ES2284243T3 - Proteina de resistencia de cancer de mama (bcrp) y el adn que la codifica. - Google Patents
Proteina de resistencia de cancer de mama (bcrp) y el adn que la codifica. Download PDFInfo
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Abstract
Polipéptido que tiene la secuencia de la SEC ID Nº 1 (Proteína de Resistencia de Cáncer de Mama, BCRP) que induce resistencia a los fármacos quimioterapéuticos contra el cáncer en células de cáncer de mama.
Description
Proteína de resistencia de cáncer de mama (BCRP)
y el ADN que la codifica.
Esta solicitud se basa en el documento de
Estados Unidos Provisional 60/073763, presentado el 2/5/98.
La invención se refiere a la familia de
proteínas conocida como proteínas de resistencia a múltiples
fármacos. Estas proteínas son transportadores xenobióticos que
confieren resistencia a fármacos quimioterapéuticos contra el
cáncer. La invención describe un nuevo miembro proteico de esta
familia llamado Proteína de Resistencia de Cáncer de Mama (BCRP) y
el ADN que la codifica.
El desarrollo de resistencia a múltiples
fármacos quimioterapéuticos frecuentemente sucede durante el
tratamiento del cáncer. Dos proteínas transportadoras xenobióticas
transmembrana, P-glicoproteína (Pgp) y la proteína
de resistencia a múltiples fármacos (MRP) son capaces de causar
resistencia a múltiples fármacos cuando se introducen por
transfección en células sensibles a fármacos en cultivo (1,2). A
pesar de esto, el papel que estos transportadores desempeñan en la
resistencia a fármacos clínicos mostrado por cánceres humanos no
está claro, y se han buscado mecanismos alternativos o adicionales
de resistencia a fármacos funcionales en esta enfermedad.
Para abordar este problema, Chen et. al.
(3) seleccionaron células MCF-7 de carcinoma de mama
humano para la resistencia a la antraciclina doxorrubicina en
presencia de verapamil, un inhibidor de Pgp. La sublínea resistente
a múltiples fármacos resultante, MCF-7/AdrVp,
muestra una marcada resistencia cruzada a otras antraciclinas
(daunorrubicina [DNR],
3'-desamino-3'[3-ciano-4-morfolinil]doxorrubicina,
pero no idarrubicina), y a la antracenodiona mitoxantrona, pero
permanece sensible a los alcaloides de la vinca, paclitaxel (3,4) y
cisplatino. Las células MCF-7/AdrVp no
sobreexpresan Pgp o MRP, a pesar de presentar una reducción marcada
en la acumulación intracelular de la antraciclina daunorrubicina y
el colorante fluorescente rodamina 123 en comparación con las
células MCF-7 (4,5). Las células
MCF-7/AdrVp no presentan una alteración en la
distribución subcelular del fármaco (4) tal como se observa en
ciertas células que sobreexpresan MRP. Aunque la acumulación
disminuida de daunorrubicina en células MCF-7/AdrVp
no se invierte por el antagonista de P-glicoproteína
clásico ciclosporina A, el agotamiento de ATP provoca la eliminación
completa del flujo anormal tanto de daunorrubicina como de rodamina
(4).
La necesidad de la técnica de dilucidar el
mecanismo de resistencia a fármacos sigue existiendo, ya que la
quimioterapia sigue siendo el método principal para tratar de forma
no invasiva muchos tipos de cáncer. También existe la necesidad en
la técnica de contrarrestar el mecanismo de resistencia a fármacos
para proporcionar de este modo un transcurso más largo y más eficaz
de tratamiento con fármaco quimioterapéutico para pacientes con
cáncer.
El descubrimiento descrito en la presente
invención cumple las necesidades anteriores. El descubrimiento de la
BCRP y su gen correspondiente avanza enormemente el conocimiento en
la técnica sobre el mecanismo de resistencia a fármacos
proporcionando un nuevo transportador xenobiótico que está
sobreexpresado en una diversidad de líneas celulares de cáncer
humano resistentes a fármacos, y confiere resistencia a muchos
agentes quimioterapéuticos.
BCRP es una proteína de aproximadamente 655
aminoácidos y está codificada por un gen que tiene un ADNc de
aproximadamente 2418 nucleótidos. La proteína muestra actividad y
tiene una homología de secuencia que la coloca en la superfamilia
del casete de unión a ATP (ABC) de proteínas transportadoras. La
masa molecular es de aproximadamente 72,3 kilodalton (kD) exclusiva
de cualquier glicosilación. La expresión de BCRP en células de
cáncer humano sensibles a fármacos confiere resistencia a
mitoxantrona, doxorrubicina, y daunorrubicina, y reduce la
acumulación de daunorrubicina en las células transfectadas
clonadas.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar una proteína de mamífero que sea una proteína
resistente a múltiples fármacos (MDR) y un transportador
xenobiótico, y se llama proteína de resistencia de cáncer de mama
(BCRP).
También es un objeto de la presente invención
proporcionar el gen y/o el ADNc que codifica dicha proteína MDR de
mamífero.
Otro objeto de la invención es proporcionar
fragmentos antisentido del gen de BCRP que inhiba la expresión de la
BCRP in vivo.
Otro objeto más de la presente invención es
proporcionar un método para usar sondas derivadas del gen de BCRP
como una herramienta de diagnóstico para cuantificar la expresión
génica o amplificación génica en muestras tomadas de pacientes con
cáncer.
Otro objeto de la invención es proporcionar
anticuerpos contra la BCRP.
Otro objeto más de la invención es proporcionar
un método para invertir la resistencia a fármacos de las células
cancerosas administrando anticuerpos contra BCRP.
Otro objeto más de la invención es proporcionar
un método para invertir la resistencia a fármacos de las células
cancerosas administrando Fumitremorgina C.
Otro objeto de la invención es proporcionar un
método para potenciar un tratamiento de quimioterapia del paciente
para cáncer de mama administrando anticuerpos al paciente para
inhibir la actividad de resistencia de BCRP.
Estos y otros objetos de la invención, que serán
evidentes a partir de la descripción detallada de la invención
proporcionada a continuación en este documento, se han cumplido, en
una realización, por BCRP sustancialmente pura y el gen que codifica
BCRP.
La Figura 1A es una autorradiografía de las
huellas genéticas de ARN de células MCF-7.
La Figura 1B es una autorradiografía de una
hibridación de transferencia de Northern de ARNm de células
MCF-7/W, MCF-7/AdrVp, y
MCF-7/AdrVpPR.
La Figura 1C es una autorradiografía de una
hibridación de transferencia de Southern genómica de ADN de células
MCF-7/AdrVp, MCF-7/W y
MCF-7/AdrVpPR.
La Figura 2A es la secuencia de aminoácidos
deducida de BCRP con motivos.
La Figura 2B muestra la similitud relativa de
BCRP con miembros seleccionados de la superfamilia de
transportadores ABC.
La Figura 2C es la secuencia de ADNc que
codifica la BCRP.
La Figura 2D es un gráfico de un filograma que
muestra la evolución de la secuencia de aminoácidos de BCRP en
relación con ciertos miembros diferentes de la familia ABC de
proteínas transportadoras.
