ES2284243T5 - Proteína de resistencia de cáncer de mama (BCRP) y el ADN que la codifica - Google Patents

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

DESCRIPCION

Protema de resistencia de cancer de mama (bcrp) y el adn que la codifica

Esta solicitud se basa en el documento de Estados Unidos Provisional 60/073763, presentado el 2/5/98. Campo de la invencion

La invencion se refiere a la familia de protemas conocida como protemas de resistencia a multiples farmacos. Estas protemas son transportadores xenobioticos que confieren resistencia a farmacos quimioterapeuticos contra el cancer. La invencion describe un nuevo miembro proteico de esta familia llamado Proteina de Resistencia de Cancer de Mama (BCRP) y el ADN que la codifica.

Antecedentes de la invencion

El desarrollo de resistencia a multiples farmacos quimioterapeuticos frecuentemente sucede durante el tratamiento del cancer. Dos protemas transportadoras xenobioticas transmembrana, P-glicoprotema (Pgp) y la proteina de resistencia a multiples farmacos (MRP) son capaces de causar resistencia a multiples farmacos cuando se introducen por transfeccion en celulas sensibles a farmacos en cultivo (1,2). A pesar de esto, el papel que estos transportadores desempenan en la resistencia a farmacos clmicos mostrado por canceres humanos no esta claro, y se han buscado mecanismos alternativos o adicionales de resistencia a farmacos funcionales en esta enfermedad.

Para abordar este problema, Chen et. al. (3) seleccionaron celulas MCF-7 de carcinoma de mama humano para la resistencia a la antraciclina doxorrubicina en presencia de verapamil, un inhibidor de Pgp. La sublmea resistente a multiples farmacos resultante, MCF-7/AdrVp, muestra una marcada resistencia cruzada a otras antraciclinas (daunorrubicina [DNR], 3'-desamino-3'[3-ciano-4-morfolinil] doxorrubicina, pero no idarrubicina), y a la antracenodiona mitoxantrona, pero permanece sensible a los alcaloides de la vinca, paclitaxel (3,4) y cisplatino. Las celulas MCF-7/AdrVp no sobreexpresan Pgp o MRP, a pesar de presentar una reduccion marcada en la acumulacion intracelular de la antraciclina daunorrubicina y el colorante fluorescente rodamina 123 en comparacion con las celulas MCF-7 (4,5). Las celulas MCF- 7/AdrVp no presentan una alteracion en la distribucion subcelular del farmaco (4) tal como se observa en ciertas celulas que sobreexpresan MRP. Aunque la acumulacion disminuida de daunorrubicina en celulas MCF-7/AdrVp no se invierte por el antagonista de P-glicoprotema clasico ciclosporina A, el agotamiento de ATP provoca la eliminacion completa del flujo anormal tanto de daunorrubicina como de rodamina (4).

La necesidad de la tecnica de dilucidar el mecanismo de resistencia a farmacos sigue existiendo, ya que la quimioterapia sigue siendo el metodo principal para tratar de forma no invasiva muchos tipos de cancer. Tambien existe la necesidad en la tecnica de contrarrestar el mecanismo de resistencia a farmacos para proporcionar de este modo un transcurso mas largo y mas eficaz de tratamiento con farmaco quimioterapeutico para pacientes con cancer.

Sumario de la Invencion

El descubrimiento descrito en la presente invencion cumple las necesidades anteriores. El descubrimiento de la BCRP y su gen correspondiente avanza enormemente el conocimiento en la tecnica sobre el mecanismo de resistencia a farmacos proporcionando un nuevo transportador xenobiotico que esta sobreexpresado en una diversidad de lmeas celulares de cancer humano resistentes a farmacos, y confiere resistencia a muchos agentes quimioterapeuticos.

BCRP es una proteina de aproximadamente 655 aminoacidos y esta codificada por un gen que tiene un ADNc de aproximadamente 2418 nucleotidos. La proteina muestra actividad y tiene una homologfa de secuencia que la coloca en la superfamilia del casete de union a ATP (ABC) de protemas transportadoras. La masa molecular es de aproximadamente 72,3 kilodalton (kD) exclusiva de cualquier glicosilacion. La expresion de BCRP en celulas de cancer humano sensibles a farmacos confiere resistencia a mitoxantrona, doxorrubicina, y daunorrubicina, y reduce la acumulacion de daunorrubicina en las celulas transfectadas clonadas.

Un objeto de la presente invencion es proporcionar una protema de mairnfero que sea una protema resistente a multiples farmacos (MDR) y un transportador xenobiotico, y se llama protema de resistencia de cancer de mama (BCRP).

Tambien es un objeto de la presente invencion proporcionar el gen y/o el ADNc que codifica dicha protema MDR de mam^era.

Otro objeto de la invencion es proporcionar fragmentos antisentido del gen de BCRP que inhiba la expresion de la BCRP in vivo.

Otro objeto mas de la presente invencion es proporcionar un metodo para usar sondas derivadas del gen de BCRP como una herramienta de diagnostico para cuantificar la expresion genica o amplificacion genica en muestras tomadas de pacientes con cancer.

Otro objeto de la invencion es proporcionar anticuerpos contra la BCRP.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Otro objeto mas de la invencion es proporcionar un metodo para invertir la resistencia a farmacos de las celulas cancerosas administrando anticuerpos contra BCRP.

Otro objeto mas de la invencion es proporcionar un metodo para invertir la resistencia a farmacos de las celulas cancerosas administrando Fumitremorgina C.

Otro objeto de la invencion es proporcionar un metodo para potenciar un tratamiento de quimioterapia del paciente para cancer de mama administrando anticuerpos al paciente para inhibir la actividad de resistencia de BCRP.

Estos y otros objetos de la invencion, que seran evidentes a partir de la descripcion detallada de la invencion proporcionada a continuacion en este documento, se han cumplido, en una realizacion, por BCRP sustancialmente pura y el gen que codifica BCRP.

Breve Descripcion de los Dibujos

La Figura 1A es una autorradiograffa de las huellas geneticas de ARN de celulas MCF-7.

La Figura 1B es una autorradiograffa de una hibridacion de transferencia de Northern de ARNm de celulas MCF-7/W, MCF-7/AdrVp, y MCF-7/AdrVpPR.

La Figura 1C es una autorradiograffa de una hibridacion de transferencia de Southern genomica de ADN de celulas MCF-7/AdrVp, MCF-7/W y MCF-7/AdrVpPR.

La Figura 2A es la secuencia de aminoacidos deducida de BCRP con motivos.

La Figura 2B muestra la similitud relativa de BCRP con miembros seleccionados de la superfamilia de transportadores ABC.

La Figura 2C es la secuencia de ADNc que codifica la BCRP.

La Figura 2D es un grafico de un filograma que muestra la evolucion de la secuencia de aminoacidos de BCRP en relacion con ciertos miembros diferentes de la familia ABC de protemas transportadoras.

La Figura 3 muestra una autorradiograffa de una transferencia de Northern de multiples tejidos.

La Figura 4A es una autorradiograffa de una transferencia de Northern de subclones de transfectantes BCRP.

La Figura 4B es un grafico de la acumulacion y la retencion de Daunorrubicina (DNR) en las celulas de control del vector pcDNA3 y los clones 6 y 8 transfectados con BCRP.

La Figura 4C muestra los factores de resistencia relativa-MCF-7, los controles de vector, los clones 19, 6, y 8.

La Figura 4D son graficos que muestran el efecto de diversas concentraciones de farmacos quimioterapeuticos sobre la supervivencia de celulas del clon 8 de MCF-7 transfectadas con BCRP.

La Figura 4E muestra un grafico de los efectos del agotamiento de ATP de la retencion de rodamina 123 por celulas MCF-7 transfectantes/pcDNA3 (control de vector vado) o MCF-7/BCRP clon 8.

La Figura 5 es una tabla que muestra el efecto de diversos farmacos quimioterapeuticos sobre celulas MCF-7 transfectadas con BCRP.

La Figura 6 es una autorradiograffa que muestra la expresion del gen o Humano en celulas MCF-7 detectadas por la reaccion en cadena de la polimerasa de transcripcion inversa (RT-PCR).

La Figura 7 es una autorradiograffa que muestra la expresion de BCRP en muestras de celulas blasticas de pacientes con leucemia mielogenica aguda.

Las Figuras 8A, 8B y 8C son autorradiograffas que muestran los resultados de hibridaciones de transferencia de Northern de ARNm de diversas lmeas celulares resistentes a farmacos sondeadas con una sonda de BCRP.

La Figura 9 es una autorradiograffa de una hibridacion de transferencia de Southern de diversas lmeas celulares MCF-7.

La Figura 10 es un grafico que muestra los resultados de la administracion de FTC a celulas transfectadas con BCRP.

