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Verfahren zur Abschwächung von Tollwutvirus sowie nur Herstellung
von Tollwutvaccine
Die Erfindung betrifft die Abschwächung von virulentem Tollwutvirus
bis zu einer nicht pathogenen Form ohne wesentlichen Verlust seiner antigenen Wirkung
und die Herstellung von Tollwutvaccine aus dieser nicht pathogenen Form.
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Seit vielen Jahren wird versucht, einen ungefährlichen und wirksamen
Impfstoff zur Verhütung von Tollwut zu entwickeln, und in den letzten Jahren sind
auch manche Erfolge mit phenolisierten oder carbolisierten Tollwutvaccinen verzeichnet
worden. Dabei wurde jedoch festgestellt, daß diese Vaccrn.en verschiedene Nachteile
aufweisen. In erster Linie ist, wie bei allen Vaccinen mit getötet Viren, der mit
phenolisierter Vaccil,e erzielte Schutz nicht von großer Dawer, und gewöhnlich ist
jährliche Bmpfuag zu empfehlen. Ein zweiter Nachteil solcher Vaccinen liegt darin,
daß sie gewöhnlich aus Hirngewebe von Kaninchen hergestellt werden und daß die Verwendung
solcher Gewebe in einer Vaccine in Anbetracht der nach ihrer Verwendung in zunehmendem
Maße beobachteten neuroparalytischen Anzeichen nicht als ungefährlich angesehen
werden kann. Ein dritter Nachteil dieser Vaccine besteht in deren hohen Kosten,
die auf das zu ihrer Herstellung notwendige Verfahren zurückzuführen sind.
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Wie auf Grund der Nachteile und Beschränkungen von Vaccinen mit getötetem
Virus zu erwarten
war, wurden zahlreiche Versuche gemacht, eine
ungefährliche Vaccine mit abgeschwächtem Virus zu entwickeln. Bei diesen Versuchen
sind aber Fehlschläge aufgetreten, oder- sie sind in den meisten Fällen nur beschränkt
erfolgreich gewesen, was darauf zurückzuführen ist, daß der Virus in seinen charakteristischen
Eigenschaften im allgemeinen bereits nach verhältnismäßig wenigen Durchgängen durch
einen bestimmten Wirtsorganismus fixiert ist.
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Mit anderen Worten, wenn der Tollwutvirus durch eine Serie eines bestimmten
Wirtsorganismus durchgeleitet wird, so erfährt er im allgemeinen blei den ersten
wenigen Durchgängen bis zu einem gewissen Grad eine Abschwächung und erreicht dann
einen Punkt, von dem ab weitere Seriendurchgänge die charakteristischen Eigenschaften
des Virus nicht mehr in größerem Maße ändern. Beispielsweise sind von P a 5 t e
u r erhaltene Virusstämme, die an die Züchtung in Kaninchen adaptiert sind, durch
Kaninchen in über 2000 Seriendurchgängen durchgeleitet worden, ohne daß die charakteristischen
Eigenschaften des ursprünglichen Pasteurstammes wesentlich geändert worden wären.
Trotz der allgemeinen - Tendenz des Tollwutvirus, bereits nach einigen Durchgängen
endgültig fixiert zu sein, hat sich gezeigt, daß ein nach dem erfindungsgemäßen
neuen Verfahren abgeschwächter, lebender Tollwutvirus erhalten und eine ungefährliche
Vaccine hergestellt werden kann.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zur Abschwächung eines virulenten
Virus bis zu einer nicht pathogenen Form ohne wesentlichen Verlust seiner antigenen
Wirkung besteht darin, daß man einen virulenten Virus in ein Brutei einbringt, den
Virus dort eine gewisse Zeit wachsen läßt, die Virusteilchen von dem Brutei entfernt
und sie in ein anderes Brutei einbringt und den Serienlnäßigen Durchgang von Brutei
zu Brutei fortsetzt, bis wenigstens 150 Passagen durch Bruteier stattgefunden haben
und der Virus seine pathogenen Eigenschaften verloren hat. Zur Herstellung von Vaccine
werden Viruspartikeln aus den Bruteiern entnommen und daraus eine Vaccine hergestellt,
die nicht pathogen ist, aber bei lnjektion in tollwutempfindliche Säugetiere schützende
Antikörper zu erregen vermag.
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Durch die erfindungsgemäßen neuen, aus einem vollständig abgeschwächten
Virus hergestellten Vaccinen werden viele Nachteile und Beschränkungen der bekannten
Vaccine mit getötetem Virus überwunden.
