DE68924265T2

DE68924265T2 - Verwendung von einem reagens zum nachweis eines mit einem säurebeständigen bakterienantigen übereinstimmenden antikörpers.

Info

Publication number: DE68924265T2
Application number: DE68924265T
Authority: DE
Inventors: Yoshiko Kato; Yayoi Natsuhara; Shiro Oka; Yoshiteru Ueno; Ikuya Yano; Junji Yoshinaga
Original assignee: Sawai Pharmaceutical Co Ltd; Medisa Shinyaku Inc
Current assignee: Sawai Pharmaceutical Co Ltd; Medisa Shinyaku Inc
Priority date: 1989-01-18
Filing date: 1989-12-28
Publication date: 1996-02-15
Anticipated expiration: 2009-12-29
Also published as: DE68924265D1; WO1990008323A1; EP0407605A4; EP0407605B1; EP0407605A1

Description

TECHNISCHES GEBIET

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung eines besonderen Reagenzes zum Nachweisen eines Antikörpers gegen ein säurefestes bakterielles Antigen.

STAND DER TECHNIK

Die säurefesten Bakterien sind durch die Anwesenheit von Mykolsäure, einer äußerst stark hydrophoben, langkettigen Fettsäure auf der Oberflächenschicht ihrer Zellen gekennzeichnet. Die Mykolsäure liegt sowohl gebunden an verschiedene Lipide, Saccharide, Peptide und andere Substanzen als auch an Arabinogalactan vor.
Vor allem erregte Trehalosedimykolat (nachfolgend als TDM abgekürzt), eine an ein Saccharid gebundene Mykolsäure, welches auch als Cordfaktor bei Tuberkelbazillen bekannt ist, unter dem Gesichtspunkt seines engen Bezugs zur Pathogenität des Bazillus auf einmal viel Aufmerksamkeit als toxisches Glykolipidprodukt, das durch menschliche Tuberkelbazillen produziert wird. In den letzten Jahren ist gefunden worden, daß TDM in den Zellwänden einer großen Zahl anderer Bakterienarten der Gattung Mycobacterium und damit eng verwandter nicht-pathogener Aktinomyzeten, wie etwa den zur Gattung Nocardia und Rhodococcus gehörigen, ebenfalls weitverbreitet ist.
Es ist ferner bekannt, daß die in den Zellwänden säurefester Bakterien gefundene Mykolsäure nicht nur als TDM, sondern auch als mykolsäurehaltige Glykolipide (nachstehend als MGL bezeichnet), wie etwa Glucoseinonomykolat, Glucosedimykolat, Fructosemonomykolat, Arabinosemonomykolat, Mannosemonomykolat, Trehalosemonomykolat, Trehalosetrimykolat und Trehalosetetramykolat, auftritt.
Diese MGLs haben dadurch viel Aufmerksamkeit erregt, daß sie eine breite Vielfalt immunopharmakologischer Bioaktivitäten, wie etwa sowohl Immunadjuvansaktivitäten, eine nicht-spezifische Schutzimmunität, Granulombildungsvermögen, Makrophagenaktivierungsvermögen und Antitumoraktivitäten als auch Toxizitäten besitzen [s. Kekkaku, 63 (3), 41-54 (1988) und die Proceedings of the 11th Meeting of the Japanese Society for Medical Mass Spectrometry, 11, 63-72 (1986)].
Eine besondere Art Mykolsäure ist für Bakterienarten spezifisch, die als ein wichtiger Faktor zur Bestimmung säurefester Bakterien dienen. In der Zwischenzeit ist bereits die Unterklassenzusammensetzung und die molekulare Zusammensetzung von Mykolsäure für jede Bakterienart aufgeklärt worden [s. Journal of Clinical Microbiology, 24 (6), 106-1070 (1986) und das Journal of General Microbiology, 134, 2213-2229 (1988)].
Es ist deshalb möglich, säurefeste Bakterien und zwar infektiöse Bakterienarten durch Ermitteln des Antikörpers gegen die aus jeder Bakterienart stammende Mykolsäure oder ihre Derivate nachzuweisen.
Da diese Bakterienarten jedoch hauptsächlich durch Analysieren der morphologischen und biologischen Merkmale von Bakterienzellen nachgewiesen wurden, die nach Isolierung der Kultur erhalten wurden, hat dieses Nachweisverfahren Problem wie etwa den Mangel an Schnelligkeit und eine unbefriedigende Zuverlässigkeit der Ergebnisse aufgrund bei einigen Arten erhaltener widersprüchlicher Ergebnisse der Beurteilung aufgeworfen.
Es ist eine wohlbekannte Tatsache, daß Infektionen mit dem Tuberkelbazillus oder eng damit verwandten säurefesten Bakterien hauptsächlich mit Epitheloidzellengranulomen verlaufen, was auf verschiedenen immunologischen Reaktionen beruht, und Tuberkel und Kavitation, die charakteristischste Läsionen, hervorrufen. Es gibt jedoch kein Verfahren zur schnellen Identifizierung dieser infektiösen Bakterien. Bei diesem Hintergrund besteht eine starke Nachfrage nach einem Verfahren zur schnellen Diagnose dieser Infektionen mit dem Tuberkelbazillus oder damit eng verwandten säurefesten Bakterien.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Reagenz zur Bestimmung säurefester Bakterienarten und säurefester Bakteriengattungen (einschließlich der Gattungen Mycobacterium, Nocardia und Rhodococcus) bereitzustellen.
Es ist ein weitere Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Bestimmung säurefester Bakterienarten und säurefester Bakteriengattungen (einschließlich der Gattungen Mycobacterium, Nocardia und Rhodococcus) bereitzustellen.
Es ist noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur raschen Diagnose von Infektionen mit säurefesten Bakterien beim Menschen und anderen Tieren bereitzustellen.

OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Die Erfinder führten ausgedehnte Untersuchungen an Mykolsäure und ihren Derivaten, Zellwand-Lipidbestandteilen der Zellen von Tuberkelbazillen und anderen säurefesten Bakterien durch und haben gefunden, daß ein als Antwort auf die Verabreichung von aus diesen Bakterienzellen erhaltenem MGL an lebende Körper produzierter Antikörper eine Mykolsäure-Struktureinheit (und zwar Mykolsäure selbst oder ein Derivat derselben) als Antigen erkennt und ferner strukturelle Unterschiede innerhalb der Mykolsäure- Unterklassen erkennt. Die Erfinder haben ferner gefunden, daß ein Antikörper in Patienten mit einer Infektion durch säurefeste Bakterien eine Mykolsäure, ein Mykolsäuresalz, einen Mykolsäureester oder einen Ester einer anderen Fettsäure mit einer Kohlenstoffzahl von 14 oder mehr als Mykolsäure mit einem Mono- oder Disaccarid als Antigen erkennt, und daß, wenn als Probe eine Körperflüssigkeit eines mit einem Tuberkelbazillus oder einem damit nahe verwandten säurefesten Bakterium infizierten Patienten verwendet wird, der darin enthaltene Antikörper die vorgenannten Verbindungen als Antigene erkennt. Die Erfinder führten auf der Grundlage dieser Befunde weitere Untersuchungen durch und vervollständigten die vorliegende Erfindung.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Verbindung, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Mykolsäuren, Mykolsäuresalzen, Mykolsäureestern und Estern anderer Fettsäuren mit einer Kohlenstoff zahl von 14 und mehr als Mykolsäure mit einem Mono- oder Disaccharid ausgewählt ist, in einem ELISA-Verfahren zum Nachweisen eines Antikörpers gegen ein säurefestes bakterielles Antigen in einer Serumprobe (einschließlich der Gattungen Mycobacterium, Nocardia und Rhodococcus) bereit.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose säurefester bakterieller Infektionen bereit, wobei der Unterschied in der Absorption zwischen einer einem gesunden Menschen entnommenen Probe und einer Probe aus einem Patienten durch ein Nachweisverfahren für einen Antikörper gegen ein vorstehend beschriebenes säurefestes bakterielles Antigen bestimmt wird.
In der vorliegenden Erfindung sind die säurefesten Bakteriengattungen hauptsächlich Mycobacterium, Nocardia und Rhodococcus usw. Beispiele der Gattung Mycobacterium angehörender säurefester Bakterienarten schließen Tuberkelbazillen wie etwa M. tuberculosis und M. bovis und damit nahe verwandte säurefeste Bakterien wie etwa M. kansasii, M. leprae, M. intracellulare-M. avium-Komplex und atypische Mykobakterien wie etwa N. scrofulaceum und M. fortuitum ein.
Im Umfang der vorliegenden Erfindung ist Mykolsäure als Verbindung mit einer Struktur der folgenden Formel (I) definiert:
worin R¹ und R² unabhängig eine normale oder verzweigte aliphatische C&sub1;&sub0;&submin;&sub6;&sub0;-Kette darstellen.
Hier können R¹ und R² Gruppen mit unterschiedlichen Polaritäten besitzen, z.B. Cycloalkylgruppen, wie etwa ein Cyclopropanring, Niederalkylgruppen wie etwa eine Methylgruppe, Niederalkoxygruppen wie etwa eine Methoxygruppe, Epoxygruppe, Hydroxygruppe, Carbonylgruppe und Carboxylgruppe, und können eine Doppelbindung (vorzugsweise 1 bis 7 Doppelbindungen) besitzen.
Die Struktur der aus Bakterienzellen erhaltenen Mykolsäure schwankt unter den Bakterienarten breit und die Kohlenstoffgesamtzahl, Doppelbindungszahl und die Kohlenstoff zahl von R¹ und R² sind taxonomisch signifikant. Was die Kohlenstoffgesamtzahl betrifft, so schwankt sie breit. Zum Beispiel ist C&sub8;&sub0; oder mehr oft bei der Gattung Mycobacterium, C&sub5;&sub0; oder derart bei der Gattung Nocardia und C&sub3;&sub0; oder derart bei der Gattung Corynebacterium der Fall. Außerdem besitzen R¹ und R² verschiedene Gruppen mit unterschiedlichen Polaritäten, wie etwa ein Cyclopropanring, eine Methylgruppe, Methoxygruppe, Epoxygruppe, Hydroxygruppe, Carbonylgruppe und Carboxylgruppe. Diese Tatsachen sind bereits bekannt ["Biseibutu no Kagaku Jikkenho", verlegt von Gakkai Syuppan Center, 131-143 (10. Februar 1985, 3. Auflage); European Journal of Biochemistry, 139, 173-180 (1984)].
Es ist jedoch anzumerken, daß der Unterschied im Substituenten bei der Bestimmung von Bakterienarten in der vorliegenden Erfindung von Bedeutung ist. Zum Beispiel ist von den folgenden Unterklassen bekannt, daß sie aus Bakterienzellen erhalten werden können. (a) α-Mykolsäure (C&sub7;&sub8; < , M. tuberculosis)) (b) Methoxymykolsäure (C&sub8;&sub5; < , M. tuberculosis) (c) β-Mykolsäure (oder Ketomykolsäure) (C&sub8;&sub5; < , M. tuberculosis) (d) Dicarboxymykolsäure (C&sub6;&sub0; < , M. phlei)
Beispiele schließen auch α'-Mykolsäure (dasselbe wie α-Mykolsäure mit Ausnahme der Kohlenstoff zahl) und diejenigen mit einer Epoxygruppe ein.
Die von der vorliegenden Erfindung umfaßte Mykolsäure ist wie vorstehend definiert' aber die vorstehend dargestellten Kohlenstoffzahlen sind Durchschnittswerte und die Mykolsäure kann ein Gemisch verschiedener Mykolsäuren mit unterschiedlichen Kohlenstoffzahlen sein.
In der vorliegenden Erfindung bedeutet das Mykolsäuresalz das Salz der vorstehend definierten Mykolsäure mit einem Metall wie etwa Natrium oder Kalium.
In der vorliegenden Erfindung bedeutet der Mykolsäureester nicht nur einen Ester mit einem Mono- oder Disaccharid, sondern auch einen Alkyl-, Alkenyl-, Silyl- oder Arylester. Diese Ester unterliegen keiner Einschränkung so lange sie die Antigen-Antikörper-Reaktion nicht beeinträchtigen. Beispiele derartiger Ester schließen den Methylester, Ethylester, t-Butylester, Phenylester, Trimethylsilylester und Benzylester ein.
Die andere Fettsäure mit einer Kohlenstoff zahl von 14 oder mehr (vorzugsweise 14 bis 80, bevorzugter 14 bis 40) als Mykolsäure bedeutet eine gesättigte oder ungesättigte aliphatische Carbonsäure, die einen Substituenten, wie etwa eine Hydroxylgruppe, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkoxygruppe, eine C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylgruppe, eine Epoxygruppe, eine Carbonylgruppe oder eine Carboxylgruppe besitzen kann. Beispiele einfacher Fettsäuren ohne Substituent schließen gesättigte Fettsäuren, wie etwa Myristinsäure, Pentadecansäure, Palmitinsäure, Heptadecansäure, Stearinsäure, Nonadecansäure, Arachinsäure, Behensäure, Lignocerinsäure, Cerotinsäure, Heptacosansäure, Montansäure, Melissinsäure und Vaccensäure, und ungesättigte Fettsäuren, wie etwa Ölsäure, Elaidinsäure, Cetoleinsäure, Erucasäure, Brassidinsäure, Linolsäure, Linolensäure, Arachidonsäure und Stearolsäure, ein.
In der vorliegenden Erfindung bedeutet das Monosaccharid nicht nur ein normales, verzweigtes oder cyclisches Monosaccharid, wie etwa Pentose, Hexose, Heptose, Octose, Nonose oder Decose, sondern auch ein Substitutionsprodukt, wie etwa ein Desoxyzukker, Methylzucker, Thiozucker oder Aminozucker.
Das Disaccharid bedeutet Maltose, Cellobiose, Gentobiose, Melibiose, Lactose, Turanose, Sophorose, Trehalose, Isotrehalose, Sucrose oder Isosaccharose.
In der vorliegenden Erfindung unterliegen das Alkyl, Alkenyl oder Aryl keiner Einschränkung. Beispiele davon schließen Alkyle (z.B. normale, verzweigte oder cyclische Alkyle wie etwa Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Isobutyl, sec-Butyl, tert-Butyl, Butyl, Hexyl, Cyclohexyl), das substituiert sein kann, Alkenyle (z.B. normale, verzweigte oder cyclische Alkenyle, wie etwa Allyl, Vinyl, Benzyl und Styryl) und Aryle (z.B. Phenyl und Naphthyl) ein. Insbesondere bedeutet das C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl in der vorliegenden Erfindung ein Alkyl mit einer Kohlenstoffzahl von 6 oder weniger, wie etwa Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Isobutyl, sec-Butyl, tert-Butyl, Butyl, n-Amyl, Isoamyl, Hexyl, Cyclopentyl und Cyclohexyl.
Die vorgenannten Mykolsäuren oder Mykolsäureester mit einer anderen Substanz als einem Saccharid werden durch ein an sich bekanntes Verfahren (z.B. Extraktion und Synthese aus Bakterienzellen) hergestellt.
Die Extraktion aus Bakterienzellen wird wie folgt durchgeführt:
Bakterienzellen werden der direkten Hydrolyse und Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel unterzogen, gefolgt von der Trennung durch DSC (Dünnschichtchromatographie), oder Glykolipide werde aus Bakterienzellen mit Chloroform-Methanol oder einem anderen Lösungsmittel extrahiert und getrennt und der Hydrolyse unterzogen, gefolgt von der Extraktion der Lipide mit einem organischen Lösungsmittel und der DSC-Trennung, um die Mykolsäuren aus unterschiedlichen Unterklassen zu liefern.
Diese Mykolsäuren können weiter durch herkömmliche Verfahren in Niederalkylester überführt werden.
