3 d'éther et par 5 cm3 d'éther de pétrole (P.E.s 35-60°C), séché sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2.7 kPa) à 20°C. On obtient ainsi 1,66 g de poudre crème. Les filtrats sont réunis, concentrés à sec sous pression réduite (20 mm 35 de mercure ; 2,7 kPa) à 20eC,repris 3 fois par 150 cm3 au total

d'éther, concentrés à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; J

2.7 kPa) à 30°C et repris par un mélange de 25 cm3 d'éther et de x/ B 25 cm3 d'éther de pétrole (P.E. s 35-60°C), Le solide est séparé./par 93

t I I

» » filtration puis est lavé 2 fois par 20 cmj au total d'éther dè pétrole (P.E. = 35-60°C) et séché sous pression réduite (20 mm . . de mercure ; 2,7 kPa) à 20eC„ La totalité de la poudre obtenue (1,66 g + 0,55 g) est versée dans 500 cm3 d'eau fortement agitée.

5 Après 1 heure d'agitation, le précipité est séparé par filtration, lavé 3 fois par 150 cm3 au total d'eau et séché sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 20eC. On obtient ainsi 1,52 g de poudre crème que l'on chromatographie sur 45 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm) contenus dans une colonne de 2 cm de 10 diamètre. Pour cela, pn dissout 1,52 g de poudre dans 60 cm3 d'acide acétique tiédi à 60eC et, à la solution obtenue, on ajoute 5 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On évapore à sec le mélange sous pression réduite'(20 mm'de mercure ; 2,7 hPa) à 50°C.et le résidu ainsi obtenu est chargé sur la colonne de silice. On élue 15 avec de l'acide acétique en recueillant des fractions de· 30 cm3·

Les fractions 11 à 27 sont réunies, concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure j- 2,7 kPa) à 50°G. On obtient ainsi 720 mg de poudre rosée q^e l'on chromatographie sur 36 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm) contenus dans une colonne de 2 cm de 20 diamètre. Pour cela, on dissout les 720 mg de poudre dans 30 cm3 d'acide acétique et à-la solution obtenue, on ajoute 3 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On évapore à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 kPa) à 50°C et le résidu ainsi obtenu est chargé sur la colonne de' silice. On élue avec un mélange 25 acétate d'éthyle - acide acétique (2-8 en volumes) en recueillant des fractions de 40 cm3. Les fractions 12 à 29 sont réunies, concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7. kPa) à 50°C. Le résidu obtenu est trituré dans un mélange de 25 cm3 d'éther et 25 cm3 d'éther de pétrole (p.E.=35-60eC) » séparé'par 30 filtration et séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure ; „ 0,04 kPa) ’à 20°C. On obtient ainsi 220 mg d'acide N°-[N-(N-docosanoyl L alanyl)-Y-I) glutamyl] L,L diamino-2,6 thia-4 pimélamique.

Ef = 0,32 [silicagel ; n.butanol - pyridine - acide acétique -‘eau (5Ο-2Ο-6-24 en volumes)] / 35 Ef = 0,60 [silicagel ; acide acétique] / /

Spectre de masse : M = 729 (théorie : 729) j // y t t 94 • » r * ·

Le U-docosanoyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle p.eut être préparé de la façon suivante :

On ajoute 1,95 cm3 de chloroformiate d'isobutyTe à une solution, maintenue à 25°C, de 5,19 8 d'acide docosanoïque dans 5 un mélange de 150 cm3 de tétrahydrofuranne et de 2,1 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à 25°C, puis on ajoute une solution de 5,69 8 de chlorhydrate de L alanyl-a-L glutamate de benzyle dans un mélange de 35 cm3 de soude 1 U et 17'cm3 d?eau. Le .mélange réactionnel est agité pendant 30 minutes 10 vers 30°C, .puis pendant 18 .heures vers 20°C. environ. On ajoute alors 100 cm3 d'eau et on acidifie à pl 1. On obtient un précipité que l'on sépare par filtration, lave 3 fois par 75 cm3 au total d'eau et sèche sous pression réduite (0,3 mm de mercure ; 0,04 kPa) à 20°C. On obtient ainsi 6,55 8 d'uné poudre blanche. On en diBsout 15 6 g dans 50 cm3 de tétrahydrofuranne contenant,.20 g de gel de silice neutre (0,04-0,Q63 mm). On concentre à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure ; 2,7 £Pa) à 50°C et on charge l'ensemble sur une colonne de 3»5 cm de diamètre contenant 180 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par : 20 1300 cm3 d'un mélange cyclohexane - acétate d'éthyle (1-1 en volumes) 60.0 cm3 d'acétate d'éthyle 500 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle - tétrahydrofuranne (95-5 eu volumes) 900 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle - tétrahydrofuranne 25 (9-1 en volumes) 800 cm3 d'un mélange acétate .d'éthyle - tétrahydrofuranne (8-2 en volumes) 1000 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle - tétrahydrofuranne (6-4 en volumes) .

