JP2003135067A - Ｇ＋Ｃ含量が高いｒＤＮＡのスペーサー領域のエンハンサーとしての利用 - Google Patents
Ｇ＋Ｃ含量が高いｒＤＮＡのスペーサー領域のエンハンサーとしての利用Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、Ｇ＋Ｃ含量が高いｒＤＮＡのスペ
ーサー領域を外来性の遺伝子に連結して生物または植物
細胞に組み込むことにより、該スペーサーを外来性遺
伝子の発現を増大させるエンハンサーとして機能させ
る。外来性遺伝子の発現を増大させた生物または植物
細胞を取得する。形質転換された生物あるいは植物細
胞において外来性遺伝子の発現を増大させることで物質
生産を行う、等を目的とする。 【解決手段】 Ｇ＋Ｃ含量が高いｒＤＮＡのスペーサー
領域あるいは配列番号１に記載のＤＮＡを含む外来性遺
伝子を構築し、それを生物または植物細胞に導入するこ
とで形質転換体における外来性遺伝子の発現を増大させ
る。
ーサー領域を外来性の遺伝子に連結して生物または植物
細胞に組み込むことにより、該スペーサーを外来性遺
伝子の発現を増大させるエンハンサーとして機能させ
る。外来性遺伝子の発現を増大させた生物または植物
細胞を取得する。形質転換された生物あるいは植物細
胞において外来性遺伝子の発現を増大させることで物質
生産を行う、等を目的とする。 【解決手段】 Ｇ＋Ｃ含量が高いｒＤＮＡのスペーサー
領域あるいは配列番号１に記載のＤＮＡを含む外来性遺
伝子を構築し、それを生物または植物細胞に導入するこ
とで形質転換体における外来性遺伝子の発現を増大させ
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、外来性遺伝子の発
現を増大させる方法、特に、Ｇ+Ｃ含量が高いリボソー
ムＤＮＡ（以下、ｒＤＮＡと略記する）のスペーサー領
域のエンハンサーとしての利用に関するものである。
現を増大させる方法、特に、Ｇ+Ｃ含量が高いリボソー
ムＤＮＡ（以下、ｒＤＮＡと略記する）のスペーサー領
域のエンハンサーとしての利用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子組換えによる植物の機能改変はキ
メラ遺伝子の植物細胞への導入に依存し、導入された遺
伝子の発現はそのプロモーターに依存する。プロモータ
ーはＲＮＡポリメラーゼが結合して転写レベルでの遺伝
子発現を開始する配列の他、空間的および時間的な遺伝
子発現制御に関与する配列や外的な刺激に応答する配列
を含み、各プロモーター独自の遺伝子発現様式を示す。
例えば、イネのクロロフィルa/b結合タンパク質（Ｃａ
ｂ）のプロモーターは緑葉において光誘導的に遺伝子の
発現を活性化する（Tada et al. EMBO J.（1986）10,18
03-1808）。外来遺伝子の発現レベルの上昇は、プロモ
ーターの転写活性を強化させるＤＮＡ配列であるエンハ
ンサーを外来遺伝子の構築体に加えることによりしばし
ば達成される。エンハンサーの機能は、近傍に存在する
プロモーターからの距離、相対位置、および方向性によ
って大きな影響を受けないことを特徴とする。また、エ
ンハンサーは本来機能しているものとは異なるプロモー
ターに連結した場合でも機能する場合が多く、また、エ
ンハンサー配列を反復させることでより発現レベルを高
めることが可能である。
メラ遺伝子の植物細胞への導入に依存し、導入された遺
伝子の発現はそのプロモーターに依存する。プロモータ
ーはＲＮＡポリメラーゼが結合して転写レベルでの遺伝
子発現を開始する配列の他、空間的および時間的な遺伝
子発現制御に関与する配列や外的な刺激に応答する配列
を含み、各プロモーター独自の遺伝子発現様式を示す。
例えば、イネのクロロフィルa/b結合タンパク質（Ｃａ
ｂ）のプロモーターは緑葉において光誘導的に遺伝子の
発現を活性化する（Tada et al. EMBO J.（1986）10,18
03-1808）。外来遺伝子の発現レベルの上昇は、プロモ
ーターの転写活性を強化させるＤＮＡ配列であるエンハ
ンサーを外来遺伝子の構築体に加えることによりしばし
ば達成される。エンハンサーの機能は、近傍に存在する
プロモーターからの距離、相対位置、および方向性によ
って大きな影響を受けないことを特徴とする。また、エ
ンハンサーは本来機能しているものとは異なるプロモー
ターに連結した場合でも機能する場合が多く、また、エ
ンハンサー配列を反復させることでより発現レベルを高
めることが可能である。
【０００３】Borysjukら（Nature Biotech. (2000), 1
8, 1303-1306）は、タバコの２５ＳｒＤＮＡおよび１８
ＳｒＤＮＡ間に存在する配列であるＡおよびＴ塩基に富
むaps（amplification-promoting sequnec）配列が外来
遺伝子の増幅と発現を促進することを明らかにしたが、
そのaps配列中には反復配列が９箇所存在し、酵母にお
いて遺伝子増幅に関与するＡＲＳ（autonomously repli
cating sequence）の11塩基のコンセンサス配列(A/T)TT
TAT(A/G)TTT(A/T)に最低でも９塩基が一致する。一方、
イネのｒＤＮＡの2138ヌクレオチド配列から構成される
スペーサー領域はＧ＋Ｃ含量が71%であり、Ａ＋Ｔ含量
よりかなり高いことが知られている（Takaiwa et al. P
lant Mol. Biol. (1990) 15: 933-935）。また、イネの
スペーサー領域にはタバコでみられたようなaps配列に
相当する配列は存在しない。イネのｒＤＮＡのスペーサ
ー領域には、トウモロコシ、コムギ、ニンジン、ハツカ
ダイコンなどで保存されるｒＤＮＡの転写開始点である
TATA(R)TA(N)GGG配列を３箇所含み、また、この保存性
の高い配列を含む３つの250塩基の反復配列が存在す
る。さらに前記250塩基の反復配列の一部に相当する100
塩基の配列も隣接して存在する。
8, 1303-1306）は、タバコの２５ＳｒＤＮＡおよび１８
ＳｒＤＮＡ間に存在する配列であるＡおよびＴ塩基に富
むaps（amplification-promoting sequnec）配列が外来
遺伝子の増幅と発現を促進することを明らかにしたが、
そのaps配列中には反復配列が９箇所存在し、酵母にお
いて遺伝子増幅に関与するＡＲＳ（autonomously repli
cating sequence）の11塩基のコンセンサス配列(A/T)TT
TAT(A/G)TTT(A/T)に最低でも９塩基が一致する。一方、
イネのｒＤＮＡの2138ヌクレオチド配列から構成される
スペーサー領域はＧ＋Ｃ含量が71%であり、Ａ＋Ｔ含量
よりかなり高いことが知られている（Takaiwa et al. P
lant Mol. Biol. (1990) 15: 933-935）。また、イネの
スペーサー領域にはタバコでみられたようなaps配列に
相当する配列は存在しない。イネのｒＤＮＡのスペーサ
ー領域には、トウモロコシ、コムギ、ニンジン、ハツカ
ダイコンなどで保存されるｒＤＮＡの転写開始点である
TATA(R)TA(N)GGG配列を３箇所含み、また、この保存性
の高い配列を含む３つの250塩基の反復配列が存在す
る。さらに前記250塩基の反復配列の一部に相当する100
塩基の配列も隣接して存在する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、イネ
のｒＤＮＡのスペーサー領域に代表されるＧ＋Ｃ含量が
高いｒＤＮＡのスペーサー領域を外来性の遺伝子に連結
して生物または植物細胞に導入することにより、植物細
胞における外来遺伝子の発現量を増大させるエンハンサ
ーとして機能させる方法を提供することである。
のｒＤＮＡのスペーサー領域に代表されるＧ＋Ｃ含量が
高いｒＤＮＡのスペーサー領域を外来性の遺伝子に連結
して生物または植物細胞に導入することにより、植物細
胞における外来遺伝子の発現量を増大させるエンハンサ
ーとして機能させる方法を提供することである。
【０００５】本発明のさらなる目的は、当該エンハンサ
ーの利用により、かつ植物の緑葉、根、塊茎、茎、葉、
花又は種子の１以上において発現する任意のプロモータ
ーの外来性遺伝子の発現機能を増大させる方法又は外来
性遺伝子がコードする蛋白質或いは該蛋白質の作用によ
り生産される物質の生産方法を提供することにある。
ーの利用により、かつ植物の緑葉、根、塊茎、茎、葉、
花又は種子の１以上において発現する任意のプロモータ
ーの外来性遺伝子の発現機能を増大させる方法又は外来
性遺伝子がコードする蛋白質或いは該蛋白質の作用によ
り生産される物質の生産方法を提供することにある。
【０００６】また、当該配列が得られた植物以外の植物
における外来遺伝子の発現を高める方法又はその様に外
来遺伝子の発現が高められた植物を提供することも本発
明の目的である。
における外来遺伝子の発現を高める方法又はその様に外
来遺伝子の発現が高められた植物を提供することも本発
明の目的である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、Ｇ＋Ｃ含
量が高いｒＤＮＡのスペーサー領域の配列、特にイネ由
来の当該配列が外来遺伝子の発現レベルを高めるエンハ
ンサーとして機能するということを見出し、本発明を完
成するに至った。
量が高いｒＤＮＡのスペーサー領域の配列、特にイネ由
来の当該配列が外来遺伝子の発現レベルを高めるエンハ
ンサーとして機能するということを見出し、本発明を完
成するに至った。
【０００８】即ち、本願発明は以下のとおりである。
［１］ ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド配
列の全て、ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド配
列の内部の反復されたヌクレオチド配列、又はこれらに
由来するヌクレオチド配列を含有し、そのＧ及びＣ塩基
の総量が５０％を上回るＤＮＡを、外来性遺伝子のプロ
モーターを活性化するエンハンサーとして利用する方
法。 ［２］ ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド配
列の全て又はｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド
配列の内部の反復されたヌクレオチド配列に由来するヌ
クレオチド配列を含有し、そのＧ及びＣ塩基の総量が５
０％を上回るＤＮＡが、３ＸＳＳＣ、20mM NaPO4(pH6.