La Figura 3 muestra una autorradiografía de una
transferencia de Northern de múltiples tejidos.
La Figura 4A es una autorradiografía de una
transferencia de Northern de subclones de transfectantes BCRP.
La Figura 4B es un gráfico de la acumulación y
la retención de Daunorrubicina (DNR) en las células de control del
vector pcDNA3 y los clones 6 y 8 transfectados con BCRP.
La Figura 4C muestra los factores de resistencia
relativa-MCF-7, los controles de
vector, los clones 19, 6, y 8.
La Figura 4D son gráficos que muestran el efecto
de diversas concentraciones de fármacos quimioterapéuticos sobre la
supervivencia de células del clon 8 de MCF-7
transfectadas con BCRP.
La Figura 4E muestra un gráfico de los efectos
del agotamiento de ATP de la retención de rodamina 123 por células
MCF-7 transfectantes/pcDNA3 (control de vector
vacío) o MCF-7/BCRP clon 8.
La Figura 5 es una tabla que muestra el efecto
de diversos fármacos quimioterapéuticos sobre células
MCF-7 transfectadas con BCRP.
La Figura 6 es una autorradiografía que muestra
la expresión del gen \omega Humano en células
MCF-7 detectadas por la reacción en cadena de la
polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR).
La Figura 7 es una autorradiografía que muestra
la expresión de BCRP en muestras de células blásticas de pacientes
con leucemia mielogénica aguda.
Las Figuras 8A, 8B y 8C son autorradiografías
que muestran los resultados de hibridaciones de transferencia de
Northern de ARNm de diversas líneas celulares resistentes a fármacos
sondeadas con una sonda de BCRP.
La Figura 9 es una autorradiografía de una
hibridación de transferencia de Southern de diversas líneas
celulares MCF-7.
La Figura 10 es un gráfico que muestra los
resultados de la administración de FTC a células transfectadas con
BCRP.
Se describe un nuevo gen y la proteína
codificada por dicho gen, llamada la Proteína asociada a Resistencia
de Cáncer de Mama (BCRP) en la presente invención. Se muestra que la
BCRP se sobreexpresa en células humanos de carcinoma de mama,
carcinoma de colon, carcinoma gástrico, fibrosarcoma, y origen de
mieloma resistentes a múltiples fármacos (MDR). La BCRP es un
transportador xenobiótico que confiere resistencia a múltiples
fármacos quimioterapéuticos, y pertenece a la superfamilia de
transportadores ABC. La BCRP parece ser responsable de la alteración
en el transporte de fármacos y la resistencia a fármacos manifestada
por diversas células cancerosas.
La presente invención pertenece parcialmente a
la BCRP, a fragmentos de este factor, así como derivados
funcionales, agonistas y antagonistas, y productos de descomposición
metabólica de este factor. La secuencia de aminoácidos de BCRP se
representa en la SEC ID Nº 1 y la Figura 2A. La invención se refiere
especialmente a agentes que son capaces de inhibir BCRP,
preferiblemente anticuerpos contra BCRP o sondas antisentido para el
gen de BCRP. La invención abarca adicionalmente agentes químicos que
inhiben la expresión del gen o ARNm de BCRP, incluyendo
Fumitremorgina C (FTC). La invención también se refiere a métodos
para inhibir la actividad de BCRP o la expresión del gen de BCRP
administrando dichos agentes.
Un "derivado funcional" de BCRP es un
compuesto que tiene una actividad biológica (funcional o
estructural) que es sustancialmente similar a una actividad
biológica de BCRP. La expresión "derivados funcionales"
pretende incluir los "fragmentos", "variantes",
"análogos", o "derivados químicos" de una molécula. Se
entiende que un "fragmento" de una molécula tal como BCRP, se
refiere a cualquier subconjunto polipeptídico de la molécula. Un
fragmento funcional significa una molécula con una secuencia de
aminoácidos similar, pero no idéntica, pero que tiene la misma
función de la BCRP de longitud completa. Se entiende que una
"variante" de una molécula tal como BCRP se refiere a una
molécula sustancialmente similar en estructura y función a la
molécula completa, o a un fragmento de la misma. Se dice que una
molécula es "sustancialmente similar" a otra molécula si ambas
moléculas tienen estructuras sustancialmente similares o si ambas
moléculas tienen una actividad biológica similar.
Por tanto, con la condición de que dos moléculas
tengan una actividad similar, se consideran variantes ya que este
término se usa en este documento incluso si la estructura de una de
las moléculas no se encuentra en la otra, o si la secuencia de
restos aminoacídicos no es idéntica. Se entiende que un
"análogo" o agente que imita la función de una molécula tal
como BCRP se refiere a una molécula sustancialmente similar en
función pero no en estructura a la molécula completa o a un
fragmento de la misma. Como se usa en este documento, se dice que
una molécula es un "derivado químico" de otra molécula cuando
contiene restos químicos adicionales que normalmente no son parte de
la molécula. Dichos restos pueden mejorar la solubilidad, absorción,
vida media biológica, etc. de la molécula. Los restos pueden
disminuir alternativamente la toxicidad de la molécula, eliminar o
atenuar cualquier efecto secundario indeseable de la molécula, etc.
Los restos capaces de mediar dichos efectos se describen en
Remington's Pharmaceutical Sciences (1980). Se conocen bien
en la técnica procedimientos para acoplar dichos restos a una
molécula.
molécula.
Un "antagonista" de BCRP es un compuesto
que inhibe la función de BCRP. Dichos antagonistas pueden ser
inmunoglobulinas (tales como, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal
o policlonal, o fragmentos activos de dicho anticuerpo). Los
antagonistas o inhibidores de acuerdo con la presente invención que
son útiles para inhibir el efecto de resistencia a fármacos causado
por BCRP son un anticuerpo producido contra la BCRP o el fármaco
fumitremorgina C (FTC), una micotoxina. Se obtuvo FTC del Dr. Lee
Greenberg en Wyeth-Ayrest Laboratories en Pearl
River, Nueva York.
Puede prepararse un anticuerpo policlonal capaz
de unirse a BCRP inmunizando un animal con una preparación de BCRP o
derivado funcional de BCRP. Los métodos para conseguir dichas
inmunizaciones son bien conocidos en la técnica. También pueden
emplearse anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos para
ensayar la presencia o cantidad de BCRP en una muestra biológica
particular. Dichos anticuerpos pueden producirse inmunizando
esplenocitos con BCRP activada (7). Los anticuerpos de unión a BCRP
de la presente invención pueden administrarse a pacientes para
reducir la resistencia a fármacos quimioterapéuticos, y por tanto
para potenciar su tratamiento. Los métodos de administración
dependerán de las circunstancias particulares de cada paciente
individual y pertenecen a las capacidades de los especialistas en la
técnica.
La BCRP de la presente invención puede obtenerse
por procesos naturales (tales como, por ejemplo, induciendo la
producción de BCRP de una célula humana o animal); por métodos
sintéticos (tales como, por ejemplo, usando el método de Merrifield
sintetizando polipéptidos para sintetizar BCRP, derivados
funcionales de BCRP, o agonistas o antagonistas de BCRP
(inmunoglobulina o no inmunoglobulina); o por la aplicación de
tecnología recombinante (tal como, por ejemplo, para producir la
BCRP de la presente invención en diversos hospedadores, por ejemplo,
levaduras, bacterias, hongos, células de mamífero cultivadas, por
nombrar algunos, o de plásmidos recombinantes o vectores virales).
