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Verfahren zur Reinigung und Trennung der Vitamine der Bl2-Gruppe durch
Verteilungschromatographie an Zellulose Zusatz zum Patent 930651
Im Zusatzpatent
940 369 wurde ein Verfahren zur Trennung der Vitamine der Bt2-Gruppe an Zellulosesäulen
unter Verwendung von n-Butanol beschrieben, das durch Zusatz von Salzen zum Entwickler,
die die Trennschärfe erhöhen, wie z. B.
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Kaliumperchlorat, gekennzeichnet ist.
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Erfindungsgemäß kann dieses Verfahren sehr beträchtlich verbessert
werden, wenn an Stelle des n-Butanols sec.-Butanol ver wendet wird.
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Sec.-Butylalkohol wurde bisher als Entwickler in der Zellulosepulver-Chromatographie
von Vitaminen der B12-Gruppe nicht verwendet, da dabei die Trennschärfe zu gering
ist. Bei Anwendung von wassergesättigtem sec.-Butanol (etwa 31 Volumteile Wasser
auf etwa 69 Volumteile sec.-Butanol) gehen die Zonen der verschiedenen Vitamin-B12-Arten
ohne Trennung ineinander über. Bei 25% Wasser im Entwickler (25 Volumteile Wasser
+ 75 Volumteile sec.-Butanol) werden zwar die Vitamine der B12-Gruppe getrennt,
die Zonen liegen aber zu nahe aneinander. Bei 20% Wasser ist die Trennaschärfe bereits
beträchtlich; die langsam wandernden Faktoren werden aber infolge des Vorhandenseins
zu geringer Unterschiede der R-Werte und zu diffuser Zonen auch dann noch zu schlecht
getrennt.
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Die Zellulosepulver- sec.-Butanol-Chromatographile der Vitamine der
Bl2-Gruppe gibt überraschenderwe ise ausgezeichnete Ergebnisse, wenn dem Entwickler
eriindungsgemal gewisse Salze, wie z. B. Kaliumperchlorat, beigemengt werden. Das
Kaliumperchlorat löst sich sehr wenig in alkoholischen Medien (weit unter 1 1%).
Diese Salz kann entweder in Pulverform dem zu chromatographierenden Produkt, z.
B. einem Vitamin-B12-Kieselgur-Präparat, beigemengt werden; es ist jedoch zweckmäßiger,
den Entwickler durch Schütteln mit einem Überschuß an gemahlenem Kaliumperchlorat
zu sättigen. Ferner kann dieses Salz auch vor Beginn der Entwicklung der Chromatographiersäule
einverleibt werden.
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Bei Verwendung eines mit Kaliumperchlorat gesäftigten Entwicklers,
bestehend aus sec.-Butanol und Wasser mit Cyanidionen, werden die langsam wandernden
Zonen in der Chromatographiersäule mehr oder weniger zurückgehalten. Durch diese
Abbremsung der Wanderung wird das Auflösungsvermögen der Säule, d. h. deren Trennwirkung,
sehr wesentlich verbessert, wobei gleichzeitig auch die Schärfe der Zonen erhöht,
d. h. deren Breite vermindert wird.
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Zur besseren Veranschaulichung dieses Effektes werden in der Tabelle
1 die entsprechenden R-Werte für verschiedene Wassergehalte des Entwicklers mit
und ohne Kaliumperchlorat angeführt.
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Tabelle I Chromatographische Trennung einiger Vitamin-B12-Arten in
ZellulosepuIversäulen Entwickler: CN'-haltiges sec.-Butanol mit verschiedenem Wassergehalt
mit und ohne Kaliumperchlorat Säulendurchmesser 11,5 lum, Höhe 65 mm
| Entwickler R-Werte der @aktoren (b) |
| Säule Volumenverhältnis KClO4 der Faktoren (b) |
| Nr. sec.- Wasser @@@@4 1 II III IV Ergebnis |
| 1 69 3I (a) ohne nur eine diffuse Zone Keine Trennung |
| 2 75 25 ohne 0,67 0,42 0,33 0,26 Zonen etwas diffus und |
| zu dicht aneinander |
| 3 80 20 ohne 0,40 0,21 0,086 0,055 I und II recht gut ge- |
| trennt, III und IV dif- |
| fus, quantitativ nicht |
| trennbar |
| 4 69 3I (a) mit 1,0 0,77 o, 57 o,24 III und IV sehr gut ge- |
| trennt |
| 5 75 25 mit 0,67 0,34 o,I46 0,067 Alle Faktoren sehr gut |
| getrennt |
| 6 80 20 mit 0,38 0,15 0,058 o, o27 Schnelle Faktoren sehr |
| gut getrennt, die ande- |
| ren wandern zu langsam |
(a) = wassergesättigt.
