DE69927710T2 - Phenethyl-5-bromopyridylthioharnstoff (pbt) derivative mit spermizider wirkung - Google Patents

Phenethyl-5-bromopyridylthioharnstoff (pbt) derivative mit spermizider wirkung Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung ist auf neue PBT-Derivate enthaltende Zusammensetzungen, die spermizide Aktivität aufweisen, gerichtet.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Das menschliche Immunschwächevirus (HIV), das ursächliche Mittel für erworbenes Immunschwächesyndrom (AIDS), ist die am schnellsten voranschreitende Ursache für den Tod von Frauen im fortpflanzungsfähigen Alter. Heterosexuelle Übertragung macht weltweit 90% aller HIV-Infektionen aus und stellt einen wachsenden Anteil von neuen HIV-Infektionen in den Vereinigten Staaten dar. Bis zum Jahr 2000 werden 13 Millionen Frauen mit HIV infiziert sein von weltweit insgesamt 40 Millionen HIV-infizierten Individuen. Ohne einen wirksamen prophylaktischen Anti-HIV-Impfstoff oder eine antiretrovirale Therapie werden von der Frau kontrollierte Vaginalmikrobizide zur Herabsetzung von mukosaler und perinataler HIV-Übertragung benötigt.
  • Es bestehen Bedenken, daß die weltweite Verwendung von detergenten Spermiziden, wie beispielsweise Nonoxynol-9 (N-9) das Risiko von HIV-Übertragung tatsächlich erhöhen könnten. N-9 wird seit mehr als 30 Jahren in frei verkäuflichen Gelen, Schäumen, Cremes, Schwämmen, Filmen und Schaumtabletten, die für das Abtöten von Spermien ausgelegt sind, verwendet. Weil für N-9 gezeigt wurde, daß es in vitro HIV inaktiviert, ist es das einzige topische Mikrobizid, das derzeit für den Schutz gegen sexuell übertragene HIV-Infektion bei Frauen in Betracht gezogen wird. Der Hauptnachteil der Verwendung von N-9 ist jedoch dessen detergenzienartige Wirkung auf Epithelzellen. Häufige Verwendung von N-9 als ein vaginales Empfängnisverhütungsmittel wurde mit einem erhöhten Risiko für Gebärmutterhals-Scheiden-Infektion, -Irritation oder -Geschwürbildung in Verbindung gebracht. Da eine fortgesetzte Anwendung von N-9 die Scheidenflora verändern und opportunistische Infektionen fördern kann, kann es die Empfänglichkeit des ektozervikalen Epithels und der endozervikalen Schleimhaut für HIV-Infektion erhöhen. Darüber hinaus haben kürzlich durchgeführte klinische Studien gezeigt, daß N-9 enthaltende vaginale Empfängnisverhütungsmittel keine Wirkung auf die Übertragung von HIV/AIDS und andere STD hatten, wenn sie als ein Teil eines Gesamtpräventionsprogramms zum Schutz vor heterosexueller Übertragung von HIV/AIDS bereitgestellt wurden. Siehe z.B. Roddy et al., 1998, N. Eng. J. Med. 339: 504–510; Hira et al., 1997, Int. J. STD AIDS 8: 243–250.
  • Neue wirkungsvolle, sichere und von Frauen kontrollierte topische Mikrobizide ohne detergenzienartige Membrantoxizität sollten gegenüber derzeit erhältlichen Vaginalmikrobiziden klinische Vorteile haben. Physiologische Befruchtung hängt von der Fähigkeit des ejakulierten Spermiums ab, zu schwimmen, an die Zona Pellucida zu binden und in die Eizelle einzudringen. Jede dieser Aktivitäten ist in erster Linie von der Spermienmobilität abhängig. Daher könnte die Hinzufügung einer spermiziden Funktion zu ausgewählten antiretroviralen Arzneimitteln, wie beispielsweise Nicht- Nukleosid-Inhibitoren (NNI), ein wirksamer Weg sein, die heterosexuelle vaginale Übertragung von HIV herabzusetzen und Empfängnis zu verhüten.
  • Phenethyl-5-brompyridylthioharnstoff-Derivate und deren Verwendung als Inhibitoren für reverse Transkriptase von HIV sind in Bioorg. Med. Chem, 1998, 6(6), 1789–1797, J. Med. Chem. 1996, 39, 4261–4274, EP-A-O 540 143 und WO-A-99 47501 (veröffentlicht nach dem Prioritätstag der vorliegenden Anmeldung) offenbart.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen bereit, die Nicht-Nukleosid-Inhibitoren (NNI) enthalten, welche Phenethyl-5-brompyridylthioharnstoff- (PBT-) Derivate sind. Diese Verbindungen sind als Spermien immobilisierende und empfängnisverhütende Mittel geeignet. Soweit den Anmeldern bekannt ist, wurden PBT-Derivate zuvor nicht untersucht und bei diesen erkannt, daß sie eine empfängnisverhütende, wie z.B. spermizide oder Spermien immobilisierende, Aktivität aufweisen.
  • Die Erfindung stellt ein Kondom oder einen Intravaginaleinsatz bereit mit einer wirksamen spermiziden Menge einer Verbindung mit der chemischen Struktur (I):
    Figure 00020001
    worin R, R1, R2, R3 und R4 unabhängig voneinander Wasserstoff, F, Cl, Br oder I sind und worin wenigstens einer von R, R1, R2, R3 und R4 F, Cl, Br oder I ist,
    oder einem pharmazeutisch verträglichen Salz davon mit der Maßgabe, daß der Intravaginaleinsatz nicht ein Pessar oder ein Tampon ist.
  • Weitere Aspekte der Erfindung werden dem Fachmann auf dem Gebiet bei Betrachtung der nachfolgenden Figuren, der ausführlichen Beschreibung, der Beispiele und der Patentansprüche deutlich.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 zeigt die chemischen Strukturen von N-[2-(2,5-Dimethoxyphenethyl)]-N'-[2-(5-brompyridyl)]-thioharnstoff (D-PBT), N-[2-(2-Fluorphenethyl)]-N'-[2-(5-brompyridyl)]-thioharnstoff (F- PBT), 5-Isopropyl-2-[(methylthiomethyl)-thio]-6-(benzyl)-pyrimidin-4-(1H)-on (S-DABO) und N-[2-(2-Pyridyl)-ethyl]-N'-[2-brompyridyl)]-thioharnstoff (Trovirdin, ein PETT-Derivat).
  • 2 ist ein Diagramm, das die konzentrationsabhängige Hemmung der Spermienmobilität durch Trovirdin, D-PBT, F-PBT, S-DABO und N-9 zeigt. Hochgradig bewegliche Spermienfraktionen wurden für 3 Stunden mit steigenden Konzentrationen (31,2 μM – 500 μM) Trovirdin, D-PBT, F-PBT, S-DABO und N-9 oder 1% DMSO in dem Testmedium inkubiert, und der Prozentsatz an mobilen Spermien wurde durch CASA bestimmt. Jeder Datenpunkt repräsentiert den Mittelwert aus drei bis vier unabhängigen Experimenten.
  • 3 ist ein Diagramm, das die zeitabhängige Spermienimmobilisierung in der Gegenwart von F-PBT zeigt. Mobile Spermien wurden bei 37°C in Testmedium in der Gegenwart von 1 mM F-PBT oder 1% DMSO alleine inkubiert. In Zeitabständen von 5 bis 10 Minuten wurde die Spermienmobilität durch CASA getestet. Jeder Datenpunkt repräsentiert den Mittelwert ± SD aus zwei unabhängigen Experimenten.
