DE69919379T2

DE69919379T2 - Komplexe von hyaluronic saure/carnitinen und pharmazeutische und kosmetische zusammensetzungen

Info

Publication number: DE69919379T2
Application number: DE69919379T
Authority: DE
Inventors: Michele Fransoni
Original assignee: Continental Projects Ltd
Current assignee: Continental Projects Ltd
Priority date: 1998-11-13
Filing date: 1999-11-11
Publication date: 2005-09-08
Anticipated expiration: 2019-11-12
Also published as: ES2228128T3; DE69919379D1; EP1131105B1; US6585987B1; AU1295200A; EP1131105A1; WO2000029030A1; ATE273026T1

Description

Die Erfindung betrifft Komplexe von Hyaluronsäure und "Carnitinen", wobei die letzteren hierin sowohl Carnitin an sich als auch insbesondere seine Acylderivate mit geradkettigen oder verzweigtkettigen aliphatischen Carbonsäuren, die gegebenenfalls ungesättigt oder mehrfach ungesättigt sind, mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen betreffen.
Obwohl die erfindungsgemäßen Komplexe als Carnitinkomponente DL-Carnitin oder D- und L-Carnitin-Gemische in verschiedenen Verhältnissen als auch die verwandten Acylderivate, wie vorstehend beschrieben, enthalten können, betrifft die bevorzugte Ausführungsform Komplexe von Hyaluronsäure und L-Carnitin oder Acyl-L-Carnitin, worin "Acyl" die vorstehend definierten Bedeutungen aufweist. Erfindungsgemäß wird deshalb "Carnitin", wenn nicht anderweitig beschrieben, L-Carnitin betreffen. Das Gleiche trifft für die verschiedenen Acylcarnitine zu, die im Nachstehenden aufgeführt werden.
"Hyaluronsäure" wird hierin eine Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht von etwa 2 × 10³ bis etwa 5 × 10⁶, vorzugsweise etwa 2 × 10⁵ bis etwa 3 × 10⁶ betreffen.
Wie es durch das vorstehend Beschriebene offensichtlich ist, sind beide Komponenten der erfindungsgemäßen Komplexe an sich bekannt. Information bezüglich Hyaluronsäure als auch zahlreiche Literaturangaben bezüglich Carnitin (Seite 281) und Acetylcarnitin (Seite 13) finden sich unter anderem im Merck Index, 11. Ausgabe, Seite 751, 281 bzw. 13, wohingegen Acylcarnitine und/oder die Verwendung davon der Gegenstand einer Reihe von Patenten sind (vgl. z.B. US-PSen 4,346,107, 4,194,006, 4,343,816).
Die EP 0 951 909 beschreibt Kombinationen von L-Carnitin und Derivaten mit Hyaluronsäure, die entzündungshemmend und knorpelschützend sind.
Die therapeutischen Indikationen der zitierten Komponenten sind auch bekannt. Insbesondere wird Hyaluronsäure als Coadjuvanz bei der Behandlung von Synovitis und Gewebsreparationsprozessen verwendet.
Es wurde nun festgestellt, dass Komplexe (oder sogar einfache Kombinationen) von Hyaluronsäure und "Carnitinen" (was sowohl Carnitin an sich als auch dessen Acylderivate betrifft) in der Form eines Nahrungsergänzungsmittels oder eines echten Medikaments vorliegen und fungieren können, abhängig von deren günstigen, vorbeugenden oder therapeutischen Wirkung, die die Komplexe oder Kombinationen zeigen sollen, abhängig von den spezifischen Endverbrauchern.
Ferner wurde festgestellt, dass die Komplexe und Kombinationen in Kosmetika nützlich sein können.
Die Komplexe und die vorstehend beschriebenen Kombinationen weisen tatsächlich: a) eine erhöhte schützende Wirkung auf Gewebe und Zellplasmamembran, b) entzündungshemmende und Radikal-abfangende Wirkungen, c) eine Wirkung gegen Alterung, insbesondere wiederherstellende oder beibehaltende Wirkungen auf die Hautelastizität, und d) eine allgemeine trophische, kosmetisch bemerkenswerte Wirkung auf. Insbesondere sind die erfindungsgemäßen Komplexe und Kombinationen zur Behandlung von Synovitis und Gonarthrose, Crohn-Krankheit, eitriger Rektokolitis und Zöliakie verwendbar. Die Wirkungen können mehr oder weniger ausgeprägt sein, abhängig von dem verwendeten individuellen "Carnitin".
Folglich ist ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand pharmazeutische und kosmetische Zusammensetzungen, die als wirksamen Bestandteil enthalten: a) Kombinationen von Hyaluronsäure und Carnitin oder Acylcarnitin oder b) – gemäß einem bevorzugten erfindungsgemäßen Aspekt – Komplexe von Hyaluronsäure und Carnitin oder Acylcarnitin, wobei die Kombinationen und Komplexe die zwei Komponenten in Gewichtsverhältnissen von 3:1 bis 1:3, vorzugsweise in gleichen Gewichtsverhältnissen, enthalten.
Insbesondere ist ein erfindungsgemäßer Gegenstand pharmazeutische Zusammensetzungen, die als wirksamen Bestandteil die vorstehend definierten Kombinationen a) oder Komplexe b) mit schützender Wirkung auf Gewebe und Zellplasmamembran, mit entzündungshemmenden und Radikal-abfangenden Wir kungen, für die Therapie von Synovitis und Gonarthrose, für die Therapie von Crohn-Krankheit, eitriger Rektokolitis und Zöliakie enthalten, und außerdem kosmetische Zusammensetzungen, die die Kombinationen a) oder Komplexe b) mit Wirkung gegen Alterung und wiederherstellenden und beibehaltenden Wirkungen auf die Hautelastizität und eine allgemeine trophische Wirkung enthalten.
Wie bereits beschrieben, sind Carnitin und Acylcarnitine, die in den vorstehend beschriebenen pharmazeutischen und kosmetischen Zusammensetzungen enthalten sind, vorzugsweise L-Carnitin und Acyl-L-Carnitin. Besonders bevorzugt sind Acetyl-L-Carnitin, Propionyl-L-Carnitin und Palmitoyl-L-Carnitin.
Die erfindungsgemäßen Komplexe enthalten die zwei Komponenten in Gewichtsverhältnissen von 1:3 bis 3:1, vorzugsweise in gleichen Gewichtsverhältnissen. Sie werden dadurch erhalten, dass a) Hyaluronsäure zu einer Suspension oder Lösung von Acylcarnitin (oder Carnitin) in PBS und/oder Ethanol (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) unter starkem Rühren bei einer Temperatur von 20 bis 60°C gegeben wird, b) Acylcarnitin (oder Carnitin) zu einer Lösung von Hyaluronsäure in PBS gegeben wird, das Ganze zuerst einer Sonifizierung bei Temperaturen von 10 bis 30°C, vorzugsweise 15 bis 20°C, und sodann einer Zentrifugation unterzogen wird, wobei der Überstand wiedergewonnen wird. Das sich ergebende Produkt erwies sich als ein tatsächlicher Komplex mittels der chemisch-physikalischen Bestimmungen, die im Folgenden beschrieben werden.
Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Komplexe ist in den nachstehenden, nicht begrenzenden Beispielen veranschaulicht. Im Folgenden wird Hyaluronsäure als HA bezeichnet werden. Ferner wird HA eine Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht von etwa 2 × 10⁵ bis etwa 3 × 10⁶ sowohl als die Säure als auch als Alkali- oder Erdalkalimetallsalze betreffen.
