KR20010034142A

KR20010034142A - 핵산단편, 그것을 포함하는 재조합 벡터 및 그것을 사용한구조유전자의 발현촉진방법

Info

Publication number: KR20010034142A
Application number: KR1020007007761A
Authority: KR
Inventors: 우에키쥰
Original assignee: 미즈노 마사루; 니뽄 다바코 산교 가부시키가이샤
Priority date: 1998-11-19
Filing date: 1999-09-24
Publication date: 2001-04-25
Also published as: AU771898B2; WO2000031250A1; JP2000152785A; DE69931754D1; CA2318401A1; EP1050580A4; CN1198926C; US6861517B1; CN1292819A; AU5884599A; EP1050580B1; EP1050580A1; DE69931754T2; ATE329041T1

Abstract

하류에 위치하는 구조유전자의 발현을 촉진하는 효과가 우수한 신규한 핵산단편이 개시되어 있다. 본 발명의 핵산단편은 서열표의 서열번호1에 나타낸 염기서열을 갖는 단리된 핵산단편 또는 상기 염기서열 중 1 또는 복수의 염기가 치환 또는 결실되고, 또는 상기 염기서열에 1 또는 복수의 염기가 삽입 또는 부가된 핵산단편으로서, 그 하류에 위치하는 구조유전자의 발현을 촉진하는 효과를 갖는 핵산단편(단, 서열표의 서열번호3 기재의 염기서열을 갖는 핵산을 제외)이다.

Description

핵산단편, 그것을 포함하는 재조합 벡터 및 그것을 사용한 구조유전자의 발현촉진방법{NUCLEIC ACID FRAGMENTS, RECOMBINANT VECTOR CONTAINING THE SAME AND METHOD FOR PROMOTING THE EXPRESSION OF STRUCTURAL GENE BY USING THE SAME}

외래유전자의 발현촉진은, 유전자공학의 기법을 식물에 응용할 때에 가장 필요로 하는 기술이다. 그 기술의 하나는 유전자발현의 촉진효과를 갖는 DNA 단편을 이용하는 것이다. 외래유전자의 발현을 촉진하는 DNA 단편으로서는, 옥수수의 알콜디하이드로게나아제의 인트론(Callis et al. Gene ＆ Development 1. 1183∼1200(1987)) 및 벼의 포스포리파아제 D (이하, 「PLD」라고 하는 경우도 있음)의 제1인트론(국제공개공보 W096/30510) 등이 알려져 있다. 또한, 인트론 유래의 DNA 단편에 관하여, 인트론의 내부서열을 일부 삭제하기도 하거나, 또는 인트론의 내부에 동일한 인트론을 삽입하여 발현촉진작용에 미치는 영향을 조사한 사례가 보고되어 있다(Mascarenhas et al. Plant Mol. Biol. 15. 913∼920(1990). Clancy et al. Plant Sci. 98, 151∼161(1994)).

그러나, 실제에 있어서는 이용할 수 있는 DNA 단편의 종류가 한정되어 있고, 발현촉진효과도 불충분한 경우가 많기 때문에, 보다 효과가 큰 DNA 단편의 존재가 요구되고 있었다. 또한, 상기와 같이 인트론 서열을 수식하는 것에 의해 발현촉진효과를 높이는 시도가 행해지고 있지만 인트론 내부의 발현촉진작용을 갖는 영역을 특정한 사례나, 촉진작용이 원래의 인트론 유래의 DNA 단편의 2배에 달한 사례는 알려져 있지 않다.

본 발명은 하류에 위치하는 구조유전자의 발현을 촉진하는 기능을 갖는 핵산단편, 그것을 포함하는 재조합 벡터 및 그것을 사용한 구조유전자의 발현방법에 관한 것이다.

따라서, 본 발명의 목적은 하류에 위치하는 구조유전자의 발현을 촉진하는 효과가 우수한 신규의 핵산단편, 상기 핵산단편을 포함하고 구조유전자의 발현이 촉진되는 재조합 벡터 및 상기 핵산을 사용하여 그 하류의 구조유전자의 발현을 촉진하는 방법을 제공하는 데 있다.

