DK149867B - Proteolytisk enzympraeparat og fremgangsmaade til fremstilling deraf - Google Patents

Description

i 149867

Opfindelsen angår et hidtil ukendt proteolytisk enzympræparat.

Man har erkendt, at der er en efterspørgsel efter termostabile proteolytiske enzymer i næringsmiddel-, gærings-, foder og medicinalindustrien, som ikke helt bliver imødekommet. Det er nu lykkedes at fremstille et hidtil ukendt proteolytisk enzym, som er termostabilt, ved dyrkning af en hidtil ukendt mikroorganisme isoleret fra en varm sø i varmekildeområdet Rotorua i New Zealand.

Det proteolytiske enzympræparat ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved det i krav l's kendetegnende del anførte.

I det følgende benyttes disse betegnelser: SDS er natriumdodecylsulfat.

Triton (indregistreret varemærke)X 100 er octyl-phenolpolyethylenglycolether.

Tween (indregistreret varemærke) 80 er sorbitanmo-no o1eatpo1yoxya1ky1en.

CBZ-D-Phe-TETA-Sepharose er N-carbobenzoxy-D-Phenylalanin-tetraethylen-tetramin-Sepharose, idet Separose er indregistreret varemærke for en perleformet agarosegel.

SPC 25 er et sulfopropylderivat af Sephadex G25, idet Sephadex er indregistreret varemærke for en perleformet tværbundet dextrangel.

Sephadex (indregistreret varemærke) G 75 er et perleformet polysacchariddextranderivat.

. Egenskaber af caldolysin« A. fysisk« (1) En molekylvægt på 20.000 + 3.000 bestemmes ved gel-chromatografi, SDS-elektroforese og elektroforese.

(2) Isoelektrisk punkt: 8,5 + 0,5.

(3) Reaktion på inhibitorer (tabel 3) og enzymatisk specificitet angiver, at caldolysin kan klassificeres som en metal-chelator-følsom lytisk protease (se Morihara (1974) “Comparative Specificity of Microbial Proteases", Advanced in Enzymology 41 179).

2 149867 B · Enzymatisk,

Caldolysin hydrolyserer en række højmolekylære proteinsubstrater (tabel 4) og nogle lavmolekylære peptidsubstrater (tabel 5). Imidlertid hydrolyseres et antal almindelige peptidanaloge (proteasesubstrater) ikke (tabel 5).

Caldolysin lyserer. et bredt område af gramnegative bakterier, men kun få grampositive mikroorganismer (tabel 6), C, Stabilitet, (1) Termostabilitet.

2 -L

I nærværelse af 10 mM Ca bibeholdes 100# aktivitet ved temperaturer på 75°0 og derunder i lange perioder (intet tab i løbet af 170 timer), Fjernel- 2+ sen af Ca reducerer termostabiliteten kendeligt. Halveringstidsdata ved temperaturer mellem 75°C og 95°C er vist i tabel 7 tillige med publicerede data om andre termofile proteaser, (2) pH-stabilitet.

Caldolysin er stabilt (i nærværelse af calciumion ved 20°C) i lange perioder ved pH-værdier på 4,0-12,0. Ved pH 3,0 T1^2 = 2 timer.

Ved høje og lave pH-værdier (f.eks, pH 4 og pH 10) resulterer inkubation ved forhøjet temperatur i en udtalt reduktion i stabiliteten.

149867 3

Tabel 3-

Type af Inhibitor Koncentration $ inhibering virkning $ inhibering af aktivitet _ __ af aktivitet

Generel EDTA 12,5 mM 100$ metal- EDTA 10 mM 70$ oh elat or EDTA 1 mM 40 $

EDTA 0,15 mM

Cystein- lodeddikesyre 10 mM 60$ enzym- " 2 mM -

inhibitor " 0,25 mM

Serin- Phenylmethyl- 10 nM 10$

enzym- sulfonylfluorid 1 mM

inhibitor ” 5 mM -

Cystein- p-chlormercuri- 5 mM -

enzym- benzoat 2,5 mM

inhibitor

Zn-specifik o-phenanth rolin 10 mM

chelator " 1 mM -

Ca-speoifik EGTA 10 mM 45$ chelator EGTA 1 mM 18$

Trypsininhibitor 1,0 M.g ml ^ _2 sur prote- N-a-p-tosyl-L-lysin 3x10 m;I - aseinhibi- Chlormethylketon, HC1 tor

Skønt man ikke ønsker at binde sig til nogen bestemt teori, er den tilsyneladende inhibering af caldolysin med EDTA og EGTA sandsynligvis resultatet af destabilisering forårsaget af calciumfjernelse og det efterfølgende tab af enzymaktivitet som resultat af autolyse.

1-49867

A

Tabel 4.

Hydrolyse af proteiner med caldolysin.