30 900 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle - tétrahydrofuranne (4-6 en volumes) 500 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle - tétrahydrofuranne (2-8 en volumes) et / 600 cm3 de tétrahydrofuranne en recueillant des fractions de /7 / 35 100 cm3. /jj/ ( i i « t 95

Les fractions 17 à 68 réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 ma de mercure ; 2,7 kPa) à 50eC. On obtient ainsi 3»31 g de N-docosanoyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle.

5 Ef = 0,54 [silicagel ; acétate d'éthyle - tétrahydrofuranne (8-2 en volumes)] / 1- • . * » Λ

Claims (15)

1. Un nouveau tri-, tétra- ou pentapeptide caractérisé en ce qu'il répond à la formule générale : aCO-HHCHCO-HECHCO-E1 Ah, Ah2ch2oo -NHCH-Eg • ' Ψ& B,-HH CH-E. · 3 4 3 dans laquelle ECO- représente un reste d'acide gras dans lequel E représente un radical alcoyle-contenant 1 à 44 atomes de carbone (éventuellement substitué par un radical hydroxy, phényle ou cyclohexyle), alcényle contenant 2 à 29 atomes de carbone et pouvant contenir 10 plus d'une double liaison ou un reste d'acide mycolique tel que rencontré dans la structure de la paroi bactérienne des mycobactéries, de Nocardia ou de corynébactéries, B.j représente un radical hydroxy, amino, alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone ou benzyloxy, 15 les symboles Bg et B^, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou un radical carboxy, carbamoyle, alcoyloxy-carbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone, benzyloxycarbonyle, N-carbonylglycyle ou N-carbonyl B alanyle éventuellement estérifié par un radical alcoyle contenant 1 à 4 20 atomes de carbone ou benzyle, étant entendu que B2 et E^ ne peuvent ' pas représenter simultanément un atome d'hydrogène, E, représente un atome d'hydrogène ou un reste glycyle ou E alanyle, «» V étant entendu que, lorsque Bg et E^, identiques ou différents, représentent chacun un radical N-carbonylglÿcyle ou N-carbonyl 25 B alanyle, E^ représente un atome d'hydrogène, X représente un atome de soufre ou un radical méthylène, m et n, identiques ou / différents, représentent chacun un nombre entier égal à 1 ou 2, Sf • - r .97: V I I t • * étant entendu que, lorsque X représente un radical méthylène, i et n ne peuvent pas être simultanément égaux à 1, étant entendu que l'alanine liée à l'acide glutamique est 30us forme L, l'acide glutamique est sous forme h, la lanthionine, lorsque X représente un atome de soufre et m et n sont égaux à 1, la 5 cystathionine, lorsque X représente un atome de soufre et m et n sont différents, l'homolanthionine, lorsque X représente un atome de soufre et m et n sont égaux à 2, l'acide diamino-2,7 . subérique*, lorsque X représente un radical méthylène et l'un des symboles m ou n est égal à 1 et l11 autre est égal à 2, sont sous 10 forme S,D j L,L ; SD, LL· (racémique) ou S,L (méso) ou sous forme des mélanges L,meso ou S,meso, et la thialysine, lorsque l'un des symboles R2 ou R^ représente un atome d'hydrogène, X représente un atome de soufre et m et'n sont égaux à 1, est sous forme L· ou S ou D,L.ainsi que leurs sels.