본원 발명자들은, 예의연구한 결과 벼의 포스포리파아제 D(이하,「PLD」라고 하는 경우도 있음)의 제1인트론 속의 특정한 영역이 우수한 유전자 발현촉진효과를 갖는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 서열표의 서열번호1에 나타낸 염기서열을 갖는 단리된 핵산단편 또는 상기 염기서열 중 1 또는 복수의 염기가 치환 또는 결실되거나, 또는 상기 염기서열에 1 또는 복수의 염기가 삽입 또는 부가된 핵산단편으로서, 그 하류에 위치하는 구조유전자의 발현을 촉진하는 효과를 갖는 단리된 핵산단편(단, 서열표의 서열번호3 기재의 염기서열을 갖는 핵산을 제외)을 제공한다. 또한, 본 발명은 서열표의 서열번호1에 나타낸 염기서열을 갖는 핵산단편 또는 상기 염기서열 중 1 또는 복수의 염기가 치환 또는 결실되거나, 또는 상기 염기서열에 1 또는 복수의 염기가 삽입 또는 부가된 핵산단편으로서, 그 하류에 위치하는 구조유전자의 발현을 촉진하는 효과를 갖는 핵산단편(단, 서열표의 서열번호3 기재의 염기서열을 갖는 핵산을 제외)과, 상기 핵산단편의 하류에 위치하는 구조유전자를 적어도 포함하고, 상기 핵산단편에 의해 상기 구조유전자의 발현이 촉진되는 재조합 벡터를 제공한다. 게다가, 본 발명은 구조유전자의 상류에 서열표의 서열번호1에 나타낸 염기서열을 갖는 핵산단편 또는 상기 염기서열 중 1 또는 복수의 염기가 치환 또는 결실되거나, 상기 염기서열에 1 또는 복수의 염기가 삽입 또는 부가된 핵산단편으로서, 그 하류에 위치하는 구조유전자의 발현을 촉진하는 효과를 갖는 핵산단편(단, 서열표의 서열번호3 기재의 염기서열을 갖는 핵산을 제외)을 삽입하는 것으로 이루어지는 구조유전자의 발현촉진방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 본 발명의 방법에 의해 소망의 구조유전자의 발현이 촉진된 식물 및 상기 형질을 유지하는 자손을 제공한다.

본 발명에 의해, 구조유전자의 상류에 끼워 넣는 것에 의해 상기 구조유전자의 발현이 유의하게 촉진되는 신규한 핵산단편이 제공되었다. 본 발명의 핵산단편을 구조유전자의 상류에 삽입하는 것에 의해, 상기 구조유전자의 발현이 촉진되기 때문에, 본 발명은 예컨대, 재조합 벡터를 사용한 외래유전자의 발현을 촉진할 수가 있어 유전자공학의 분야 등에 있어서 많은 공헌을 할 것으로 기대된다.

상기와 같이, 본 발명의 핵산단편은 서열표의 서열번호1에 나타낸 염기서열을 갖는 핵산단편 또는 상기 염기서열 중 1 또는 복수의 염기가 치환 또는 결실되거나, 상기 염기서열에 1 또는 복수의 염기가 삽입 또는 부가된 핵산단편으로서, 그 하류에 위치하는 구조유전자의 발현을 촉진하는 효과를 갖는 핵산단편이다. 단, 서열표의 서열번호3으로 표시되는 염기서열은 벼의 PLD의 제1인트론의 염기서열이고, 벼의 PLD의 제1인트론이 그 하류의 유전자의 발현촉진효과를 갖는 것은 이미 본 출원인이 밝혔기(국제공개공보 W096/30510) 때문에 이 서열은 제외한다. 또, 서열번호1에 나타낸 염기서열은 벼의 PLD의 제1인트론(서열번호3)의 5′말단에서 제2번째의 염기(이하,「2nt」와 같이 기재)로부터 65nt의 영역의 염기서열이다.

상기한 바와 같이, 서열번호1에 나타낸 염기서열 중 1 또는 복수의 염기가 치환 또는 결실되거나, 상기 염기서열에 1 또는 복수의 염기가 삽입 또는 부가된 핵산단편으로서, 그 하류에 위치하는 구조유전자의 발현을 촉진하는 효과를 갖는 핵산단편(이하, 편의적으로「수식핵산단편」이라고 하는 경우도 있음)도 본 발명의 범위에 포함된다. 이 경우, 수식핵산단편 중의 서열번호1기재의 서열에 대응하는 부분은 서열번호1기재의 서열과 70%이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖고 있는 것이 바람직하다. 또한, 이들 수식핵산은 엄격한 조건(즉, 5 x Denhardt′s reagent, 6 x SSC, 0.5% SDS 또는 0.1% SDS 라고 하는 일반적인 하이브리디제이션 용액을 사용하여 50∼65℃에서, 바람직하게는 50℃와 60℃의 2단계, 또는 50℃, 55℃, 6O℃, 65℃의 4단계로 반응을 행하는)에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 핵산과 하이브리디제이션하는 것이 바람직하다.

