WO2000031250A1 - Fragments d'acides nucleiquse, vecteur de recombinaison contenant de tels fragments, et procede utilisant de tels fragments pour favoriser l'expression d'un gene structurel - Google Patents

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    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid fragment having a function of promoting the expression of a structural gene located downstream, a recombinant vector containing the nucleic acid fragment, and a method for expressing a structural gene using the same.
  • Promoting the expression of foreign genes is the technology that is most needed when applying genetic engineering techniques to plants.
  • One such technique is the use of DNA fragments that have the effect of promoting gene expression.
  • DNA fragments that promote the expression of foreign genes include maize alcohol dehydrogenase intron (Callis et al. Gene & Development 1, 1183-1200 (1987)) and rice phospholipase D (hereinafter referred to as “phospholipase D”).
  • phospholipase D rice phospholipase D
  • the first intron which may be referred to as “PLD”) (International Publication W096 / 30510) and the like.
  • the present invention there has been provided a novel nucleic acid fragment in which expression of the structural gene is significantly promoted by being incorporated into the upstream of the structural gene. Since the expression of the structural gene is promoted by inserting the nucleic acid fragment of the present invention upstream of the structural gene, the present invention provides, for example, the promotion of the expression of a foreign gene using a recombinant vector. It is expected to contribute greatly in the field of genetic engineering.
  • BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION-As described above the nucleic acid fragment of the present invention is a nucleic acid fragment having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing or one or more bases in the nucleotide sequence are substituted.
  • the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing is the nucleotide sequence of the first intron of rice PLD, and it has already been confirmed that the first intron of rice PLD has the effect of promoting the expression of a gene downstream thereof. This sequence is excluded because the applicant has made the disclosure (International Publication No. W096 / 30510).
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is from the second base (hereinafter referred to as “2 nt”) from the 5 ′ end of the first intron (SEQ ID NO: 3) of rice PLD to 65 nt. Is the base sequence of the region.
  • a nucleic acid fragment in which one or more bases of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 have been substituted or deleted, or one or more bases have been inserted or added to the base sequence, and Nucleic acid fragments having an effect of promoting the expression of a structural gene located downstream are also included in the scope of the present invention.
  • the portion corresponding to the sequence described in SEQ ID NO: 1 in the modified nucleic acid fragment is 70% or more, more preferably 85% or more, still more preferably 95% or more of the sequence described in SEQ ID NO: 1.
  • they have homology.
  • these modified nucleic acids are obtained by combining a nucleic acid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 with a stringent condition (ie, 5 ⁇ Denhardt's reagent, 6 ⁇ SSC, 0.5% SDS or 0.1% SDS). 50 to 65 ° C, preferably 50 ° C and 60 ° C, or 50 ° C, 55 ° C using a general hybridization solution such as , 60 ° C.
  • the nucleic acid fragment of the present invention can be easily prepared by chemical synthesis.
  • the sequence of the first intron of the rice PLD gene is already known (International Publication WO096 / 30510), it can be easily prepared by a nucleic acid amplification method such as PCR using rice genomic DNA as type III. it can. PCR is well known in the art, and kits and devices therefor are commercially available and can be easily implemented.
  • nucleic acid fragments of the present invention When a plurality of nucleic acid fragments of the present invention are linked, a plurality of nucleic acid fragments of the present invention may be linked in advance, or the nucleic acid fragment of the present invention may be inserted into a region containing the nucleic acid fragment of the present invention. Good.
  • the nucleic acid fragment of the present invention is preferably inserted into an intron sequence located upstream of a structural gene whose expression is to be promoted.
  • an intron sequence is not particularly limited, but a preferred example is the first intron (SEQ ID NO: 3) of the rice PLD gene.
  • the insertion position of the nucleic acid fragment of the present invention is not particularly limited. Part of the primer may be inserted together with the intron fragment.