8)からなるハイブリダイゼーション溶液中で65℃でハイ
ブリダーゼーションの後、0.2ＸＳＳＣの洗浄溶液中で6
5℃で洗浄後に、ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオ
チド配列の全て、ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオ
チド配列の内部の反復されたヌクレオチド配列を含有
し、そのＧ及びＣ塩基の総量が５０％を上回るＤＮＡに
ハイブリダイズすることを特徴とする［１］記載の方
法。 ［３］ Ｇ及びＣ塩基をそれぞれ少なくとも２５％有
する［１］又は［２］に記載の方法。 ［４］ Ｇ及びＣ塩基をそれぞれ少なくとも３０％有
する［３］に記載の方法。 ［５］ Ｇ及びＣ塩基をそれぞれ少なくとも３５％有
する［４］に記載の方法。 ［６］ ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド配
列の全て、ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド配
列の内部の反復されたヌクレオチド配列、又はこれらに
由来するヌクレオチド配列を含有し、そのＧ及びＣ塩基
の総量が５０％を上回るＤＮＡがイネ由来である［１］
〜［５］の何れか一項に記載の方法。 ［７］ ＤＮＡが単離及び／又は精製されたＤＮＡで
ある、［１］〜［６］の何れか一項に記載の方法。 ［８］ ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド配
列の全て、ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド配
列の内部の反復されたヌクレオチド配列、又はこれらに
由来するヌクレオチド配列を含有し、そのＧ及びＣ塩基
の総量が５０％を上回るＤＮＡを、外来性遺伝子のプロ
モーターを活性化するエンハンサーとして利用して、１
以上の外来遺伝子のプロモーターの活性を高めることに
より植物の１以上の器官における１以上の外来性遺伝子
の発現を増大させる方法。 ［９］ ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド配
列の全て、ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド配
列の内部の反復されたヌクレオチド配列、又はこれらに
由来するヌクレオチド配列を含有し、そのＧ及びＣ塩基
の総量が５０％を上回るＤＮＡが植物遺伝子から得られ
るか、又は合成により生成されるものであることを特徴
とする、［８］に記載の方法。 ［１０］ 遺伝子プロモーターが植物における遺伝子
プロモーターである、［８］又は［９］に記載の外来性
遺伝子の発現を増大させる方法。 ［１１］ ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド
配列の全て、ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド
配列の内部の反復されたヌクレオチド配列、又はこれら
に由来するヌクレオチド配列を含有し、そのＧ及びＣ塩
基の総量が５０％を上回るＤＮＡが植物の緑色又は非緑
色組織、特には該植物の根、塊茎、種子、茎、花又は葉
における遺伝子の発現を増大させる、［８］〜［１０］
のいずれか１項に記載の外来性遺伝子の発現を増大させ
る方法。 ［１２］ ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド
配列の全て、ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド
配列の内部の反復されたヌクレオチド配列、又はこれら
に由来するヌクレオチド配列を含有し、そのＧ及びＣ塩
基の総量が５０％を上回るＤＮＡを複数用いることを特
徴とする、［８］〜［１１］のいずれか１項に記載の外
来性遺伝子の発現を増大させる方法。 ［１３］ ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド
配列の全て、ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド
配列の内部の反復されたヌクレオチド配列、又はこれら
に由来するヌクレオチド配列を含有し、そのＧ及びＣ塩
基の総量が５０％を上回るＤＮＡが正常方向及び逆方向
の両者で作動する、［８］〜［１２］のいずれか１項に
記載の外来性遺伝子の発現を増大させる方法。 ［１４］ ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド
配列の全て、ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド
配列の内部の反復されたヌクレオチド配列、又はこれら
に由来するヌクレオチド配列を含有し、そのＧ及びＣ塩
基の総量が５０％を上回るＤＮＡが、発現させようとす
る遺伝子プロモーター又はターミネーターのいずれかに
結合する、［８］〜［１３］のいずれか１項に記載の外
来性遺伝子の発現を増大させる方法。 ［１５］ ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド
配列の全て、ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド
配列の内部の反復されたヌクレオチド配列、又はこれら
に由来するヌクレオチド配列を含有し、そのＧ及びＣ塩
基の総量が５０％を上回るＤＮＡと遺伝子プロモーター
とコード配列もしくは非コード配列及びターミネーター
配列を含むキメラ遺伝子。 ［１６］ 前記のキメラ遺伝子が１を上回る該ＤＮＡ
及び１を上回る遺伝子プロモーターを含むことを特徴と
する、［１５］に記載のキメラ遺伝子。 ［１７］ ［１５］又は［１６］のいずれか１項に記
載のキメラ遺伝子を有する形質転換された植物。 ［１８］ 形質転換された植物がジャガイモ、タバ
コ、綿花、レタス、メロン、カボチャ、キュウリ、エン
ドウマメ、セイヨウアブラナ、ダイズ、テンサイもしく
はヒマワリから選ばれる双子葉植物種、又はコムギ、オ
オムギ、ライムギ、イネもしくはトウモロコシから選ば
れる単子葉植物種である、［１７］に記載の植物。 ［１９］ ［１］〜［１４］のいずれか１項に記載の
方法により外来性遺伝子の発現が高められた細胞。
列の全て、ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド配
列の内部の反復されたヌクレオチド配列、又はこれらに
由来するヌクレオチド配列を含有し、そのＧ及びＣ塩基
の総量が５０％を上回るＤＮＡを、外来性遺伝子のプロ
モーターを活性化するエンハンサーとして利用する方
法。 ［２］ ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド配
列の全て又はｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド
配列の内部の反復されたヌクレオチド配列に由来するヌ
クレオチド配列を含有し、そのＧ及びＣ塩基の総量が５
０％を上回るＤＮＡが、３ＸＳＳＣ、20mM NaPO4(pH6.