게다가, 본 발명의 핵산을 발현을 촉진하고 싶은 구조유전자의 상류에 삽입하는 경우 유전자의 발현촉진에 효과가 있는, 가능한 한 작은 영역을 삽입하는 것이 바람직하기 때문에 본 발명의 핵산의 염기수는 120염기 이하인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 80염기 이하이고, 더더욱 바람직하게는 64염기 이하이다.

상기 본 발명의 핵산단편은 2개이상 연결하는 것에 의해 그 효과를 보다 크게 하는 것이 가능하다. 이 경우, 본 발명의 핵산단편을 직접 연결하여도 좋고, 그것들의 사이에 다른 서열이 개재하고 있어도 좋다.

본 발명의 핵산은 DNA나 RNA 모두 좋지만, 안정성의 관점에서 DNA가 바람직하다. 본 발명의 핵산단편은, 화학합성에 의해 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 벼 PLD 유전자의 제1인트론의 서열은 이미 공지이기 때문에(국제공개공보 WO96/30510), 벼의 게놈 DNA를 주형으로 한 PCR 등의 핵산증폭법에 의해 용이하게 제조할 수가 있다. PCR은 이 분야에서 주지이고, 그 때문의 키트 및 장치도 시판되어 있기 때문에 용이하게 실시할 수 있다.

또, 본 발명의 핵산단편을 복수 연결하는 경우에는, 복수의 본 발명의 핵산단편을 미리 연결하더라도 좋고, 본 발명의 핵산단편을 포함하는 영역에 본 발명의 핵산단편을 삽입시켜도 좋다.

구조유전자의 상류에 상기한 본 발명의 핵산단편을 삽입하는 것에 의해 상기 구조유전자의 발현을 촉진할 수 있다. 구조유전자는 그 상류에 위치하는 프로모터에 의해 제어되지만, 본 발명의 핵산단편은 프로모터와 구조유전자의 사이에 삽입하여도 좋고 프로모터의 상류에 삽입하여도 좋지만, 전자가 보다 바람직하다. 이 경우, 본 발명의 핵산단편과 구조유전자의 거리는 Obp∼10OObp가 바람직하고, 또한, 프로모터와 본 발명의 핵산단편과의 거리도 Obp∼100Obp가 바람직하다.

본 발명의 핵산단편은 발현을 촉진하고자 하는 구조유전자의 상류에 위치하는 인트론서열 중에 삽입하는 것이 바람직하다. 이와 같은 인트론서열은 특별히 한정되지 않지만, 바람직한 예로서 벼의 PLD 유전자의 제1인트론(서열번호3)을 들 수 있다. 인트론서열 중에 삽입하는 경우, 본 발명의 핵산단편의 삽입위치는 특별히 한정되지 않는다. 프라이머의 일부가 인트론단편과 같이 삽입되어 있어도 좋다. 다만, 인트론이 벼의 PLD 유전자의 제1인트론(서열번호3)인 경우에는 본 발명의 핵산단편이 복수 연결되도록 인트론의 1 또는 65nt에 삽입하는 것이 바람직하고, 특히 65nt에 삽입하여 본 발명의 핵산단편을 2개 직접 연결하는 것이 바람직하다. 또, 발현을 촉진하려고하는 구조유전자의 상류에 인트론서열이 반드시 존재한다고는 할 수는 없으나, 적당한 인트론서열이 존재하지않는 경우에는 우선, 발현을 촉진하고자 하는 구조유전자의 상류에, 예컨대 벼 PLD 유전자의 제1인트론 같은 적당한 인트론서열을 삽입하여 이것에 본 발명의 핵산단편을 삽입할 수 있다. 또, 삽입은 제한효소를 사용한 통상적인 방법에 의해 용이하게 행할 수 있다.