Diese Mykolsäuren oder Mykolsäureester mit einer anderen Substanz als einem Saccharid (z.B. Mykolsäure-C&sub1;&submin;&sub6;-alkylester) können auch durch Synthese durch herkömmliche Verfahren wie folgt erhalten werden: Verfahren Niederalkyl R³-CH&sub2;CHO Hydrolyse (z. B. 10% KOH) Alkyl
In diesen Formeln ist R³-CH&sub2; mit R¹ in der vorstehenden Formel (I) identisch und R² besitzt dieselbe Definition wie vorstehend.
Wenn eine verzweigte Fettsäure wie α-Alkyl-β-hydroxyfettsäure (III) [die durch die vorstehende Formel (I) dargestellte Mykolsaure] hergestellt wird, kann gemäß Verfahren A das gewünschte Produkt Mykolsäureniederalkylester (II) durch eine Claisen- Kondensation des Fettsäureesters gefolgt von der Reduktion mit NaBM&sub4; wie in der Literatur beschrieben [Bull. Soc. Chim. Fr., 504-510 (1954)] erhalten werden, wenn R³ und R² dieselbe Alkylgruppe darstellen.
Gemäß Verfahren B kann der Mykolsäure-C&sub1;&submin;&sub6;-alkylester (II) durch Kondensation eines aliphatischen Aldehyds und eines α-Bromcarbonsäureesters durch Reformatsky-Reaktion erhalten werden, wenn R³ und R² voneinander verschiedene Alkylgruppen sind. Die Hydrolyse der durch Verfahren A oder B erhaltenen Verbindung (II) liefert die gewünschte Produktverbindung (III) [Mykolsäure (I)].
Gemäß Verfahren C kann die Verbindung (III) [Mykolsäure (I)] direkt durch Kondensation eines aliphatischen Aldehyds und einer Carbonsäure, vorzugsweise in Gegenwart einer starken Base wie etwa LDA (Lithiumdiisopropylamid) bei einer Konzentration von 2 Mol oder mehr erhalten werden, wenn R³ und R² von einander verschiedene Alkylgruppen sind.
Die Synthese liefert selbstverständlich verschiedene Mykolsäuren mit verschiedenen erwünschten Kohlenstoff zahlen und mit einer einheitlichen Zusammensetzung.
Es ist anzumerken, daß ein Mykolsäuresalz leicht zum Beispiel durch Reaktion einer Mykolsäure mit einer Base hergestellt werden kann.
Eine andere Fettsäure mit einer Kohlenstoff zahl von 14 oder mehr als Mykolsäure wird ebenfalls durch ein an sich bekanntes Verfahren hergestellt.
Die auf diese Weise (aus Bakterienzellen oder durch Synthese erhaltene) erhaltene Mykolsäure, das Mykolsäuresalz oder die Fettsäure mit einer Kohlenstoff zahl von 14 oder mehr wird mit einem vorstehend beschriebenen Mono- oder Disaccharid durch ein bekanntes Verfahren zum Liefern eines Esters mit einem Saccharid verestert.
In der vorliegenden Erfindung ist das Disaccharid vorzugsweise Trehalose. Mit anderen Worten ist der Ester vorzugsweise ein Ester von Mykolsäure mit Trehalose oder ein anderer Ester einer Fettsäure mit einer Kohlenstoff zahl von 14 oder mehr als Mykolsäure mit Trehalose (nachstehend als TFE abgekürzt).
Beispiele von TFE schließen Trehalosepalmitat, Trehalosemyristat, Trehalosestearat, Trehaloseoctadecadienoat, Trehalosecorynomykolat und Trehalosemykolat, genauer 6,6'-Di-O-palmitoyl-α,α- trehalose, 6,6'-Di-O-mykoloyl-α,α-trehalose und 2,6'-Di-O-oleoyl-α,α-trehalose ein.
Der TFE schließt bekannte Verbindungen ein und wird durch Unterziehen von Trehalose und der vorgenannten Mykolsäure (aus Bakterienzellen oder durch Synthese erhalten), dem Mykolsäuresalz oder der Fettsäure mit einer Kohlenstoff zahl von 14 oder mehr einem an sich bekannten Veresterungsverfahren hergestellt. Zum Beispiel kann ein Disubstitutionsprodukt von Trehalose in 6- und 6'-Stellung durch das in der offengelegten japanischen Patentveröffentlichung Nr. 185599/1983 und in Chemistry and Physics of Lipids, Bd. 27, S. 345-352 (1980), beschriebene Verfahren oder ein dazu analoges Verfahren hergestellt werden.
Ferner kann ein asymmetrisches Disubstitutionsprodukt von Trehalose (z.B. in 2- und 6'-Stellung substituiert) durch Schützen jeweils der 4- und 6-Stellung und 4'-und 6'-Stellung von Trehalose mit einer Schutzgruppe wie etwa Tetraisopropyldisiloxan-1,3-diyl, ihr Isomerisieren durch ein bekanntes Verfahren, erneutes Schützen der 6-Stellung, Diacylieren der 2- und 6'- Stellung mit einer gewünschten Fettsäure und Entschützen der anderen geschützten Gruppen als die in 2- und 6'-Stellung hergestellt werden.
Der TFE ist vorzugsweise ein Ester, der mit 1 bis 4 Fettsäuren (einschließlich Mykolsäure) in wahlfreien Stellungen, vorzugsweise in einer der 2-, 2'-, 3-, 3'-, 6- und 6'-Stellungen gebundene Trehalose umfaßt, wobei weiter einem Ester der Vorzug gegeben wird, der mit zwei Fettsäuren (einschließlich Mykolsäure) in 6- und 6'-Stellung gebundene Trehalose umfaßt.
In der vorliegenden Erfindung ist es sogar möglich, infektiöse Bakterienarten zu ermitteln, wenn ein Mykolsäureester jeder Unterklasse als Reagenz zum Nachweis des Antikörpers gegen ein säurefestes bakterielles Antigen verwendet wird; deshalb ist der Trehalosemykolsäureester (nachstehend als TME abgekürzt) unter den TFE bevorzugt.
Beispiele des TME schließen Trehalosemonomykolat, Trehalosedimykolat, Trehalosetrimykolat und Trehalosetetramykolat ein, wobei Trehalose-6,6'-dimykolat der Vorzug gegeben wird.
Spezielle Beispiele des TME schließen 6'-O-Corynomykoloyl-2-O- pentadecanoyl-α,α-trehalose, 2-O-Icosanoyl-6'-O-(3-hydroxy-2-n- octadecyltetracosanoyl)-α,α-trehalose, 2-O-(9-Octadecenoyl)-6'- O-(3-hydroxy-2-tetradecyl-11-icosenoyl)-α,α-trehalose, 2-O- Pentadecanoyl-3-O-octadecanoyl-6'-O-(3-hydroxy-2-n-tetradecyldocosanoyl)-α,α-trehalose, 2,3-Di-O-eicosanoyl-6'-O-(3-hydroxy-2- n-octadecyltetracosanoyl)-α,α-trehalose und 2,3-Di-O-(9-octadecenoyl)-6'-O-(3-hydroxy-2-tetradecyl-11-icosenoyl)-α,α-trehalose ein.
Der TME schließt bekannte Verbindungen ein und kann aus säurefesten Bakterien, wie etwa denjenigen der Gattung Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus und Corynebacterium, durch ein bekanntes Verfahren wie bei dem vorstehend beschriebenen Verfahren der Extraktion von Mykolsäure aus Bakterienzellen extrahiert und isoliert werden. In diesem Fall ist es möglich, Trehalose-6- monomykolat, Trehalose-6,6'-dimykolat (Cordfaktor), Trehalose- 2,3,6'-trimykolat, Trehalose-2,6,6'-trimykolat und andere von verschiedenen Bakterienarten stammende zu erhalten.
Wie vorstehend angegeben ist es möglich, TME direkt aus Bakterienzellen auf der Grundlage der Zahl an Trehalose gebundener Mykolsäuren abzutrennen, aber dies ist nicht möglich auf der Grundlage der Art (Unterklasse) wie etwa einem unterschiedlichen Mykolsäuresubstituenten usw. Aus diesem Grund kann, wenn eine gewünschte, aus Bakterienzellen stammende Mykolsäure, an eine bestimmte Stellung von Trehalose gebunden ist, TME dadurch produziert werden, daß Mykolsäure allein aus einem säurefesten Bakterium durch ein bekanntes Verfahren extrahiert, abgetrennt und isoliert wird und sie und Trehalose dem an sich bekannten Veresterungsverfahren, welches vorstehend beschrieben worden ist, unterworfen werden.
In der vorliegenden Erfindung ist es wie im Fall von Disacchariden auch möglich, einen Ester einer Mykolsäure (aus Bakterienzellen oder durch Synthese hergestellt), ein Mykolsäuresalz oder eine Fettsäure mit einer Kohlenstoff zahl von 14 oder mehr mit einem Monosaccharid herzustellen.
Beim Nachweis des Antikörpers gegen das säurefeste Bakterien- Antigen, dem Bestimmen der Art der säurefesten Bakterienart, dem Bestimmen der Gattung der säurefesten Bakterien (einschließlich Mycobacterium, Nocardia und Rhodococcus) oder der Diagnose der Infektionen mit säurefesten Bakterien mittels des Reagenzes der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, daß die Mykolsäure, das Mykolsäuresalz, der Mykolsäureester (nachstehend MS abgekürzt) oder der Ester der anderen Fettsäure mit einer Kohlenstoff zahl von 14 oder mehr als Mykolsäure mit einem Mono- oder Disaccharid (nachstehend SFE abgekürzt) verwendet wird, nachdem er auf einer Platte immobilisiert worden ist. Diese Antigene werden anschließend mit einer antikörperhaltigen Probe (z.B. Körperflüssigkeit, insbesondere Blut, Serum, Plasma, Pleuraerguß, Aszitesflüssigkeit oder Urin des mit dem Tuberkulosebazillus infizierten Patienten) in Berührung gebracht und durch das ELISA-Verfahren (enzymverknüpfter Immunsorbenstest), ein an sich bekanntes Verfahren, analysiert.
Somit stehen diese beiden Verfahren zum Nachweis zur Verfügung: das Einschritt-Testverfahren und das Zweischritt-Testverfahren. Bei dem Einschritt-Testverfahren werden eine durch Immobilisieren verschiedener Arten MS oder SFE auf Näpfchen hergestellte feste Phase, eine Probe und ein enzymmarkierter Antikörper zur selben Zeit umgesetzt. Nach einer vorgegebenen Zeitspanne wird der unumgesetzte Teil des markierten Antikörpers durch Waschen entfernt, gefolgt von der Bestimmung der Enzymaktivität der festen Phase unter Bestimmen des in der Probe enthaltenen Antikörpers gemäß dem MS oder SFE.
