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TECHNISCHES
GEBIET
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Gegenstand
der Erfindung ist ein Nucleinsäurefragment
mit der Funktion zur Förderung
der Expression von Strukturgenen, die sich stromabwärts vom
Nucleinsäurefragment
befinden, ein rekombinanter Vektor, enthaltend dasselbe und ein
Verfahren zur Expression von Strukturgenen unter Verwendung desselben.
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HINTERGRUND
DES STANDES DER TECHNIK
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Die
Förderung
der Expression von Fremdgenen stellt das am meisten benötigte Verfahren
zur Applikation der Genmanupulationstechniken an Pflanzen dar. Dieses
Verfahren schließt
die Nutzung eines DNA-Fragments mit einer Aktivität zur Förderung
der Genexpression ein. Bekannte DNA-Fragmente, welche die Expression
von Fremdgenen fördern,
schließen
das Intron der Maisalkoholdehydrogenase (Callis et al. Gene & Development 1,
1183–1200
(1987)), und das erste Intron der Reisphospholipase D (auf die hierin nachstehend
auch als auf „PLD" verwiesen wird)
ein (Internationale Publikation WO96/30510). Des Weiteren wurden
die Einflüsse
auf die Aktivität
zur Förderung
der Genexpression, durch Deletieren eines Teils einer internen Region
eines Introns oder durch Insertieren des gleichen Introns in eine
Stelle im Intron, berichtet (Mascarenhas et al. Plant Mol. Biol.
15, 913–920
(1990), Clancy et al. Plant Sci. 98, 151–161 (1994)).
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Bisher
ist jedoch die Anzahl an DNA-Fragmenten, die für diesen Zweck verwendet werden
können, beschränkt, und
in den meisten Fällen
sind ihre Wirkungen zur Förderung
der Genexpression unzureichend. Deshalb wurde ein DNA-Fragment mit
einer höheren
Aktivität
gefordert. Obwohl weiter versucht wurde, die Aktivität zur Förderung
der Expression durch Modifikation der Intronsequenzen zu steigern,
wurde nicht über
die Region berichtet, welche die Aktivität zur Förderung der Expression in einem
Intron aufweist, und ein Fall, worin die Förderungsaktivität eines
vom Intron herrührenden
Original-DNA-Fragments
verdoppelt wird, ist nicht bekannt.
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OFFENBARUNG
DER ERFINDUNG
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist demgemäß die Bereitstellung eines
neuen Nucleinsäurefragments
mit einer hohen Aktivität
zur Förderung
der Expression von Strukturgenen, die sich stromabwärts vom
Nucleinsäurefragment
befinden; eines rekombinanten Vektors, der das vorstehend erwähnte Nucleinsäurefragment
enthält,
worin die Expression eines Strukturgens gefördert wird; und die Bereitstellung
eines Verfahrens zur Förderung
der Expression eines Strukturgens unter Verwendung des vorstehend
erwähnten
Nucleinsäurefragments,
welches Strukturgen sich stromabwärts vom Nucleinsäurefragment
befindet.
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Die
erfinderische Tätigkeit
umfasste intensive Untersuchungen, wobei entdeckt wurde, dass eine
spezifische Region im ersten Intron der Reisphospholipase D (auf
die hierin nachstehend auch als auf "PLD" verwiesen
wird) eine hohe Aktivität
zur Förderung
der Genexpression aufweist, womit die vorliegende Erfindung abgeschlossen
ist.
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Das
heißt,
dass die vorliegende Erfindung eine Nucleinsäuresequenz zur Förderung
der Expression eines Strukturgens bereitstellt, das sich stromabwärts davon
befindet, umfassend eine Vielzahl an Nucleinsäurefragmenten, die ligiert
sind, worin jedes Fragment die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Nucleotidsequenz
aufweist.