Se dice que los compuestos de la presente invención están
"sustancialmente libres de contaminantes naturales" si las
preparaciones que los contienen están sustancialmente libres de
materiales con los que estos productos se encuentran de forma normal
y natural.
La elección del método a emplear dependerá de
factores tales como la conveniencia, rendimiento deseado, etc. No es
necesario emplear sólo uno de los métodos, procesos, o tecnologías
descritos anteriormente para producir BCRP; los procesos, métodos y
tecnologías descritos anteriormente pueden combinarse para obtener
BCRP. Es más preferible preparar BCRP expresando el gen o secuencia
de ADNc que codifica la proteína BCRP. Dicho gen o secuencia de ADNc
se llamará a partir de ahora el "gen de BCRP" o "secuencia de
ADNc de BCRP".
Se empleó la técnica de huella genética de ARN
para clonar el ADNc de BCRP. La formación de huellas genéticas de
ARN usa la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y pares de
cebadores degenerados para amplificar el ARNm celular. Esta técnica
se basa en modificaciones de la técnica de "Presentación
Diferencial de ARNm" desarrollada por Liang y Pardee (6). Se
usaron estas técnicas como un medio para descubrir genes que se
expresan de forma diferencial en líneas celulares seleccionadas por
fármacos en comparación con células parentales. La diferencia
principal entre la Huella Genética de ARN y la Presentación
Diferencial es que el protocolo de huella genética de ARNm usa una
única reacción de síntesis de ADNc, seguida por amplificación con
cebadores cadena arriba y cadena abajo. La Presentación Diferencial
usa de 9 a 12 síntesis de ADNc para cada muestra de ARN con un
cebador oligo(dT) anclado, seguido por la amplificación con
un cebador cadena arriba.
El gen de BCRP clonado, obtenido a través de los
métodos descritos anteriormente y en los ejemplos, puede unirse de
forma operativa a un vector de expresión, e introducirse en células
bacterianas, o eucariotas para producir la proteína BCRP. Las
técnicas para dichas manipulaciones se describen en Maniatis, T.
et al. supra, y son bien conocidas en la técnica (8).
La secuencia de ADNc de BCRP es de
aproximadamente 2418 nucleótidos de longitud. El ADNc de BCRP se
representa en la SEC ID Nº 2 o Figura 2C. El ADNc de BCRP puede
usarse para expresar la BCRP. Además, la secuencia de ADNc de BCRP,
o una parte de la misma, puede usarse como sonda en un ensayo de
transferencia de Northern o para la selección de sondas en un ensayo
de RT-PCR para medir el ARNm de BCRP en diversas
muestras tisulares. La medición de la expresión de BCRP por
transferencia de Northern o ensayo de RT-PCR puede
ser determinante de la respuesta al fármaco para fármacos
quimioterapéuticos en el tiempo. Las técnicas para estos ensayos se
describen en los ejemplos y son bien conocidas en la técnica (8).
Por lo tanto, dicho ensayo podría usarse para determinar si el fallo
de un paciente para responder a la quimioterapia se debe a la
sobreexpresión de BCRP, y por tanto la resistencia a los fármacos.
Además, podrían desarrollarse sondas antisentido basadas en la
secuencia de ADNc representada en la SEC ID Nº 2 y la Figura 2C.
Estas sondas pueden administrarse a pacientes para que se unan al
ADNc de BCRP de forma endógena y por tanto para inhibir la expresión
de la BCRP. Dicha terapia podría usarse para detener o ralentizar la
propensión del paciente a llegar a ser resistente a los fármacos
quimioterapéuticos y por tanto hacer al tratamiento más eficaz. Las
técnicas para la producción y administración de sondas antisentido
son bien conocidas en la técnica. Las técnicas de hibridación de
ácido nucleico y clonación son bien conocidas en la técnica (8).
Los datos presentados en los ejemplos y las
figuras correspondientes apoyan enormemente la conclusión de que el
nuevo miembro BCRP de la familia ABC presentado en este documento es
un transportador xenobiótico que es principalmente responsable del
fenotipo resistente a fármacos de células
MCF-7/AdrVp.
En la presente invención también se muestra la
sobreexpresión de BCRP en varias líneas celulares cancerosas. Estas
líneas celulares incluyen células de carcinoma de colon S1, HT29,
células de carcinoma gástrico EPG85-257, células de
fibrosarcoma EPR86-079, y células de mieloma 8226.
La sobreexpresión del ARNm de BCRP en cada una de estas líneas
celulares, y la amplificación del gen de BCRP en las células
resistentes a fármacos demuestran un importante papel de BCRP en la
resistencia a agentes citotóxicos. Además, la sobreexpresión
impuesta de BCRP en células MCF-7 disminuyó la
acumulación celular de daunorrubicina y confirió un patrón de
resistencia cruzada a fármacos a las células transfectadas que era
casi idéntico al de las células MCF-7/AdrVp. El
grado de sobreexpresión de BCRP en los clones transfectantes 6 y 8
se correlaciona con las alteraciones en el nivel de estado
estacionario intracelular de daunorrubicina y su grado de
resistencia a mitoxantrona, daunorrubicina y doxorrubicina.
Una diferencia principal entre los clones
transfectantes que sobreexpresan BCRP y la sublínea
MCF-7/AdrVp original es que el grado de resistencia
a fármacos en la última es mayor que en las células transfectadas,
mientras que los niveles de ARNm de BCRP en estado estacionario en
cada una son comparables (Figura 4A). Varias posibilidades pueden
contribuir a esta diferencia. Las diferencias en la estabilidad
proteica y/o localización pueden contribuir al fenotipo resistente a
fármacos completo, o puede requerirse la expresión de otras
proteínas. Recientemente, se informó de que miembros de la familia
de antígenos carcinoembrionarios (CEA), principalmente el antígeno
de reacción cruzada no específica (NCA) y el propio CEA, están
marcadamente sobreexpresados en la superficie celular de células
MCF-7/AdrVp y MCF-7/AdrVpPR en
comparación con células MCF-7 sensibles a fármacos
(15). Una elevada densidad de estas glicoproteínas ácidas en la
superficie celular puede protonar fármacos tales como mitoxantrona,
daunorrubicina o doxorrubicina que evita la entrada en la célula. De
hecho, Kawaharata, et. al. (16) informaron de que la
expresión impuesta de CEA en células NIH3T3 transfectadas provoca
tanto la acumulación disminuida como la resistencia a doxorrubicina
en las células transfectadas. Por tanto, la sobreexpresión relativa
de los miembros de la familia de CEA en la superficie de células
MCF-7/AdrVp podría funcionar junto con BCRP para
causar mayor resistencia a mitoxantrona, doxorrubicina y
daunorrubicina que la causada por BCRP sola. Esta hipótesis podría
ensayarse co-transfectando la sublínea
MCF-7/BCRP-clon 8 con un vector de
expresión que contenga NCA o CEA.
