DEP0014395MA - - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

Tag der Anmeldung: 1. Juli 1955 Bekanntgemacht am 19. Januar 1956

DEUTSCHES PATENTAMT

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zu der Herstellung von Vaccinen gegen Poliomyelitis.

Es ist bekannt, daß Poliomyelitis eine Viruskrankheit ist, die tödlich sein kann oder zu weitreichenden Verkrüpplungen führt. Wegen der Natur dieser Krankheit liegt der einzige brauchbare Zugang zu diesem Problem in einer Prophylaxis, d. h. in einer Entwicklung von Mitteln, die das Auftreten der Krankheit verhindern. Kürzlich wurde eine Vaccine aus abgetöteter Poliomyelitis entwickelt, die aus abgetöteten, aber antigenen Poliomyelitisvirusarten der Typen i, 2 und 3 zusammengesetzt ist, und diese wurden einer erschöpfenden klinischen Prüfung unterworfen. Diese Poliomyelitis-Vaccine stellt gleich vielen anderen Vaccinen eine wäßrige Zubereitung dar, die durch Injektion verabreicht wird. Deswegen ist es notwendig, daß die Vaccine steril ist, d. h. frei von schädlichen Bakterien ,und Schimmelpilzen, nicht nur während der Herstellungs- und Verpackungszeit, sondern auch zur Zeit der Verabreichung. Wenn- gleich es vielleicht, theoretisch wenigstens, möglich ist, die Vaccine unter aseptischen Bedingungen herzustellen und zu verpacken, können solche Vaccinen zur Zeit der Verabreichung durchaus verunreinigt sein, insbesondere wenn die Verpackung, wie allgemein im Handel bekannt ist, eine Mehrfach-Dosen-Packung darstellt. Darüber hinaus ist die Herstellung unter vollständig aseptischen Bedingungen

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vom Standpunkt der Kosten aus nicht angängig und gänzlich undurchführbar. Bei einem Versuch, sicher . - zustellen, daß die Vaccine des Poliomyelitis-Virus frei von verunreinigenden Bakterien, Schimmelpilzen und Pilzen ist und dieses sicher bleibt, wurde vorgeschlagen, eine Quecksilberbindung, insbesondere Thiomerosal (Natriumäthylquecksilberthiosalicylat), als Schutzmittel zuzugeben. Wenngleich dieser Versuch eine Lösung für das Problem der Verunreinigung

ίο ergeben¹ hat, hat er ein anderes und vielleicht noch ernsthafteres aufsteigen lassen. Das Thiomerosal verursacht nämlich, daß die Poliomyelitis-Vaccine ihre Wirksamkeit verlieren. Deswegen müssen Poliomyelitis-Vaccine-Produkte, die Thiomerosal als Schutzmittel enthalten, bald nach ihrer Herstellung verabreicht werden. Dies ist natürlich höchst unerwünscht, da die Vaccine schwierig und kostspielig herzustellen ist und unter solchen Umständen die Herstellung auf bekannte kurze Zeiträume des Bedarfs beschränkt werden muß. Im Hinblick hierauf und weil die Vaccine mehrere Monate für die Herstellung erfordert, ist es undurchführbar, hinreichend Vaccine herzustellen, um einem unerwarteten Notbedarf zu entsprechen. Es ist daher ein dringender Bedarf für

-25 eine Poliomyelitis-Vaccine vorhanden, die nicht nur sicher frei von verunreinigenden Bakterien und Schimmelpilzen zur Zeit der Verabreichung ist, sondern die auch ihre Wirkung, d. h. ihre antigene Wirkung über eine beträchtliche Zeitdauer unter normalen Bedingungen einer Lagerung behält.

CH₃

CH.

CH,- C — CHX

CH,

Es ist Ziel der Erfindung, eine Pohomyelitis-Vaccine zu schaffen, die sicher frei von verunreinigenden Bakterien, Pilzen und Schimmelpilzen ist und es über eine beträchtliche Zeitdauer unter normalen Bedingungen einer Lagerung und der Verwendung bleibt.

Es ist weiter ein Ziel der Erfindung, eine Poliomyelitis-Vaccine zu schaffen, die ihre antigene Wirkung über eine beträchtliche Zeitdauer unter normalen Lagerungsbedingungen beibehält.