Substrat Hydrolysehastighed f af hastighed Δ280 min-1 X 103 af oaeeinhyaroljse casein 3,33 100 ovalbumin 1,45 44 okseserumalbumin 1,33 40 hemoglobin 0,90 27 collagen 0,70 21 fibrin 0,65 18

Hydrolysehastighed f af hastighed a · -1 ^ in3 af a2o-casein-hydrolyse

Δ440 in x 1U

azo-casein 2,75 100 azo-albumin 4,15 151 azo-collagen 0,87 32 -1 3 min x 10 elastin-kongorødt 0,25 ca. 7 149867 5

Tabel 5.

Hydrolyse af peptid og peptidanaloge ved hjælp af caldolysin.

Substrat Hydrolyse hydrolyseret _ _ binding_

Gly-gly

Gly-gly-gly

Gly-gly-gly-gly - gly-gly

Gly-gly-gly-gly-gly - gly-gly D-leu-gly - -

Ii-leu-gly BOC-ala-try-met-asp- phe-UHg CBZ-gly-phe-HHg

Acetyl-ala-ala-ala-OMe - ala-ala CBZ-gly-pro-gly-gly- pro-ala - gly-pro CBZ-gly-pro-leu-gly-pro + pro-leu

Benzoyl-arginin»-ethyl- ester - - CBZ-gly-p-nitro-phenyl- ester

Tosyl-arginin*-ethyl- ester

Benzoyl-arginin-p- -nitroanilid

Benzoyl-phe-val-arg-p- nitroanilid + amid C B Z-gly-pro-arg-p-nitroanilid U9867 s

Tabel 6.

Lyse af mikroorganisme ved 75°C med caldolysin (20 ug ml'*1 0.1 M).

Mikroorganisme ATCC Gram- Kom- Par- ingen nr, reak- plet tiel lyse tion lyse lyse ___a___

Arthrobacter globiformis 8907 + +

Arthrobacter - + +

Bacillus cereus 9373 + +

Bacillus megaterium 9376 + +

Bacillus circulans 9374 + +

Micrococcus luteus - + +

Micrococcus lysodeikticus - + +

Saccharomyces cerevisiae - + +

Sarcina lutea 196 + +

Sporedanner uidentificeret Bacillus) + +

Staphylococcus aureus 6571 + +

Streptomyces griseus 8136 + +

Agrobacterium tumefaciens 15955 - +

Alcaligenes faecilis 8156 - +

Alcaligenes viscolactis 8154 - + C'itrobacter freundii - +

Cytophaga johnsonae - +

Escherichia coli B 11303 - +

Escherichia. coli K-^ _

Escherichia coli - +

Escherichia coli V7 - +

Enterobacter aerogenes - +

Enterobacter cloacae - +

Klebsiella pneumoniae 418 - +

Proteus vulgaris 67 - +

Pseudomonas aerogenes -- +

Salmonella typhimurium -- +

Serratia marcescens 1377 - +

Shigella flexneri - +

Shigella sonnei -- ί α, Gramreaktioner angivet fra Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (1974), 8. udgave (Buchanan E.E. og Gibbons N.E., redaktører) ’.Villiams & Y/ilkins Ltd, 7 149-867

P

d μ o o o o o o o o o cd o o ooooooo p om o o m o m o m φ oo s CO CO C"- co CO CTi σι p o i *· o +1 p 3 p (0 • p <XJ + + + + + Η Φ Η P P P P P P P P P ΛΡι

-P A A ΛΛΛΛΛΛΛ COS

co φ ht η æ m m ο W+3 β ·>»·»·» C\J a •η h o co <r o m h \ P . CM (O H ·+

φ A KM

> A β) cd . ΐ s° N * §i h *d _ Φ so

Λ _ H

O O

6¾ m +

(0 CO

H d « Φ Μ Η O O Ό d Φ CO H Op o λ d +» m a

•Η O H >> C^-O

μ Η ·Η H S

>ί d Λ o r-p

Ha aOHHHHH P W

o o h in in m in in h <d φ co s cd m m m m m φ ·> ό -PH poiiiii w co Η O ,Ρ Φ E-tE-iHHE-i cd

Η Μ P O CO £ (Q OS

« d a c d+> dm« w ω μ „ a

HOcdHO HddPPP eR

HSPHPHSSSSS in··

H P ,Ο H Cd H p p p P P »P

o Q) h om o φ φ φ φ φ o φ cd Λ cd cd-P cd Λ Λ Λ Λ A w

fC -P S fflco W E-i E-ι Ε-» E-ι Η ·· H

P Φ Φ 00 10 p Η -H Φ-Ρ H bo Φ

PP

Od) ·η co co co -P ho

P cd cd Φ P

p> P H T) fliH

cd«H oh p P p p P φ p p CO Ο -P Η Η Η Η H co Φ i>> sa Φ CO CO CO CO CO >,£ £ H So co t>> >> >"> J>> r*» Hd NO oa CdHHHHH Cd

PS SO ΦΟΟΟΟΟ P P

KP PP -P Ό Ό Ό Ό Ό CH

Φ Φ·Η OHHHHH

A Λ E P cd cd cd cd. cd £h Éh <! aooooo + 149867 8 (5) Stabiliserende virkning af divalente kationer.