Otra posible explicación para el mayor grado de
resistencia de células MCF-7/AdrVp en comparación
con los transfectantes es que BCRP es parte de un complejo
transportador multiproteico. La vía de translocación de
transportadores ABC típicos está compuesta de dos dominios de unión
a ATP y dos dominios altamente hidrófobos que contienen regiones de
membrana. Esto puede conseguirse en una única molécula, como es el
caso de MRP o Pgp, que son dos veces el tamaño de BCRP
(aproximadamente 1.300 en comparación con 655 aminoácidos). Como
alternativa, el complejo activo de ciertos transportadores ABC puede
formarse por la heterodimerización de dos proteínas no idénticas,
cada una de las cuales contiene una única región de unión a ATP e
hidrófoba. Las proteínas \omega y marrón (b) de Drosophila y las
proteínas Tap-1 y Tap-2 que
transportan proteínas de clase I de histocompatibilidad principal
son ejemplos de miembros de la familia ABC que muestran dicha
interacción cooperativa. La presencia del sitio de unión de
fosfopanteteína en BCRP sugiere que BCRP puede ser parte de un
complejo multiproteico. Por tanto, es posible que BCRP tenga un
cofactor o cofactores proteicos que hagan de ella un transportador
mucho más eficaz en un estado heteromérico. La activación o
sobreexpresión de este cofactor en células
MCF-7/AdrVp con relación a células
MCF-7 podría explicar el transporte aumentado de
fármacos en la sublínea MCF-7/AdrVp con relación a
los transfectantes de BCRP.
El descubrimiento de la expresión elevada de
ARNm de BCRP en las células S1M1-3.2 de carcinoma de
colon humano sugiere que BCRP es el transportador de fármacos "no
Pgp, no MRP" manifestado por esta línea celular resistente a
múltiples fármacos. Esto es de particular importancia a causa del
reciente informe (25) de un inhibidor específico del transportador
identificado en células S1M1-3.2. Este inhibidor,
fumitremorgina C (FTC), no invierte la resistencia en células que
sobreexpresan Pgp o MRP. La Figura 10 muestra que FTC es capaz de
potenciar la acumulación e inhibir el flujo de BBR 3390 (un fármaco
aza-antrapirazol que es evacua por BCRP) en células
MCF-7 transfectadas con BCRP.
Los siguientes ejemplos se proporcionan
solamente para propósitos ilustrativos y de ningún modo pretenden
limitar el alcance de la presente invención.
Líneas celulares. Las células de
carcinoma de mama MCF-7, su sublínea resistente a
fármacos MCF-7/AdrVp, y una sublínea de reversión
parcialmente sensible a fármacos (MCF-7/AdrVpPR,
obtenida del Dr. Antonio Fojo, Medicine Branch, National Cancer
Institute), se mantuvieron en cultivo como se ha descrito
previamente (5). La sublínea MCF-7/AdrVp se mantuvo
de forma continua en presencia de 100 ng/ml de doxorrubicina
(Pharmacia Adria, Dublin, OH) y 5 \mug/ml de verapamil (Sigma
Chemicals, St. Louis, MO).
Las condiciones de crecimiento para las líneas
celulares usadas en los estudios de transferencia de Northern están
contenidas en las referencias enumeradas en la Tabla 1. Las células
de carcinoma de colon S1M1-3.2 se obtuvieron de
células S1 (un subclón de la línea celular de carcinoma de colon
humano LS174T) por selección para el crecimiento a concentraciones
crecientes de mitoxantrona hasta que se consiguió una concentración
final de 3,2 \muM. Se adquirieron células
HL-60/MX2 de la American Type Culture Collection
(Manassas, VA) y se mantuvieron en cultivo como se ha descrito
previamente (17).
Ejemplo
1
Se transcribió de forma inversa el ARN celular
total purificado (2 \mug) de células MCF-7/W,
MCF-7/AdrVp o MCF-7/AdrVpPR que se
habían invertido parcialmente a la sensibilidad a fármacos por
cultivo en ausencia de agentes de selección con 200 unidades de
transcriptasa inversa de virus de la leucemia murina de Moloney en
presencia de un cebador oligo(dT) (0,1 \muM), y dNTP 1 mM a
42ºC durante 1 hora. Las reacciones se terminaron calentando a 75ºC
durante 10 minutos. Los ADNc producidos de este modo se almacenaron
a -20ºC hasta su uso adicional.
Las huellas genéticas de ARN se realizaron
usando el kit de huellas genéticas de ARN Delta^{TM} (Clontech
Laboratories, Palo Alto, CA) con modificaciones minoritarias. Las
huellas genéticas de ARN se consiguen por amplificación del ADNc por
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), usando cebadores
aleatorios.
Para cada reacción de huellas genéticas, se
amplificó ADNc diluido 1:10 (dilución A) o 1:40 (dilución B) de cada
línea celular con un cebador cadena arriba (P) y uno cadena abajo
(T) en presencia de dNTP 50 \muM, [^{33}P]dATP 50 nM, y
la "Advantage KlenTaq Polymerase Mix" suministrada con el kit
de Clontech. Los cebadores P cadena arriba eran de 25 unidades
arbitrarias. Los cebadores T cadena abajo eran cebadores
oligo(dT) anclados de 30 unidades cuyo extremo 3' contenía la
secuencia
5'-T_{9}N_{1}N_{1}-3', en la
que N_{1} es A, C o G. El cebador P se une al ADNc en base a la
homología casual. Se emparejaron diez cebadores P y nueve cebadores
T para dar 90 posibles combinaciones.
Los primeros tres ciclos de PCR se realizaron a
una rigurosidad relativamente baja (temperatura de hibridación
40ºC). A causa de esto, el cebador P se unió de forma imperfecta,
que aumentó la cantidad de productos amplificados. Los productos de
estos primeros ciclos después se amplificaron por 24 ciclos de PCR a
elevada rigurosidad (temperatura de hibridación 60ºC). Se prepararon
reacciones de control de PCR que contenían agua estéril en lugar de
ADNc (control de agua), o 0,02 \mug de ARN celular total (control
de ARN). Los controles de ARN se prepararon para evaluar si el ARN
estaba contaminado con ADN genómico.
Después de la reacción de PCR, se cargó una
pequeña cantidad de cada mezcla de reacción en un gel de
poliacrilamida al 5%, después de lo cual se secaron los geles,
después se hicieron autorradiografías (Figura 1A). Estas
autorradiografías demostraron un patrón de "huella genética de
ARN" característico de 50 a 100 bandas del producto de PCR de 100
a 2000 nucleótidos de longitud. Los carriles 1, 3, y 5 eran mezclas
de reacción en las que se había añadido ADNc diluido 1:10 (dilución
A); los carriles 2, 4, y 6 representan mezclas de reacción en las
que se había añadido ADNc diluido 1:40 (dilución B). Los carriles 7
y 8 son "controles de H_{2}O", en los que se había añadido
agua estéril a la mezcla de reacción de PCR en lugar de ADNc. Los
carriles 9, 10 y 11 son "controles de ARN", en los que se añade
0,02 \mug de ARN celular de MCF-7/W,
MCF-7/AdrVp, o MCF-7/AdrVpPR en
lugar de ADNc. Estos "controles de ARN" sirven para indicar la
contaminación del ARN con ADN genómico. Las autorradiografías se
inspeccionaron para los productos de PCR que se produjeron en mayor
abundancia en reacciones que usaron ARN transcrito de forma inversa
de células MCF-7/AdrVp, en comparación con los del
ARN usado de las células MCF-7/W o
MCF-7/AdrVpPR (Figura 1A). La FLECHA indica un
producto de PCR que representa una especie de ARNm que se
sobreexpresa en células MCF-7/AdrVp, en comparación
con las células MCF-7/W o
MCF-7/AdrVpPR. Este es el producto de PCR que se
cortó del gel y se amplificó y clonó usando el método de
"Clonación TA", cuyo clon deseado se llamó Clon 8 (véase a
continuación).