Überraschenderweise werden diese Ziele sowie auch andere Ziele, die hernach ersichtlich werden, erreicht und die vorgenannten Schwierigkeiten bei Poliomyelitis-Vaccinen überwunden gemäß der Erfindung, indem man in eine abgetötete Poliomyelitis-Vaccine, d. h. in eine wäßrige Lösung, die einen nichtinfektiösen, sondern antigenen Poliomyelitis-Virus enthält, eine Substanz einverleibt, die zur Klasse der Verbindungen gehört, die als Eiweißfällung und Denaturungsmittel bekannt ist. Insbesondere umfaßt die vorliegende Erfindung das Einverleiben von Benzäthoniumchlorid in eine ,wäßrige abgetötete Poliomyelitis-Vaccine in einer Konzentration (Gramm auf Kubikzentimeter) im Bereich von etwa 1: 20 000 bis ι: 50 000. Das Benzäthoniumchlorid wird der Vaccine vorzugsweise durch langsame Zugabe einer verdünnten wäßrigen Lösung von Benzäthoniumchlorid einverleibt. Es ist bekannt als Benzyldimethyl-[2-(2-(p-i, i, 3,3-Tetramethylbutyl-phenoxy)-äthoxy)-äthyl]-ammoniumchlorid-Monohydrat und besitzt die Formel

CH₃.

O — C H₉ — O H₉ — O —C H₉ — C H₉ —

H₉O

Cl CH₉

Die bevorzugten Produkte sind solche, die Benzäthoniumchlorid in einer Konzentration im Bereich von ι: 20 000 bis 1 : 40 000 enthalten.

Die bei der Herstellung von Produkten nach der Erfindung verwendeten wäßrigen abgetöteten Poliomyelitis-Vaccine können irgendeinen oder alle verschiedenen Typen des Poliomyelitis-Virus enthalten. Die bevorzugten Vaccinen sind solche, die die Typen i, 2, 3 des Poliomyelitis-Virus enthalten. Besonders geeignete Vaccine sind solche, die einen relativ niedrigen Eiweißgehalt aufweisen, vorzugsweise solche, die weniger als 18 bis 20 γ Eiweißstickstoff je cm³ aufweisen. Solche Vaccinen können auf mehreren verschiedenen Wegen hergestellt werden, zum Beispiel kann ein zerkleinertes Gewebe aus Affennieren mit Trypsin behandelt werden, um fremde Gewebe zu entfernen. Die restlichen Zellen läßt man sich vervielfältigen, das Medium wird mit Poliomyelitis-Virus beimpft, das Gemisch dann entwickelt, die Flüssigkeit gesammelt und der lebende Virus durch Behandlung mit Formaldehyd, Ultraviolettbestrahlung oder andere geeignete Mittel inaktiviert. Gegebenenfalls können auch Vaccinen verwendet werden, die unter Fortlassung der Trypsinbehandlungsstufe hergestellt wurden, aber in diesem Fall kann der Eiweißgehalt der Vaccine übermäßig hoch sein und sollte daher vor der Verwendung bestimmt werden. Bei der Herstellung von gemischten Vaccinen, d. h. von Vaccinen, die mehr als eine Art von Poliomyelitis-Virus enthalten, ist es üblich, die gesammelten Flüssigkeiten, die die verschiedenen Arten enthalten, nach der Inaktivierungsstuf e zusammen zuzugeben oder zu vermischen, obgleich gegebenenfalls dies auch vorher geschehen kann. Bei Verwendung von mit Formaldehyd inaktivierten Vaccinen werden die besten Ergebnisse gemäß vorliegender Erfindung erzielt durch Verwendung von Vaccinen, denen kein Natriumbisulfit zugesetzt war, um den Formaldehydgehalt zu reduzieren.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert:

Beispiel 1

Für die Entwicklung von Poliomyelitis-Virus werden Zellen hergestellt nach dem Verfahren von Dulbecco, Journal of Experimental Medicine, Bd. 99, S. 167,

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(1952). In Kürze besteht dieses Verfahren darin, daß man zunächst eine Suspension der Epithel-Zellen von Nieren von Affen herstellt (s. Dulbecco, Proc. Nat. Acad. Sei., Bd. 38, S. 747, [1954]) durch Behandlung von mazeriertem Nierengewebe von gesunden Cynomalgus- oder Rhesus-Affen mit Trypsin zur Entfernung von Fremdstoffen und zum Herauslösen der einzelnen Zellen. Diese Zellen läßt man sich auf einer Glasfläche in einem beliebigen Gewebskulturmedium vervielfältigen. Die so erhaltene, Schicht von entwickelten Nierenzellen wird dann mit einer Impfkultur von Poliomyelitis-Virus, Type 1 (Mahoney), beimpft und das Gemisch bei 36 bis 37⁰ entwickelt, bis die Zerstörung der Zellen vollständig ist und große Mengen von neuem Virus freigesetzt wurden. Die Flüssigkeit, die den Virus enthält, wird dann gesammelt und durch eine ultrafeine gefrittete Glaskerze filtriert. Das Filtrat, das den lebenden Poliomyelitis-Virus, Type 1, enthält, wird auf den Virusgehalt, die. Bakterien-Sterilität und die Stammeinheit untersucht.