  • the intron is the first intron of the rice PLD gene (SEQ ID NO: 3)
  • the PGR product was digested with restriction enzymes BamHI and Bgl II, and ⁇ the BamHI site in Maruchiku cloning site of P BI221 (pBI [PLD (2 65)], pBI [PLD (66-1
  • the intron sequences was digested with 65-th site by connexion intron B g III, was inserted a PCR product of the digested with BamHI and Bgl II (pBI [PLD + PLD (2- 65)] and pBI [PLD + PLD (66-120)]).
  • pBI [PLD + PLD (2- 65)] and pBI [PLD + PLD (66-120)] According to the method described in a previous report (Shimamoto et al. Nature, 338, 274-276 (1989)), the above set was described in cultured rice cells (Baba et al. Plant Cell Physiol. 27, 463-471 (1986)). After introducing the recombinant plasmid, -glucuronidase (GUS) activity was measured. Table 1 shows the relative values of the activity.
  • SEQ ID NO: 1 shows the nucleotide sequence of the 2 nt to 65 nt region
  • SEQ ID NO: 4 shows the nucleotide sequence of an intron (including 10 exon sequences at both ends) overlapping the 2 nt to 65 nt region
  • SEQ ID NO: 2 shows the sequence of the intron portion excluding the exon sequences at both ends.

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Description

明細書 、 核酸断片、 それを含む組換えベクター及びそれを用いた構造遺伝子の発現促進方 法
技術分野
本発明は、 下流に位置する構造遺伝子の発現を促進する機能を有する核酸断片、 それを含む組換えベクター及びそれを用いた構造遺伝子の発現方法に関する。
背景技術
外来遺伝子の発現促進は、 遺伝子工学の手法を植物に応用する際に最も必要と される技術である。 その技術のひとつに遺伝子発現の促進効果を有する D N A断 片の利用がある。 外来遺伝子の発現を促進する DN A断片としては、 トウモロコ シのアルコールデヒドロゲナ一ゼのイントロン （Cal l is et al. Gene & Develop ment 1， 1183 - 1200 (1987)) 及びイネのホスホリパーゼ D (以下、 「P L D」とい うことがある）の第 1イントロン （国際公開公報 W096/30510)等が知られている。 また、 イントロン由来の DN A断片について、 イントロンの内部配列を一部削除 したり、 あるいはイントロンの内部に同一のイントロンを揷入して発現促進作用 へ及ぼす影響を調べた事例が報告されている (Mascarenhas et al. Plant Moに Biol. 15, 913-920 (1990), Clancy et al. Plant Scに 98, 151-161 (1994)) 。