Beispiel 1
Palmitoyl-L-Carnitin (PC) wurde in absolutem Ethanol gelöst und sodann wurde die Lösung zu einer PBS-Lösung (pH-Wert von 7,4) gegeben, um PC-Endkonzentrationen von 0,1, 0,5 und 1 mg/ml zu ergeben. Die sich ergebenden Suspensionen wurden drei Minuten bei Raumtemperatur vortexiert, sodann unter Rühren eine Stunde bei 50°C stehen gelassen. Während dieser Zeitspanne wurde pulv rige Hyaluronsäure (HA) mit unterschiedlichen Molekulargewichten (2 × 10⁵ bis 3 × 10⁶) langsam zu der Suspension bis zu einer HA-Endkonzentration von 0,1, 0,5 und 1 mg/ml gegeben. Bei jeder Zugabe von HA wurde die Probe mindestens eine Minute vortexiert und sodann unter den gleichen Temperaturbedingungen inkubiert.
Beispiel 2
Pulvriges PC wurde zu einer PBS-Lösung gegeben und sodann wurde die sich ergebende Suspension in der Kälte für eine Zeitspanne von 5 bis 15 Minuten sonifiziert. HA wurde sodann zugegeben und das sich ergebende Gemisch wurde einige Minuten vortexiert, sodann unter Rühren etwa eine Stunde bei Temperaturen von 21 bis 50°C inkubiert.
Beispiel 3
Zu einer 2-ml-Lösung an HA mit einem Molekulargewicht von 3,4 × 10⁶ bzw. 2 × 10⁵ in PBS (1 mg∙ml^–1) wurde ein Aliquot an PC (20 μM) in Ethanol (20 μl) gegeben. Die Komponenten wurden 15 bis 20 Minuten bei 20°C in einem Ultraschall-Wasserbad, das auf 100 Watt eingestellt war, gemischt. Die sich ergebenden schillernden Lösungen wurden 10 Minuten zentrifugiert (3 000 g) und die Überstände abgetrennt. Diese Lösung zeigte keinerlei Phasentrennung, sogar nach Stehenlassen bei 4°C für mehrere Tage.
BEWERTUNG DES HA/CARNITIN-KOMPLEXES
Bestimmungen der Wirkungen einer Ultrasonifizierung auf die molekulare Dispersität von HA.
Um die Wirkungen von Ultraschall auf HA allein zu bestimmen, wurde das vorstehend verwendete Protokoll (Beispiel 3) für Zeitspannen von bis zu zwei Stunden ohne PC wiederholt. Eine Probe (0,5 ml) des sich ergebenden sonifizierten oder nicht sonifizierten Materials (1 mg∙ml^–1) in PBS (pH-Wert von 7,2) mit 20 μl Ethanol wurde sodann auf eine Sepharose CL-2B-Gelfiltrationssäule (30 × 1 cm), die mit dem gleichen Puffer äquilibriert war, gegeben. Die Säule wurde bei 3 bis b ml/h mit PBS eluiert und die Mengen an HA in den gesammelten Fraktionen wurden durch Hexuronat-Analyse unter Verwendung des Blumenkranz-und-Asboe-Hansen-Verfahrens bestimmt.
Untersuchungen über die Wechselwirkung von HA mit ³H-PC durch Gelausschlusschromatographie.
Gemische an HA (1 mg·ml^–1 in PBS) und ethanolischem ³H-PC (20 μl, 20 μM) wurden zwei Stunden unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Protokolls sonifiziert. Sonifikate (1 ml) wurden auf einer Sepharose CL-2B-Säule (1 × 60 cm) fraktioniert, wobei bei 3,6 ml·h^–1 mit PBS als dem Elutionspuffer eluiert wurde. Fraktionen (1 ml) wurden gesammelt und hinsichtlich Hexuronsäure und Radioaktivität (Zerfall pro Minute) durch Scintillationsspektrometrie überwacht.
Untersuchungen über die Wechselwirkung von HA mit PC unter Verwendung von MALLS-Photometrie.
In diesen Experimenten wurden ein MALLS-Photometer zusammen mit einem Brechungsindex (RI)-Nachweisgerät, einer Superose 6 HR30-Gelpermeationssäule (GPC) und einer Hubkolbenpumpe P500 mit zwei Kolben verwendet. Gemische an HA (1,0 mg·ml^–1 in PBS) und PC (20 μl, 20 μM in Ethanol) wurden 0, 15, 30, 60 oder 120 Minuten sonifiziert. Lösungen wurden sodann mit einem gleichen Volumen an PBS verdünnt, zentrifugiert (3 000 g) und der Überstand wurde auf die Superose 6-Säule aufgetragen, wobei bei 24 ml·h^–1 mit PBS-Puffer unter Verwendung der P500-Pumpe eluiert wurde. Fraktionen wurden nacheinander mit dem MALLS-Photometer und RI-Nachweisgerät untersucht. Alle Experimente erfolgten dreifach. Das Molekulargewicht-Zahlenmittel (M_n), die massegemittelte Molekülmasse (M_w), der Z-Mittelwert des Molekulargewichts (Mz) und die berechneten quadratischen Mittelwerte (RMS) der Radien für jeden dieser Parameter wurden für die Menge an Winkelvariationen an gestreutem Licht für die von der Säule eluierenden Fraktionen bestimmt. Das Verhältnis M_w/M_n wurde verwendet, um die molekulare Polydispersität zu bewerten.
¹H-NMR-Spektroskopie
Hoch auflösende ¹H-NMR (199,5 MHz) der Proben wurde unter Verwendung eines JEOLFX-200-Spektrometers erhalten, das in dem Fourier-Transformationsmodus arbeitete. Proben waren in 10-mm-Wilmard-Glasröhrchen zusammen mit einem koaxialen 5-mm-Röhrchen mit Tetramethylsilan in Deuteriumoxid enthalten. Dies wurde als eine externe Integrationsreferenz verwendet. Die Probentemperatur wurde bei 37°C gehalten. Alle Proben wurden mit Argon vor den Messungen entgast. Die Konformationsmobilität (Flexibilität) einer Lösung an HA wurde unter Verwendung eines Verfahrens bestimmt, das die Bestimmung der Linienbreite bei halber Peakhöhe (v_1/2) für die Methylprotonenresonanz der Acetamidodesoxyglucose-Reste der Hyaluronat-1H-NMR-Spektren erforderte.
¹³C-NMR-Spektroskopie
Protonen-entkoppelte ¹³C-NMR-Spektren (50,1 MHz) von in D₂O gelösten HA-Zubereitungen (10% w/v) wurden unter Verwendung eines JEOLFX-200-FT-Spektrometers erhalten. Proben waren in 10-mm-Wilmard-Glasröhrchen enthalten, in denen ein 4 mm koaxiales Röhrchen mit Acetonitril als einer externen Referenz platziert worden war. Die Probentemperatur wurde bei 37°C gehalten und eine Spektralbreite von 1 kHz und 6 000 Datenpunkten wurde verwendet.
ERGEBNISSE
Gelausschlusschromatographie von Sonifikaten von HA mit ³H-PC.
Eine Chromatographie von Sonifikaten von HA mit 3H-PC unter Verwendung der gleichen Bedingungen, wie sie für HA allein verwendet wurden, zeigte, dass, obwohl der Hauptteil an radioaktiv markiertem PC bei dem Gesamtvolumen (V_L) erschien, ein Teil des aufgetragenen radioaktiv-markierten PCs bei V₀ eluierte. Das ³H-PC eluierte in Fraktionen, die größtenteils den Fraktionen von HA mit höherem Molekulargewicht entsprachen.