Bei dem Zweischritt-Testverfahren werden ein immobilisiertes Antigen und eine Probe umgesetzt. Nach einer vorgegebenen Zeitspanne wird der unumgesetzte Teil des Antikörpers in der Probe durch Waschen entfernt, gefolgt von der Reaktion mit einem enzymmarkierten anti-Antikörper. Nach einer vorgegebenen Zeitspanne wird der unumgesetzte Teil des markierten Antikörpers durch Waschen entfernt, gefolgt von der Bestimmung der Enzymaktivität der festen Phase unter Bestimmen des in der Probe enthaltenen Antikörpers gemäß dem MS oder SFE. Zur weiteren Ermittlung in größerer Einzelheit, das heißt dem Ermitteln säurefester Bakterienarten, wird MS für jede Unterklasse getrennt auf Näpfchen immobilisiert.
Das Immobilisierungsverfahren ist keiner Beschränkung unterworfen, so lange der Gegenstand der vorliegenden Erfindung nicht beeinträchtigt wird. Zum Beispiel wird MS oder SFE in einem organischen Lösungsmittel wie etwa Hexan, Isopropanol oder Ethanol gelöst und die sich daraus ergebende Lösung wird zum Immobilisieren des MS oder SFE Näpfchens einer Mikroplatte usw. zugesetzt. Die Immobilisierung wird in etwa 2 bis 48 Stunden erreicht. Es ist bevorzugt, die Näpfchen mit einem geeigneten Lösungsmittel zu waschen und nach der Immobilisierung zu blokkieren.
Die Reaktion von MS oder SFE in den Näpfchen und dem Antikörper in der Probe wird unter Bedingungen, bei denen die Reaktion leicht abläuft (z.B. in einer Feuchtigkeitskammer bei einer Temperatur von 20 bis 40ºC und einer Feuchtigkeit von 70 bis 100%) etwa 30 Minuten bis 2 Stunden durchgeführt, bis sie sich selbst beendet. Nach Abschluß der Reaktion wird ein anti-Antikörper mit oder ohne Entfernen der unumgesetzten Substanzen in den Näpfchen zugesetzt und die Reaktion wird bei dem Zustand, bei dem die Reaktion leicht abläuft (z.B. in einer Feuchtigkeitskammer bei einer Temperatur von 20 bis 40ºC und einer Feuchtigkeit von 70 bis 100%) etwa 10 Minuten bis 2 Stunden durchgeführt, bis sie sich selbst beendet. Der Reaktionsrückstand wird entfernt und die Näpfchen werden mit einem organischen Lösungsmittel wie etwa Hexan oder Isopropanol, einem Phosphatpuffer oder einem anderen Waschmittel gewaschen.
Der vorgenannte anti-Antikörper ist ein anti-Antikörper gegen den vorgenannten primären Antikörper und wird mittels eines Tieres (die Tierart ist keiner Einschränkung unterworfen; Beispiele verwendbarer Tiere schließen Ziegen, Pferde, Schafe und Rinder ein) hergestellt. Es ist bevorzugt, einen anti-Antikörper gegen IgM (IgG kann eingeschlossen sein) zu verwenden, wenn eine Mykolsäure, ein Mykolsäuresalz oder ein Mykolsäureester jeder Unterklasse zur Identifizierung der Bakterienart verwendet wird, und einen anti-Antikörper gegen IgM + IgG zu verwenden, wenn ein Ester einer anderen Fettsäure mit einer Kohlenstoffzahl von 14 oder mehr als Mykolsäure mit einem Sacccharid (Mono- oder Disaccharid) zum Bestimmen von Bakteriengattungen verwendet wird. In der vorliegenden Erfindung wird ein an einen Marker gekuppelter anti-Antikörper verwendet. Hier kann jede normalerweise zu einem Immuntest verwendete Substanz als Marker verwendet werden und Beispiele derartiger Substanzen schließen Enzyme, radioaktive Substanzen, lumineszierende Substanzen und fluoreszierende Substanzen ein. Beispiele von Enzymen schließen Peroxidase, β-D-Galactosidase und alkalische Phosphatase ein. Beispiele radioaktiver Substanzen schließen Iod und Deuterium ein. Beispiele lumineszierender Substanzen schließen Acridiumsalze ein. Beispiele fluoreszierender Substanzen schließen Fluoreszeinisothiocyanat ein.
Der Zweck des Herstellens eines an einen Marker gekuppelten anti-Antikörpers kann durch ein an sich bekanntes Verfahren vollständig erreicht werden.
Anschließend wird der an der Reaktion beteiligte anti-Antikörper wie folgt bestimmt: wenn der anti-Antikörper zum Beispiel an Peroxidase als Marker gekuppelt ist, wird die Peroxidase mit o- Phenylendiamin und Wasserstoffperoxid unter Hervorrufen einer Farbentwicklung umgesetzt, gefolgt von der Bestimmung der optischen Dichte (OD) bei einer Hauptwellenlänge von 492 nm und einer Unterwellenlänge von 690 nm.
Es ist erwünscht, daß die Ergebnisse als Unterschiede bei den Unterschieden der optischen Dichte (ODD) zwischen der durchschnittlichen OD eines gesunden Menschen als Kontrolle und der OD der Probe berechnet werden. Wenn der ODD nicht weniger als 0,100 ist, zeigt er die Anwesenheit eines signifikanten Wertes für einen durch ein säurefestes Bakterium produzierten Antikörper an, und somit wird der Patient, aus dem die Probe gesammelt wurde, (einschließlich nicht-menschlicher Tiere), als mit einem säurefesten Bakterium (Tuberkelbazillus oder ein damit nahe verwandtes säurefestes Bakterium) infiziert beurteilt.
Die Proben sind Körperflüssigkeiten von Tieren einschließlich Menschen. Beispiele nicht-menschlicher Tiere schließen Säuger, wie etwa Pferde, Schweine und Hühner, und Vögel ein. Beispiele verwendbarer Körperflüssigkeiten schließen Serum, Plasma, Rükkenmarksflüssigkeit, Speichel, Pleuraerguß, Aszitesflüssigkeit und Urin ein. In der vorliegenden Erfindung kann die Probe gemäß einem bekannten Verfahren vorbereitet werden. Wenn der Antikörper in zum Beispiel Serum bestimmt wird, ist es bevorzugt, das Serum in 40- bis 640-facher, idealerweise 160-facher Verdünnung zu verwenden.
Das Reagenz der vorliegenden Erfindung zum Nachweis des Antikörpers gegen ein säurefestes bakterielles Antigen, das Verfahren des Nachweises des Antikörpers gegen ein säurefestes bakterielles Antigen mittels des Reagenzes und das Verfahren der Diagnose von Infektionen mit einem säurefesten Bakterium, das sich auf das Nachweisverfahren gründet, sind einfachere Verfahren und bieten eine viel höhere Spezifität im Vergleich mit herkömmlichen Reagenzien und Verfahren.
Insbesondere das Reagenz der vorliegenden Erfindung erlaubt einen sehr raschen Antikörpernachweis, Bakteriennachweis und eine Infektionsdiagnose, da ein Test durch direktes Verwenden einer Körperflüssigkeit des Patienten mit einer Infektion mit einem säurefesten Bakterium als Probe auf der Grundlage eines ELISA-Verfahrens ausgeführt wird.
Da weiterhin für die vorliegende Erfindung verwendete Reagenzien (MS und SFE) auch durch Synthese hergestellt werden können, können sie leicht in großen Mengen in industriellem Maßstab bereitgestellt werden.
Außerdem erlauben das Reagenz und das Verfahren der vorliegenden Erfindung einen hochempfindlichen Test, der die Bestimmung einer Spurenmenge im Serum vorliegenden Antikörpers ermöglicht.
Somit kann ein einfacher und rascher Nachweis des Antikörpers gegen ein säurefestes bakterielles Antigen mittels des Reagenzes durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung ausgeführt werden, und die Bestimmung säurefester Bakteriengattungen (einschließlich der Gattungen Mycobacterium, Nocardia und Rhodococcus) kann wiederum ausgeführt werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Diagnose zum Bestimmen des infizierenden säurefesten Bakteriums auf der Grundlage einer Bestimmung säurefester Bakterienarten mittels einer Mykolsäure, eines Mykolsäuresalzes oder eines Mykolsäureesters (MS) jeder Unterklasse als einem Reagenz zum Nachweis eines Antikörpers gegen ein säurefestes bakterielles Antigen durchgeführt, wodurch sich der besondere Effekt ergibt, daß eine rasche Auswahl eines therapeutischen Wirkstoffs für die Krankheit möglich ist.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine graphische Darstellung, welche den Nachweis der Antikörper gegen Trehalosedimykolat (TDM), Glucosemonomykolat (GM) und Mannosemonomykolat (MM), welche alle aus Nocardia rubra (Nr-) stammen, durch das ELISA-Verfahren zeigt. Fig. 2 ist eine graphische Darstellung, welche den Nachweis des Antikörpers gegen Nr-TDM durch das ELISA-Verfahren zeigt. Fig. 3 ist eine graphische Darstellung, welche durch das Maus-Immunisierungsverfahren bestimmte Unterschiede beim Antikörpergehalt gegen Nr-TDM zeigt. Fig. 4 ist eine graphische Darstellung, welche die Reaktionen unter Verwenden von Nr-Bakterienzellen als Antigene mit oder ohne das Entfernen von Mykolsäure zeigt. Fig. 5 ist eine graphische Darstellung, welche die Antigenitäten von Mykolsäuremethylestern zeigt. Fig. 6 ist eine graphische Darstellung, welche die Reaktivitäten zeigt, die unter Verwenden verschiedener TDM und Mykolsäuremethylester als Antigen erhalten wurden. Fig. 7 ist eine graphische Darstellung, welche den Antikörpernachweis eines durch das ELISA-Verfahren mit Trehalose-6,6'- dipalmitat (TDP) als Antigen zeigt.