본 발명은 또, 상기 본 발명의 방법을 발현벡터에 적용하여 얻어지는 재조합벡터를 제공한다. 본 발명의 재조합 벡터는 시판의 발현벡터의 클로닝 부위에 본 발명의 핵산단편과 발현을 촉진하고자 하는 구조유전자를 삽입하는 것에 의해 용이하게 제조할 수 있다. 또, 이와 같은 발현벡터는 식물용 발현벡터가 바람직하고, 여러가지의 것이 이 분야에서 잘 알려져 있으며 또한 시판되어 있다. 이들 발현벡터는 숙주세포내에서 복제하기 위한 복제개시점, 프로모터, 외래유전자를 삽입하기위한 제한효소부위를 부여하는 클로닝부위 및 약제내성유전자 등의 선택마아커를 적어도 포함하고, 통상 전사를 안정하게 종료시키는 터미네이터를 포함한다. 본 발명의 방법에 있어서는 이들 공지의 발현벡터의 어느 것도 채용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 근거하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 예시적인 기재일 뿐이며, 하기 실시예는 어떠한 의미에 있어서도 한정적으로 해석하여서는 안된다.

35S 프로모터의 하류에 베타글루쿠로니다아제(GUS) 유전자를 배치시킨 클론테크사 제품의 벡터 pBl221(35S promoter, GUS)에 하기와 같이 분할한 PLD 인트론의 내부영역, PLD 인트론, 더욱이 일부의 영역을 중복시킨 PLD 인트론을 삽입하여 GUS 발현의 촉진효과를 조사하였다.

벡터를 이하의 방법으로 제작하였다. 벼의 PLD 유전자의 제1인트론은 13염기로 이루어진다(서열번호3). 인트론의 2nt∼65nt, 66nt∼l2Ont, 121nt∼173nt의 영역에 대응하는 DNA 단편을 PCR에 의해서 얻었다. 사용한 프라이머는 각각,

5′-CTATGACCCGGGATCCTAAGCCCAGTGTGC-3′와

5′-GCAAGCAAGCAGATCTGAGCGGAGAAGAAG-3′,

5′-TATGACCCGGGATCCGATCTGCTTGCTTGC-3′과

5′-ACCTAACGTAGATCTAGCGACACTCGCAGC-3′,

5′-TATGACCCGGGATCCGCTTCGTCTTCCTTC-3′과

5′-GTGTCGCTAGATCTCTGCGCCCCCCCACAC-3′

이다. PCR 산물을 제한효소 BamHI 및 BglII로 소화하여, pBl221의 멀티클로닝부위에 있는 BamHI 사이트에 삽입하였다(pBl[PLD(2∼65)], pBl[PLD(66∼120)], 및 pBl[PLD(121∼173)].

더욱이, 다음과 같이 2nt∼65nt 또는 66nt∼12Ont의 영역을 중복하여 포함하는 PLD 인트론을 갖는 벡터를 제작하였다. 우선, W096/30510에 기재된 바와 같이 벼 PLD 유전자의 제1인트론(서열번호3)을 프라이머(5′-ACCCGGTAAGCCCAG-3′, 3′-CCCCCGCGTCCATCC-5′)를 사용하여 PCR에 의해 증폭하고, 상기 증폭산물을 pCRII 벡터에 서브클로닝하여 EcoRI로 잘라내어 Klenow 단편에 의해서 평활말단으로 한 뒤, pBl221 벡터의 SmaI 부위에 삽입한 pBl221 벡터(pBl[PLD])를 제조하였다. 상기 인트론서열을 BglII에 의해서 인트론의 65번째의 부위에서 절단하여, BamHI 및 BglII로 소화한 상기의 PCR 산물을 삽입시켰다(pBl[PLD+PLD(2∼65)] 및 pBl[PLD+PLD(66∼120)]).

이미 보고된 문헌(Shimamoto et al. Nature. 338, 274∼276(1989))의 방법에 따라서 벼 배양세포(Baba et al. Plant Cell Physiol. 27. 463∼471(1986))에 상기 재조합 플라스미드를 도입 후, 베타글루쿠로니다아제(GUS)활성을 측정하였다. 활성의 상대치를 표 1에 나타내었다.

표 1

벡터	상대 GUS 활성
pBl221pBl[PLD]pBl[PLD(2∼65)]pBl[PLD(66∼120)]pBl[PLD(121∼173)]pBl[PLD+PLD(2∼65)]pBl[PLD+PLD(66∼120)]	1.0144.92.51.72814

PLD 인트론의 분할에서는, 3개의 영역과도 대조(pBl221)에 비교하여 높은 GUS 활성을 나타내었다. 2nt∼65nt의 영역의 효과가 가장 높고, 다음으로 66nt∼12Ont의 영역이었다. 이들 2개의 영역을 인트론안에 삽입한 경우는 2nt∼65nt의 영역의 중복으로, 활성이 본래 인트론의 경우의 2배로 되었다. 그러나, 66nt∼12Ont의 영역의 중복으로서는 활성의 상승은 확인되지 않았다.

