CN1292819A - 核酸片段、含有该片段的重组载体以及应用该片段启动结构基因表达的方法 - Google Patents

核酸片段、含有该片段的重组载体以及应用该片段启动结构基因表达的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了具有显著启动位于其下游之结构基因表达之活性的新核酸片段。根据本发明的核酸片段是具有序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的分离的核酸片段或具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列相同但其中已取代或缺失一或多个核苷酸、或已插入或添加一或多个核苷酸的分离的核酸片段(排除具有序列表中SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的核酸),所述片段具有启动位于其下游的结构基因表达之活性。

Description

核酸片段、含有该片段的重组载体以及 应用该片段启动结构基因表达的方法
本发明涉及具有启动位于其下游的结构基因表达之功能的核酸片段、含有该片段的重组载体以及用该片段启动结构基因表达的方法。
对外源基因表达的启动是将基因工程应用到植物中的最迫切需要的技术。这一技术包括对具有启动基因表达之活性的DNA片段的应用。启动外源基因表达的已知DNA片段包括玉米醇脱氢酶的内含子(Callis等，基因和发育1,1183-1200(1987))、水稻磷脂酶D的第一内含子(后文亦称之为“PLD”)(国际公开号WO96/30510)。此外，通过缺失内含子内部区域的一部分或通过在该内含子内部位点插入同样的内含子而对启动基因表达之活性所造成的影响，已有文献报道(Mascarenhas等，植物分子生物学，15,913-920(1990),Clancy等，植物科学，98,151-161(1994))。
然而，到目前为止，可应用于该目的的DNA片段的数目十分有限，而且在大多数情况下，它们启动基因表达的效应也不够强。因此需要具有较高活性的DNA片段。此外，尽管有人尝试通过修饰内含子序列而增强启动表达之活性，但至今尚未有关于内含子中具有启动表达的活性之区域的报道，内含子来源的初始DNA片段的启动活性加倍的情况也属未知。
因此，本发明的一个目的是提供新型核酸片段，该片段具有较高的启动位于其下游的结构基因的表达的活性；包含上述核酸片段的重组载体，其中结构基因的表达被启动；还提供了用上述核酸片段启动位于其下游的结构基因表达的方法。
本发明人通过深入研究发现，水稻磷脂酶D(下文也称“PLD”)的第一内含子中特定区域具有较高的启动基因表达的活性，据此完成本发明。
即，本发明提供了具有序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的分离的核酸片段或具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列相同但其中已取代或缺失一或多个核苷酸、或已插入或添加一或多个核苷酸的分离的核酸片段(排除具有序列表中SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的核酸)，所述片段具有启动其下游结构基因表达之活性。本发明还提供了重组载体，其至少包含具有序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的核酸片段或具有与SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列相同但其中已取代或缺失一或多个核苷酸、或已插入或添加一或多个核苷酸、并具有启动位于所述核酸片段下游的结构基因表达之活性的核酸片段(排除具有序列表中SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的核酸)，和位于所述核酸片段下游、其表达由所述核酸片段启动的结构基因。本发明还提供了启动结构基因表达的方法，包括在所述结构基因上游的位置处插入具有序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的核酸片段或具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列相同但其中已取代或缺失一或多个核苷酸、或已插入或添加一或多个核苷酸、并具有启动位于所述核酸片段下游的结构基因表达之活性的核酸片段(排除具有序列表中SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的核酸)。本发明还提供了一种植物，其中目的结构基因的表达由本发明的方法启动，以及保持这种特性的该植物的子代。
通过本发明，提供了通过在结构基因上游的位点处插入核酸而显著启动结构基因表达的新核酸片段。通过在结构基因上游的位点处插入本发明的核酸片段可启动结构基因的表达。因此，通过本发明，可启动如重组载体中外源基因的表达，从而预期本发明将对基因工程或相关领域作出较大贡献。