2. Procédé de préparation d'un produit selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on fait réagir un dipeptide de formule générale : RCO-HHCHCO-HHCHCO-R^ CHj CïïgCHgCOOH dans laquelle R est défini comme dans la revendication 1 et 20 R(j représente un radical amino ou alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone ou benzyloxy, sur un produit de formule générale : h2roh-r2 Wm φΛ Rg-HHCE-R^ dans laquelle R2, R^, X, m et n sont définis comme dans la revendication 1 et Rg représente un groupement protecteur de la fonction 25 amine ou un. reste glycyle ou S alanyle dont la fonction amine est substituée par un groupement protecteur, suivie du remplacement dvJ groupement protecteur représenté ou porté par Rg par un atome /J / 98 *1 I » « k* d'hydrogène et éventuellement du remplacement du radioal B,., lorsqu'il représente un radical alcoylozy contenant 1 à 4 atomes de carbone ou benzyloxy, par un radical hydroxy et des radicaux alcqyloxycarbonyles contenant 2 à 5 atomes de carbone ou benzyloxy-5 carbonyles représentés ou portée par Bg et/ou B^ par des radicaux carboxy, et isole le produit obtenu éventuellement sous forme de sel.

3· Procédé de préparation d'un produit selon la revendication 1 * caractérisé en ce que l'on fait réagir un dérivé de la-L· alanine 10 de.formule générale : ' BCO-HHCHCO-OH l . “ï· ... dans laquelle B est défini comme dans la revendication 1, sur un di-, tri- ou tétrapeptide de formule .générale t HgïïCHCO-B.j ch2(3H2co-hhce-b2 (ΓΑ· Bg-HHOH-B^ 13 dans laquelle B^, Bg, B^, X, m et n sont définis oomme dans la revendication 1 et Bg est défini comme dans la revendication 2, suivie du remplacement du groupement protecteur représenté ou porté par Bg par un atome d'hydrogène et éventuellement du remplacement du radical B^, lorsqu'il représente un radical alcoylozy 20 contenant l à 4 atomes de carbone ou benzyloxy, par un radical hydroxy, et des radicaux alcoylozycarbonyles contenant 2 à 5 atomes de carbone ou benzyloxy carbonyles représentés ou portés par Bg et/ou B^ par des radicaux carboxy, et isole le produit obtenu, éventuellement sous forme de sel. ' 23 4* Procédé de préparation d'un produit selon la revendication 1 , oarac$ériBé en oe que l'on fait réagir un aoide de formule générale t / BC0-0H n/Y 99 . ' ». « · ί> \ ÔLans laquelle Η est défini comme dans la revendication 1, ou un dérivé activé de cet acide» sur un tri-, tétra- ou pentapeptide de foxm\*le générale : h2uchco-hhchco-e1 CH, CH_CHoC0-ÏÏHCK-Eo J 6 6 \ ά X <H>» ". Eg-MCH-B^ 5 dan« laquelle Ej, Bg, B^, X, i et n sont définis comme dans la revendication 1 et Bg est défini comme dans la revendication 2, suivie du remplacement du groupement proteoteur porté par Bg par un atome d'hydrogène et éventuellement du radical B^, lorsqu'il représente un radical alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone 10 ou benzyloxy, par un radical hydroxy, et des radicaux alcoyloxy- carbcnyles contenant 2 à 5 atomes de carbone ou benzyloxycarbonyles , représentés ou portés par B2 et/ou E^ par des radicaux carboxy, puif isole le produit obtenu éventuellement sous forme de sel, 5, procédé de préparation d'un produit selon la revendication 1 15 pour lequel les symboles B2 et/ou B^ représentent un radical U-cjrbonylglycyle ou N-carbonyl B alanyle éventuellement estérifié par vm radical alcoyle contenant 1 à 4 atomes de carbone ou benîyla caractérisé en ce que l'on fait réagir un amincaoide de foxgrule générale :

