DE69935782T2

DE69935782T2 - Brustkrebsresistenzprotein (bcrp) und für dieses kodierende dna

Info

Publication number: DE69935782T2
Application number: DE69935782T
Authority: DE
Inventors: Douglas D. Columbia ROSS; L. Austin Silver Spring DOYLE; Lynne Houston ABRUZZO
Original assignee: University of Maryland at Baltimore
Current assignee: University of Maryland at Baltimore
Priority date: 1998-02-05
Filing date: 1999-02-05
Publication date: 2007-08-16
Anticipated expiration: 2019-02-06
Also published as: US7541437B2; ATE359291T1; WO1999040110A1; US7655755B2; JP4187412B2; EP1054894A1; AU755567B2; EP1054894B2; JP2002502592A; EP1054894B1; IL137466A0; IL137466A; US20030036645A1; ES2284243T5; DE69935782T3; IL191982A; IL191982A0; AU2761099A; CA2319715A1; EP1054894A4

Description

Diese Anmeldung basiert auf der US-Provisional 60/073763, eingereicht am 02.05.1998.
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf die als Multidrug-Resistenz-Proteine bekannte Proteinfamilie. Diese Proteine sind xenobiotische Transporter, die eine Resistenz gegenüber chemotherapeutischen Arzneimittel für Krebs verleihen. Die Erfindung beschreibt ein neues Mitglied dieser Proteinfamilie, das Brustkrebs-Resistenz-Protein (Breast Cancer Resistance Protein, BCRP) genannt wird sowie die dafür kodierende DNA.
Hintergrund der Erfindung
Die Entwicklung einer Resistenz gegenüber verschiedenen chemotherapeutischen Arzneimitteln tritt häufig während der Behandlung von Krebs auf. Zwei xenobiotische Transmembran-Transporterproteine, P-Glykoprotein (pgp) und das Multidrug-Resistenz-Protein (MRP) sind in der Lage, eine Multidrug-Resistenz zu verursachen, wenn sie in Arzneimittel-sensitive Zellen in Kultur transfiziert werden (1,2).
Trotzdem ist die Rolle, die diese Transporter bei der klinischen Arzneimittelresistenz spielen, wie sie von humanen Krebsarten gezeigt wird, unklar, und nach Alternativen oder zusätzlichen Arzneimittelresistenz-Mechanismen, die bei dieser Erkrankung wirksam sind, wurde gesucht.
Um dieses Problem anzugehen, selektierten Chen et al. (3) humane MCF-7 Brustkarzinomzellen auf Resistenz gegenüber dem Anthracyclin Doxorubicin in der Gegenwart von Verapamil, einem Inhibitor von Pgp. Die resultierende Multidrug-resistente Sublinie, MCF-7/AdrVp, zeigt eine deutliche Kreuzresistenz gegenüber anderen Anthracyclinen (Daunorubicin [DNR], 3'-Deamino-3'[3-cyano-4-morpholinyl]-doxorubicin, jedoch nicht Idarubicin), sowie gegenüber dem Anthracenedion Mitoxantron, bleibt jedoch sensitiv gegenüber Vincaalkaloiden, Paclitaxel (3,4) und Cisplatin. MCF-7/AdrVp Zellen überexprimieren Pgp oder MRP nicht, obwohl sie eine deutliche Verringerung der intrazellulären Akkumulation des Anthracyclins Daunorubicin und des fluoreszenten Farbstoffes Rhodamin 123 im Vergleich zu MCF-7 Zellen zeigen (4,5). MCF-7/AdrVp Zellen zeigen keine Veränderung der subzellulären Verteilung des Arzneimittels (4), wie in bestimmten Zellen beobachtet wird, die MRP überexprimieren. Obwohl die verringerte Akkumulation von Daunorubicin in MCF-7/AdrVp Zellen nicht durch den klassischen P-Glykoprotein-Antagonisten Cyclosporin A umgekehrt wird, führt eine Depletion von ATP zu einer vollständigen Aufhebung des abnormalen Abflusses sowohl von Daunorubicin als auch von Rhodamin (4).
Das Bedürfnis auf dem Gebiet, den Mechanismus der Arzneimittelresistenz aufzuklären, ist ständig vorhanden, da die Chemotherapie das wichtigste Verfahren zur nicht-invasiven Behandlung vieler Arten von Krebs bleibt. Es gibt außerdem einen Bedarf auf dem Gebiet, dem Mechanismus der Arzneimittelresistenz entgegen zu wirken, um so einen längeren und effektiveren Verlauf der Behandlung mit chemotherapeutischen Arzneimitteln für Krebspatienten zur Verfügung zu stellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die in der vorliegenden Erfindung beschriebene Entdeckung erfüllt die oben genannten Bedürfnisse. Die Entdeckung des BCRP und dessen entsprechenden Gens entwickelt das Wissen auf dem Gebiet über Arzneimittelresistenz-Mechanismen deutlich weiter, indem ein neuer xenobiotischer Transporter zur Verfügung gestellt wird, der in einer Vielzahl von Arzneimittel-resistenten humanen Krebszelllinien überexprimiert wird und Resistenz gegenüber vielen chemotherapeutischen Mitteln verleiht.
BCRP ist ein Protein mit etwa 655 Aminosäuren und wird durch ein Gen kodiert, das eine cDNA mit etwa 2418 Nukleotiden aufweist. Das Protein zeigt eine Aktivität und weist eine Sequenzhomologie auf, die es der ATP-Binding Cassette (ABC)-Superfamilie der Transporterproteine zuordnet. Das Molekulargewicht beträgt etwa 72,3 Kilodalton (kD) ohne Glykosylierung. Die Expression von BCRP in Arzneimittel-sensitiven humanen Krebszellen verleiht eine Resistenz gegenüber Mitoxantrone, Doxorubicin und Daunoru bicin und reduziert die Akkumulation von Daunorubicin in den geklonten transfizierten Zellen.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Säugerprotein zur Verfügung zu stellen, das ein Multidrug-Resistenz-(MDR)-Protein und ein xenobiotischer Transporter ist, und das Brustkrebs-Resistenz-Protein (BCRP) genannt wird.
Es ist außerdem eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, das Gen und/oder die cDNA zur Verfügung zu stellen, die für das genannte MDR-Säugerprotein kodiert.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Antisense-Fragmente des BCRP-Gens zur Verfügung zu stellen, welche die Expression des BCRP in vivo inhibieren.
Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Verwendung von Sonden, die von dem BCRP-Gen abgeleitet sind, als diagnostisches Mittel zur Verfügung zu stellen, um die Gen-Expression oder Gen-Amplifikation in Proben zu quantifizieren, die Patienten mit Krebs entnommen wurden.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Antikörper gegen das BCRP zur Verfügung zu stellen.
Es ist noch eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Reversion der Arzneimittelresistenz der Krebszellen zur Verfügung zu stellen, indem BCRP-Antikörper verabreicht werden.
Es ist noch eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Reversion der Arzneimittelresistenz der Krebszellen zur Verfügung zu steifen, indem Fumitremorgin C verabreicht wird.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Verstärkung der Chemotherapiebehandlung von Brustkrebs eines Patienten zur Verfügung zu stellen, indem dem Patienten Antikörper verabreicht werden, um die Resistenzaktivität von BCRP zu inhibieren.
Diese und weitere Aufgaben der vorliegenden Erfindung, die aus der detaillierten Beschreibung der Erfindung ersichtlich werden, die im folgenden zur Verfügung gestellt wird, wurden in einer Ausführungsform mit Hilfe von im wesentlichen reinem BCRP und dem für BCRP-kodierenden Gen gelöst.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A ist ein Autoradiogramm des RNA-Fingerprintings von MCF-7 Zellen.
1B ist ein Autoradiogramm einer Northern Blot-Hybridisierung von mRNA aus MCF-7/W Zellen, MCF-7/AdrVp Zellen und MCF-7/AdrVpPR Zellen.
1C ist ein Autoradiogramm einer genomischen Southern Blot-Hybridisierung von DNA aus MCF-7/AdrVp Zellen, MCF-7/W Zellen und MCF-7/AdrVpPR Zellen.
2A ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von BCRP mit Motiven.
2B zeigt die relative Ähnlichkeit von BCRP mit ausgewählten Mitgliedern der ABC-Transporter Superfamilie.
2C ist die cDNA-Sequenz, die für das BCRP kodiert.
2D ist eine grafische Darstellung eines Phylogramms, das die Evolution der Aminosäuresequenz von BCRP im Verhältnis zu bestimmten anderen Mitgliedern der ABC-Familie von Transporterproteinen zeigt.