  • 4 ist ein Diagramm, das die Wirkung von F-PBT auf die Spermienbewegungsparameter zeigt. Mobile Fraktionen von Spermien wurden in Testmedien in der Gegenwart von 1 mM F-PBT inkubiert, und die zeitabhängigen Mobilitätseigenschaften wurden unter Verwendung von Hamilton Thorne-IVOS Version 10 CASA bestimmt, wie es unter "Materialien und Methoden" beschrieben ist. Einheiten: μm/s für VCL, VAP, VSL; μm für ALH; % für MOT, STR, LIN; und Hz für BCF.
  • 5A ist ein Diagramm, das die Wirkung von D-PBT, F-PBT, S-DABO und N-9 auf die Spermienakrosomenmembranintegrität zeigt. Mobile Spermien wurden in der Gegenwart oder Abwesenheit zunehmender Konzentrationen der drei NNI und N-9 für 6 Stunden vorinkubiert. Der Prozentsatz an hinsichtlich der Akrosomen intakten Spermien, bestimmt durch FITC-Pisum sativum-Lectinbindungstest, wurde als der Mittelwert ± SD aus drei separaten Experimenten ausgedrückt.
  • Die 5B bis 5E sind konfokale Laserabtastfluoreszenzabbildungen von Spermien. Die gezeigten Spermien sind dreifach markiert mit FITC-Pisum sativum-Lectin für Akrosom (grün), TO-TO-3-lodid für DNA (blau) und Nile-Rot für Membranlipid (rot). In hinsichtlich Akrosomen intakten Spermien zeigte der Akrosomenbereich des Spermienkopfs eine gleichförmige, hellgrüne Fluoreszenz. In hinsichtlich Akrosomen umgesetzten Spermien fehlte entweder die grüne Fluoreszenz oder sie war auf den äquatorialen Abschnitt des Spermienkopfs beschränkt. 5B zeigt Spermien, die 0,5% DMSO alleine ausgesetzt waren; 5C zeigt Spermien, die 500 μM F-PBT ausgesetzt waren, und 5D zeigt Spermien, die 500 μM S-DABO ausgesetzt waren. Keine der 5B, 5C oder 5D zeigt eine erhöhte Akrosomenreaktion der Spermien nach 5 Stunden Inkubation. 5E zeigt Spermien, die 500 μM N-9 ausgesetzt waren, und zeigt nur hinsichtlich Akrosomen umgesetzte Spermien.
    (Originalvergrößerung × 1000)
  • Ausführliche Beschreibung
  • Definitionen
  • Alle in dieser Anmeldung verwendeten wissenschaftlichen und technischen Begriffe haben Bedeutungen, wie sie allgemein auf dem Gebiet verwendet werden, wenn es nicht anders angegeben ist. So wie sie in dieser Anmeldung verwendet werden, haben die folgenden Wörter oder Ausdrücke die angegebenen Bedeutungen.
  • Wie es hierin verwendet wird, bedeutet "PBT" die Verbindung Phenethyl-5-brompyridylthioharnstoff.
  • Wie es hierin verwendet wird, bedeutet "F-PBT" die Verbindung N-[2-(2-Fluorphenethyl)]-N'[2-(5-brompyridyl)]-thioharnstoff.
  • Wie es hierin verwendet wird, bedeutet "D-PBT" die Verbindung N-[2-(2,5-Dimethoxyphenethyl)]-N'-[2-(5-brompyridyl)]-thioharnstoff.
  • Wie es hierin verwendet wird, bedeutet "N-9" das Virizid/Spermizid Nonoxynol-9.
  • Wie es hierin verwendet wird, bezieht sich "reverse Transkriptase (RT)" auf ein Enzym mit einer NNI-Bindungsstelle ähnlich zu derjenigen von HIV-1 RT.
  • Wie es hierin verwendet wird, bedeutet ein "Nicht-Nukleosid-Inhibitor (NNI)" von reverser Transkriptase von HIV (HIV-RT) eine Verbindung, die an eine allosterische Stelle von HIV-RT bindet, was zu einer nicht-kompetitiven Hemmung von HIV-RT-Aktivität führt. Beispiele für Nicht-Nukleosid-Inhibitoren von HIV-RT umfassen, sind aber nicht beschränkt auf F-PBT und D-PBT.
  • Wie sie hierin verwendet werden, werden die Begriffe "Analoges" oder "Derivat" austauschbar zur Bezeichnung einer chemischen Substanz, die strukturell und funktional mit einer anderen Substanz verwandt ist, verwendet. Ein Analoges oder ein Derivat hat eine gegenüber der anderen Substanz modifizierte Struktur und behält die Funktion der anderen Substanz, in diesem Fall behält sie die Fähigkeit, mit einer NNI-RT-Bindungsstelle in Wechselwirkung zu treten. Das Analoge oder das Derivat muß nicht, kann aber aus der anderen Substanz synthetisiert sein.
  • Wie es hierin verwendet wird, bezieht sich "pharmazeutisch verträgliches Salz" auf ein Salz, das die gewünschte biologische Aktivität der Ausgangsverbindung behält und keine unerwünschten toxikologischen Wirkungen ausübt. Beispiele für solche Salze umfassen, sind aber nicht beschränkt auf (a) Säureadditionssalze, die mit anorganischen Säuren gebildet werden, z.B. Salzsäure, Bromsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure und ähnliche, und Salze, die mit organischen Säuren gebildet werden, wie beispielsweise Essigsäure, Oxasäure, Weinsäure, Succinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Gluconsäure, Zitronensäure, Äpfelsäure, Ascorbinsäure, Benzoesäure, Gerbsäure, Pamoasäure, Alginsäure, Polyglutaminsäure, Naphthalensulfonsäuren, Naphthalendisulfonsäuren, Polygalacturonsäure, (b) Salze mit polyvalenten Metallkationen, wie beispielsweise Zink, Calcium, Wismut, Barium, Magnesium, Aluminium, Kupfer, Kobalt, Nickel, Cadmium und ähnliche, oder (c) Salze, die mit einem organischen Kation, gebildet aus N,N'-Dibenzylethylendiamin oder Ethylendiamin, gebildet werden, oder (d) Kombinationen von (a) und (b) oder (c), wie z.B. ein Zink- Tannatsalz und ähnliche. Die bevorzugten Säureadditionssalze sind das Trifluoracetatsalz und das Acetatsalz.
  • Wie es hierin verwendet wird, umfaßt "pharmazeutisch verträglicher Träger" jedes Material, welches, wenn es mit einer Verbindung der Erfindung kombiniert wird, ermöglicht, daß die Verbindung biologische Aktivität behält, wie beispielsweise die Fähigkeit, Spermienaktivität zu hemmen, und welches mit dem Immunsystem des Subjekts nicht reaktiv ist. Beispiele umfassen, sind aber nicht beschränkt auf jegliche der pharmazeutischen Standardträger, wie beispielsweise phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Wasser, Emulsionen, wie beispielsweise Öl/Wasser-Emulsion, und verschiedene Arten von Benetzungsmitteln. Bevorzugte Verdünnungsmittel für eine Aerosol- oder eine parenterale Verabreichung sind phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder normale (0,9%-ige) Kochsalzlösung. Zusammensetzungen, die solche Träger enthalten, werden gemäß gut bekannten herkömmlichen Verfahren formuliert (siehe z.B. Remington's Pharmaceutical Sciences, Kapitel 43, 14. Aufl., Mack Publishing Co., Easton A 18042, USA).
  • Verbindungen
  • Im Verlauf der Suche nach Mitteln mit verbesserter Aktivität gegen HIV wurden neue NNI für reverse Transkriptase (RT) von HIV-1 synthetisiert. Die US-Patentanmeldung Seriennummer 09/040,538, eingereicht am 17. März 1998, offenbart Nicht-Nukleosid-Inhibitoren von reverser Transkriptase, eine NNI-Verbindung bindende Tasche von HIV-RT und Verfahren zur Verwendung davon.