20 H^OHCO-Bg ·.·'·. *7. àa»$ laquelle Βγ représente un atome d'hydrogène ou un radical ué&yle, l'aminoacide étant dans oe oas sous forme B, et Bq repré-' senîa un radical hydroxy ou alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de , caiiwne ou benzyloxy, .sur-un peptide de formule, générale s / »I · . · • > 100 » Λ m BC0-NHjJHCq-NHj!HC0-E5 CS, CHoCHoC0-HHCH-EQ 5 Z d t ? (fV» 4¾ h6-sh-oh-e]0 dans laquelle H, B^, Eg, X, m et n sont définis comme précédemment et l'un des symboles E^ ou B^q représentant un radical carboxy, l'autre représente un atome d'hydrogène ou un radical carboxy, _ 5 carbamoyle, alcoyloxycarbonyle contenant 2 à 5 atomes de carbone, benzyloxycarbonyle, N-carbonylglycyle ou B-carbonyl B alanyle ; estérifié par un radical alcoyle contenant 1 à 4 atomes de carbone ou benzyle, étant entendu que lorsque et B^q représentent j chacun un radical carboxy, Bg- représente un groupement protecteur i 10 de la fonction amine, suivie éventuellement du remplacement des radicaux E^ et/ou Bg, lorsqu'ils représentent un radical alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone ou benzyloxy, par un radical hydroxy, et/ou des radicaux alcoyloxycarbonyles contenant 2 à 5 atomes de carbone ou benzyloxycarbonyles représentés ou portée 15 P®* 2^ ou E10 par un radical carboxy, et du remplacement du* ! groupement protecteur représenté ou porté par Bg par un atome , d'hydrogène, puis isole le produit obtenu éventuellement sous forme de sel.

6. Procédé selon la revendication 5 pour la préparation d'un i » 1 20 produit selon la revendication 1 pour lequel les symboles Bg et I B. sont identiques et représentent un radical N-carbonylglycyle ou j. . N-carbonyl B alanyle éventuellement estérifié caractérisé en ce que | l'on fait réagir un aminoacide de formule générale t !..♦'· ‘ s„n chco-Bq i · !. 25 dans laquelle B. et Kg sont définie comme dans la revendication 5, sur un produit de formule générale t • . * · EGO -NHGÏÏGO -NHCHCO-E^ CH, CHgCHgCOHHCHGO-OH * W- i, / f // w» if 101 lit •A dans laquelle R, R,., X, m et n sont définis comme dans la revendication 1 et Rg représente un groupement protecteur de la fonction amine, suivi du remplacement du radioal Rg par un atome d'hydrogène et éventuellement des radicaux R^ et/ou Rg par un radical hydroxy, 5 et isole le produit obtenu. 7* Procédé selon la revendication 5 pour la préparation d'un produit selon la revendication 1 pour lequel les symboles Rg et R^ sont identiques ou différents et représentent un radical N-oar-bonylglycyle ou N-carbonyl R alanyle éventuellement eetérifié 10 caractérisé en ce que l'on fait réagir un aminoacide de formule générale't HoNCEC0-Rfl % 8 dans laquelle Ry et Rg sont définis comme dans la revendication 5» sur un produit de formule générale t RCO-HïïpHCO-HHCHCO-R,. CH, CHgCHgCO-HHCH-R 15 ? φΆι Rg—HH—CH—R.j q dans laquelle R, R^f X, m et n sont définis comme dans la revendication 1 et Rg représente un groupement protecteur de la fonction amine, l'un des symboles R^ ou R^Q représente un radical carboxy et l'autre représente un radical alcoyloxycarbonyle conte— 20 nant 2 à 5 atomes de carbone ou benzyloxycarbonyle; puis, après remplacement du radical alcoyloxycarbonyle ou benzyloxycarbonyle par un radioal carboxy, fait réagir l'aminoaoide de formule » * générale t HgHpHGO-Rg R' 7 25 dans laquelle Rg est défini comme ci-dessus et R'y est identique au ou différent du radical Ηγ de l'aminoacide- utilisé ci-dessus, tsuivi du remplacement du radical Rg par un atome d'hydrogène et éventuellement des radicaux Rj ou Rjq par un radical carboxy et des/ . radicaux R,- et/ou Rg par un radioal hydroxy, et isole le produit/y 30 obtenu éventuellement sous forme de sel· //fl *ι V k # ^ iJf % 102