しかしながら、 現状では利用できる D NA断片の種類が限られており、 発現促 進効果も不十分である場合が多いため、 より効果の大きい D N A断片の存在が望 まれていた。 また、 上記のように、 イントロン配列を修飾することにより発現促 進効果を高める試みが行なわれているが、 イントロン内部の発現促進作用を有す る領域を特定した事例や、 促進作用がもとのィントロン由来 D N A断片の 2倍に 達した事例は知られていない。
発明の開示
従って、 本発明の目的は、 下流に位置する構造遺伝子の発現を促進する効果が 優れた新規な核酸断片、 該核酸断片を含み、 構造遺伝子の発現が促進された組換 えベクター及び該核酸を用いてその下流の構造遺伝子の発現を促進する方法を提 供することである。 本願発明者らは、 鋭意研究の結果、 イネのホスホリパーゼ D (以下、 「P L D J ということがある）の第 1イントロン中の特定の領域が、 優れた遺伝子発現促進 効果を有することを見出し、 本発明を完成した。
すなわち、 本発明は、 配列表の配列番号 1に示す塩基配列を有する単離された 核酸断片又は該塩基配列のうち 1若しくは複数の塩基が置換し若しくは欠失し又 は該塩基配列に 1若しくは複数の塩基が挿入され若しくは付加された核酸断片で あって、 その下流に位置する構造遺伝子の発現を促進する効果を有する単離され た核酸断片（ただし、 配列表の配列番号 3記載の塩基配列を有する核酸を除く） を提供する。 また、 本発明は、 配列表の配列番号 1に示す塩基配列を有する核酸 断片又は該塩基配列のうち 1若しくは複数の塩基が置換し若しくは欠失し又は該 塩基配列に 1若しくは複数の塩基が挿入され若しくは付加された核酸断片であつ て、 その下流に位置する構造遺伝子の発現を促進する効果を有する核酸断片（た だし、 配列表の配列番号 3記載の塩基配列を有する核酸を除く） と、 該核酸断片 の下流に位置する構造遺伝子とを少なくとも含み、 前記核酸断片により、 該構造 遺伝子の発現が促進される組換えベクターを提供する。 さらに、 本発明は、 構造 遺伝子の上流に、 配列表の配列番号 1に示す塩基配列を有する核酸断片又は該塩 基配列のうち 1若しくは複数の塩基が置換し若しくは欠失し又は該塩基配列に 1 若しくは複数の塩基が挿入され若しくは付加された核酸断片であつて、 その下流 に位置する構造遺伝子の発現を促進する効果を有する核酸断片（ただし、 配列表 の配列番号 3記載の塩基配列を有する核酸を除く） を挿入することから成る、 構 造遺伝子の発現促進方法を提供する。 さらに、 本発明は、 該本発明の方法により、 所望の構造遺伝子の発現が促進された植物及び該形質を維持するその子孫を提供 する。
本発明により、 構造遺伝子の上流に組み込むことにより、 該構造遺伝子の発現 が有意に促進される新規な核酸断片が提供された。 本発明の核酸断片を構造遺伝 子の上流に挿入することにより、 該構造遺伝子の発現が促進されるので、 本発明 は、 例えば組換えべクタ一を用いた外来遺伝子の発現を促進することができ、 遺 伝子工学の分野などにおいて多いに貢献するものと期待される。 発明を実施するための最良の形態 - 上記のように、 本発明の核酸断片は、 配列表の配列番号 1に示す塩基配列を有 する核酸断片又は該塩基配列のうち 1若しくは複数の塩基が置換し若しくは欠失 し又は該塩基配列に 1若しくは複数の塩基が挿入され若しくは付加された核酸断 片であって、 その下流に位置する構造遺伝子の発現を促進する効果を有する核酸 断片である。 ただし、 配列表の配列番号 3に示される塩基配列は、 イネの P L D の第 1イントロンの塩基配列であり、 イネの P L Dの第 1イントロンがその下流 の遺伝子の発現促進効果を有することは、 既に本出願人が明らかにしている （国 際公開公報 W096/30510)ので、 この配列は除外する。 なお、 配列番号 1に示す塩 基配列は、 イネの P L Dの第 1イントロン（配列番号 3 )の 5 '末端から第 2番目 の塩基 （以下、 「2 n t」のように記載） から 6 5 n tの領域の塩基配列である。 上記の通リ、 配列番号 1に示す塩基配列のうち 1若しくは複数の塩基が置換し 若しくは欠失し又は該塩基配列に 1若しくは複数の塩基が挿入され若しくは付加 された核酸断片であって、 その下流に位置する構造遺伝子の発現を促進する効果 を有する核酸断片（以下、 便宜的に「修飾核酸断片」ということがある）も本発明の 範囲に含まれる。 