  • Es wurde unerwarteterweise entdeckt, daß mehrere von diesen NNI spermizide und/oder Spermien immobilisierende Aktivität aufweisen, was sie als aktive Mittel für Empfängnisverhütungs- und Spermienimmobilisierungsprodukte und -verfahren geeignet macht. NNI, welche die spermizide Aktivität aufweisen, umfassen Derivate von PBT. Die Derivate von PBT der Erfindung sind besonders zur Herstellung von Empfängnisverhütungsprodukten geeignet, die die Verbreitung von sexuell übertragenen Krankheiten, speziell die Verbreitung von HIV, reduzieren können. Ein Kontakt von Spermien mit diesen spermiziden NNI hemmt die Mobilität der Spermien und besitzt die gewünschten spermiziden und/oder empfängnishemmenden Funktionen.
  • PBT-Derivate, die eine signifikante spermizide Aktivität aufweisen, umfassen halogensubstituierte PBT-Derivate mit der unten gezeigten chemischen Struktur (I) oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon:
    Figure 00060001
    worin R, R1, R2, R3 und R4 unabhängig voneinander Wasserstoff, F, Cl, Br oder I sind und worin wenigstens einer von R, R1, R2, R3 und R4 F, Cl, Br oder I ist.
  • Vorzugsweise ist eines von R, R1, R2, R3 und R4 in der Struktur (I) F oder Cl. Einige, aber nicht sämtliche der geeigneten halogensubstituierten PBT-Derivate der Erfindung sind nachfolgend aufgelistet:
    N-[2-(2-Fluorphenethyl)]-N'-[2-(5-brompyridyl)]-thioharnstoff,
    N-[2-(2-Chlorphenethyl)]-N'-[2-(5-brompyridyl)]-thioharnstoff,
    N-[2-(3-Fluorphenethyl)]-N'-[2-(5-brompyridyl)]-thioharnstoff,
    N-[2-(3-Chlorphenethyl)]-N'-[2-(5-brompyridyl)]-thioharnstoff,
    N-[2-(4-Fluorphenethyl)]-N'-[2-(5-brompyridyl)]-thioharnstoff,
    N-[2-(4-Chlorphenethyl)]-N'-[2-(5-brompyridyl)]-thioharnstoff.
  • Eines der besonders bevorzugten PBT-Derivate der Erfindung ist N-[2-(2-Fluorphenethyl)]-N'-[2-(5-brompyridyl)]-thioharnstoff (F-PBT), welches die unten gezeigte chemische Struktur (II) hat:
    Figure 00060002
  • PBT-Derivate der Erfindung können synthetisiert werden, wie es in den Beispielen hierin beschrieben ist und wie es in Vig et al., BIOORG. Meo. CHeM., 6:1789–1797 (1998) beschrieben ist. Kurzgefaßt wird 2-Amino-2-brompyridin mit 1,1-Thiocarbonyldiimidazol kondensiert, um das Vorläufer-Thiocarbonyl-Derivat zu erhalten. Weitere Umsetzung mit in geeigneter Weise halogensubstituiertem Phenylethylamin liefert die halogenierten PBT-Zielderivate.
  • Die Reinheit und die physikochemischen Eigenschaften einiger PBT-Derivate sind in den Beispielen hiern beschrieben und wurden ausführlich in Vig et al., BIOORG. MED. CHEM., 6:1789– 1797 (1998) und in Vig et al., BIOORG Meo CHEM LETTERS, 8:1461–1466 (1998) angegeben.
  • Zusammensetzungen, Gegenstände und Methoden
  • PBT-Derivate der vorliegenden Erfindung werden als Zusammensetzungen, d.h. als Kondome oder Intravaginaleinsätze für die spermizide Anwendung, dargeboten. Solche Zusammensetzungen sind insbesondere für eine Anwendung in Säugern vorgesehen, d.h. in jeder Klasse von höheren Wirbeltieren, die ihre Jungen mit Milch, die aus Brustdrüsen abgesondert wird, ernähren, wie z.B. Menschen, Kaninchen und Affen. Es wird auch in Erwägung gezogen, daß die Zusammensetzungen als Spermienimmobilisierungszusammensetzungen verwendet werden können. Es wird erwartet, daß die vorliegende Erfindung in den meisten praktischen Anwendungen von Menschen verwendet werden wird.
  • Die Zusammensetzungen (d.h. Kondom oder Intravaginaleinsatz) der vorliegenden Erfindung enthalten ein oder mehrere spermizide PBT-Derivate und pharmazeutisch verträgliche Salze davon, wie sie oben offenbart sind. Die im allgemeinen verwendete Menge an spermiziden PBT-Derivaten wird diejenige Menge sein, die notwendig ist, um die gewünschten spermiziden Ergebnisse zu erzielen. Die Mengen können für spezielle Zusammensetzungen je nach Bedarf variiert werden. Die Mengen an spermiziden PBT-Derivaten werden typischerweise im Bereich von etwa 0,025 bis 0,5 Gew.-% auf der Grundlage des Gesamtgewichts der empfängnisverhütenden Zusammensetzung liegen. Vorzugsweise wird die Menge der eingesetzten spermiziden PBT-Derivate im Bereich von etwa 0,05 bis 0,5 Gew.-% und bevorzugter von etwa 0,05 bis 0,25 Gew.-% auf der Grundlage des Gesamtgewichts der Zusammensetzung liegen.
  • Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können nicht nur die spermiziden PBT-Derivate enthalten, sondern je nach Bedarf auch pharmazeutisch verträgliche Träger, Verdünnungsmittel oder Vehikel, d.h. Materialien für eine geeignete Auslieferung und/oder ein Halten der spermiziden NNI an einer Stelle für einen Kontakt mit Spermien und so daß die gewünschte spermizide und/oder antivirale schützende Aktivität bereitgestellt wird.
  • Eine vorteilhafte Komponente in der pharmazeutischen Zusammensetzung für eine Verabreichung eines Spermizids ist eine polymere Verabreichungskomponente, wie sie in dem US-Patent 5,595,980 beschrieben ist. Es wurde herausgefunden, daß diese polymere Verabreichungskomponente die Wirksamkeit eines Spermizids erhöht und die Scheidenirritation bei einer Verabreichung vermindert.
  • Zusätzlich zu der polymeren Komponente kann der Rest der empfängnisverhütenden Zusammensetzungen, d.h. typischerweise von etwa 0,1 bis 99,8% und häufig etwa 50 bis 99,8 Gew.%, optional einen oder mehrere kosmetische Bestandteile enthalten. Solche kosmetischen Bestandteile sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und werden auf dem Gebiet häufig als Verdünnungsmittel, Lösungsmittel und Hilfsmittel bezeichnet. Typischerweise umfassen kosmetische Bestandteile z.B. Wasser, Ethylalkohol, Isopropylalkohol, Glycerin, Glycerolpropylenglycol, Sorbitol und andere Alkohole mit hohem Molekulargewicht. Darüber hinaus können die empfängnisverhütenden Zusammensetzungen geringe Mengen, wie z.B. von etwa 0,1 bis 5 Gew.-% auf der Grundlage des Gewichts der empfängnisverhütenden Zusammensetzungen, andere Additive enthalten, wie z.B. Stabilisatoren, grenzflächenaktive Stoffe, Menthol, Eukalyptusöl, andere ätherische Öle, Duftstoffe und ähnliches. Polyoxyethylen 20-Sorbitanmonolaurat ist ein bevorzugter Stabilisator für eine Verwendung in den Zusammensetzungen. Die Auswahl und die Mengen an kosmetischen Bestandteilen, anderen Additiven und Mischverfahren können nach Techniken, die auf dem Gebiet gut bekannt sind, durchgeführt werden.
  • Die erfindungsgemäßen spermizid aktiven Bestandteile und empfängnisverhütenden Zusammensetzungen, welche diese enthalten, können durch irgendeine Intervaginalvorrichtung, wie beispielsweise Schwämme, Kondome, einschließlich Frauenkondomen, Suppositorien und Filmen, an die Scheide eines Säugers ausgeliefert werden.