Untersuchungen der Wirkungen von PC und Sonifizierung auf die molekularen Eigenschaften von HA unter Verwendung von MALLS-Photometrie.
Obwohl eine Sonifizierung von HA den Mn-Wert, den Mw-Wert und den Mz-Wert hinsichtlich nicht sonifiziertem (nativem) HA (Mw = 3,4 × 10⁶) progressiv verminderte, waren diese Parameter in den entsprechenden Sonifikaten, in denen PC umfasst war, höher. Die entsprechenden RMS-Radien waren auch durchweg höher als in HA-Sonifikaten ohne PC, aber die Polydispersität (Mw/Mn) war unabhängig von der Gegenwart von PC oder der Sonifizierungszeitspanne.
NMR-Untersuchungen
Die chemischen Verschiebungswerte im ¹³C-NMR für HA zeigten, dass die Werte für die Ringkohlenstoffatome der N-Acetylglucosamin- und Glucuronsäure-Disaccharid-Wiederholungseinheit von HA für alle Zubereitungen vergleichbar waren, was identische Primärstrukturen bestätigte. Eine Sonifizierung einer HA mit hohem Molekulargewicht oder einer Zubereitung von HA mit niedrigem Molekulargewicht mit PC für Zeitspannen von bis zu zwei Stunden erhöhte den Anteil an vorhandenen flexiblen Domänen, wie aus Linienbreitenwerten der Acetamidomethylprotonen in deren entsprechenden ¹H-NMR-Spektren bestimmt. In den Kontrollexperimenten, in denen PC weggelassen wurde und eine Sonifizierung für die gleichen Zeitspannen erfolgte, wurde eine leichte Abnahme des Prozentsatzes an Flexibilität der HA-Zubereitungen festgestellt.
Die Wirkungen eines Variierens der HA-Konzentrationen auf den Prozentsatz an flexiblen und starren Segmenten, die in einer HA-Lösung vorhanden waren, die 60 Minuten in Gegenwart von PC sonifiziert worden war, zeigten, dass sich die vorhandenen relativen Verhältnisse über einen 10fachen Verdünnungsbereich nicht wesentlich veränderten.
ENTZÜNDUNGSHEMMENDE WIRKUNG
Eine spezifische Hautentzündungsreaktion, die durch unterschiedliche Phlogistika von sowohl exogenem als auch endogenem Ursprung, einschließlich der Bildung von Radikalen, Lipoperoxiden, Prostaglandinen und Cytokinen, verursacht wird, ist diejenige, die durch intradermale Injektion von Dithranol induziert wird, wie von Mustakallio (Mustakallio K., DERMATOVENER, 54, 125, 1979) beschrieben.
Dithranol wird intradermal bei der Dosis von 20 mcg auf dem Rücken eines rasierten Mehrschweinchens injiziert.
Auf der anderen Seite des Rückens werden vor der Injektion der gleichen Menge an Dithranol HA allein oder Acetyl-L-Carnitin (AC) allein oder HA und AC zusammen oder der HA- und AC-Komplex verteilt.
Ein Gemisch aus Lanolin und Ethylenglykolmonostearat wird verwendet, um diese Verbindungen zu verteilen. Nach 48 Stunden dieser Behandlung bestätigte die Auswertung der Dithranol-induzierten Hautentzündungsfläche, das HA fähig ist, die Entzündungsfläche auf etwa 30% zu senken. Auf der anderen Seite weist AL allein keine schützende Wirkung auf.
Die Kombination von AC und HA induziert eine offensichtlichere hemmende Wirkung auf die Dithranol-induzierte Entzündung.
Die gleichzeitige Verabreichung von AC und HA induziert eine hemmende Wirkung bei der Oberfläche der Entzündungsfläche auf etwa 50%. Eine sehr signifikante Hemmung (über 75%) ist insgesamt offensichtlich, wenn der HA-Komplex mit der gleichen Menge an HA und AC verwendet wird.
Diese Experimente belegen die überraschende und leistungsfähige schützende Wirkung, die durch den Komplex HA/AC induziert wird, im Vergleich mit derjenigen, die durch die einzelnen Verbindungen allein oder zusammen gezeigt werden (Tabelle 1).
Diese überraschende, unerwartete Wirkung, die von dem Komplex aus HA und AC gezeigt wird, im Vergleich mit seinen Komponenten, die entweder allein oder zusammen verwendet werden, wurde durch einen weiteren unterschiedlichen Test, demjenigen von Theleocidin, gezeigt, das wie andere Sorbolmyristate, falls injiziert, wichtige Hautveränderungen und die Bildung von Tumorreaktionen in Mäusen induziert (Fujiki H., Biochem. Biophys. Res. Commun., 90, 976, 1979). Diese Hautveränderungen erhöhen das Ornithindecarboxylase-Enzym und diese Erhöhung steht in Verbindung zu der Schwere der induzierten Hautschädigung.
In diesen Experimenten wird Theleocidin auf die rasierte Rückenhaut von Mäusen bei einer Dosis von 5 mcg/Maus, gelöst in 0,2 ml Lösung, injiziert.
HA und AC, entweder allein oder zusammen oder in der Form eines erfindungsgemäßen Komplexes verabreicht, werden 5 Minuten vor Theleocidin auf den Rücken der Tiere verteilt. Ornithindecarboxylase wird auf die homogenisierte Epidermis der Tiere 5 Stunden nach der Theleocidin-Injektion gemäß dem Verfahren von O'Brien und Nakadate dosiert (O'Brien T.G., Cancer Res., 35, 1662, 1975 – Nakadate T., Cancer Res., 42, 2841, 1982). Die Proteinkonzentration eines Epi dermisextrakts wird nach dem von Lowry beschriebenen Verfahren bewertet (Lowry O.H., J. Biol. Chem. 193, 265, 1951).
Wie in Tabelle 2 gezeigt, belegen diese Experimente auch eine überraschende, unerwartete und leistungsfähigere Wirkung des erfindungsgemäßen Komplexes aus HA und AC im Vergleich mit den zwei einzelnen Komponenten.
Tabelle 1
Tabelle 2
KLINISCHE VERSUCHE
WIRKUNG VON HYALURONSÄURE/CARNITIN AUF DIE BARRIEREFUNKTION DES HORNHAUTEPITHELS IM FALLE DES "TROCKENEN AUGE"-SYNDROMS
Trockenheit der Konjunktiva isoliert oder in Zusammenhang mit einer anderen okularen oder extra-okularen Erkrankung, ist anerkanntermaßen fähig, eine lokale Schädigung auf dem Hornhautepithel zu induzieren, das unter anderem seine Barrierefunktion verlieren kann. Basierend auf einer vorausgehenden Untersuchung bei Kaninchen, die die Wirksamkeit einer 1:1 w/w-Kombination von Hyaluronsäure/Carnitin bei der Verhinderung von durch Ioddämpfe induzierten Erosionen belegte, erfolgte ein Klinikversuch bei 27 Patienten, die unter "trockenem Auge" litten und mit entweder nur Hyaluronsäure oder Hyaluronsäure/Carnitin behandelt wurden. Gemäß dem Protokoll erhielt jeder Patient 4 Wochen eine medikamentöse Behandlung (Hyaluronsäure) in der Form von Collyrium in ein Auge und eine unterschiedliche Behandlung (Hyaluronsäure/Carnitin) in das andere Auge, so dass jeder Patient auch als die Kontrolle fungierte. Eine subjektive Bewertung und klinische Untersuchungen, verbunden mit einem Fluorescein-Test, erfolgten zwei Wochen nach dem Beginn der Behandlung als auch an ihrem Ende (4 Wochen). Die erhaltenen Ergebnisse belegten, dass Hyaluronsäure allein keine signifikanten Vorteile entweder beim Verbessern der die Patienten beeinträchtigenden Symptome oder beim Erhalten einer wirksamen Barrierefunktion in dem Hornhautepithel bereitstellte. Umgekehrt zeigte eine Fluorophotometrie des Auges, das mit Hyaluronsäure/Carnitin behandelt wurde, um die Fluoresceinaufnahme in spezifische Hornhautbereiche zu untersuchen, eine signifikante Verbesserung der Barrierefunktion bereits nach zwei Wochen der Behandlung in den unteren Hornhautbereichen und vier Wochen in den zentralen Bereichen.