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Gegenstand
der Erfindung ist weiter ein Verfahren zur Förderung der Expression eines
Strukturgens, umfassend die Insertion, an einer Stelle stromaufwärts vom
Strukturgen, einer Nucleinsäuresequenz
zur Förderung
der Expression eines Strukturgens, das sich stromabwärts davon
befindet, umfassend eine Vielzahl an Nucleinsäurefragmenten, die ligiert
sind, worin jedes Fragment die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Nucleotidsequenz
aufweist.
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Gegenstand
der Erfindung ist weiter eine Pflanze oder Nachkommen davon, die
an einer Stelle stromaufwärts
vom Strukturgen eine wie vorstehend beschriebene Nucleinsäure umfasst/umfassen.
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Es
wurde erfindungsgemäß ein neues
Nucleinsäurefragment
bereitgestellt, das die Expression eines Strukturgens durch Insertieren
der Nucleinsäure
in eine Stelle stromaufwärts
vom Strukturgen signifikant fördert.
Durch Insertieren des erfindungsgemäßen Nucleinsäurefragments
in eine Stelle stromaufwärts
von einem Strukturgen, wird die Expression des Strukturgens gefördert. Deshalb
kann erfindungsgemäß die Expression
von zum Beispiel eines Fremdgens in einem rekombinanten Vektor gefördert werden,
so dass erwartet wird, dass die vorliegende Erfindung einen sehr
weitgehenden Beitrag auf dem Gebiet der genetischen Manipulation
oder dergleichen leisten wird.
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BESTE AUSFÜHRUNGSFORM
DER ERFINDUNG
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Wie
vorstehend erwähnt
wird, stellt das erfindungsgemäße Nucleinsäurefragment
die Nucleinsäuresequenz
zur Förderung
der Expression eines Strukturgens dar, das sich stromabwärts davon
befindet, umfassend eine Vielzahl an Nucleinsäurefragmenten, die ligiert
sind, worin jedes Fragment die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Nucleotidsequenz
aufweist. Die in SEQ ID NO: 3 im Sequenzprotokoll gezeigte Nucleotidsequenz
stellt jedoch die Nucleotidsequenz des ersten Introns der Reis-PLD
dar, und da erfindungsgemäß offenbart
wurde, dass das erste Intron der Reis-PLD eine Aktivität zur Förderung
der Expression des Gens aufweist, das sich stromabwärts davon
befindet (Internationale Publikation WO96/30510), ist diese Sequenz
ausgeschlossen. Die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Nucleotidsequenz stellt
die Nucleotidsequenz des Bereichs im ersten Intron (SEQ ID NO: 3)
der Reis-PLD vom zweiten Nucleotid (hierin nachstehend zum Beispiel
als „ 2
nt" angegeben) aus
dem 5'-Ende bis
65 nt dar.
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Wie
vorstehend erwähnt
wird, weisen die Nucleinsäurefragmente,
die ligiert sind, worin jedes Fragment die wie in SEQ ID NO: 1 gezeigte
Nucleotidsequenz aufweist, Aktivitäten zur Förderung der Expression eines
sich stromabwärts
von den Nucleinsäurefragmenten
befindenden Strukturgens auf. In diesem Fall weist die Region im
modifizierten Nucleinsäurefragment,
die einer Region in der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Sequenz entspricht,
bevorzugt eine Homologie von nicht weniger als 70%, bevorzugter
von nicht weniger als 85%, bevorzugter nicht weniger als 95% mit
der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Sequenz auf. Des Weiteren hybridisieren diese
modifizierten Nucleinsäurefragmente
mit der Nucleinsäure,
die die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Nucleotidsequenz aufweist, unter
stringenten Bedingungen (d. h. die Hybridisierung wird in einer üblichen
Hybridisierungslösung,
wie zum Beispiel 5 × Denhardt-Reagenz,
6 × SSC,
0,5% SDS oder 0,1% SDS, bei 50 bis 65°C, bevorzugt in zwei Schritten
bei 50°C
und bei 60°C
oder in vier Schritten bei 50°C,
55°C, 60°C und 65°C durchgeführt).