  • Die empfängnisverhütenden Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise an eine Stelle für einen Kontakt mit Spermien, wie beispielsweise die Scheide eines Säugers, in einer Dosierung verabreicht, welche dahingehend wirksam ist, daß sie Spermien, z.B. in der Scheide vorhandene Spermien, immobilisiert und/oder das Eindringen von Spermien in die Gebärmutterhalsschleimhaut hemmt. Typische Dosierungen liegen im Bereich zwischen etwa 0,0001 bis 0,001 Gramm der Zusammensetzung pro Kilogramm Körpergewicht des Säugers.
  • Intervaginale Vorrichtungen können auch dazu verwendet werden, die Verabreichung der spermizid aktiven Bestandteile oder der empfängnisverhütenden Zusammensetzungen, welche diese enthalten, zu unterstützen, wie es in dem US-Patent 5,069,906 beschrieben ist.
  • Beim Verabreichen der spermizid aktiven Bestandteile in der Form der oben genannten Zusammensetzungen können die Zusammensetzungen auch so formuliert sein, daß das Spermizid schnell und/oder mit einer länger anhaltenden Freisetzung des Wirkstoffs abgegeben wird. Solch eine Formulierung, die sowohl schnelle als auch länger anhaltende Freisetzung bereitstellt, wurde in dem US-Patent 4,707,362 beschrieben.
  • Es wird in Erwägung gezogen, daß die spermiziden NNI der Erfindung in einen spermiziden Gegenstand, wie beispielsweise einen Vaginaleinsatz, ein Kondom oder eine andere solche Vorrichtung, aufgenommen sein kann, so daß das spermizide NNI, wenn der Gegenstand verwendet wird, für einen Kontakt mit Spermien ausgeliefert werden kann.
  • Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, welche nicht als die Erfindung beschränkend angesehen werden sollten, weiter erläutert.
  • Beispiele
  • In der Bemühung, ein vaginales, mikrobizides Empfängnisverhütungsmittel zu entwickeln, das potentiell in der Lage ist, eine HIV-Übertragung zu verhindern sowie eine Empfängniskontrolle bereitzustellen, wurden Nicht-Nukleosid-Inhibitoren (NNI) von reverser Transkriptase (RT) von HIV-1 synthetisiert und hinsichtlich der Doppelfunktion Anti-HIV und spermizide Aktivität untersucht.
  • Die Synthese von NNI als Inhibitoren von HIV-RT basierte auf einem Computermodell, in dem eine Bindungstasche für einen Stoff von neun einzelnen Kristallstrukturen von RT-NNI-Komplexen konstruiert wurde. Die NNI umfassen: N-[2-(2,5-Dimethoxyphenethyl)]-N'-[2-(5-brompyridyl)]-thioharnstoff (D-PBT) und N-[2-(2-Fluorphenethyl)]-N'-[2-(5-brompyridyl)]-thioharnstoff (F-PBT).
  • Wie man in 1 sieht, könnte der NNI Trovirdin als zwei chemische Gruppen, die über eine Thioharnstoffgruppe miteinander verbunden sind, betrachtet werden. Eine Hälfte des Moleküls besteht aus einem Pyridylthioharnstoffrest, der einen intramolekularen, wasserstoffgebundenen, heterozyklischen Ring bildet. Die andere Hälfte des Moleküls ist ein Pyridylring, der von der Thiocarbonylgruppe durch einen Ethyl-Linker getrennt ist. Computerandockverfahren unter Verwendung von Trovirdin offenbarten mehrere Stellen, die für die Aufnahme größerer funktionaler Gruppen, die den Pyridylring umgeben, des Ethyl-Linkers und der Umgebung der 5-Brom-Position von Trovirdin verwendet werden könnten. Daher wurden strategisch entworfene funktionale Gruppen hinzugefügt, um neue Derivate mit potentiell höherer Affinität für die NNI-Bindungstasche von HIV-RT zu erhalten. Es wurden zwei PBT-Derivate (D-PBT und F-PBT) durch Ersetzen des 2-Pyridyl-Rings von Trovirdin gegen einen 2,5-Dimethoxyphenylrest (D-PBT) oder ein Fluoratom an der Ortho-Position (F-DBT) synthetisiert.
  • Die Anti-HIV-Aktivität dieser zwei NNI (D-PBT und F-DBT) wurde mit derjenigen von Trovirdin und derjenigen des Virizids/Spermizids Nonoxynol-9 (N-9) verglichen, indem die Aktivität von viraler RT und die p24-Antigen-Produktion als Marker für virale Replikation unter Verwendung von mit HIV infizierten menschlichen peripheralen mononukleären Zellen (PBMC) gemessen wurden. Die Wirkungen auf die Spermienbewegungskinematik und die Spermienmembranintegrität wurden durch computerunterstützte Spermienanalyse (CASA) bzw. durch konfokale Laserabtastmikroskopie (CLSM) analysiert. Die wachstumshemmenden Wirkungen von NNI versus N-9 gegenüber normalen menschlichen ektozervikalen und endozervikalen Epithelzellen wurden unter Verwendung des MTT-Assays getestet. Beide NNI waren starke Inhibitoren für gereinigte rekombinante HIV-RT und hoben die HIV-Replikation in PBMC bei nanomolaren Konzentrationen (IC50 < 1 nM) im Vergleich zu N-9 oder Trovirdin [IC50-Werte von 2,2 μM bzw. 0,007 μM] auf. F-PBT zeigte auch eine konzentrations- und zeitabhängige spermizide Aktivität.
  • I. MATERIALIEN UND METHODEN
  • A. Chemische Synthese
  • Alle Chemikalien wurden so verwendet, wie sie von der Aldrich Chemical Company (Milwaukee, Wisconsin) erhalten wurden. Alle Reaktionen wurden unter Stickstoff durchgeführt. Säulenchromatographie wurde unter Verwendung von EM Science-Silicagel 60 und einem der folgenden Lösungsmittel durchgeführt: Ethylacetat, Methanol, Chloroform, Hexan oder Methylenchlond. Kernspinresonanz- (NMR-) Spektren wurden auf einem 300 MHz Instrument von Varian (Palo Alto, CA) (Modell Mercury 2000) aufgenommen, und chemische Verschiebungen (δ) sind in Teilen pro Million (ppm) im Verhältnis zu Tetramethylsilan als ein interner Standard bei 0 ppm angegeben. 1 3C-NMR-Spektren wurden bei 75 MHz in CDCl3 auf dem gleichen Instrument unter Anwendung einer Protonenentkopplungstechnik aufgenommen. Die für 1 3C-NMR angegebenen chemischen Verschiebungen beziehen sich auf das Chloroformtriplett bei 77 ppm. Schmelzpunkte wurden unter Verwendung eines Schmelzpunktapparates Mel-Temp. 3.0 (Laboratory Devices Inc., Holliston, MA) gemessen und sind nicht korrigiert. UV-Spektren wurden auf einem UV/Vis-Spektrometer von Beckmann (Fullerton, CA), Modell DU 7400, aufgenommen unter Verwendung einer Zellenweglänge von 1 cm und Methanollösungsmittel. Fourier-Transformations-Infrarotspektren wurden unter Verwendung eines Instruments von FT-Nicolet (Madison, WI), Modell Protege 460, aufgenommen. Massenspektrenanalyse wurde unter Verwendung eines matrixunterstützten Laserdesorptionsflugzeitspektrometers (MALDI-TOF) (Modell G2025A) von Hewlett-Packard (Palo Alto, CA) in dem Molekularionendetektionsmodus durchgeführt (die verwendete Matrix war Cyanhydroxyzimtsäure). Einige Proben wurden unter Verwendung eines Instruments von Finnigan (Madison, WI), MAT 95, analysiert. Elementaranalyse wurde von Atlantic Microlabs (Norcross, GA) durchgeführt.