8)からなるハイブリダイゼーション溶液中で65℃でハイ
ブリダーゼーションの後、0.2ＸＳＳＣの洗浄溶液中で6
5℃で洗浄後に、ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオ
チド配列の全て、ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオ
チド配列の内部の反復されたヌクレオチド配列を含有
し、そのＧ及びＣ塩基の総量が５０％を上回るＤＮＡに
ハイブリダイズすることを特徴とする［１］記載の方
法。 ［３］ Ｇ及びＣ塩基をそれぞれ少なくとも２５％有
する［１］又は［２］に記載の方法。 ［４］ Ｇ及びＣ塩基をそれぞれ少なくとも３０％有
する［３］に記載の方法。 ［５］ Ｇ及びＣ塩基をそれぞれ少なくとも３５％有
する［４］に記載の方法。 ［６］ ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド配
列の全て、ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド配
列の内部の反復されたヌクレオチド配列、又はこれらに
由来するヌクレオチド配列を含有し、そのＧ及びＣ塩基
の総量が５０％を上回るＤＮＡがイネ由来である［１］
〜［５］の何れか一項に記載の方法。 ［７］ ＤＮＡが単離及び／又は精製されたＤＮＡで
ある、［１］〜［６］の何れか一項に記載の方法。 ［８］ ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド配
列の全て、ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド配
列の内部の反復されたヌクレオチド配列、又はこれらに
由来するヌクレオチド配列を含有し、そのＧ及びＣ塩基
の総量が５０％を上回るＤＮＡを、外来性遺伝子のプロ
モーターを活性化するエンハンサーとして利用して、１
以上の外来遺伝子のプロモーターの活性を高めることに
より植物の１以上の器官における１以上の外来性遺伝子
の発現を増大させる方法。 ［９］ ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド配
列の全て、ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド配
列の内部の反復されたヌクレオチド配列、又はこれらに
由来するヌクレオチド配列を含有し、そのＧ及びＣ塩基
の総量が５０％を上回るＤＮＡが植物遺伝子から得られ
るか、又は合成により生成されるものであることを特徴
とする、［８］に記載の方法。 ［１０］ 遺伝子プロモーターが植物における遺伝子
プロモーターである、［８］又は［９］に記載の外来性
遺伝子の発現を増大させる方法。 ［１１］ ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド
配列の全て、ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド
配列の内部の反復されたヌクレオチド配列、又はこれら
に由来するヌクレオチド配列を含有し、そのＧ及びＣ塩
基の総量が５０％を上回るＤＮＡが植物の緑色又は非緑
色組織、特には該植物の根、塊茎、種子、茎、花又は葉
における遺伝子の発現を増大させる、［８］〜［１０］
のいずれか１項に記載の外来性遺伝子の発現を増大させ
る方法。 ［１２］ ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド
配列の全て、ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド
配列の内部の反復されたヌクレオチド配列、又はこれら
に由来するヌクレオチド配列を含有し、そのＧ及びＣ塩
基の総量が５０％を上回るＤＮＡを複数用いることを特
徴とする、［８］〜［１１］のいずれか１項に記載の外
来性遺伝子の発現を増大させる方法。 ［１３］ ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド
配列の全て、ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド
配列の内部の反復されたヌクレオチド配列、又はこれら
に由来するヌクレオチド配列を含有し、そのＧ及びＣ塩
基の総量が５０％を上回るＤＮＡが正常方向及び逆方向
の両者で作動する、［８］〜［１２］のいずれか１項に
記載の外来性遺伝子の発現を増大させる方法。 ［１４］ ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド
配列の全て、ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド
配列の内部の反復されたヌクレオチド配列、又はこれら
に由来するヌクレオチド配列を含有し、そのＧ及びＣ塩
基の総量が５０％を上回るＤＮＡが、発現させようとす
る遺伝子プロモーター又はターミネーターのいずれかに
結合する、［８］〜［１３］のいずれか１項に記載の外
来性遺伝子の発現を増大させる方法。 ［１５］ ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド
配列の全て、ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチド
配列の内部の反復されたヌクレオチド配列、又はこれら
に由来するヌクレオチド配列を含有し、そのＧ及びＣ塩
基の総量が５０％を上回るＤＮＡと遺伝子プロモーター
とコード配列もしくは非コード配列及びターミネーター
配列を含むキメラ遺伝子。 ［１６］ 前記のキメラ遺伝子が１を上回る該ＤＮＡ
及び１を上回る遺伝子プロモーターを含むことを特徴と
する、［１５］に記載のキメラ遺伝子。 ［１７］ ［１５］又は［１６］のいずれか１項に記
載のキメラ遺伝子を有する形質転換された植物。 ［１８］ 形質転換された植物がジャガイモ、タバ
コ、綿花、レタス、メロン、カボチャ、キュウリ、エン
ドウマメ、セイヨウアブラナ、ダイズ、テンサイもしく
はヒマワリから選ばれる双子葉植物種、又はコムギ、オ
オムギ、ライムギ、イネもしくはトウモロコシから選ば
れる単子葉植物種である、［１７］に記載の植物。 ［１９］ ［１］〜［１４］のいずれか１項に記載の
方法により外来性遺伝子の発現が高められた細胞。
【０００９】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、遺伝子プロモーターの発現を増大させる方法
であって、ｒＤＮＡのスペーサー領域をエンハンサーと
して用いて１以上の遺伝子プロモーターの活性を高める
ことにより植物の１以上の器官における１以上の遺伝子
の発現を増大させる方法である。また、当該エンハンサ
ーとして利用されるＤＮＡはＧ及びＣ塩基に富むヌクレ
オチド配列であり、その含有するＧ及びＣ塩基の総量は
該ヌクレオチド配列の50％を上回るエンハンサーである
方法である。
本発明は、遺伝子プロモーターの発現を増大させる方法
であって、ｒＤＮＡのスペーサー領域をエンハンサーと
して用いて１以上の遺伝子プロモーターの活性を高める
ことにより植物の１以上の器官における１以上の遺伝子
の発現を増大させる方法である。また、当該エンハンサ
ーとして利用されるＤＮＡはＧ及びＣ塩基に富むヌクレ
オチド配列であり、その含有するＧ及びＣ塩基の総量は
該ヌクレオチド配列の50％を上回るエンハンサーである
方法である。
【００１０】本明細書中で用いられる場合、発現の増大
とは、本発明のエンハンサーと共に用いた場合の遺伝子
の発現が、本発明のエンハンサーとして利用されるＤＮ
Ａを用いずにその遺伝子の発現において見られるであろ
うものよりも大きいことを意味する。
とは、本発明のエンハンサーと共に用いた場合の遺伝子
の発現が、本発明のエンハンサーとして利用されるＤＮ
Ａを用いずにその遺伝子の発現において見られるであろ
うものよりも大きいことを意味する。
【００１１】本発明に係るエンハンサーとして利用され
るＤＮＡは植物の遺伝子から得られるか、又は合成によ
り産生されることが出来る。エンハンサーとして利用さ
れるＤＮＡは植物遺伝子の相同体であっても、合成によ
り産生された配列の相同体であってもよい。
るＤＮＡは植物の遺伝子から得られるか、又は合成によ
り産生されることが出来る。エンハンサーとして利用さ
れるＤＮＡは植物遺伝子の相同体であっても、合成によ
り産生された配列の相同体であってもよい。
【００１２】本発明に係るエンハンサーとして利用され
るＤＮＡは、イネのｒＤＮＡのスペーサー領域から得ら
れることができる。該エンハンサーとして利用されるＤ
ＮＡは隣接する２５ＳｒＤＮＡおよび１８ＳｒＲＮＡ配
列を含んでもプロモーターの発現を増大させることがで
きる。
るＤＮＡは、イネのｒＤＮＡのスペーサー領域から得ら
れることができる。該エンハンサーとして利用されるＤ
ＮＡは隣接する２５ＳｒＤＮＡおよび１８ＳｒＲＮＡ配
列を含んでもプロモーターの発現を増大させることがで
きる。
【００１３】そのようなエンハンサーとして利用される
ＤＮＡとしての機能を有するＤＮＡとしては配列表の配
列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡが例示でき
る。そして当該配列番号１の４８６−２６２４番目の塩
基配列を有するＤＮＡは全スペーサー領域であり、該全
スペーサー領域のみをエンハンサーとして利用してもよ
い。
ＤＮＡとしての機能を有するＤＮＡとしては配列表の配
列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡが例示でき
る。そして当該配列番号１の４８６−２６２４番目の塩
基配列を有するＤＮＡは全スペーサー領域であり、該全
スペーサー領域のみをエンハンサーとして利用してもよ
い。
【００１４】好ましくは、植物の１以上の器官に組み込
まれる遺伝子の高められた発現は、そのエンハンサーと
して利用されるＤＮＡが得られた植物とは異なる植物に
おけるものである。この相違は植物の型、すなわち系統
群(family)の相違であっても、又は同じ植物系統群の別
の植物であってもよい。
まれる遺伝子の高められた発現は、そのエンハンサーと
して利用されるＤＮＡが得られた植物とは異なる植物に
おけるものである。この相違は植物の型、すなわち系統
群(family)の相違であっても、又は同じ植物系統群の別
の植物であってもよい。
【００１５】本発明は、遺伝子プロモーターのためのエ
ンハンサーであって、当該エンハンサーとして利用され
るＤＮＡはＧ及びＣ塩基に富むヌクレオチド配列であ
り、その含有するＧ及びＣ塩基の総量がこのヌクレオチ
ド配列の50％を上回るＤＮＡを提供する。このエンハン
サー配列は単離及び／又は精製されたされた配列が適切
でありうる。
ンハンサーであって、当該エンハンサーとして利用され
るＤＮＡはＧ及びＣ塩基に富むヌクレオチド配列であ
り、その含有するＧ及びＣ塩基の総量がこのヌクレオチ
ド配列の50％を上回るＤＮＡを提供する。このエンハン
サー配列は単離及び／又は精製されたされた配列が適切
でありうる。
【００１６】このエンハンサーとして利用されるＤＮＡ