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Wenn
die erfindungsgemäße Nucleinsäure in eine
Stelle stromaufwärts
von einem Strukturgen insertiert wird, von dem erwünscht ist,
dass dessen Expression gefördert
wird, ist die Insertion eines Fragments bevorzugt, dessen Größe so klein
wie möglich
ist, welches Fragment eine Aktivität zur Förderung der Genexpression aufweist.
Folglich beträgt
die Anzahl an Nucleotiden im erfindungsgemäßen Nucleinsäurefragment
bevorzugt nicht mehr als 120, bevorzugter nicht mehr als 80 und
bevorzugter nicht mehr als 64.
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Durch
Ligieren von zwei oder mehr erfindungsgemäßen Fragmenten, kann die Aktivität gesteigert
werden. In diesem Fall können
die erfindungsgemäßen Nucleinsäurefragmente
direkt ligiert werden oder es kann eine Intervening-Sequenz dort
dazwischen existieren.
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Die
erfindungsgemäße Nucleinsäure kann
entweder DNA oder RNA sein. DNA ist jedoch hinsichtlich der Stabilität bevorzugt.
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Die
erfindungsgemäßen Nucleinsäurefragmente
können
anhand der chemischen Synthese leicht hergestellt werden. Da die
Nucleotidsequenz des ersten Introns des Reis- PLD-Gens bekannt ist
(International Publikation WO96/30510), können die erfindungsgemäßen Nucleinsäurefragmente
als Alternative leicht anhand von Nucleinsäureamplifikationsverfahren,
wie zum Beispiel der PCR unter Verwendung der genomischen DNA von
Reis als Matrize, erhalten werden. Die PCR ist im Stand der Technik überall bekannt
und ein Kit und Gerät
sind deshalb gewerblich erhältlich,
so dass sie leicht durchgeführt
werden kann.
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In
Fällen,
in denen eine Vielzahl an erfindungsgemäßen Nucleinsäurefragmenten
ligiert wird, kann eine Vielzahl an erfindungsgemäßen Nucleinsäurefragmenten
vorläufig
ligiert werden, oder ein erfindungsgemäßes Nucleinsäurefragment
kann in eine Region insertiert werden, die das erfindungsgemäße Nucleinsäurefragment
enthält.
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Durch
Insertieren des vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Nucleinsäurefragments
an einer Stelle stromaufwärts
von einem Strukturgen kann die Expression des Strukturgens gefördert werden. Strukturgene
werden durch einen Promotor kontrolliert, der sich stromaufwärts davon
befindet. Das erfindungsgemäße Nucleinsäurefragment
kann entweder zwischen dem Promotor und dem Strukturgen oder an einer
Stelle stromaufwärts
vom Promotor insertiert werden, wobei die erstere Möglichkeit
bevorzugt ist. In diesem Fall kann der Abstand zwischen dem erfindungsgemäßen Nucleinsäurefragment
und dem Strukturgen bevorzugt 0 bp bis 1000 bp betragen, und der
Abstand zwischen dem Promotor und dem erfindungsgemäßen Nucleinsäurefragment
kann auch bevorzugt 0 bp bis 1000 bp betragen.
