ES2228128T3 - Complejos de acido hialuronico/carnitinas y composiciones farmaceuticas y cosmeticas. - Google Patents
Complejos de acido hialuronico/carnitinas y composiciones farmaceuticas y cosmeticas.Info
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Abstract
Complejos de ácido hialurónico/carnitinas y composiciones farmacéuticas y cosméticas. La presente invención se refiere a complejos de ácido hialurónico y ¿carnitinas¿, este último término significa en la presente memoria descriptiva carnitina como tal y, más específicamente, sus derivados acilo con ácidos carboxílicos alifáticos de cadena lineal o ramificada, opcionalmente insaturados o poliinsaturados, que contienen de 2 a 20 átomos de carbono. Aunque los complejos según la invención pueden contener, como componente de carnitina, DL-carnitina o mezclas de D y L carnitina en proporciones variables, así como los derivados acilo relacionados como se ha indicado antes, la forma de realización preferida se refiere a complejos de ácido hialurónico y L-carnitina o de acil-L-carnitina, en el que ¿acil¿ tiene los significados definidos anteriormente. Por tanto, en la presente invención, ¿carnitina¿ significará, a menos que se indique otra cosa, L-carnitina; los mismo se aplica a las diversas acilcarnitinas que se citarán a continuación. En la presente memoria descriptiva, ¿ácido hialurónico¿ significará un ácido hialurónico de peso molecular variable desde aproximadamente 2 x 103 aproximadamente 5 x 106, preferentemente de aproximadamente 2 x 105 a aproximadamente 3 x 106.
Description
Complejos de ácido hialurónico/carnitinas y
composiciones farmacéuticas y cosméticas.
La presente invención se refiere a complejos de
ácido hialurónico y "carnitinas", este último término
significa en la presente memoria descriptiva carnitina como tal y,
más específicamente, sus derivados acilo con ácidos carboxílicos
alifáticos de cadena lineal o ramificada, opcionalmente insaturados
o poliinsaturados, que contienen de 2 a 20 átomos de carbono.
Aunque los complejos según la invención pueden
contener, como componente de carnitina,
DL-carnitina o mezclas de D y L carnitina en
proporciones variables, así como los derivados acilo relacionados
como se ha indicado antes, la forma de realización preferida se
refiere a complejos de ácido hialurónico y
L-carnitina o de
acil-L-carnitina, en el que
"acil" tiene los significados definidos anteriormente. Por
tanto, en la presente invención, "carnitina" significará, a
menos que se indique otra cosa, L-carnitina; los
mismo se aplica a las diversas acilcarnitinas que se citarán a
continuación.
En la presente memoria descriptiva, "ácido
hialurónico" significará un ácido hialurónico de peso molecular
variable desde aproximadamente 2 x 10^{3} aproximadamente 5 x
106, preferentemente de aproximadamente 2 x 10^{5} a
aproximadamente 3 x 10^{6}.
Como se hace evidente de lo que se ha indicado
antes, ambos componentes de los complejos según la invención son
conocidos por sí mismos. La información en cuanto al ácido
hialurónico así como las numerosas referencias acerca de la
carnitina (página 281) y acetilcarnitina (página 13) se pueden
encontrar, entre otros, en el Índice de Merck, 11ª
edición, páginas 751, 281 y 13, respectivamente; mientras que las
acilcarnitinas y/o el uso de las mismas son objeto de una serie de
patentes (véase, por ejemplo, los documentos US 4.346.107, US
4.194.006, US 4.343.816).
El documento EP 0 951 909 describe combinaciones
de L-carnitina y derivados con ácido hialurónico,
que son antiinflamatorios y protectores de cartílago.
Las indicaciones terapéuticas de los componentes
citados también son bien conocidas. En particular, el ácido
hialurónico se usa como coadyuvante en el tratamiento de la
sinovitis y en los procesos de reparación tisular.