Descripcion Detallada de la Invencion

Se describe un nuevo gen y la protema codificada por dicho gen, llamada la Protema asociada a Resistencia de Cancer de Mama (BCRP) en la presente invencion. Se muestra que la BCRP se sobreexpresa en celulas humanos de carcinoma de mama, carcinoma de colon, carcinoma gastrico, fibrosarcoma, y origen de mieloma resistentes a multiples farmacos (MDR). La BCRP es un transportador xenobiotico que confiere resistencia a multiples farmacos quimioterapeuticos, y pertenece a la superfamilia de transportadores ABC. La BCRP parece ser responsable de la alteracion en el transporte

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

de farmacos y la resistencia a farmacos manifestada por diversas celulas cancerosas.

La presente invencion pertenece parcialmente a la BCRP, a fragmented de este factor, asf como derivados funcionales, agonistas y antagonistas, y productos de descomposicion metabolica de este factor. La secuencia de aminoacidos de BCRP se representa en la SEC ID N° 1 y la Figura 2A. La invencion se refiere especialmente a agentes que son capaces de inhibir BCRP, preferiblemente anticuerpos contra BCRP o sondas antisentido para el gen de BCRP. Se divulgan adicionalmente agentes qmmicos que inhiben la expresion del gen o ARNm de BCRP, incluyendo Fumitremorgina C (FTC). Se divulgan metodos para inhibir la actividad de BCRP o la expresion del gen de BCRP administrando dichos agentes.

Un “derivado funcional” de BCRP es un compuesto que tiene una actividad biologica (funcional o estructural) que es sustancialmente similar a una actividad biologica de BCRP. La expresion “derivados funcionales” pretende incluir los “fragmentos”, “variantes”, “analogos”, o “derivados qmmicos” de una molecula. Se entiende que un “fragmento” de una molecula tal como BCRP, se refiere a cualquier subconjunto polipeptidico de la molecula. Un fragmento funcional significa una molecula con una secuencia de aminoacidos similar, pero no identica, pero que tiene la misma funcion de la BCRP de longitud completa. Se entiende que una “variante” de una molecula tal como BCRP se refiere a una molecula sustancialmente similar en estructura y funcion a la molecula completa, o a un fragmento de la misma. Se dice que una molecula es “sustancialmente similar” a otra molecula si ambas moleculas tienen estructuras sustancialmente similares o si ambas moleculas tienen una actividad biologica similar.

Por tanto, con la condicion de que dos moleculas tengan una actividad similar, se consideran variantes ya que este termino se usa en este documento incluso si la estructura de una de las moleculas no se encuentra en la otra, o si la secuencia de restos aminoaddicos no es identica. Se entiende que un “analogo” o agente que imita la funcion de una molecula tal como BCRP se refiere a una molecula sustancialmente similar en funcion pero no en estructura a la molecula completa o a un fragmento de la misma. Como se usa en este documento, se dice que una molecula es un “derivado qmmico” de otra molecula cuando contiene restos qmmicos adicionales que normalmente no son parte de la molecula. Dichos restos pueden mejorar la solubilidad, absorcion, vida media biologica, etc. de la molecula. Los restos pueden disminuir alternativamente la toxicidad de la molecula, eliminar o atenuar cualquier efecto secundario indeseable de la molecula, etc. Los restos capaces de mediar dichos efectos se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences (1980). Se conocen bien en la tecnica procedimientos para acoplar dichos restos a una molecula.

Un “antagonista” de BCRP es un compuesto que inhibe la funcion de BCRP. Dichos antagonistas pueden ser inmunoglobulinas (tales como, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o policlonal, o fragmentos activos de dicho anticuerpo). Los antagonistas o inhibidores que son utiles para inhibir el efecto de resistencia a farmacos causado por BCRP son un anticuerpo producido contra la BCRP o el farmaco fumitremorgina C (FTC), una micotoxina. Se obtuvo FTC del Dr. Lee Greenberg en Wyeth-Ayrest Laboratories en Pearl River, Nueva York.

Puede prepararse un anticuerpo policlonal capaz de unirse a BCRP inmunizando un animal con una preparacion de BCRP o derivado funcional de BCRP. Los metodos para conseguir dichas inmunizaciones son bien conocidos en la tecnica. Tambien pueden emplearse anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos para ensayar la presencia o cantidad de BCRP en una muestra biologica particular. Dichos anticuerpos pueden producirse inmunizando esplenocitos con BCRP activada (7). Los anticuerpos de union a BCRP de la presente invencion pueden administrarse a pacientes para reducir la resistencia a farmacos quimioterapeuticos, y por tanto para potenciar su tratamiento. Los metodos de administracion dependeran de las circunstancias particulares de cada paciente individual y pertenecen a las capacidades de los especialistas en la tecnica.

La BCRP de la presente invencion puede obtenerse por procesos naturales (tales como, por ejemplo, induciendo la produccion de BCRP de una celula humana o animal); por metodos sinteticos (tales como, por ejemplo, usando el metodo de Merrifield sintetizando polipeptidos para sintetizar BCRP, derivados funcionales de BCRP, o agonistas o antagonistas de BCRP (inmunoglobulina o no inmunoglobulina); o por la aplicacion de tecnologfa recombinante (tal como, por ejemplo, para producir la BCRP de la presente invencion en diversos hospedadores, por ejemplo, levaduras, bacterias, hongos, celulas de mamffero cultivadas, por nombrar algunos, o de plasmidos recombinantes o vectores virales). Se dice que los compuestos de la presente invencion estan “sustancialmente libres de contaminantes naturales” si las preparaciones que los contienen estan sustancialmente libres de materiales con los que estos productos se encuentran de forma normal y natural.

La eleccion del metodo a emplear dependera de factores tales como la conveniencia, rendimiento deseado, etc. No es necesario emplear solo uno de los metodos, procesos, o tecnologfas descritos anteriormente para producir BCRP; los procesos, metodos y tecnologfas descritos anteriormente pueden combinarse para obtener BCRP. Es mas preferible preparar BCRP expresando el gen o secuencia de ADNc que codifica la protema BCRP. Dicho gen o secuencia de ADNc se llamara a partir de ahora el “gen de BCRP” o “secuencia de ADNc de BCRP”.

Se empleo la tecnica de huella genetica de ARN para clonar el ADNc de BCRP. La formacion de huellas

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

geneticas de ARN usa la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) y pares de cebadores degenerados para amplificar el ARNm celular. Esta tecnica se basa en modificaciones de la tecnica de “Presentacion Diferencial de ARNm” desarrollada por Liang y Pardee (6). Se usaron estas tecnicas como un medio para descubrir genes que se expresan de forma diferencial en lmeas celulares seleccionadas por farmacos en comparacion con celulas parentales. La diferencia principal entre la Huella Genetica de ARN y la Presentacion Diferencial es que el protocolo de huella genetica de ARNm usa una unica reaccion de smtesis de ADNc, seguida por amplificacion con cebadores cadena arriba y cadena abajo. La Presentacion Diferencial usa de 9 a 12 smtesis de ADNc para cada muestra de ARN con un cebador oligo(dT) anclado, seguido por la amplificacion con un cebador cadena arriba.

El gen de BCRP clonado, obtenido a traves de los metodos descritos anteriormente y en los ejemplos, puede unirse de forma operativa a un vector de expresion, e introducirse en celulas bacterianas, o eucariotas para producir la protema BCRP. Las tecnicas para dichas manipulaciones se describen en Maniatis, T. et al. supra, y son bien conocidas en la tecnica (8).

La secuencia de ADNc de BCRP es de aproximadamente 2418 nucleotidos de longitud. El ADNc de BCRP se representa en la SEC ID N° 2 o Figura 2C. El ADNc de BCRP puede usarse para expresar la BCRP. Ademas, la secuencia de ADNc de BCRP, o una parte de la misma, puede usarse como sonda en un ensayo de transferencia de Northern o para la seleccion de sondas en un ensayo de RT-PCR para medir el ARNm de BCRP en diversas muestras tisulares. La medicion de la expresion de BCRP por transferencia de Northern o ensayo de RT-PCR puede ser determinante de la respuesta al farmaco para farmacos quimioterapeuticos en el tiempo. Las tecnicas para estos ensayos se describen en los ejemplos y son bien conocidas en la tecnica (8). Por lo tanto, dicho ensayo podna usarse para determinar si el fallo de un paciente para responder a la quimioterapia se debe a la sobreexpresion de BCRP, y por tanto la resistencia a los farmacos. Ademas, podnan desarrollarse sondas antisentido basadas en la secuencia de ADNc representada en la SEC ID N° 2 y la Figura 2C. Estas sondas pueden administrarse a pacientes para que se unan al ADNc de BCRP de forma endogena y por tanto para inhibir la expresion de la BCRP. Dicha terapia podna usarse para detener o ralentizar la propension del paciente a llegar a ser resistente a los farmacos quimioterapeuticos y por tanto hacer al tratamiento mas eficaz. Las tecnicas para la produccion y administracion de sondas antisentido son bien conocidas en la tecnica. Las tecnicas de hibridacion de acido nucleico y clonacion son bien conocidas en la tecnica (8).

Los datos presentados en los ejemplos y las figuras correspondientes apoyan enormemente la conclusion de que el nuevo miembro BCRp de la familia ABC presentado en este documento es un transportador xenobiotico que es principalmente responsable del fenotipo resistente a farmacos de celulas MCF- 7/AdrVp.