は、イネのｒＤＮＡスペーサー領域の配列、又はそれに
類似する配列であって、そのサブ配列、特にスペーサー
内の反復配列がエンハンサーとして活性であることがよ
り有利である。この反復配列は配列表の配列番号１の７
９５-１６６７番目の塩基配列に相当する。
は、イネのｒＤＮＡスペーサー領域の配列、又はそれに
類似する配列であって、そのサブ配列、特にスペーサー
内の反復配列がエンハンサーとして活性であることがよ
り有利である。この反復配列は配列表の配列番号１の７
９５-１６６７番目の塩基配列に相当する。
【００１７】類似配列は相同体としても知られ得る。本
明細書中で用いられる場合、相同体という用語は、別の
ヌクレオチド配列と同一であるか又はそれに類似するヌ
クレオチド配列を有する核酸を意味する。その類似性
は、そのヌクレオチド配列が本発明によるエンハンサー
として作用可能となるのに十分なものでなければならな
い。好ましくは、遺伝子プロモーターは植物で機能する
遺伝子プロモーターである。
明細書中で用いられる場合、相同体という用語は、別の
ヌクレオチド配列と同一であるか又はそれに類似するヌ
クレオチド配列を有する核酸を意味する。その類似性
は、そのヌクレオチド配列が本発明によるエンハンサー
として作用可能となるのに十分なものでなければならな
い。好ましくは、遺伝子プロモーターは植物で機能する
遺伝子プロモーターである。
【００１８】本発明にかかるエンハンサーとして利用さ
れるＤＮＡは複数のエンハンサー用ＤＮＡを含んでいて
もよい。これら本発明に係るエンハンサーとして利用さ
れるＤＮＡは、正常又は逆方向の両者において適切に作
動し得る。また、本発明に係るのエンハンサーとして利
用されるＤＮＡは、発現させようとする遺伝子のプロモ
ーター又はターミネーターのいずれかに作動可能に結合
させ得ることが適切である。
れるＤＮＡは複数のエンハンサー用ＤＮＡを含んでいて
もよい。これら本発明に係るエンハンサーとして利用さ
れるＤＮＡは、正常又は逆方向の両者において適切に作
動し得る。また、本発明に係るのエンハンサーとして利
用されるＤＮＡは、発現させようとする遺伝子のプロモ
ーター又はターミネーターのいずれかに作動可能に結合
させ得ることが適切である。
【００１９】また、本発明は、本発明に係るエンハンサ
ーとして利用されるＤＮＡ、遺伝子プロモーター、コー
ド配列もしくは非コード配列及びターミネーター配列を
含むキメラ遺伝子も提供する。ここで用いられる場合、
キメラ遺伝子という用語は、１種を上回る生物からの配
列を有する組換えＤＮＡ分子を意味する。
ーとして利用されるＤＮＡ、遺伝子プロモーター、コー
ド配列もしくは非コード配列及びターミネーター配列を
含むキメラ遺伝子も提供する。ここで用いられる場合、
キメラ遺伝子という用語は、１種を上回る生物からの配
列を有する組換えＤＮＡ分子を意味する。
【００２０】前記キメラ遺伝子は１種を上回るエンハン
サーとして利用されるＤＮＡ及び１種を上回るプロモー
ターを有していても良く、レポーター配列又は識別可能
な特徴を形質転換された植物に付与する他の任意の配列
を含むことが可能である。エンハンサーは、このキメラ
遺伝子に含まれる場合、正常の方向であっても逆方向で
あってもよい。
サーとして利用されるＤＮＡ及び１種を上回るプロモー
ターを有していても良く、レポーター配列又は識別可能
な特徴を形質転換された植物に付与する他の任意の配列
を含むことが可能である。エンハンサーは、このキメラ
遺伝子に含まれる場合、正常の方向であっても逆方向で
あってもよい。
【００２１】本発明における外来性遺伝子とは、宿主細
胞が本来有していない遺伝子を指しており、そのような
遺伝子は蛋白質をコードする領域とその上流に当該領域
の発現を制御するプロモーター領域（遺伝子プロモータ
ー）を少なくとも有し、更に所望によりその上流にトラ
ンジットペプチド配列や下流にターミネーター領域を有
していてもよい。この場合、これら蛋白質をコードする
領域以外のプロモーター領域およびターミネーター領域
等は必ずしもその由来が蛋白質をコードする領域と同一
である必要はなく、必要に応じて適宜選択可能である。
このような外来性遺伝子の例としては実施例１に記載の
アロエ緑葉由来ＮＡＤＰリンゴ酸酵素のｃＤＮＡを含む
ものや、実施例２に記載の大腸菌カタラーゼ遺伝子を含
むものがあげられる。
胞が本来有していない遺伝子を指しており、そのような
遺伝子は蛋白質をコードする領域とその上流に当該領域
の発現を制御するプロモーター領域（遺伝子プロモータ
ー）を少なくとも有し、更に所望によりその上流にトラ
ンジットペプチド配列や下流にターミネーター領域を有
していてもよい。この場合、これら蛋白質をコードする
領域以外のプロモーター領域およびターミネーター領域
等は必ずしもその由来が蛋白質をコードする領域と同一
である必要はなく、必要に応じて適宜選択可能である。
このような外来性遺伝子の例としては実施例１に記載の
アロエ緑葉由来ＮＡＤＰリンゴ酸酵素のｃＤＮＡを含む
ものや、実施例２に記載の大腸菌カタラーゼ遺伝子を含
むものがあげられる。
【００２２】さらに本発明は、本発明による１以上のエ
ンハンサーとして利用されるＤＮＡを用いることにより
その形質転換された植物中の１以上の遺伝子の発現が増
大している形質転換された植物を提供する。加えて本発
明は、本明細書の方法又はそのエンハンサーとしての利
用の結果として発現が増大している遺伝子を有する細胞
も提供する。
ンハンサーとして利用されるＤＮＡを用いることにより
その形質転換された植物中の１以上の遺伝子の発現が増
大している形質転換された植物を提供する。加えて本発
明は、本明細書の方法又はそのエンハンサーとしての利
用の結果として発現が増大している遺伝子を有する細胞
も提供する。
【００２３】この形質転換された植物は、双子葉植物
種、例えばジャガイモ、タバコ、綿花、レタス、メロ
ン、カボチャ、キュウリ、エンドウマメ、セイヨウアブ
ラナ、ダイズ、テンサイもしくはヒマワリ、又は単子葉
植物種、例えばコムギ、オオムギ、ライムギ、イネもし
くはトウモロコシでありうる。植物を形質転換する方法
としては、形質転換因子としてアグロバクテリウム・ツ
メファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）また
は、アグロバクテリウム リゾゲネス（Agrobacteriumrh
izogenes）を用いたＴ−ＤＮＡによる植物細胞の形質転
換法、プロトプラストへの直接導入法（インジェクショ
ン法、エレクトロポレーション法等）、パーティクルガ
ン法等やその他の可能性が含まれるが、熟練した読者に
は公知であり、ここでは詳細な説明は省略する。一旦、
植物組織に導入されると、構造遺伝子の発現は、一過性
の発現系で測定され得て、あるいは植物ゲノム内への安
定に組み込まれるための選別ののち、決定されうる。技
術としては、植物組織のインビトロ培養、そして多くの
場合に、植物体への再分化が知られている。導入された
遺伝子を、もともと形質転換された植物から商業的に有
用な培養物に転移する技術は、当業者には知られてい
る。以下に示されている以外は、クローニング技術、Ｄ
ＮＡの単離、増幅および精製、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡ
ポリメラーゼ、制限酵素およびそのようなものを含む酵
素反応の標準技術、ＰＣＲ技術および種々の分離技術は
既知の標準技術であって、通常当業者に用いられてい
る。それらの標準技術は、例えばSambrrk et al.Molecu
lar Cloning 第２版 (1989) Cold Spring Harbor Labor
atory Press, New Yorkに記載されている。ここに用い
られている略号および命名は、当分野に標準的であると
思われ、ここに挙げられている専門雑誌に一般的に用い
られている。以下の実施例は、例示を目的として提供さ
れているのみであり、本発明の範囲を限定することを意
図しているのではない。
種、例えばジャガイモ、タバコ、綿花、レタス、メロ
ン、カボチャ、キュウリ、エンドウマメ、セイヨウアブ
ラナ、ダイズ、テンサイもしくはヒマワリ、又は単子葉
植物種、例えばコムギ、オオムギ、ライムギ、イネもし
くはトウモロコシでありうる。植物を形質転換する方法
としては、形質転換因子としてアグロバクテリウム・ツ
メファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）また
は、アグロバクテリウム リゾゲネス（Agrobacteriumrh
izogenes）を用いたＴ−ＤＮＡによる植物細胞の形質転
換法、プロトプラストへの直接導入法（インジェクショ
ン法、エレクトロポレーション法等）、パーティクルガ
ン法等やその他の可能性が含まれるが、熟練した読者に
は公知であり、ここでは詳細な説明は省略する。一旦、
植物組織に導入されると、構造遺伝子の発現は、一過性
の発現系で測定され得て、あるいは植物ゲノム内への安
定に組み込まれるための選別ののち、決定されうる。技
術としては、植物組織のインビトロ培養、そして多くの
場合に、植物体への再分化が知られている。導入された
遺伝子を、もともと形質転換された植物から商業的に有
用な培養物に転移する技術は、当業者には知られてい
る。以下に示されている以外は、クローニング技術、Ｄ
ＮＡの単離、増幅および精製、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡ
ポリメラーゼ、制限酵素およびそのようなものを含む酵
素反応の標準技術、ＰＣＲ技術および種々の分離技術は
既知の標準技術であって、通常当業者に用いられてい
る。それらの標準技術は、例えばSambrrk et al.Molecu
lar Cloning 第２版 (1989) Cold Spring Harbor Labor
atory Press, New Yorkに記載されている。ここに用い
られている略号および命名は、当分野に標準的であると
思われ、ここに挙げられている専門雑誌に一般的に用い
られている。以下の実施例は、例示を目的として提供さ
れているのみであり、本発明の範囲を限定することを意
図しているのではない。
【００２４】
【実施例】実施例１ コード領域としてアロエ緑葉由来
ＮＡＤＰ型リンゴ酸酵素のｃＤＮＡを組込んだキメラ遺
伝子をイネで発現させた例 （１）発現ベクターの構築 アロエ緑葉由来ＮＡＤＰ型リンゴ酸酵素のｃＤＮＡは以
前に本田らにより単離され、ヌクレオチド配列が決定さ
れたものを用いた（Honda et al. DNA Res. (1997) 4,
397-400; Honda et al. Gene (2000) 243, 85-92）。こ
れまでに２つのタイプのｃＤＮＡクローン、Ame1, Ame2
単離されているが、アロエに存在するＮＡＤＰ型リンゴ
酸酵素のいくつかのアイソザイムの中で緑葉において主
要なタイプに対応するAme1（Honda et al. Gene (2000)
243, 85-92）を本実施例に用いた。Ame1のｃＤＮＡ領
域は、そのクローニングベクターであるpBluescript SK
＋をSmaIとKpnIで同時に切断して調製した。また、Ｃａ
ｂプロモーターを含む領域は、プラスミドpLHC4.4（Y.