En la actualidad se ha descubierto que los
complejos (o incluso las simples combinaciones) de ácido
hialurónico y "carnitinas" (que quiere decir carnitina como
tal y sus derivados acilo) pueden estar en forma de y actuar como
un complemento alimentario o un medicamento real, según su acción
favorable, preventiva o terapéutica, que se pretende que dichos
complejos o combinaciones ejerzan, en función de los usuarios
finales específicos.
Además, se ha descubierto que dichos complejos y
combinaciones pueden ser valiosos en la cosmética.
De hecho, los complejos y las combinaciones
indicados anteriormente poseen: a) una mayor actividad protectora
sobre los tejidos y la membrana plasmáticas de las células, b)
actividades antiinflamatorias y antioxidantes; c) actividad
antienvejecimiento, en particular actividades de restauración o
mantenimiento de la elasticidad de la piel; d) una acción general
trófica, de importancia cosmética. En particular, los complejos y
las combinaciones según la invención son adecuadas para el
tratamiento de la sinovitis y la gonartrosis, la enfermedad de
Crohn, la rectocolitis ulcerosa y la enfermedad celíaca. Dichas
actividades pueden ser más o menos marcadas, dependiendo de la única
"carnitina" usada.
Por tanto, otro objeto de la invención son las
composiciones farmacéuticas y cosméticas que contienen como
ingrediente activo: a) combinaciones de ácido hialurónico y
carnitina o acilcarnitina o b) según un aspecto preferido de la
invención, complejos de ácido hialurónico y carnitina o
acilcarnitina, donde dichas combinaciones y complejos contienen los
dos componentes en proporciones en peso variables de 3:1 a 1:3,
preferentemente en proporciones equiponderales.
Más particularmente, un objeto de la invención
son composiciones farmacéuticas que contienen como ingrediente
activo las combinaciones a) o los complejos b) definidos
anteriormente, con actividad protectora sobre los tejidos y las
membranas plasmáticas celulares; con actividades antiinflamatorias y
antioxidantes; para el tratamiento de sinovitis y gonartrosis; para
el tratamiento de la enfermedad de Crohn, la rectocolitis ulcerosa
y la enfermedad celíaca; es más, composiciones cosméticas que
contienen las combinaciones a) o los complejos b), con actividad
antienvejecimiento, actividades de restauración y de mantenimiento
sobre la elasticidad de la piel y una acción trófica general.
Como ya se ha mencionado, la carnitina y las
acilcarnitinas contenidas en las composiciones farmacéuticas y
cosméticas mencionadas anteriormente son, preferentemente,
L-carnitina y
acil-L-carnitina. En particular se
prefieren acetil-L-carnitina,
propionil-L-carnitina y
palmitoíl-L-carnitina.
Los complejos de la invención contienen los dos
componentes en proporciones ponderales variables de 1:3 a 3:1,
preferentemente en proporciones equiponderales. Se obtienen
mediante: a) la adición de ácido hialurónico a una suspensión o una
solución de acilcarnitina (o carnitina) en PBS y/o etanol (suero
salino tamponado con fosfato), en agitación enérgica, a una
temperatura de 20-60ºC, b) la adición de
acilcarnitina (o carnitina) a una solución de ácido hialurónico en
PBS, sometiendo todo, en primer lugar, a ultrasonidos a
temperaturas variables de entre 10 y 30ºC, preferentemente a
15-20ºC, después a centrifugación, con recuperación
del sobrenadante. Se ha probado que el producto resultante es un
complejo real por medio de las determinaciones
químico-físicas que se describirán a
continuación.
El procedimiento para la preparación de los
complejos de la invención se ilustra en los siguientes ejemplos no
limitantes. A continuación, el ácido hialurónico se denominará AH.
Además, AH significará un ácido hialurónico de peso molecular
variable desde aproximadamente 2 x10^{5} a aproximadamente 3 x
10^{6}, como el ácido y como las sales de metales alcalinos o
alcalino-térreos.