8· Procédé de préparation d'un produit selon la revendication 1 pour lequel E^ représente un radical glycyle ou 3) alanyle caractérisé en ce que l'on fait réagir un aminoacide de formule générale: Ei Λ -NHCHC0-0H 5 dans laquelle Βγ est défini comme dans la revendication 5 et représente un groupement protecteur de la fonction amine sur un tri- ou tétrapeptide de formule générale : v EC0-HlCHC0-]JHpC0-Hî . lîgj CHgCHgCO-HHCH-Eg ’ * <Κ’· · • (k)n . H-N-CH-E. » 1 ^4 Idans laquelle Ef , Eg, E^, X, m et n sont définis comme dans la 10 revendication 1, étant entendu que Eg et E^ ne peuvent pas représenter simultanément un radical N-carbonylglycyle ou H-carbonyl 3. alanyle éventuellement estérifié, puis replace le radical E^ par un atome d'hydrogène et éventuellement le radical E^, lorsqu'il représente un radical alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone 15 ou benzyloxy, par un radical hydroxy et des radicaux alooyloxy- carbonyles contenant 2 à 5 atomes de carbone ou benzyloxycarbozyles. représentés par Bg et/ou E^ par des radicaux oarboxy, puis isole le produit obtenu éventuellement sous forme de sel. ‘ 9. Procédé de préparation d'un produit selon la revendication 1 20 caractérisé en ce que l'on fait réagir un produit de formule générale : B1 j-HHGHCO-E, CHgCHgCO-NHjîHOO-Y CHg-Zg dans laquelle E^ est défini comme dans la revendication 1 E^ représente un groupement protecteur de la fonction amine ou un reste / 25 1) alanyle dont la fonction amine est substituée par un groupement? / 103 ' ' *. » . \ s protecteur de la fonction amine ou par un reste d'acide gras, Y représente un radical hydroxy, alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone, benzyloxy, H-glycyle ou· N-D alanyle éventuellement estérifié par un radical alcoyle contenant 1 à 4 5 atomes de carbone ou benzyle et Zg représente un groupement -SH ou un atome d'halogène, autre que le fluor, ou un reste d'ester réaotif tel qu'un radical toluène suif onyle ou méthane suif onyle, sur un produit de formule générale : X1-HH^HC0-T1 «Vi · 10 dans laquelle X^ représente un atome d'hydrogène ou un groupement protecteur de la fonction amine ou un reste glycyle ou 1) alanyle. dont la fonction amine est éventuellement substituée par un groupement protecteur de la fonction amine, représente un y radical hydroxy, alcoyl,oxy contenant 1 à 4 atomes de carbone, 15 benzyloxy, N-glycyle ou H- S alanyle éventuelle— · ment estérifié et Z'g a la même définition que Zg, étant entendu que l'un des symboles Zg ou Z'g représente un groupement -SH et que lorsque Z'g représente un reste toluène suif onyle et méthane-sulfonyle, Xj est différent d'un reste glycyle ou D alanyle, puis, 20 lorsque représente un groupement protecteur de la fonction amine, remplace ce groupement protecteur par un atome d'hydrogène et fait agir un dérivé de la L alanine dont la fonction amine est substituée par un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine et, dans ce dernier cas, d'uu acide gras . 25 de formule générale BCOOH dans laquelle B est défini comme dans la revendication 1 ; après élimination de ce groupement protecteur, ou, lorsque B^ représente un reste L alanyle dont la fonction amine est substituée par un groupement protecteur de la fonction amine, fait agir un acide gras de formule BCOOH, après élimination - 30 de ce groupement protecteur, puis élimine, le cas échéant, les groupements protecteurs représentés ou portés par E^, T, X^ et y sans toucher au reste de la molécule, et isole le produit obtenu / éventuellement sous forme de sel. A/. If « m

10· Procédé de préparation d'un produit selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on fixe sur un support approprié un amino-aoide ou un peptide de formule générale : R^ EHCH—R^ (fVn 5 dans laquelle X, a et n sont définis comme- dans la' revendication 1» l'un des symboles Eg ou ^ représente un radical carboxy, E-carbo-nylglycyle ou E-carbonyl B alanyle et l'autre représente un atome d'hydrogène ou un radical carbamoyle, alcoyloxycarbonyle contenant 2 à 5 atomes de carbone» benzyloxyoarbonyle, H-carbonylglycyle ou ¥