如上所述，本发明的核酸片段是具有序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的核酸片段或具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列相同但其中已取代或缺失一或多个核苷酸、或已插入或添加一或多个核苷酸、并具有启动位于所述核酸片段下游的结构基因表达之活性的核酸片段。但序列表中SEQ ID NO:3所示核苷酸序列是水稻PLD中第一内含子的核苷酸序列，因本发明人曾公开：水稻PLD的第一内含子具有启动位于其下游的基因表达的活性(国际公开号WO96/30510)，故将该序列排除在外。SEQ ID NO:1所示核苷酸序列是水稻PLD的第一内含子(SEQ ID NO:3)中从5’-端第二个核苷酸(后文称为“2nt”)至65nt的区域核苷酸序列。
如上所述，具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列相同但其中已取代或缺失一或多个核苷酸、或已插入或添加一或多个核苷酸、并具有启动位于所述核酸片段下游的结构基因表达之活性的核酸片段(为方便起见后文也称为“修饰型核酸片段”)也包括在本发明范围内。此时，修饰型核酸片段中与SEQ ID NO:1所示序列中的区域相应的区域优选与SEQ ID NO:1所示序列具有不少于70％、更优选不少于85％、更优选不少于95％的同源性。此外，这些修饰型核酸片段优选与具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的核酸在严紧条件下杂交(即在常用杂交溶液如5x Denhardt’s试剂、6x SSC、0.5％SDS或0.1％SDS中，在50-65℃，优选在50℃和在65℃分两步，或在50℃、55℃、60℃和65℃分四步完成杂交)。
在需要启动表达的结构基因上游的位点处插入本发明的核酸时，优选所插入片段的大小尽量小，且片段具有启动基因表达的活性。因此，本发明核酸片段中的核苷酸数目优选不超过120，更优选不超过80，更优选不超过64。
通过连接本发明的两个或更多片段可增强活性。此时，本发明的核酸片段可以直接连接或在其之间可存在间插序列。
本发明的核酸可以是DNA或RNA。但就稳定性而言，优选DNA。
本发明的核酸片段容易通过化学合成法制备。或者，因水稻PLD基因的第一内含子的核苷酸序列是已知的(国际公开号WO96/30510)，本发明的核酸片段通过使用水稻基因组DNA为模板应用诸如PCR之类的核酸扩增方法容易获得。PCR为本领域众所周知，其试剂盒和仪器均市场有售，故便于执行。
在连接多个本发明的核酸片段时，可使多个本发明的核酸片段初步连接，或将本发明的一个核酸片段插入包含本发明核酸片段的区域中。
通过在结构基因上游的位点处插入上述本发明的核酸片段，可启动该结构基因的表达。结构基因受位于其上游的启动子的控制。本发明的核酸片段可在启动子与结构基因之间插入或在启动子上游的位点处插入，优选前者。此时，本发明核酸片段与结构基因之间的距离优选是0bp-1000bp，启动子与本发明核酸片段之间的距离也可优选是Obp-1000bp。
优选在需启动其表达的结构基因上游的内含子序列中插入本发明的核酸片段。尽管对这样的内含子序列未作限制，但优选的实例为水稻PLD基因的第一内含子(SEQ ID NO:3)。在将本发明核酸片段插入内含子序列中时，对插入位置未作限定。可与内含子片段一起插入某引物的一部分。但当内含子是水稻PLD基因的第一内含子(SEQ ID NO:3)时，优选将本发明的核酸片段插入1nt或65nt位点处，以连接本发明的多个核酸片段。尤其优选将本发明的核酸片段插入65nt位点处，以便使本发明的两个核酸片段直接连接。尽管有些情况下需启动表达的结构基因上游不存在内含子序列，在不存在合适内含子序列时，首先将合适的内含子序列如水稻PLD基因的第一内含子插入需启动表达之结构基因上游的位点处，然后插入本发明的核酸片段。根据常规方法用一或多种限制酶可方便地完成插入。
本发明还提供了将本发明上述方法应用于表达载体而获得的重组载体。本发明的重组载体便于通过将本发明核酸片段和需启动表达的结构基因插入市售表达载体的克隆位点处而制备。这样的表达载体优选为植物的一种表达载体。各种植物表达载体均为本领域已知并在市场有售。这些表达载体包括用于在宿主细胞中复制的复制起点、启动子、便于插入外源基因的限制性克隆位点、及选择性标记如抗药基因，并通常包含可稳定终止转录的终止子。在本发明的方法中，可应用这些已知表达载体中的任何一种。
实施例
本发明将通过其实施例作更详尽描述。应注意实施例旨在举例说明的目的，并非作限制性说明。
在购自CLONTECH的、带有35S启动子下游β-葡糖醛酸酶(GUS)基因的载体pBI221(pBI221(35S启动子，GUS))中，插入PLD内含子内部区域的一部分、PLD内含子或PLD内含子加PLD内含子的一部分，并检查对GUS表达的启动效应。
经以下方法制备载体。水稻PLD基因的第一内含子由173个核苷酸组成(SEQ ID N0:3)。经PCR制备分别对应于内含子中2nt-65nt、66nt-120nt或121nt-173nt的DNA片段。所用引物如下：
5′-CTATGACCCGGGATCCTAAGCCCAGTGTGC-3′和
5′-GCAAGCAAGCAGATCTGAGCGGAGAAGAAG-3′；
5′-TATGACCCGGGATCCGATCTGCTTGCTTGC-3′和
5′-ACCTAACGTAGATCTAGCGACACTCGCAGC-3′；
5′-TATGACCCGGGATCCGCTTCGTCTTCCTTC-3′和
5′-GTGTCGCTAGATCTCTGCGCCCCCCCACAC-3′
用限制酶Bam HⅠ和BglⅡ消化每种PCR产物，然后插入pBI221多克隆位点中的BamHⅠ位点中，获得重组载体(pBI[PLD(2-65)]、pBI[PLD(66-120)]和pBI[PLD(121-173)])。