  • 1. Chemische Synthese von Trovirdin
  • Trovirdin (N-[2-(2-Pyridyl)-ethyl]-N'-[2-brompyridyl]-thioharnstoff) wurde gemäß dem Literaturverfahren synthetisiert. Siehe Cantrell et al., J. MED CHEM 39:4261–4274 (1996).
  • 2. Chemische Synthese von D-PBT
  • Die Verbindung D-PBT ([N-[2-(2,5-Dimethoxyphenethyl)]-N'-[2-(5-brompyridyl)]-thioharnstoff) wurde synthetisiert, wie es in Vig et al., BIOORG. MED. CHEM, 6:1789–1797 (1998) beschrieben ist.
  • Zusammengefaßt wurde D-PBT synthetisiert, wie es in Schema 1 angegeben ist.
  • Schema 1
    Figure 00110001
  • Die Reinheit und die Eigenschaften des erhaltenen D-PBT waren wie folgt: weißer Feststoff (2 g, 67%); Smp. 133–138°C; UV (MeOH) λmax: 202, 205, 231, 276 und 300 nm; IR(KBr Disc) v 3209, 3152, 3078, 3028, 2951, 2831, 1595, 1533, 1468, 1306, 1227, 1095, 1059, 1022, 862, 825, 796, 707 cm–1;1H NMR (CDCl3) δ 11,24 (br, s, 1H), 9,30 (br, s, 1H), 8,10-8,09 (d, 1H), 7,65 (dd, 1H), 6,82-6,76 (m, 4H), 4,03-3,97 (q, 2H), 3,77 (s, 3H), 3,76 (s, 3H), 3,00-2,96 (t, 2H); 13C NMR (CDCL3) δ 178,7, 153,1, 151,8, 151,7, 146,5, 140,9, 128,1, 117,7, 113,3, 112,6, 111,2, 110,9, 55,7, 55,5, 45,6 und 29,9; MALDI-TOF Masse ermittelt, 394,0 (M – 1), 396,0 (M + 1), berechnet, 395,0; Anal. (C16H18BrN3O2S) C, H, N, S, Br.
  • 3. Chemische Synthese von F-PBT
  • Die Verbindung F-PBT (N-[2-(2-Fluorphenethyl)]-N'-[2-(5-brompyridyl)]-thioharnstoff) wurde synthetisiert, wie es in Vig et al., BIOORG. MED. CHEM. 6:1789–1797 (1998) beschrieben ist.
  • Genauer gesagt wurde F-PBT gemäß Schema 2 synthetisiert. Zusammengefaßt wurde 2-Amino-5-brompyridin mit 1,1-Thiocarbonyldiimidazol unter Erhalt des Vorläufer-Thiocarbonyl-Derivats kondensiert. Die weitere Umsetzung mit in geeigneter Weise substituiertem Phenylethylamin, in diesem Fall 2-Fluorphenethylamin, lieferte das gewünschte F-PBT. Schema 2
    Figure 00110002
    wobei: i) 1,1-Thiocarbonyldiimidazol, Acetonitril, Raumtemperatur, 12 Stunden, und
    ii) DMF, 2-Fluorphenethylamin, 100°C, 15 Stunden.
  • Die folgenden Verfahren wurden speziell für die Synthese von F-PBT verwendet: Thiocarbonyldiimidazol (8,90 g, 50 mmol) und 2-Amino-5-brompyridin (8,92 g, 50 mmol) wurden zu 50 ml trokkenem Acetonitril bei Raumtemperatur hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde für 12 Stunden gerührt und das Präzipitat filtriert, mit kaltem Acetonitril (2 × 25 ml) gewaschen und unter Vakuum getrocknet unter Erhalt von 11,40 g (80%) Verbindung A. Zu einer Suspension von Verbindung A (0,55 Äq.) in Dimethylformamid (15 ml) wurde ein geeignetes Amin, in diesem Falle 2-Fluorphenethylamin, (0,5 Äq.) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde auf 100°C erhitzt und für 15 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in eiskaltes Wasser gegossen und die Suspension für 30 Minuten gerührt. Das Produkt wurde filtriert, mit Wasser gewaschen, getrocknet und weiter durch Säulenchromatographie gereinigt unter Erhalt der Zielverbindung in guten Ausbeuten.
  • Die Reinheit und die Eigenschaften des erhaltenen N-[2-(2-Fluorphenethyl)]-N'-(2-(5-brompyridyl)]-thioharnstoffs (F-PBT) waren wie folgt:
    Ausbeute: 71%; Smp. 156–157°C; UV (MeOH) λmax: 209, 256, 274 und 305 nm; IR(KBr) v 3446, 3234, 3163, 3055, 2935, 1672, 1595, 1560, 1531, 1466, 1390, 1362, 1311, 1265, 1227, 1169, 1136, 1089, 1003, 864, 825, 756 cm–1; 1H NMR (CDCl3) δ 11,36 (br s, 1H), 9,47 (br s, 1H), 8,05-8,04 (d, 1H), 7,72-7,68 (dd, 1H), 7,30-7,03 (m, 4H), 6,87-6,84 (d, 1H), 4,06-3,99 (q, 2H), 3,10-3,05 (t, 2H); 13C NMR (CDCl3) δ 179,1, 163,1, 151,7, 146,2, 141,1, 131,2, 131,1, 128,5, 128,4, 124,1, 115,5, 115,2, 113,6, 112,2, 45,8 und 28,2; 19F NMR (CDCl3) δ –42,58 & –42,55 (d); MALDI-TOF ermittelt: 355,0 (M + 1), berechnet: 354,0; Anal. (C14H13BrFN3S) C, H, N, S.
  • C. Tests der Spermienimmobilisierungsaktivität (SIA)
  • Zur Bewertung der spermiziden Wirkungen von Trovirdin, D-PBT, F-PBT, S-DABO und ZDV im Vergleich zu N-9 wurden hochgradig mobile Fraktionen von gepoolten Spenderspermien (n = 6) durch diskontinuierliche Zentrifugation in einem Percoll-Gradienten (90-45%) (Conception Technologies, San Diego, CA) und nach dem "Aufschwimm"-Verfahren, wie es in D'Cruz et al., BIOL REPROD, 54:1217–1228 (1996) beschrieben ist, hergestellt. Alle Spenderspermienproben wurden nach eingeholtem Einverständnis und gemäß den Richtlinien des Hughes Institute Institutional Review Board erhalten. Mobile Spermien (≥ 10 × 106/ml) wurden in 1 ml Biggers, Whitten und Whittingam'schem Medium (BWW), welches 25 mM HEPES (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) und 0,3% BSA enthielt, in der Gegenwart oder Abwesenheit von zweifachen Reihenverdünnungen von Testsubstanz (500 μM bis 31,2 μM) in 1% DMSO suspendiert. Die Stammlösungen von NNI wurden in DMSO (100 mM) hergestellt und in Testmedium unter Erhalt der gewünschten Konzentrationen verdünnt. Zu Kontrollröhrchen wurde ein entsprechendes Volumen DMSO (1%) hinzugegeben. N-9 wurde in BWW-0,3% BSA (pH 7,4) unter Erhalt der gewünschten Konzentrationen (31,2 μM bis 500 μM) verdünnt. Nach 3 Stunden Inkubation bei 37°C wurde der Prozentsatz an mobilen Spermien mittels CASA nach Verfahren, wie sie in D'Cruz et al., BIOL REPROD., 58:1515–1526 (1998) und D'Cruz et al., MOL HUM REPROD, 4:683–693 (1998) beschrieben sind, bestimmt. Der Prozentsatz der Mobilität wurde mit zum Schein behandelten Kontrollsuspensionen von mobilen Spermien verglichen. Die spermizide Aktivität von Testverbindungen wurde als die EC50 ausgedrückt (die Endkonzentration der Verbindung in Medium, die den Anteil an mobilen Spermien um 50% herabsetzt).