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Die neuen, lerfindungsgeniäßen Vaccinen sind ver hältnismäßig billig,
ergeben eine verhältnismäßig lang andauernde Immunität und sind im wesentlichen.
frei von Gewebe des Zentralnervfflsystems, so daß keine Schwierigkeiten in Form
neuroparalytischer Realçtianen beobachtet wurden. Die erfindungsgemäßen Vaccinen
haben den weiteren Vorteil, daß das Verfahren zu ihrer Herstellung weitgehend vereinfacht
ist, was in erster Linie darauf zurückzuführen ist, daß der bei ihrer Ilerstellung
verwendete Virus im Gegensatz zu den bekannten Verfahren, bei denen Kaninchen verwendet
wurden, in Eiembrvos gezüchtet wird. Wenn ein Tier, wie beispielsweise ein Kaninchen,
für die Züchtung des Virus für die Vaccine verwendet wird, muß es zunächst von einem
Veterinär untersucht, eine bestimmte Zeit in Quarantäne gehalten, dann in vielen
Fällen auf Tuberkulose und andere Krankheiten getestet und dann mit Antibiotika
und anderen chemotherapeutischen Materialien behandelt werden, um sicherzugehen,
daß es frei ist von bakteriellen Insektionen. Außerdem muß die zu impfende Stelle
rasiert, gewaschen und sterilisiert werden. Im Gegensatz zu diesem umständlichen
Verfahren bestehen die für die Impfung eines Eiembryos erforderlichen Schritte darin,
zunächst sicherzustellen, daß die Eier frei von S. pullorum sind, und dann das Ei
zu durchleuchten und an einer bestimmten Stelle ein kleines Loch für die Injektion
des Impfvirus zu bohren. Ein weiterer Vorteil der aus Eiembryo hergestellten Vaccine
besteht darin, daß bei ihrer Verwendung weniger unerwünschte allergische Erscheinungen
auftreten als beim Gebrauch irgendeines anderen Materials.
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Dler wesentlichste Vorteil der neuen, erfindungsgemäßen Vaccine besteht
jedoch darin, daß der Grad der Abschwächung des Virus so groß ist, daß dieser mit
nahezu vollkommener Gefahrlosigkeit verwendet werden kann. Bisher wurden Vaccinen
mit teilweise ,geschwächtem lebendem Virus zur Verhütung neurotroper Erkrankungen
insbesondere bei Haustieren verwendet, obwohl der Grad der Abschwächung so gering
war, daß Paralyse oder sogar Tod hätte eintreten können, wenn die Impfstoffe intracerebral
injiziert worden wären. Dies ist nur deshalb möglich, weil der Tierkörper bei intramuskulärer
oder subkutaner Injektion genügend Antikörper produziert, bevor der lebende Virus
Gelegenheit hat, sich in dem Nervensystem festzw setzen. Solange jedoch irgendeine
Möglichkeit besteht, daß der Virus in das Nervensystem gelangen kann, bevor der
Antikörpertiter ein ausreichend hohes Niveau erreicht hat, und unter Umständen Paralyse
oder Tod verursachen kann, kann die Vaccine nicht als vollkommen ungefährlich angesehen
werden. Die erfindungsgemäßen neuen Vaccinen sind so vollständig abgeschwächt, daß
sogar bei direkter Injektion in das Hirngewebe verschiedener Arten von Tieren, die
als für Rabies sehr empfänglich bekannt sind, keine ernsthaften Kranlleitserscheinu,ng,en
bleobachtet wurden. Es ist offensichtlich, daß dies sowohl ein tatsächlicher als
auch ein psychologischer Vorteil ist uild bestimmend sein wird für die zukünftige
Verwendung der Vaccine in jedem Fall, in dem eine Immunisierung gegen Tollwut erwünscht
erscheint.
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Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein abgeschwächter
lebender Tollwutvirus dadurch erhalten, daß man Bruteier nach fünf- bis neuntägiger
Bebrütung an irgendeiner Stelle, vorzugsweise im Dottersack oder Allantoicsack,
mit dem Virus impft, 5 bis 12 Tage nach der Impfung den Virus von dem Kükenembryo
erntet, den so erhaltenen Virus zur Impfung eines zweiten, 5 bis 9 Tage alten Hühnerembryos
verwendet und den serienweisen Durchgang des Virus so lange
fortsetzt,
bis wenigstens 150 Durchgänge durch Hühnerembryos erfolgt sind. Es wurde gefunden,
daß nach etwa 150 bis 200 Durchgängen durch Hühnerembryos der Virus eine merkliche
und plötzliche Änderung seiner pathogenen Eigenschaften erfährt, so daß er avirulent
wird, und zwar sogar für 14 Tage alte Mäu-se bei intracerebraler Injektion.