BESTE AUSFÜHRUNGSWEISE DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung wird nachstehend mittels der folgenden Beispiele in größerer Einzelheit beschrieben, aber die Erfindung wird durch sie keinesfalls begrenzt.
Es ist anzumerken, daß in Beispiel 1 bis 10 Bestimmungen durch das nachstehend beschriebene ELISA-Verfahren mit Serumverdünnungsraten von 5-, 10-, 20-, 40- und 80-fach in Beispiel 1 bis 6 durchgeführt werden. Die Ergebnisse werden in den jeweiligen Abbildungen dargestellt.

[Test durch ELISA]

Eine Ethanol- oder Isopropanollösung des Antigens wird auf eine 96-Näpfchen-Mikroplatte zu 50 ul/Näpfchen verteilt. Diese Mikroplatte wird anschließend unter Verdampfen der Lösung zur Trockene zum Adsorbieren des Antigens über Nacht stehen lassen.
Dieser Mikroplatte werden 100 ul/Näpfchen einer mit 0,5% Tween 20 ergänzten phosphatgepufferten Kochsalzlösung (pH 7,4) (nachstehend als PBS-T abgekürzt) zugesetzt und die Mikroplatte wird 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen. Auf der anderen Seite werden 100 ul/Näpfchen mit 5% Rinderserumalbumin ergänztes PBS-T zugesetzt und die Mikroplatte wird 2 Stunden bei Raumtemperatur stehen lassen.
Nachdem das PBS-T oder das mit 5% Rinderserumalbumin ergänzte PBS-T durch Saugen entfernt wurde, werden 50 ul/Näpfchen Antikörper (serielle Serumverdünnung) verteilt und die Mikroplatte wird 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen lassen.
Nach 3 mal Waschen mit PBS-T wurden 50 ul/Näpfchen peroxidasemarkiertes Antimaus-Ig(G+M) zugesetzt und die Mikroplatte wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen lassen.
Nach 3 mal Waschen mit PBS-T wurden 50 ul/Näpfchen sowohl mit o-Phenylendiamin als auch wäßrigen Wasserstoffperoxid (pH 4,9) ergänztem Citratpuffer (pH 4,9) verteilt, gefolgt von der Zugabe von 50 ul/Näpfchen 6N HCl und Bestimmung der optischen Dichte bei 492 nm mittels eines Mikroplatten-Lesegeräts.

Beispiel 1

Nachweis von Antikörpern gegen Nr-TDM, GM und MM durch das ELISA-Verfahren

Antigene: Trehalosedimykolat (nachstehend als TDM abgekürzt), Glucosemonomykolat (nachstehend als GM abgekürzt) und Mannosemonomykolat (nachstehend als MM abgekürzt), die alle aus Nocardia rubra (nachstehend als Nr abgekürzt) stammten, wurden jeweils als Ethanollösung mit 200 ug/ml hergestellt. Jede Lösung wurde auf eine 96-Näpfchen-Mikroplatte zu 10 ug/50 ul/Näpfchen verteilt und man ließ die Mikroplatte zur Antigenadsorption unter Verdampfen der Lösung zur Trockene über Nacht stehen. Die Ergebnisse für diese Antigene werden in Fig. 1 durch TDM, GM beziehungsweise MM dargestellt.
Antikörper: ICR-Mäusen wurde aus Nr- stammendes (Nr-) TDM, GM oder MM in Form einer Emulsion vom Wasser-in-Öl-in-Wasser-Typ (nachs-tehend als w/o/w-Emulsion abgekürzt), die 3,2% Freundsches inkomplettes Adjuvans enthielt, in einer Dosis von 30 ug/Maus durch intravenöse Injektion über die Schwanzvene (nachstehend als i.v. abgekürzt) 10 Mal jeden zweiten Tag zudosiert. Zwei Tage nach der letzten Verabreichung wurde Blut abgenommen. Das auf diese Weise erhaltene Serum wurde mit PBS-T 5-fach verdünnt, wonach es zum Inaktivieren der Komplemente im Serum 30 Minuten bei 56ºC unter Liefern einer Ausgangslösung thermisch behandelt wurde (nachfolgend als Inaktivierung bezeichnet), welche anschließend in seriellen Verdünnungen mit PBS-T verwendet wurde. Die Ergebnisse für diese Antikörper werden in Fig. 1 durch TDM, GM beziehungsweise MM dargestellt.

(Ergebnisse)

Wie in Fig. 1 dargestellt wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:
1. Ein Antikörper, der MGL als Antigen erkennt, wurde im Serum von Mäusen nachgewiesen, denen 10 mal 30 ug MGL (mykolsäurehal tiges Glykolipid) i.v. zudosiert wurde.
2. Das Serum von Mäusen, denen TDM verabreicht wurde, zeigte einen hohen Antikörpergehalt gegen TDM, GM und MM.

Beispiel 2

(Absichten)

1. Zum Untersuchen der nicht-spezifischen Adsorption von Mausserumglobulin durch das an eine Platte adsorbierte Antigen Nr- TDM, wurde ein Serum aus der w/o/w-Kontrollgruppe (später beschrieben) als Antikörper verwendet.
2. Zum Bestimmen, ob die Reaktion des Antigen-Glykolipids mit Mausserumimmunoglobulin gegen ein nicht-spezifisches Lipid erfolgt oder nicht, wurde Eiweiß-Phosphatidylcholin (PC) als Antigen verwendet.
3. Die Wirkungen des Blockierungsverfahrens mittels 5% Rinderserumalbumin (BSA) auf die antigenadsorbierte Platten wurden untersucht.
Antigene: Nr-TDM oder PC wurde als Ethanollösung mit 200 ug/ml hergestellt. Jede Lösung wurde zu 10 ug/50 ul/Näpfchen auf eine 96-Näpfchen Mikroplatte verteilt. Diese Mikroplatte ließ man zum Verdampfen der Lösung zur Trockene für die Antigenadsorption über Nacht stehen.
Die Ergebnisse für diese Antigene werden in Fig. 2 durch TDM beziehungsweise PC dargestellt.
Antikörper: 1) 5-fache Verdünnung eines aus ICR-Mäusen erhaltenen Serums, denen 10 x 30 ug Nr-TDM (dasselbe wie in Beispiel 1) zudosiert wurde.
2) Inaktivierte 5-fache Verdünnung mit PBS-T eines Serums, das durch Blutentnahme aus ICR-Mäusen erhalten wurde, denen 10 mal jeden zweiten Tag 0,2 ml/Maus einer w/o/w-Emulsion zudosiert wurden, die kein Glykolipid enthielt. Die Ergebnisse für diese Antikörper werden in Fig. 2 durch TDM beziehungsweise w/o/w-Kontrolle dargestellt.

(Ergebnisse)

Wie in Fig. 2 dargestellt, wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:
1. Fast keine Reaktion fand zwischen dem Antigen (TDM oder PC) und dem Serum der w/o/w-Kontrollgruppe statt; es wurde bestätigt, daß die Adsorption nicht-spezifisch war.
2. Keine Reaktion fand zwischen dem Antigen PC und dem Antikörper der TDM-Gruppe statt; es wurde bestätigt, daß die Reaktion keine Reaktion mit einem nicht-spezifischen Lipid war.
3. Das Blockierverfahren mit 5% BSA hatte keine besondere Wirkung.