Se disolvió
palmitoíl-L-carnitina (PC) en etanol
absoluto, después la solución se añadió a una solución de PBS (pH
7,4) para obtener concentraciones finales de PC de 0,1 y 0,5 y 1
mg/ml. Las suspensiones resultantes se agitaron en vórtex durante 3
minutos a temperatura ambiente, después se dejaron en agitación
durante 1 hora a 50ºC. Durante este tiempo, a la suspensión se
añadió lentamente ácido hialurónico (AH) en polvo de diferentes
pesos moleculares (2 x 10^{5} a 3 x 10^{6}) hasta alcanzar una
concentración final de 0,1, 0,5 y 1 mg/ml. En cada adición de AH,
la muestra se agitó en vórtex durante al menos 1 minuto y después se
incubó en las mismas condiciones de temperatura.
A una solución de PBS se añadió PC en polvo y
después, la suspensión resultante se sometió a ultrasonidos en frío
durante un tiempo variable desde 5 a 15 minutos. Posteriormente se
añadió AH y la mezcla resultante se agitó en vórtex durante algunos
minutos, después se incubó en agitación durante aproximadamente una
hora a temperaturas que varían desde 21ºC a 50ºC.
A una solución de 2 ml de AH con peso molecular
3,4 x 10^{6} ó 2 x 10^{5}, respectivamente, en PBS (1 mg
ml^{-1}) se añadió una alícuota de PC (20 \muM) en etanol (20
\mul). Los componentes se mezclaron durante 15-20
minutos a 20ºC en un baño de agua con ultrasonidos, a 100 W. Las
soluciones opalescentes resultantes se centrifugaron (3000 g)
durante 10 minutos y se separaron los sobrenadantes. Está solución
no mostró ningún signo de separación de fases, incluso después de
haber estado en reposo a 4ºC durante varios días.
Con el fin de determinar los efectos de los
ultrasonidos sobre el AH solo, el protocolo usado anteriormente
(Ejemplo 3) se repitió durante periodos de hasta 2 h en ausencia de
PC. A continuación, una alícuota (0,5 ml) de la solución resultante
sometida o no a ultrasonidos (1 mg ml^{-1}) en PBS (pH 7,2) que
contenía 20 \mul de etanol se aplicó a una columna de filtración
en gel de sefarosa CL-2B (30 x cm) equilibrada con
el mismo tampón. La columna se eluyó a 3-6 ml/h con
PBS, y los niveles de AH en las fracciones recogidas se
determinaron mediante análisis con hexuronato usando el
procedimiento de Blumenkranze y Asboe-Hansen.
Mezclas de AH (1 mg ml-1 en PBS)
y PC-^{3}H etanólico (20 \mul; 20 \muM) se
sometieron a ultrasonidos durante 2 horas usando el protocolo
descrito anteriormente. Los sonicados se fraccionaron en una columna
de sefarosa CL-2B (1 x 60 cm) eluyendo a 3,6 ml
h^{-1} con PBS como tampón de elución. Las fracciones (1 ml) se
recogieron y analizaron para detectar ácido hexurónico y
radioactividad (desintegración por minuto) mediante espectrometría
por centelleo.
En estos experimentos se usó un fotómetro MALLS
junto con un detector del índice de refracción (IR), una columna de
permeación en gel de superosa 6 HR30 (GPC) y una bomba de
reciprocidad de pistón doble P500. Las mezclas de AH (1,0 mg
ml-1 en PBS) y PC (20 \mul; 20 \muM en etanol)
se sometieron a ultrasonidos durante 0, 15, 30, 60 ó 120 minutos.
Después, las soluciones se diluyeron con un volumen igual de PBS,
se centrifugaron (3000 g) y el sobrenadante se aplicó a la columna
6 de superosa, eluyendo a 24 ml h^{-1} con tampón PBS usando la
bomba P500. Las fracciones se examinaron en serie con el fotómetro
MALLS y el detector de IR. Todos los experimentos se llevaron a cabo
por triplicado. El peso molecular promedio en número (Mn), el peso
molecular promedio en peso (Mw), el peso molecular promedio en Z
(Mz) y la raíz cuadrada media (RCM) de los radio calculada para
cada uno de estos parámetros se determinaron a partir de la
cantidad de variación angular de la luz dispersada para las
fracciones eluidas de la columna. La proporción Mw/Mn se usó para
valorar la polidispersidad molecular.