En la presente invencion tambien se muestra la sobreexpresion de BCRP en varias lmeas celulares cancerosas. Estas lmeas celulares incluyen celulas de carcinoma de colon S1, HT29, celulas de carcinoma gastrico EPG85-257, celulas de fibrosarcoma EPR86-079, y celulas de mieloma 8226. La sobreexpresion del ARNm de BCRP en cada una de estas lmeas celulares, y la amplificacion del gen de BCRP en las celulas resistentes a farmacos demuestran un importante papel de BCRp en la resistencia a agentes citotoxicos. Ademas, la sobreexpresion impuesta de BCRP en celulas MCF-7 disminuyo la acumulacion celular de daunorrubicina y confirio un patron de resistencia cruzada a farmacos a las celulas transfectadas que era casi identico al de las celulas MCF-7/AdrVp. El grado de sobreexpresion de BCRP en los clones transfectantes 6 y 8 se correlaciona con las alteraciones en el nivel de estado estacionario intracelular de daunorrubicina y su grado de resistencia a mitoxantrona, daunorrubicina y doxorrubicina.

Una diferencia principal entre los clones transfectantes que sobreexpresan BCRP y la sublmea MCF- 7/AdrVp original es que el grado de resistencia a farmacos en la ultima es mayor que en las celulas transfectadas, mientras que los niveles de ARNm de BCRP en estado estacionario en cada una son comparables (Figura 4A). Varias posibilidades pueden contribuir a esta diferencia. Las diferencias en la estabilidad proteica y/o localizacion pueden contribuir al fenotipo resistente a farmacos completo, o puede requerirse la expresion de otras protemas. Recientemente, se informo de que miembros de la familia de antfgenos carcinoembrionarios (CEA), principalmente el antfgeno de reaccion cruzada no espedfica (NCA) y el propio CEA, estan marcadamente sobreexpresados en la superficie celular de celulas MCF- 7/AdrVp y MCF-7/AdrVpPR en comparacion con celulas MCF-7 sensibles a farmacos (15). Una elevada densidad de estas glicoprotemas acidas en la superficie celular puede protonar farmacos tales como mitoxantrona, daunorrubicina o doxorrubicina que evita la entrada en la celula. De hecho, Kawaharata, et. al. (16) informaron de que la expresion impuesta de CEA en celulas NIH3T3 transfectadas provoca tanto la acumulacion disminuida como la resistencia a doxorrubicina en las celulas transfectadas. Por tanto, la sobreexpresion relativa de los miembros de la familia de CEA en la superficie de celulas MCF-7/AdrVp podna funcionar junto con BCRP para causar mayor resistencia a mitoxantrona, doxorrubicina y daunorrubicina que la causada por BCRP sola. Esta hipotesis podna ensayarse co-transfectando la sublmea MCF-7/BCRP-clon 8 con un vector de expresion que contenga NCA o CEA.

Otra posible explicacion para el mayor grado de resistencia de celulas MCF-7/AdrVp en comparacion con los transfectantes es que BCRP es parte de un complejo transportador multiproteico. La via de translocacion de transportadores ABC tfpicos esta compuesta de dos dominios de union a ATP y dos dominios altamente hidrofobos que contienen regiones de membrana. Esto puede conseguirse en una

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

unica molecula, como es el caso de MRP o Pgp, que son dos veces el tamano de BCRP (aproximadamente 1.300 en comparacion con 655 aminoacidos). Como alternativa, el complejo activo de ciertos transportadores ABC puede formarse por la heterodimerizacion de dos protemas no identicas, cada una de las cuales contiene una unica region de union a ATP e hidrofoba. Las protemas o y marron (b) de Drosophila y las protemas Tap-1 y Tap-2 que transportan protemas de clase I de histocompatibilidad principal son ejemplos de miembros de la familia ABC que muestran dicha interaccion cooperativa. La presencia del sitio de union de fosfopantetema en BCRP sugiere que BCRP puede ser parte de un complejo multiproteico. Por tanto, es posible que BCRP tenga un cofactor o cofactores proteicos que hagan de ella un transportador mucho mas eficaz en un estado heteromerico. La activacion o sobreexpresion de este cofactor en celulas MCF-7/AdrVp con relacion a celulas MCF-7 podna explicar el transporte aumentado de farmacos en la sublmea MCF-7/AdrVp con relacion a los transfectantes de BCRP.

El descubrimiento de la expresion elevada de ARNm de BCRP en las celulas S1M1-3.2 de carcinoma de colon humano sugiere que BCRP es el transportador de farmacos “no Pgp, no MRP” manifestado por esta lmea celular resistente a multiples farmacos. Esto es de particular importancia a causa del reciente informe (25) de un inhibidor espedfico del transportador identificado en celulas S1M1-3.2. Este inhibidor, fumitremorgina C (FTC), no invierte la resistencia en celulas que sobreexpresan Pgp o MRP. La Figura 10 muestra que FTC es capaz de potenciar la acumulacion e inhibir el flujo de BBR 3390 (un farmaco aza- antrapirazol que es evacua por BCRP) en celulas MCF-7 transfectadas con BCRP.

Los siguientes ejemplos se proporcionan solamente para propositos ilustrativos y de ningun modo pretenden limitar el alcance de la presente invencion.

Ejemplos

Lineas celulares. Las celulas de carcinoma de mama MCF-7, su sublmea resistente a farmacos MCF- 7/AdrVp, y una sublmea de reversion parcialmente sensible a farmacos (MCF-7/AdrVpPR, obtenida del Dr. Antonio Fojo, Medicine Branch, National Cancer Institute), se mantuvieron en cultivo como se ha descrito previamente (5). La sublmea MCF-7/AdrVp se mantuvo de forma continua en presencia de 100 ng/ml de doxorrubicina (Pharmacia Adria, Dublin, OH) y 5 |ig/ml de verapamil (Sigma Chemicals, St. Louis, MO).

Las condiciones de crecimiento para las lmeas celulares usadas en los estudios de transferencia de Northern estan contenidas en las referencias enumeradas en la Tabla 1. Las celulas de carcinoma de colon S1M1-3.2 se obtuvieron de celulas S1 (un subclon de la lmea celular de carcinoma de colon humano LS174T) por seleccion para el crecimiento a concentraciones crecientes de mitoxantrona hasta que se consiguio una concentracion final de 3,2 |iM. Se adquirieron celulas HL-60/MX2 de la American Type Culture Collection (Manassas, VA) y se mantuvieron en cultivo como se ha descrito previamente (17).

Ejemplo 1: Smtesis de ADNc por transcripcion inversa de ARNm

Se transcribio de forma inversa el ARN celular total purificado (2 |ig) de celulas MCF-7/W, MCF-7/AdrVp o MCF-7/AdrVpPR que se habfan invertido parcialmente a la sensibilidad a farmacos por cultivo en ausencia de agentes de seleccion con 200 unidades de transcriptasa inversa de virus de la leucemia murina de Moloney en presencia de un cebador oligo(dT) (0,1 |iM), y dNTP 1 mM a 42°C durante 1 hora. Las reacciones se terminaron calentando a 75°C durante 10 minutos. Los ADNc producidos de este modo se almacenaron a -20°C hasta su uso adicional.

Ejemplo 2 Formacion de huellas geneticas de ARN

Las huellas geneticas de ARN se realizaron usando el kit de huellas geneticas de ARN Delta™ (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA) con modificaciones minoritarias. Las huellas geneticas de ARN se consiguen por amplificacion del ADNc por la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), usando cebadores aleatorios.

Para cada reaccion de huellas geneticas, se amplifico ADNc diluido 1:10 (dilucion A) o 1:40 (dilucion B) de cada lmea celular con un cebador cadena arriba (P) y uno cadena abajo (T) en presencia de dNTP 50 |iM, [33P]dATP 50 nM, y la “Advantage KlenTaq Polymerase Mix” suministrada con el kit de Clontech. Los cebadores P cadena arriba eran de 25 unidades arbitrarias. Los cebadores T cadena abajo eran cebadores oligo(dT) anclados de 30 unidades cuyo extremo 3' contema la secuencia 5'-TgN-iNr3', en la que N1 es A, C o G. El cebador P se une al ADNc en base a la homologfa casual. Se emparejaron diez cebadores P y nueve cebadores T para dar 90 posibles combinaciones.

Los primeros tres ciclos de PCR se realizaron a una rigurosidad relativamente baja (temperatura de hibridacion 40°C). A causa de esto, el cebador P se unio de forma imperfecta, que aumento la cantidad de productos amplificados. Los productos de estos primeros ciclos despues se amplificaron por 24 ciclos de PCR a elevada rigurosidad (temperatura de hibridacion 60°C). Se prepararon reacciones de control de PCR que conteman agua esteril en lugar de ADNc (control de agua), o 0,02 |ig de ARN celular total (control de ARN). Los controles de ARN se prepararon para evaluar si el ARN estaba contaminado con

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

ADN genomico.