3 zeigt ein Autoradiogramm eines Northern Blots mit verschiedenen Geweben.
4A ist ein Autoradiogramm eines Northern Blots von Subklonen von BCRP-Transfektanten.
4B ist eine grafische Darstellung der Daunorubicin (DNR)-Akkumulation und -Retention in den pcDNA3 Vektor Kontrollzellen und den mit BCRP-transfizierten Klonen 6 und 8.
4C zeigt die relative Resistenz gegenüber Faktoren von MCF-7, Vektorkontrolle, Klone 19, 6 und 8.
4D sind grafische Darstellungen, die die Wirkung verschiedener Konzentrationen von chemotherapeutischen Arzneimitteln auf das Zellüberleben von dem mit BCRP-transfizierten MCF-7 Klon 8 zeigen.
4E zeigt eine grafische Darstellung der Wirkungen der ATP-Deletion auf die Retention von Rhodamin 123 durch den Transfektanten MCF-7/pcDNA3 (leere Vektorkontrolle) oder Zellen des MCF-7/BCRP Klon 8.
5 ist eine Tabelle, welche die Wirkung verschiedener chemotherapeutischer Arzneimittel auf BCRP-transfizierte MCF-7 Zellen zeigt.
6 ist ein Autoradiogramm, das die Expression des humanen ω-Gens in MCF-7 Zellen zeigt, die mit Hilfe der Reversen Transkription-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) nachgewiesen wurde.
7 ist ein Autoradiogramm, das die Expression von BCRP in Proben von Blasten aus Patienten mit akuter myeloischer Leukämie zeigt.
8A, 8B und 8C sind Autoradiogramme, welche die Ergebnisse von Northern Blot-Hybridisierungen von mRNA aus verschiedenen Arzneimittel-resistenten Zelllinien zeigen, die mit einer BCRP-Sonde untersucht wurden.
9 ist ein Autoradiogramm einer Southern Blot-Hybridisierung aus verschiedenen MCF-7 Zelllinien.
10 ist eine graphische Darstellung, welche die Ergebnisse der Verabreichung von FTC an BCRP-tranzfizierte Zellen zeigt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Ein neues Gen und das durch das genannte Gen kodierte Protein, genannt das Brustkrebsresistenz-assoziierte Protein (Breast Cancer Resistance-associated Protein, BCRP) werden in der vorliegenden Erfindung beschrieben. Es wurde gezeigt, dass das BCRP in humanen Multidrug-resistenten (MDR) Brustkarzinomzellen, Kolonkarzinomen, Magenkarzinomen, Fibrosarkomen und Myelomen exprimiert werden. Das BCRP ist ein xenobiotischer Transporter, der Resistenz gegenüber verschiedenen chemotherapeutischen Arzneimitteln verleiht und zu der ABC-Transporter-Superfamilie gehört. Das BCRP scheint verantwortlich zu sein für die Veränderung bei dem Arzneimitteltransport und der Arzneimittelresistenz, die in verschiedenen Krebszellen manifestiert ist.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich zum Teil auf das BCRP, auf Fragmente dieses Faktors, ebenso wie auf funktionelle Derivate, Agonisten und Antagonisten sowie metabolische Abbauprodukte dieses Faktors. Die Aminosäuresequenz von BCRP ist in SEQ ID NR.1 und 2A dargestellt. Die Erfindung betrifft insbesondere Agentien, die in der Lage sind, BCRP zu inhibieren, vorzugsweise Antikörper gegen BCRP oder Antisense-Sonden gegen das BCRP-Gen. Die Erfindung umfasst weiterhin chemische Agentien, welche die Expression des BCRP-Gens oder die mRNA inhibieren, einschließlich Fumitremorgin C (FTC). Die Erfindung betrifft außerdem Verfahren zum Inhibieren der Aktivität von BCRP oder der Expression des BCRP-Gens durch Verabreichung solcher Agentien.
Ein „funktionelles Derivat" von BCRP ist eine Verbindung, die eine biologische Aktivität (entweder funktionell oder strukturell) besitzt, die im wesentlichen ähnlich zu einer biologischen Aktivität von BCRP ist. Der Begriff „funktionelle Derivate" soll die „Fragmente", „Varianten", „Analoga" oder „chemische Derivate" eines Moleküls umfassen. Ein „Fragment" eines Moleküls wie zum Beispiel BCRP soll sich auf jegliche Polypeptid-Teilmenge des Moleküls beziehen. Ein funktionelles Fragment bezeichnet ein Molekül mit einer ähnlichen, jedoch nicht identischen Aminosäuresequenz, das aber dieselbe Funktion wie das vollständig lange BCRP hat. Eine „Variante" eines Moleküls wie zum Beispiel BCRP soll sich auf ein Molekül beziehen, das in seiner Struktur und Funktion im wesentlichen ähnlich entweder mit dem gesamten Molekül oder einem Fragment davon ist. Ein Molekül wird als „im wesentlichen ähnlich" mit einem anderen Molekül bezeichnet, wenn bei de Moleküle im wesentlichen ähnliche Strukturen aufweisen oder wenn beide Moleküle eine ähnliche biologische Aktivität besitzen.
Unter der Voraussetzung, dass zwei Moleküle eine ähnliche Aktivität besitzen, werden sie folglich als Varianten betrachtet, da dieser Begriff hierin auch dann verwendet wird, wenn die Struktur eines der Moleküle nicht in dem anderen zu finden ist oder wenn die Sequenz der Aminosäurereste nicht identisch ist. Ein „Analogon" oder ein Agens, das die Funktion eines Moleküls wie BCRP imitiert, soll sich auf ein Molekül beziehen, das im wesentlichen ähnlich in der Funktion, jedoch nicht in der Struktur mit entweder dem gesamten Molekül oder einem Fragment davon ist. Wie hierin verwendet, wird ein Molekül als ein „chemisches Derivat" eines anderen Moleküls bezeichnet, wenn es zusätzliche chemische Reste enthält, die normalerweise nicht Teil des Moleküls sind. Solche Reste können die Löslichkeit, Absorption, biologische Halbwertszeit, etc. des Moleküls verbessern. Die Reste können wahlweise die Toxizität des Moleküls verringern, irgendeinen ungewünschten Nebeneffekt des Moleküls eliminieren oder abschwächen, etc.. Reste, die in der Lage sind, solche Wirkungen zu vermitteln, sind in Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) offenbart. Methoden zur Kopplung solcher Reste an ein Molekül sind auf dem Gebiet wohl bekannt.
Ein „Antagonist" von BCRP ist eine Verbindung, welche die Funktion von BCRP inhibiert. Solche Antagonisten können Immunglobuline sein (wie zum Beispiel ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper, oder aktive Fragmente solcher Antikörper). Antagonisten oder Inhibitoren gemäß der vorliegenden Erfindung, die zur Inhibierung der Arzneimittelresistenzwirkung nützlich sind, die durch BCRP verursacht wird, sind: ein Antikörper, der gegen BCRP erzeugt wurde, oder das Arzneimittel Fumitremorgin C (FTC), ein Mycotoxin. FTC wurde von Dr. Lee Greenberg von den Wyeth-Ayerst Laboratorien in Pearl River, New York, erhalten.
Ein polyklonaler Antikörper, der in der Lage ist, an BCRP zu binden, kann durch Immunisieren eines Säugetieres mit einer Zubereitung von BCRP oder einem funktionellen Derivat von BCRP hergestellt werden. Verfahren zur Durchführung solcher Immunisierungen sind auf dem Gebiet wohl bekannt. Monoklonale Antikörper oder Fragmente davon können ebenfalls verwendet werden, um das Vorhandensein oder die Menge von BCRP in einer bestimmten biologischen Probe zu überprüfen. Solche Antikörper können durch Immunisieren von Splenocyten mit aktiviertem BCRP (7) erzeugt werden. Die BCRP- bindenden Antikörper der vorliegenden Erfindung können Patienten verabreicht werden, um die Resistenz gegenüber chemotherapeutischen Arzneimitteln zu reduzieren und folglich deren Behandlung zu verbessern. Verfahren zur Verabreichung werden abhängig sein von den besonderen Umständen eines jeden individuellen Patienten und liegen innerhalb der Fähigkeiten der Fachleute auf dem Gebiet.