BEWERTUNG DER WIRKSAMKEIT DER KOMBINATION VON HYALURON-SÄURE/CARNITIN BEI DER BEHANDLUNG VON TROPHISCHEN GESCHWÜREN DER UNTEREN EXTREMITÄTEN
Gefäßgeschwüre der unteren Extremitäten sind multidisziplinäre Erkrankungen.
Unter Geschwür wird der Verlust an Substanz verstanden, der mit hämodynamischen, hämorherologischen und Koagulationsveränderungen verbunden ist: die Einbeziehung einer Mikrozirkulation, entweder primär oder sekundär, ist bei der Geschwürbildung wichtig und bewirkt eine Beeinträchtigung des Gewebstrophismus mit einem Verlust an Gewebe.
Geschwüre können oft die Manifestation einer Reihe von Erkrankungen sein, denen eine unzureichende Blutzirkulation zu Grunde liegt, die eine Hypoxie verursacht. Eine Oximetrie durch die Haut belegte tatsächlich, dass in dem Fall von Gefäßläsionen der pO₂-Wert 5 bis 10 mm Hg erreicht, Mengen, die die metabolische Leistungsfähigkeit und Energieproduktion der Zelle stark beeinflussen. Ferner proliferieren Leukozyten und zeigen deren phagocytische Aktivität bei einem pO₂-Wert von 30 bis 40 mm Hg.
Eine Therapie ist immer noch ein ungelöstes Problem trotz der großen Anzahl von pharmakologischen und physikalischen Hilfen.
Von dem statistischen Gesichtspunkt aus betreffen gemäß zahlreicher Untersuchungen trophische Geschwüre der unteren Extremitäten 1 bis 3% der Bevölkerung mit einem 5%igen Maximum unter Patienten, die älter als 60 sind. Die herkömmlichsten Geschwüre-verursachenden Faktoren sind Phlebopathien, Arteriopathien, Diabetes mit der in Beziehung stehenden Mikroangioneuropathie. Die betroffenen Bereiche sind in Reihenfolge der Häufigkeit die mediale Oberfläche des Knöchels, gefolgt von der Seitenfläche des Knöchels, der vorderen und hinteren Oberfläche, der Wade und dem Fuß. Die Durchschnittsdauer eines Geschwürs beträgt etwa 26 Wochen mit einem Bereich, der von 4 bis 30 Jahren variiert, und Rezidive sind sehr häufig.
Der Heilungsprozess beinhaltet eine Entzündung mit einer Zellmigration, eine Neovaskularisierung und Wiederherstellung. Eine Zellreparatur wird durch verschiedenen Faktoren, die als Gewebsregenerationsstimulatoren fungieren, vermittelt.
Die Beobachtung von Geschwürmerkmalen ist wichtig, um dessen Entwicklung vorherzusehen, und insbesondere wichtig ist die Charakterisierung auf der Basis von: Stelle – Form – Größe – Anzahl – Ränder – Granulationsgewebe – Epidermis neben dem Geschwür.
VENENGESCHWÜRE: Sie sind mehr oder weniger tiefe Geschwüre, die mit Hypertonie, die sekundär zu einer Krampfader-Erkrankung oder Venenthrombose ist, in Beziehung stehen. Hauptursache ist eine chronische Venenhypertonie, die Mikrogefäße beeinflusst, mit einem folgenden Herunterfahren der Zirkulation und strukturellen und funktionellen Modifikationen.
ARTERIELLE GESCHWÜRE: Sie stehen hauptsächlich mit einer peripheren artherosklerotischen Erkrankung in Beziehung. Geschwüre sind trophische Läsionen, die Patienten mit chronischer Verschlussarteriosklerose betreffen. Sie treten auf, wenn eine Abnahme des Blutflusses mehr als 50% beträgt, wobei unter diesem Umstand eine Kompensation durch Mikrozirkulation nicht länger möglich ist und das bereits heikle hämodynamische Gleichgewicht gefährdet ist.
Das verwendete Protokoll ist wie folgt:
1) Topische Verabreichungen einer Kombination von Hyaluronsäure und Carnitin (1:1 nach Gewicht) oder von Carnitin allein oder von Hyaluronsäure allein, vorherige Befeuchtung der Läsion mit Kochsalzlösung für eine Zeitspanne von 10 Minuten. In den ersten Behandlungen ist es möglich, Hyaluronsäure bei einer höheren Konzentration als Carnitin zu verwenden, um ein Säubern des Geschwürs zu fördern. In den folgenden Behandlungen wurden solche Konzentrationen der zwei Moleküle verwendet, um besser Gebrauch von der Rolle von Carnitin in normalisierendem Gewebstrophismus zu machen. Eine Behandlung begann gewöhnlich während des Krankenhausaufenthalts und wurde sodann bei der analgetischen Therapieklinik fortgesetzt.
In der Regel durchlaufen Patienten eine solche Behandlung ohne Probleme. Einige Patienten litten episodisch an leichten, kurzen Reizungen und manchmal an einem lokalen Brennen während der ersten Sitzungen der Behandlung.
Für diesen Versuch angemeldete Patienten kamen von medizinischen und Chirurgieabteilungen, auf denen sie nicht erfolgreich verschiedene medikamentöse Behandlungen erhielten (Mesoglycan, Connectivin, Mucopolysaccharide).
18 Frauen und 12 Männer von 62 bis 80 Jahren mit trophischen Geschwüren verschiedener Größe und an verschiedenen Stellen irgendwo an den Extremitäten oder Füßen wurden behandelt.
ERGEBNISSE
Ergebnisse wurden wie folgt eingestuft: SEHR GUT, wenn das Geschwür vollständig geheilt wurde, GUT, wenn mindestens 50% Verminderung der Läsion erreicht wurde, NULL, wenn keine signifikanten Veränderungen der Läsion nach einer 30-tägigen Behandlung auftraten.
Die Ergebnisse sind wie folgt:
SEHR GUT: bei 15 Patienten, d.h. 50%,
GUT: bei 11 Patienten, d.h. 36,7%
NULL: bei 4 Patienten, d.h. 13,3%.
Im Fall der Behandlung mit Hyaluronsäure allein oder mit Carnitin allein waren die Ergebnisse bemerkenswert schlechter, derart, dass in nur 16% der Patienten, die für die gleiche Zeitspanne mit Hyaluronsäure behandelt wurden, eine Reaktion, die GUT erreichte, erhalten wurde, wohingegen bei keinem Patienten eine SEHR GUTE Reaktion festgestellt wurde. Ferner zeigten von dem histologischen Standpunkt aus Biopsien aus Patienten, die mit der Kombination aus Hyaluronsäure/Carnitin behandelt wurden, eine Normalisierung der Epidermisschicht, was nicht bei den Kontrollen festgestellt werden konnte.