Beispiel 3

Untersuchung von Unterschieden beim Antikörpergehalt gegen Nr TDM durch das Maus-Immunisierungsverfahren

Antigen: Nr-TDM wurde in einer Ethanollösung mit 200 ug/ml hergestellt Diese Lösung wurde zu 10 ug/50 ul/Näpfchen auf eine 96-Näpfchen-Mikroplatte verteilt, gefolgt von der Antigenadsorption.
Antikörper: 1) 5-fache Verdünnung eines von ICR-Mäusen erhaltenen Serums, denen 10 mal 30 ug Nr-TDM (dasselbe wie in Beispiel 1) zudosiert wurden.
2) 5-fache Verdünnungen von Seren, die durch Blutentnahme aus Mäusen nach 1, 4, 7 und 14 Tagen auf die Verabreichung von 1 mal 300 ug Nr-TDM folgend erhalten wurden.
3) 5-fache Verdünnung eines aus ICR-Mäusen erhaltenen Serums 1 Tag nach der Verabreichung von 0,2 ml/i.v. einer kein Glykolipid enthaltenden w/o/w-Emulsion.

(Ergebnisse)

Wie in Fig. 3 dargestellt, wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:
1. Die selbe Absorption bei 492 nm wie bei der w/o/w-Kontrollgruppe wurde nach 1 bis 14 Tagen auf die Verabreichung von 1 mal 300 ug Nr-TDM folgend erhalten; es wurde kein Antikörper nachgewiesen.
2. In den Näpfchen, die nicht mit Mausserum ergänzt wurden, trat fast keine Fluoreszenzfärbung auf; es wurde bestätigt, daß Nr-TDM keine nicht-spezifische Adsorption des sekundären Antikörpers zeigte [peroxidasemarkiertes Antimaus-Ig(G+M)].

Beispiel 4

Untersuchung von Reaktionen, wenn als Antigene Nr-Bakterienzellen mit und ohne Entfernen von Mykolsäure verwendet wurden.
Antigene: 1) Nr-Bakterienzellen
2) Nr-Bakterienzellen wurden mit einem 2:1-Gemisch (Vol./Vol) von Chloroform und Methanol gemischt, gefolgt von der Ultrabeschallung zum Entfernen des extrahierbaren Lipids und anschließend Säurehydrolyse (sie Anmerkung 1) unter Entfernen des gebundenen Lipids (BL).
Diese Antigene 1) und 2) wurden jeweils in Boratpuffer suspendiert, so daß die Absorption bei 525 nm zu 0,43 wurde. Jede auf diese Weise erhaltene Ausgangssuspension wurde in 1/1-, 1/5- und 1/25-fachen Verdünnungsraten verdünnt. Jede auf diese Weise erhaltene Verdünnung wurde zu 50 ul/Näpfchen auf eine Platte verteilt. Man ließ die Platte zur Antigenadsorption über Nacht stehen, gefolgt vom Entfernen des Überstands durch Saugen.
Antikörper: 1) Aus ICR-Mäusen gesammeltes Serum, denen 10 mal 30 ug Nr-TDM (dasselbe wie in Beispiel 2) zudosiert wurden.
2) Aus ICR-Mäusen gesammeltes Serum, denen 10 mal 0,2 ml w/o/w-Kontrolle (dasselbe wie in Beispiel 2) zudosiert wurden.

(Ergebnisse)

Wie in Fig. 4 dargestellt, wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:
1. Die Nr-Bakterienzellen reagierten mit dem Antikörper.
2. Die Reaktivität gegenüber dem Antikörper nahm als Antwort auf das Entfernen des Lipids (Mykolsäure) aus den Nr-Bakterienzellen ab.
(Anmerkung 1:) Säurehydrolyse: nach der Zugabe von 6N HCl in einer Menge von etwa einem Drittel der Zellsuspension, wurde die Zellsuspension über Nacht auf 90 ºC erhitzt, gefolgt von der Lipidextraktion mit n-Hexan. Die sich daraus ergebende Wasserschicht wurde als Antigen verwendet.

Beispiel 5

Untersuchung der Antigenität des Mykolsäureniederalkylesters

Antigene: 1) Nr-TDM.
2) Durch Hydrolyse und Methylierung von Nr-TDM erhaltener Mykolsäuremethylester.
Diese Antigene 1) und 2) wurden jeweils in einer Ethanollösung zu 200 ug/ml hergestellt. Jede Lösung wurde zu 10 ug/50 ul/Näpfchen auf eine 96-Näpfchen-Mikroplatte verteilt, gefolgt von der Antigenadsorption.
Antikörper: 1) Serum von ICR-Mäusen, denen 10 mal 30 ug Nr- TDM (dasselbe wie in Beispiel 1) zudosiert wurden.
2) Serum von ICR-Mäusen, denen 10 mal 0,2 ml w/o/w-Kontrolle (dasselbe wie in Beispiel 2) zudosiert wurden.

(Ergebnisse)

Wie in Fig. 5 dargestellt, wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:
Der Mykolsäureniederalkylester zeigte eine zu derjenigen von TDM äquivalente Antigenität.

Beispiel 6

Antigene: 1) Nr-TDM.
2) M. intraceliuiare-TDM [nachstehend als M. int. bezeichnet].
3) M. kansaii-TDM [nachstehend als M. kan. bezeichnet).
4) Aus Nr stammender Mykolsäuremethylester.
5) Aus M. int. stammender α-Mykolsäuremethylester (M&sub1;).
6) Aus M. int. stammender Ketomykolsäuremethylester (M&sub2;).
7) AusM. int. stammender Dicarboxymykolsäuremethylester (M&sub3;).
Jedes Antigen wurde in einer Ethanollösung mit 200 ug/ml hergestellt. Jede Lösung wurde zu 10 ug/50 ul/Näpfchen auf eine 96- Näpfchen-Mikroplatte verteilt. Man ließ die Mikroplatte unter Verdampfen der Lösung zur Trockene zur Antigenadsorption stehen.
Die Ergebnisse für diese Antigene werden in Fig. 6 jeweils durch 1) bis 7) dargestellt.
Antikörper: 1) Serum von ICR-Mäusen, denen 10 mal 30 ug Nr-TDM (dasselbe wie in Beispiel 1) zudosiert wurden.

(Referenz)

1. Alle von Nr stammenden Mykolsäuren sind α-Mykolsäuren mit einer Gesamtlänge der Kohlenstoffkette von C&sub3;&sub6;&submin;&sub4;&sub8; (Durchschnitt 44) und einer verhältnismäßig kurzen Seitenkette von C&sub1;&sub0;&submin;&sub1;&sub4; in der α-Stellung.
2. M. int. besitzt drei Arten Mykolsäure, die jeweils die folgende durchschnittliche Kohlenstoffkettenlänge besitzen:
M&sub2;: α-Mykolsäure C&sub8;&sub0;
M&sub2;: Ketomykolsäure C&sub8;&sub5;
M&sub3;: Dicarboxymykolsäure C&sub6;&sub9;
3. M. kan. besitzt drei Arten Mykolsäure, mit einer Vorherrschaft von α-Mykolsäure. Die durchschnittliche Kohlenstoffkettenlänge ist wie folgt
α-Mykolsäure C&sub8;&sub0;
Methoxymykolsäure C&sub7;&sub8;
Ketomykolsäure C&sub8;&sub3;

(Ergebnisse)

Wie in Fig. 6 dargestellt, wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:
1. Der Antikörper gegen Nr-TDM reagierte mit dem Nr-TDM, dem von Nr stammenden Mykolsäuremethylester (α-Mykolsäure), M. kan.- TDM (der größte Prozentsatz der Mykolsäure ist α-Mykolsäure) und dem von N. int stammenden α-Mykolsäuremethylester (M&sub1;), reagierte aber nicht mit dem von M. int. stammenden Ketomykolsäuremethylester (M&sub2;) oder dem von M. int. stammenden Dicarboxymykolsäuremethylester (M&sub3;)
2. Von M. kan. und M. int. stammende Mykolsäuremethylester waren in der Kohlenstoffkettenlänge einander fast äquivalent, waren aber in der Unterklassenzusammensetzung voneinander verschieden.
3. Auf der Grundlage dieser Befunde wird das Antiserum von Mäusen, die mit Nr-TDM immunisiert wurden, als gegen von Nr stammende α-Mykolsäureester hochspezifisch erachtet.