이상의 결과로부터, PLD 인트론의 2nt∼65nt의 영역은 유전자발현을 촉진하는 효과를 갖는 것이 분명하게 되었다. 2nt∼65nt 영역의 염기서열을 서열번호1에, 또한 2nt∼165nt의 영역을 중복시킨 인트론(양단에 엑손서열 10염기씩을 포함하는)의 염기서열을 서열번호4에, 양단의 엑손서열을 제외한 인트론부분의 서열을 서열번호2에 나타내었다.

＜110＞ JAPAN TOBACCO INC.

＜120＞ Nucleic acid fragments, recombinant vectors containing the same a

nd method for promoting the expression of structural gene by usin

g the same

＜130＞ 2000-JP/P-0701

＜150＞ JP

＜151＞ 1998-11-19

＜160＞ 12

＜170＞ KOPATIN 1.5

＜210＞ 1

＜211＞ 64

＜212＞ DNA

＜213＞ 0ryza sativa

＜400＞ 1

taagcccagt gtgcttaggc taagcgcact agagcttctt gctcgcttgc ttcttctccg 60

ctca 64

＜210＞ 2

＜211＞ 242

＜212＞ DNA

＜213＞ 0ryza sativa

＜400＞ 2

gtaagcccag tgtgcttagg ctaagcgcac tagagcttct tgctcgcttg cttcttctcc 60

gctcagatcc taagcccagt gtgcttaggc taagcgcact agagcttctt gctcgcttgc 120

ttcttctccg ctcagatctg cttgcttgct tgcttcgcta gaaccctact ctgtgctgcg 180

agtgtcgctg cttcgtcttc cttcctcaag ttcgatctga ttgtgtgtgt gggggggcgc 240

ag 242

＜210＞ 3

＜211＞ 173

＜212＞ DNA

＜213＞ Oryza sativa

＜400＞ 3

gtaagcccag tgtgcttagg ctaagcgcac tagagcttct tgctcgcttg cttcttctcc 60

gctcagatct gcttgcttgc ttgcttcgct agaaccctac tctgtgctgc gagtgtcgct 120

gcttcgtctt ccttcctcaa gttcgatctg attgtgtgtg tgggggggcg cag 173

＜210＞ 4

＜211＞ 262

＜212＞ DNA

＜213＞ 0ryza sativa

＜400＞ 4

tcaccacccg gtaagcccag tgtgcttagg ctaagcgcac tagagcttct tgctcgcttg 60

cttcttctcc gctcagatcc taagcccagt gtgcttaggc taagcgcact agagcttctt 120

gctcgcttgc ttcttctccg ctcagatctg cttgcttgct tgcttcgcta gaaccctact 180

ctgtgctgcg agtgtcgctg cttcgtcttc cttcctcaag ttcgatctga ttgtgtgtgt 240

gggggggcgc aggtagggcg ag 262

＜210＞ 5

＜211＞ 30

＜212＞ DNA

＜213＞ 0ryza sativa

＜400＞ 5

ctatgacccg ggatcctaag cccagtgtgc 30

＜210＞ 6

＜211＞ 30

＜212＞ DNA

＜213＞ 0ryza sativa

＜400＞ 6

gcaagcaagc agatctgagc ggagaagaag 30

＜210＞ 7

＜211＞ 30

＜212＞ DNA

＜213＞ 0ryza sativa

＜400＞ 7

tatgacccgg gatccgatct gcttgcttgc 30

＜210＞ 8

＜211＞ 30

＜212＞ DNA

＜213＞ 0ryza sativa

＜400＞ 8

acctaacgta gatctagcga cactcgcagc 30

＜210＞ 9

＜211＞ 30

＜212＞ DNA

＜213＞ 0ryza sativa

＜400＞ 9

tatgacccgg gatccgcttc gtcttccttc 30

＜210＞ 10

＜211＞ 30

＜212＞ DNA

＜213＞ 0ryza sativa

＜400＞ 10

gtgtcgctag atctctgcgc ccccccacac 30

＜210＞ 11

＜211＞ 15

＜212＞ DNA

＜213＞ 0ryza sativa

＜400＞ 11

acccggtaag cccag 15

＜210＞ 12

＜211＞ 15

＜212＞ DNA

＜213＞ 0ryza sativa

＜400＞ 12

cccccgcgtc catcc 15