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(b) = Faktor 1 =Ätio-cobalamin, Faktor II =Vitamin B12, Faktor IV
=Pseudovitamin B12. Zur Erklärung vgl.
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W. Friedrich und K. Bernhauer, Angew. Chemie, 65, 627 (1953), und
K. Bernhauer und W. Friedrich, ebenda 66, 776 (1954).
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Die in der Tabelle I enthaltenen Werte geben ein noch anschaulicheres
Bild, wenn sie in einem Diagramm dargestellt werden, wie Fig. I zeigt. Es ist daraus
klar ersichtlich, daß bei jedem der drei verwendeten Wassergehalte des sec.-Butanols
durch eine Sättigung des Entwicklers mit Kaliumperchlorat das Auflösungsvermögen
der Säule beträchtlich erhöht wird, wodurch die Vitamine der B12-Gruppe viel besser
getrennt werden.
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Dieser Effekt ist am größten beim höchsten Wassergehalt des Entwicklers
(etwa 3 31%), bei dem also auch die Konzentration an Perchlorat am höchsten ist:
Ohne Kaliumperchlorat sind alle Zonen diffus, fließen also ineinander ; in Gegenwart
von Kaliumperchlorat ist die Trennung der schnell wandernden Faktoren ziemlich gut,
die der langsam wandernden sehr gut.
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Bei Benutzung eines Entwicklers mit 25% Wasser bilden die Vitamin-B12-Arten
auch ohne Kaliumperchlorat Zonen, die aber nicht genügend voneinander getrennt sind;
dies gilt vor allem für die langsamer wandernden Zonen. Mit Kaliumperchlorat werden
alle Zonen selir gut getrennt. Es ist aus der Fig. I zu ersehen, daß hier die Zonen
viel weiter auseinandergezogen sind als ohne Kaliumperchlorat.
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Bei Verwendung eines noch wasserärmeren Entwicklers (20% Wasser)
ist der Effekt des Kalium-
perchlorats etwas geringer, die Zonen
sind aber schärfer, d. h. enger begrenzt, und weiter auseinandergezogen als. ob
ne Kaliumperchlorat.
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Auf Grund dieser Erkenntnisse wird erfindungsgemäß folgende Arbeitsweise
zur Trennung komplizienter Vitamin-B12-Gemische vorgeschlagen: Man entwickelt anfangs
mit sec.-Butanol, das nur 20 bis 25% Wasser enthält und mit Kaliumperchlorat gesättigt
ist. Nach Durchlaufen der schnellen Faktoren (Faktor 1 und ähnliche) erhöht man
den Wassergehalt des Entwicklers auf 25 bis 28°/o und eluiert den. Faktor II sowie
ähnlich wandernde Faktoren. Zum Schluß entwickelt man mit wassergesättigtem sec.-Butanol
unter Gewinnung der langsam laufenden Faktoren (Faktor III, Pseudofaktoren, Faktor
V usw.). Dadurch wird erreicht, daß die Chromatographie mit maximaler Geschwindigkeit
und maximaler Trennwirkung verläuft.