Das BCRP gemäß der vorliegenden Erfindung kann mit Hilfe natürlicher Verfahren erhalten werden (wie zum Beispiel durch Induzieren der Produktion von BCRP durch eine humane oder tierische Zelle); mit Hilfe synthetischer Verfahren (wie zum Beispiel durch Verwendung des Merrifield Verfahrens zur Synthetisierung von Polypeptiden, um BCRP, funktionelle Derivate von BCRP oder Agonisten oder Antagonisten von BCRP (entweder Immunglobulin oder Nicht-Immunglobulin) zu synthetisieren; oder durch Verwendung der Gentechnologie (wie zum Beispiel, um das BCRP gemäß der vorliegenden Erfindung in verschiedenen Wirten, zum Beispiel Hefezellen, Bakterienzellen, Pilzen, kultivierten Säugerzellen, um einige zu nennen, oder von rekombinanten Plasmiden oder viralen Vektoren zu produzieren). Die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung werden als „im wesentlichen frei von natürlichen Kontaminanten" bezeichnet, wenn die Zubereitungen, die sie enthalten, im wesentlichen frei von Materialien sind, mit denen diese Produkte normalerweise und natürlicherweise zusammen zu finden sind.
Die Wahl, welche Methode anzuwenden ist, wird von Faktoren wie zum Beispiel der Einfachheit, der gewünschten Ausbeute usw. abhängig sein. Es ist nicht notwendig, nur eine(s) der oben beschriebenen Verfahren, Methoden oder Techniken anzuwenden, um BCRP herzustellen; die oben beschriebenen Verfahren, Methoden und Techniken können kombiniert werden, um BCRP zu erhalten. Es wird am meisten bevorzugt, BCRP durch Exprimieren des Gens oder der cDNA-Sequenz, die das BCRP-Protein kodiert, herzustellen. Ein solches Gen oder eine solche cDNA-Sequenz wird hierin im weiteren als das „BCRP-Gen" oder „die BCRP cDNA-Sequenz" bezeichnet.
Die Methode des RNA-Fingerprintings wurde angewendet, um die cDNA von BCRP zu klonieren. Das RNA-Fingerprinting verwendet die Polymerasekettenreaktion (PCR) und degenerierte Primerpaare, um die zelluläre mRNA zu amplifizieren. Diese Methode basiert auf Modifikationen der Methode des „Differential Display von mRNA", das von Liang und Pardee entwickelt wurde (6). Wir verwendeten diese Methode als ein Mittel, um Gene zu entdecken, die in Arzneimittel-selektierten Zelllinien im Vergleich zu ihren Eltern zellen differenziell exprimiert werden. Der Hauptunterschied zwischen dem RNA-Fingerprinting und dem Differential Display ist, dass das mRNA-Fingerprinting-Protokoll eine einzige cDNA Synthesereaktion verwendet, gefolgt von einer Amplifikation mit Upstream- und Downstream-Primern. Das Differential Display verwendet 9 bis 12 cDNA Synthesen für jede RNA-Probe mit einem verankerten Oligo (dT) Primer, gefolgt von einer Amplifikation mit einem Upstream-Primer.
Das klonierte BCRP-Gen, das mit Hilfe der oben beschriebenen und in den Beispielen beschriebenen Verfahren erhalten wurde, kann funktionell mit einem Expressionsvektor verbunden werden und in bakterielle oder eukaryontische Zellen eingeführt werden, um das BCRP-Protein zu produzieren. Methoden für solche Manipulationen sind in Maniatis, T. et al offenbart und auf dem Gebiet wohl bekannt (8).
Die BCRP cDNA-Sequenz ist etwa 2418 Nukleotide lang. Die BCRP cDNA wird in SEQ ID NR:2 oder 2C dargestellt. Die BCRP cDNA kann verwendet werden, um das BCRP zu exprimieren. Außerdem kann die BCRP cDNA-Sequenz oder ein Teil davon als eine Sonde in einem Northern Blot Assay verwendet werden oder zur Auswahl von Sonden in einen RT-PCR Assay, um die BCRP mRNA in verschiedenen Gewebeproben zu messen. Durch die Messung der Expression von BCRP mit Hilfe eines Nothern Blots oder eines RT-PCR-Assays kann die Arzneimittelantwort auf chemotherapeutische Arzneimittel im Zeitablauf bestimment werden. Die Methoden für diese Assays sind in den Beispielen beschrieben und auf dem Gebiet wohl bekannt (8). Folglich könnte ein solches Assay verwendet werden, um zu bestimmen, ob das fehlende Ansprechen eines Patienten auf die Chemotherapie auf die Überexpression von BCRP zurückzuführen ist und folglich die Resistenz gegenüber den Arzneimitteln. Außerdem könnten Antisense-Sonden basierend auf der cDNA-Sequenz entwickelt werden, die in SEQ ID NR:2 und 2C dargestellt ist. Diese Sonden können Patienten verabreicht werden, um die BCRP cDNA endogen zu binden und folglich die Expression des BCRP zu inhibieren. Eine derartige Therapie könnte verwendet werden, um die Neigung eines Patienten, resistent gegenüber chemotherapeutischen Arzneimitteln zu werden, zum Stillstand zu bringen oder zu verlangsamen und folglich die Behandlung effektiver zu machen. Methoden zur Herstellung und Verabreichung von Antisense-Sonden sind auf dem Gebiet wohl bekannt. Methoden der Nukleinsäure-Hybridisierung und -Klonierung sind auf dem Gebiet wohl bekannt (8).
Die in den Beispielen und entsprechenden Figuren dargestellten Daten unterstüzen die Schlussfolgerung stark, dass das neue ABC Familienmitglied BCRP, von dem hier berichtet wird, ein xenobiotischer Transporter ist, der für den Arzneimittelresistenz-Phänotyp der MCR-7/AdrVp Zellen primär verantwortlich ist.
Die Überexpression von BCRP in verschiedenen Krebszelllinien wird ebenfalls in der vorliegenden Erfindung gezeigt. Diese Zelllinien schließen die Kolonkarzinomzellen S1, HT29, wie Magenkarzinomzellen EPG85-257, die Fibrosarkomzellen EPR86-079 und die Myelomzellen 8226 ein. Die Überexpression von BCRP mRNA in jeder dieser Zelllinien und die Amplifikation des BCRP-Gens in Arzneimittel-resistenten Zellen weist eine wichtige Rolle für den BCRP bei der Resistenz gegenüber zytotoxischen Mitteln nach. Darüber hinaus verringerte die verstärkte Überexpression von BCRP in MCF-7 Zellen die zelluläre Akkumulation von Daunorubicin und verlieh den transfizierten Zellen ein Muster der Arzneimittel-Kreuzresistenz, das nahezu identisch mit dem von MCF-7/AdrVp Zellen war. Der Grad der Überexpression von BCRP in den transfizierten Klonen 6 und 8 korreliert mit den Veränderungen der intrazellulären stationären Konzentration an Daunorubicin und ihrem Resistenzgrad gegenüber Mitoxantron, Daunorubicin und Doxorubicin.
Ein Hauptunterschied zwischen den BCRP-überexprimierenden transfizierten Klonen und der ursprünglichen MCF-7/AdrVp Subline ist, dass der Grad der Arzneimittelresistenz in den letzteren höher ist als in den transfizierten Zellen, während die stationären Konzentrationen an BCRP mRNA jeweils vergleichbar sind (4A). Mehrere Möglichkeiten können zu diesem Unterschied beitragen. Unterschiede in der Proteinstabilität und/oder Proteinlokalisierung könnten zu dem vollständigen Arzneimittel-resistenten Phänotyp beitragen, oder die Expression weiterer Proteine könnte benötigt werden. Vor kurzem haben wir berichtet, dass Mitglieder der Familie des Karzino-embryonalen Antigens (carcinoembrionic antigen, CEA), in erster Linie das unspezifische kreuzreagierende Antigen (non-specific cross reacting antigen, NCA) und CEA selbst, auf der Zelloberfläche von MCF-7/AdrVp Zellen und MCF-7/AdrVpPR Zellen im Vergleich zu Arzneimittel-sensitiven MCF-7 Zellen deutlich überexprimiert sind (15). Eine hohe Dichte dieser acidischen Glykoproteine auf der Zelloberfläche könnten Arzneimittel wie zum Beispiel Mitoxantron, Daunorubicin oder Doxorubicin protonieren, was den Eintritt in die Zelle verhindert. Tatsächlich berichteten Kawaharata et. al. (16), dass die verstärkte Expression von CEA in transfizierten NIH3T3 Zellen sowohl zu einer verminderten Akkumulation von Doxorubicin als auch zu einer Resistenz gegenüber Doxorubicin in den transfizierten Zellen führt. Folglich könnte die relative Überexpression von CEA-Familienmitgliedern auf der Zelloberfläche von MCF-7/AdrVp Zellen mit BCRP zusammenwirken, um eine größere Resistenz gegenüber Mitoxantron, Doxorubicin und Daunorubicin zu verursachen, als die, die durch BCRP allein verursacht wird. Diese Hypothese könnte durch Cotransfizieren der MCF-7/BCRP Klon 8-Sublinie mit einem Expressionsvektor, der NCA oder CEA enthält, überprüft werden.