この場合、 修飾核酸断片中の、 配列番号 1記載の配列に対応す る部分は、 配列番号 1記載の配列と 7 0 %以上、 さらに好ましくは 8 5 %以上、 さらに好ましくは 9 5 %以上の相同性を有していることが好ましい。 また、 これ らの修飾核酸は、 配列番号 1で示される塩基配列を有する核酸と、 ストリンジェ ントな条件（すなわち、 5 X Denhardt's reagent, 6 x SSC, 0. 5% SDS又は 0. 1 % S DSといった一般的なハイブリダィゼーシヨン溶液を用いて 5 0 ~ 6 5 °Cで、 好 ましくは 5 0 °Cと 6 0 °Cの 2段階、 又は、 5 0 °C、 5 5 °C、 6 0 °C、 6 5 °Cの 4 段階で反応を行なう）において、 ハイブリダイズするものであることが好ましい。 さらに、 本発明の核酸を、 発現を促進したい構造遺伝子の上流に挿入する場合、 遺伝子の発現促進に効果のある、 できるだけ小さな領域を挿入することが好まし いので、 本発明の核酸の塩基数は1 2 0塩基以下であることが好ましく、 さらに 好ましくは 8 0塩基以下であり、 さらに好ましくは 6 4塩基以下である。
上記本発明の核酸断片は、 2個以上連結することによりその効果をより大きく することが可能である。 この場合、 本発明の核酸断片を直接連結してもよいし、 - それらの間に他の配列が介在していてもよい。
本発明の核酸は D N Aでも R N Aでもよいが、 安定性の観点から D N Aが好ま しい。
本発明の核酸断片は、 化学合成により容易に調製することができる。 また、 ィ ネ P L D遺伝子の第 1イントロンの配列は既に公知であるので （国際公開公報 W 096/30510)、 イネのゲノミック D N Aを錶型とした P C R等の核酸増幅法により 容易に調製することができる。 P C Rはこの分野において周知であり、 そのため のキット及び装置も市販されているので容易に実施することができる。
なお、 本発明の核酸断片を複数連結する場合には、 複数の本発明の核酸断片を 予め連結してもよいし、 本発明の核酸断片を含む領域に本発明の核酸断片を挿入 してもよい。
構造遺伝子の上流に上記した本発明の核酸断片を挿入することにより、 該構造 遺伝子の発現を促進することができる。 構造遺伝子は、 その上流に位置するプロ モーターにより制御されるが、 本発明の核酸断片は、 プロモーターと構造遺伝子 の間に挿入してもよいし、 プロモーターの上流に挿入してもよいが、 前者がより 好ましい。 この場合、 本発明の核酸断片と構造遺伝子の距離は 0 b p ~ 1 O O O b pが好ましく、 また、 プロモータ一と本発明の核酸断片との距離も 0 b p ~ 1 O O O b pが好ましい。
本発明の核酸断片は、 発現を促進しょうとする構造遺伝子の上流に位置するィ ントロン配列中に挿入することが好ましい。 このようなイントロン配列は特に限 定されないが、 好ましい例としてイネの P L D遺伝子の第 1イントロン（配列番 号 3 )を挙げることができる。 イントロン配列中に挿入する場合、 本発明の核酸 断片の挿入位置は特に限定されない。 プライマーの一部がイントロン断片と共に 揷入されていてもよい。 もっとも、 イントロンがイネの P L D遺伝子の第 1イン トロン（配列番号 3 )である場合には、 本発明の核酸断片が複数連結されるように、 イントロンの 1又は 6 5 n tに挿入することが好ましく、 特に 6 5 n tに揷入し て本発明の核酸断片を 2個直結することが好ましい。 なお、 発現を促進しようと する構造遺伝子の上流にイントロン配列が必ずしも存在するとは限らないが、 適 当なイントロン配列が存在しない場合には、 先ず、 発現を促進しょうとする構造 遺伝子の上流に例えばイネ P L D遺伝子の第 1イントロンのような適当なイント ロン配列を挿入し、 これに本発明の核酸断片を挿入することができる。 なお、 揷 入は、 制限酵素を用いた常法により容易に行うことができる。 本発明はまた、 上記本発明の方法を発現ベクターに適用して得られる組換えべ クタ一を提供する。 本発明の組換えベクターは、 市販の発現ベクターのクロ一二 ング部位に本発明の核酸断片と、 発現を促進すべき構造遺伝子とを挿入すること により容易に調製することができる。 なお、 このような発現ベクターは、 植物用 発現ベクターが好ましく、 種々のものがこの分野において周知であり、 かつ市販 されている。 これらの発現べクタ一は、 宿主細胞内で複製するための複製開始点、 プロモーター、 外来遺伝子を挿入するための制限酵素部位を与えるクローニング 部位及び薬剤耐性遺伝子等の選択マーカーを少なくとも含み、 通常、 転写を安定 に終了させるターミネータ一を含む。 本発明の方法においては、 これらの公知の 発現べクタ一のいずれをも採用することができる。