Ein Filtrat, das den lebenden Poliomyelitis-Virus, Type 2 (MEF-i-Stamm), enthält, wird nach dem oben für die Herstellung des Filtrats mit Poliomyelitis-Virus, Type i, beschriebenen Verfahren hergestellt.

Ein Filtrat mit einem lebenden Poliomyelitis-Virus, Type 3 (Saukett-Stamm), wird nach dem gleichen Verfahren hergestellt.

Die lebenden Virusarten, die in den einzelnen Filtraten enthalten sind, werden durch Zugabe von ,30 Formaldehyd und durch Entwicklung der erhaltenen getrennten Mischungen gemäß der Arbeitsweise, die im einzelnen in der Verbesserung mit zu den mindesten Erfordernissen für . Poliomyelitis-Vaccine beschrieben ist, veröffentlicht am 20. Mai 1954 durch das United States Department of Health, Education and Welfare, inaktiviert. Es wird kein Natriumbisulfat zugegeben, um das überschüssige Formaldehyd zu neutralisieren. Etwa gleiche Mengen der Typen 1, 2 und 3 der abgetöteten Poliomyelitis-Virus-Vaccine werden vereinigt, und die erhaltenen vereinigten Vaccine werden in aliquote Teile zerlegt, die bei der Herstellung von Produkten nach der Erfindung verwendet werden. Ein aliquoter Teil wird in unveränderter Form für die Verwendung als Kontrollprobe zurückbehalten.

O;75 cm³ einer i°/_oigen Lösung von Benzäthoniumchlorid werden langsam unter mäßigem, aber wirksamem Rühren zu 150 cm³ kalter wäßriger abgetöteter Poliomyelitis-Vaccine, die wie oben angegeben hergestellt war, zugegeben. Das anfallende Produkt wird in Ampullen in geeigneten Mengen bei der Verwendung bei der Immunisierung abgefüllt. Diese Poliomyelitis-Vaccine, die Benzäthonium in- einer Konzentration von 1: 20 000 enthält, behält seine Wirksamkeit unter den normalen Bedingungen einer Lagerung (Eisschranktemperatur) über mindestens 8 Monate. Sie bleibt auch frei von verunreinigenden Bakterien und Schimmelpilzen unter normalen Bedingungen der Verwendung und Lagerung.

Die Bestimmungen der Wirksamkeit der Kontrollprobe des Vaccine-Produkts nach der Erfindung sind in Tabelle 1 unten angegeben. Diese Wirksamkeiten werden bestimmt durch das Verfahren der Serum-Neutralisation, beschrieben von SaIk, Younger und Ward, American Journal of Hygiene, Bd. 60, S. 214, (1954). Die Ergebnisse sind angegeben in Werten eines geometrischen mittleren Titers. Kurz gesagt besteht das Untersuchungsverfahren darin, daß man Affen mit dreimal i-cm³-Dosen der Vaccine in wöchentlichen Intervallen impft, die Tiere am Ende der Behandlungsperiode zur Ader läßt, aus dem gesammelten Blut ein Serum gewinnt und die Zahl der im Serum vorhandenen Antikörper bestimmt. Diese Bestimmung wird durch serienmäßige Verdünnung des Serums mit Salzlösung und Vermischung der verdünnten aliquoten Teile mit einer Standardlösung vorgenommen, die eine bekannte Anzahl von Infektionseinheiten einer gegebenen Art von Poliomyelitis-Virus enthält, z. B. wenn man die Analyse auf Wirksamkeit des Typs ι durchführt, verwendet man eine Standardlösung, die eine bekannte Anzahl von Infektionseinheiten des Typs 1 des Poliomyelitis-Virus enthält. Für die Analyse auf Wirksamkeit des Typs 2 und des Typs 3 verwendet man Standardlösungen des infektiösen Virus Typ 2 und Typ 3. Der Endpunkt der Titration ist die Verdünnung, bei der das Serum hinreichend Antikörper enthält, um eine genaue Neutralisation zu ergeben, d. h. sich mit der bekannten Anzahl von infektiösen Einheiten des Virus in der Standardlösung zu verbinden oder diese nicht infektiös zu machen. Eine Anzahl von Affen wird bei der Analyse der Wirksamkeit für jede Typenart von Poliomyelitis-Virus verwendet. Die so erhaltenen Ergebnisse werden für einen guten Vergleich und statistische Auswertung in eine geeignete Form gebracht, indem man den Logarithmus der Basis 2 der Endpunkt-Verdünnung für das Serum für jeden Fall nimmt, diese Zahlenmittel und dann den Gegenwert des so erhaltenen Mittels verwendet. Dieser Gegenwert wird der geometrische Mitteltiter der Vaccine genannt und ist natürlich für jede Virusart, die in der Vaccine vorhanden ist, verschieden. Da der geometrische Mittelwert abhängig ist von der Wirksamkeit der Standardlösung des beim Versuch verwendeten infektiösen Poliomyelitis-Virus, ist es notwendig, die Zahl der infektiösen Einheiten des in der Standardlösung vorhandenen Poliomyelitis-Virus zu spezifizieren, um die richtige Kennzeichnung des geometrischen mittleren Titers wiederzugeben. Das Verfahren der Berechnung des geometrisch mittleren Titers ist im einzelnen dargelegt in der obenerwähnten Abänderung Nr. 2 der Mindesterfordernisse für Poliomyelitis-Vaccine.