Eine weitere mögliche Erklärung für den höheren Resistenzgrad von MCR-7/AdrVp Zellen im Vergleich zu den Transfektanten ist, dass BCRP Teil eines Multiprotein-Transporterkomplexes ist. Der Translokationsweg eines typischen ABC-Transporters besteht aus zwei ATP-bindenden Domänen und zwei stark hydrophoben Domänen, die Membran-überspannende Regionen enthalten. Dies kann über ein einziges Molekül erreicht werden, wie im Falle von MRP oder Pgp, die doppelt so groß wie BCRP sind (etwa 1.300 Aminosäuren im Vergleich zu 655 Aminosäuren). Alternativ kann der aktive Komplex bestimmter ABC-Transporter durch die Heterodimerisierung von zwei nicht-identischen Proteinen gebildet werden, die jeweils eine einzige ATP-bindende und hydrophobe Region enthalten. Das ω-Protein und das brown (b) Protein von Drosophila und die Tap-1 und Tap-2 Proteine, welche die Haupt-Histokompatibilität-Klasse 1-Proteine transportieren, sind Beispiele für ABC-Familienmitglieder, die eine solche kooperative Interaktion zeigen. Das Vorhandensein der Phosphopantethein-Anheftungsstelle auf BCRP legt nahe, das BCRP ein Teil eines Multiproteinkomplexes sein könnte. Folglich ist es möglich, dass BCRP einen/mehrere Proteincofaktor(en) hat, der/die es zu einem wesentlich effizienteren Transporter in einem heteromeren Zustand machen. Die Aktivierung oder Expression dieses Cofaktors in MCF-7/AdrVp im Vergleich zu MCF-7 Zellen könnte den erhöhten Arzneimitteltransport in der MCF-7/AdrVp-Sublinie im Vergleich zu den BCRP-Transfektanten erklären.
Die Entdeckung einer erhöhten Expression der BCRP mRNA in den humanen Koloncarzinomzellen S1M1-3.2 legt nahe, dass BCRP der „nicht-Pgp, nicht-MRP" Arzneimitteltransporter ist, der von dieser Multidrug-resistenten Zelllinie offenbart wird. Dies ist auf Grund des kürzlichen Berichts (25) über einen spezifischen Inhibitor des in S1M1-3.2 Zellen identifizierten Transporters von besonderer Wichtigkeit. Dieser Inhibitor, Fumitrimorgin C (FTC), macht die Resistenz in Zellen, die Pgp oder MRP überexprimieren, nicht rückgängig. 10 zeigt, dass FTC in der Lage ist, die Akkumlation von BBR 3390 (ein Aza-Anthrapyrazol Arzneimittel, das mit Hilfe von BCRP ausgeschleust wird) in BCRP-transfizierten MCF-7 Zellen zu verstärken und den Efflux von BBR 3390 in BCRP-transfizierten MCF-7 Zellen zu inhibieren. Die folgenden Beispiele werden lediglich zu illustrativen Zwecken zur Verfügung gestellt und sind in keiner Weise als den Umfang der vorliegenden Erfindung beschränkend gedacht.
Beispiele
Zelllinien. MCF-7 Brustkarzinomzellen, ihre Arzneimittel-resistente Sublinie MCF-7/AdrVp und eine teilweise Arzneimittel-sensitive revertante Sublinie (MCF-7/AdrVpPR, erhalten von Dr. Antonio Fojo, Medizinabteilung, National Cancer Institut), wurden wie zuvor beschrieben (5) in Kultur gehalten. Die MCF-7/AdrVp-Sublinie wurde kontinuierlich in Gegenwart von 100 ng/mi Doxorubicin (Pharmacia Adria, Dublin, OH) und 5 μg/ml Verapamil (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) gehalten.
Die Wachstumsbedingungen für die Zelllinien, die in den Nothern Blot Studien verwendet wurden, sind in den in Tabelle 1 aufgelisteten Referenzen enthalten. Die S1M1-3.2 Kolonkarzinomzellen wurden von S1-Zellen (einem Subklon der humanen Kolonkarzinomzelllinie LS174T) mit Hilfe einer Wachstumsselektion bei zunehmenden Konzentrationen an Mitoxantron, bis eine Endkonzentration von 3.2 μM erreicht wurde, abgeleitet. Die HL-60/MX2 Zellen wurden von der American Type Culture Collection (Manassas, VA) erworben und wie zuvor beschrieben in Kultur gehalten (17).
Beispiel 1: Synthese von cDNA durch reverse Transkription von mRNA
Gereinigte zelluläre Gesamt-RNA (2 μg) aus MCF-7/W Zellen, MCF-7/AdrVp Zellen oder MCF-7/AdrVpPR Zellen, die teilweise zur Arzneimittelsensitivität revertiert sind, indem sie in Abwesenheit der selektierenden Mittel kultiviert wurden, wurden mit 200 Einheiten der reversen Transkriptase des Moloney murinen Leukämievirus in Gegenwart eines Oligo (dT) Primers (0,1 μM) und 1 mM dNTP bei 42°C für eine Stunde revers transkribiert. Die Reaktionen wurden durch erhitzen auf 75°C für 10 Minuten beendet. Die so hergestellten cDNAs wurden bei –20°C gelagert, bis sie weiterverwendet wurden.
Beispiel 2 RNA-Fingerprinting
Das RNA-Fingerprinting wurde unter Verwendung des Delta^TM RNA-Fingerprinting-Kits (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA) mit geringen Modifikationen durchgeführt. Das RNA-Fingerprinting wird durch Amplifikation der cDNA mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Zufallsprimern erreicht.
Für jede Fingerprintingreaktion wurde cDNA, die 1:10 verdünnt wurde (Verdünnung A) oder 1:40 verdünnt wurde (Verdünnung B), von jeder Zelllinie mit einem Upstream (P) und einem Downstream (T) Primer in der Gegenwart von 50 μM dNTP, 50 nM [³³P]dATP und dem „Advantage KlenTaq Polymerase Mix", der mit dem Clontech-Kit zur Verfügung gestellt wird, amplifiziert. Die Upstream P-Primer waren beliebige 25-mere. Die Downstream T-Primer waren 30-mere, verankerte Oligo(dT)Primer, deren 3' Ende die Sequenz 5'-T₉N₁N₁-3' enthielt, wobei N₁ A, C oder G ist. Der P-Primer bindet auf Grund einer Zufallshomologie an die cDNA. Wir kombinierten zehn P-Primer und neun T-Primer, um 90 verschiedene Kombinationen zu erhalten.
Die ersten drei PCR-Zyklen wurden mit einer relativ geringen Stringenz (Annealing Temperatur 40°C) durchgeführt. Aus diesem Grunde banden die P-Primer unvollständig, was die Anzahl der amplifizierten Produkte erhöhte. Die Produkte aus diesen frühen Zyklen wurden anschließend durch 24 PCR-Zyklen bei hoher Stringenz (Annealing Temperatur 60°C). amplifiziert. Kontroll-PCR-Reaktionen wurden hergestellt, die steriles Wasser an Stelle von cDNA (Wasserkontrolle) oder 0,02 μg der gesamten zellulären RNA (RNA-Kontrolle) enthielten. Die RNA-Kontrollen wurden hergestellt, um festzustellen, ob die RNA durch genomische DNA kontaminiert war.