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Es ist bekannt, daß Mäuse zu den Tieren gehören, die am empfänglichsten
sind für Tollwut, und es wird angenommen, daß damit zum erstenmal ein abgeschwächter
Virus gezüchtet wurde, der intracerebral in hohen Konzentrationen injiziert werden
kann, ohne Tod zu verursachen. Noch übierraschenider ist jedoch, daß das Virusmaterial
die gleiche Antigenität behält, die ein Virus aufweist, der nur wenigen Eipassagen
unterworfen wurde. Das bedeutet mit anderen Worten, daß die abgeschwächten Virusmaterialien
der vorliegenden Erfindung eine ausgezeichnete immunologische Wirkung haben, obwohl
sie ihre Fähigkeit, bei intracerebraler Injektion typische Tollwut hervorzurufen,
verloren haken.
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Für die Durchführung des erfindungsgemäen Verfahrens kann nahezu
jeder verfügbare Virus stamm verwendet werden. Im Gegensatz zu anderen Viren traten
nur sehr geringe Schwierigkeiten auf, wenn man die verschiedensten Viren zur Züchtung
in Hülmerembryos einbrachte. Es konnte auf diesom Wirt pralttisch jeder Stamm Virus
gezüchtet werden, wenn man alternierend Passagen durch Hühnerembryos mit Passagen
durch Mäwse oder einen anderen Wirt und dann wieder durch Hühner embryos erfolgen
ließ. Bei den meisten Virus stammen sind aber solche alternierenden Durchgänge nicht
erforderlich, und der Virus adaptiert sich leicht selbst nach einigen wenigen Passagen
an das Eiembryo. Daher ist es möglich, für die Herstellung der neuen Vaccine Straßenvirus
zu verwenden. Jedoch ist es oft vorteilhaft, einen Virusstamm zu verwenden, der
durch Durchgänge durch ammalische Wirtsorganismen »fixiert« wurde.
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Vrenn Straßenvirus serienweise durch Tiere, wie Kaninchen oder Meerschweinchen,
geleitet wird, unterliegt er zuerst sehr schnellen Änderungen, derart, daß die Inkubationszeit
vzesentlich herabgesetzt und der Infektionstiter erhöht wird, sowie weiteren Änderungen.
Nach einer Anzahl von Passagen, gewöhnlich etwa zwanzig bis achtzig, ist der Stamm
in seinen Eigenschaften verhältnismäßig fixiert, so daß er sich bei weiteren Durchgängen
nicht mehr wesentlich ändert. Es gibt heute viele Stämme von fixierten Viren, und
sie sind im wesentlichen alle für die erfindungsgemäße Herstellung der neuen Vaccine
verwendbar. Trotzdem ist es gewöhnlich vorteilhaft, einen Stamm zu wählen, dessen
geringe pathogene und hohe immunologische Wirkung bekannt sind.
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Der »Flury«-Stamm von fixiertem Virus ist für die Verwendung bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren ausgezeichnet geeignet. Dieser Virusstamm wurde
ursprünglich durch Serienpassagen durch Hirngewebe von Küken isoliert und fixiert.
Er ist bei der Rockefeller Foundation, New York City, erhältlich. Er hat Eigenschaften,
die ihn für die Verwendung bei dem neuen Verfahren besonders geeignet machen. So
besitzt dieser Stamm beispielsweise, wie durch intracerebrale Impfung beim 50. Eidurchgang
festgestellt wurde, eine geringe Pathogenität gegenüber Kaninchen, und, obwohl der
Virus bei intracerebraler Injektion bei Hunden lebensgefährliche Tollwut verursacht,
bleiben die Speicheldrüsen der befallenen Tiere virusfrei. Trotz dieser verhältnismäßig
milden Eigenschaften besitzt der Flurystamm im Vergleich mit anderen Stämmen von
fixiertem Virus eine hohe immunologische Wir kung.