此外，除包含PLD内含子以外还包含PLD内含子中2nt-65nt或66nt-120nt区域的载体制备如下：首先，如WO96/30510所述，用引物(5’-ACCCGGTAAGCCCAG-3’、3’-CCCCCGCGTCCATCC-5’)经PCR扩增水稻PLD基因的第一内含子(SEQ ID NO:3)，将扩增产物亚克隆至pCRⅡ载体中。用EcoRⅠ消化所得产物，切割片段用Klenow片段补平，然后将补平的片段插入pBI221的SmaⅠ位点以获得载体(pBI[PLD])。用BglⅡ在内含子序列中65nt处切割，再向所述内含子中插入用BamHⅠ和BglⅡ消化的上述PCR产物，获得载体(pBI[PLD+PLD(2-65)]和pBI[PLD+PLD(66-120)])。
通过所报道的方法(Shimamoto等，自然，338,274-276(1989))，将上述各重组载体分别导入水稻培养细胞(Baba等，植物细胞生理学，27,463-471(1986))，测量β-葡糖醛酸酶(GUS)活性。相对活性示于表1。
     表1
载体 GUS相对活性
pBI221pBI[PLD]pBI[PLD(2-65)]pBI[PLD(66-120)]pBI[PLD(121-173)]pBI[PLD+PLD(2-65)]pBI[PLD+PLD(66-120)]     1.0144.92.51.72814
这三个作为PLD内含子一部分的区域所表现的GUS活性均高于对照物(pBI221)的活性。2nt-65nt区域表现出最高活性，66nt-120nt区域表现出第二高的活性。在向内含子中插入这两种区域每一种的情况下，内含子中插入2nt-65nt区域时的活性是只含内含子时所获得的原始活性的两倍，而插入66nt-120nt区域时活性没有增加。
这些结果说明，PLD内含子的2nt-65nt区域具有启动基因表达的活性。2nt-65nt区域的核苷酸序列示于SEQ ID NO:1，插有2nt-65nt区域的内含子的核苷酸序列(两个末端各包括10个核苷酸)示于SEQ ID NO:4，其中两个末端处的外显子序列均已除去的核苷酸序列示于SEQ ID NO:2。序列表<110>日本烟草公司<120>核酸片段、含有该核酸片段的重组载体以及使用该核酸片段启动结构基因表达的方法<130>99PF189-PCT<160>12<210>1<211>64<212>DNA<213>稻<400>1taagcccagt gtgcttaggc taagcgcact agagcttctt gctcgcttgc ttcttctccg   60ctca                                                                64<210>2<211>242<212>DNA<213>稻<400>2gtaagcccag tgtgcttagg ctaagcgcac tagagcttct tgctcgcttg cttcttctcc   60gctcagatcc taagcccagt gtgcttaggc taagcgcact agagcttctt gctcgcttgc  120ttcttctccg ctcagatctg cttgcttgct tgcttcgcta gaaccctact ctgtgctgcg  180agtgtcgctg cttcgtcttc cttcctcaag ttcgatctga ttgtgtgtgt gggggggcgc  240ag                                                                 242<210>3<211>173<212>DNA<213>稻<400>3gtaagcccag tgtgcttagg ctaagcgcac tagagcttct tgctcgcttg cttcttctcc   60gctcagatct gcttgcttgc ttgcttcgct agaaccctac tctgtgctgc gagtgtcgct  120gcttcgtctt ccttcctcaa gttcgatctg attgtgtgtg tgggggggcg cag         173<210>4<211>262<212>DNA<213>稻<400>4tcaccacccg gtaagcccag tgtgcttagg ctaagcgcac tagagcttct tgctcgcttg   60cttcttctcc gctcagatcc taagcccagt gtgcttaggc taagcgcact agagcttctt  120gctcgcttgc ttcttctccg ctcagatctg cttgcttgct tgcttcgcta gaaccctact  180ctgtgctgcg agtgtcgctg cttcgtcttc cttcctcaag ttcgatctga ttgtgtgtgt  240gggggggcgc aggtagggcg ag                                           262<210>5<211>30<212>DNA<213>稻<400>5CTATGACCCG GGATCCTAAG CCCAGTGTGC                                    30<210>6<211>30<212>DNA<213>稻<400>6gcaagcaagc agatctgagc ggagaagaag                                    