El producto de PCR sobreexpresado en células
MCF-7/AdrVp se escindió del gel secado y se eluyó
hirviendo en 40 ml de ddH_{2}O durante 5 minutos, después se
amplificó por PCR durante 20 ciclos usando los cebadores originales
y se separó en geles de agarosa al 2%/bromuro de etidio. Estos
productos de PCR después se ligaron en un plásmido "Vector de
Clonación TA", pCR® 2.1, que después se clonó usando técnicas
convencionales para productos de PCR (Kit TA Cloning® Original,
Invitrogen Corporation, San Diego, CA).
Los plásmidos pCR®2.1 que contienen el producto
de PCR se usaron para transformar la cepa TOP 10F de E. coli.
Se cogieron colonias bacterianas individuales y se aisló el ADN
plasmídico por minipreparaciones (Wizard^{TM} Miniprep, Promega,
Madison, WI). Se amplificó el ADN plasmídico por PCR con los
cebadores "P" y "T" originales, después se sometieron a
electroforesis en gel. La banda de tamaño original se cortó, y se
aisló el ADN hirviendo en 100 \mul de ddH_{2}O a 100ºC durante 5
minutos. Se volvió a amplificar una alícuota del ADN por PCR con los
cebadores originales durante 20 ciclos. Se visualizó una única banda
en geles con bromuro de etidio que se cortó, electroeluyó y después
se precipitó.
Se usó el método de transferencia de Northern
"inverso" para explorar los clones del vector TA. En resumen,
se realizó un análisis de Northern "inverso" del siguiente
modo. El producto de PCR aislado de 12 diferentes colonias de E.
coli que estaban transformadas por el plásmido pCR2.1 se fijó
por duplicado a membranas Zeta Probe (BioRad, Richmond, CA) en un
aparato de slot blot. Una de las membranas duplicadas se sondeó con
la mezcla de reacción de PCR marcada con [^{33}P] que amplificó el
ADNc de MCF-7 usando los cebadores "P" y
"T" originales en el kit de Huella genética de ARN. La otra
membrana se sondeó con la mezcla de reacción de PCR paralela marcada
con [^{33}P] original que amplificó el ADNc producido por células
MCF-7/AdrVp, usando condiciones de transferencia de
Northern convencionales de hibridación, después de lo cual se evaluó
la unión de la sonda por autorradiografía. Un único clon TA (Clon 8
- SEC ID Nº 7) se identificó de este modo cuyo inserto de producto
de PCR identificaba una especie de ARN de 2,4 kb que estaba
marcadamente sobreexpresada en células MCF-7/AdrVp,
en comparación con células MCF-7 (Figura 1B, panel
superior). La sublínea MCF-7/AdrVpPR de reversión
parcial tenía una expresión intermedia de la especie de ARNm de 2,4
kb (Figura 1B, panel superior). Para controlar la equivalencia en la
carga de los carriles, se separa la transferencia y después se
vuelve a sondear con ARN 18S radiomarcado (Figura 1B, panel
inferior).
Se realizaron transferencias de Southern usando
el producto de PCR del Clon 8. En resumen, se aisló el ADN, se
digirió con EcoR1, se sometió a electroforesis en gel de
agarosa, se transfirió y fijó a un filtro de nitrocelulosa. El
filtro se sondeó con el producto de PCR de Clon 8 que se marcó en el
extremo con [^{32}P]-dCTP, después se hizo la
autorradiografía mostrada (Figura 1C, panel superior). Esto demostró
que el gen afín para BCRP se amplificaba en células tanto
MCF-7/AdrVp como MCF-7/AdrVpPR, en
comparación con las células MCF-7 parentales (Figura
1C, panel superior). El panel inferior de la Figura 1C muestra el
electroforetograma del gel de agarosa teñido con bromuro de etidio
del ADN genómico correspondiente después de la digestión con
EcoR1, para demostrar la equivalencia aproximada de la carga
del gel.
Se realizó la secuenciación de los ADNc con un
secuenciador de ADN automático (Perkin Elmer, Inc., Foster City,
CA). Todas las secuencias de ADN se confirmaron secuenciando en la
dirección inversa. El producto de PCR expresado de forma diferencial
en el Clon 8 TA se secuenció y se descubrió que era un ADNc de 795
pb (SEC ID Nº 7). Las búsquedas en bases de datos de proteínas de la
secuencia de aminoácidos deducida reveló un elevado grado de
homología con miembros de la superfamilia ABC de proteínas
transportadoras.
Se construyó una biblioteca de ADNc de
MCF-7/AdrVp usando el kit de construcción de
bibliotecas de ANDc por PCR CapFinder^{TM} (Clontech) de acuerdo
con el protocolo del fabricante. La técnica de CapFinder^{TM} está
diseñada específicamente para producir ADNc bicatenario de longitud
completa. El fragmento de ADNc del Clon 8 de 795 pb se radiomarcó y
usó como sonda para explorar la biblioteca de ADNc preparada a
partir de células MCF-7/AdrVp. Los clones positivos
aislados se sometieron a exploración secundaria y terciaria, después
se ensayaron por hibridación por transferencia de Northern usando
ARN obtenido de células MCF-7,
MCF-7/AdrVp y MCF-7/AdrVpPR. Se
encontraron múltiples clones que tenían insertos de 2,4 kb, el
tamaño aproximadamente del ARNm de BCRP sugerido por transferencia
de Northern.
Se ligaron cuatro de los insertos de 2,4 kb en
el plásmido pCR2.1, después se clonaron estos vectores TA en E.
coli (como se ha descrito anteriormente). Un clon del vector TA
que contenía un inserto del fragmento de ADNc de 2,4 kb se
identificó y aisló. La secuenciación del inserto de ADNc de 2,4 kb
se realizó con un secuenciador de ADN automático (Perkin Elmer Inc.,
Foster City, CA). Todas las secuencias de ADN se confirmaron por
secuenciación en la dirección inversa. Después de secuenciar, se
descubrió que el inserto de ADNc era de 2418 pb de longitud como en
la Figura 2C o la SEC ID Nº 2. El análisis del ADNc para las fases
de lectura abierta (ORF) usando el programa "FRAMES" contenido
en el paquete de software Genetics Computer Group (GCG) indicó la
presencia de una ORF larga que comenzaba en la posición 239, y
finalizaba con el codón de parada TAA en la posición
2204-6. La secuencia de aminoácidos deducida de esta
ORF se muestra en la Figura 2A, y la SEC ID Nº 1. La proteína tiene
655 aminoácidos y un peso molecular aproximado de aproximadamente
72,3 kilodalton. La proteína codificada por esta secuencia se ha
denominado Proteína de Resistencia de Cáncer de Mama, o BCRP (Figura
2A).