Despues de la reaccion de PCR, se cargo una pequena cantidad de cada mezcla de reaccion en un gel de poliacrilamida al 5%, despues de lo cual se secaron los geles, despues se hicieron autorradiograffas (Figura 1A). Estas autorradiograffas demostraron un patron de “huella genetica de ARN” caractenstico de 50 a 100 bandas del producto de PCR de 100 a 2000 nucleotidos de longitud. Los carriles 1, 3, y 5 eran mezclas de reaccion en las que se habfa anadido ADNc diluido 1:10 (dilucion A); los carriles 2, 4, y 6 representan mezclas de reaccion en las que se habfa anadido ADNc diluido 1:40 (dilucion B). Los carriles 7 y 8 son “controles de H2O”, en los que se habfa anadido agua esteril a la mezcla de reaccion de PCR en lugar de ADNc. Los carriles 9, 10 y 11 son “controles de ARN”, en los que se anade 0,02 |ig de ARN celular de MCF-7/W, MCF-7/AdrVp, o MCF-7/AdrVpPR en lugar de ADNc. Estos “controles de ARN” sirven para indicar la contaminacion del ARN con ADN genomico. Las autorradiograffas se inspeccionaron para los productos de PCR que se produjeron en mayor abundancia en reacciones que usaron ARN transcrito de forma inversa de celulas MCF-7/AdrVp, en comparacion con los del ARN usado de las celulas MCF-7/W o MCF-7/AdrVpPR (Figura 1A). La FLECHA indica un producto de PCR que representa una especie de ARNm que se sobreexpresa en celulas MCF-7/AdrVp, en comparacion con las celulas MCF-7/W o MCF-7/AdrVpPR. Este es el producto de PCR que se corto del gel y se amplifico y clono usando el metodo de “Clonacion TA”, cuyo clon deseado se llamo Clon 8 (vease a continuacion).

Ejemplo 3: Amplificacion del ADNc diana por clonacion TA.

El producto de PCR sobreexpresado en celulas MCF-7/AdrVp se escindio del gel secado y se eluyo hirviendo en 40 ml de ddH2O durante 5 minutos, despues se amplifico por PCR durante 20 ciclos usando los cebadores originales y se separo en geles de agarosa al 2%/bromuro de etidio. Estos productos de PCR despues se ligaron en un plasmido “Vector de Clonacion TA”, pCR® 2.1, que despues se clono usando tecnicas convencionales para productos de PCR (Kit TA Cloning® Original, Invitrogen Corporation, San Diego, CA).

Los plasmidos pCR®2.1 que contienen el producto de PCR se usaron para transformar la cepa TOP 10F de E. coli. Se cogieron colonias bacterianas individuales y se aislo el ADN plasirffdico por minipreparaciones (Wizard™ Miniprep, Promega, Madison, WI). Se amplifico el ADN plasirffdico por PCR con los cebadores “P” y “T” originales, despues se sometieron a electroforesis en gel. La banda de tamano original se corto, y se aislo el ADN hirviendo en 100 |il de ddH2O a 100°C durante 5 minutos. Se volvio a amplificar una affcuota del ADN por PCR con los cebadores originales durante 20 ciclos. Se visualizo una unica banda en geles con bromuro de etidio que se corto, electroeluyo y despues se precipito.

Ejemplo 4 Aislamiento del clon de BCRP

Se uso el metodo de transferencia de Northern “inverso” para explorar los clones del vector TA. En resumen, se realizo un analisis de Northern “inverso” del siguiente modo. El producto de PCR aislado de 12 diferentes colonias de E. coli que estaban transformadas por el plasmido pCR2.1 se fijo por duplicado a membranas Zeta Probe (BioRad, Richmond, CA) en un aparato de slot blot. Una de las membranas duplicadas se sondeo con la mezcla de reaccion de PCR marcada con [33P] que amplifico el ADNc de MCF-7 usando los cebadores “P” y “T” originales en el kit de Huella genetica de ARN. La otra membrana se sondeo con la mezcla de reaccion de PCR paralela marcada con [33P] original que amplifico el ADNc producido por celulas MCF-7/AdrVp, usando condiciones de transferencia de Northern convencionales de hibridacion, despues de lo cual se evaluo la union de la sonda por autorradiograffa. Un unico clon TA (Clon 8 - SEC ID N° 7) se identifico de este modo cuyo inserto de producto de PCR identificaba una especie de ARN de 2,4 kb que estaba marcadamente sobreexpresada en celulas MCF-7/AdrVp, en comparacion con celulas MCF-7 (Figura 1B, panel superior). La sublmea MCF-7/AdrVpPR de reversion parcial tema una expresion intermedia de la especie de ARNm de 2,4 kb (Figura 1B, panel superior). Para controlar la equivalencia en la carga de los carriles, se separa la transferencia y despues se vuelve a sondear con ARN 18S radiomarcado (Figura 1B, panel inferior).

Se realizaron transferencias de Southern usando el producto de PCR del Clon 8. En resumen, se aislo el ADN, se digirio con EcoR1, se sometio a electroforesis en gel de agarosa, se transfirio y fijo a un filtro de nitrocelulosa. El filtro se sondeo con el producto de PCR de Clon 8 que se marco en el extremo con [32P]- dCTP, despues se hizo la autorradiograffa mostrada (Figura 1C, panel superior). Esto demostro que el gen affn para BCRP se amplificaba en celulas tanto MCF-7/AdrVp como MCF-7/AdrVpPR, en comparacion con las celulas MCF-7 parentales (Figura 1C, panel superior). El panel inferior de la Figura 1C muestra el electroforetograma del gel de agarosa tenido con bromuro de etidio del ADN genomico correspondiente despues de la digestion con EcoR1, para demostrar la equivalencia aproximada de la carga del gel.

Ejemplo 5 Secuenciacion del clon de BCRP

Se realizo la secuenciacion de los ADNc con un secuenciador de ADN automatico (Perkin Elmer, Inc., Foster City, CA). Todas las secuencias de ADN se confirmaron secuenciando en la direccion inversa. El producto de PCR expresado de forma diferencial en el Clon 8 TA se secuencio y se descubrio que era un ADNc de 795 pb (SEC ID N° 7). Las busquedas en bases de datos de protemas de la secuencia de aminoacidos deducida revelo un elevado grado de homologfa con miembros de la superfamilia ABC de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

protemas transportadoras.

Ejemplo 6 Aislamiento del ADN de BCRP de longitud completa

Se construyo una biblioteca de ADNc de MCF-7/AdrVp usando el kit de construccion de bibliotecas de ANDc por PCR CapFinder™ (Clontech) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La tecnica de CapFinder™ esta disenada espedficamente para producir ADNc bicatenario de longitud completa. El fragmento de ADNc del Clon 8 de 795 pb se radiomarco y uso como sonda para explorar la biblioteca de ADNc preparada a partir de celulas MCF-7/AdrVp. Los clones positivos aislados se sometieron a exploracion secundaria y terciaria, despues se ensayaron por hibridacion por transferencia de Northern usando ARN obtenido de celulas MCF-7, MCF-7/AdrVp y MCF-7/AdrVppR. Se encontraron multiples clones que teman insertos de 2,4 kb, el tamano aproximadamente del ARNm de BCRP sugerido por transferencia de Northern.

Se ligaron cuatro de los insertos de 2,4 kb en el plasmido pCR2.1, despues se clonaron estos vectores TA en E. coli (como se ha descrito anteriormente). Un clon del vector TA que contema un inserto del fragmento de ADNc de 2,4 kb se identifico y aislo. La secuenciacion del inserto de ADNc de 2,4 kb se realizo con un secuenciador de ADN automatico (Perkin Elmer Inc., Foster City, CA). Todas las secuencias de ADN se confirmaron por secuenciacion en la direccion inversa. Despues de secuenciar, se descubrio que el inserto de ADNc era de 2418 pb de longitud como en la Figura 2C o la SEC ID N° 2. El analisis del ADNc para las fases de lectura abierta (ORF) usando el programa “FRAMES” contenido en el paquete de software Genetics Computer Group (GCG) indico la presencia de una ORF larga que comenzaba en la posicion 239, y finalizaba con el codon de parada TAA en la posicion 2204-6. La secuencia de aminoacidos deducida de esta ORF se muestra en la Figura 2A, y la SEC ID N° 1. La protema tiene 655 aminoacidos y un peso molecular aproximado de aproximadamente 72,3 kilodalton. La protema codificada por esta secuencia se ha denominado Protema de Resistencia de Cancer de Mama, o BCRP (Figura 2A).

El analisis de la secuencia de BCRP con el programa de GCG “MOTIFS” demostro una unica region de union a ATP/GTP (11) Walker “A” en los aminoacidos 80-87 y un sitio de union a fosfopantetema en los aminoacidos 213-228 (Figura 2A). La fosfopantetema (o pantetema 4' fosfato) es el grupo prostetico de las protemas de vehroulo de acilo en algunos complejos multienzimaticos donde sirven para la union de acidos grasos activados y grupos aminoacido (12).