10 E-earbonyl B alanyle estérifié par un radical aîcoyle contenant 1 à 4 atomes de carbone ou benzyle, R^g représente un groupement protecteur de la.fonction amine ou un radical glycyle ou E alanyle dont la fonction amine est substituée par un groupement protecteur de la fonction amine et Ε^γ représente un groupement protecteur 15 de la fonction amine» étant entendu que les groupements protecteurs représentés ou portés par R^g et Ε^γ sont différents» puis» après déblooage de la fonotion amine protégée par Ε^γ» oondense l'aoide E glutamique dont les fonctions amine et α-carboxy sont convenablement protégées» c'est-à-dire le produit'de formule générale : E,.-EHCHCO-R,. 20 18 J 5 CHgCHgCO-OH dans laquelle E^g représente un groupement protecteur de la fonction . amine et E^ représente un radical amino» alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de oarbone ou benzyloxy, puis» après déblocage de la fonction amine protégée per R.jg» condense un dérivé de la L alanine / 25 de formule générale : A7 R14-NH0HC0-0H nJ/ '·· uf . J · 405 dans laquelle représente un groupement protecteur de la fonction amine, poils, après déblocage de la fonction amine protégée par E^, condense l'acide de formule générale s ECO-OH 5 dans laquelle E est défini comme dans la revendication 1, puis sépare le produit obtenu de son support et élimine, si nécessaire, les groupements protecteurs des fonctions amines et carboxy, et isole le produit obtenu éventuellement sous forme de sel.

11. Procédé de préparation d'pn produit selon la revendication 1 10 caractérisé en ce que l'on fixe sur un support approprié un amino-acide ou un peptide de formule générale : E17-NHpH-E2 (ρΛ ειΓηηοη-ι4 dans laquelle Eg, E^, E^g, E^, X, m et n sont définis comme dans la revendication 10, puis, après déblocage de la fonction amine 15 protégée par E^, condense un dérivé de l'acide glutamique de formule générale : v E, o-HHCHCO-Ec 10 1 5 ch2ch2co-oh dans laquelle E^ et E1Q sont définis comme dans la revendication 10, puis, après déblocage de la fonction amine protégée par E^g, 20 condense un dérivé de la L alanine de formule générale : EC0-HHCHC0-01 dans laquelle E est défini comme dans la revendication 1, puis 5 sépare le produit obtenu de son support et élimine si nécessaire les groupements protecteurs des fonctions amines et carboxy, et/ ’ 25 isole le produit obtenu éventuellement sous forme de sel.

12. Procédé de préparation d'un produit selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on fixe sur un support approprié un aminoacide ou un peptide de formule générale : 106 « » l u -NHÇH-Eg <P2>- <^A> • 16 4’ 5 dans laquelle R,,, E^g, R^, X, m et n sont définis comme dans la revendication 10, puis, après déblocage de la fonction amine protégée par R^y, condense un dipeptide de formule générale : R19-NHj!HCO-ÎIHpCO-a5 CHj CHgCHgCO-OH dans laquelle R,. est défini comme dans la revendication 10 et R^ 10 représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine différent de celui représenté ou porté par R-jg» et que, lorsque R^ représente un groupement protecteur de la fonction amine, on fait réagir l'acide de formule générale : RC0-0H 15 dans laquelle R est défini comme dans la revendication 1, après déblocage de la fonction amine protégée par R^, puis sépare le produit obtenu de son support et élimine si nécessaire les groupements protecteurs des fonctions amine et carboxy, et isole le produit obtenu éventuellement sous forme de sel. 20 13· Procédé de préparation d'un produit selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on fixe sur un support approprié le peptide de formule générale * R20-NHj5HCO-R5 CHgCHgCO-HHCH-Rg fJ» . /- (l2>n /}/ 107. * » , J dans laquelle Rg» ^4» ^5» X» m et n sont définis comme dans la revendication 10 et EgQ représente -un groupement protecteur de la fonction amine différent de celui représenté ou porté par R.jg, puis après déblocage de la fonction amine protégée par EgQ, 011 con<ienBe 5 un dérivé ie la L alanine de formule générale : e14-nh^hco-oh CE- 3 dans laquelle E^ est défini comme dans la revendication 10,puis après déblocage de la fonction amine protégée par E^, on condense l’acide d% formule générale :