El análisis de la secuencia de BCRP con el
programa de GCG "MOTIFS" demostró una única región de unión a
ATP/GTP (11) Walker "A" en los aminoácidos
80-87 y un sitio de unión a fosfopanteteína en los
aminoácidos 213-228 (Figura 2A). La fosfopanteteína
(o panteteína 4' fosfato) es el grupo prostético de las proteínas de
vehículo de acilo en algunos complejos multienzimáticos donde sirven
para la unión de ácidos grasos activados y grupos aminoácido
(12).
El examen de la estructura de BCRP con los
programas de GCG "PEPPLOT" y "PLOTSTRUCTURE" reveló un
dominio amino-terminal relativamente hidrófilo
(aminoácidos 1-400) que contiene la secuencia de
unión a ATP y un dominio carboxi-terminal
relativamente hidrófobo (aminoácidos 401-655), que
contiene al menos tres dominios transmembrana putativos (TM1, TM2 y
TM3), y cuatro sitios de N-glicosilación potenciales
(Glyc) (Figura 2A). Los dominios transmembrana se estimaron por el
uso de un programa para predecir hélices en proteínas de membrana
integradas (13). El análisis de la secuencia de BCRP por el programa
de GCG "DOTPLOT" demuestra que el péptido es homólogo con la
mitad de la molécula Pgp o MRP duplicada, excepto que Pgp o MRP
tienen la configuración NH_{2}-[dominios transmembrana]-[unión a
ATP 1]-[dominios transmembrana]-[unión a ATP
2]-COOH, mientras que la de BCRP es NH_{2}-[unión
a ATP]-[dominios transmembrana]-COOH. La similitud
relativa de BCRP con otros miembros de la superfamilia de
transportadores ABC se determinó usando el programa "PILEUP" de
GCG. Este análisis demostró que la secuencia peptídica de BCRP está
relacionada sólo de forma distante con la
P-glicoproteína (PgP o Mdr1) o MRP (Figura 2B).
Se consiguieron análisis de ADNc y secuencias
proteicas deducidas usando bases de datos de proteínas y nucleótidos
a las que se accedieron usando el Wisconsin Sequence Analysis
Package Versión 8 (Genetics Computer Group [GCG], Madison, WI] que
están disponibles a través de la Frederick Cancer Research Center's
Supercomputing Facility (Frederick, MD).
Una comparación "FASTA" de la secuencia de
aminoácidos de BCRP reveló un elevado grado de homología con al
menos 50 proteínas de transporte de casete de unión a ATP. La mayor
coincidencia fue PIR2:G02068, el homólogo humano del gen blanco
(\omega) de Drosophila, que tiene 638 aminoácidos, y es un
29,3% idéntico a BCRP. El gen \omega en Drosophila funciona
en el transporte celular de guanina y triptófano, que son
precursores del pigmento de la retina (9). Se descubrió que el
homólogo humano de \omega no se sobreexpresa en células
MCF-7/AdrVp en comparación con células
MCF-7, como se detecta por un ensayo de PCR de
transcripción inversa (Figura 6).
El programa "Oligo" (Versión 5.0, National
Biosciences, Inc., Plymouth, MN) se usó para ayudar a determinar los
cebadores adecuados para la detección del homólogo humano de
\omega por PCR de transcripción inversa. Estos ensayos se hicieron
usando una modificación de los descritos previamente para la beta
actina y MRP (10), excepto en que se usaron cebadores específicos
para el gen \omega en lugar de MRP. El cebador superior comienza
en la posición 5' 2136 del ARNm de \omega humano, y tenía la
secuencia 5'-CGA CCG ACG ACA CAG
A-3) (SEC ID Nº 3). El cebador inferior comienza en
la posición 3' 2590, y tenía la secuencia 5'-CTT AAA
ATG AAT GCG ATT GAT-3') (SEC ID Nº 4). Para asegurar
la uniformidad de la carga del gel, también se realizó un ensayo de
PCR de transcripción inversa para la beta actina. Las
concentraciones finales de los cebadores usados fueron 200 nM. Se
realizaron veinticinco ciclos de desnaturalización (94ºC, 1 minuto),
hibridación (50ºC, 1 minuto) y elongación (72ºC, 2 minutos). La
Figura 6 muestra una electroforesis en gel de agarosa de una
alícuota de las mezclas de reacción de PCR que usaron ARN de células
MCF-7 o MCF-7/AdrVp que demuestra
que tanto \omega como la beta actina humanas se expresan de forma
aproximadamente igual en estas líneas celulares.
Se realizó transferencia de Northern con una
sonda de ADNc del Clon 8 marcado con ^{32}P. El ARN sometido a
electroforesis en gel de agarosa pretransferido de múltiples tejidos
se adquirió de Clontech, para su uso en múltiples ensayos de
transferencia de Northern tisular. (Figura 3). La mayor expresión de
BCRP se observó en tejido placentario, con cantidades inferiores de
expresión demostrable en cerebro, próstata, intestino delgado,
testículo, ovario, colon e hígado. Los transcritos de BCRP
estuvieron por debajo del nivel de detección en el corazón, pulmón,
músculo esquelético, riñón, páncreas, bazo, timo y leucocitos de
sangre periférica.
Se insertó el ADNc de BCRP de longitud completa
en el sitio de clonación múltiple del vector de expresión pcDNA3
(Invitrogen). Después de la subclonación de la construcción de
pcDNA3-BCRP, se realizó un análisis de secuencia de
ADN para confirmar que el inserto en el clon que se eligió que
estaba en una orientación con sentido respecto al promotor CMV del
vector pcDNA3. Se transfectaron células MCF-7 con
pcDNA3-BCRP, usando el método de precipitación con
fosfato cálcico (17), seleccionadas por cultivo con geneticina
(G418, 1 mg/ml), después de subclonaron por dilución limitante en
placas de cultivo de fondo redondo de 96 pocillos. Los subclones se
ensayaron para la expresión de ARNm de BCRP por análisis de
transferencia de Northern, usando el ADNc del Clon 8 radiomarcado
como sonda (Figura 4A). Como control, también se transfectaron
células MCF-7 con el vector pcDNA3 vacío, después se
seleccionaron por crecimiento en medio que contenía 1 mg/ml de G418
(Figura 4A). Se seleccionaron dos clones de células
MCF-7 transfectadas con pcDNA3-BCRP
que se descubrió que sobreexpresaban BCRP (clones 6 y 8) y se
expandieron para estudios adicionales (Figura 4A). Un tercer clon de
las células transfectadas con pcDNA3-BCRP, el clon
19, no sobreexpresaba BCRP, y se seleccionó para el estudio como
control.