El examen de la estructura de BCRP con los programas de GCG “PEPPLOT” y “PLOTSTRUCTURE” revelo un dominio amino-terminal relativamente hidrofilo (aminoacidos 1-400) que contiene la secuencia de union a ATP y un dominio carboxi-terminal relativamente hidrofobo (aminoacidos 401-655), que contiene al menos tres dominios transmembrana putativos (TM1, TM2 y TM3), y cuatro sitios de N- glicosilacion potenciales (Glyc) (Figura 2A). Los dominios transmembrana se estimaron por el uso de un programa para predecir helices en protemas de membrana integradas (13). El analisis de la secuencia de BCRP por el programa de GCG “DOTPLOT” demuestra que el peptido es homologo con la mitad de la molecula Pgp o MRP duplicada, excepto que Pgp o MRP tienen la configuracion NH2-[dominios transmembrana]-[union a ATP 1]-[dominios transmembrana]-[union a ATP 2]-COOH, mientras que la de BCRP es NH2-[union a ATP]-[dominios transmembrana]-COOH. La similitud relativa de BCRP con otros miembros de la superfamilia de transportadores ABC se determino usando el programa “PILEUP” de GCG. Este analisis demostro que la secuencia peptfdica de BCRP esta relacionada solo de forma distante con la P-glicoprotema (PgP o Mdr1) o MRP (Figura 2B).

Ejemplo 7 Comparacion de la secuencia de BCRP con la secuencia de o

Se consiguieron analisis de ADNc y secuencias proteicas deducidas usando bases de datos de protemas y nucleotidos a las que se accedieron usando el Wisconsin Sequence Analysis Package Version 8 (Genetics Computer Group [GCG], Madison, WI] que estan disponibles a traves de la Frederick Cancer Research Center's Supercomputing Facility (Frederick, MD).

Una comparacion “FASTA” de la secuencia de aminoacidos de BCRP revelo un elevado grado de homologfa con al menos 50 protemas de transporte de casete de union a ATP. La mayor coincidencia fue PIR2:G02068, el homologo humano del gen blanco (o) de Drosophila, que tiene 638 aminoacidos, y es un 29,3% identico a BCRP. El gen o en Drosophila funciona en el transporte celular de guanina y triptofano, que son precursores del pigmento de la retina (9). Se descubrio que el homologo humano de o no se sobreexpresa en celulas MCF-7/AdrVp en comparacion con celulas MCF-7, como se detecta por un ensayo de PCR de transcripcion inversa (Figura 6).

El programa “Oligo” (Version 5.0, National Biosciences, Inc., Plymouth, MN) se uso para ayudar a determinar los cebadores adecuados para la deteccion del homologo humano de o por PCR de transcripcion inversa. Estos ensayos se hicieron usando una modificacion de los descritos previamente para la beta actina y MRP (10), excepto en que se usaron cebadores espedficos para el gen o en lugar de MRP. El cebador superior comienza en la posicion 5' 2136 del ARNm de o humano, y tema la secuencia 5'-CGA CCG AcG ACA CAG A-3) (SEC ID N° 3). El cebador inferior comienza en la posicion 3' 2590, y tema la secuencia 5'-CTT AAA ATG AAT GCG AtT GAT-3') (SEC ID N° 4). Para asegurar la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

uniformidad de la carga del gel, tambien se realizo un ensayo de PCR de transcripcion inversa para la beta actina. Las concentraciones finales de los cebadores usados fueron 200 nM. Se realizaron veinticinco ciclos de desnaturalizacion (94°C, 1 minuto), hibridacion (50°C, 1 minuto) y elongacion (72°C, 2 minutos). La Figura 6 muestra una electroforesis en gel de agarosa de una almuota de las mezclas de reaccion de PCR que usaron ARN de celulas MCF-7 o MCF-7/AdrVp que demuestra que tanto ro como la beta actina humanas se expresan de forma aproximadamente igual en estas lmeas celulares.

Ejemplo 8: Transferencias de Northern de diversos tejidos humanos con una sonda de BCRP (Clon 8)

Se realizo transferencia de Northern con una sonda de ADNc del Clon 8 marcado con 32P. El ARN sometido a electroforesis en gel de agarosa pretransferido de multiples tejidos se adquirio de Clontech, para su uso en multiples ensayos de transferencia de Northern tisular. (Figura 3). La mayor expresion de BCRP se observo en tejido placentario, con cantidades inferiores de expresion demostrable en cerebro, prostata, intestino delgado, testmulo, ovario, colon e hugado. Los transcritos de BCRP estuvieron por debajo del nivel de deteccion en el corazon, pulmon, musculo esqueletico, rinon, pancreas, bazo, timo y leucocitos de sangre periferica.

Ejemplo 9: Expresion de BCRP en celulas MCF-7 - Estudios Funcionales

Se inserto el ADNc de BCRP de longitud completa en el sitio de clonacion multiple del vector de expresion pcDNA3 (Invitrogen). Despues de la subclonacion de la construccion de pcDNA3-BCRP, se realizo un analisis de secuencia de ADN para confirmar que el inserto en el clon que se eligio que estaba en una orientacion con sentido respecto al promotor CMV del vector pcDNA3. Se transfectaron celulas MCF-7 con pcDNA3-BCRP, usando el metodo de precipitacion con fosfato calcico (17), seleccionadas por cultivo con geneticina (G418, 1 mg/ml), despues de subclonaron por dilucion limitante en placas de cultivo de fondo redondo de 96 pocillos. Los subclones se ensayaron para la expresion de ARNm de BCRP por analisis de transferencia de Northern, usando el ADNc del Clon 8 radiomarcado como sonda (Figura 4A). Como control, tambien se transfectaron celulas MCF-7 con el vector pcDNA3 vado, despues se seleccionaron por crecimiento en medio que contema 1 mg/ml de G418 (Figura 4A). Se seleccionaron dos clones de celulas MCF-7 transfectadas con pcDNA3-BCRP que se descubrio que sobreexpresaban BCRP (clones 6 y 8) y se expandieron para estudios adicionales (Figura 4A). Un tercer clon de las celulas transfectadas con pcDNA3-BCRP, el clon 19, no sobreexpresaba BCRP, y se selecciono para el estudio como control.

Ejemplo 10: Efecto de Farmacos Quimioterapeuticos en Celulas MCF-7 transfectadas con BCRP

Se examino la acumulacion y retencion de daunorrubicina en las celulas transfectadas mediante citometna de flujo. Los clones 6 y 8 que sobreexpresan BCRP presentaron una acumulacion y retencion disminuida de daunorrubicina, en comparacion con los controles transfectados con vector (Figura 4B), con concentraciones de estado estacionario intracelular de farmaco en los clones 8 y 6 respectivamente de aproximadamente el 30% o el 50% de las obtenidas en las celulas de control de vector. Esta diferencia no se debio a diferencias en el volumen de celulas, ya que los volumenes de las sublmeas que sobreexpresan BCRP ensayadas no era menor que la de las celulas de control transfectadas con vector vado. Los volumenes de celulas, medidos por Coulter Channelyzer™ son 2515+56, 3074+112 y 2459+56 |im3 para el clon 6 MCF-7/BCRP, clon 8 MCF-7/BCRP y las celulas de control con vector MCF-7/pcDNA3, respectivamente. Estos valores son comparables con las mediciones previas de los volumenes de celulas MCF-7 (5).

La sensibilidades de las diversas sublmeas transfectadas a los agentes quimioterapeuticos se ensayaron por el ensayo de citotoxicidad con sulforrodamina-B (SRB) (14). Se calculo la LC50 definida como la concentracion de farmaco que causaba letalidad al 50% de las celulas. A partir de esto, se calculo “Factor de Resistencia” (RF) dividiendo la LC50 para un farmaco dado frente a una lmea celular transfectada por la LC50 de ese farmaco frente a celulas mCF-7 no transfectadas. Los clones 6 y 8 que sobreexpresan BCRP presentaron resistencia a mitoxantrona, daunorrubicina y doxorrubicina, en comparacion con las celulas del clon 19 que no sobreexpresan BCRP, celulas MCF-7, o los controles transfectados con vector vado (Figuras 4C, 4D, 5). La Figura 5 contiene los valores de LC50 medios para multiples experimentos de citotoxicidad para todas las lmeas celulares y farmacos ensayados. La Figura 4D muestra estudios de LC50 tfpicos para los seis farmacos ensayados para celulas MCF-7/W y celulas MCF-7/pcDNA3-BCRP clon 8 para ilustrar los datos de los que se obtuvieron los valores de LC50, y la exactitud de las mediciones. El asterisco y la lmea continua en la Figura 4D indican celulas MCF-7/W, los cuadrados cerrados y las lmeas de puntos representan celulas del clon 8 MCF-7/pcDNA3-BCRP. Las barras verticales en la Figura representan la desviacion tfpica de seis determinaciones duplicadas.

Como las celulas MCF-7/AdrVp, los clones 6 y 8 transfectantes de MCF-7/BCRP presentaron el mayor grado de resistencia a mitoxantrona. El patron de resistencia cruzada presentada por las celulas transfectadas que sobreexpresan BCRP es muy similar al presentado por celulas MCF-7/AdrVp, excepto que las celulas MCF-7/AdrVp tienen mayor resistencia relativa a todos los farmacos citotoxicos en el fenotipo. Los clones 6 y 8 transfectados con BCRP permanecieron relativamente sensibles a idarrubicina, cisplatino y paclitaxel (taxol), ya que son celulas MCF-7/AdrVP (Figuras 4C, 4D y 5).