Um die Stabilität der antigenen Eigenschaften des Vaccine-Produktes nach der Erfindung bei der Lagerung zu bestimmen, wird die Vaccine eine Woche auf 37° erwärmt und dann 8 Wochen bei 4° gelagert. Die Wirksamkeit jeder Virusart wird dann, wie oben beschrieben, bestimmt. Da ein Erwärmen auf 37⁰ während einer Woche den gleichen Effekt auf die Wirksamkeit einer Vaccine hervorruft wie ein Lagern während 6 Monaten bei 4⁰, entspricht die Aufbewahrung der Vaccine während des Versuchs einer Lagerung von 8 Monaten bei 4⁰. Das Kontrollmuster wurde 9 Wochen bei 4⁰ gelagert, und dann wurde die Wirksamkeit jedes Stammes des Virus bestimmt, wie oben beschrieben wurde.

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labeile ι

Untersuchungsmuster	Virusart	Zahl der. verwendeten Affen	Nummer der neutralisierten Einheiten von infektiösem ■ ■ Virus*)	Geometrischer mittlerer Titer
Kontrolle	I 2 3	8 8 8	IO1·6 .IO2'8	256 650 41
Vaccine-Produkt, enthaltend Benzäthoniumchlorid (c = ι: 20 ooo)	I 2 3	(M CM (M HHH	IO1·8 I0I1-S IO2·8	204 540 47

*) Wirksamkeit der Standardlösung, die bei den Versuchen verwendet wurde.

Wie aus deri obigen Ergebnissen ersichtlich ist, behält die Vaccine nach der Erfindung ihre Wirksamkeit im Hinblick auf alle drei Virusarten über eine Lagerzeit, die einer Lagerzeit bei 4⁰ während 8 Monaten äquivalent ist. Im Gegensatz hierzu hatten Vaccine-Proben, denen Thiomerosal als Schutzstöfr zugegeben war, ihre Wirksamkeit im Hinblick auf alle drei Virusarten unter den gleichen Bedingungen der Lagerung vollständig verloren. Dies wird durch die folgenden Versuche gezeigt:

Eine mit Formaldehyd inaktivierte Vaccine mit Poliomyelitis-Virus der Typen 1, 2 und 3 wird, wie oben beschrieben, hergestellt und in aliquote Teile

TabeUe 2

Untersuchungsmuster	Virusart	Zahl der verwendeten Affen	Nummer der neutralisierten Einheiten von infektiösem Virus*) .	Geometrischer mittlerer Titer
Kontrolle	I 2 3	II II II	I0I1S IO1·6 IO0'8	284 809 773
Vaccine-Produkt, enthaltend Thiomerosal (c = ι: 100 000)	I 2 3	HHH K) K) K)	lOi,e I0I1S IO0'8	<4 . 26 9

unterteilt. Ein aliquoter Teil wird als Kontrolle zurückgehalten, und zu einem anderen wurden hinreichend Thiomerosal zugegeben, um die Thiomerosalkonzentration auf 1: 100 000 zu bringen. Die Kontrollprobe und das Muster mit Thiomerosal wurden ι Woche auf 37⁰ erwärmt und 1 Woche bei 4⁰ gelagert, und dann wurde die Wirksamkeit jeder Virusart nach dem oben beschriebenen Verfahren bestimmt. Das Erwärmen und Lagern dieser Muster entsprach einer Lagerung von 6 Monaten bei 4°. Die Ergebnisse der Bestimmung der Wirksamkeit sind in der Tabelle 2 wiedergegeben.