Se examinó la acumulación y retención de
daunorrubicina en las células transfectadas mediante citometría de
flujo. Los clones 6 y 8 que sobreexpresan BCRP presentaron una
acumulación y retención disminuida de daunorrubicina, en comparación
con los controles transfectados con vector (Figura 4B), con
concentraciones de estado estacionario intracelular de fármaco en
los clones 8 y 6 respectivamente de aproximadamente el 30% o el 50%
de las obtenidas en las células de control de vector. Esta
diferencia no se debió a diferencias en el volumen de células, ya
que los volúmenes de las sublíneas que sobreexpresan BCRP ensayadas
no era menor que la de las células de control transfectadas con
vector vacío. Los volúmenes de células, medidos por Coulter
Channelyzer^{TM} son 2515\pm56, 3074\pm112 y 2459\pm56
\mum^{3} para el clon 6 MCF-7/BCRP, clon 8
MCF-7/BCRP y las células de control con vector
MCF-7/pcDNA3, respectivamente. Estos valores son
comparables con las mediciones previas de los volúmenes de células
MCF-7 (5).
La sensibilidades de las diversas sublíneas
transfectadas a los agentes quimioterapéuticos se ensayaron por el
ensayo de citotoxicidad con sulforrodamina-B (SRB)
(14). Se calculó la LC_{50} definida como la concentración de
fármaco que causaba letalidad al 50% de las células. A partir de
esto, se calculó "Factor de Resistencia" (RF) dividiendo la
LC_{50} para un fármaco dado frente a una línea celular
transfectada por la LC_{50} de ese fármaco frente a células
MCF-7 no transfectadas. Los clones 6 y 8 que
sobreexpresan BCRP presentaron resistencia a mitoxantrona,
daunorrubicina y doxorrubicina, en comparación con las células del
clon 19 que no sobreexpresan BCRP, células MCF-7, o
los controles transfectados con vector vacío (Figuras 4C, 4D, 5). La
Figura 5 contiene los valores de LC_{50} medios para múltiples
experimentos de citotoxicidad para todas las líneas celulares y
fármacos ensayados. La Figura 4D muestra estudios de LC_{50}
típicos para los seis fármacos ensayados para células
MCF-7/W y células
MCF-7/pcDNA3-BCRP clon 8 para
ilustrar los datos de los que se obtuvieron los valores de
LC_{50}, y la exactitud de las mediciones. El asterisco y la línea
continua en la Figura 4D indican células MCF-7/W,
los cuadrados cerrados y las líneas de puntos representan células
del clon 8 MCF-7/pcDNA3-BCRP. Las
barras verticales en la Figura representan la desviación típica de
seis determinaciones duplicadas.
Como las células MCF-7/AdrVp,
los clones 6 y 8 transfectantes de MCF-7/BCRP
presentaron el mayor grado de resistencia a mitoxantrona. El patrón
de resistencia cruzada presentada por las células transfectadas que
sobreexpresan BCRP es muy similar al presentado por células
MCF-7/AdrVp, excepto que las células
MCF-7/AdrVp tienen mayor resistencia relativa a
todos los fármacos citotóxicos en el fenotipo. Los clones 6 y 8
transfectados con BCRP permanecieron relativamente sensibles a
idarrubicina, cisplatino y paclitaxel (taxol), ya que son células
MCF-7/AdrVP (Figuras 4C, 4D y 5).
Para determinar los efectos del agotamiento del
ATP sobre la retención de rodamina 123 por las células transfectadas
con BCRP en comparación con los controles, se incubaron células en
medio completo o en condiciones de agotamiento de ATP. Se agotó el
ATP de las células MCF-7 por incubación en DMEM
libre de glucosa que contenía
2-desoxi-D glucosa 50 mM y azida
sódica 15 mM durante 20 minutos (37ºC). Se añadió rodamina 123 (0,5
\mug/ml de concentración final) durante 30 minutos más. Las
células se colocaron en hielo, se lavaron de rodamina, y se
incubaron en condiciones de agotamiento de ATP durante 30 minutos
más, y se determinó la retención de rodamina por citometría de flujo
(excitación 488 nm, emisión 520 nm). Esto demuestra que la función
de transporte de BCRP parece depender del ATP.
Los ensayos de RT-PCR se
realizaron usando una modificación de los descritos previamente para
la beta actina y MRP (10), excepto en que se usaron cebadores
específicos para BCRP en lugar de MRP. Para BCRP, los cebadores
usados fueron (con sentido) 5'-TTA GGA TTG AAG CCA
AAG G-3' (SEC ID Nº 5) y (antisentido)
5'-TAG GCA ATT GTG AGG AAA ATA-3'
(SEC ID Nº 6). El extremo 5' del cebador con sentido comienza en la
posición nucleotídica 1727 del ADNc de BCRP (SEC ID Nº 2 y Figura
2C); el extremo 3' de la sonda antisentido corresponde a la posición
2152 del ADNc de BCRP (Figura 2C). Las concentraciones finales de
los cebadores usados fueron 200 nM. La concentración de magnesio
final usada para PCR fue 700 \muM. Se realizaron treinta y cinco
ciclos de desnaturalización (94ºC, 1 minuto), hibridación (50ºC, 1
minuto) y elongación (72ºC, 2 minutos). Después de la electroforesis
en gel de agarosa de una alícuota de la mezcla de reacción de PCR,
los geles se transfirieron a nitrocelulosa y se hizo la
transferencia de Southern como se ha descrito previamente (12),
usando el producto de PCR del clon 8 de 795 pb (extremo 5' marcado
por ^{32}P-dCTP) como sonda para BCRP. La longitud
del producto de PCR esperada es 446 pb.
El ARN celular total se obtuvo de las células
blásticas de catorce pacientes con AML. Se hicieron controles usando
volúmenes variables de la mezcla de reacción de PCR que se proceso
con ARN de MCF-7/W transcrito de forma inversa. Los
resultados de estos controles y los ensayos de
RT-PCR de las muestras de células blásticas de los
pacientes se representan en la Figura 7. Estos controles que usan
ARN de MCF-7/W indican que el ensayo de
RT-PCR que se desarrolló es cuantitativo. Obsérvese
en la Figura 7 que algunos pacientes tienen niveles muy bajos de
expresión de BCRP, mientras que otros (pacientes 3, 4, 5 y 7) tienen
niveles de expresión comparables con o mayores que el de las células
MCF-7/W. Esta variación en la expresión de BCRP
entre muestras de células blásticas de pacientes AML mantiene
abierta la posibilidad de que esos pacientes que tienen una
expresión relativamente elevada de BCRP sean más resistentes al
tratamiento con los fármacos anti-neoplásicos que
son susceptibles a la resistencia causada por BCRP (antraciclinas y
mitoxantronas). La mitoxantrona y la antraciclina daunorrubicina son
fármacos importantes usados en el tratamiento de AML.
Se usó el ARN celular total para el análisis de
Northern en todos los casos excepto para células H209 o H69, en las
que se usó poli A+. La extracción de ARN y la transferencia de
Northern se realizaron por técnicas convencionales, y como se ha
descrito en el Ejemplo 4. Se usó un fragmento de 795 pb (clon 8, SEC
ID Nº 7) del extremo 3' del ADNc de BCRP de 2418 pb como sonda de
hibridación después de marcarla con [^{32}P]-dCTP
(kit de marcaje "Prime-a-Gene",
Promega, Madison, WI). Para controlar las variaciones en la carga de
muestra, se separaron las transferencias, después se
re-hibridaron con \beta-actina
marcada con ^{32}P o sondas de ARN 18S.