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Gegenüber der Verteilungschroimatographie unter Verwendung von n-Butanol
als Entwickler werden bei dem erfindungsgemäßen Prozeß, also unter Verwendung von
sec.-Butanol, viel geringere Mengen an Entwickler benötigt: Erstens wird sec.-Butanol
verdünnter verwendet, so daß man hier weniger an reinem sec.-Butanol selbst einsetzen
muß, zweitens werden erhebliche Mengen an Entwickler infolge der hohen R-Werte eingespart,
d. h. durch die schnelle Wanderung der Zonen. Wenn nämlich nach dem erörterten Schema
gearbeitet wird, liegen die R-Werte der entwickelten Zonen zwischen etwa 0,4 (Faktor
I bei sec.-Butanol + 20% Wasser + Kaliumperchlorat + etwas Cyanid als Entwickler)
und 0,24 (Faktor IV bei wassergesättigten sec.-Butanol + Kaliumperchlorat + etwas
Cyanid als Entwickler). Bei Verwendung von wassergesättigtem n-Butanol mit Kaliumperchlorat
betragen die R-Werte 0,4 bis. etwa 0,04, d. h. die langsamen Faktoren wandern hier
etwa fünfmal langsamer, wodurch zum Schluß fünfmal soviel Entwickler benötigt wird
als im Fall des erfindungsgemäßen Verfahrens.
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Es kann vorkommen, daß manche Vitamin-B12-Faktoren - vor allem die
langsam wandernden -anfanges nicht rot-, sondern violettgefärbt wandern, auch wenn
sie zur Gruppe der roten (kompletten) Faktoren (vgl. Note b der Tab. 1) gehören.
Dies ist wohl so zu erklären, daß sich im oberen Teil der Chromatographiersäure
Cyanidionen anreichern, wodurch die dort befindlichen Vitamin-B12-Faktoren in dicyanokomplexe
umgewandelt werden.
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Dies stört aber den Verlauf des Chromatogramms nicht.
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Es konnte weiter gezeigt werden, daß die in der Säulenchromatographie
unter Verwendung von »ungeformetr«, also pulverförmiger oder faseriger Zellulose
gewonnenen. Erkenntnisse über die Trennung der Vitamine der B12-Gruppe mittels wassergesättigtem
sec. -Butanol als Entwickler auch für jegliche Art von »geformter« Zellulose, beispielsweise
Zellulosekartons, Zelluloseblätter, verschiedene Arten der »Chromatopile« usw. und
daher auch für die Papierchromatographie Geltung haben.
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Wenn bei Verwendung von FiLtrierpapier dem Entwickler - wassergesättigtem
sec.-Butanol -Kalimperchlorat beigemengt wird, so zeigen die entwickelten Papierchromatogramme
eine viel bessere Auflösung, d. h. Trennung der einzelnen Vitamine der Bt2-Gruppe,
als ohne Zuhilfenahme dieses Salzes. Diese überraschende und völlig neue Beobachtung
ist von großer praktischer Bedeutung.
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Für die Papierchromatographie werden nämlich viel geringere Stoffmengen
und ein viel geringerer Arbeitseinsatz benötigt als für die Säulenchromatographie,
so daß es von Vorteil ist, vor der Durchführung der Säulenchromatographie das zu
trennendeGemisch der Vitamine der Bj2-Gruppe papierchromatographisch zu prüfen.
Dem erfindungsgemäßen säulenchromatographischen Verfahren ist die papierchromatographische
Methode nur unter Verwendung von wasser- und kal iumperohloratgesättigtem sec.-Butanol
ebenbürtig, nicht aber die bisher gebräuchliche Methode, die sich des sec.-Butanols
ohne Kaliumperchliorat bediente. Die letztere Methode gibt keine bzw. nur eine völlig
unzureichende Trennung der langsam laufenden Vitamin-B12-Faktoren (Faktor III, Faktor
A, Pseudovitamin B, 2 usw.), wie die Fig. 2 zeigt, so daß eine weitere Trennung
diesler Faktoren in einem zweiten Arbeitsgang, näinlich durch Elektrophorese erforderlilch
war.
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Das erfindungsgemäße Verfahren soll an Hand von einigen. Beispielen
noch näher erläutert werden.