  • Um die Wirkung der Dauer der Inkubation auf die SIA von spermiziden NNI zu testen, wurden mobile Fraktionen von Spermien (107/ml) bei 37°C in BWW-0,3% BSA in der Gegenwart von 1 mM F-PBT, S-DABO in 1% DMSO oder 1% DMSO alleine als Trägerkontrolle inkubiert. In Zeitintervallen von 5 oder 10 Minuten wurden doppelte aliquote Teile (4 μl) in zwei 20 μm Mikrozellkammern (Conception Technologies) überführt und die Spermienmobilität durch CASA für eine Dauer von 60 Minuten untersucht.
  • D. Spermienkinematikparameter
  • Für CASA wurden 4 μl jeder Spermiensuspension in zwei 20 μm Mikrozellkammern in einer Zählkammer bei 37°C eingebracht. Wenigstens 5–8 Felder pro Kammer wurden für die Analyse abgetastet, wobei ein Hamilton Thorne integriertes visuelles optisches System (IVOS), Instrument der Version 10 (Hamilton Thorne Research Inc., Danvers, MA) verwendet wurde. Jedes Feld wurde für 30 Sekunden aufgenommen. Die Computerkalibrierungen wurden auf 30 Bilder mit einer Bildfrequenz von 30/Sekunde eingestellt. Weitere Einstellungen waren die folgenden: minimaler Kontrast 8, minimale Größe 6, Kleinstmaßgatter 1,0, Höchstmaßgatter 2,9, Niedrigstintensitätsgatter 0,6, Höchstintensitätsgatter 1,4, Phasenkontrastbeleuchtung, niedrige Weggeschwindigkeit bei 10 μm/s und Schwellwertgeradlinigkeit bei 80% und Vergrößerungsfaktor 1,95.
  • Die Spermienkinematikparameter, die bestimmt wurden, umfaßten die Anzahlen von mobilen (MOT) und progressiv mobilen (PRG) Spermien, krummlinige Geschwindigkeit (VCL; ein Maß für die Gesamtentfernung, die von einem bestimmten Spermium während der Erfassung zurückgelegt wurde, geteilt durch die verstrichene Zeit), mittlere Weggeschwindigkeit (VAP; der räumlich gemittelte Weg, der das Taumeln des Spermienkopfs eliminiert), die geradlinige Geschwindigkeit (VSL; die geradlinige Entfernung vom Beginn zum Ende eines Weges, geteilt durch die benötigte Zeit), die Schlagkreuzfrequenz (BCF; die Frequenz, mit der der Spermienkopf den durchschnittlichen Weg des Spermiums kreuzt), die Amplitude der seitlichen Kopfverlagerung (ALH; die mittlere Weite der Spermienkopfoszillation) und die Derivate, Geradlinigkeit (STR = VSL/VAP × 100) und die Linearität (LIN = VSL/VCL × 100; Abweichung des Spermienweges von einer geraden Linie). Die Daten von jeder einzelnen Zellspur wurden aufgenommen und analysiert. Wenigstens 200 mobile Spermien wurden für jeden aliquoten Teil einer genommenen Probe analysiert.
  • E. Konfokale Laserabtastmikroskopie (CLSM)
  • Der Prozentsatz an Spermien mit einem intakten Akrosom nach einer 6-stündigen Behandlung mit oder ohne steigenden Konzentrationen (31,2 μM bis 500 μM) der drei NNI (S-DABO, F-PBT und D-PBT) im Vergleich zu N-9 wurde mittels CLSM ausgewertet. Mit Ethanol permeabilisierte und luftgetrocknete Spermienabstriche wurden nacheinander mit drei Fluoreszenzmarkern, FITC-Pisum sativum-Lectin, TOTO-3-lodid und Nile-Rot (Molecular Probes, Eugene, OR), gefärbt, weil ihre Ziele verschiedene sind (Akrosom, Kern bzw. Membranlipid). Die Proben wurden unter einem konfokalen Laserabtastmikroskop BioRad MRC-1024 (BioRad Laboratories, Hercules, CA), das mit einem Krypton/Argon-Gemischtgaslaser ausgestattet war (Anregungslinien: 488, 568 und 647 nm) und auf einem aufrechten Mikroskop der Serie Nikon Eclipse E800 montiert war, untersucht. Die Fluoreszenzemissionen von Fluorescein, TOTO-3-lodid und Nile-Rot aus dem Akrosomenbereich, dem Kern und der Plasmamembran von Spermien nach Ethanolpermeabilisierung wurden gleichzeitig detektiert unter Verwendung der 598/40 nm, 522 DF32 bzw. 580 DF32 Emission/Filter. Konfokalbilder wurden unter Verwendung einer Nikon 100x (NA 1.35) Objektivlinse und eines Kalman-Sammelfilters erhalten. Digitalisierte Bilder wurden auf einer Jaz-Speicherplatte (Iomega Corporation, Roy, UT) und unter Verwendung von Lasersharp (Bio-Rad) mit der Software Adobe Photoshop (Adobe Systems, Mountain View, CA) verarbeitet. Fertige Bilder wurden auf einem Farbdrucker Fuji Pictography 3000 (Fuji Photo Film Co., Tokio, Japan) ausgedruckt.
  • F. Zellproliferationstest
  • Normale menschliche ektozervikale (CrEC 4627) und endozervikale Epithelzellen (CrEC-En 4312) wurden von Clonetics (San Diego, CA) erhalten und in 150 cm2 T-Gewebekulturflaschen (Corning Corp., Corning, NY) in Basalmedium für Epithelzellen des kurzen Atemweges (Clonetics), das mit 50 μg/ml BPE, 0,5 μg/ml Hydrocortison, 0,5 μg/ml hEGF, 0,1 μg/ml Retinolsäure, 10 μg/ml Transferrin, 5 μg/ml Insulin, 5 μg/ml Epinephrin und 0,5 μg/ml BSA-FAF versetzt war, vermehrt. Zur Bestimmung der wachstumshemmenden Wirkungen von F-PBT und S-DABO im Vergleich zu N-9 verwendeten wir einen auf MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) basierenden kolorimetrischen Test für die Quantifizierung von Zellproliferation, wie es in Narla et al., CLIN CAAICER RES, 4:1405–1414 (1998) beschrieben ist.
  • Zusammengefaßt wurden die Zellen mit 0,125% (w/v) Trypsin-0,02% EDTA (GIBCO) aus Kulturen, die in der exponentiellen Phase gehalten wurden, geerntet und zentrifugiert (300 g × 5 Minuten). Nach dem Suspendieren und Zählen wurden die Zellen in Volumen von 100 μl in dreifacher Ausfertigung in 96-Well-Gewebekulturplatten gegeben. Nach 3 und 24 Stunden Inkubation wurde das Kulturmedium verworfen, durch 100 μl frisches Medium ersetzt, welches zweifache Reihenverdünnungen von Wirkstoffen in Medium unter Erhalt von 3,9 μM bis 250 μM für N-9 und 250 μM bis 4 mM für F-PBT und S-DABO enthielt. NNI wurden in DMSO auf eine Konzentration von 100 mM rekonstituiert. Stammlösung von N-9 wurde in sterilem PBS hergestellt. Kontroll-Wells mit Medium, das 0,25% DMSO alleine enthielt, wurden als Kontrollen einbezogen. Die Kulturplatten wurden dann für 24 Stunden inkubiert, bevor zu jedem Well 10 μl MTT-Lösung (5 mg/ml in PBS) hinzugefügt wurden. Wells, die nur Medium und MTT enthielten, wurden für jede Platte als Kontrolle verwendet. Die Tetrazolium/Formazan-Reaktion wurde für 4 Stunden bei 37°C ablaufen gelassen, und dann wurden 100 μl Solubilisierungspuffer (10% Natriumdodecylsulfat in 0,1% HCl) zu sämtlichen Wells hinzugefügt und sorgfältig gemischt, um die dunkelblauen Formazankristalle zu lösen.
  • Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurden die optischen Dichten (OD) bei 540 nm unter Verwendung eines automatischen 96-Well-Multiscanner Lesegerätes gemessen, wobei der Solubilisierungspuffer als Leerwert diente. Zur Umsetzung der OD540-Werte in die Anzahl lebender Zellen in jedem Well wurden die OD540-Werte mit denjenigen auf Standard-OD540- versus -Zellzahlkurven, die für jede Zellinie erzeugt worden waren, verglichen. Der Prozentsatz an Überlebenden wurde unter Verwendung der folgenden Formel berechnet: % Überlebende = Anzahl lebende Zellen [Test]/Anzahl lebende Zellen [Kontrolle] × 100. Alle Tests wurden dreifach durchgeführt, und die Ergebnisse wurden als IC50-Werte ausgedrückt. Der IC50 war definiert als die Konzentration, die für eine 50%ige Reduzierung des Überlebens der Zellen erforderlich war.
  • G. Statistische Analyse
  • Ergebnisse sind als die Mittelwerte oder die Mittelwerte ± SD aus unabhängigen Messungen angegeben. Die statistische Signifikanz des Unterschieds zwischen Testgruppen wurde durch Einweganalyse der Varianz und den Dunnett-Mehrfachvergleichstest analysiert. Lineare Regressionsanalyse wurde verwendet, um korrelierende Werte zwischen zwei gemessenen Parametern zu finden. Ein p-Wert von < 0,05 wurde als signifikant angesehen. Nicht-lineare Regressionsanalyse wurde verwendet, um die IC50- und EC50-Werte aus den Kurven des Konzentrationseffekts zu finden, wobei das Softwareprogramm GraphPad PRISM, Version 2.0 (San Diego, CA) verwendet wurde.
  • II. ERGEBNISSE
  • A. Tabellen
  • Auf die folgenden zwei Tabellen wird bei der Diskussion der Ergebnisse der Experimente Bezug genommen: Tabelle 1. Wirkung von NNI auf die Mobilität von menschlichen Spermien
    Figure 00150001
    • d EC50 = Wirkstoffkonzentration, die die Spermienmobilität um 50% hemmt.
    Tabelle 2. Wirkung von F-PBT und N-9 auf das Zellwachstum von normalen menschlichen ektozervikalen und endozervikalen Epithelzellen, quantitativ bestimmt durch den MTT-Test
    Figure 00160001
    • a Die Zellproliferation wurde nach 24-stündiger Behandlung mit 5 verschiedenen Konzentrationen (250 μM bis 4000 μM) von F-PBT und S-DABO getestet.
    • b EC50 = Wirkstoffkonzentration, die die Spermienmobilität um 50% hemmt.
    • cIC50 = Wirkstoffkonzentration, die das Zellwachstum um 50% hemmt.
    • Sl = Der Selektivitätsindex ist gleich dem Verhältnis von IC50 zu EC50
  • C. Spermizide Aktivität von NNI
  • Anschließend wurden die Wirkungen der drei NNI (S-DABO, D-PBT und F-PBT) und Trovirdin auf die Funktion menschlicher Spermien im Vergleich zu N-9 untersucht. Ein Aussetzen der hochgradig mobilen Fraktion menschlicher Spermien an Trovirdin oder D-PBT beeinflußte die Spermienmobilität selbst bei Konzentrationen bis zu 500 μM nicht (siehe 2 und Tabelle 1). Des weiteren bestätigte die Spermienmobilitätskinematik unter Verwendung von CASA, daß eine Trovirdin- oder D-PBT-Behandlung die Spermienbewegungsparameter, wie beispielsweise die progressive Mobilität (PRG), die Spurgeschwindigkeit (VCL), die Weggeschwindigkeit (VAP), die geradlinige Geschwindigkeit (VLS), die Geradlinigkeit des Schwimmusters (STR), die Linearität der Spermienspuren (LIN), die Schlagkreuzfrequenz (BCF) und die Amplitude der seitlichen Spermienkopfabweichung (ALH), nicht veränderte. Im Gegensatz zu Trovirdin oder D-PBT führte die Einführung eines Fluoratoms an der Ortho-Position des Phenylrings in PBT oder einer Isopropylgruppe an der C-5-Position des Thyminrings von S-DABO zu einer konzentrationsabhängigen spermiziden Aktivität. Der EC50-Wert von 147 μM (95% Cl: 94–330 μM), der für F-PBT erhalten wurde, lag innerhalb des spermiziden Bereichs von N-9 (EC50-Wert von 81 μM; 95% Cl: 41–410 μM) (siehe 2 und Tabelle 1). Auch die Bestimmung der Kinetik der Spermienimmobilisierung mittels CASA zeigte ein lineares Verhältnis zwischen der Inkubationszeit und dem Verlust an progressiver Spermienmobilität nach einem Aussetzen an die Verbindung F-PBT (Korrelationskoeffizient 0,811, p < 0,005) (siehe 3). Die erforderliche Zeit für einen 50%-igen Mobilitätsverlust von progressiv mobilen Spermien, die an F-PBT ausgesetzt waren, betrug 10 Minuten (95% Cl: 8–12 Minuten). Durch Vergleich blieb die Spermienmobilität in Kontrollproben während des 60-minütigen Erfassungszeitraums stabil (95% ± 3% im Vergleich zur Basislinie).
  • Der zeitabhängige Spermienmobilitätsverlust (PRG), der durch F-PBT induziert wurde, stand in Zusammenhang mit signifikanten Veränderungen in den Bewegungseigenschaften der überlebenden Spermien, insbesondere in Bezug auf die Spurgeschwindigkeit (VCL), die Weggeschwindigkeit (VAP) und die geradlinige Geschwindigkeit (VSL). Die repräsentativen Spermienkinematikpara meter von mit F-PBT behandelten Spermien gegenüber der Zeit sind in 4 gezeigt. Die Abnahmen von VSL und VCL oder VSL und VAP waren in ihrer Größenordnung ähnlich. Daher blieben die Werte für die Linearität (LIN) der Spermienspuren und die Geradlinigkeit (STR) des Schwimmusters relativ konstant. Auch die Schlagkreuzfrequenz (BCF) und die Amplitude der seitlichen Spermienkopfverlagerung (ALH) waren relativ stabil, während der Anteil mobiler Spermien während der linearen Phase des Mobilitätsverlusts abnahm. Die Spermienmobilitätsparameter von Kontrollspermien zeigten keine signifikanten Veränderungen während des 60-minütigen Inkubationszeitraums.
  • D. Spermizide NNI haben keine detergensartige Membrantoxizität
  • Nonoxynol-9, das am häufigsten verwendete Vaginalspermizid, immobilisiert Spermien infolge einer detergenzienartigen Wirkung auf die Spermienplasmamembran. Aufgrund seiner membranzerstörenden Eigenschaften wurde gezeigt, daß eine dauerhafte Anwendung von N-9 das Gebärmutterhals-Scheiden-Epithel schädigt, eine akute Gewebeentzündungsreaktion verursacht und die Wahrscheinlichkeit einer HIV-Infektion durch heterosexuelle Übertragung erhöht. Ein Spermizid, das keine unspezifische Membrantoxizitätseigenschaft von Empfängnisverhütungsmitteln vom Detergenstyp auslöst, würde klinische Vorteile bieten.