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Der Flurystamm von Tollwutvirus kann serienweise durch Hühnerembryos
passiert werden, ohne daß alternierende Passagen erforderlich sind. Es wurde jedoch
festgestellt, daß während der ersten Eidurchgänge ein merklicher Abfall im LD- 5o-Titer
für Küken und Mäuse erfolgt. Nach etwa dem 10. bis 15. Durchgang zeigt sich, daß
der LD-so-Titer des Virus sowohl für Hühner als auch für Mäuse ziemlich hoch ist
und während der folgenden Passagen verhältnismäßig konstant bleibt, bis bei etwa
dem 150. bis 200. Eidurchgang eine merkliche Änderung festzustellen ist. An diesem
Punkt sinkt die Pathogenität sowohl Mäusen als auch anderen Tieren gegenüber merklich
ab, so daß 14 Tage alte oder ältere Mäuse selbst bei intracerebraler Injeltion mit
dem abgeschwächten Virus material nicht lebensgefährlich von Tollwut befallen werden.
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Obwohl der Virus vorzugsweise durch ununterbrochenen serienweisen
Durchgang durch in Entwicklung begriffenes Hühnerembryogewebe abge schwächt wird,
kann es erwünscht sein, die Reihe der Passagen für Testzwecke oder zur Vosrratsbildung
zu unterbrechen, indem man den Virus in an deren Wirtsorganismen, wie in Eintagsküken
oder jungen Mäusen, züchtet. Die Reihe der Durchgänge kann dann im Brutei fortgesetz,
werden.
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Hühnereier werden darum bevorzugt, weil sie billig und immer erhältlich
sind, jedoch ist die Verwendung von Eiern anderer Vögel nicht ausgeschlossen.
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Das bevorzugte Verfahren zur Entwirklung des abgeschwächten Virus
und zur Herst-l-ung einer Vaccine daraus kann kurz wie folgt zusammengefaßt werden:
5 bis 9 Tage bebrüt-ete Eier von pullorumfreien Hühnern werden aus,,esuell., ihre
Schale beim Luftsack mit einem Bohrer öffnet und das Ei mit 0,5 ml Virus nach dem
150. Durchgang durch Eier infiziert. Die Verdiinnung des verwendeten Virus wurde
vorher durch Titration in Eiern und saugenden Mäusen bestimmt und so errechnet,
daß optimales Wachstum erzielt wurde.
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Die Eier werden mit Kollodiumäther verschlossen und 7 bis I2 Tage
bei 34 bis 360 bebrütet. Dann werden die Eier durchleuchtet, und diejenigen verworten,
die tote Embryos enthalten.
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Die lebenden Embryos werden unter aseptischen Bedinguagen gewonnen,
in einer Mühle als-Io°%iges Gewebe zerrieben und auf eine Gewebekonzentration von
70% verdünnt. Diese Suspension wird dann durch Gaze filtriert, so daß das Filtrat
leicht durch eine 2o-gauge-Kanüle treten kann.
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Zu diesem Filtrat kann Streptomycin bis zu einer Konzentration von
Eoooy pro ml und Penicillin bis zu einer Konzentration von 500 Einheiten pro ml
zugesetzt werden. - Wenn solche Antibiotika zugesetzt werden, wird die Suspension
2 Stunden bei 40 gehalten und dann abgefüllt, gefroren und getrocknet Wenn keine
Antibiotika zugesetzt werden, kann die Suspension sofort abgefüllt werden. Nach
dem Trocknen wird das Produkt auf Feuchtigkeit, Gefährlichkeit für Tiere und Wirksamkeit
getestet.
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Um das erfindungsgemäße Verfahren näher zu erläutern wurde eine Kükenhirususpension,
die die I36. Kükenpassage des Flurystammes von Tollwutvirus aus der Rockefeller
Fouadation darstellte, rehydratisiert, und Eintagsküken wurden intracerebral injiziert.