実施例
以下、 本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。 もっとも、 下記実施例 は例示のためにのみ記載するものであり、 下記実施例をいかなる意味においても 限定的に解釈してはならなし、。
35Sプロモーターの下流に beta- Glucuronidase (GUS) 遺伝子を配した GLONTE
CH社製のベクター PBI221 (35S promoter, GUS) に、 下記のように、 分割した PL Dイントロンの内部領域、 PLDイントロン、 さらに一部の領域を重複させた PLD イン卜ロンを挿入して GUS発現の促進効果を調べた。
ベクターを以下の方法で作製した。 イネの PLD遺伝子の第 1イントロンは 1 7 3塩基からなる （配列番号 3) 。 イントロンの 2 n t〜65 n t、 66 n t ~ 1 20 n t、 1 2 1 n t〜1 73 n tの領域に対応する D N A断片を PCRによって 得た。 用いたプライマーは、 それぞれ
5' -CTATGACCCGGGATCCTAAGCCCAGTGTGC-3' と 5' -GCAAGCAAGCAGATCTGAGCGGAGAAGAAG-3'、
5' -TATGACCCGGGATCCGATCTGCTTGCTTGC-3' と
5' -ACCTAACGTAGATCTAGCGACACTCGCAGC-3'、
5' -TATGACCCGGGATCCGCTTCGTCTTCCTTC-3' と
5' -GTGTCGCTAGATCTCTGCGCCCCCCCACAC-3'
である。 PGR産物を制限酵素 BamHIおよび Bgl I Iで消化して、 PBI221のマルチク ローニング部位にある BamHIサイ トに揷入した (pBI [PLD (2 65) ]、 pBI [PLD(66-1
20)]、 および pBI [PLD(121- 173)]。
さらに、 次のように 2 n t〜65 n tあるいは 66 n t〜1 20 n tの領域を 重複して含む PLDイントロンを有するベクタ一を作製した。 先ず、 W096/30510 に記載されるように、 イネ PLD遺伝子の第 1イントロン（配列番号 3) をプライ マ一 （5'- AGGGGGTAAGGGGAG-3' , 3' -CCCCCGCGTCCATCC-5' ) を用いて PCRにより 増幅し、 該増幅産物を pGRI Iベクターにサブクロ一ニングし、 EcoRIで切り出し て Klenow断片によって平滑末端とした後、 PBI221ベクターの Sma I部位に揷入 した pBI221ベクター （pBI [PLD]) を調製した。 該イントロン配列を Bg I I I によ つてイントロンの 65番目の部位で切断し、 BamHI および Bgl I Iで消化した上記 の PCR産物を挿入した (pBI [PLD+PLD(2- 65)]および pBI [PLD+PLD(66- 120)]) 。 既報 (Shimamoto et al. Nature, 338, 274-276 (1989) ) の方法にしたがつ てイネ培養細胞 （Baba et al. Plant Cel l Physiol. 27, 463 - 471 (1986) ) に上 記組換えプラスミ ドを導入後、 -glucuronidase (GUS)活性を測定した。 活性の 相対値を表 1に示す。
表 1
Figure imgf000008_0001
PLDイントロンの分割では、 3つの領域とも対照 （pBI221) に比べて高い GUS 活性を示した。 2 n t ~ 65 n tの領域の効果が最も高く、 次が 66 n t ~ 1 2- O n tの領域であった。 これら 2つの領域をイントロン内に挿入した場合は、 2 n t ~65 n tの領域の重複で、 活性がもとのイントロンの場合の 2倍になった。 しかし、 66 n t〜 1 20 n tの領域の重複では活性の上昇は認められなかった。 以上の結果から、 PLDイントロンの 2 n t〜65 n tの領域は、 遺伝子発現を 促進する効果を有することが明らかになった。 2 n t〜65 n tの領域の塩基配 列を配列番号 1に、 また 2 n t ~65 n tの領域を重複させたイントロン （両端 にェキソン配列 10塩基ずつを含む） の塩基配列を配列番号 4に、 両端のェキソ ン配列を除いたィントロン部分の配列を配列番号 2に示す。