Tabel 8 nedenfor viser indflydelsen af metalioner på stabiliteten af caldolysin ved 85°C (12 μ§ ml*"**· enzym, pH 8,1 Tris-eddikesyre, I = 0,3 M liter-3·). Caldolysin dialyseres i nærværelse af 1,0 mM EDTA til fjernelse af eventuelle metalioncofaktorer. Standardmetalionopløsninger sættes til portioner af "apoenzymet" for at give 10 mM i koncentration, hvorefter termostabiliteten af enzymet bestemmes.

Tabel 8.

Metalion Halveringstid _; minutter

Calcium anslået 340

Zink 144

Strontium 155

Magnesium 86

Cobalt 60

Barium 43

Kobber 21

Ingen anslået 5-10 (4) Stabilitet over for denatureringsmidler,

Caldolysin har vist sig at være stabilt og aktivt i nærværelse af en række denatureringsmidler, som det fremgår af tabel 9 nedenfor.

Tabel 9.

Stabilitet af caldolysin i nærværelse af denatureringsmidler.

Denaturerings- Halveringstid Halveringstid middel_ ved 18°C_ ved 75°C_ 1$ SDS >> 13 timer > 5 timer δ M urinstof >? 67 timer 53 minutter 0,8 M urinstof >>13 timer 148 minutter 6 K guanidin, HC1 » 31 timer 59 mimitter 1 fo Triton X 100 - »60 minutter 1fo Tween 80 - » 60 minutter (5) Andet,

Caldolysin er stabilt mod koncentrering ved lyofili-sering (frysetørring) og rotationsfordampning (reduceret tryk ved 37°0) som vist i tabel 10.

9 149887 label 10.

©ncentrerings- Koncentrations- $ tab af metode faktor specifik __ _ aktivitet

Lyofilisering 7 7»28

Rotationsfordampning 20 under 5,0$ D. Forhold mellem pH-værdi og aktivitet.

Optimum-pH-værdi for aktivitet på azo-casein optræder ved 8,5 +0,5 (ved 75°C). Ved en pH-værdi på 6,0-9,5 bibeholdes mere end 80$ af den optimale aktivitet.

E. Forhold mellem temperatur og aktivitet.

Under 40°C er enzymaktiviteten lav (mindre end 6$ af aktiviteten ved 80°C). Aktiviteten stiger næsten lineært mellem 45°C og 80°C.

HB: Skønt den procentvise aktivitet er lav ved normale temperaturer (20-40°C), kan tilstrækkelig aktivitet til effektiv proteolyse opnås simpelthen ved benyttelse af større mængder af enzym. Dets brugbarhed er imidlertid klart maksimal ved 65-85°C.

Enzympræparatet kan ifølge opfindelsen hensigtsmæssigt være stabiliseret som angivet i krav 2 og 3 og immobiliseret som angivet i krav 4.

Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af det omtalte enzympræparat, og denne fremgangsmåde er ejendommelig ved det i krav 5’s kendetegnende del anførte.

Fordelagtige udførselsformer er anført i krav 6-10. /

Mieroorganismen isoleres fra den varme sø nr. 351 i henhold til markering på et kort af "Wh^kii- rewarewa Hot Springs”, 1:2000, 1. udgave fra New Zealand Geological Survey (bibliografisk reference - Lloyd, E.F.

1974, Geology of Whakarewarewa Hot Springs, DSIR information series nr. 104 DSIR, Wellington, N.Z.). Den varme sø har en temperatur på 79°C + 4°C, har et lavt sulfidindhold ved en pH-værdi på 7,5-7,8. Organismen vokser dårligt under 60°C. Den er obligatorisk aerob. Cellerne er gramnegative, 149867 10 ikke-bevægelige og ikke-sporedannende stave. Den ligner Thermus aquaticus (Brock m.fl., J. Bacteriol. 98, 289-287; Degfryse m.fl., Archives of Microbiology 117,18), men der har vist sig en betydelig forskel i cytochromsammensæt-ningen mellem den omhandlede mikroorganisme og Thermus aquaticus.

Andre egenskaber ved denne mikroorganisme er anført nedenfor og er også beskrevet i Hickey and Daniel, J. og Gen. Microbiology (1979), 114, 195-200.

Isolering af mikroorganismen (forberedende trin)

Der tages prøver fra den ovennævnte varme sø. Isoleringen foretages ved gentagne subkulturer ved 75°C af organismerne indeholdt i en 1 ml prøve fra den varme sø i 10 ml af næringsvæske med halv styrke, pH-værdi 8,0. Dette efterfølges af vækst i det medium, som er beskrevet i eksempel 1 (i).

Fremstilling af subcellulære fraktioner

Der fremstilles cellefraktioner som beskrevet af Daniel (Biochim. et Biophys. Acta 216, 328-341), blot at sedimentationen af små partikler udføres ved 250.000 g i 1 time.

Måling af oxidasesvstemaktiviteter

Oxygenoptagelsen måles polarografisk under anvendelse af en Rank-elektrode (Rank Brothers, Bottisham, Cambridge, England). Reaktionsblandingen består af 0,1 M KHg PO^/NagHPO^--stødpude, pH-værdi 7,0, en passende mængde membranpartikel-protein og 50 μιηοΐ substrat (undtagen i tilfælde af NADH, hvor der benyttes 5 μΐΕοΙ) i et slutrumfang på 2,5 ml.