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Die
Insertion des erfindungsgemäßen Nucleinsäurefragments
in eine Intronsequenz, die sich stromaufwärts vom Strukturgen befindet,
dessen Expression gefördert
werden soll, ist bevorzugt. Obwohl eine derartige Intronsequenz
nicht restriktiert ist, stellt das erste Intron (SEQ ID NO: 3) des
Reis-PLD-Gens ein bevorzugtes Beispiel dar. In Fällen, in denen das erfindungsgemäße Nucleinsäurefragment
in eine Intronsequenz insertiert wird, ist die Stelle der Insertion
nicht restriktiert. Ein Teil eines Primers kann zusammen mit einem Intronfragment
insertiert werden. In Fällen,
in denen das Intron jedoch das erste Intron (SEQ ID NO: 3) des Reis-PLD-Gens
darstellt, wird bevorzugt, dass die erfindungsgemäßen Nucleinsäurefragmente
in die Stelle von 1 nt oder 65 nt insertiert werden, damit eine
Vielzahl der erfindungsgemäßen Nucleinsäurefragmente
ligiert wird. Die Insertion des erfindungsgemäßen Nucleinsäurefragments
in die Stelle von 65 nt ist insbesondere bevorzugt, um auf diese
Weise zwei erfindungsgemäße Nucleinsäurefragmente
direkt zu ligieren. Obwohl es Fälle
gibt, in denen eine Intronsequenz stromaufwärts vom Strukturgen, dessen
Expression gefördert
werden soll, nicht existiert, wird in Fällen, in denen eine geeignete
Intronsequenz nicht existiert, eine geeignete Intronsequenz, wie
zum Beispiel das erste Intron des Reis-PLD-Gens zuerst an einer
Stelle stromaufwärts
vom Strukturgen, dessen Expression gefördert werden soll, insertiert,
und dann kann das erfindungsgemäße Nucleinsäurefragment
gegebenenfalls dort hinein insertiert werden. Die Insertion kann
durch ein übliches
Verfahren unter Verwendung von einem oder mehr Restriktionsenzym(en)
leicht durchgeführt
werden.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung sind auch rekombinante Vektoren, die
durch Applizieren des vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens
an einen Expressionsvektor erhalten werden. Der erfindungsgemäße rekombinante
Vektor kann durch Insertieren des erfindungsgemäßen Nucleinsäurefragments
und eines Strukturgens, dessen Expression in eine Klonierungsstelle
eines gewerblich erhältlichen
Expressionsvektors gefördert
werden soll, leicht hergestellt werden. Bei einem derartigen Expressionsvektor kann
es sich bevorzugt um einen für
Pflanzen handeln. Im Stand der Technik sind verschiedene Expressionsvektoren
für Pflanzen überall bekannt
und gewerblich erhältlich.
Diese Expressionsvektoren schließen einen Replikationsstartpunkt
zur Replikation in Wirtszellen, einen Promotor, Klonierungsstellen,
die Restriktionsstellen zur Insertion von Fremdgenen bereitstellen
und einen Selektionsmarker, wie zum Beispiel ein Arzneimittel-resistentes
Gen, ein und enthalten gewöhnlich
einen Terminator, der die Transkription stabil terminiert. Im erfindungsgemäßen Verfahren
kann jedweder dieser bekannten Expressionvektoren eingesetzt werden.
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BEISPIELE
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Die
vorliegende Erfindung wird nun konkreter unter Bezugnahme auf die
Beispiele davon beschrieben. Es sollte beachtet werden, dass die
Beispiele lediglich zu Erläuterungszwecken
vorgelegt werden und nicht in irgendeiner restriktiven Weise interpretiert
werden sollten.
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In
einen gewerblich von CLONTECH erhältlichen Vektor pBI221, enthaltend
das β-Glucuronidase-(GUS)-Gen
stromabwärts
vom 35S-Promotor (pBI221 (35S-Promotor, GUS)), wurde ein Teil der
inneren Region des PLD-Introns, das PLD-Intron oder das PLD-Intron
plus ein Teil des PLD-Introns insertiert, und es wurde die Wirkung
auf die Förderung
der GUS-Expression untersucht.