Para determinar los efectos del agotamiento del ATP sobre la retencion de rodamina 123 por las celulas

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

transfectadas con BCRP en comparacion con los controles, se incubaron celulas en medio completo o en condiciones de agotamiento de ATP. Se agoto el ATP de las celulas MCF-7 por incubacion en DMEM libre de glucosa que contema 2-desoxi-D glucosa 50 mM y azida sodica 15 mM durante 20 minutos (37°C). Se anadio rodamina 123 (0,5 |ig/ml de concentracion final) durante 30 minutos mas. Las celulas se colocaron en hielo, se lavaron de rodamina, y se incubaron en condiciones de agotamiento de ATP durante 30 minutos mas, y se determino la retencion de rodamina por citometna de flujo (excitacion 488 nm, emision 520 nm). Esto demuestra que la funcion de transporte de BCRP parece depender del ATP.

Ejemplo 11: Expresion de BCRP en celulas blasticas de pacientes con leucemia mielogenica aguda (AML) detectada por un ensayo de reaccion en cadena de la polimerasa de transcripcion inversa (RT-PCR).

Los ensayos de RT-PCR se realizaron usando una modificacion de los descritos previamente para la beta actina y MRP (10), excepto en que se usaron cebadores espedficos para BCRP en lugar de MRP. Para BCRP, los cebadores usados fueron (con sentido) 5'-TTA gGa TTG AAG CCA AAG G-3' (SEC ID N° 5) y (antisentido) 5'-TAG GCA ATT GTG AGG AAA ATA-3' (SEC ID N° 6). El extremo 5' del cebador con sentido comienza en la posicion nucleotidica 1727 del ADNc de BCRP (SEC ID N° 2 y Figura 2C); el extremo 3' de la sonda antisentido corresponde a la posicion 2152 del ADNc de BCRP (Figura 2C). Las concentraciones finales de los cebadores usados fueron 200 nM. La concentracion de magnesio final usada para PCR fue 700 |iM. Se realizaron treinta y cinco ciclos de desnaturalizacion (94°C, 1 minuto), hibridacion (50°C, 1 minuto) y elongacion (72°C, 2 minutos). Despues de la electroforesis en gel de agarosa de una alfcuota de la mezcla de reaccion de PCR, los geles se transfirieron a nitrocelulosa y se hizo la transferencia de Southern como se ha descrito previamente (12), usando el producto de PCR del clon 8 de 795 pb (extremo 5' marcado por 32P-dCTP) como sonda para BCRP. La longitud del producto de PCR esperada es 446 pb.

El ARN celular total se obtuvo de las celulas blasticas de catorce pacientes con AML. Se hicieron controles usando volumenes variables de la mezcla de reaccion de PCR que se proceso con ARN de MCF-7/W transcrito de forma inversa. Los resultados de estos controles y los ensayos de RT-PCR de las muestras de celulas blasticas de los pacientes se representan en la Figura 7. Estos controles que usan ARN de MCF-7/W indican que el ensayo de RT-PCR que se desarrollo es cuantitativo. Observese en la Figura 7 que algunos pacientes tienen niveles muy bajos de expresion de BCRP, mientras que otros (pacientes 3, 4, 5 y 7) tienen niveles de expresion comparables con o mayores que el de las celulas MCF- 7/W. Esta variacion en la expresion de BCRP entre muestras de celulas blasticas de pacientes AML mantiene abierta la posibilidad de que esos pacientes que tienen una expresion relativamente elevada de BCRP sean mas resistentes al tratamiento con los farmacos anti-neoplasicos que son susceptibles a la resistencia causada por BCRP (antraciclinas y mitoxantronas). La mitoxantrona y la antraciclina daunorrubicina son farmacos importantes usados en el tratamiento de AML.

Ejemplo 12: Hibridacion de transferencia de Northern en diversas lmeas celulares de cancer.

Se uso el ARN celular total para el analisis de Northern en todos los casos excepto para celulas H209 o H69, en las que se uso poli A+. La extraccion de ARN y la transferencia de Northern se realizaron por tecnicas convencionales, y como se ha descrito en el Ejemplo 4. Se uso un fragmento de 795 pb (clon 8, SEC ID N° 7) del extremo 3' del ADNc de BCRP de 2418 pb como sonda de hibridacion despues de marcarla con [32P]-dCTP (kit de marcaje “Prime-a-Gene”, Promega, Madison, WI). Para controlar las variaciones en la carga de muestra, se separaron las transferencias, despues se re-hibridaron con p- actina marcada con 32P o sondas de ARN 18S.

La Figura 8A muestra los resultados de la hibridacion de transferencia de Northern del ARNm de celulas MCF-7 (carril 1), celulas MCF-7/MITOX (carril 2), celulas 8226/ W (carril 3), y celulas 8226/MR20 (carril 4). La transferencia se sondeo para BCRP con un ADNc de 795 pb (Clon 8, SEC ID N° 7) despues de marcar con 32P-dCTP (panel superior). Para controlar la equivalencia en la carga de muestra, se separo la transferencia y se volvio a sondear para la p-actina.

La Figura 8B muestra los resultados de una hibridacion de transferencia de Northern de ARNm de celulas S1/M1-3.2 (carril 1), celulas S1/W (carril 2), celulas MCF-7/W (carril 3), celulas MCF-7/MXpr (carril 4), celulas MCF-7/MXrs250 (carril 5), celulas MCF-7/MXrs600 (carril 6), celulas MCF-7/VP (MRP+) (carril 7), celulas MCF-7/Adr (Pgp+) (carril 8), celulas MCF-7/MTX (DHFR+) (carril 9), MCF-7/AdrVp1000 (BCRP+) (carril 10). La transferencia se sondeo como se ha descrito para la Figura 8A.

La Figura 8C muestra una hibridacion de transferencia de Northern de ARNm de celulas HT29 de carcinoma de colon humano (carril 1), celulas HT29RNOV (carril 2), celulas MDA-MB-231 de carcinoma de mama humano (carril 3), celulas MDA-MB 231RNOV (carril 4), celulas EPF86-079 de fibrosarcoma humano (carril 5), celulas EPF86-079RNOV (carril 6), celulas EPG85-257 de carcinoma gastrico humano (carril 7), celulas EPG85-257RNOV (carril 8), celulas EPG85-257RDB (Pgp+) (carril 9), celulas EPP85-181 de carcinoma pancreatico humano (carril 10), celulas EPP85181RNOV (carril 11), y celulas EPP85- 181RDB (Pgp+) (carril 12). Las transferencias se sondearon como se ha descrito anteriormente para la Figura 8A.

Ejemplo 13: Hibridacion de transferencia de Southern

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Se aislo el ADN genomico usando tecnicas convencionales (8) de las celulas MCF-7/W sensibles al farmaco parental (carriles 1, 7), celulas MCF-7/MXpr (carriles 2, 8); celulas MCF-7/MXrs250 (carriles 3, 9), celulas MCF-7/MXrs6oo (calles 4, 10), celulas MCF-7/VP (sobreexpresion de MRP, carriles 5, 11), y celulas MCF-7/MTX (derivados de resistencia por sobreexpresion de DHFR, carriles 6, 12), se digirio con EcoR1 o BamH1, se separo por electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, se tino con bromuro de etidio, se transfirio, y se fijo a un filtro de nitrocelulosa usando tecnicas convencionales (8). El filtro se hibrido con la sonda de BCRP de 795 pb marcada con [32P] como se ha descrito anteriormente para la Figura 8 (Figura 9, panel superior). La electroforesis en gel de agarosa al 0,8% tenido con bromuro de etidio del ADN genomico despues de la digestion con las endonucleasas de restriccion, y antes de la transferencia al filtro de nitrocelulosa, demostro una equivalencia aproximada de la carga de muestra (Figura 9, panel inferior).

Ejemplo 14: Efectos de fumitremorgina C (FTC) en las celulas transfectadas con BCRP

Se cultivaron celulas MCF-7 transfectadas con el vector vado pcDNA3 o pcDNA3 que contiene el ADNc de BCRP de longitud completa (clon transfectante 8) en forma de monocapas en matraces de cultivo tisular. Los efectos de FTC en la acumulacion de aza-antrapirazol BBR3390 se midieron exponiendo estas celulas al aza-antrapirazol BCR3390 fluorescente (5 |iM) en presencia o ausencia de FTC 10 |iM durante 60 minutos. Despues, se retiraron las celulas de los matraces por tratamiento con tripsina, y se midio el contenido de bBR3390 intracelular por citometna de flujo. Se midieron los efectos de FTC sobre la retencion de BBR3390 exponiendo otro conjunto de celulas (control de vector y clon 8 transfectante) a BBR3390 5 |iM y sin FTC 10 |iM durante 60 minutos, retirando por lavado de las celulas el farmaco, despues reincubando las celulas durante 30 minutos mas en medio reciente con y sin FTC. Se midio el contenido de BBR3390 intracelular por citometna de flujo. (Vease la Figura 10).