Beispiel 7

Nr-TDM wurde der Säurehydrolyse gemäß den Verfahren von Beispiel 4 und 5 unter Liefern eines Vinylesters und Phenylesters derselben unterzogen, welche als Antigene verwendet wurden.
Antigene: 1) Von Nr stammender Nykolsäurevinylester.
2) Von Nr stammender Mykolsäurephenylester.
3) α-Mykolsäure (Syntheseprodukt).
4) α-Mykolsäuremethylester (Syntheseprodukt).
Jedes Antigen wurde in Ethanollösung zu 200 ug/ml hergestellt. Jede Lösung wurde zu 10 ug/50 ul/Näpfchen auf eine 96-Näpfchen- Mikroplatte verteilt. Diese Mikroplatte ließ man unter Verdampfen der Lösung zur Trockene zur Antigenadsorption über Nacht stehen.
Antikörper: Serum von Mäusen, denen 10 mal 30 ug Nr-TDM (dasselbe wie in Beispiel 1) zudosiert wurde.

(Ergebnisse)

1. Der Antikörper gegen Nr-TDM reagierte mit dem aus Nr stammenden Mykolsäurevinylester (α-Mykolsäure) und -phenylester und ebenso mit der durch organische Synthese hergestellten α-Mykolsäure und ihrem Methylester.
2. Wie vorstehend angegeben wird das von Mäusen, die mit Nr TDM immunisiert wurden, gesammelte Antiserum als nicht nur gegen von Nr stammende sondern auch gegenüber synthetisierte α-Mykolsäure und ihre Ester hochspezifisch erachtet.

Beispiel 8

Von M. int. stammender TDM wurde der Säurehydrolyse gemäß dem Verfahren von Beispiel 4 unterzogen, gefolgt von der Isolierung und Reinigung von M&sub2; und M&sub3;. Ein Glucoseester von M&sub2; und ein Arabinoseester von M&sub3; wurden jeweils hergestellt und als Antigene verwendet.
Antigene: 1) Von M. int. stammender Ketomykolsäureglucoseester (M&sub2;).
2) Von M. int. stammender Dicarboxymykolsäurearabinoseester (M&sub3;).
3) Nr-TDM.
4) M. kan.-TDM.
Jedes Antigen wurde in Ethanollösung zu 200 ug/ml hergestellt. Jede Lösung wurde zu 10 ug/50 ul/Näpfchen auf eine 96-Näpfchen- Mikroplatte verteilt. Diese Mikroplatte ließ man unter Verdampfen der Lösung zur Trockene zur Antigenadsorption über Nacht stehen.
Antikörper: Serum von Mäusen, denen 10 mal 30 ug M. int.-TDM (hergestellt in derselben Weise wie Beispiel 1) zudosiert wurden.

(Ergebnisse)

1. Der Antikörper gegen M. int.-TDM reagierte mit dem M&sub2;-Glucoseester und M&sub3;-Arabinoseester, zeigte aber mit Nr-TDM und M. kan.-TDM einer niedrige Aktivität.
2. Auf der Grundlage dieser Befunde wird angenommen, daß das Antiserum von Mäusen, die mit M. int.-TDM immunisiert wurden, eine hohe Spezifität gegen Ketomykolsäureester und Dicarboxylmykolsäureester zeigt und seine Reaktionsantwort nicht von den Sacchariden sondern von den Fettsäuren (Keto- und Dicarboxymykolsäuren) abhängt.

Beispiel 9

Antigene: 1) Trehalose-6,6'-dipalmitat (nachstehend als TDP abgekürzt).
2) Hexan (Kontrolle).
3) Methylstearat (Vergleich).
Jedes Antigen wurde in Ethanollösung zu 200 ug/ml hergestellt. Jede Lösung wurde zu 10 ug/50 ul/Näpfchen auf eine 96 Näpfchen- Mikroplatte verteilt. Diese Mikroplatte ließ man unter Verdampfen der Lösung zur Trockene über Nacht zur Antigenadsorption stehen. Die von diesen Antigenen erhaltenen Ergebnisse des Nachweises werden in Fig. 7 durch TDP, Kontrolle beziehungsweise Stearat dargestellt.
Antikörper: Ein Serum, das durch Blutentnahme aus mit dem Tuberkelbazillus infizierten Patienten erhalten wurde, die beim Bakteriennachweis als positiv getestet wurden, wurde mit PBS-T 5-fach verdünnt und unter Liefern einer Ausgangsslösung inaktiviert (30 Minuten bei 56ºC hitzebehandelt), welche anschließend in seriellen Verdünnungen mit PBS-T verwendet wurde.

(Ergebnisse)

Wie in Fig. 7 dargestellt, wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:
1. Das Serum von Patienten, die mit dem Tuberkelbazillus infiziert waren, erkannte TFE spezifisch als Antigen.
2. Das Serum von Patienten, die mit dem Tuberkelbazillus infiziert waren, zeigte ebenfalls einen hohen Antikörpergehalt gegen TFE.
Es ist anzumerken, daß wenn ein Serum, das durch Blutentnahme aus einem gesunden Menschen erhalten wurde, durch das ELISA- Verfahren in derselben Weise wie vorstehend getestet wurde, keine Farbentwicklung auftrat.

Beispiel 10

Dem Verfahren von Beispiel 9 wurde gefolgt, außer daß TDP in die nachstehend dargestellten Verbindungen geändert wurde.
1) Von M. tubercuiosis stammendes GM und MM (α-, Methoxy- oder Ketomykolsäuren).
2) Von M. int. stammende α-Mykolsäure- (M&sub1;) oder Ketomykolsäure(M&sub2;)-methyl, -vinyl- oder -phenylester.
3) Von M. kan. stammendes TDM, GM und MM (α-, Methoxy- oder Ketomykolsäuren).
4) 6-O-Palmitoylglycose (synthetischer Monoester).
5) 6-O-Palmitoylmannose (synthetischer Monoester).
6) 6,6'-Di-O-corynomykoloyl-α,α-trehalose [synthetischer TFE (Diester)].
7) 6,6'-Di-O-palmitoyl-α,α-trehalose [synthetischer TFE (Diester)].
8) 6,6'-Di-O-mykoloyl-α,α-trehalose [synthetischer TFE (Diester)].
9) 2,6'-Di-O-oleoyl-α,α-trehalose [synthetischer TFE (Diester)].
10) 6'-O-Corynomykoloyl-2-O-pentadecanoyl-α,α-trehalose [syn thetischer TFE (Diester)].
11) 2-O-Icosanoyl-6'-O-(3-hydroxy-2-n-octadecyltetracosanoyl)- α,α-trehalose [synthetischer TFE (Diester)].
12) 2-O-(9-Octadecenoyl)-6'-O-(3-hydroxy-2-tetradecyl-11-icosenoyl)-α,α-trehalose [synthetischer TFE (Diester)).
13) 2-O-Pentadecanoyl-3-O-octadecanoyl-6'-O-(3-hydroxy-2-n- tetradecyldocosanoyl)-α,α-trehalose [synthetischer TFE (Triester)].
14) 2,3-Di-O-eicosanoyl-6'-O-(3-hydroxy-2-n-octadecyltetracosanoyl)-α,α-trehalose [synthetischer TFE (Triester)).
15) 2,3-Di-O-(9-octadecenoyl)-6'-O-(3-hydroxy-2-tetradecyl-11- icosenoyl)-α,α-trehalose [synthetischer TFE (Triester)].

(Ergebnisse)

Das Serum von mit dem Tuberkelbazillus infizierten Patienten erkennt nicht nur spezifisch TFE, sondern auch Ester anderer Fettsäuren als Mykolsäure mit einem Mono- oder Disaccharid und Mykolsäureestern.

Beispiel 11

Verfahren zum Bestimmen der Gattung Mycobacterium und Verfahren zur Diagnose von Infektionen mit säurefesten Bakterien unter Verwenden von Proben, die aus mit säurefesten Bakterien infizierten Patienten und gesunden Menschen gesammelt wurden.

(Glykolipidherstellung aus Bakterienzellen)

Der Stamm M. tuberculosis H37Rv. wurde als Ausgangsmaterial für das Cordfaktorantigen verwendet.

(Isolierung und Reinigung des Cordfaktorantigens)

Bakterienzellen wurden in einem Gemisch von Chloroform und Methanol (2:1, Vol./Vol.) suspendiert, gefolgt vom Zellaufbrechen durch Ultrabeschallung. Der Extrakt aus der Chloroformschicht wurde zur Trockene eingedampft und in einer geringen Menge eines Gemisches von Chloroform und Methanol (2:1, Vol./- Vol.) gelöst. Diese Extrakte wurden der Kieselgel-DSC mittels Chloroform-Methanol-Aceton-Essigsäure (90:10:6:1, Vol./Vol.) als Entwicklungslösungsmittel unterzogen. Es traten mehrere Banden auf, aus denen Trehalose-6,6'-dimykolat (TDM) mittels eines Gemisches von Chloroform und Methanol (2:1, Vol./Vol.) abgetrennt und isoliert wurde.