Im Anschluss an die PCR-Reaktion wurde eine geringe Menge einer jeden Reaktionsmischung auf ein 5% Polyacrylamidgel geladen, anschließend wurden die Gele getrocknet, und dann wurden Autoradiogramme angefertigt (1A). Diese Autoradiogramme zeigten ein charakteristisches „RNA-Fingerprint"-Muster von 50 bis 100 PCR Produktbanden mit 100 bis 2.000 Nukleotiden Länge. Die Spuren 1, 3 und 5 sind Reaktionsmischungen, in denen cDNA dazugegeben wurde, die 1:10 verdünnt war (Verdünnung A); die Spuren 2, 4 und 6 zeigen Reaktionsmischungen, in denen cDNA dazugegeben wurde, die 1:40 verdünnt war (Verdünnung B). Die Spuren 7 und 8 sind „H₂O-Kontrollen", in denen steriles Wasser zu der PCR-Reaktionsmischung anstelle der cDNA dazugegeben wurde. Die Spuren 19, 10 und 11 sind "RNA-Kontrollen", in denen 0,02 μg zelluläre RNA aus MCF-7/W, MCF-7/AdrVp, oder MCF-7/AdrVpPR Zellen anstelle der cDNA dazugegeben wurde. Diese "RNA-Kontrollen" dienen dazu, eine Kontamination der RNA durch genomische DNA anzuzeigen. Die Autoradiogramme wurden auf PCR-Produkten untersucht, die in größeren Mengen in Reaktionen produziert wurden, die revers-transkribierte RNA aus MCF-7/AdrVp Zellen verwendete, im Vergleich zu solchen, die RNA aus MCF-7/W Zellen oder MCF-7/AdrVpPR Zellen verwendeten (1A). Der PFEIL bezeichnet ein PCR-Produkt, das eine mRNA-Spezies repräsentiert, die in MCF-7/AdrVp Zellen im Vergleich zu MCF-7/W Zellen oder MCF-7/AdrVpPR Zellen überexprimiert ist. Dieses ist das PCR-Produkt, das aus dem Gel ausgeschnitten und amplifiziert wurde und unter Verwendung der "TA-Klonierungs"-Methode kloniert wurde, wobei der gewünschte Klon Klon 8 genannt wurde (siehe unten).
Beispiel 3 Amplifikation der Ziel-cDNA mit Hilfe der TA-Klonierung
Das in den MFC-7/AdrVp Zellen überexprimierte PCR-Produkt wurde aus dem getrockneten Gel ausgeschnitten und durch Kochen in 40 ml ddH₂O für 5 Minuten eluiert, anschließend mit Hilfe der PCR für 20 Zyklen unter Verwendung der ursprünglichen Primer amplifiziert und auf 2% Agarose/Ethidiumbromid-Gelen aufgetrennt. Diese PCR-Produkte wurden anschließend in ein "TA Cloning Vector"-Plasmid ligiert, pCR^®2.1, das anschließend unter Verwendung von Standardverfahren für PCR-Produkte kloniert wurde (Original TA Cloning^® Kit, Invitrogen Corporation, San Diego, CA).
Die pCR^®2.1 Plasmide, die das PCR-Produkt enthielten, wurden verwendet, um den TOP 10F E. coli-Stamm zu transformieren. Einzelne Bakterienkolonien wurden gepickt, und Plasmid-DNA wurde mit Hilfe von Minipreps (Wizard^TM Miniprep, Promega, Madison, WI) isoliert. Die Plasmid-DNA wurde mittels PCR mit den ursprünglichen "P"- und den "T"-Primern amplifiziert, anschließend einer Gelelektrophorese unterzogen. Die Bande mit der ursprünglichen Größe wurde ausgeschnitten, und die DNA wurde durch kochen in 100 μl ddH₂O bei 100°C für 5 Minuten isoliert. Ein Aliquot der DNA wurde mit Hilfe der PCR mit den ursprünglichen Primern für 20 Zyklen reamplifiziert. Eine einzige Bande wurde auf Ethidiumbromid-Gelen sichtbar gemacht, die ausgeschnitten, elektroeluiert und anschließend präzipitiert wurde.
Beispiel 4 Isolieren des BCRP-Klons
Das "Reverse" Northern Blot-Verfahren wurde verwendet, um die TA-Vektorklone zu screenen. Kurz beschrieben wurde eine "Reverse" Northern Analyse wie folgt durchgeführt. Das aus 12 verschiedenen E-coli Kolonien, die mit dem pCR2.1 Plasmid transformiert wurden, isolierte PCR-Produkt wurde zweifach auf Zeta-Probe (BioRad, Richmond, CA)-Membranen in einem Slot Blot-Apparat fixiert. Eine der duplizierten Membranen wurde mit der [³³P]-markierten PCR-Reaktionsmischung untersucht, welche die MCF-7 cDNA unter Verwendung der ursprünglichen "P"- und "T"-Primer in dem RNA-Fingerprinting-Kit amplifizierte. Die andere Membran wurde mit der ursprünglichen [³³P]-markierten parallelen PCR-Reaktionsmischung sondiert, welche die cDNA amplifizierte, die von MCF-7/AdrVp Zellen hergestellt wurde, unter Verwendung von Northern Blot Standardbedingungen für die Hybridisierung, wobei die Bindung der Sonde anschließend mit Hilfe der Autoradiografie bestimmt wurde. Ein einziger TA-Klon (Klon 8 – SEQ ID NR. 7) wurde so identifiziert, dessen PCR-Produkt-Insert eine 2,4 kb mRNA-Spezies aufwies, die in MCF-7/AdrVp Zellen im Vergleich zu MCF-7 Zellen deutlich überexprimiert war (1B, obere Abbildung). Die teilweise revertierte MCF-7/AdrVpPR Sublinie zeigte eine mittlere Expression der 2,4 kb mRNA-Spezies (1B, obere Abbildung). Um die gleichmäßige Beladung der Spuren zu überprüfen, wurde der Blot gestrippt und anschließend mit radioaktiv markierter 18S RNA erneut sondiert (1B, untere Abbildung).
Southern Blots wurden unter Verwendung des Klon-8 PCR-Produktes durchgeführt. Kurz beschrieben wurde deren DNA isoliert, mit EcoR1 verdaut, einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, auf einen Nitrozellulosefilter transferriert und auf diesem fixiert. Der Filter wurde mit dem Klon-8 PCR-Produkt sondiert, das am Ende mit [³²P]-dCTP markiert war, anschließend wurde das gezeigte Radioautogramm gemacht (1C, obere Abbildung). Dies zeigte, dass das verwandte (cognate) Gen für BCRP sowohl in MCF-7/AdrVp Zellen als auch in MCR-7/AdrVpPR Zellen amplifiziert wurde, im Vergleich zu den elterlichen MCF-7 Zellen (1C, obere Abbildung). Die untere Abbildung in 1C zeigt das Bild einer mit Ethidiumbromid gefärbten Agarose-Gelelektrophorese der korrespondierenden genomischen DNA nach einem Verdau mit EcoR1, um eine etwa gleichmäßige Beladung des Gels nachzuweisen.
Beispiel 5 Sequenzieren des BCRP-Klons
Die Sequenzierung der cDNAs wurde mit Hilfe eines automatischen DNA-Sequenzierers durchgeführt (Perkin Elmer, Inc., Foster City, CA). Sämtliche DNA-Sequenzen wurden durch Sequenzieren in die entgegengesetzte Richtung bestätigt. Das differenziell exprimierte PCR-Produkt in dem TA-Klon 8 wurde sequenziert und es wurde festgestellt, dass es eine 795 bp lange cDNA ist (SEQ ID NR. 7). Proteindatenbank-Recherchen der abgeleiteten Aminosäuresequenz offenbarten einen hohen Grad an Homologie mit Mitgliedern der ABC-Superfamilie von Transporterproteinen.
Beispiel 6 Isolation der vollständig langen BCRP-cDNA
Eine MCF-7/AdrVp cDNA-Bibliothek wurde unter Verwendung des CapFinder^TM PCR cDNA Library Construction Kits (Clontech) in Übereinstimmung mit den Angaben des Herstellers konstruiert. Die CapFinder^TM-Methode ist spezifisch dafür vorgesehen, vollständig lange doppelsträngige cDNA herzustellen. Das 795 bp lange cDNA-Fragments des Klons 8 wurde radioaktiv markiert und als Sonde verwendet, um die aus MCF-7/AdrVp Zellen hergestellte cDNA Bibliothek zu screenen. Isolierte positive Klone wurden einem zweiten und dritten Screening unterzogen und anschließend mit Hilfe der Northern Blot-Hybridisierung unter Verwendung der aus MCF-7 Zellen, MCF-7/AdrVP und MCF-7/AdrVpPR Zellen erhaltenen RNA überprüft. Von mehreren Klonen wurde festgestellt, dass sie 2,4 kb Inserts aufweisen, was in etwa die Größe der BCRP mRNA ist, wie sie durch das Northern Blotting nahe gelegt wurde.