*) Wirksamkeit der Standardlösung, die bei den Versuchen verwendet wurde.

Beispiele

Eine mit Formaldehyd inaktivierte Vaccine mit Poliomyelitis-Virus, Type 1, 2 und 3, wurde hergestellt wie im Beispiel 1 und in aliquote Teile unterteilt. Ein aliquoter Teil wurde in unveränderter Form für die Verwendung als Kontrollmuster zurückbehalten.

Ein anderer aliquoter Teil der Vaccine wurde in eine Vaccine nach der Erfindung bei tropfenweiser Zugabe von 5 cm³ einer Lösung von Benzäthoniumchlorid ι: 200 im Verlauf von etwa 2 Minuten unter wirksamem Rühren in der Kälte zu je 11 Vaccine hergestellt. Die anfallende Lösung mit Benzäthoniumchlorid in einer Konzentration von 1: 40 000 stellt die Vaccine nach der Erfindung dar.

Um die Stabilität der antigenen Eigenschaften der Vaccine nach der Erfindung bei der Lagerung zu bestimmen, wurde die Vaccine 4 Wochen bei 4° gelagert. Die Wirksamkeit jeder Virusart wurde dann, wie oben beschrieben, bestimmt. Die Kontrollprobe wurde gleichfalls 4 Wochen bei 4° gelagert, und dann wurde die Wirksamkeit jeder Virusart wie oben bestimmt. Die Ergebnisse dieser Wirksamkeitsversuche sind in Tabelle 3 wiedergegeben.

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Tabelle 3

Untersuchungsmuster	Virusart	Zahl der verwendeten Affen	Nummer der neutralisierten Einheiten von infektiösem Virus*)	Geometrischer mittlerer Titer
Kontrolle	OJ K) H	12 12 12	IO1'36 IO1,86	178 316 107
Vaccine-Produkt, enthaltend Benzäthoniumchlorid (c = ι: 40 000)	I 2 3	IO IO IO	IO1'36 IO1·86	152 490 60

*) Wirksamkeit der Standardlösüng, die bei den Versuchen verwendet wurde.

Für Vergleichszwecke sind die Ergebnisse von

■Wirksamkeitsbestimmungen eines anderen Kontrollmusters und einer anderen Vaccine nach der Erfindung, die nach dem oben beschriebenen Verfahren, jedoch mit einer anderen mit Formaldehyd inaktivierten Vaccine, die die Typen 1, 2 und 3 des Poliomyelitis-Virus enthielt, hergestellt wurden, in der Tabelle 4 wiedergegeben.

	Tabelle 4	Virusart	Zahl der verwendeten Affen'	Nummer der	Geometrischer mittlerer Titer
				neutralisierten Einheiten von infektiösem
Untersuchungsmuster	I	\ II.	Virus*)	68
	2	II	IO1,36	141
Kontrolle	3	II	IO3'5	76
	, ι .	12	IO1,86	71
	2	12	IO1·36	71
Vaccine-Produkt, enthaltend	3	12	IO1·5	76
Benzäthoniumchlorid			IO1'86
(c = ι: 40 000)

*) Wirksamkeit der Standardlösung, die bei den Versuchen verwendet wurde.

Wie aus den Ergebnissen der Tabellen 3 und 4 ersichtlich ist, behielten Vaccinen nach der Erfindung, die Benzäthoniumchlorid in einer Konzentration ι: 40 000 enthielten, ihre Wirksamkeit im Hinblick auf alle drei Virusarten bei einer Lagerung während 4 Wochen bei 4⁰ bei. Die Kontrollproben behielten ihre Wirksamkeit unter den gleichen Bedingungen der Lagerung, aber waren empfindlich gegen eine Vergiftung durch Pilze und Schimmelpilze. Es ist auch ersichtlich, daß kein merklicher Unterschied zwischen der Wirksamkeit der Vaccinen, die Benzäthoniumchlorid enthielten, und der Wirksamkeit der Kontrollproben vorhanden war.

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung einer Poliomyelitis-Vaccine, dadurch gekennzeichnet, daß einer wäßrigen Lösung von Poliomyelitis-Virus, die wenigstens eine abgetötete oder antigene Virusart enthält, Benzäthoniumchlorid im Verhältnis von 1 g auf 20 000 bis 5° ⁰⁰° ecm, vorzugsweise 1 g auf 40 000 ecm, Viruslösung zugesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Viruslösung die abgetöteten oder antigenen Poliomyelitis-Virusarten 1, 2 und 3 enthält und das Benzäthoniumchlorid in wäßriger Lösung verwendet wird.

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