Stødpuder afbalanceres ved den ønskede temperatur med vandbestænket luft i 30 minutter.

Partiklerne afbalanceres i elektroden i 2 minutter før målingen af oxygenoptagelsen. Der-måles hastigheder i det første minut.

149867 11

Spektrofotometri,

Der fås differensspektre ved stuetemperatur med et skrivende Cary-spektrofotometer model 17.

Koncentrationen af individuelle cytochromer bestemmes fra de (dithionit-reducerede minus oxiderede)-differensspektre samt for cytochrom fra de (reducerede ninus reduceret + CO)-differensspektre under anvendelse af følgende bølgelængdepar og ekstinktionskoefficienter: Cftype-cyto-chrom 553-540, ε^ = 19 mM ^ cm ^ (Chance m.fl., J. Bio.

C>:em. 21£, 439-451), totalt b-type-cytochrom 569-575 nm, emM = 0111-1 & Haneert J· Bio· Chem. 239. 1024- -1031), cytochrom o-CO, 417-429, εγηΜ = 170 mM”’·*' cm**^ (Daniel, Biochim. et Biophys. Acta 216. 328-341), a-type-cyto-chrom 602-630 og 613-630 = 24 mM”'*' cm*"·*· (Van Galder

Biochim. et Biophys. Acta 118. 36-46).

Vaskede membranpartikler er i stand til at oxidere andre substrater indbefattet glutamat og malat (over 0,05 1 —i umol 0o min~'L (mg protein) ) og lactat, citrat, fumarat, glycerol og glucose (0,005-0,02 μιηοΐ Og min (mg protein) ). Bortset fra tilfældet med succinat og lactat forøges aktiviteterne ved hj®lp af tilsat overliggende væske samt DADH,

Acetat, saccharose, manitol og ethanol oxideres ikke.

Både MDH- og succinatoxidaser har maksimumaktivitet ved en pH-værdi på 7,0 og ved en phosphatstødpudemolaritet på 0,1 M, bestemt ved 75°C.

Aktiviteterne af UADH- og succinatoxidaser bestemmes efter 2 minutters præinkubation ved temperaturer mellem 40°C og 95°C. Hver er størst ved 75°C i cellefri ekstrakt og.ved store og små partikler. HADH-oxidasehastigheden i respirationspartikler er særlig temperaturfølsom, idet hastigheder- 149867 12 ne ved 70°C og 80°C er omkring halvdelen af værdien ved 75°C.

I alle tilfælde er aktiviteten ved 75°C mindst 10 gange større end aktiviteten ved 40°C.

Ved 75°C gælder bortset fra et indledende delvis tab af aktivitet, at respirationskæden i hele celler, celle -frie ekstrakter og respirationspartikler er forholdsvis stabil, men der er en betydelig forøgelse på kort tid i suc-cinatrespirationen af hele celler,og endogen respiration følger et lignende mønster. Ved 90°C findes dette for hele celler og cellefrie ekstrakter, men ikke vaskede respirationspartikler, Ved 90°C er succinatoxidasen af hele celler og HADH-oxidasen af vaskede respirations partikler væsentlig mindre stabil end oxidase aktiviteterne af cellefrie ekstrakter.

Disse stabiliteter er væsentlig større end dem, som opgives for liADH-oxidase fra Bacillus stearothermophilus-pro-toplaster (Wisdom & Walker, J. Bacteriol., 114, 1336-1345).

Termostabiliteten af MDH-oxidaseaktiviteten af respirationspartikler ved 90°C i en periode på 15 minutter er upåvirket af phosphatstødpudekoncentrationen (0,01 M til 2,0 M), 1,0 M - MgSO^ eller af 10 mg ml""1 casein. Stabiliteten øges til ca, det dobbelte ved hjælp af 50>£ rumfang/rum-fang glycerol, 2,0 H - (HH4)2 S04 og 10 mg ml-1 HADH. Hastighederne bestemmes ved 75°C,

Der noteres absorptionstoppe for a-, b- og c-type-cytochromer hos vaskede respirationspartikler ved henholdsvis 613 og 602, 559 og 555 nm. Det hovedsagelige a-typecytochrom har en absorptionstop ved 613 nm, hvilket er usædvanligt:

Trugene ved 615 og 444 nm i. carbonmonoxidspektret antyder, at i det mindste ét af a-typeeytochromerne er en terminal-oxidase. Truget ved 561 nm og toppen ved 417 nm angiver tilstedeværelsen af cytochrom o, og truget ved 550 nm angiver, at der er noget CO-reaktionsdygtigt c-typecytochrom i respirationspartiklerne. Højhastighedsupernatanten indeholder mindst to opløselige c-typecytochromer, da forholdet mellem toppene ved 420 og 426 nm varierer noget mellem præparationerne, og da i det mindste en af disse er CO-reaktionsdygtig.