Vier der 2,4 kb Inserts wurden in das pCR2.1 Plasmid ligiert, und anschließend wurden diese TA-Vektoren in E. coli kloniert (wie oben beschrieben). Einer der TA-Vektorklone, der ein 2,4 kb cDNA-Fragment-Insert enthielt, wurde identifiziert und isoliert. Die Sequenzierung des 2,4 kb cDNA-Inserts wurde mit Hilfe eines automatischen DNA-Sequenziergerätes (Perkin Elmer Inc., Foster City, CA) durchgeführt. Sämtliche DNA-Sequenzen wurden mit Hilfe der Sequenzierung in der entgegengesetzten Richtung bestätigt. Nach der Sequenzierung wurde festgestellt, dass das cDNA-Insert eine Länge von 2418 bp hat, wie in 2C oder SEQ ID NR. 2 gezeigt. Das Überprüfen der cDNA auf offene Leserahmen (open reading frames, ORF) unter Verwendung des Programms "FRAMES", das in dem Genetics Computer Group (GCG) Software-Paket enthalten ist, zeigte die Gegenwart eines langen ORF, der bei Position 239 begann und mit dem Stop- Codon TAA bei Position 2204-6 endete. Die abgeleitete Aminosäuresequenz dieses ORF ist in 2A und SEQ ID Nr.1 gezeigt. Das Protein hat 655 Aminosäuren und ein ungefähres Molekulargewicht von etwa 72,3 Kilodalton. Das von dieser Sequenz kodierte Protein wurde Brustkrebs-Resistenz-Protein oder BCRP genannt (2A).
Die Analyse der Sequenz von BCRP mit dem GCG-Programm "MOTIFS" zeigte eine einzige Walker "A" ATP/GTP-Bindungsregion (11) bei den Aminosäuren 80–87 sowie eine Phosphopantethein-Anheftungsstelle bei den Aminosäuren 213–228 (2A). Phophopantethein (oder Pantethein 4'-Phosphat) ist die prosthetische Gruppe eines Acyl-Trägerproteins in einigen Multienzymkomplexen, wo es zur Anheftung von aktivierten Fettsäuren und Aminosäuregruppen dient (12).
Die Untersuchung der BCRP-Struktur mit den GCG-Programmen "PEPPLOT" und PLOTSTRUCTURE" zeigte eine relativ hydrophile aminoterminale Domäne (Aminosäuren 1–400), welche die ATP-Bindungssequenz enthält sowie eine relativ hydrophobe Carboxy-terminate Domäne (Aminosäure 401–655), welche wenigstens drei mutmaßliche Transmembrandomänen (TM1, TM2 und TM3) und vier potentielle N-Glykosylierungsstellen (Glyc) enthält (2A). Die Transmembran-Domänen wurden mit Hilfe der Verwendung eines Programms zur Voraussagung von Helices in integralen Membranproteinen abgeschätzt (13). Die Analyse der BCRP-Sequenz mit Hilfe des GCG-Programms "DOTBLOT" zeigt, dass das Peptid homolog zu der Hälfte des duplizierten Pgp oder MRP-Moleküls ist, das mit der Ausnahme, dass Pgp oder MRP die Konfiguration NH₂-[Transmembran-Domänen-[ATP-Bindung-1]-[Transmembran-Domänen]-[ATP-Bindung-2]-COOH aufweisen, während die von BCRP NH₂-[ATP-Bindung]-[Transmembran-Domänen]-COOH ist. Die relative Ähnlichkeit von BCRP mit anderen Mitgliedern der Superfamilie der ABC-Transporter wurde unter Verwendung des "PILEUP"-Programms von GCG bestimmt. Diese Analyse zeigte, dass die Peptidsequenz von BCRP nur entfernt mit dem P-Glykoprotein (PgP oder Mdr1) oder MRP ist (2B) verwandt ist.
Beispiel 7 Vergleich der BCRP-Sequenz mit der ω-Sequenz
Die Analysen der cDNA-Sequenzen und abgeleiteten Proteinsequenzen wurden unter Verwendung der Protein- und Nukleotidsequenz-Datenbanken durchgeführt, auf die unter Verwendung der Wisconsin Sequence Analysis Package Version 8 (Genetics Com puter Group [CGC], Madison, WI) zugegriffen wurde, die über die Frederick Cancer Research Center's Supercomputing Facility (Frederik, MD) erhältlich ist.
Ein "FASTA"-Vergleich der Aminosäuresequenz von BCRP zeigte einen hohen Homologiegrad mit wenigstens 50 ATP-Bindungskassette-Transportproteinen. Die höchste Übereinstimmung war PIR2:G02068, das humane Homolog des Drosophila white (ω-) Gens, das 638 Aminosäuren lang ist und zu 29,3% identisch mit BCRP ist. Das ω-Gen in Drosophila wirkt bei dem zellulären Transport von Guanin und Tryptophan mit, die Vorläufer des retinalen Pigments sind (9). Wir haben festgestellt, dass das humane Homolog von ω in MCF-7/AdrVp Zellen im Vergleich zu MCF-7 Zellen nicht überexprimiert wird, wie mit Hilfe des Reverse-Transkription-PCR-Assays festgestellt wurde (6).
Das Programm "Oligo" (Version 5,0, National Biosciences, Inc., Plymyth, MN) wurde verwendet, um bei der Bestimmung geeigneter Primer für den Nachweis des humanen Homologs von ω mit Hilfe der Reversen Transkription-PCR zu helfen. Diese Assays wurden unter Verwendung einer Abwandlung der zuvor für Beta-Actin und MRP beschriebenen Assays durchgeführt (10), außer dass Primer verwendet wurden, die spezifisch für das ω-Gen anstelle von MRP sind. Der obere Primer begann bei der 5'-Position 2136 der humanen ω mRNA und hatte die Sequenz 5'-CGA CCG ACG ACA CAG A-3' (SEQ ID NR. 3); der untere Primer begann bei der 3'-Position 2590 und hatte die Sequenz 5'-CTT AAA ATG AAT GCG ATT GAT-3' (SEQ ID Nr. 4). Um eine gleichförmige Beladung des Gels sicherzustellen, wurde außerdem ein Reverse Transkriptions-PCR-Assay für Beta-Actin durchgeführt. Die Endkonzentration der verwendeten Primer betrug 200 nM. Fünfundzwanzig Zyklen zur Denaturierung (94°C, 1 Minute), Annealing (50°C, 1 Minute) und Elongation (72°C, 2 Minuten) wurden durchgeführt. 6 zeigt eine Agarose-Gelelektrophorese eines Aliquots der PCR-Reaktionsmischungen, die RNA aus MCF Zellen oder MCF-7-/AdrVp Zellen verwendeten, was zeigt, dass sowohl das humane ω, als auch Beta-Actin in etwa gleichen Mengen in diesen Zelllinien exprimiert werden.
Beispiel 8: Nothern Blots verschiedener humaner Gewebe mit der BCRP-Sonde (Klon 8)
Ein Northern Blot mit einer mit ³²P-markierten cDNA-Sonde des Klons 8 wurde durchgeführt. Vorgeblottete Agarose-gelelektrophorisierte RNA aus verschiedenen Geweben wurde von Clontech erworben, um in Northern Blot-Assays mit verschiedenen Geweben verwendet zu werden (3). Die höchste Expression von BCRP wurde in platzentarem Gewebe beobachtet, wobei geringeren Mengen der Expression im Gehirn, der Prostata, dem Dünndarm, den Hoden, den Ovarien, dem Darm und der Leber nachweisbar waren. Im Herzen, der Lunge, Skelettalmuskeln, Niere, Pankreas, Milz, Thymus und peripheren Blut-Leukocyten waren die BCRP-Transkripte unter dem Detektionslevel.
Beispiel 9: Expression von BCRP in MCF-7 Zellen – Funktionale Studien
Die vollständig lange BCRP cDNA wurde in die multiple Klonierungsstelle des Expressionsvektors pcDNA3 (Invitrogen) insertiert. Im Anschluss an die Subklonierung des pcDNA3-BCRP Konstruktes wurde eine DNA-Sequenzanalyse durchgeführt, um zu bestätigen, dass das Insert in dem Klon, der ausgewählt wurde, in Sense-Orientierung zu dem CMV-Promotor des pcDNA3-Vektors vorlag. MCF-7 Zellen wurden mit pcDNA3-BCRP unter Verwendung des Kalzium-Phosphat-Präzipitationsverfahrens (17) transfiziert, durch Kultivieren mit Geneticin (G418, 1 mg/ml) selektiert, und anschließend durch limitierende Verdünnung in 96 Well-Kulturplatten mit flachem Boden subkloniert. Die Subklone wurden mit Hilfe einer Northern Blot Analyse auf Expression der BCRP mRNA überprüft, unter Verwendung einer radioaktiv markierten cDNA des Klons 8 als Sonde (4A). Als Kontrolle wurden die MCF-7 Zellen außerdem mit dem leeren pcDNA3-Vektor transfiziert, anschließend durch Wachstum in Medium selektiert, das 1 mg/ml G418 enthielt (4A). Zwei Klone der MCF-7 Zellen, die mit pcDNA3-BCRP transfiziert wurden, von denen festgestellt wurde, dass sie BCRP überexprimieren (Klone 6 und 8), wurden ausgewählt und für weitere Untersuchungen expandiert (4A). Ein dritter Klon der mit pcDNA3-BCRP transfizierten Zellen, Klon 19, überexprimierte BCRP nicht und wurde als Kontrolle für Studien ausgewählt.