La Figura 8A muestra los resultados de la
hibridación de transferencia de Northern del ARNm de células
MCF-7 (carril 1), células
MCF-7/MITOX (carril 2), células 8226/ W (carril 3),
y células 8226/MR20 (carril 4). La transferencia se sondeo para BCRP
con un ADNc de 795 pb (Clon 8, SEC ID Nº 7) después de marcar con
^{32}P-dCTP (panel superior). Para controlar la
equivalencia en la carga de muestra, se separó la transferencia y se
volvió a sondear para la \beta-actina.
La Figura 8B muestra los resultados de una
hibridación de transferencia de Northern de ARNm de células
S1/M1-3.2 (carril 1), células S1/W (carril 2),
células MCF-7/W (carril 3), células
MCF-7/MX_{PR} (carril 4), células
MCF-7/MX_{RS250} (carril 5), células
MCF-7/MX_{RS600} (carril 6), células
MCF-7/VP (MRP+) (carril 7), células
MCF-7/Adr (Pgp+) (carril 8), células
MCF-7/MTX (DHFR+) (carril 9),
MCF-7/AdrVp1000 (BCRP+) (carril 10). La
transferencia se sondeó como se ha descrito para la Figura 8A.
La Figura 8C muestra una hibridación de
transferencia de Northern de ARNm de células HT29 de carcinoma de
colon humano (carril 1), células HT29RNOV (carril 2), células
MDA-MB-231 de carcinoma de mama
humano (carril 3), células MDA-MB 231RNOV (carril
4), células EPF86-079 de fibrosarcoma humano (carril
5), células EPF86-079RNOV (carril 6), células
EPG85-257 de carcinoma gástrico humano (carril 7),
células EPG85-257RNOV (carril 8), células
EPG85-257RDB (Pgp+) (carril 9), células
EPP85-181 de carcinoma pancreático humano (carril
10), células EPP85181RNOV (carril 11), y células
EPP85-181RDB (Pgp+) (carril 12). Las transferencias
se sondearon como se ha descrito anteriormente para la Figura
8A.
Se aisló el ADN genómico usando técnicas
convencionales (8) de las células MCF-7/W sensibles
al fármaco parental (carriles 1, 7), células
MCF-7/MX_{PR} (carriles 2, 8); células
MCF-7/MX_{RS250} (carriles 3, 9), células
MCF-7/MX_{RS600} (calles 4, 10), células
MCF-7/VP (sobreexpresión de MRP, carriles 5, 11), y
células MCF-7/MTX (derivados de resistencia por
sobreexpresión de DHFR, carriles 6, 12), se digirió con EcoR1 o
BamH1, se separó por electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, se
tiñó con bromuro de etidio, se transfirió, y se fijó a un filtro de
nitrocelulosa usando técnicas convencionales (8). El filtro se
hibridó con la sonda de BCRP de 795 pb marcada con [^{32}P] como
se ha descrito anteriormente para la Figura 8 (Figura 9, panel
superior). La electroforesis en gel de agarosa al 0,8% teñido con
bromuro de etidio del ADN genómico después de la digestión con las
endonucleasas de restricción, y antes de la transferencia al filtro
de nitrocelulosa, demostró una equivalencia aproximada de la carga
de muestra (Figura 9, panel inferior).
Se cultivaron células MCF-7
transfectadas con el vector vacío pcDNA3 o pcDNA3 que contiene el
ADNc de BCRP de longitud completa (clon transfectante 8) en forma de
monocapas en matraces de cultivo tisular. Los efectos de FTC en la
acumulación de aza-antrapirazol BBR3390 se midieron
exponiendo estas células al aza-antrapirazol BCR3390
fluorescente (5 \muM) en presencia o ausencia de FTC 10 \muM
durante 60 minutos. Después, se retiraron las células de los
matraces por tratamiento con tripsina, y se midió el contenido de
BBR3390 intracelular por citometría de flujo. Se midieron los
efectos de FTC sobre la retención de BBR3390 exponiendo otro
conjunto de células (control de vector y clon 8 transfectante) a
BBR3390 5 \muM y sin FTC 10 \muM durante 60 minutos, retirando
por lavado de las células el fármaco, después reincubando las
células durante 30 minutos más en medio reciente con y sin FTC. Se
midió el contenido de BBR3390 intracelular por citometría de flujo.
(Véase la Figura 10).
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\hskip1cmAbrusso, Lynne V.
\hskip1cmRoss, Douglas D.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proteína de Resistencia de Cáncer de
mama (BCRP) y AND que la codifica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Ross Umb conversion
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<140> 011-005
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<141>
05-02-1999
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<150> 60/073763
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<151>
05-02-1998
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<160> 7
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 655
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Células MCF-7/AdrVp
humanas
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 2418
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Células MCF-7/AdrVp
humanas
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 16
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 4
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\hfill
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<212> ADN
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<400> 5
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<210> 6
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<400> 6
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\hskip-.1em\dddseqskiptaggcaattg tgaggaaaat a
\hfill
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<210> 7
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<211> 795
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
Claims (17)
1. Polipéptido que tiene la secuencia de
la SEC ID Nº 1 (Proteína de Resistencia de Cáncer de Mama, BCRP)
que induce resistencia a los fármacos quimioterapéuticos contra el
cáncer en células de cáncer de mama.
2. El polipéptido de la reivindicación 1
que es de aproximadamente 655 aminoácidos de longitud.
3. El polipéptido de la reivindicación 1
que tiene una masa molecular de 72,3 kilodalton.
4. Un anticuerpo que se une al
polipéptido de la reivindicación 1.
5. El anticuerpo de la reivindicación 4
que es monoclonal.
6. El anticuerpo de la reivindicación
que es policlonal.
7. Una secuencia de ácido nucleico que
codifica el polipéptido de la reivindicación 1.
8. La secuencia de ácido nucleico de la
reivindicación 7 que es la secuencia de la SEC ID Nº 2.
9. Un ácido nucleico que comprende la
secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 2.
10. Una sonda antisentido que inhibe la
expresión del polipéptido de la reivindicación 1.
11. La sonda antisentido de la
reivindicación 10 que es la cadena complementaria de la secuencia de
la SEC ID Nº 7.
12. Un método para determinar la causa de
la resistencia de un paciente a los fármacos quimioterapéuticos
contra el cáncer ensayando in vitro la expresión del
polipéptido de la reivindicación 1, por lo que la sobreexpresión de
dicho polipéptido indica que esa es la causa.
13. Uso del anticuerpo de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 para preparar un
medicamento para inhibir la actividad de la Proteína de Resistencia
de Cáncer de Mama.
14. Uso de la sonda de la reivindicación 11
para preparar un medicamento para inhibir la actividad de la
Proteína de Resistencia de Cáncer de Mama.
15. Uso del anticuerpo de la reivindicación
4 para preparar un medicamento para potenciar un tratamiento
quimioterapéutico del paciente contra el cáncer.
16. Uso de la sonda de la reivindicación 11
para preparar un medicamento para potenciar un tratamiento
quimioterapéutico del paciente contra el cáncer.
17. Uso de Fumitremorgina C para preparar
un medicamento para potenciar un tratamiento quimioterapéutico del
paciente contra el cáncer de mama.
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