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Beispiel I Ein Kieselgur-Trockenpräparat, enthaltend je etwa I mg
an den Vitamin-B12-Faktoren I (Ätiocobalamin), II (VitaminB12), III und. IV (Pseudovitamin
B2) wird auf eine Zellulosepulversäule (Durchmesser 11,5 mm, Höhe 65 mm) gebracht,
die auf folgende Weise hergestellt wurde: Etwa 4 g Zellulosepulver werden mit 40
ccm wassergesättigtem sec.-Butanol und o, o8 einer 10%igen Blausäurelösung.geschüttelt,
in einigen Portionen in die unten mit einem Waftepfropfen versehene Säule eingefüllt
und jedesmal kräftig zusammengedrückt.
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Der Entwickler enthält im Liter 1 ccm einer Io°/oigen Blausäurelösung
und wird vor Gebrauch mit einem Überschuß an pulverisiertem Kaliumperchlorat bis
zur Sättigung geschüttelt. Es wird zunächst mit sec. -Butanol von der angeführten
Zusammensetzung, enthaltend 20% Wasser (80 Volumteile sec.-Butanol + 20 Volumteile
Wasser) entwickelt. Nach Durchlaufen des Faktors I wird der Wassergehalt des Entwicklers
auf 25% erhöht; nach Durchlaufen des Faktors II wird mit waissergesättigtem Entwickler
gearbeitet, bis alle weiteren Faktoren eluiert sind. Man erhält alle eingesetzten
Vitamin-B12-Faktoren in völlig getrenntem Zustand.
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Beispiel 2 Ein die gleichen Vitamine der B12-Gruppe wie im Beispiel
I enthaltendes Kieselgurpräparat wird auf eine Chrom atographiersäule aus Zellulosepulver
und sec.-Butanol-Wasser der gleichen Zusammen-
setzung wie oben
aufgetragen. Das Chromatogramm wird zunächst mit einem mit Kaliumpefchlorat gesättigten
Gemisch aus 25 Volumteilen Wasser und 75 Volumteilen sec.-Butanol, enthaltensid
die übliche Menge an Blausäure, entwickelt.
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Nach Elution der Vitamin-B12-Faktoren I und II wird mit wassergesättigtem
sec.-Butanol, enthaltend wie zuvor Kaliumperchlorat und Blausäure, weiterentwickelt,
bis alle Vitamin-B12-Faktoren einzeln eluiert sind.
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Beispiel 3 Ein Gemisch von Vitaminen der B12-Gruppe, enthaltend Vitamin
B12, Faktor III, Faktor und Pseudovitamin B12 wird in Form eines Fleckes von etwa
8 mm Durchmesser auf Chromatographierpapier (Whatman I) aufgetragen. Anschließend
wird mit wassergesättigtem seo.-Butanol, enthaltend eine Spur Blausäure und gesättigt
mit Kaliumperchlorat, I8 Stunden lang bei 240 aufsteigend entwickelt. Die einzelnen
Vitamin-B12-Faktoren erscheinen auf dem Papier völlig getrennt als runde bzw. leicht
ovale Flecke von folgenden Rf-Werten: Vitamin-B12-Art: Rf-Wert Vitamin B12 . 0,31
Vitamin-B12-Faktor III . 0,24 Vitamin-B12-Faktor.A . 0,18 Pseudovitamin B12 . 0,15
Fig. 1: R-Werte einiger Vitamine der Bl2-Gruppe bei. verschiedenem Wassergehalt
des. Entwicklers.
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Säulenmaterial: Zellulosepulver, Whatman Standard Grade. Entwickler:
Wasserhaltiges sec .-Butanol, gesättigt mit Kaliumperchlorat, enthaltend Cyanidionen,
Wassergehalt des Entwicklers 20, 25 und 31 31% (wassergesättigt). Vi.tamin-B12-Faktoren
(von unten nach oben): Faktor I (Ätio-cobalamin), Faktor II (Vitamin B12), Faktor
III, Faktor IV (Pseudovitamin B12).
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Fig. 2: Rf-Werte einiger Vitamine der B12-Gruppe. Papier: Whatman
I. Entwickler: Wasser gesättigtes sec.-Butanol, enthaltend Cyanidionen, ohne Kaliumperchlorat
bzw. gesättigt mit Kaliumperchlorat. Sonstige Versuchsbedingungen: Temperatur 24°,
Dauer 18 Stunden, aufsteigend.