Beispiel 10: Wirkung chemotherapeutische Arzneimittel auf BCRP-transfizierte MCF-7 Zellen
Die Akkumulation und Retention von Daunorubicin wurde in den transfizierten Zellen mit Hilfe der Durchlusszytometrie untersucht. Die BCRP überexprimierenden Klone 6 und 8 zeigten eine verringerte Akkumulation und Retention von Daunorubicin im Vergleich zu den Vektor-transfizierten Kontrollen (4B), wobei die intrazellulären stationären Konzentrationen des Arzneimittels in den Klonen 8 und 6 etwa 30% bzw. 50% dessen war, was in den Vektor-Kontrollzellen erzielt wurde. Dieser Unterschied war nicht auf Unter schiede in dem Zellvolumen zurückzuführen, da die Volumina der überprüften BCRP-überexprimierenden Sublinien nicht geringer waren, als das der leeren Vektor-transfizierten Kontrollzellen. Die Zellvolumina, die mit Hilfe eines Coulter Channelyzer^TM gemessen wurden, sind 2515 ± 56, 3074 ± 112 und 2459 ± 56 μm³ für den MCF-7/BCRP Klon 6, den MCF-7/BCRP Klon 8 bzw. die MCF-7/pcDNA3 Vektor-Kontrollzellen. Diese Werte sind vergleichbar mit unseren früheren Messergebnissen der MCF-7 Zellvolumina (5).
Die Sensitivitäten der verschiedenen transfizierten Sublinien gegenüber chemotherapeutischen Mitteln wurden mit Hilfe des Sulforhodamin-B (SRB) Zytotoxizitäts-Assays (14) getestet. Die LC₅₀, die als Konzentration des Arzneimittels definiert ist, die eine Lethalität von 50% der Zellen verursacht, wurde berechnet. Davon ausgehend wurde die "X-fache Resistenz, Fold of Resistance" (RF) berechnet, indem die LC₅₀ für ein bestimmtes Arzneimittel gegen eine transfizierte Zelllinie durch die LC₅₀ dieses Arzneimittels gegen nicht-transfizierte MCF-7 Zellen dividiert wurde. Die BCRP-überexprimierenden Klone 6 und 8 zeigten eine Resistenz gegen Mitoxantron, Daunorubicin und Doxorubicin im Vergleich zu nicht-BCRP-überexprimierenden Zellen des Klon 19, MCF-7 Zellen oder mit leerem Vektor transfizierte Kontrollen (4C, 4D, 5). 5 enthält die medianen LC₅₀-Werte aus Mehrfach-Zytotoxizitäts-Experimenten für sämtliche getesteten Zelllinien und Arzneimittel. 4D zeigt typische LC₅₀-Studien für die sechs Arzneimittel, die für MCF-7/W Zellen und Zellen des MCF-7/pcDNA3 BCRP Klons 8 getestet wurden, um die Daten, aus denen die LC₅₀-Werte stammten, sowie die Exaktheit der Messungen darzustellen. Der Stern und die durchgezogene Linie in 4D zeigt MCF-7/W Zellen, die ausgefüllten Quadrate und gestrichelten Linien stellen Zellen des MCF-7/pcDNA3 BCRP Klons 8 dar. Die vertikalen Balken in der Figur stellen die Standardabweichungen von sechs Wiederholungsbestimmungen dar.
Wie die MCF-7/AdrVp Zellen zeigten die MCF-7/BCRP-Transfektanten Klone 6 und 8 den höchsten Resistenzgrad gegenüber Mitoxantron. Das Muster der Kreuzresistenz, das von den BCRP-überexprimierenden transfizierten Zellen gezeigt wurde, ist demjenigen sehr ähnlich, dass von den MCF-7/AdrVp Zellen gezeigt wird, außer dass MCF-7/AdrVp Zellen eine größere relative Resistenz gegenüber allen zytotoxischen Arzneimitteln im Phänotyp aufweisen. Die BCRP-transfizierten Klone 6 und 8 blieben relativ sensitiv gegenüber Idarubicin, Cisplatin und Paclitaxel (Taxol), wie es auch MCF-7/AdrVp Zellen sind (4C, 4D und 5).
Um die Wirkungen der ATP-Depletion auf die Retention von Rhodamin 123 durch die BCRP-transfizierten Zellen im Vergleich zu Kontrollen zu bestimmen, wurden die Zellen in Vollmedium oder unter ATP-depletierten Bedingungen inkubiert. Die MCF-7 Zellen wurden durch Inkubation in glukosefreiem DMEM, das 50mM 2-Deoxy-D Glukose und 15mM Natriumazid enthielt, für 20 Minuten (37°C) ATP-depletiert. Rhodamin 123 wurde für weitere 30 Minuten dazugegeben (0,5 μg/ml Endkonzentration). Die Zellen wurden auf Eis platziert, das Rhodamin wurde weggewaschen, und die Zellen wurde unter ATP-depletierten Bedingungen für weitere 30 Minuten inkubiert, und die Rhodamin-Retention wurde mit Hilfe der Durchflusszytometrie bestimmt (Anregung 488nm, Emission 520nm). Dies zeigt, dass die Transporterfunktion von BCRP von ATP abhängig zu sein scheint.
Beispiel 11: Expression von BCRP in Blasten von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML), wie sie mit Hilfe eines Reverse-Transkription-Polymerase-kettenreaktion (RT-PCR)-Assay nachgewiesen wurde.
Die RT-PCR Assays wurden unter Verwendung einer Abwandlung der zuvor für Beta-Actin und MRP beschriebenen Assays (10) durchgeführt, außer dass anstelle von MRP-Primern verwendet wurden, die spezifisch für BCRP sind. Für BCRP waren die verwendeten Primer (Sense) 5'-TTA GGA TTG AAG CCA AAG G-3' (SEQ ID NR. 5), und (Antisense) 5'-TAG GCA ATT GTG AGG AAA ATA-3' (SEQ ID NR. 6). Das 5'-Ende des Sense-Primers beginnt bei Nukleotidposition 1727 der BCRP cDNA (SEQ ID NR. 2 und 2C); das 3'-Ende der Antisense-Sonde entspricht der Position 2152 der BCRP cDNA (2C). Die Endkonzentrationen der verwendeten Primer betrugen 200 nM. Die für die PCR verwendete Magnesium-Endkonzentration war 700 μM. Fünfunddreissig Zyklen Denaturierung (94°C, 1 Minute), Annealing (50°C, 1 Minute) und Elongation (72°C, 2 Minuten) wurden durchgeführt. Nach einer Agarose-Gelelektrophorese eines Aliquots der PCR-Reaktionsmischung wurden die Gele auf Nitrozellulose transferriert, und ein Southern Blotting wurde, wie zuvor beschrieben (12), unter Verwendung des 795 bp langen PCR-Produktes des Klons 8 (5'-Ende mit ³²P-dCTP markiert) als Sonde für BCRP durchgeführt. Die erwartete Länge des PCR-Produktes ist 446 bp.
Zelluläre Gesamt-RNA wurde aus den Blasten von 14 Patienten mit AML erhalten. Kontrollen wurden unter Verwendung verschiedener Volumina der PCR-Reaktionsmischung durchgeführt, die mit revers transkribierter MCF-7/W RNA durchgeführt wurde. Die Er gebnisse dieser Kontrollen und der RT-PCR-Assays der Blastenproben aus Patienten sind in 7 gezeigt. Diese Kontrollen, die RNA von MCF-7/W Zellen verwenden, zeigen, dass das von uns entwickelte RT-PCR-Assay quantitativ ist. In 7 ist zu beachten, dass einige Patienten sehr geringe Expressionsmengen von BCRP aufweisen, während andere (Patienten 3, 4, 5 und 7) Expressionslevel aufweisen, die vergleichbar mit oder höher als die von MCF-7/W Zellen sind. Diese Variationen bei der Expression von BCRP in Blastenproben von AML-Patienten lässt die Möglichkeit offen, dass diejenigen Patienten, die eine relativ starke Expression von BCRP aufweisen, gegenüber einer Behandlung mit anti-neoplastischen Arzneimitteln, die für die durch BCRP verursachte Resistenz empfänglich sind (Anthracycline und Mitoxantron) resistenter sind. Mitoxantron und das Anthracyclin Daunorubicin sind wichtige Arzneimittel, die bei der Behandlung von AML verwendet werden.