Tada et al. EMBO J. (1991) 10, 1803-1808）をHidIII
とSmaIで同時に切断して調製した。こうして調製された
ＣａｂプロモーターとAme1のｃＤＮＡのＤＮＡ断片は、
あらかじめHindIIIとKpnIで切断したプラスミドベクタ
ーであるpUC19に同時にクローニングした。こうして得
られたプラスミドをさらにHindIIIとSacIで同時に切断
してＣａｂプロモーター領域とAme1のｃＤＮＡ領域を含
むＤＮＡ断片を調製し、あらかじめHindIIIとSacIで同
時に切断してＧＵＳ遺伝子を除去したバイナリーベクタ
ーpBI-HIにクローニングした。なお、pBI-HIにはハイグ
ロマイシン耐性遺伝子であるネオマイシンホスホトラン
スフェラーゼ遺伝子が含まれている。こうして得られた
発現ベクターをpBI-MCと命名した。また、pBI-MCにイネ
のｒＤＮＡのスペーサー領域を付加した発現ベクターを
以下のように構築した。まず、イネｒＤＮＡの１ユニッ
トを含むプラスミドpRR217（Takaiwa et al. Nucl. Aci
ds Res. (1985) 12, 5441-5448）から、スペーサー領域
全長とその両端の２５ＳｒＤＮＡ、１７ＳｒＤＮＡをそ
れぞれ一部含む領域約3.2 kbをEcoRIとBamHIで同時に切
断して調製し、これをあらかじめEcoRIとBamHIで切断し
たプラスミドpBluescript SK＋にクローニングした。こ
うして得られたプラスミドをさらにXhoIとXbaIで同時に
切断して約3.2 kb断片を再度調製し、あらかじめSalIと
XbaIで切断したpUC19にクローニングした。こうして得
られたプラスミドをpUC-SPと命名した。次に、pUC-SPを
Sse8387IとXbaIで同時に切断して約3.2 kb断片をさらに
調製し、これをpBI-MCのＣａｂプロモーターの上流にあ
るSse8387IおよびXbaI認識部位にセンスの方向で挿入し
た。こうして得られた発現ベクターをpBI-MC/SP3.2と命
名した。以上の構築した発現ベクターの構造を図１に示
す。
ＮＡＤＰ型リンゴ酸酵素のｃＤＮＡを組込んだキメラ遺
伝子をイネで発現させた例 （１）発現ベクターの構築 アロエ緑葉由来ＮＡＤＰ型リンゴ酸酵素のｃＤＮＡは以
前に本田らにより単離され、ヌクレオチド配列が決定さ
れたものを用いた（Honda et al. DNA Res. (1997) 4,
397-400; Honda et al. Gene (2000) 243, 85-92）。こ
れまでに２つのタイプのｃＤＮＡクローン、Ame1, Ame2
単離されているが、アロエに存在するＮＡＤＰ型リンゴ
酸酵素のいくつかのアイソザイムの中で緑葉において主
要なタイプに対応するAme1（Honda et al. Gene (2000)
243, 85-92）を本実施例に用いた。Ame1のｃＤＮＡ領
域は、そのクローニングベクターであるpBluescript SK
＋をSmaIとKpnIで同時に切断して調製した。また、Ｃａ
ｂプロモーターを含む領域は、プラスミドpLHC4.4（Y.
Tada et al. EMBO J. (1991) 10, 1803-1808）をHidIII
とSmaIで同時に切断して調製した。こうして調製された
ＣａｂプロモーターとAme1のｃＤＮＡのＤＮＡ断片は、
あらかじめHindIIIとKpnIで切断したプラスミドベクタ
ーであるpUC19に同時にクローニングした。こうして得
られたプラスミドをさらにHindIIIとSacIで同時に切断
してＣａｂプロモーター領域とAme1のｃＤＮＡ領域を含
むＤＮＡ断片を調製し、あらかじめHindIIIとSacIで同
時に切断してＧＵＳ遺伝子を除去したバイナリーベクタ
ーpBI-HIにクローニングした。なお、pBI-HIにはハイグ
ロマイシン耐性遺伝子であるネオマイシンホスホトラン
スフェラーゼ遺伝子が含まれている。こうして得られた
発現ベクターをpBI-MCと命名した。また、pBI-MCにイネ
のｒＤＮＡのスペーサー領域を付加した発現ベクターを
以下のように構築した。まず、イネｒＤＮＡの１ユニッ
トを含むプラスミドpRR217（Takaiwa et al. Nucl. Aci
ds Res. (1985) 12, 5441-5448）から、スペーサー領域
全長とその両端の２５ＳｒＤＮＡ、１７ＳｒＤＮＡをそ
れぞれ一部含む領域約3.2 kbをEcoRIとBamHIで同時に切
断して調製し、これをあらかじめEcoRIとBamHIで切断し
たプラスミドpBluescript SK＋にクローニングした。こ
うして得られたプラスミドをさらにXhoIとXbaIで同時に
切断して約3.2 kb断片を再度調製し、あらかじめSalIと
XbaIで切断したpUC19にクローニングした。こうして得
られたプラスミドをpUC-SPと命名した。次に、pUC-SPを
Sse8387IとXbaIで同時に切断して約3.2 kb断片をさらに
調製し、これをpBI-MCのＣａｂプロモーターの上流にあ
るSse8387IおよびXbaI認識部位にセンスの方向で挿入し
た。こうして得られた発現ベクターをpBI-MC/SP3.2と命
名した。以上の構築した発現ベクターの構造を図１に示
す。
【００２５】（２）形質転換イネの取得
上記（１）で得られた植物形質転換用発現ベクターpBI-
MCあるいはpBI-MC/SPを保有するアグロバクテリウム・
ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）は、H
ieiらの方法（Hiei et al. Plant J. (1994) 6, 271-28
2）に従ってイネ胚盤由来カルスに感染させた。ただ
し、アグロバクテリウム・ツメファシエンスは菌株とし
てLBA4404を、イネはジャポニカ品種であるキヌヒカリ
を用いた。アグロバクテリウムを除菌後、発現ベクター
が組み込まれた形質転換イネカルスの選抜はハイグロマ
イシンを用いて行った。選抜した耐性カルスから植物体
を再生させ、形質転換イネを得た。形質転換イネは閉鎖
系のグロースチャンバーを用いて、２４℃、湿度６０
％、１４時間日長（７００μｍｏｌ／ｍ2／ｓｅｃ）に
環境条件を調整して形質転換イネを育成した。
MCあるいはpBI-MC/SPを保有するアグロバクテリウム・
ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）は、H
ieiらの方法（Hiei et al. Plant J. (1994) 6, 271-28
2）に従ってイネ胚盤由来カルスに感染させた。ただ
し、アグロバクテリウム・ツメファシエンスは菌株とし
てLBA4404を、イネはジャポニカ品種であるキヌヒカリ
を用いた。アグロバクテリウムを除菌後、発現ベクター
が組み込まれた形質転換イネカルスの選抜はハイグロマ
イシンを用いて行った。選抜した耐性カルスから植物体
を再生させ、形質転換イネを得た。形質転換イネは閉鎖
系のグロースチャンバーを用いて、２４℃、湿度６０
％、１４時間日長（７００μｍｏｌ／ｍ2／ｓｅｃ）に
環境条件を調整して形質転換イネを育成した。
【００２６】（３） 形質転換イネの粗酵素液抽出
作出された形質転換イネについて、ＮＡＤＰ型リンゴ酸
酵素の活性を測定するための粗酵素液の抽出を行った。
最上位展開葉０．３ｇを液体窒素中で粉砕後、１．５ｍ
ｌの抽出バッファー（１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５）、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５％（Ｗ／Ｖ）グリセ
ロール、２０％（Ｗ／Ｖ）エチレングリコール）、１０
ｍｇ不溶性ポリビニールピロリドン、１ｍＭ ＤＴＴを
添加し完全に磨砕した。４℃、１５０００ｒｐｍで５分
間遠心して残さを沈殿させ、得られた上清を粗酵素液と
した。
酵素の活性を測定するための粗酵素液の抽出を行った。
最上位展開葉０．３ｇを液体窒素中で粉砕後、１．５ｍ
ｌの抽出バッファー（１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５）、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５％（Ｗ／Ｖ）グリセ
ロール、２０％（Ｗ／Ｖ）エチレングリコール）、１０
ｍｇ不溶性ポリビニールピロリドン、１ｍＭ ＤＴＴを
添加し完全に磨砕した。４℃、１５０００ｒｐｍで５分
間遠心して残さを沈殿させ、得られた上清を粗酵素液と
した。
【００２７】（４） 形質転換イネのリンゴ酸酵素活性
２５℃に加温した反応バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ （ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５
ｍＭ ＮＡＤＰ＋）１ｍｌに上記（３）で得られた粗酵
素液５０μｌを加えて混合した。これに１Ｍリンゴ酸ナ
トリウム水溶液５μｌを添加して反応を開始した。酵素
活性は３４０ｎｍの吸光度の変化から算出した(Saitou
et al. Plant Cell Physiol. (1994) 35, 1165-1171)。
発現ベクターを含まないコントロールイネの活性を１と
した場合の相対活性をそれぞれ図２、図３にまとめた。
イネｒＤＮＡのスペーサー領域を含まない発現ベクター
pBI-MCを導入したイネ６系統の酵素活性（図２、Ｎｏ．
１〜６）と当該スペーサー領域を含む発現ベクターpBI-
MC/SP3.2を導入したイネ８系統の酵素活性（図３、Ｎ
ｏ．１〜８）との比較から、スペーサー領域は外来性の
キメラ遺伝子の発現を増大させるエンハンサーとして機
能していることが示された。
−ＨＣｌ （ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５
ｍＭ ＮＡＤＰ＋）１ｍｌに上記（３）で得られた粗酵
素液５０μｌを加えて混合した。これに１Ｍリンゴ酸ナ
トリウム水溶液５μｌを添加して反応を開始した。酵素
活性は３４０ｎｍの吸光度の変化から算出した(Saitou
et al. Plant Cell Physiol. (1994) 35, 1165-1171)。
発現ベクターを含まないコントロールイネの活性を１と
した場合の相対活性をそれぞれ図２、図３にまとめた。
イネｒＤＮＡのスペーサー領域を含まない発現ベクター
pBI-MCを導入したイネ６系統の酵素活性（図２、Ｎｏ．
１〜６）と当該スペーサー領域を含む発現ベクターpBI-