Referencias

1. Kessel D, Botterill V and Wodinsky I, Uptake and retention of daunomycin by mouse leukemia cells as factors in drug response, Cancer Res 28: 938-941, 1968; Bewilder JCL and Rheum H, Cellular resistance to actinomycin D in Chinese Hamster cells in vitro:

Cross-resistance, radioautographic, and cytogenetic studies. Cancer Res 30: 1174-1184, 1970; Ling V and Thompson LH, Reduced permeability in CHO cells as a mechanism of resistance in a series of independently-derived VP-16 resistant human tumour cell lines, J Cell Physiol 83: 103-116, 1974.

2. Cole SPC, Bhardwaj G, Gerlach JH, Mackie JE, Grant CE, Almquist KC,

Stewart AJ, Kurz EU, Duncan AMV and Deeley RG: Overexpression of a transporter gene in a multidrug- resistant human lung cancer cell line. Science 258: 1650-1654, 1992.

3. Chen Y-N, Mickley LA, Schwartz AM, Acton EM, Hwang J, Fojo AT. Characterization of adriamycin- resistant human breast cancer cells which display overexpression of a novel resistance-related membrane protein. J. Biol. Chem. 265: 10073-10080, 1990.

4. Lee JS., Scala S, Matsumoto Y, Dickstein B, Robey R, Zhan Z, Altenberg

G, Bates SE. Reduced drug accumulation and multidrug resistance in human breast cancer cells without associated P-glycoprotein or MRP overexpression. J Cell Biochem 65: 513-526, 1997.

5. Doyle LA, Ross Dd, Sridhara R, Fojo At, Kaufmann SH, Lee EJ, Schiffer CA. Expression of a 95 kDa membrane protein is associated with low daunorubicin accumulation in leukaemic blast cells. Br. J. Cancer 71, 52-58, 1995.

6. Liang P and Pardee A. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. Science 257: 967-971, 1992; Liang P, Averboukh L, Keyomarsi K, Sager R and Pardee A. Differential display and cloning of messenger RNAs from human breast cancer versus mammary epithelial cells. Cancer Res 52: 6966-6968, 1992).

7. Kohler et al. (Nature 256: 495 (1975); Eur. J. Immunol. 6: 511 (1976); Euro J. Immunol. 6: 292 (1976).

8. Maniatis, T. et al. In: Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982), and by Haymes, B. D. et al., In: Nucleic Acid Hybridizations, A Practical Approach. IRL Press, Washington, D.C. (1985)

9. Morgan TH. Sex limited inheritance in Drosophila. Science 32: 120-122, 1910; Bingham PM, Levis R, Rubin GM. Cloning of DNA sequences from the white locus of D melanogaster by a novel and general method. Cell 25: 693-704, 1981; O'Hare K, Murphy C, Levis R, Rubin GM. DNA sequence of the white locus of Drosophila melanogaster. J Mol Biol 180: 437-455, 1984; Pepling M, Mount SM. Sequence of a cDNA from the Drosophila melanogaster white gene. Nucleic Acids Res 18: 1633, 1990; Chen H, Rossier C, Lalioti MD, Lynn A, Chakravarti A, Perrin G, Antonarkis SE. Cloning of the cDNA for a human homologue of the Drosophila white gene and mapping to Chromosome 21q22.3. Am J Hum Genet 59: 6675, 1996.

10. Ross DD, Doyle LA, Schiffer CA, Lee EJ, Grant CE, Cole SPC, Deeley RG, Yang W and Tong Y. Expression of multidrug resistance-associated protein (MRP) mRNA in blast cells from acute myeloid leukemia (AML) patients. Leukemia 10: 48-55, 1996.

11. Walker, J.E., Saraste, M., Runswick, M.J., Gay, N.J. Distantly related sequences in the alpha- and beta- subunits of ATP synthase, kinases, and other ATP-requiring enzymes and a common nucleotide binding fold. EMBO J. 1: 945-951, 1982.

12. Pugh, E.L., Wakil, S.J. Studies on the mechanism of fatty acid synthesis. XIV. The prosthetic group of acyl carrier protein and the mode of its attachment to protein. J. Biol. Chem. 240: 4727-4733, 1965

13. Rao JKM, and Garos P. A conformational preference parameter to predict helices in integral membrane

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

proteins. Biochim Biophys Acta 899: 179-214, 1986.

14.Skehan P, Storeng R, Scudiero D, Monks A, McMahon J, Vistica D, Warren JT, Bokesch H, Kenny S, Boyd MR. New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer drug screening. J Natl Cancer Inst 82: 11071112, 1990.

15. Ross DD, Gao Y, Yang Y, Leszyk J, Shively J, Doyle LA. The 95-kilodalton membrane glycoprotein overexpressed in novel multidrug resistant breast cancer cells is NCA, the nonspecific cross-reacting antigen of carcinoembryonic antigen. Cancer Res 57: 5460-5464, 1997.

16. Kawaharata H, Hinoda Y, Itoh F, Endo T, Oikawa S, Nakazato H, Imai K. Decreased sensitivity of carcinoembryonal antigen cDNA-transfected cells to adriamycin. Int J Cancer 72, 377-382, 1997.

1. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, and Struhl K, editors. Current protocols in molecular biology, volume 1, chapter 9. John Wiley and Sons, N.Y., 1989.

17. Harker WG, Slade DL, Dalton WS, Meltzer PS, Trent JM. Multidrug resistance in mitoxantrone-selected HL-60 leukemia cells in the absence of P-glycoprotein overexpression. Cancer Res 49: 4542-4549, 1989.

18. Taylor CW, Dalton WS, Parrish PR, Gleason MC, Bellamy WT, Thompson FH, Roe DJ, Trent JM. Different mechanisms of deceased drug accumulation in doxorubicin and mitoxantrone resistant variants of the MCF-7 human breast cancer cell line. Br J Cancer 63: 923-929, 1991.

19. Nakagawa M, Schneider E, Dixon KH, m Horton J, Kelley K, Morrow C, Cowan K. Reduced intracellular drug accumulation in the absence of P-glycoprotein (mdr1) overexpression in mitoxantrone-resistant human MCF-7 breast cancer cells. Cancer Res 52: 6175-6181, 1992.

20. Yang C-HJ, Cowan K, Schneider E. Reselection of a mitoxantrone-resistant breast carcinoma cell line with mitoxantrone results in a parallel increase in cross-resistance to camptothecin analogues. Proc Amer Assoc Cancer Res (abstract) 37: 308, 1996.

21.Schneider E, Horton JK, Yang C-H, Nakagawa M, Cowan KH. Multidrug resistance-associated protein gene overexpression and reduced drug sensitivity of topoisomerase II in a human breast carcinoma MCF7 cell line selected for etoposide resistance. Cancer Res 54: 152-158, 1994.

22. Fairchild CR, Ivy pS, Kao-Shan C-S, Whang-Peng J, Rosen N, Israel MA, Melera PW, Cowan KH, Goldsmith ME. Isolation of amplified and overexpressed DNA sequences from adreamycin-resistant human breast cancer cells. Cancer Res 47: 5141-5148, 1987.

23. Cowan KH, Goldsmith ME, Levine RM, Aitken SC, Douglass E, Clendeninn N, Neinhuis AW, Lipman ME. Dihydrofolate reductase gene amplification and possible rearrangement in estrogen-responsive methotrexate resistant human breast cancer cells. J Biol Chem 257: 15079-15086, 1982.

24. Futcher BW, Abbaszadegan MR, Domann F, Dalton WS. Analysis of MRP mRNA in mitoxantrone- selected, multidrug resistant human tumour cells. Biochem Pharm 47: 1601, 1994.

25. Rabindran SK, He H, Singh M, Brown E, Collins KI, Annable T, Greenberger LM. Reversal of a novel multidrug resistance mechanism in human colon carcinoma cells by fumitremorgin C. Cancer Res 58: 5850-5858, 1998.

26. Yu Q, Mirski SEL, Sparks KE, Cole SPC. Two COOH-truncated cytoplasmic forms of topoisomerase IIa in a VP-16 selected lung cancer cell line result from partial gene deletion and alternative splicing. Biochemistry 36: 5868-5877, 1997.

27. Dietel M, Arps H, Lage H, Neindorf A. Membrane vesicle formation due to acquired mitoxantrone resistance in human gastric carcinoma cell line EPG85-257. Cancer Res 50: 6100-6106, 1990.

28. Kellner U, Hutchinson L, Seidel A, Lage H, Danks MK, Deitel M, Kaufmann SH. Decreased drug accumulation in a mitoxantrone-resistant gastric carcinoma in the absence of P-glycoprotein. Int J Cancer 71: 817-824, 1997.

29. Holm PS, Scanlon KJ, Dietel M. Reversion of multidrug resistance in the P-glycoprotein-positive human pancreatic cell lin (EPP85-181RDB) by introduction of a hammerhead ribozyme. Br J Cancer 70: 239-243, 1994.