  • Daher wurden die Wirkungen von F-PBT und S-DABO auf die Akrosomenmembranintegrität des Spermienkopfes als ein Marker für Membranschädigung durch Dreifachfärbung (FITC-Pisum sativum-Lectin für Akrosom, TOTO-3-lodid für Kern-DNA und Nile-Rot für Membranlipide) von Spermien unter Anwendung von CLSM getestet. Die Untersuchung von mit FITC-Lectin, TOTO-3 und Nile-Rot gefärbten Spermien durch CLSM offenbarte eine intensive Akrosomenfärbung mit FITC-Lectin (grün), eine Kernfärbung mit TOTO-3 (blau) bzw. eine Membranfärbung (rot) mit Nile-Rot (siehe 5). Trotz vollständiger Immobilisierung von Spermien in der Gegenwart von F-PBT und S-DABO offenbarten in der konfokalen Mikroskopie > 90% der behandelten Spermien eine Akrosomenfärbung nach 6 Stunden Inkubation im Vergleich zu N-9, welche einen vollständigen Verlust der Akrosomenfärbung zeigten (siehe 5A). Somit wurde die spermizide Aktivität der Verbindung F-PBT nicht durch Membranzerstörung verursacht oder war damit einhergehend. In Spermien, die an Vehikel (d.h. 1% DMSO) alleine (gezeigt in 5B) oder 500 μM F-PBT (gezeigt in 5C) oder S-DABO (gezeigt in 5D) für 6 Stunden ausgesetzt worden waren, zeigte mehr als die Hälfte des Spermienkopfs (d.h. der Akrosomenbereich) eine gleichmäßige hellgrüne Fluoreszenz, was ein Anzeichen dafür war, daß die Akrosome intakt blieben. Im Vergleich zeigten Spermien, die an 500 μM N-9 (gezeigt in 5E) unter identischen Bedingungen ausgesetzt worden waren, keine grüne Fluoreszenz aufgrund von Zerstörung der Membranintegrität und Verlust von Akrosomenmembranen. Diese Eigenschaften von F-PBT und S-DABO stehen in deutlichem Gegensatz zu dem Aktivitätsprofil des derzeit verwendeten Spermizids N-9, welches seine Wirkungen über eine detergensartige Fähigkeit zur Schädigung der Spermienmembranen ausübt, wobei es die Spermienfunktion beeinträchtigt.
  • E. Selektive spermizide Aktivität von F-PBT und S-DABO versus N-9
  • Der MTT-Test, der die Zellproliferation und -lebensfähigkeit mißt, wurde dazu verwendet, die in vitro-Zytotoxizität von F-PBT und S-DABO im Vergleich zu N-9 an konfluenten Einzellagen von normalen menschlichen ektozervikalen und endozervikalen Epithelzellen zu testen. Die Zellen wurden diesen Verbindungen in Dosierungen im Bereich von 3,9 μM bis 4 mM für 3 Stunden oder 24 Stunden ausgesetzt. Die konzentrationsabhängigen Zellüberlebenskurven für F-PBT und S-DABO versus N-9 für diese Zellen, gemessen mit dem MTT-Test, wurden mit der spermiziden Aktivität, die mittels CASA gemessen wurde, verglichen. In MTT-Tests zeigte N-9 signifikante Zytotoxizität gegenüber ektozervikalen Epithel- und endozervikalen Epithelzellen mit mittleren IC50-Werten von 15 μM bzw. 11 μM. Im Vergleich waren die IC50-Werte für die F-PBT- und S-DABO-Dosisüberlebenskurven für ektozervikale und endozervikale Epithelzellen > 4 mM für S-DABO bzw. > 1 mM für F-PBT (siehe Tabelle 2). Somit war N-9 nur in zytotoxischen Konzentrationen spermizid (EC50-Wert: 81 μM; Selektivitätsindices: 0,18 bzw. 0,13 für ektozervikale bzw. endozervikale Zellen), wogegen F-PBT und S-DABO hohe Selektivitätsindices für diese Zellen zeigten (Sl: > 6,8 bzw. > 19,8 für ektozervikale Zellen bzw. endozervikale Zellen). Somit waren F-PBT und S-DABO signifikant geringer aktiv gegen diese Zellen des Fortpflanzungstrakts. Diese Studien zeigen, daß die spermizide Aktivität von F-PBT und S-DABO nicht mit unspezifischer Zytotoxizität verbunden ist.
  • III. DISKUSSION DER ERGEBNISSE DES EXPERIMENTS
  • B. Spermizide Aktivität
  • Spermienmobilitätskinematik in Verbindung mit konfokaler Laserabtastmikroskopie zeigten, daß F-PBT und S-DABO einen Stillstand der Spenrmienmobilität in einer konzentrations- und zeitabhängigen Art und Weise verursachten, ohne das Spermienplasma und die Akrosomenmembranintegrität zu beeinflussen, anders als das detergente Spermizid N-9. Darüber hinaus waren F-PBT und S-DABO selektiv spermizid im Vergleich zu N-9, welches gegenüber menschlichen ektozervikalen sowie endozervikalen Epithelzellen in spermiziden Dosen zytotoxisch war. Somit scheinen die ektozervikalen Epithelzellen durch zytotoxische Angriffe durch das detergensartige Spermizid N-9 verwundbar zu sein. Der Vorteil der spermiziden Funktionen der NNI der Erfindung legen nahe, daß weitere Modifikationen dieser NNI zu sogar noch potenteren doppelfunktionalen NNI mit der Doppelfunktion der Anti-HIV- und der spermiziden Aktivitäten sowie zu verminderten Zytotoxizitäten gegenüber den Epithelzellen des Genitaltrakts führen könnten.
  • Die Synthese von NNI als Anti-HIV-Mittel mit Doppelfunktion mit starker spermizider Aktivität stellt einen erheblichen Schritt vorwärts in der Entwicklung neuer Mikrobizide zur Eindämmung von heterosexueller HIV-Übertragung über die Vagina dar. Diese vielversprechenden Ergebnisse zeigen, daß NNI mit Doppelfunktion das einzigartige klinische Potential besitzen, der aktive Bestandteil eines neuen, von der Frau kontrollierbaren, topischen, viriziden Vaginalempfängnisverhütungsmittels für Frauen, die einem hohen Risiko für das Erwerben von HIV durch heterosexuelle, vaginale Übertragung unterliegen, zu werden.

Claims (5)

  1. Kondom oder Intravaginaleinsatz mit einer wirksamen spermiziden Menge einer Verbindung der Formel (I):
    Figure 00190001
    worin R, R1, R2, R3 und R4 unabhängig voneinander Wasserstoff, F, Cl, Br oder I sind und worin wenigstens einer von R, R1, R2, R3 und R4 F, Cl, Br oder I ist, oder einem pharmazeutisch verträglichen Salz davon mit der Maßgabe, daß der Intravaginaleinsatz nicht ein Pessar oder ein Tampon ist.
  2. Kondom oder Intravaginaleinsatz nach Anspruch 1, wobei wenigstens einer von R, R1, R2, R3 und R4 F oder Cl ist.
  3. Kondom oder Intravaginaleinsatz nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Verbindung der Formel (1) aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: N-[2-(2-Fluorphenethyl)]-N'-[2-(5-brompyridyl)]-thioharnstoff, N-[2-(2-Chlorphenethyl)]-N'-[2-(5-brompyridyl)]-thioharnstoff, N-[2-(3-Fluorphenethyl)]-N'-[2-(5-brompyridyl)]-thioharnstoff, N-[2-(3-Chlorphenethyl)]-N'-[2-(5-brompyridyl)]-thioharnstoff, N-(2-(4-Fluorphenethyl)]-N'-[2-(5-brompyridyl)]-thioharnstoff, N-[2-(4-Chlorphenethyl)]-N'-[2-(5-brompyridyl)]-thioharnstoff, und pharmazeutisch verträglichen Salzen davon.
  4. Kondom oder Intravaginaleinsatz nach Anspruch 3, wobei die Verbindung der Formel (I) unter N-[2-(2-Fluorphenethyl)]-N'-[2-(5-brompyridyl)]-thioharnstoff und pharmazeutisch verträglichen Salzen davon ausgewählt ist.
  5. Kondom oder Intravaginaleinsatz nach einem der vorangegangenen Ansprüche, welches/welcher weiterhin einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel umfaßt.
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