149867 13

Cytoohromerne af type b og c i Thermus HH er blevet angivet af Pask-Hughes & Williams (Scientific Progress at Oxford 62, 373-393) og a-605 og b- og c-typecytochromer i en organisme af typen Thermus aquaticus af McFetters og Ulrich (J. Bacterial. 110 (2), 777-779).

Cytochromkoncentrationerne (μmol cytochrom (g.protein)”1) i respirationspartikler er a-602, 0,03; a-613, 0,06; total b-type 0,89; o-0,2lj total c-type 0,64. I supematan-ten c-type 0,79; CØ-reaktionsdygtigt cytochrom c, 0,02. Bisse koncentrationer er ret typiske for dem, som findes i andre aerober.

Alle undersøgte inhibitorer frembringer inhiberings-niveauer inden for området af dem, som findes hos andre bakterier, og der er ikke noget tegn på, at aktive områder er mindre udsatte end hos ikke-termophile, Terminaloxidaseinhi-bitorer påvirker HADH- og succinatoxidaser lige meget ligesom amytal. Rotenon har mere effekt på MBH-oxidasen, medens bathophenanthrolin-2-heptyl-4-hydroxy-quinolin-ir-oxid og an-timycin A er mere effektive inhibitorer for succinatoxidase.

Nedenstående eksempler illustrerer fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Eksempel 1

Trin 1'

Dyrkning af mikroorganismen (I) Kulturer opretholdes på et medium bestående af Allen’s salte, jvf. tabel 16 sidst i beskrivelsen (Jackson m.fl., Archiv fur Mikrobiol. 88, 127-133) med 0,1% vægt/rumfang gærekstrakt' (BBL) og 0,1% vægt/rumfang trypticase (BBL) i flydende kultur ved 75°C. Mediet indstilles til en pH-r værdi på 8,2 før autoklavering. Den endelige pH-værdi er 7,5.

(II) Organismen dyrkes ved 75°C på et lignende medium, men med 0,3% gærekstrakt og 0,3% trypticase. 500 ml charger dyrkes i 2 liter erlenmeierkolber i en orbitalinkubator og høstes enten til brug eller benyttes til podning af en 20 liter fermenteringsbeholder. Organismen vokser godt ved 75°C under 149867 14 betingelserne (I) og (II) og dårligt under 60°C. Der høstes celler i den sene logfase (10-12 timer efter podningen) ved o 7 “1 en absorption på ca. 1,4 ved 650 nm (ca.2,5 x 10'celler ml ).

Trin 2a Totrins rensning af caldolysln

Rumfang 50 liter Dyrkningsvæske centrifugering '' 50 liter Supernatant (1) CBZ-I-Phe-TETA-Sepharose- -4B-affinitetschromatografi 2,5 liter Absorbat (2)

Den dyrkningsvæske,'som behandles ifølge ovenstående diagram, kommer fra trin 1. Centrifugeringen udføres i en kontinuerlig strømningscentrifuge ved 27.000 g. Supernat antens pH-værdi indstilles på 8, før den ledes gennem affinitetsgelen.

De eksperimentelle data fremgår af nedenstående tabel 1.

Tabel 1.

Trin Rumfang Protein Aktivitet Specifik Rensning Udbytte liter pg/ml PU/ml Aktivi- fold $ tet _____PU/mg________ 1. Supernatant 20 24 0,005 0,25 1,0 100 2. Affinitets- renset 1,1 14 0,079 5,76 23,2 73

Trin 2 b Piertrinsrensning af caldolvsin.

Det samlede reaktionsskema fremgår af følgende diagram: 149867 15

Rumfang 50 liter dyrkningsvæske I centrifugering 27.000 g γ kontinuerlig strømning 50 liter supernatant (l) SPC 25-ionbytter retardat indeholdende 2 mindre proteaser -«£- v 49,5 liter eluat (2) I milliporeultracentri- I fugering I 1.000-(molekylvægt, Λ nominel)-afskærings- i membran

filtrat X

8 liter retentat (3) CBZ-L-Phe-TETA-Sepha- rose-4B-affinitets- ,' chromatografi 2.5 liter adsorbat (4) enzympulver ! resuspenderes i i stødpude t enzymkoncentrat (5) 1.5 liter renset caldo- lysin (6) gelchromatografi på

Sephadex G75 149867 16

Størstedelen af enkelthederne fremgår af diagrammet. Imidlertid koncentrerer ultrafiltreringstrinnet eluatet (2) 10 gange, Eetentatet (III), som underkastes affinitetschroma-tografi, indstilles til en pH-værdi på 8, og absorbatet (4) elueres som en enkelt top med pH 2,7 0,1 M eddikesyre indeholdende 10 mM Ca^+.

Enzymkoncentratet (5) elueres fra 075-gelsøjlen under o+ anvendelse af en eluerende stødpude ved pH 8,1 og 10 mM Ca ,

De forskellige trins data i reaktionsskemaet fremgår af tabel 2 nedenfor.