MC/SP3.2を導入したイネ８系統の酵素活性（図３、Ｎ
ｏ．１〜８）との比較から、スペーサー領域は外来性の
キメラ遺伝子の発現を増大させるエンハンサーとして機
能していることが示された。
【００２８】実施例２ コード領域として大腸菌カタラ
ーゼ遺伝子katEを組込んだキメラ遺伝子をイネで発現さ
せた例。 （１）発現ベクターの構築 大腸菌カタラーゼ遺伝子katEのヌクレオチド配列（von
Ossowski. J. Bacteriol(1991) 173, 514-520）をもと
に、当該遺伝子の翻訳開始点より下流の配列と翻訳開始
点の上流にNotIの認識部位を付加した、配列表の配列番
号２に記載されたセンス方向のＰＣＲプライマーを合成
した。さらに、当該遺伝子の3'非翻訳領域を含み、なお
かつKpnIの認識部位を付加した、配列表の配列番号３に
記載されたアンチセンス方向のＰＣＲプライマーを合成
した。これらのプライマーを用いて大腸菌ゲノムを鋳型
としたＰＣＲを行い、katEの全コード領域の両端にNotI
およびKpnI認識部位が付与された約2.7 kbのＤＮＡ断片
を増幅した。その増幅断片をNotIとKpnIで同時に切断す
ることにより、それらの制限酵素の結合末端を有するＤ
ＮＡ断片を調製した。一方、竹内らによって単離された
トウモロコシのNADP-ME型リンゴ酸酵素ｃＤＮＡ（Takeu
chi et al. Planta (2000）211, 265-274)をSmaIとNotI
で同時に切断することにより、NADP-ME型リンゴ酸酵素
のトランジットペプチド領域に対応するＤＮＡ断片を調
製した。こうして調製されたトランジットペプチド領域
およびkatEのＤＮＡ断片は、あらかじめSmaIとKpnIで切
断しておいたpBI-MCI（実施例１（１））にセンスの方
向でクローニングした。こうして得られた得られた発現
ベクターをpBI-KTEと命名した。また、pBI-KTEのＣａｂ
プロモーターの上流にイネのｒＤＮＡのスペーサー領域
約3.2kbを付加した発現ベクターを実施例１（１）に記
載した方法と同様に構築し、pBI-KTE/SP3.2と命名し
た。さらに、また、pBI-KTEのＣａｂプロモーターの上
流にイネｒＤＮＡのスペーサー領域内の反復配列約1.1k
bを付加した発現ベクターを以下のように構築した。ま
ず、当該反復配列の上流側の配列に対応する、配列表の
配列番号４に記載されたＰＣＲプライマーと下流側の配
列に対応する、配列表の配列番号５に記載されたＰＣＲ
プライマーを合成した。これらのプライマーを用いてプ
ラスミドpRR217（Takaiwa et al. Nucl. Acids Res. (1
985) 12, 5441-5448）を鋳型としたＰＣＲを行い、ｒＤ
ＮＡ内の反復配列を含む約1.1 kbを増幅した。増幅した
ＤＮＡ断片はBKL Kit （TaKaRa co.）を用いて平滑化
し、プラスミドpUC118のHincII認識部位にクローニング
した。得られたクローン中から当該反復配列の上流にSs
e8387I認識部位および下流にXbaI認識部位を有するクロ
ーンを選び出し、それらの制限酵素の結合末端を有する
約1.1 kbのＤＮＡ断片（配列表の配列番号１の７０６−
１８１３番目の配列に相当する）を調製した。これをpB
I-KTEのＣａｂプロモーターの上流にあるSse8387Iおよ
びXbaI認識部位にセンスの方向で挿入した。こうして得
られた発現ベクターをpBI-KTE/SP1.1と命名した。以
上、構築した発現ベクターの構造を図４に示す。これら
は、実施例１の（２）に記載された方法によりイネに導
入し、実施例１の（３）に記載された方法により粗酵素
液を抽出した。
ーゼ遺伝子katEを組込んだキメラ遺伝子をイネで発現さ
せた例。 （１）発現ベクターの構築 大腸菌カタラーゼ遺伝子katEのヌクレオチド配列（von
Ossowski. J. Bacteriol(1991) 173, 514-520）をもと
に、当該遺伝子の翻訳開始点より下流の配列と翻訳開始
点の上流にNotIの認識部位を付加した、配列表の配列番
号２に記載されたセンス方向のＰＣＲプライマーを合成
した。さらに、当該遺伝子の3'非翻訳領域を含み、なお
かつKpnIの認識部位を付加した、配列表の配列番号３に
記載されたアンチセンス方向のＰＣＲプライマーを合成
した。これらのプライマーを用いて大腸菌ゲノムを鋳型
としたＰＣＲを行い、katEの全コード領域の両端にNotI
およびKpnI認識部位が付与された約2.7 kbのＤＮＡ断片
を増幅した。その増幅断片をNotIとKpnIで同時に切断す
ることにより、それらの制限酵素の結合末端を有するＤ
ＮＡ断片を調製した。一方、竹内らによって単離された
トウモロコシのNADP-ME型リンゴ酸酵素ｃＤＮＡ（Takeu
chi et al. Planta (2000）211, 265-274)をSmaIとNotI
で同時に切断することにより、NADP-ME型リンゴ酸酵素
のトランジットペプチド領域に対応するＤＮＡ断片を調
製した。こうして調製されたトランジットペプチド領域
およびkatEのＤＮＡ断片は、あらかじめSmaIとKpnIで切
断しておいたpBI-MCI（実施例１（１））にセンスの方
向でクローニングした。こうして得られた得られた発現
ベクターをpBI-KTEと命名した。また、pBI-KTEのＣａｂ
プロモーターの上流にイネのｒＤＮＡのスペーサー領域
約3.2kbを付加した発現ベクターを実施例１（１）に記
載した方法と同様に構築し、pBI-KTE/SP3.2と命名し
た。さらに、また、pBI-KTEのＣａｂプロモーターの上
流にイネｒＤＮＡのスペーサー領域内の反復配列約1.1k
bを付加した発現ベクターを以下のように構築した。ま
ず、当該反復配列の上流側の配列に対応する、配列表の
配列番号４に記載されたＰＣＲプライマーと下流側の配
列に対応する、配列表の配列番号５に記載されたＰＣＲ
プライマーを合成した。これらのプライマーを用いてプ
ラスミドpRR217（Takaiwa et al. Nucl. Acids Res. (1
985) 12, 5441-5448）を鋳型としたＰＣＲを行い、ｒＤ
ＮＡ内の反復配列を含む約1.1 kbを増幅した。増幅した
ＤＮＡ断片はBKL Kit （TaKaRa co.）を用いて平滑化
し、プラスミドpUC118のHincII認識部位にクローニング
した。得られたクローン中から当該反復配列の上流にSs
e8387I認識部位および下流にXbaI認識部位を有するクロ
ーンを選び出し、それらの制限酵素の結合末端を有する
約1.1 kbのＤＮＡ断片（配列表の配列番号１の７０６−
１８１３番目の配列に相当する）を調製した。これをpB
I-KTEのＣａｂプロモーターの上流にあるSse8387Iおよ
びXbaI認識部位にセンスの方向で挿入した。こうして得
られた発現ベクターをpBI-KTE/SP1.1と命名した。以
上、構築した発現ベクターの構造を図４に示す。これら
は、実施例１の（２）に記載された方法によりイネに導
入し、実施例１の（３）に記載された方法により粗酵素
液を抽出した。
【００２９】（２） 形質転換イネのカタラーゼ酵素活
性 カタラーゼ活性の測定は活性酸素測定マニュアル（浅田
ら編、1992、講談社）に記載のある過酸化水素の減少に
よる測定法に従った。発現ベクターを含まないコントロ
ールイネの活性を１とした場合の相対活性をそれぞれ図
5、図6にまとめた。イネｒＤＮＡのスペーサー領域を含
まない発現ベクターpBI-KTEを導入したイネ13系統の酵
素活性（図５、Ｎｏ．１〜１３）、当該スペーサー領域
約3.2kbを含む発現ベクターpBI-KTE/SP3.2を導入したイ
ネ5系統の酵素活性（図６、Ｎｏ．1〜５）、および当該
スペーサー領域内の反復配列を含む約1.1 kbを含む発現
ベクターpBI-KTE1.1を導入したイネ4系統の酵素活性
（図６、Ｎｏ．６〜９）の比較から、スペーサーなしの
場合ではコントロール比で1.5倍以下の酵素活性を示す
系統しか得られなかったが、約3.2 kbおよび約1.1 kbの
スペーサー領域を用いた場合には、全体的に酵素活性が
高く、中には2倍以上の酵素活性を示す系統が得られ
た。これらの結果と実施例１の結果から、ｒＤＮＡのス
ペーサーの全長を含む領域およびスペーサー内の反復配
列は外来性のキメラ遺伝子の構造に関わりなく発現を増
大させるエンハンサーとして機能していることが示され
た。
性 カタラーゼ活性の測定は活性酸素測定マニュアル（浅田
ら編、1992、講談社）に記載のある過酸化水素の減少に
よる測定法に従った。発現ベクターを含まないコントロ
ールイネの活性を１とした場合の相対活性をそれぞれ図
5、図6にまとめた。イネｒＤＮＡのスペーサー領域を含
まない発現ベクターpBI-KTEを導入したイネ13系統の酵
素活性（図５、Ｎｏ．１〜１３）、当該スペーサー領域
約3.2kbを含む発現ベクターpBI-KTE/SP3.2を導入したイ
ネ5系統の酵素活性（図６、Ｎｏ．1〜５）、および当該
スペーサー領域内の反復配列を含む約1.1 kbを含む発現
ベクターpBI-KTE1.1を導入したイネ4系統の酵素活性
（図６、Ｎｏ．６〜９）の比較から、スペーサーなしの
場合ではコントロール比で1.5倍以下の酵素活性を示す
系統しか得られなかったが、約3.2 kbおよび約1.1 kbの
スペーサー領域を用いた場合には、全体的に酵素活性が
高く、中には2倍以上の酵素活性を示す系統が得られ
た。これらの結果と実施例１の結果から、ｒＤＮＡのス
ペーサーの全長を含む領域およびスペーサー内の反復配
列は外来性のキメラ遺伝子の構造に関わりなく発現を増
大させるエンハンサーとして機能していることが示され
た。
【００３０】
【発明の効果】本発明によれば、Ｇ＋Ｃ含量が高いｒＤ
ＮＡのスペーサーを外来性の遺伝子の発現を増大させる
エンハンサーとして機能させることが可能になる。本発
明によれば、外来性遺伝子の発現を増大させた生物また
は植物細胞を取得することが可能になる。本発明によれ
ば、形質転換された生物あるいは植物細胞において外来
性遺伝子の発現を増大させることで外来性遺伝子に由来
する物質生産を行うことが可能になる。
ＮＡのスペーサーを外来性の遺伝子の発現を増大させる
エンハンサーとして機能させることが可能になる。本発
明によれば、外来性遺伝子の発現を増大させた生物また
は植物細胞を取得することが可能になる。本発明によれ
ば、形質転換された生物あるいは植物細胞において外来
性遺伝子の発現を増大させることで外来性遺伝子に由来
する物質生産を行うことが可能になる。