Schließlich belegte die Verwendung der Kombination von Hyaluronsäure/Carnitin eine therapeutische Wirksamkeit sogar bei den chronischen Geschwüren, d.h. denjenigen, die mindestens ein Jahr vorhanden waren. Nach 23 Wochen waren 89% der Läsionen, die schwieriger zu heilen waren, vollständig geschlossen, im Vergleich mit 15% von denjenigen, die mit der herkömmlichen Therapie, die hauptsächlich im Ausüben von Druck bestand, unter Verwendung von Hyaluronsäure und Feuchthalten der Läsion behandelt wurden.
Keine Komplikationen traten im Wesentlichen im Hinblick auf die vorstehend beschriebenen Symptome auf.
SCHLUSSFOLGERUNGEN
Hinsichtlich der erhaltenen Ergebnisse kann festgestellt werden, dass das vorgeschlagene Behandlungsprotokoll vollständig zufrieden stellend bei nahezu allen Patienten ist, und eine solche Feststellung ist sogar noch signifikanter, wenn man in Betracht zieht, dass eine vorherige medikamentöse Behandlung keine vorteilhaften Ergebnisse zeigte. Die vier Patienten, bei denen keine Ergebnisse (NULL) erhalten wurden, erhielten erfolgreich ein Hauttransplantat.
SICHELZELLANÄMIE
Die im Folgenden beschriebenen Fälle betreffen einige Patienten, die an Drepanocytose leiden, eine Hämoglobinerkrankung, die in afrikanischen Völkern aus den Malaria-Regionen häufig ist, bei der große Geschwürbereiche mit einem Verlust an Substanz bei den unteren Extremitäten offensichtlich sind.
Der Begriff Sichelzellanämie umfasst eine große Gruppe von hämatologischen Erkrankungen mit unterschiedlichen Symptomen und Genotypen. Die herkömmlichste Form ist die homozygote Vererbung für Hämoglobin S (die sich von der Substitution von Glutaminsäure durch Valin in der 6-Position der β-Hämoglobinkette ableitet). Seltener ist eine Sichelzellanämie aufgrund einer doppelten Heterozygose für Hämoglobin S und für Thalassämie oder für Hämoglobin C. Die Bildung von intrazellulären Fasern, die von der Polymerisation von Hämoglobin S abstammen, bewirkt die typische Sicheldeformierung von roten Blutkörperchen. Dies führt zu einer Starrheit von roten Blutkörperchen, was zu Verminderungen der Mikrozirkulation und einem Gefäßverschluss führt. Ferner führen solche strukturellen Veränderungen zu einem verminderten Überleben von roten Blutkörperchen und folglich zu einer chronischen hämolytischen Anämie.
Klinische Manifestationen
Sichelzellanämie tritt innerhalb der ersten zwei Lebensjahre auf. Symptome können in zwei Hauptkategorien eingeteilt werden, diejenigen, die mit Hämolyse in Beziehung stehen, und diejenigen, die von gefäßverschließenden Vorgängen abstammen. Folglich werden starre Gefäßgeschwüre, die gewöhnlich gegenüber den herkömmlichen therapeutischen Behandlungen beständig sind, bei diesen Patienten leicht festgestellt.
Behandlung
Eine Behandlung, die in diesen Patienten mit der Kombination aus Hyaluronsäure/Carnitin erfolgt, führt zu extrem günstigen therapeutischen Ergebnissen mit einer "restitutio ad integrum" des Schadensbereichs innerhalb relativ kurzer Zeitspannen.
HA/CARNITIN-VERSCHLEISS-WIRKUNG
VERFAHREN
Prinzip
Ein Standardverschleißtest, der von Ingenieuren seit vielen Dekaden verwendet wird, ist der Vier-Kugel-Test (Institute of Petroleum; Extreme pressure properties: friction and wear tests for lubricants. Four ball machine in Standard Methods for Analysis of Petroleum and related Products, Band I, Chichester, Wiley, 1990, Seiten 256 ff.). Seine formale Beschreibung als ein einfacher Test für Antiverschleißeigenschaften von Industrieölen und -fetten "unter Hochdruck" – d.h. Hochdruck unter Technikstandards – zeigte, dass es für ein biologisches Schmiermittel viele Größenordnungen zu streng sein könnte, wenn typische Belastungen verglichen werden, die in der Technik und Physiologie angetroffen werden. Es war deswegen am überraschensten und willkommensten, wenn Vorläufe zeigten, dass synthetische Synovialflüssigkeit nicht nur die Tests überlebte, sondern mehrere industrielle Schmiermittel übertraf (Hills B.A. Hyaluronic acid lubricating compounds. AU-PS #620821, 1992). Dieser Test wurde daher als ein Extremtest eingesetzt, der dazu benötigt wurde, Antiverschleißfähigkeiten zu differenzieren.
Vier-Kugel-Test
Die "Vier-Kugel-Hochdruck-Schmiermittel-Maschine" wurde in den Standardtestverfahren (siehe vorstehende Referenz) beschrieben. Falls eine Schmierung unter diesen extremen Belastungen (40 kg vertikale Last) schlecht ist oder nach einer Zeitspanne zusammenbricht, schweißt sodann die vierte Kugel sich an die anderen drei und der Test wird automatisch gestoppt. Ansonsten wird der Lauf für eine Stunde fortgesetzt und die Durchmesser der Kratzer in jeder der zwei Ebe nen, die sich in jeden der drei fixierten Kugeln befinden, dadurch gemessen, dass ein Mikroskop in zwei gegenseitig senkrechten Ebenen geschwenkt wurde. Die Ergebnisse sind als die Mittelwerte der sechs erhaltenen Werte angegeben – dem mittleren Kratzdurchmesser (MSD). Die Gleitgeschwindigkeit beträgt 23,3 cm/s für einen anfänglichen Hertz-Belastung von 3 400 MPa, was sich auf etwa 700 MPa für einen typischen MSD-Wert von 0,8 mm verringert. Dieser Wert entspricht einem Verschleißasymmetrievolumen von etwa 2 × 10^–2 mm³ (Willermet P.A. und Kandah S.J., Wear asymmetry – A comparison of the wear volumes of the rotating and the stationary balls in the four-ball machine. Trans. Am. Soc. Lubricating Eng. 26:173-178, 1982). Der Test wird dreimal mit jeder Probe wiederholt. Die besten Schmieröle ergeben Werte von etwa 0,35 mm, wohingegen die besten wässrigen Schmiermittel einen typischen Bereich von etwa 0,8 bis 0,9 mm aufweisen (Castrol Mean Scar Diameters for Typical Commercial Lubricants. Sidney: Castrol (Australien) Pty.Ltd). Schlechte Schmiermittel wie Wasser oder Kochsalzlösung beenden den Test nicht. Die Kugeln schweißen nach lediglich 10 bis 12 Sekunden zusammen.
Materialien
Die nachstehenden Flüssigkeiten wurden getestet:

1. Synovialflüssigkeit wurde aus dem Kniegelenk von menschlichen Freiwilligen aspiriert. Flüssigkeit mit jeglicher Spur an Blut wurde verworfen. Die Flüssigkeit aller Gelenke wurde gesammelt, um die 9 ml zu erreichen, die für jeden Test benötigt wurden, und wurden sofort für den Test verwendet. Der pH-Bereich des vereinigten Materials betrug 6,5 bis 6,9.