149867 17 τ) Η bO Ο α *ν ο-

•Η C

β Ο (Μ Ο S C0 (Μ β> (Q η k k « « ft 4^ β Η Η CM C" t-- Ο jp φ K\ N 0\ f<

od I

Q) CO

,+> IO CO ΙΛ 00 -i B

.ρ ft «k « « » V-/ OOOCOCOOVO ,α^ξ. O vo in CM CM Η β

•β H *H

H 0) 03 cd

•p O

,¾ Φ •Η -Ρ ΙΛ t*> \0 «ΗΗ C\l <f 4 <f N σ\ in *H^bO ft ft ft ft ft ft ♦*

O *H S Η H CM VO <r o O

φ-Ρ'ν. -d- m h ΡιΛΡ Η +>

CQ CO CU CO

ρ

-P

+» i λ ta <S> >> tt! O .£ •PH ^ o tn ts is m is β HHO Φ O ΟΊ o <J· VO CM o\ ta (0>ΦΙ1Ι,ΟΗ »»».»* . ρ h -p Ad φ in <f tn η H o » cmo-ρομλχ o

Μ Ad .β τΗ Ή ^ O

H CO Ρ,-Ρ Φ JA

0) C'- Φ Ό &H β S> •p -π m >

Η Φ'-' O O O VO VO IS

co-p ho o -ί h tn tn •POS o ts <1- co β O p*w <f CM Η ·Η HP, ja β Ή •Ρ Μ ο β ** tø β in m tn ιη cp φ ·> ·> ·> « -Ρ s-ρ ο σ> οο cm ο η β ·η m -ϊ ω

Cd Η S

II

r\ Ό

R I

Ν -Ρ β •Ρ β C0 Φ J0 Φ Ρ β -Ρ Ad •Ρ -Ρ β S Μ β φ Φ £> ·Η Φ 03 Ο Ν -Ρ Ο β β β Ρ β Φ Ο Φ Η Ρ (0 Ο β Ad Ο β β Ad 03 -Ρ -Ρ Φ Λ Η Φ -Ρ Φ Φ -Ρ •Ρ Φ β Φ 03 03 Ο C0 I Ο -Ρ Η β β β in (¾ Η Η Φ Qi β β CM Η β Η β •Η Φ Η ·Η «Η β Ρ, CA Η «Ρ Ο ΙΑ £> en β ·η «ρ >> c- CO CO S << 1-1 ϋ Η Η CM ΙΛ -ί ιη ΙΟ Κ 149867 18

Eksempel 2. Vækst af mikroorganismen .ok produktion..af caldolysin

Optimal produktion af caldolysin opnås, når mikroorganis--men. dyrkes på peptonmedium indeholdende Allen’s salte ved peptonkoncentrationer på 0,6-1$ (celledelingstid ca. 2 timer). Koncentrationer af peptoner over 1$ inhiberer produktionen. Mikroorganismen vokser dårligt på salte/casein- eller salte/al-bumin-medier og udskiller kun lidt protease. Imidlertid kan udbytterne af ekstraeellulær protease forøges betydeligt ved tilsætning af proteinsubstrater til 0,6$ peptonmedier. Ved 75°C indtræder optimalt udbytte af caldolysin i løbet af 18 timer (19$ podemateriale, luftning = medierumfang/minut).

Udbytte: 0,12 PU/ml dyrkningsmedium: hvor 1 PU = 1 mg tyr frigjort/minut ved 75°C; substrat = 0,5$ casein.

Immobilisering af caldolysin på glasperler.

Caldolysin immobiliseres på ikke-porøse glasperler ved hjælp af den silan-glutaraldehyd-koblingsmetode, som er beskrevet af Stolzenbach og Caplan (1976), Methods in Enzy-molog; 44, 926. 10 g glasperler (Corning Class, 40 masker pr, cm) vaskes i et overskud af 5$ HI'TO^ ved 100°C i 50 minutter. Det syrevaskede glas filtreres og skylles og sættes derpå til en 10$1 s vandig opløsning af γ-aminopropyltri-ethoxysilan (indstillet til pH 5,5 med HNO^). Suspensionen inkuberes ved 75°C i ca. 5 timer for at tillade silanise-ring. Efter filtrering sættes de silaniserede glasperler til en 20 ml rumfang af 5$ glutaraldehyd i 0,01 M, pH 7, phos-phatstødpude. Pette omsættes i vakuum i 2 timer ved stuetemperatur og vaskes endelig grundigt med destilleret vand.

17 ml af en opløsning af caldolysin (25 μg ml-1) af kendt aktivitet sættes til det fremstillede keramiske substrat. Suspensionen omrøres ved stuetemperatur i 18 timer til fuldstændig glutaraldehydtværbinding. Det immobiliserede enzym filtrerés derpå, vaskes med 100 ml HgO, 100 ml 1 I HaCl og yderligere 500 ml H20. Filtratet og vaskevæskerne analyseres ved Kunitz’ metode.

149867 19

Det immobiliserede kompleks analyseres ved en modifikation af Kunitz' metode. 14 mg prøver af enzymperlekomplek-set anbringes i reagensglas, blandes med 2 ml 0,5$ casein-substrat og inkuberes ved 75°0 under kontinuerlig omrystning.

De proteolytiske aktiviteter af den oprindelige enzymopløsning, det immobiliserede præparat og vaskevæskerne (ikke-im-mobiliseret enzym) beregnes (tabel 11).