Die Küken wurden am sechsten Tag nach der Impfung getötet. Dann erfolgte ein weiterer
Durchgang durch Eintagsküken. Diese wurden wiederum am sechsten Tag getötet, und
0,5 ml einer IoO/oigen Suspension ihres Hirngewebes wurde in den Dottersack von
7 Tage bebrüteten Eiern geimpft. 6 Tage nach der Impfung wurden die Embryos getötet,
und aus den homogerisierten Embryos wurden Suspensionen hergestellt. Die Dottersäcke
von 7 Tage alten befruchteten Eiern wurden dann mit einer 20 %eigen Embryosuspension
in destilliertem Wasser geimpft und die Embryos wiederum 6 Tage nach der Impfung
getötet und aus dem Embryomaterial homogenisierte Suspension hergestellt. Dieses
Herfahren wurde mit insgesamt 12 Serienpassagen bei 7 Tage a-ltgELMiiihrierembryos,
die jeweils am sechsten Tag verarbeitet wurden, wiederholt, bis insgesamt 14 Serienpassagen
durch Eiembryos erfolgt waren. Bei der I 5. und den folgenden Passagen erfolgte
die Verarbeitung am achten bis zehnten Tag nach der Impfung, da sich gezeigt hatte,
daß dadurch bessere Ergebnisse erzielt wurden. Nach etwa 20 Passagen erwies sich
der Virus als relativ fixiert, so daß er sich bei vielen nachfolgenden Passagen
niicht merklich änderte.
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Während dieser Periode behielt der Virus seine ganze Infektionswirkung
bei direkter Injektion in das Zentralnervensystem von Meerschweinchen, Hamstern
und Mäusen bei, und bis zur 1 So. Passage einschließlich erwies er sich als lebensgefährlich
für sechs von sechs getesteten Mäusen bei intracerebraler Injektion. Bei der 181.
Passage wurde eine merkliche und plötzliche Änderung der pathogenen Eigenschaften
des Tollwutstammes festgestellt, und wenn Virusmaterial von der 182. Passage I4
Tage alten Mäusen intracerebral injiziert wurde, zeigte keines der Tiere Anzeichen
von Erkrankung, und sie wurden unterschiedslos immun gegen eine spätere Injektion
mit Strafenvirus. Der Virus behielt diese milden Eigenschaften während~ der folgenden
Passagen bei und erwies sich als vollständig abgeschwächt.
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Um die Reproduzierbarkeit der erhaltenen Ergebnisse zu prüfen, wurden
die obigen Vers.uche wiederholt, indem man von Material des 170. Durchganges - ausging.
Auch dieses Material sowie das Material des 171. und 172. Durchganges erwies sich
bei intracerebraler Injektion bei Mäusen als vollständig virulent. Material des
174. Durchganges erwies sich auch bei intracerebraler Injektion bei 14 Tage alten
Mäusen als vollständig avirulent, ebenso wie das Material des vorhergehenden Versuches,
und die geimpften Mäuse. entwickelten keinerlei Tollwutsymptome.
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Die obigen Versuche wurden noch einmal unter Verwendung von Material
des 170. Durchganges als Ausgangsmaterial wiederholt. In diesem Fall wurde beim
I72. Durchgang eine merkliche Änderung festgestellt, und das Material des 173. und
der folgenden Durchgänge erwies sich als vollständig abgeschwächt und avirulent,
wenn es intracerebral in das Hirn von 14 Tage alten Küken injiziert wurde.
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Weitere Versuche ergaben, daß die Änderung zu jedem Zeitpunkt zwischen
etwa dem 150. bis etwa dem 200. Durchgang erfolgen kann.
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Die antigene Wirkung des Virusmaterials wurde bei zahlreichen Tierarten,
einschließlich Mäusen, Meerschweinchen, Hunden, Kühen und Schimpansen, geprüft.
In jedem Fall ergab die Väccine eine ausgezeichnete Immunität gegen spätere Infektion
durch Straßenvirus, oder es" zeigte sich, daß sie die Bildung von- Antikörpern stark
anregte.
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Schimpansen wurden nicht mit Straßenvirus infiziert, da sie sehr
kostspielige Tiere sind. Jedoch konnte die Anwesenheit von Antikörpern einwandfrei
nachgewiesen werden.
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Es wurden zahlreiche Teste durchgeführt, um die antigene Wirkung
des erfindungsgemäßen Virus materials zu bestimmen, und in jedem Fall wurden ausgezeichnete
Ergebnisse .erhalten. Bei diesen Versuchen erhielt jeder der verwendeten mischrassigen
Hunde 5 ml einer 20 obigen Suspension des Materials intramuskulär in das Hinterbein.
Bei einer Testreihe mit insgesamt 44 Hunden wurden 25 Tiere mit Material, das, wie
oben beschrieben, aus Material der 187. Eipassage erhalten war, geimpft, und 19
Tiere wurden als Kontrolltiere verwendet.