(Proben)

Seren, die aus 50 Patienten, die mit einem säurefesten Bakterium infiziert waren, und aus 55 gesunden Menschen gesammelt wurden, wurden als Proben verwendet.
Gesunde Menschen: alle außer einem waren bei der Tuberkulinhautreaktion positiv.
Patienten: alle Patienten wurden in einem Test auf säurefeste Bakterien sowohl durch Abstrichuntersuchung als auch Kultur bakteriologisch als positiv bestätigt. Ein Niacintest offenbarte, daß von den 50 Patienten 45 Patienten mit einer M. tuberculosis (Tuberkulose) infizierte Patienten waren und die anderen 5 Patienten mit einer atypischen mykobakteriellen Infektion waren. Alle Patienten besaßen eine Lungenerkrankung, von denen 1 eine Pleuritis hat und 7 eine Diabetes mellitus-Komplikation hatten. Die Patienten waren im Bereich von 20 bis 80 alt. Die Blutproben wurden nach einer speziellen Chemotherapie bei 46 Patienten und vor der Behandlung bei 4 Patienten gesammelt.
Ferner wurden getrennt Seren von Patienten getestet, die nicht mit einem säurefesten Bakterium infiziert waren und Krebs (Adenocarcinom) in einer Lunge hatten.

(Test durch das ELISA-Verfahren)

Ein ELISA-Test wurde auf einer Polystyrol-Mikrotiterplatte (Falcon 3915, hergestellt von Becton Dickinson Co.) ausgeführt. Das gereinigte Cordfaktorantigen (TDM) wurde in n-Hexan gelöst, um eine Konzentration von 0,1 mg/ml zu erreichen. Eine 50 ul-Portion dieser Probe wurde jedem Näpfchen zugesetzt (TDM 5 ug/Näpfchen).
Nach dem Trocknen der Platte bei Raumtemperatur wurden jedem Näpfchen 150 ul einer PBS-T enthaltenden Immunisierungsblockierlösung zugesetzt und man ließ die Platte in einem Inkubator 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen, gefolgt vom Entfernen durch Saugen. Anschließend wurden 50 ug/Näpfchen einer 160-fachen Serumverdünnung zugesetzt und man ließ die Platte 1 Stunde stehen. Peroxidasemarkiertes Ziege-anti-Human-IgG (500-fache Verdünnung mit PBS-T) wurde als sekundärer Antikörper (anti-Antikörper) verwendet. Nachdem man die Platte 1 weitere Stunde in einem Inkubator stehen ließ, wurde eine Substratlösung zugesetzt, die so verdünnt war, daß 1 mg/ml o-Phenylendiamin in einer Lösung enthalten waren, die 0,1 M Zitronensäure, 0,2 M Na&sub2;HPO&sub4;:12H&sub2;O und 0,04% wäßriges Wasserstoffperoxid enthielt.
Die Reaktion wurde durch Zusatz von 6N HCl beendet und die Absorptionen bei 492-630 nm wurden mittels eines Mikroplatten- Lesegeräts bestimmt. Jeder Inkubator wurde bei Raumtemperatur gehalten und die Platte wurde während jeder Reaktion dreimal mit PBS-T gewaschen.
Die experimentellen Ergebnisse wurden durch ODD ausgewertet.

(Ergebnisse)

Gesunde Menschen: Die durchschnittliche OD betrug 0,099, auf deren Grundlage die ODD berechnet wurde. Die OD reichte bei gesunden Menschen von 0,096 bis 0,102 und keiner von ihnen wurde als positiv beurteilt.
Patienten: Von den 50 Patienten mit einer Infektion durch säurefeste Bakterien wurden 48 (43 der 45 Patienten mit einer Tuberkelbazillusinfektion und alle 5 Patienten mit der atypischen Mykobakterieninfektion) als positiv beurteilt (0,100 überschreitende ODD) (96% Empfindlichkeit)
Es ist anzumerken, daß die durchschnittliche ODD bei den Tuberkulosepatienten 1,273 betrug und die durchschnittliche ODD bei den Patienten mit der atypischen Mykobakterieninfektion, die im Niacintest negativ waren, 1,356 betrug. Die ODD der Patienten, die nicht mit säurefesten Bakterien infiziert waren, mit Krebs in einer Lunge betrug 0,009 und sie wurden als negativ beurteilt.
Keiner der 55 gesunden Menschen wurde als positiv beurteilt (0,100 überschreitende ODD).
Diese Befunde zeigen, daß der Antikörper, der mit dem aus M. tuberculosis stammenden Cordfakor (TDM) reagiert, in Seren von Patienten auftrat, die bei Tests zum Nachweis säurefester Bakterien positiv waren, und in gesunden Menschen nicht nachgewiesen wurde (100% Spezifität)

Beispiel 12

Unter Verwenden von Seren von 29 Tuberkulosepatienten, die in Beispiel 11 als positiv beurteilt wurden, wurde dem Verfahren von Beispiel 11 gefolgt, außer daß der in Beispiel 11 verwendete Cordfaktor (TDM) durch aus M. kan., M int. oder Nr oder Trehalose-6,6'-dicorynomykolat (Syntheseprodukt) stammenden Cordfaktor ersetzt wurde. Alle diese Patienten wurden auf alle 4 Antigene positiv beurteilt.

Beispiel 13

Dem Verfahren von Beispiel 12 wurde gefolgt, indem aus den in Beispiel 12 beschriebenen Bakterienzellen erhaltene Trehalose-6- monomykolate verwendet wurden. Alle Proben wurden als positiv beurteilt.

Beispiel 14

Dem Verfahren von Beispiel 12 wurde gefolgt, außer daß die Verdünnungsrate der Seren von 29 in Beispiel 11 als positiv beurteilten Tuberkulosepatienten auf 1280-fach geändert wurde. Alle Proben wurden als positiv beurteilt.

Claims

1. Verwendung einer aus der aus Mykolsäuren, Mykolsäuresalzen, Mykolsäureestern und Estern von anderen Fettsäuren als Mykolsäure mit der Kohlenstoffzahl 14 oder größer bestehenden Gruppe ausgewählten Verbindung mit einem Mono- oder Disaccharid in einem ELISA-Verfahren zum Nachweisen eines Antikörpers gegen ein säurebeständiges bakterielles Antigen in einer Serumprobe.

2. Verwendung wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei der Ester ein C&sub1;-C&sub6;-Alkylester ist.

3. Verwendung wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei der Ester ein Ester mit Trehalose oder Glucose ist.

4. Verwendung wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei der Ester ein Mono- oder Tetrasubstitutionsprodukt von Trehalose in einer aus der 2-, 2'-, 3-, 3'-, 6- und 6'-Stellung ausgewählten Stellung ist.

5. Verwendung wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei der Ester wenigstens ein aus der aus 6,6'-Di-O-palmitoyl-α,α-trehalose, 6,6'-Di-O-mykoloyl-α,α-trehalose, 2,6'-Di-O-oleoyl-α,α-trehalose, 6'-O-Corynomykoloyl-2-O-pentadecanoyl-α,α-trehalose, 2-O- Icosanoyl-6'-O-(3-hydroxy-2-n-octadecanyl-tetracosanoyl)-α,α- trehalose, 2-O-(9-0ctadecenoyl)-6'-O-(3-hydroxy-2-tetradecanyl- 11-icosenoyl)-α,α-trehalose, 2-O-Pentadecanoyl-3-O-octadecanoyl- 6'-O-(3-hydroxy-2-n-tetradecanyl-docosanoyl)-α,α-trehalose, 2,3- Di-O-eicosanoyl-6'-O-(3-hydroxy-2-n-octadecanyl-tetracosanyl)- α,α-trehalose und 2,3-Di-O-(9-octadecenoyl)-6'-O-(3-hydroxy-2- tetradecanyl-11-icosenoyl)-α,α-trehalose bestehenden Gruppe ausgewählter Ester ist.

6. Verwendung wie in einem der Ansprüche 1 - 5 beansprucht, wobei der Antikörper gegen ein säurebeständiges bakterielles Antigen in der Probe ein Antikörper ist, der in einer Körperflüssigkeit eines Patienten enthalten ist, der mit dem Tuberkelbazillus oder einem damit eng verwandten, säurebeständigen Bakterium infiziert ist.

7. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 - 6 zur Diagnose von Infektionen mit säurebeständigen Bakterien, welche das Bestimmen des Unterschieds der optischen Dichte zwischen einer einem gesunden Menschen entnommenen Probe und einer dem Patienten entnommenen Probe umfaßt.