30. Harker WG, Slade DL, Dalton WS, Meltzer PS, Trent JM. Multidrug resistance in mitoxantrone-selected HL-60 leukemia cells in the absence of P-glycoprotein overexpression. Cancer Res 49: 4542-4549, 1989.

Claims (19)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   REIVINDICACIONES

   1. Polipeptido que tiene la secuencia de la SEC ID N° 1 (Protema de Resistencia de Cancer de Mama, BCRP) que induce resistencia a los farmacos quimioterapeuticos contra el cancer en celulas de cancer de mama.
2. 2. El polipeptido de la reivindicacion 1 que es de aproximadamente 655 aminoacidos de longitud.
3. 3. El polipeptido de la reivindicacion 1 que tiene una masa molecular de 72,3 kilodalton.
4. 4. Un anticuerpo que se une al polipeptido de la reivindicacion 1.
5. 5. El anticuerpo de la reivindicacion 4 que es monoclonal.
6. 6. El anticuerpo de la reivindicacion que es policlonal.
7. 7. Una secuencia de acido nucleico que codifica el polipeptido de la reivindicacion 1.
8. 8. La secuencia de acido nucleico de la reivindicacion 7 que es la secuencia de la SEC ID N° 2.
9. 9. Un acido nucleico que comprende la secuencia de nucleotidos de la SEC ID N° 2.
10. 10. Una sonda antisentido que inhibe la expresion del polipeptido de la reivindicacion 1.
11. 11. La sonda antisentido de la reivindicacion 10 que es la cadena complementaria de la secuencia de la SEC ID N° 7.
12. 12. Un metodo para determinar la causa de la resistencia de un paciente a los farmacos quimioterapeuticos contra el cancer ensayando in vitro la expresion del polipeptido de la reivindicacion 1, por lo que la sobreexpresion de dicho polipeptido indica que esa es la causa.
13. 13. Uso del anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 para preparar un medicamento para inhibir la actividad de la Protema de Resistencia de Cancer de Mama.
14. 14. Uso de la sonda de la reivindicacion 11 para preparar un medicamento para inhibir la actividad de la Protema de Resistencia de Cancer de Mama.
15. 15. Uso del anticuerpo de la reivindicacion 4 para preparar un medicamento para potenciar un tratamiento quimioterapeutico del paciente contra el cancer.
16. 16. Uso de la sonda de la reivindicacion 11 para preparar un medicamento para potenciar un tratamiento quimioterapeutico del paciente contra el cancer.

    imagen1

    imagen2

    AdrVp W

    AdrVpPR

    imagen3

    FIG. IB

    Secuencia Peptfdica de BCRP

    Longitud: 663 aminoacidos

    1 AEKIKTLQMS SSNVEVFIPV SQGNTNGFPA TASNDLKAFT EGAVLSFHNI

    Motivo Walker A

    51

    CYRVKLKSGF LPCRKPVEKE

    101

    LAARJKDPSGL SGDVXINGAP

    151

    SAALRLATTM TNHEKKERIN

    201

    RTSIGMELIT DPSILFLDEP

    251

    HQPRYSIFKL FDSLTLLASG

    301

    FFLDIINGDS TAVALNREEO

    351

    KETKAELHQL SGGEKKKKIT

    401

    QASIAQIIVT WLGLtVIGAI

    TM J

    451

    SAVELFWEK KLFIHEYISG

    501

    VYFMLGLKPK ADAFFVMMFT

    Cfyc

    551

    ICFVFMMXFS GLLVWitTTIA

    ™2 Glyc

    501

    PGIji£$GNNP CNYATCTGEE

    651

    IAYLK1LFLK KYS

    Sitio de Fosfopanteteina

    Glyc

    Give

    TM 3

    FIG. 2A

    P45844; Proteina blanca humana

    Proteina blanca de Anopheles albimanus

    fL

    L76302:

    BCRP

    Q08234:

    P43071:

    S05789:

    S14174:

    S05872:

    M74447:

    M55637:

    M88599:

    M88598:

    Js0051:

    M60042:

    A25059:

    M60040:

    M60041: M59076: M59077:

    A32547:

    M83785:

    M76974:

    Transportador dependiente de ATP de levadura Cdr1 de la proteina MDR de C. albicans Exportador del factor de union de levadura Exportador del factor de union de levadura Exportador del factor de union de levadura Tap 1 humana

    Tap 1 de raton

    Pgp 1 de Entamoeba histolytica Pgp 2 de Entamoeba histolytica Mdr 2 humana Pgp 3 de hamster chino Mdr 1 humana Pgp 1 de hamster chino

    Pgp 2 de hamster chino Mdr 49 de Drosophila Mdr 65 de Drosophila

    Mdr 1 de P. falciparum CFTR de cazon CFTR de cazon

    A30300; CFTR humana Lo5628: Mrp 1 humana

    A34207: PgpA de Leishmania

    FIG. 2B

    Filograma evolutivo de Transportadores ABC Seleccionados

    imagen4

    FIG. 2D

    imagen5

    imagen6

    Contenido de DNR Intracelular (FU/celula)

    imagen7

    imagen8

    Tiempo de Incubacion (min)

    Control de vector —+—

    BCRP Cion 6 —I—

    BCRP Cion 8

    FIG. 4B

    Resistencia en veces (RF)

    imagen9

    Mitox

    m

    Dox

    Ida

    n

    DDP (Cisplatino) □

    Paclitaxel

    FIG. 4C

    5

    K)

    CD

    imagen10

    imagen11

    Supervivencia celular (% del Control) Superviviencia celular (% del Control)

    120

    110 H 100 90 80 - 70 - 60 50 40 30 20 - 10 - 0

    0

    imagen12

    11111------r1 r-r r'TTi-q----1—r-m-irq-----“r~ttttttti-----1—rrmn] i r-rrmf

    0,1 1 10 100 1000 10000

    [Daunorrubicina], nM

    FIG, 4D-3

    imagen13

    [Cisplatino]. nM

    FIG. 4D-4

    Supervivencia Celular (% del Control) Supervivencia Celular (% del Control)

    imagen14

    [Doxorrubicina], nM

    FIG. 4D-5

    imagen15

    [Paclitaxel], nM

    FIG, 4D-6

    Retencion de Rodamina (FU/celula)

    imagen16

    LC50, nM

    Llnea celular

    Mitoxantrona Daunorrubicina Doxorrubucina Idarrubicina Cisplatino Paclitaxel

    LC50

    RF LC50 RF LC50 RF LC50 RF LC50 RF LC50 RF

    MCF-7/W

    48 1,0 47 1,0 57 1,0 75 1,0 2.367 1,0 1,9 1,0

    MCF-7/pcDNA3

    54 V 72 1,5 66 1,2 126 1,7 3,525 1,5 3,0 1,6

    MCF-7/BCRPc19

    21 0,4 54 1,1 67 1,2 107 1,4 8,950 2,9 0,8 0,4

    MCF-7/BCRPoll

    393** 8,2 218** 4,5 254 5,2 140 1,8 3,080 1,3 1,4 0,7

    MCF-7/BCRPcS

    1,495** 31,2 328** 7,0 768* 9,2 285 3,5 3,700 1,5 1,8 0,9

    MCF—7/AdrVp

    180,000** 3333 1667** 35,5 8650** 175,0 70 0,8 4,700 2,01 2,8 1,5

    ♦ = difiere significativamente de MCF-7/W o MCf-7/pcDNA3, p <0,05(ensayo t de Student) ** = difiere significativamente de MCF-7/W o MCF-7/pcDNA3, p <0,01 (ensayo t de Student)

    FIG. 5

    Expresion del gen w humano en celulas MCF-7, Detectada por RT-PCR

    500 pb 300 pb

    MCF-7 MCF-7 Marcadores AdrVP W

    imagen17

    FIG. 6

    475 pb whumana 232 pb p-actina

    5

    Deteccion por RT-PCR de la expresion del ARNm de BCRP en celulas MCF-7/W o Celulas Blasticas de Pacientes con Leucemia Mieloide Aguda

    imagen18

    imagen19

    MCF-7/W----------► 5pl 1,5pl 0,5pl 1

    2 3 4 5

    ~ .

    0* # • %

    7 8 9 10

    11 12 13 14

    # * -

    m m * m

    FIG. 7

    5

    imagen20

    imagen21

    5

    imagen22

    5

    EcoRt

    123456

    Bam H1

    7 8 9101112

    Kb

    Clave:

    1,7. MCF-7/W

    imagen23

    2,8. MCF-7/MXpR

    23’2 3, 9. MCF-7/MXRS250

    y^b
17. 6.6 4, 10. MCF-7/MXRg600
18. 4.3

    5, 11. MCF-7/VP (MRP+)
19. 2.3 6,12. MCF-71NITX (DHFR+)

    2,0

    1.3

    1.07

    imagen24

    FIG. 9

    4^

    O

    700-i

    imagen25

    imagen26

    Acum. Reten. Control del Vector

    imagen27

    imagen28

    i r

    Acum. Reten. BCRP Cion 8

    FIG. 10

    ^Control

    S+FTC