DEP0029797DA - Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums - Google Patents

Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums

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DEP0029797DA
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DE
Germany
Prior art keywords
actinomyces
alcohol
adsorbate
active material
adsorbent
Prior art date
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Expired
Application number
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English (en)
Inventor
William S. Princeton Marsh
Rudolf L. Summit Mayer
Robert P. East Orange Mull
Caesar R. Summit Scholz
Robert W. Chatham N. J. Townley
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF Schweiz AG
Original Assignee
Ciba AG
Publication date

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Description

CIBA AKTIENGESELLSCHAFT, BASEL (SCHWEIZ)
« r? ra '5 f. OO /p
Patsnfanwait Dipl.-Eng. ί:.."' ,:;':::v:;,
Hamburg g j
Neuer Wall 10, 4. Stock Anruf 3479 00
2 7. Dez. 1943
D@utsch3.and
Yerfahran zur Herstellung eines aewert Antibioticums.
Diese Erfindung bsfasst sich mit einem Verfahren
sur Herstellurag eines neuen Antibioticums« Dieses gewinnt man aus Actinomyces Vinaceuss einer neuen aus dem Erdboden isolierten Spesiesr Sie weist morphologische und biochemische Unterschiede gegenüber den bekannten Actinomyces=Arteas aus welchen Anti= biotica erhalten werden,, beispielsweise Actinomyces antibloticuss Actinomyces lavendulae und Actinomyces griseuSj, auf ,·, wie dies in der Tabelle 1 gezeigt wird0
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r'\s L «-iJloticua wird -dadurch hergestelltP dass man d'j :· in */:<:5r"~ Γ' '" * in einem geeigneten Msdiiisi kultiviert s das. Kohlenstoff-" iHid 5- tiolcst äff-Quellen, wie S = Bd Kohlenhydrate beispielsweise Dertrcsef RohrMie!·,·:· Jzi lactose^ CRycer-Ins Pepton, hyciroli ertes Caseiai Matriumnitrat usw. enthält s wie -L· h 1 .;f -„'o - ' ..· jt 1 S~V « -B. Kalium-, Magnesium» und
. i. f. c - <- i1 >% . , Ij""". ^riiC'"•'!■!"C73, Kachdem das Wachstura beendet Istf wird diU Eultur filtriert und das Filtrat mit «i;isa> /df wpfciotismittol wie e«B. aktivierte Kohle, Kaolin j oder anderen Erdea behandelt. HacMera das Adsorbat gegebenen«= falls suerst mit Alkohol ausgewaschen Imrdes, wird das aktive Material mit einem alkoholischen Lösungsmittel wie einem angesäuerten Alkoholi beispielsweise Eethanolischer Salzsäure oder mit einer Mischung eines Alkohols mit anderen Lösungsmitteln wie SoB, Dimethylearbonat-Methanols-Bensol-=Aetherf Chloroform= »Methanol usw0 eluiort. Das Antibioticum wird aus dem Eluat mit einem. ^erdtinnuRgsmitteii welches mit den vorgenannten LösurAgsiTiittoin Liue lifcar ist, wie S0Bo Aethsrs Petrolaethers, Pentans ΙΙίι:~γ: s.v.•-^fallt 0 Das so erhaltene Produkt besitzt ein k>n -c :c " '-' '' 1 "*v ict sehjjf ^ark gegen Stamm© von
Ci; ; "* 1 C''-..^ ''tv, ;.'.·, hcriuis und Bacillus sub tills
ν.-] ι-" 'ei j, . ;· ■ if .^'.n 5U5'.f.8 von Staphylococcus aureus und Escherichia coli wirksam.
Sur weiteren ReixiIgung kann das erhaltene/Material der Chromatographie, in z.B. alkoholischer Lösung über Aluminiumoxyd unterworfen werden« .Mach dem Eindampfen des Lösungsmittels wird das Produkt in kristalliner Form erhalten. Bs kann dann weiter umkristallisiert werden.