2. Eine Lösung von Hyaluronan (10 mg/ml, Healon, LKB-Pharmacia) wurde auf einen pH-Wert von 6,7 gepuffert.
3. Eine Lösung von Carnitin oder seinen Acylderivaten (d.h. Acetyl-, Propionyl-, Palmitoyl-, etc.) wurde auf einen pH-Wert von 6,7 gepuffert.
4. Eine synthetische Synovialflüssigkeit wurde dadurch hergestellt, das unterschiedliche Mengen an HA und Carnitinen verwendet wurden. Zum Beispiel wurden 10 mg/ml HA und 10 mg/ml Carnitin oder seiner Derivate gemischt und auf einen pH-Wert von 6,7 gepuffert.

Tabelle 3. Durchschnittliche Kratzerdurchmesser
Ergebnisse und Diskussion
Da Schmiermittel, die eine Reibung vermindern, nicht notwendigerweise einen Verschleiß vermindern, haben wir die neue Eigenschaft einer chemischen Assoziation zwischen HA und Derivaten behandelt, um signifikant Verschleiß zu vermindern.
Der Wert für eine Synovialflüssigkeit erreichte denjenigen für die besten Schmieröle, 0,35 mm, und übertraf Werte für "Grundstock"-Schmieröle. Sogar noch eindrucksvoller war die Tatsache, dass der MSD-Wert von 0,66 mm geringer war als derjenige eines jeglichen käuflichen Schmiermittels auf Wasserbasis. Während HA oder Carnitine allein keine offensichtlichen Antiverschleißeigenschaften unter diesen Bedingungen aufwiesen, wurde, wenn HA mit Carnitinderivaten verwendet wurde, ein MSD-Wert festgestellt, der ähnlich zu dem Wert ist, der für Synovialflüssigkeit gemessen wurde. Zum Beispiel wurde in Gegenwart von Palmitoyl-L-Carnitin und HA ein Wert von 0,51 mm erhalten. Eine statistische Analyse zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen den Werten für Acetyl-, Propionyl- oder Palmitoyl-L-Carnitin, obwohl die Ergebnisse mit Palmitoyl-L-Carnitin die wohl besten wahren. Auf der anderen Seite zeigten Carnitin und HA einen schlechteren MSD-Wert von 1,57 mm, was zeigt, dass die Acylreste für die Antiverschleißeigenschaften wichtig waren.
Die MSD-Werte für das Gemisch aus HA und Carnitinderivaten könnten lediglich der Ereichung eines Synergismus zwischen den zwei Komponenten zuordenbar sein. Außerdem zeigte, wenn ein Koeffizient der Gleitreibung unter Last gemessen wurde, das gleiche Gemisch eine hervorragende Schmiermitteleigenschaft, was Koeffizienten einer Gleitreibung von so niedrig wie 0,002 bis 0,005 unter Hochlast, d.h. innerhalb des physiologischen Bereichs, ergab.
TROPHISCHE EIGENSCHAFTEN VON HA/CARNITIN AUF KNORPELGEWEBE
Materialien und Verfahren
Knorpelgewebeprobenvorbereitung
35 Patienten wurden in die Untersuchung eingeschlossen. Ausschlusskriterien waren Sepsis, Bindegewebserkrankungen, rheumatoide Arthritis, Kristallablagerungserkrankungen, bekannte heriditäre oder kongenitale Erkrankungen, Immobilisierung für mehrere Wochen als auch Behandlung mit Corticosteroiden und cytotoxischen Arzneimitteln.
Kulturverfahren
Gewebsproben, die von jedem Donor erhalten wurden, wurden in Stücke von 3 bis 6 mg in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), mit Penicillin (5 000 I.U. ml^–1) supplementiert, geschnitten. Das Gewebe wurde 3-mal mit diesem Kulturmedium gewaschen. Knorpelstücke wurden zufällig entnommen, gewogen und in die unterschiedlichen Wells von Multiwellkulturplatten (typischerweise 30 bis 60 mg Gewebe/Well) gegeben. Zusätzliche Stücke wurden nicht kultiviert, sondern bei -20°C gelagert, um den Anfangsgehalt an Proteoglykanen (PG) und HA des Knorpels zu bestimmen. Kulturmedium, mit 20% (v/v) fötalem Kälberserum supplementiert, (Kulturmedium A) wurde sodann zu jedem Well gegeben und die Kulturplatten wurden in einem 90%:10% (v/v) Luft:CO₂ befeuchteten Inkubator 48 Stunden bei 37°C gegeben.
Für jedes Experiment wurde der Knorpel von einem Individuum verwendet und Gewebskulturen erfolgten 3fach: d.h. für die Kontrollkultur als auch für jeweils HA, Acetylcarnitin (ALC) oder HA + ALC wurden 3 Knorpelexplantate getrennt kultiviert. Angegebene Werte sind der Mittelwert der 3fachen Kulturen.
Pulsuntersuchungen
Nach zwei Tagen Kultur wurde das Kulturmedium abgesaugt und die Explantate wurden dreimal mit 1 ml DMEM gewaschen. Die Explantate wurden in 5% FCS-Kulturmedium (1 ml 50 mg^–1 Gewebe), mit ³H-Glucosamin (50 μCi ml^–1) supplementiert, (Kulturmedium B) wieder suspendiert. Zu jedem Well wurde eine Lösung aus HA, Acetylcarnitin (ALC) oder HA + ALC gegeben (10 ml/ml in Kulturmedium), um die Endkonzentration von 100 μg HA und 100 μg ALC zu erreichen. Die Kontrollkultur erhielt Medium allein. Kulturwells wurden sodann 12 Stunden inkubiert.
Begleituntersuchungen
Nach einem Tag Kultur in Medium A wurden die Knorpelstücke mediumfrei gesaugt, dreimal mit 1 ml DMEM gewaschen, in Kulturmedium B (1 ml 50 mg^–1 Gewebe) wieder suspendiert und 12 Stunden kultiviert. Nach Pulsmarkierung wurden die Knorpelstücke mit DMEM gewaschen und in Kulturmedium A wieder suspendiert. Medium allein oder die geeigneten Moleküle (HA, ALC oder HA + ALC), gelöst in Medium, wurden zu jedem Well (10 μl ml^–1), wie vorstehend beschrieben, gegeben und eine nicht radioaktive Begleitphase erfolgte 24 Stunden.
Isolierung und Aufreinigung von Hyaluronan und Proteoglykanen
Am Ende der Pulsmarkierungs- und nicht radioaktiven Begleitzeitspannen wurden die Kulturmedien entfernt und die Knorpelstücke wurden mit 0,15 M Natriumchlorid/0,05 M Natriumacetat, pH-Wert von 6,0 (Puffer A), gewaschen. Medien und entsprechende Waschlösungen wurden vereinigt. Rindernasal-PGs (500 μg ml^–1) und Hyaluronan (10 μg ml^–1) wurden zugegeben. Die Gemische wurden gegen Puffer A dialysiert und sodann mit Papain (10 mg ml^–1) 24 Stunden bei 60°C inkubiert. Knorpelproben wurden sodann in Puffer A wieder suspendiert. Papain wurde zu jedem Fläschchen (0,1 mg ml^–1) gegeben und das Gewebe wurde 24 Stunden bei 60°C verdaut. Proben wurden für eine Hydroxyprolin-Bestimmungen entnommen oder einer Ionenaustauschchromatographie auf einer Econo-Pak Q-Kartusche unterzogen.