Claims

請求の範囲 、
1 . 配列表の配列番号 1に示す塩基配列を有する単離された核酸断片又は該塩 基配列のうち 1若しくは複数の塩基が置換し若しくは欠失し又は該塩基配列に 1 若しくは複数の塩基が挿入され若しくは付加された核酸断片であって、 その下流 に位置する構造遺伝子の発現を促進する効果を有する単離された核酸断片（ただ し、 配列表の配列番号 3記載の塩基配列を有する核酸を除く） 。
2 . 配列表の配列番号 1に示す塩基配列を有する核酸とストリンジエンドな条 件下でハイプリダイズする請求項 1記載の核酸断片。
3 . 塩基数が 1 2 0以下である請求項 1又は 2記載の核酸断片。
4 . 配列表の配列番号 1に示す塩基配列を有する請求項 1記載の核酸断片。
5 . 請求項 1ないし 4のいずれか 1項に記載の核酸断片が複数連結された核酸 断片。
6 . 配列表の配列番号 1に示す塩基配列を有する核酸断片又は該塩基配列のう ち 1若しくは複数の塩基が置換し若しくは欠失し又は該塩基配列に 1若しくは複 数の塩基が挿入され若しくは付加された核酸断片であって、 その下流に位置する 構造遺伝子の発現を促進する効果を有する核酸断片（ただし、 配列表の配列番号 3記載の塩基配列を有する核酸を除く） と、 該核酸断片の下流に位置する構造遺 伝子とを少なくとも含み、 前記核酸断片により、 該構造遺伝子の発現が促進され る組換えべクタ一。
7 . 前記核酸断片は、 配列表の配列番号 1に示す塩基配列を有する核酸とスト リンジェントな条件下でハイブリダイズする請求項 6記載の組換えべクタ一。
8 . 前記核酸断片は、 塩基数が 1 2 0以下である請求項 6又は 7記載の組換え べクタ一。
9 . 前記核酸断片は、 配列表の配列番号 1に示す塩基配列を有する請求項 8記 載の組換えべクタ一。
1 0 . 前記核酸断片は、 前記構造遺伝子の上流に位置するイント口ン配列中に 揷入されている請求項 6ないし 9のいずれか 1項に記載の組換えベクター。
1 1 . 前記イントロン配列は、 配列表の配列番号 3で示される塩基配列を有す る請求項 1 0記載の組換えベクター。 、
1 2 . 前記ィントロン配列は、 配列表の配列番号 2に示される塩基配列を有す る核酸を含む請求項 1 0記載の組換えベクター。
1 3 . 構造遺伝子の上流に、 配列表の配列番号 1に示す塩基配列を有する核酸 断片又は該塩基配列のうち 1若しくは複数の塩基が置換し若しくは欠失し又は該 塩基配列に 1若しくは複数の塩基が挿入され若しくは付加された核酸断片であつ て、 その下流に位置する構造遺伝子の発現を促進する効果を有する核酸断片（た だし、 配列表の配列番号 3記載の塩基配列を有する核酸を除く） を挿入すること から成る、 構造遺伝子の発現促進方法。
1 4 . 前記核酸断片は、 配列表の配列番号 1に示す塩基配列を有する核酸とス トリンジエンドな条件下でハイブリダィズする請求項 1 3記載の方法。
1 5 . 前記核酸断片は、 塩基数が 1 2 0以下である請求項 1 3又は 1 4記載の 方法。
1 6 . 前記核酸断片は、 配列表の配列番号 1に示す塩基配列を有する請求項 1 5記載の方法。
1 7 . 前記核酸断片を、 前記プロモーターの上流に位置するイントロン配列中 に挿入する請求項 1 3ないし 1 6のいずれか 1項に記載の方法。
1 8 . 前記イントロン配列は、 配列表の配列番号 3に示す塩基配列を有する請 求項 1 7記載の方法。
1 9 . 前記核酸断片を挿入することにより、 該核酸断片が複数連結された領域 が形成される請求項 1 3ないし 1 8のいずれか 1項に記載の方法。
2 0 . 請求項 1 3ないし 1 9のいずれか 1項に記載された方法により、 所望の 構造遺伝子の発現が促進された植物及び該形質を維持するその子孫。
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