10 ECO-OH dans laquelle E est défini comme dans la revendication 1, puis sépare le produit obtenu de son support et élimine, si nécessaire, les groupements protecteurs des fonctions amines et carboxy, et isole le produit obtenu éventuellement sous forme de sel· 15 14· Procédé de préparation d’un produit selon la revendication 1 caractérisé en ce que l’on fixe sur un support approprié le peptide de formule générale s E20-HHCHC0-E5 CHgCHgCO-NHÇH-Eg (pVm X (K’» E16-HHCH-E4 dans laquelle Eg, E^, B^, E^, X, m et n sont définis comme dans la 20 revendication 10 et EgQ est défini comme dans la revendication 13, puis, apr&s déblocage de la fonction amine protégée par EgQ, on condense un dérivé de la L alanine de formule générale ï ECO-EH^HCO-OST- dans laquelle E est défini comme dans la revendication 1, puis sépare 25 le produit obtenu de son support et élimine éventuellement les grou^ pements protecteurs des fonctions amineB et carboxy, et isole 1.fj / -produit Obtenu éventuellement sous forme de sel. / Jy * » *> ' V ' K m 108

15· Procédé de préparation d'un produit selon la revendication 1y caractérisé en ce que l'on fixe sur un support approprié le peptide de formule générale : H21 -HHpHGO-HHpHCO-E^ CH, CHoCHftC0-HHCH-Ho J d d I Z ' bi6-shch-s4 5 dans laquelle Eg» E^, E,-, E^, X, m et n sont définis comme dans la revendication 10 et E^^ représente un groupement protecteur de la fonction amine différent du groupement protecteur représenté ou porté par B^g, puis, après déblocage de la fonotlon amine protégée par Bg.j, on oondense l'acide de formule générale t

10 ECO-OH dans laquelle E est défini comme dans la revendication 1, puis sépare le produit obtenu de son support, élimine si nécessaire les groupements protecteurs des fonctions amines et oarboxy, et isole le produit obtenu éventuellement sous forme de sel. .15 16. Procédé de préparation d'un produit selon la revendication 1 pour lequel l'un des symboles Eg ou E^ représente un radical N-carbonylglycyle ou N-carbonyl E alanyle et l'autre représente un atome d'bydrogène ou un radical carboxy, carbamoyle, alooy 1 oxycar-bonyle contenant 1 à 4 atomes de carbone, benzyloxycarbonyle,

20 N-carbonylglycyle ou N-carbonyl E alanyle éventuellement estérifié par un radical alcoyle contenant 2 à 5 atomes de carbone ou benzyle caractérisé en ce que l'on fixe sur un support approprié la glycine ou la E alanine dont la fonction amine est protégée, puis, après déblocage de la fonction amine, oondense un aminoaoide ou un • 25 peptide de formule générale i / . e22-hhçh-h2 - // (f2)* · f (k)n ' . 109 * 5» ti dans laquelle X, m et n sont définis comme dans la revendication 1, l’un des symboles Rg ou R^ représente un radical carboxy et l'autre représente un atome d'hydrogène ou un radical carbamoylef alcoyloxycarbonyle contenant 1 à A atomes de carboney benzyloxy-5 oarbonylé, M-carbonylglycyle ou H-carbonyl R alanyle estérifié par un radical alooyle contenant 2 à 5 atomes de carbone ou benzyle, R^ est défini comme dans la revendication 10 et Rgg représente un groupement protecteur de la fonction amine différent de celui qui est représenté par R^ g, puis après déblocage de la fonction 10 amine protégée par R22, met en oeuvre le procédé selon l'une des w revendications 10, 11 ou 12, puis isole le produit obtenu éventuellement sous forme de sel. £

16. Médicament caractérisé en oe qu'il est constitué par le produit selon la revendication 1 à l'état pur ou en présence d'un 15 ou plusieurs diluants compatibles et pharmaoehtiquement acceptables· Dessins : —planches • pages dont .....page de garde JzlaL.. pages de description pages de revendications abrégé descriptif Luxembourg, le Le nwrçlataire : fy Charles München s m 1 ♦ * · * • *