Die Econo-Pak Q-Säule (5 ml) wurde vorher in Puffer A bei einer Flussrate von 2 ml min^–1 äquilibriert. Aliquots an Papain-verdauten Proben (100 bis 200 μl für einen Gewebsverdau und 0,5 bis 1 ml für Mediumverdauansätze) wurden auf 2 ml mit Puffer A eingestellt und auf die Säule gegeben, die sodann mit 6 Säulenvolumina Puffer A gewaschen wurde. Anionische Makromoleküle wurden von der Säule bei 2 ml min^–1 mit dem folgenden NaCl-Gradienten (0,15 bis 0,23 M über 2 min Laufzeit, 0,23 bis 0,23 M über 15 Minuten, 0,23 bis 1,5 M über 15 min) in 0,05 M Na-Acetat mit einem pH-Wert von 6,0 eluiert. Fraktionen zu 2 ml wurden gesammelt und hinsichtlich Radioaktivität untersucht. Die Ausbeute an Radioisotop in den vereinigten Durchlauf und Gradientfraktionen betrug >90%.
Zwei ³H-radiomarkierte Peaks wurden konsistent von der Säule eluiert: Peak A bei 0,23 M NaCl und Peak B bei etwa 1 M NaCl. Für jede Probe (Gewebe und Medien) wurden Fraktionen mit radiomarkierten Peaks getrennt gesammelt, auf 80°C 10 Minuten erhitzt und auf eine Säule (0,7 × 50 cm) aus Sephadex G-50, die in 0,1 M Ammoniumbicarbonat-Puffer mit einem pH-Wert von 8,5 äquilibriert war, gegeben. In jedem Fall eluierte mehr als 90% des radiomarkierten Materials, das in beiden Peaks A und B vorhanden war, bei dem Ausschlussvolumen der G-50-Säule. Folglich wurden Aliquots von Peaks A und B mit Streptomyces-Hyaluronidase (0,1 U/Aliquot in 0,05 M Na-Acetat mit einem pH-Wert von 5,0, 6 Stunden bei 60°C) und Chondroitinase ABC (0,5 U/Aliquot in 0,1 M Tris-Fluorid, pH-Wert von 8,0, 6 Stunden bei 37°C) verdaut und die Verdauprodukte wurden auf die G-50-Säule gegeben. Auf der anderen Seite sind die Verdauprodukte der Chondroitinase ABC auch in der G-50-Säule eingeschlossen, aber im Gegensatz zu der Streptomyces-Hyaluronidase verdaut Chondroitinase ABC sowohl HA als auch Chondroitin-Ketten. Demzufolge wurde die Menge an [³H]-HA, die in jedem Peak vorhanden war, dadurch berechnet, dass die Gesamtradioaktivität des Peaks mit dem relativen Prozentsatz an radiomarkiertem Material, das gegenüber Streptomyces-Hyaluronidase empfindlich war, multipliziert wurde, während die Menge an [³H]-PG, das in jedem Peak vorhanden war, dadurch berechnet wurde, dass die Gesamtradioaktivität des Peaks mit dem relativen Prozentsatz an radiomarkiertem Material, das gegenüber einem Verdau mit Streptomyces-Hyaluronidase beständig und einem Verdau mit Chondroitinase ABC zugänglich war, multipliziert wurde.
Analytische Verfahren
Hydroxyprolin wurde durch das Verfahren von Woessner bestimmt und Hexoronatsäure durch das Verfahren von Bitter & Muir. HA wurde durch ein spezifisches Radiosorbent-Testverfahren quantifiziert.
Wiedergabe der Ergebnisse und Statistiken
Die Geschwindigkeit einer Biosynthese von PG und HA wurde durch die Summe der [³H]-PG- und [³H]-HA-Zerfälle pro Minute (d.p.m.), die in den Papain-verdauten Geweben und Medien am Ende des 12-stündigen Pulsmarkierungszeitraums festgestellt wurden, bestimmt und als d.p.m. [3H]-PG und [3H]-HA pro Stunde und pro mg an Hydroxyprolin wiedergegeben. Tatsächlich betrug der Verlust an Hydroxyprolin (und folglich an Collagen) von den Gewebsproben in das Medium über einen 72-stündigen Kulturzeitraum weniger als 5% der Menge, die in den Knorpelstücken vor einer Kultur vorhanden war. Am Ende des 24-stündigen nicht radioaktiven Begleitzeitraums wurde der Gesamteinbau an [³H]-Glucosamin in HA und PGs durch die Summe an d.p.m. von [3H]-HA und [³H]-PGs, die in den Medien und entsprechenden Papain-verdauten Gewebsproben festgestellt wurden, bestimmt. Die statistische Signifikanz der zwischen den Gruppen festgestellten Unterschiede wurde durch den Mann-Whitney U-Test bewertet, wohingegen in jeder Gruppe die Signifikanz der Unterschiede beim PG- und HA-Metabolismus in Gegenwart von unterschiedlichen Konzentrationen an Carnitin ± HA durch den Wilcoxon-Vorzeichenrang-Test bewertet wurde.
Ergebnisse und Diskussion
Die PG- und HA-Gehalte von Knorpelproben waren über einen großen Bereich von Werten verteilt (Mittelwert ± SA = 0,77 ± 0,09 bzw. 0,05 ± 0,03 für den PG- bzw. HA-Gehalt). In den unterschiedlichen Puls- und Begleitexperimenten, die ohne und mit den zu testenden Verbindungen erfolgten, ergab eine Analyse der Gewebs- und Medienproben die nachstehenden Ergebnisse: 50 bis 70% des in Peak A vorhandenen markierten Materials war empfindlich gegenüber Streptomyces-Hyaluronidase und wurde folglich als [3H]-HA identifiziert. Auf der anderen Seite wurde das gesamte in Peak B vorhandene markierte Material als Chondroitinsulfat (und folglich als Proteoglykane) identifiziert, da es durchweg beständig gegenüber einem Verdau mit Streptomyces-Hyaluronidase und einem vollständigen Verdau mit Chondroitinase empfänglich war. Ohne HA und/oder Acetyl-L-Carnitin (ALC) waren die Geschwindigkeiten einer PG- und HA-Synthese über einen spezifischen Bereich von Werten verteilt (38,11 ± 8,1 für die PG-Synthese und 3,9 ± 0,8 für die HA-Synthese). Wenn markierte Knorpelexplantate ohne Arzneimittel kultiviert wurden, betrug der Nettoverlust an [³H]-HA- und [³H]-PG-Molekülen 33,5 ± 7,3 bzw. 25,3 ± 5,9.
Mit HA oder Acetylcarnitin allein wurde eine leichte Zunahme der PG- und HA-Synthese beobachtet, aber lediglich das Vorhandensein beider Moleküle gleichzeitig war fähig, die Synthese von PGs und HA signifikant zu erhöhen (Tabelle 4). In normalem Knorpel erzeugten 100 μg HA bzw. ALC eine statistisch signifikante Zunahme hinsichtlich des Gewebsgehalts an markierten HA und PGs (p < 0,001). Außerdem induzierte HA zusammen mit ALC eine signifikante Veränderung hinsichtlich des Nettoverlusts an markierten PGs und HA (p < 0,01) von dem Knorpel während des 24-stündigen Begleitzeitraums (Tabelle 5), während HA oder ALC allein lediglich den Nettoverlust von markiertem HA verminderten.