Tabel 11.

Aktivitet af glasperleimmobiliseret caldolysin.

enzymaktivitet (PU) total enzymaktivitet af oprindelig opløsning 25,4 total enzymaktivitet ikke bundet til glasperler 0,6 total aktivitet af keramisk bundet enzym 0,2

Genvinding af aktivitet i immobi- liseret tilstand = 1$

Man konkluderer, at caldolysin enten inaktiveres under forsøget på at tværbinde det til det silaniserede glas eller bindes i en sådan orientering, at sterisk hindring forhindrer proteinsubstratets adgang til det katalytiske sæde.

Immobilisering af caldolysin i forhold til Sepha-rose 4B.

Sepharose 4B (Pharmacia) aktiveres med cyanogenbromid som beskrevet af Fujiwara & Tsuru (1977 International Journal of Peptide and Protein Research, 2* l8)· Under aktiveringen holdes Sepharose-suspensionen på 25°C og ved en pH-værdi på 10-11 ved dråbevis tilsætning af 4 H NaOH, Den aktiverede gel vaskes og opbevares ved 4°C.

15 ml af en caldolysinopløsning (25 μg ml*"1 i 0,1 M CH^COONa, pH 7,2) indstilles til en pH-værdi på 9,7 og sættes til 40 ml sedimenteret aktiveret SeP^arose 4B. Blandingen inkuberes ved 4°C i 72 timer. Derpå frafiltreres caldolysin-Se-pharose-komplekset og vaskes med destilleret vand. Analyseresultater for det frie enzym, immobiliseret enzym og gelvaske-væsker fremgår af tabel ]2, 149867 20

Tabel_12,

Aktivitet af Sepharose-4B-immobiliseret caldolysin.

Enzymaktivitet to.

Total aktivitet af fri-enzym-opløsning 17,0

Total aktivitet ikke bundet til Sepharose 0,7

Total aktivitet af Sepharosebundet enzym 12,0

Genvinding af aktivitet i immobiliseret tilstand 75$ ........ Immobilisering af caldolvsin på carboxymeth.yl- cellulose.

Curtius-azidmetoden , som først er beskrevet af Michael & Ewers (1949 Markkromo le kular Chemie 3,» 200), modificeret af Mitz & Sumraaria (1961 Nature 189« 576) og detailleret af Crook m.fl. (1970 Methods in Enzymology 1£, 963) og Lilly (1976 Methods in Enzymology 44, 46), benyttes til immobilisering af caldolysin på CM-cellulose, 5 g CM-cellulose (Pharmacia) behandles med methanol i syre, •hydrazin-hydrochlorid og natriumnitrit i syre som beskrevet i artiklerne ovenfor.

Til den aktiverede cellulose sættes 77 ml caldolysin (61,5 lig ml""·*· i pH 9,2 stødpude). Koblingsreaktionen mellem substrat og enzym ledsages af en nedsættelse af pH-værdien, som genindstilles til 8,7 ved tilsætning af mættet natrium-boratopløsning under reaktionens varighed på 60 minutter. Komplekset vaskes derpå med portioner af destilleret vand,

NaCl, eddikesyre og natriumbicarbonatopløsning. Det immobi-liserede kompleks og alle opløsninger analyseres som beskrevet ovenfor. Aktivitetsdata fremgår af tabel 13.

Tabel 13.

Aktivitet af caldolysin immoblliseret på CM-cellulose.

Enzymaktivitet (PU)

Total aktivitet af opløsning af frit enzym 239

Total aktivitet ikke bundet til CM-cellulose (vaskevæsker) 29

Total aktivitet af CH-celluloseimmobilise- ret caldolysin 66

Genvinding af aktivitet i immobiliseret tilstand 31$ 149867 21

Sammenligningsdata for frit og immobiliseret caldolysin.

Det er vist ovenfor, at immobiliseringen af caldolysin på forskellige uopløselige substrater sker med betydelige forskelle i genvindingen af aktivt immobilise-ret enzym (dvs. 1% for glasperler, 31% for CH~cellulose og 73% for Sepharose 4B). Bette kan skyldes tabet af aktivitet ved denaturering eller forskelle i inhiberingen som følge af sædet i enzym-matrix-kPvalentbindingen.

Ben aktivitet, som bevares efter immobilisering af caldolysin på Sepharose (73%) er høj sammenlignet med andre publicerede data. Ved binding af en række proteaser til Bowex M-l-anionbytterhaxpiks fandt Ohmiya m.fl. (1978 Biotechnology and Bioengineering 20, 1) aktivitetsudbytter fra 3% til 39%. Mason m.fl. (1975 Biotechnology and Bioengineering ΐχ, 1019) opnåede aktivitetsudbytter på 41,4% og 57,7% ved kobling af B. subtilis neutral protease på glas ved hjælp af henholdsvis azo- og glutaraldehydmetoden.