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Die
Vektoren wurden mittels des folgenden Verfahrens hergestellt. Das
erste Intron des Reis-PLD-Gens
besteht aus 173 Nucleotiden (SEQ ID NO: 3). DNA-Fragmente, die jeweils
2 nt-65 nt, 66 nt-120 nt oder 121 nt-173 nt des Introns entsprechen,
wurden anhand der PCR hergestellt. Bei den verwendeten Primern handelte
es sich um die folgenden:
5'-CTATGACCCGGGATCCTAAGCCCAGTGTGC-3' und
5'-GCAAGCAAGCAGATCTGAGCGGAGAAGAAG-3;
5'-TATGACCCGGGATCCGATCTGCTTGCTTGC-3' und
5'-ACCTAACGTAGATCTAGCGACACTCGCAGC-3;
5'-TATGACCCGGGATCCGCTTCGTCTTCCTTC-3' und
5'-GTGTCGCTAGATCTCTGCGCCCCCCCACAC-3'
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Jedes
der PCR-Produkte wurde mit den Restriktionsenzymen Bam HI und Bgl
II verdaut und dann in die Bam HI-Stelle in der Mehrfachklonierungstelle
in pBI221 insertiert, um die rekombinanten Vektoren (pBI[PLD(2-65)],
pBI[PLD(66-120)] und pBI[PLD(12I-173)]) zu erhalten.
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Vektoren,
die weiter die Region von 2 nt-65 nt oder 66 nt-120 nt des PLD-Introns
zusätzlich
zum PLD-Intron enthalten, wurden weiter wie folgt hergestellt: Das
erste Intron des Reis-PLD-Gens (SEQ ID NO: 3) wurde zunächst, wie
in WO96/30510 beschrieben, anhand der PCR unter Verwendung von Primern
(5'-ACCCGGTAAGCCCAG-3',3'-CCCCCGCGTCCATCC-5') amplifiziert, und
das amplifizierte Produkt wurde in den pCRII-Vektor subkloniert.
Die Resultante wurde mit Eco RI verdaut und das ausgeschnittene
Fragment wurde mit dem Klenow-Fragment stumpf gemacht (blunted),
dem die Insertion des stumpf gemachten Fragments in die Sma I-Stelle
des pBI221-Vektors zum Erhalt eines Vektors (pBI[PLD]) folgte. Die
Intronsequenz wurde an ihrem 65 nt mit Bgl II geschnitten, und das
vorstehend erwähnte
PCR-Produkt, das mit Bam HI und Bgl II verdaut wurde, wurde zum
Erhalt der Vektoren (pBI[PLD+pLD(2-65)] und pBI[PLD+PLD(66-120)]
dort hinein insertiert.
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Mithilfe
des berichteten Verfahrens (Shimamoto et al. Nature, 338, 274–276 (1989))
wurde jeder der vorstehend beschriebenen rekombinanten Vektoren
in kultivierte Reiszellen eingeführt
(Baba et al. Plant Cell Physiol. 27,463–471 (1986)), und die β-Glucuronidase-Aktivität (GUS-Aktivität) wurde
gemessen. Die relativen Aktivitäten
sind in Tabelle 1 ersichtlich.
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Alle
der drei Regionen, welche die Teile des PLD-Introns darstellen,
wiesen GUS-Aktivitäten
auf, die höher
als die der Kontrolle (pBI221) waren. Die Region von 2 nt-65 nt
zeigte die höchste
Aktivität,
und die Region von 66 nt-120 nt zeigte die zweithöchste Aktivität. Was die
Fälle anbelangt,
in denen jede dieser beiden Regionen in das Intron insertiert wurde,
betrug die Aktivität
das Zweifache der originalen Aktivität, die – im Fall der Insertion der
Region von 2 nt-65 nt in das Intron – durch das Intron allein erreicht
wurde, wohingegen die Aktivität
nicht gesteigert wurde, wenn die Region von 66 nt-120 nt insertiert
wurde.
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Diese
Ergebnisse gaben zu erkennen, dass die Region von 2 nt-65 nt des
PLD-Introns eine Aktivität zur
Förderung
der Genexpression besitzt. Die Nucleotidsequenz der Region von 2
nt-65 nt wird in SEQ ID NO: 1 gezeigt, die Nucleotidsequenz (enthaltend
jeweils 10 Nucleotide an den beiden Enden) des Introns, in das die
Region von 2 nt-65 nt weiter insertiert ist, wird in SEQ ID NO:4
gezeigt, und die Nucleotidsequenz, in der die Exonsequenzen an den
beiden Enden entfernt sind, ist in SEQ ID NO: 2 ersichtlich.
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