30<210>7<211>30<212>DNA<213>稻<400>7tatgacccgg gatccgatct gcttgcttgc                                    30<210>8<211>30<212>DNA<213>稻<400>8acctaacgta gatctagcga cactcgcagc                                    30<210>9<211>30<212>DNA<213>稻<400>9tatgacccgg gatccgcttc gtcttccttc                                    30<210>10<211>30<212>DNA<213>稻<400>10gtgtcgctag atctctgcgc ccccccacac                                    30<210>11<211>15<212>DNA<213>稻<400>11acccggtaag cccag                                                    15<210>12<211>15<212>DNA<213>稻<400>12cccccgcgtc catcc                                                    15

Claims (20)

1．一种具有序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的分离的核酸片段或具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列相同但其中已取代或缺失一或多个核苷酸、或已插入或添加一或多个核苷酸的分离的核酸片段(排除具有序列表中SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的核酸)，所述片段具有启动位于其下游的结构基因表达之活性。
2．权利要求1的核酸片段，其中该核酸片段与具有序列表中SEQ IDNO:1所示核苷酸序列的核酸在严紧条件下杂交。
3．权利要求1或2的核酸片段，其中该核酸片段含有不超过120个核苷酸。
4．权利要求1的核酸片段，其中该核酸片段具有序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
5．一种核酸片段，其包含根据权利要求1-4中任一项的多个核酸片段，并且这些片段相连。
6．一种重组载体，其至少包含具有序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的核酸片段或与具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列相同但其中已取代或缺失一或多个核苷酸或已插入或添加一或多个核苷酸的核酸片段(排除具有序列表中SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的核酸)，所述片段具有启动位于其下游的结构基因表达之活性和位于所述核酸片段下游、其表达由所述核酸片段启动的结构基因。
7．权利要求6的重组载体，其中所述核酸片段与具有序列表中SEQ IDNO:1所示核苷酸序列的核酸在严紧条件下杂交。
8．权利要求6或7的重组载体，其中所述核酸片段含有不超过120个核苷酸。
9．权利要求8的重组载体，其中所述核酸片段具有序列表中SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列。
10．权利要求6-9中任一项的重组载体，其中所述核酸片段插入位于所述结构基因上游的内含子序列中。
11．权利要求10的重组载体，其中所述内含子序列具有序列表中SEQID NO:3所示的核苷酸序列。
12．权利要求10的重组载体，其中所述内含子序列具有序列表中SEQID NO:2所示的核苷酸序列。
13．一种启动结构基因表达的方法，包括在所述结构基因上游的位置处插入具有序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的核酸片段或与具有SEQID NO:1所示核苷酸序列相同但其中已取代或缺失一或多个核苷酸、或已插入或添加一或多个核苷酸的核酸片段(排除具有序列表中SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的核酸)，所述片段具有启动位于其下游的结构基因表达之活性。
14．权利要求13的方法，其中所述核酸片段与具有序列表中SEQ IDNO:1所示核苷酸序列的核酸在严紧条件下杂交。
15．权利要求13或14的方法，其中所述核酸片段包含不超过120个核苷酸。
16．权利要求15的方法，其中所述核酸片段具有序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
17．权利要求13-16中任一项的方法，其中所述核酸片段插入位于所述结构基因上游的内含子序列中。
18．权利要求17的方法，其中所述内含子序列具有序列表中SEQ IDNO:3所示的核苷酸序列。
19．权利要求13-18中任一项的方法，其中通过插入所述核酸片段而形成有多个所述核酸片段相连于其中的区域。
20．一种植物或其子代，其中目的结构基因的表达是通过权利要求13-19中任一项的方法启动的。
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