Diese Ergebnisse stellen zum ersten Mal einen Beweis dafür bereit, dass im Gelenkknorpel die chemische Assoziation von HA und ALC begleitend fähig ist, eine HA- und PG-Synthese zu erhöhen und den Verlust an neu synthetisierten HA-Molekülen aus dem Gewebe zu vermindern. Tatsächlich führt das negative metabolische Gleichgewicht von HA zu Osteoarthritis (OA) genauso wie Veränderungen bei dem normalen Gelenkgewebe, da die OA-Knorpelmatrix durch eine progressive Abreicherung ihres HA-Gehalts charakterisiert ist. Demzufolge ist die Erhöhung der PG-Synthese ohne eine jegliche Verminderung hinsichtlich des Nettoverlusts an PGs eine vorteilhafte Wirkung, da die Verminderung bei der Konzentration von PGs proportional zu der Schwere des OA-Prozesses ist.
Tabelle 4
Die Zugabe der zwei Komponenten getrennt voneinander (in diesem Fall ist eine jegliche chemische Wechselwirkung extrem unwahrscheinlich oder zufällig in wässrigen Umgebungen, in die die Moleküle gegeben werden) zeigte keine agonistische Wirkung der zwei Substanzen. Auf der anderen Seite ist die Dissoziationskinetik der chemischen Wechselwirkungen zwischen HA und Carnitinderivaten, die in geeigneten in vitro-Bedingungen erhalten wird, auch in Gegenwart von Wasser extrem langsam und scheint mit der Gegenwart von Acylresten in Beziehung zu stehen. Dies impliziert, dass eine jegliche Grenzschmierung des Gelenks tatsächlich eine Unterart ist, die in der Technik als "lamellierte Feststoffschmierung" bekannt ist. Schließlich hängen die zusätzlichen biologischen Wirkungen, die in unserer Verbindung im Vergleich zu der einfachen Kombination der zwei Produkte vorhanden sind, wahrscheinlich mit der Gegenwart dieser neuen chemischen Spezies in der Zellmikroumgebung zusammen.
Beispiele für erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen werden im Nachstehenden beschrieben.

– 1- bis 2-ml-Röhrchen für eine intraartikuläre Injektion, die enthalten:
A) 2 bis 5 mg HA + 2 bis 5 mg L-Carnitin (oder Acetyl-, Propionyl-, Palmitoyl-L-Carnitin) oder
B) 4 bis 10 mg eines 1:1 (w/w)-Komplexes von HA/L-Carnitin (oder HA/Acetyl-, Propionyl-, Palmitoyl-L-Carnitin), wobei die Injektion einmal oder mehrere Male in einer Woche verabreicht wird,
– Kapseln für die orale Verabreichung, die enthalten:
C) 0,5 bis 2 g HA + 0,5 bis 2 g L-Carnitin (oder Acetyl-, Propionyl-, Palmitoyl-L-Carnitin) oder
D) 1 bis 4 g eines 1:1 (w/w)-Komplexes von HA/L-Carnitin (oder HA/Acetyl-, Propionyl-, Palmitoyl-L-Carnitin), wobei die Tabletten ein- bis dreimal täglich im Fall von Crohn-Krankheit, eitriger Rektokolitis, Zöliakie verabreicht werden,
– Gel für die topische Verabreichung, das enthält:
E) 1 bis 5% HA + 1 bis 5% L-Carnitin (oder Acetyl-, Propionyl-, Palmitoyl-L-Carnitin) oder
F) 2 bis 10% eines 1:1 (w/w)-Komplexes von HA/L-Carnitin (oder HA/Acetyl-, Propionyl-, Palmitoyl-L-Carnitin), das ein- bis dreimal täglich auf die Entzündungsfläche aufgetragen werden soll.

Beispiele für erfindungsgemäße kosmetische Zusammensetzungen sind Gele, die zu E) und F) ähnlich sind, oder Lotionen, Cremes, Schönheitsmasken und dergleichen mit ähnlichen Mengen der zwei Komponenten Hyaluronsäure/L-Carnitin (oder Acetyl-, Propionyl- oder Palmitoyl-L-Carnitin) oder vorzugsweise der entsprechenden erfindungsgemäßen Komplexe.

Claims

Komplexe von Hyaluronsäure mit Carnitin oder Acylcarnitinen.
Komplexe von Hyaluronsäure mit L-Carnitin oder Acyl-L-carnitinen.
Komplexe von Hyaluronsäure mit einem Acyl-L-carnitin, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acetyl-L-carnitin, Propionyl-L-carnitin und Palmitoyl-L-carnitin.
Komplexe nach den Ansprüchen 1 bis 3, wobei Hyaluronsäure eine massegemittelte Molekülmasse (M_w) von etwa 2 × 10⁵ bis 3 × 10⁶ aufweist.
Komplexe nach den Ansprüchen 1 bis 4, wobei die zwei Komponenten in Gewichtsverhältnissen von 1:3 bis 3:1 vorliegen.
Komplexe, wie in Anspruch 3 beansprucht, wobei die zwei Komponenten in gleichen Gewichtsmengen vorliegen.
Komplexe, wie in der Ansprüchen 1 bis 5 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, dass Hyaluronsäure eine massegemittelte Molekülmasse (M_w) von etwa 2 × 10⁵ bis etwa 3 × 10⁶ aufweist.
Verfahren zur Herstellung der Komplexe, wie in den vorstehenden Ansprüchen beansprucht, dadurch gekennzeichnet, dass die zwei Komponenten in einem Lösungsmittel gemischt werden und das Gemisch einer Sonifizierung und sodann einer Zentrifugation unter Wiedergewinnung des Überstands unterzogen wird.
Verfahren, wie in Anspruch 8 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel aus Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei im Wesentlichen neutralen pH-Wert besteht.
Verfahren, wie in Anspruch 8 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel aus Ethanol/PBS besteht.
Verfahren, wie in den Ansprüchen 8 bis 10 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonifizierung für einen Zeitraum von 5-120 Minuten bei 50-150 W erfolgt.
Verfahren, wie in Anspruch 11 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonifizierung für einen Zeitraum von 10-30 Minuten erfolgt.
Verfahren, wie in den Ansprüchen 8 bis 12 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonifizierung bei einer Temperatur von 15-50°C erfolgt.
Verfahren, wie in den Ansprüchen 8 bis 13 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, dass die Zentrifugation bei etwa 3000 g für einen Zeitraum von 5-30 Minuten erfolgt.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die einen oder mehrere wie in den Ansprüchen 1 bis 7 beanspruchte Komplexe enthalten.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, wie in Anspruch 15 beansprucht, mit einer schützenden Aktivität auf Gewebe und Zell-Plasmamembran und antiphlogistischen und Radikal-abfangenden Aktivitäten.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, wie in Anspruch 15 beansprucht, für eine Verwendung bei der Therapie von Synovitis und Gonarthrose, Crohn-Krankheit, Rektokolitis und Zöliakie.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, wie in Anspruch 15 beansprucht, für eine Verwendung bei der Therapie von Pathologien des Hornhautepithels.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, wie in Anspruch 15 beansprucht, für die Therapie von Geschwüren der unteren Extremitäten.
Zusammensetzungen, die die Komplexe, wie in den Ansprüchen 1 bis 7 beansprucht, enthalten, für die orale Verabreichung in Form von alimentären Ergänzungen.
Zusammensetzungen, wie in Anspruch 20 beansprucht, die ferner Vitamine, Coenzyme, mineralische Substanzen und Antioxidanzien enthalten.
Kosmetische Zusammensetzungen, die die Komplexe, wie in den Ansprüchen 1 bis 7 beansprucht, enthalten.