Claims

서열표의 서열번호1에 나타낸 염기서열을 갖는 단리된 핵산단편 또는 상기 염기서열 중 1 또는 복수의 염기가 치환 또는 결실되거나, 상기 염기서열에 1 또는 복수의 염기가 삽입 또는 부가된 핵산단편으로서, 그 하류에 위치하는 구조유전자의 발현을 촉진하는 효과를 갖는 단리된 핵산단편(단, 서열표의 서열번호3 기재의 염기서열을 갖는 핵산을 제외).
제1항에 있어서, 상기 핵산단편은 서열표의 서열번호1에 나타낸 염기서열을 갖는 핵산과 엄격한 조건하에서 하이브리디제이션하는 것을 특징으로 하는 핵산단편.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 핵산단편은 염기수가 120 이하인 것을 특징으로 하는 핵산단편.
제1항에 있어서, 상기 핵산단편은 서열표의 서열번호1에 나타낸 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 핵산단편.
제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서, 상기 핵산단편은 복수 연결된 것을 특징으로 하는 핵산단편.
서열표의 서열번호1에 나타낸 염기서열을 갖는 핵산단편 또는 상기 염기서열 중 1 또는 복수의 염기가 치환 또는 결실되거나, 상기 염기서열에 1 또는 복수의 염기가 삽입 또는 부가된 핵산단편으로서, 그 하류에 위치하는 구조유전자의 발현을 촉진하는 효과를 갖는 핵산단편(단, 서열표의 서열번호3 기재의 염기서열을 갖는 핵산을 제외)과, 상기 핵산단편의 하류에 위치하는 구조유전자를 적어도 포함하고, 상기 핵산단편에 의해 상기 구조유전자의 발현이 촉진되는 재조합 벡터.
제6항에 있어서, 상기 핵산단편은 서열표의 서열번호1에 나타낸 염기서열을 갖는 핵산과 엄격한 조건하에서 하이브리디제이션하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 핵산단편은 염기수가 120 이하인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제8항에 있어서, 상기 핵산단편은 서열표의 서열번호1에 나타낸 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터
제6항 내지 제9항 중 어느 한항에 있어서, 상기 핵산단편은 상기 구조유전자의 상류에 위치하는 인트론서열 중에 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제10항에 있어서, 상기 인트론서열은 서열표의 서열번호3으로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제10항에 있어서, 상기 인트론서열은 서열표의 서열번호2로 표시되는 염기서열을 갖는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
구조유전자의 상류에 서열표의 서열번호1에 나타낸 염기서열을 갖는 핵산단편 또는 상기 염기서열 중 1 또는 복수의 염기가 치환 또는 결실되거나, 상기 염기서열에 1 또는 복수의 염기가 삽입 또는 부가된 핵산단편으로서, 그 하류에 위치하는 구조유전자의 발현을 촉진하는 효과를 갖는 핵산단편(단, 서열표의 서열번호3 기재의 염기서열을 갖는 핵산을 제외)을 삽입하는 것으로 이루어지는 구조유전자의 발현촉진방법.
제13항에 있어서, 상기 핵산단편은 서열표의 서열번호1에 나타낸 염기서열을 갖는 핵산과 엄격한 조건하에서 하이브리디제이션하는 것을 특징으로 하는 구조유전자의 발현촉진방법.
제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 핵산단편은 염기수가 120 이하인 것을 특징으로 하는 구조유전자의 발현촉진방법.
제15항에 있어서, 상기 핵산단편은 서열표의 서열번호1에 나타낸 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 구조유전자의 발현촉진방법.
제13항 내지 제16항 중 어느 한항에 있어서, 상기 핵산단편을 상기 프로모터의 상류에 위치하는 인트론서열 중에 삽입하는 것을 특징으로 하는 구조유전자의 발현촉진방법.
제17항에 있어서, 상기 인트론서열은 서열표의 서열번호3에 나타낸 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 구조유전자의 발현촉진방법.
제13항 내지 제18항 중 어느 한항에 있어서, 상기 핵산단편을 삽입하는 것에 의해 상기 핵산단편이 복수연결된 영역이 형성되는 것을 특징으로 하는 구조유전자의 발현촉진방법.
제13항 내지 제19항 중 어느 한항에 기재된 방법에 의해, 소망의 구조유전자의 발현이 촉진된 식물 및 상기 형질을 유지하는 그 자손.