【００３１】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> MITSUI CHEMICALS, INC.
<120> A use of spacer region of rDNA which contains a high percentage of
G+C as enhancer
<130> P0000516
<160> 5
<210> 1
<211> 3172
<212> DNA
<213> Oriza sativa
<400> 1
gaattcacca agtgttggat tgttcaccca ccaataggga acgtgagctg ggtttagacc 60
gtcgtgagac aggttagttt taccctactg atgaccgtgc cgcgatagta attcaaccta 120
gtacgagagg aaccgttgat tcacacaatt ggtcatcgcg cttggttgaa aagccagtgg 180
cgcgaagcta ccgtgtgccg gattatgact gaacgcctct aagtcagaat ccaagctagc 240
aagcggcgcc tgcgccgacg cccgccccga cccacgttag ggcgcagacc cccaagggcc 300
cgtgccaccg gccaagcccg gccggccgac gcgccgcggc cggccgcctt cgaagctccc 360
ttcccaacgg gcggcgggct gaatcctttg cagacgactt aaatacgcga cggggcattg 420
taagtggcag agtggccttg ctgccacgat ccactgagat ccagtccccg cgtcgcacgg 480
attcgtccct cccccctctc ccccgcgccc cgcgcaggtt cccccccgag gccgccccgg 540
tccggccaag tccccaggcc tctctaagtc cgccgcgctg gtgggaaggc acgaagggaa 600
aacgcgctcg ccaagtcccg aagagccacc gggcagactc caaggacggg acgacgggcg 660
ggctccgggc gcgcgccacg gacgacgggc ggttggacgg cgcccatgcc caccaagcct 720
ccaacgcgtg ccgccgcacg gaacccgcca aggtcctgag cacgtaccgc gcgagagcac 780
ccgcaccacg ccgggttcgg tccacgtccg ctcgccccag ctcccgagcg aaaaccgtgt 840
gcgagctgtg aagggctgga cgctaggggt gcgtggggct ggctatggcc cacgactata 900
gtagggggga agggatggcc gggctgccac gcgcacggca cccggttcgg tccacgttcg 960
gtcgccgggc cgaaccgacc ggcaaccgtg cgcgagttgg gaagggctgg ctcgtgcagc 1020
cacccaccgg ccgaccgacc gaaaacccga ttcggtcgac gttcggtccg ccgggcgacg 1080
cgccgaaaac tgtgtgcgag ctgtgaaggg ctggacgcta ggggtgcgtt gggctggcta 1140
tggccctaga ctatagtagg gggaagggat ggccgggctg ccacgcgcaa acggcacccg 1200
gttcggtcca cgttcgggcg accgggccga ccgaccggca cccgtgcgcg agttgggaag 1260
ggctggctcg tgcagccacc caccggccga ccgaccgaaa acccgattcg gtcgacgttc 1320
ggtccgccgg gcgaccggcc gaaaactgtg tgcgagctgt gaagggctgg acgctagggg 1380
tgcgttgggc tggctatggc cctagcctat agtaggggtg agcggatggc cgggctgcca 1440
cgcgcacggc gcccggttcg gtccacgttc ggtcggcggg gcgaccgacc gggaaccgtg 1500
cacgagttgg gaagggctgg ctcgtgcagc cacccaccgg ccgaccgacc gaaaacccga 1560
ttcggtccac gttcggtccg ccgggcgacc gaccgaaaac cgtgtgcgag ctgcacggca 1620
cccggttcgg tcggctgggc gaccgaccga aaaccgtgtt cgggcacgta gcctataccg 1680
ggccggggga ggtgacggga gggctaagcg gtgccctaga ccccgattcg gccgaccgac 1740
cggtagaacg gccatgcccg cgagtaaaac gcagccccga gccggtctga gggggacggg 1800
agagaacgag aaagctgtgt gcaccctgtg aagggccagg cgcggaggga cctgaggggg 1860
ctaggtgccc aaaacaccta tgggaaaacg actcacggca ctagcacgac cccggccgct 1920
gcggggtgtc gcacgtgaga tccttcccac cgcctcctag cctgctggca cgcggccctg 1980
gcgagtctcg ccacgggccg ttccgcacgg tttttgaggc acccgtgccg ccgaaagaac 2040
gggactcgct cccgacacct ctcccacgcg tggtggccct ccggtaggcc gtcctcccag 2100
cagaccagcc gtgctccgcg cggcaggatg cttgggcggc cttgccgccg tggctgcgta 2160
gcgtatgagc agctttggac cggtgtatgc tcgcaggacc ccgccctcgt gcggccgact 2220
gccggctccc gggccccgtc actccacggc cgtccacgcg ccgtgcacgc cccaggcttc 2280
aagagatgct tgcgcgctgc tacccgtccc acgggcagag gtgctcgcac acgtccgcgc 2340
ccgcgggcgc cccacccggc gtcccgcggc ggctcgacgg cgcgaggcgc gtgcgctcgc 2400
ggcgcccggc acccaagcgt acccgtcgcc aaggcacctg ctgacacttg gtcccggatg 2460
ccgcccacga tacaggctca cggcggcccc gccccgtgcc tacccataag cgagatgctc 2520
tcggaagacg acagcccgcc cggccgccgc ctggtccgcc gctcccgacc cgggggcggc 2580
ggcgcagcgc gtcggacggc gcgggcccgt cgcggaggac gtgctacctg gttgatcctg 2640
ccagtagtca tatgcttgtc tcaaagatta agccatgcat gtgcaagtat gaactaattc 2700
gaactgtgaa actgcgaatg gctcattaaa tcagttatag tttgtttgat ggtacgtgct 2760
actcggataa ccgtagtaat tctagagcta atacgtgcaa caaaccccga cttccgggag 2820
gggcgcattt attagataaa aggctgacgc gggctccgcc cgctgatccg atgattcatg 2880
ataactcgac ggatcgcacg gccctcgtgc cggcgacgca tcattcaaat ttctgcccta 2940
tcaactttcg atggtaggat aggggcctac catggtggtg acgggtgacg gagaattagg 3000
gttcgattcc ggagagggag cctgagaaac ggctaccaca tccaaggaag gcagcaggcg 3060
cgcaaattac ccaatcctga cacggggagg tagtgacaat aaataacaat accgggcgct 3120
ttagtgtctg gtaattggaa tgagtacaat ctaaatccct taacgagga tcc 3172
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<400> 2
gcggcggccg ccatgtcgca acataacgaa aag 33
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<400> 3
gcgggtacca tcgataatac tatccgtcag 30
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<400> 4
atgcccacca agcctccaac gct 23
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<400> 5
tttctcgttc tctcccgtcc ccctca 26
【図１】 アロエ由来ＮＡＤＰ型リンゴ酸酵素遺伝子の
発現ベクターpBI-MCとpBI-MC/SP3.2の構造を示す図であ
る。
発現ベクターpBI-MCとpBI-MC/SP3.2の構造を示す図であ
る。
【図２】 発現ベクターpBI-MCを導入した１〜６の６系
統のイネにおけるＮＡＤＰ型リンゴ酸酵素活性を示す図
である。
統のイネにおけるＮＡＤＰ型リンゴ酸酵素活性を示す図
である。
【図３】 発現ベクターpBI-MC/SP3.2を導入した１〜６
の６系統のイネにおけるＮＡＤＰ型リンゴ酸酵素活性を
示す図である。
の６系統のイネにおけるＮＡＤＰ型リンゴ酸酵素活性を
示す図である。
【図４】 大腸菌由来カタラーゼ遺伝子katEの発現ベク
ターの構造を示す図である。