Eine sehr wichtige Eigenschaft des :ueu©n Antibioticuias besteht Ciarins, dass nach unseren Versuchen Mikroorganiamen gegen dieses Heilmittel nicht resistent werden im Gegensatz zu Strepto= my ein [ «/aksman et al3 Proc IfetsI Acad., Sei. 31, 157 (1945) 3 und anderen Antibiotica [McKee et al, J.Bact. /g/£, 187 (1944) J Eisman et al, Scie- 103» 673=74 (1946)3 gegen weiche leicht Resistenz auftritt. Das neue antibakterielle Mittel ist somit geeignet zur Behandlung von Infektionen und .' .besonders von SoIchenf in welchen ä:i© die Infektion verursachenden Organismen gegenüber anderen Antibloticis resistent geworden sind« JSs kann zudem mit anderen antibakteriellen Mitteln zusammen gebraucht werden» •uia zu Verhinderai, dass resistent© Stämme entstehen.
Beispiel Io
Darstellung des Bapf stoffes; Actinomyces vinaeeus wird auf einem Czapek-Dox Agar der folgenden Zusammensetzung gezüchtet;
Dextrose 40 S
MaMO3 3S0 g
ΚίΙ,.ΡΟ^ IsO g
MiSOjj \ ?H20 0,5 g
KCl ' 0,5 g
FeSOli 0,01 g
Agar 15 g
Leitungswasser mm. Auffüllen auf 1 Liter0
Dl© isräßrend .dieses Wachsttaa gebildeten Sporen werden in ©ine® ieleinsa VoIximen C5 car') von sterilem Ifesser gesammelt und mit sterilen Glaskralloa geschüttelt«. Mit der nach dem Absitaea dar grösseren Teilchen erhaltsnsn Suspension, impft man eine Ansabl
von 1 Liter Erleraeyer Kolben, welcher jeder 125. cm von hart gewordenem modifiziertes Caapek-Doz Agar enthält« Dies® Kolben werden bei 2ÖW während ?™IÖ Tagem stelisn gelassen, dph« bissieb, ein gleiehmä&slg gutes Sporenwachstuia entwickelt hat= Die
Spores werden gesasaaelt und in IGO esa desto sterilem Wasser auf·= geschwärmt» Disss Suspension filtriert Eaa unter aseptischen. Bediaguiigen durch sterile Glaswolle». Diese Sporensuspension wird ds-.nn fervj-KLi st,. u;a grosser a AnsStsseji in welchen die Herstellung des. AntibioticiJiraii Grfolgt1, zu beimpfen,=
Die Darstellung des tiM^tIgugigi^ Ein Medium der folgenden Zusmnraensetaung:
Dextrose 10 g/Liter Peptoa (Bacto) 5SQ g/Liter
Fleischkoiisentrat (Difco) 590 g/Liter WaGl SpO g/Liter
Leitungswasser sum Auffüllea auf ?00 cm ^
wird bereitet und in zwei 1 Liter FlascheiiurtevOi,? Atmosphären Dampfüberdruck während 40 Minute» sterilisiert. Die so vorbereiteten Medien werden beimpft„ dann gut geschüttelt und bei 25-28 stehen gelassen» Nach 5 Tagen hat sich ein leichtes Qberfläehenwachstum() das eine grau =-rot-blaue Farbe aexgt9 entwickelte Dann ^ird jede Flasche durchgeschüttelt und während 25-30 Tagen stehen gelassenf wobei man in Intervallen den Gehalt testierte Sobald der maximale Wirkurigstiter gegen Mycobacterium tuberculosis erreicht ist und das Flltrat ein pH über 7se seigt f wird die Actinomyces= Kultur filtriert und das Filtr.·.-1 für di© weitere chemische Extraktion und Reinigung verwendet 0
Typische Versuclisergebniss© des Filtrates mit der Plattesi-Methode werden in der nachfolgenden Tabelle geaeigt =
Höchste Verdünnungj bei der noch
vollständige Hemmung « lintritto j
Staph,, aureus E0 Coli Myco 0 tb 0
Mo» £09 Mo ο Ö20Ö No« 607
Act-, viaaceas ιFiItrat| 1»12 ls3 1:150
Act, griseus (Filtrat) 1:20 1 a !{-Ο Is 75
A c t * lave ndulae · 1:40 1:75 <1:10
Act ο antibiotics® 1:^00 O 0
Extraictiop. dg^^aktivgn Mat.erials: Zn 80 Liter des
Ifdltur=Filtrates Vierden ÖOO g Aktivkohle zugefügt und während 6 Sivanden heftig .!gerührt, Das Adsorbat wird dann von der Brühe abfiltriert und bei -5° bis aur weiteren Behandlung aufbewahrt«
10 g dieses Kohleadsorbates schüttelt man während 2
Stunckm auf einer Schüttelmaschine mit 100 cm eines Gemisches von Diraethylcarbonat-Metiianol (3:7 Vol>Teile). Das Eluat wird von der Aktivkohle efogsgsasgfc und ein gleiches Volumen Diäthyläther zugegeben, wobei ein grauweisses Pulver ausfällt, das nach dem. Trocknen bei Raumtemperatur is Vakuumexsikator 250 mg wiagto
Organismea
Teilweis© Hemmung Totale Hes
jStapbylocοccus aureus
E, coli
γ pro
100 - 200 100 - 200
Mycobacterium tuberculosis <10
γ pro chi
400 - 600 >600
20 - 40
Beispiel Zo
Daa leriahren wird aach des Beispiel 1 ausgeführt bis und mit der Behandlung mit Aktivkohle»