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30 Tage nach der Impfung wurden alle Tilere durch Intramasseterimpfung
mit New-Vork- City-Straßenvirus infiziert. Keiner der mit der erfindungsgemäß hergestellten
Vaccine geimpften Hunde bekam Tollwut, während 15 von den 19 Hunden,- die nicht
mit der erfindungsgemäßen Vaccine geimpft waren, Tollwut bekamen und starben. Es
wurden noch viele weitere Versuche an Hunden durchgeführt, und es wurden in jedem
Fall ausgezeichnete Ergebnisse, die den oben angegebenen vergleichbar waren, erhalten.
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Bei Vergleichsversuchen mit Meerschweinchenn die 0,25 ccm Vaccine
einer bestimmten Verdünnung intramuskulär in das Hinterbein injiziert bekamen und
21 Tage danach mit Straßenvirus infiziert wurden, ergab die Vaccine ebenfalls ausgezeichnete
Ergebnisse. Selbst wenn das Hühnerembryomateriat in Verdünnungen von 1 : 20, I :80
und 1 : 320 verwendet wurde, wurde aiisgezeichnete Immurnität erzielt, und alle
geimpften Tiere blieben gesund, wenn sie in der üblichen Weise mit Straßenvirus
infi'-ziert wurden. Für die obigen Teste wurden sowohl -die I78. als auch die 179.
Passage -durch -Hühner-
embryo verwendet, und beide Materialien
ergaben gleich gute Ergebnisse. Dagegen wurden zehn von zehn Kontrolltieren durch
Infektion mit Straßenvirus getötet. Bei weiteren Testen mit Meerschweinchen ergaben
Vaccine, die aus der 184. und I87.
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Hühnerembryopassage hergestellt waren, in jedem Fall bei allen sechs
getesteten Meerschweinchen ausgezeichnete Immunität, und acht von neun nicht geimpften
Kontrolltieren wurden bei Infektion durch Tollwut getötet. Bei weiteren Testen bei
Meerschweinchen mit Vaccine, die aus der 190., I96. und 200. Viruspassage hergestellt
war, zeigte es sich, daß jedes einzelne von sechs Tieren durch die erfindungsgemäße
Vaccine vollständig geschützt war, während sechs von sechs Kontrolltieren starben,
wenn sie 21 Tage danach mit Straßenvirus infiziert wurden.
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Auch Vergleichsteste mit Kühen und Schimpansen ergaben, daß die neue
Vaccine auch bei diesen Tieren ausgezeichnete immunologische Wirkung hatte. Kühe,
die 5 bis 15 ml der erfindungsgemäßen Vaccine erhalten hatten, zeigten ausgezeichnete
Immunität durch Anwesenheit von das Serum neutralisierenden Antikörpern und durch
ihre Fähigkeit, eine Infektion mit Straßenvirus verschiedener Verdünnungen zu überleben.
Auch Schimpansen zeigten ausgezeichnete Immunität auf Grund der Anwesenheit von
Serum neutralisierenden Antikörpern I4 Tage und auch längere Zeiten nach der Impfung
mit einer der neuen Vaccine, die aus Embryomaterial der 194. Eipassage von Flurystamm
hergestellt waren.
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Aus .der Arbeit von Kligler und Bernkopf, Proc. Soc. Exp. Biol. &
Med., Vol. 45, Nr. I, S. 332 bis 335 (I940), war es bereits bekannt, einen in seinen
Eigenschaften fixierten Tollwutvirus in Hühnerembryos zu züchten. Der Stamm wurde
durch 47 Generationen passiert. Die Impfung erfolgte durch Injektion in die Chorioallantoinmembran.
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Der auf diese Weise gezüchtete Virus hatte seine Virulenz für intracerebral
injizierte ausgewachsene Mäuse beibehalten, wies jedoch nach 40 aufeinanderfolgenden
Durchgängen für intraoerebral injizierte Kaninchen verminderte Virulenz auf. Hunde
konnten mit solchen Stämmen nicht gegen Tollwut immun gemacht werden. Da die Autoren
nach dem von ihnen beschriebenen Verfahren keine wirksamen Tollwutvaccine herstellen
konnten, ist wahrscheinlich jedoch hauptsächlich darauf zurückzuführen, daß die
Anzahl Durchgänge durch Hühnerembryos zu klein war. Wie aus der obigen Beschreibung
ersichtlich, hat auch bei dem Verfahren der vorliegenden Anmeldung der Virus erst
nach etwa I50 Durchgängen seine Pathogenität verloren.