ターの構造を示す図である。
【図５】 発現ベクターpBI-KTEを導入したイネにおけ
るカタラーゼ活性を示す図である。
るカタラーゼ活性を示す図である。
【図６】 発現ベクターpBI-KTE/SP3.2を導入したイネ
（Ｎｏ．１〜５）、pBI-KTE/SP1.1を導入したイネ（Ｎ
ｏ．６〜９）におけるカタラーゼ活性を示す図である。
（Ｎｏ．１〜５）、pBI-KTE/SP1.1を導入したイネ（Ｎ
ｏ．６〜９）におけるカタラーゼ活性を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
Ｆターム(参考） 2B030 AA00 CA15 CA17 CA19
4B024 AA01 AA08 BA80 CA04 CA07
CA10 DA01 DA05 EA04 FA02
FA06 GA11 HA12
4B065 AA89X AA89Y AB01 BA02
CA23 CA44 CA46
Claims (19)
- 【請求項１】 ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチ
ド配列の全て、ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチ
ド配列の内部の反復されたヌクレオチド配列、又はこれ
らに由来するヌクレオチド配列を含有し、そのＧ及びＣ
塩基の総量が５０％を上回るＤＮＡを、外来性遺伝子の
プロモーターを活性化するエンハンサーとして利用する
方法。 - 【請求項２】 ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチ
ド配列の全て又はｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオ
チド配列の内部の反復されたヌクレオチド配列に由来す
るヌクレオチド配列を含有し、そのＧ及びＣ塩基の総量
が５０％を上回るＤＮＡが、３ＸＳＳＣ、20mM NaPO4(p
H6.8)からなるハイブリダイゼーション溶液中で65℃で
ハイブリダーゼーションの後、0.2ＸＳＳＣの洗浄溶液
中で65℃で洗浄後に、ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌク
レオチド配列の全て、ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌク
レオチド配列の内部の反復されたヌクレオチド配列を含
有し、そのＧ及びＣ塩基の総量が５０％を上回るＤＮＡ
にハイブリダイズすることを特徴とする請求項１記載の
方法。 - 【請求項３】 Ｇ及びＣ塩基をそれぞれ少なくとも２５
％有する請求項１又は請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 Ｇ及びＣ塩基をそれぞれ少なくとも３０
％有する請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 Ｇ及びＣ塩基をそれぞれ少なくとも３５
％有する請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチ
ド配列の全て、ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチ
ド配列の内部の反復されたヌクレオチド配列、又はこれ
らに由来するヌクレオチド配列を含有し、そのＧ及びＣ
塩基の総量が５０％を上回るＤＮＡがイネ由来である請
求項１〜５の何れか一項に記載の方法。 - 【請求項７】 ＤＮＡが単離及び／又は精製されたＤＮ
Ａである、請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。 - 【請求項８】 ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチ
ド配列の全て、ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチ
ド配列の内部の反復されたヌクレオチド配列、又はこれ
らに由来するヌクレオチド配列を含有し、そのＧ及びＣ
塩基の総量が５０％を上回るＤＮＡを、外来性遺伝子の
プロモーターを活性化するエンハンサーとして利用し
て、１以上の外来遺伝子のプロモーターの活性を高める
ことにより植物の１以上の器官における１以上の外来性
遺伝子の発現を増大させる方法。 - 【請求項９】 ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチ
ド配列の全て、ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオチ
ド配列の内部の反復されたヌクレオチド配列、又はこれ
らに由来するヌクレオチド配列を含有し、そのＧ及びＣ
塩基の総量が５０％を上回るＤＮＡが植物遺伝子から得
られるか、又は合成により生成されるものであることを
特徴とする、請求項8に記載の方法。 - 【請求項１０】 遺伝子プロモーターが植物における遺
伝子プロモーターである、請求項8又は9に記載の外来性
遺伝子の発現を増大させる方法。 - 【請求項１１】 ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオ
チド配列の全て、ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオ
チド配列の内部の反復されたヌクレオチド配列、又はこ
れらに由来するヌクレオチド配列を含有し、そのＧ及び
Ｃ塩基の総量が５０％を上回るＤＮＡが植物の緑色又は
非緑色組織、特には該植物の根、塊茎、種子、茎、花又
は葉における遺伝子の発現を増大させる、請求項8〜10
のいずれか１項に記載の外来性遺伝子の発現を増大させ
る方法。 - 【請求項１２】 ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオ
チド配列の全て、ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオ
チド配列の内部の反復されたヌクレオチド配列、又はこ
れらに由来するヌクレオチド配列を含有し、そのＧ及び
Ｃ塩基の総量が５０％を上回るＤＮＡを複数用いること
を特徴とする、請求項8〜１１のいずれか１項に記載の
外来性遺伝子の発現を増大させる方法。 - 【請求項１３】 ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオ
チド配列の全て、ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオ
チド配列の内部の反復されたヌクレオチド配列、又はこ
れらに由来するヌクレオチド配列を含有し、そのＧ及び
Ｃ塩基の総量が５０％を上回るＤＮＡが正常方向及び逆
方向の両者で作動する、請求項8〜１２のいずれか１項
に記載の外来性遺伝子の発現を増大させる方法。 - 【請求項１４】 ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオ
チド配列の全て、ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオ
チド配列の内部の反復されたヌクレオチド配列、又はこ
れらに由来するヌクレオチド配列を含有し、そのＧ及び
Ｃ塩基の総量が５０％を上回るＤＮＡが、発現させよう
とする遺伝子プロモーター又はターミネーターのいずれ
かに結合する、請求項8〜13のいずれか１項に記載の外
来性遺伝子の発現を増大させる方法。 - 【請求項１５】 ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオ
チド配列の全て、ｒＤＮＡのスペーサー領域のヌクレオ
チド配列の内部の反復されたヌクレオチド配列、又はこ
れらに由来するヌクレオチド配列を含有し、そのＧ及び
Ｃ塩基の総量が５０％を上回るＤＮＡと遺伝子プロモー
ターとコード配列もしくは非コード配列及びターミネー
ター配列を含むキメラ遺伝子。 - 【請求項１６】 前記のキメラ遺伝子が１を上回る該Ｄ
ＮＡ及び１を上回る遺伝子プロモーターを含むことを特
徴とする、請求項15に記載のキメラ遺伝子。 - 【請求項１７】 請求項１５又は請求項１６のいずれか
１項に記載のキメラ遺伝子を有する形質転換された植
物。 - 【請求項１８】 形質転換された植物がジャガイモ、タ
バコ、綿花、レタス、メロン、カボチャ、キュウリ、エ
ンドウマメ、セイヨウアブラナ、ダイズ、テンサイもし
くはヒマワリから選ばれる双子葉植物種、又はコムギ、
オオムギ、ライムギ、イネもしくはトウモロコシから選
ばれる単子葉植物種である、請求項17に記載の植物。 - 【請求項１９】 本明細書の請求項１〜１４のいずれか
１項に記載の方法により外来性遺伝子の発現が高められ
た細胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001332861A JP2003135067A (ja) | 2001-10-30 | 2001-10-30 | Ｇ＋Ｃ含量が高いｒＤＮＡのスペーサー領域のエンハンサーとしての利用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001332861A JP2003135067A (ja) | 2001-10-30 | 2001-10-30 | Ｇ＋Ｃ含量が高いｒＤＮＡのスペーサー領域のエンハンサーとしての利用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003135067A true JP2003135067A (ja) | 2003-05-13 |
Family
ID=19148222
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001332861A Pending JP2003135067A (ja) | 2001-10-30 | 2001-10-30 | Ｇ＋Ｃ含量が高いｒＤＮＡのスペーサー領域のエンハンサーとしての利用 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003135067A (ja) |
-
2001
- 2001-10-30 JP JP2001332861A patent/JP2003135067A/ja active Pending
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