Kachdem die Aktivkohle vor der Brühe abfiltriert Ist5
werden $30 g des feuchten. Adsorbates (~ 52 Liter Kulturfiltrat) je während einer Stunde mit. vier Portionen von Methanol ClOOO8
750,-, 500 und 500 cm ) ausgerührt ο Die Methaooleluate verwirft man.
Das Adsorbat wird dann sukzessiv mit 24009 1800 und 1500 era"' OjlR=-Chlorwasaerstoff in wasserfreiem Methanol gerührt« Di® Säureeluat® vereinigt.man und schüttelt sie während 50 Minuten mit. dem halben Volumen Petrolaethsr !Siedepunkt 30-60°) s worauf ein grauer s bröckeliger Niederschlag (I) entsteht9 welcher nach dem Trocknen bei Zimmertemperatur iia Vakuumexsikator 3S65 g *ri®g%0 Durch weiteres Zufügen von Patrolaether wird nichts mehr
Wirksamkeit;
Organismen
Staphyloeoseus aureus Ko0 209
E0 Coli
Mycobacteriusi tuberculosis
Teilweise Hemmung Totale Hemmung
γ pro cm
32 - 40
60 g des obigen aktiven Materials (I) werden in 1800 cm ^ 80/£igem Methanol gelöst. Diese Lösung 'lässt man durch eine Kolonne von 1200 g mit Salzsäure behandeltem Aluminiumoxyd Iaufen0 Dann θluiert man mit ÖO^igem Methanol5 verwirft die ersten 400 cm und dampft die nächstfolgenden 2400 cm Bluat im Vakuum bsi 40-45 zur Trockne ein« Sie ergeben 18 g . aktives Material0 Diese Chromatographio wird wiederholt8 wobei man 25 g einmal Chromatograph!ert©ε Materialf in 2400 cm 8Q$igem Methanol gelöst8 an 750 g Aluminiumoscyd adsorbierte Aehnlich wie vorher eluiert man mit SO^igem Methanol und verwirft die ersten 300 cm^„ Die
1 ο nächsten 2500 cur werden im Vakuum bei 40=45 zur Trockne eingedampft und ergeben 22,7 g aktives Material0
2 65 g zweimal ehromat ο gr ap hle rt e s Material werden zn feinem Pulver gemahlen und in 500 cm^ abs« Methanol bei 55-60° gelöst« Diese Lösung wird filtriert und das Filtrat über Wacht bei Zimiiiertemperatur im geschlossenen Gefäss stehen gelassen«
Das kristalline Produkt, welches sich dabei bildet, wird abfiltriert und getrocknet» Man erhält so I512 g aktives
Material in Form seines sal2sauren Salaeai, welches bei 248 (unter Zersetzung) schmilzt; BJcsi ^ei m'fA* e
— 33i)5°° ßa bildet aus alkoholischer Lösung ein kristallines Pikrat mit eines Schmelspunkt von 215° (Zersetsung)e
Das so erhaltene Produkt ist gegen Mycobaeteritasi tuberculosis {A tlT0T 0C= Ko0 60?) wirksam mit 4.1 mg/cm?. Es ist in Wasser Ioslichf schlecht löslich in niedrig molekularen Alkoholesii, unlöslich in den meisten üblichen organischen Lösungsmitteln und kann nicht aus neutralenf sauren oder alkalischen wässrigen Lösungen in di© üblichen organischen Lösungsmittel wie Chloroform1. Aethers Bensola Ethylacetatf Butj--Iaikohol, Dibutylather oder Isopropylketon aufgenommen werd@n0
^ie wässerigen Lösungen sind während mehreren Tagen bei
Rauir/caraperatur stabil und bei 100- mindestens während 10 Itlnuteno ο
Bei 100 verliert die Substanz in saurer Lösung einen Teil ihrer Aktivität j während sie in alkalischer Lösung mit steigendem pH
Beispiel
10 'Liter vom Medium der Zusammensetzung 0
Peptoa 10· g
Flei sehkan?.entrat 5 g
Oestro5 g
MaCl . 5 g
Silicone 10 g
Ant is Chaum=Mi 11 el desto 'fesser zum Auffüllen auf 1 Liter
werden in einen 22 Liter Rundkolben eingefüllt und während 30 Minuten bei Os? Atmosphären Dampfüberdruck sterilisierte
Das Medium wird dann mit 50 cm einer Sporensuspension "von Actinoiayees vinaceus beimpft, und während 120 Stunden bei einer Temperatur von 25 mit 500 es* steriler Luft per Litsr Medium in der Mintite gelüftet. -Die so !.erhaltene Kultur verhindert das Wachstum von Mycobacterium tuberculosis {A0ToTaCo No0 003) bei einer Verdünnung von 1;£9Q« Das Iulturfiltrat kann nach einer der beiden in Beispiel 1 und 2 beschriebenen Methoden aufgearbeitet werden,