Et område af karakteristika for de immobiliserede caldolysinpræparater, indbefattet termostabilitet, pH-akti-vitetsprofiler og Michaelis-Menten-kinetik sammenlignet med de tilsvarende data for det frie enzym. Da residualaktivi-teten af det glasperleimmobiliserede enzym er yderst lav, er der ikke foretaget noget yderligere studium af dette kompleks.

Termostabiliteten af de immobiliserede caldolysinpræparater bestemmes ved forskellige temperaturer og calciumkoncentrationer. Eumfang af immobiliserede enzymer suspenderes i O^LM Tris-eddikesyre-stødpude, pH 8,1, indeholdende· kendte koncentrationer af calcium. Suspensionerne inkuberes ved den ønskede temperatur, og portioner fjernes med mellemrum til analyse efter omrøring af suspensionen til sikring af homogenitet. Immobiliserede apoenzymportioner fås ved elu-ering af det uopløselige kompleks (holdt i en Pharmacia-K 12--glassøjle) med 10 ml EBTA i nogle timer og endelig vaskning 149867 22 med destilleret vand. (Udtrykket apoenzymet er genstand for de ovenfor diskuterede "betingelser: Det er muligt, at tæt bundne caleiumioner i den immobiliserede tilstand muligvis ikke kan fjernes ved en sådan behandling). Termostabilitets-data fremgår af tabel 14.

Tabel 14.

Ξη sammenligning af termostabiliteten af frit og immobilisers t oaldolvsin.

Enzymtilstand Calcium- Ca++ Halveringstid minutter ved T°C

_ tilstand mM

85 90 95

Fri holo 10 560 60 28

Sepharo^e- -bundet holo 10 1060 165 125 CM-cellulosebundet holo 10 - 110 -

Fri apo 0 - over 6 -

Sepharose- -bundet apo 0 - 28

Fri holo 0 - ca, 15

Sepharose- -bundet holo 0 64 -

Immobiliseringen af caldolysin på Sepharose resulterer i en forøgelse i termostabiliteten på 5-4 gange i et antal fcrs’--elli-~e temperaturer og betingelser, medens en termostabilitet sforc-ge Ise på ce. det dobbelte hidrører fra kovalent binding til CM-cellulose, En nedsættelse af stabiliteten af holoenzym-Sepharose-komplekset ved inkubering i en calciumfri stødpude antyder, at stabiliseringen ved høje calciumkoncentrationer er en ligeså betydelig faktor i den ubevægeliggjorte tilstand som ved det frie enzym, medens den nedsatte stabilitet af det Sepharose-immobiliserede enzym efter EDTA-behandling (apoenzym) antyder, at immobiliseringen ikke hindrer fjernelsen af i det mindste noget af den af calcium hidførte stabilisering.

149867 23

En prøve af Thermus T-351 er blevet deponeret i American Type Culture Collectiona, 12.301 Parklawn Drive, Eockville, Maryland 2o.852 under nr. 31.674 den 30 JUI 1980.

Stabilitet af cald.olvsin ved varierende koncentrationer af Ca++.

Halveringstiden af caldolysin i nærværelse af forskellige koncentrationer af calciumioner fremgår af tabel 15. Caldolysin- og ionopløsningerne fremstilles som i eksempel 3 (C) (3) ovenfor.

Tabel 15.

Ca++-koncentration Halveringstid _mM min._ 0 under 10 0,1 15 0,5 22 1 38 5 225 10 ca. 360 50 600 100 780 500 780

Allen’s salte har følgende sammensætning:

Tabel 16

Komponent Koncentration (gm/b) (NH4)2S04 1,3 KH2P04 0,28

CaCl2.2H20 0,074

MgS04.7H20 0,247

Ovenstående tabel angiver et foretrukket eksempel på et Allen's salt. Medens der her er anført foretrukne koncentrationer, vil det forstås af fagfolk, at andre koncentrationer med beslægtede mængdeforhold kan benyttes.

Claims (5)

149867

1. Proteolytisk enzympræparat, kendetegnet ved, at det indeholder et proteolytisk enzym benævnt cal-dolysin, som er identisk med det proteolytiske enzym, der opnås ved dyrkning af Thermus aquaticus ATCC 31.674, og som har en molekylvægt på 20.000 ± 3.000 og et isoelektrisk punkt på ca. 8,5 og er stabilt ved temperaturer på 75°C og derunderved tilstedeværelse af divalente kationer og stabilt ved pH-værdier på 4-12 under tilstedeværelse af calciumioner.

2. Enzympræparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er stabiliseret ved tilstedeværelsen af divalente kationer.

3. Enzympræparat, ifølge krav 2, kendetegnet ved, at det er stabiliseret ved tilstedeværelsen af calciumkat ioner.

4. Enzympræparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at enzymet er immobiliseret på en passende bærer.

5. Fremgangsmåde til fremstilling af enzympræparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man dyrker bakteriestammen Thermus aquaticus ATCC 31.674 i et næringsmedium, og at man centrifugerer den opnåede kultur og eventuelt efter forudgående rensning underkaster supernatanten fra centrifugeringen en affinitetschromatografi på en passende aktiveret affinitetschromatografigel, og at man elu-erer caldolysinet fra gelen med en passende stødpude.