Beispiel 12: Northern Blot Hybridisierung in verschiedenen Krebszelllinien
Zelluläre Gesamt-RNA wurde für die Northern Analyse in sämtlichen Fällen außer für H209 oder H69 Zellen verwendet, bei denen die Poly A⁺ RNA verwendet wurde. Die RNA-Extraktion und das Northern Blotting wurden mit Hilfe von Standardmethoden durchgeführt und wie in Beispiel 4 beschrieben. Ein 795 bp langes Fragment (Klon 8, SEQ ID NR. 7) von dem 3'-Ende der 2418 bp langen BCRP cDNA wurde als Hybridisierungssonde verwendet, nachdem eine Markierung mit [³²P]-dCTP durchgeführt wurde ("Prime-a-Gene" Labelling Kit, Promega, Madison, WI). Um die Variationen bei der Probenbeladung zu überprüfen, wurden die Blots gestripped und anschließend mit ³²P-markierten β-Actin- oder 18S RNA-Sonden rehybridisiert.
8A zeigt die Ergebnisse der Northern Blot Hybridisierung der mRNA aus MCF-7 Zellen (Spur 1), MCF-7/MITOX (Spur 2), 8226/W Zellen (Spur 3) und 8226/MR20 (Spur 4). Der Blot wurde mit einer 795-bp langen cDNA (Klon 8, SEQ ID NR. 7) nach der Markierung mit ³²P-dCTP (obere Abbildung) auf BCRP untersucht. Um die gleichmäßige Probenbeladung zu überprüfen, wurde der Blot gestrippt und erneut auf β-Actin untersucht (untere Abbildung).
8B zeigt die Ergebnisse einer Northern Blot Hybridisierung von mRNA aus S1/M1-3.2 Zellen (Spur 1), S1/W Zellen (Spur 2), MCF-7/W Zellen (Spur 3), MCF-7/MX_PR Zellen (Spur 4), MCF-7/MX_RS250 Zellen (Spur 5), MCF-7/MX_RS600 Zellen (Spur 6), MCF-7/VP (MRP+) Zellen (Spur 7), MCF-7/Adr (Pgp+) Zellen (Spur 8), MCF-7/MTX (DHFR+) Zellen (Spur 9), MCF-7/AdrVp1000 (BCRP+) Zellen (Spur 10). Der Blot wurde wie für 8A beschrieben, mit Sonden untersucht.
8C zeigt einen Northern Blot Hybridisierung von mRNA aus humanen Colonkarzinomzellen HT29 (Spur 1), HT29RNOV Zellen (Spur 2), humanen Brustkarzinomzellen MDA-MB-231 (Spur 3), MDA-MB-231RNOV Zellen (Spur 4), humanen Fibrosarkomzellen EPF86-079 (Spur 5), EPF86-079RNOV Zellen (Spur 6), humanen Magenkarzinomzellen EPG85-257 (Spur 7), EPG85-257RNOV Zellen (Spur 8), EPG85-257RDB (Pgp+) Zellen (Spur 9), humanen Pankreaskarzinom EPP85-181 Zellen (Spur 10), EPP85185-181RNOV Zellen (Spur 11) und EPP85-181RDB (Pgp+) Zellen (Spur 12). Die Blots wurden wie oben für 8A beschrieben, mit Sonden untersucht.
Beispiel 13: Southern Blot Hybridisierung
Die genomische DNA wurde unter Verwendung von Standardmethoden (8) aus den elterlichen Arzneimittel-sensitiven MCF-7/W Zellen (Spuren 1, 7), MCF-7/MX_PR Zellen (Spuren 2, 8), MCF-7/MX_RS250 Zellen (Spuren 3, 9), MCF-7/MX_RS600 Zellen (Spuren 4, 10), MCF-7/VP Zellen (überexprimieren MRP, Spuren 5, 11) und MCF-7/MTX Zellen (erhalten ihre Resistenz durch Überexpression von DHFR, Spuren 6, 12) isoliert, mit EcoR1 oder BamH1 verdaut, mit Hilfe einer 0,8% Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt, mit Ethidiumbromid gefärbt, auf einen Nitrozellulosefilter transferriert und unter Verwendung von Standardmethoden fixiert (8). Der Filter wurde mit der [³²P]-markierten 795 bp BCRP Sonde, wie oben für 8 beschrieben, hybridisiert (9, obere Abbildung). Die mit Ethidiumbromid gefärbte 0,8% Agarose-Gelelektrophorese der genomischen DNA nach dem Verdau mit den Restriktions-Endonukleasen und vor dem Transfer auf den Nitrozellulosefilter zeigte eine etwa gleichmäßige Beladung mit Proben (9, untere Abbildung).
Beispiel 14: Die Wirkungen von Fumitremorgin C (FTC) auf BCRP-transfizierte Zellen
MCF-7 Zellen, die entweder mit dem leeren pcNA3 Vektor transfiziert wurden oder mit pcDNA3, der die vollständig lange BCRP cDNA enthielt (Transfektant Klon 8) wurden als Monolayer in Gewebskulturflaschen kultiviert. Die Wirkungen von FTC auf die Akkumulation des Aza-Anthrapyrazols BBR3390 wurden gemessen, in dem diese Zellen in Ge genwart oder Abwesenheit von 10 μM FTC für 60 Minuten dem fluoreszenten Aza-Anthrapyrazol BBR3390 (5 μM) ausgesetzt wurden. Anschließend wurden die Zellen mit Hilfe der Trypsinierung aus den Flaschen entfernt, und der intrazelluläre Gehalt an BBR3390 wurde mit Hilfe der Durchflusszytometrie gemessen. Die Wirkungen von FTC auf die Retention von BBR3390 wurden gemessen, indem eine weitere Reihe von Zellen (Vektorkontrolle und Transfektant Klon 8) mit und ohne 10 μM FTC für 60 Minuten 5μM BBR3390 ausgesetzt wurden, das Arzneimittel durch Waschen der Zellen entfernt wurde, und die Zellen für weitere 30 Minuten in frischem Medium mit und ohne FTC inkubiert wurden. Der intrazelluläre Gehalt an BBR3390 wurde mit Hilfe der Durchflusszytometrie gemessen (siehe 10).
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Sequenzprotokoll

Claims

Polypeptid, das die Sequenz der SEQ ID NR:1 hat (Brustkrebs-Resistenz-Protein, Breast Cancer Resistance Protein, BCRP), das eine Resistenz gegenüber chemotherapeutischen Arzneimitteln für Krebs in Brustkrebszellen induziert.
Das Polypeptid gemäß Anspruch 1, das eine Länge von etwa 655 Aminosäuren hat.
Das Polypeptid gemäß Anspruch 1, das ein Molekulargewicht von 72,3 Kilodalton hat.
Ein Antikörper, der an das Polypeptid gemäß Anspruch 1 bindet.
Der Antikörper gemäß Anspruch 4, der monoklonal ist.
Der Antikörper gemäß Anspruch 4, der polyklonal ist.
Eine Nukleinsäuresequenz, die für das Polypeptid gemäß Anspruch 1 kodiert.
Die Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 7, die die Sequenz in SEQ ID NR:2 ist.
Eine Nukleinsäure, die die Nukleotidsequenz der SEQ ID NR:2 umfasst.
Eine Antisense-Sonde, die die Expression des Polypeptids gemäß Anspruch 1 inhibiert.
Die Antisense-Sonde gemäß Anspruch 10, die der komplementäre Strang der Sequenz in SEQ ID NR:7 ist.
Ein Verfahren zur Bestimmung der Ursache einer Resistenz eines Patienten gegenüber chemotherapeutischen Arzneimitteln für Krebs durch Untersuchen der Expression des Polypeptids gemäß Anspruch 1 in vitro, wobei die Überexpression des genannten Polypeptids anzeigt, dass es die Ursache ist.
Verwendung des Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6 zur Herstellung eines Medikamentes zum Inhibieren der Aktivität des Brustkrebs-Resistenz-Proteins.
Verwendung der Sonde gemäß Anspruch 11 zur Herstellung eines Medikamentes zum Inhibieren der Aktivität des Brustkrebs-Resistenz-Proteins.
Verwendung des Antikörpers gemäß Anspruch 4 zur Herstellung eines Medikamentes zur Verstärkung der Chemotherapiebehandlung eines Krebspatienten.
Verwendung der Sonde gemäß Anspruch 11 zur Herstellung eines Medikamentes zur Verstärkung der Chemotherapiebehandlung eines Krebspatienten.
Verwendung von Fumitremorgin C zur Herstellung eines Medikamentes zur Verstärkung der Chemotherapiebehandlung eines Brustkrebspatienten.