Claims (1)

  1. Pi - ν viA cnsprü cb e ι
    1„ ferfahren zur Herstellung eines Antiblofcicuras, dadurch
    gekennzeichnet f ciasa man ein KuXturfiltrat von Actinomyces ^inaceus mit einem Adsorptionsmittel behandelt» das Adsorbat mit einem alkoholischen Lösungsmittel aluiert und das aktive Material mit einem fällenden Verdünnungsmittel ausfällt»
    2 ο Verfahren naeli; /Pateatansprueh I8 dadurch gekenn-
    SQichnat5 dass hjsüi ein Kulturfiltrat von Actinomyces vinaceus mit einem Adsorptionsmittel behandelt, das Adsorbat mit Alkohol wäscht, dann mit einem säurehaltigen Alkohol eluiert und das aktive Material mit einem füllenden „Verdünnungsmittel ausfällt»
    3» Verfahren nach Patentansprüchen. 1-und Z9 dadurch ·
    gekennzeichnet 9 dass sau eis Kulturfiltrat mn Actinomyces Fiaaceus ait e* i-m Adsorptionsmittel behandelt, das Adsorbat mit Alkohol wäscht f dann mit eine» säurehaltigen Alkohol .,eluiert. das aktive Materiell mit einem fällenden Verdünnungsmittel ausfällt s das erhaltene' Produkt einer chromatographischen Reinigung unterwirft und das gereinigte Material in kristalliner Fora aus dem Eiuat Isoliertc

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