Se obtuvo la RMN-^{1}H de alta
resolución (199,5 MHz) de las muestras usando un espectrómetro
JEOLFX-200 en modo de transformada de Fourier. Las
muestras se introdujeron en tubos de vidrio Wilmard de 10 mm junto
con un tubo coaxial de 5 mm con tetrametilsilano en óxido de
deuterio. Esto se usó cono una referencia de integración externa.
La temperatura de la muestra se mantuvo a 37ºC. Toda las muestras
se desgasificaron con argón antes de proceder a las mediciones. La
movilidad conformacional (flexibilidad) de la solución de AH se
determinó usando un procedimiento que requirió la determinación de
la anchura de la línea a la altura de la mitad del pico (-V ½) para
la resonancia de metil protón de los residuos de
acetamidodesoxiglucosa de los espectros RMN-^{1}H
del hialuronato.
Los espectros de desacoplamiento de protón
RMN-^{13}C (50,1 MHz) de las preparaciones de AH
(10% p/v) disueltas en D_{2}O se obtuvieron usando un
espectrómetro JEOLFX-200 FT. Las muestras se
introdujeron en tubos de vidrio Wilmard de 10 mm en los que se
había colocado un tubo coaxial de 4 mm con acetonitrilo como
referencia externa. La temperatura de la muestra se mantuvo a 37ºC
y se usaron una anchura del espectro de 1 kHz y 6000 puntos de
datos.
La cromatografía de los sonicados de AH con
PC-^{3}H en las mismas condiciones que el AH solo
mostró que, aunque la mayoría del PC marcado radioactivamente
apareció en el volumen total (V_{L}), una porción del PC marcado
radioactivamente aplicado eluyó a V_{0}. El
PC-^{3}H eluyó en fracciones que correspondían en
gran medida a las fracciones de AH de mayor peso molecular.
Aunque los ultrasonidos del AH disminuye de
progresiva los Mn, Mw y Mz con respecto al AH no sometido a
ultrasonidos (nativo) (Mw= 3,4 x 10^{6}), estos parámetros fueron
mayores en los correspondientes sonicados en los que se había
incluido PC. Los radios RMS correspondientes también fueron
consistentemente superiores que en los sonicados de AH sin PC, pero
la polidispersidad (Mw/Mn) era independiente de la presencia de PC
o del tiempo de ultrasonidos.
Los valores RMN-^{13}C de
desplazamiento químico para el AH muestran que los valores para los
carbonos del anillo de la unidad repetitiva del disacárido
N-acetilglucosamina y ácido glucurónico de AH eran
comparables en todas las preparaciones, lo que confirma que las
estructuras primarias son idénticas. Los ultrasonidos de una
preparación con AH de alto peso molecular o AH de bajo peso
molecular con PC durante periodos de tiempo de hasta 2 h aumentaron
marcadamente la proporción de dominios flexibles presentes, como se
determina a partir de los valores de la anchura de línea de los
protones de acetamidometilo en sus respectivos espectro de
RMN-^{1}H. En los experimentos control en los que
se omitió el PC y se aplicaron ultrasonidos durante los mismos
periodos de tiempo, se observó una ligera disminución del
porcentaje de flexibilidad de las preparaciones de AH.
Los efectos de la variación de las
concentraciones de AH sobre el porcentaje de segmentos flexibles y
rígidos presente en la solución de AH sometida a ultrasonidos
durante 60 minutos en presencia de PC mostraron que las
proporciones relativas presentes no cambiaron de forma sustancial en
un intervalo de diez veces la dilución.
Una reacción inflamatoria cutánea específica,
causada por diferentes factores proinflamatorios de origen exógeno
y endógeno, incluida la formación de radicales libres,
lipoperóxidos, prostaglandinas y citocinas, es la inducida mediante
inyección intradérmica de ditranol, como describe Mustakallio
(Mustakallio K., DERMATOVENER, 54, 125, 1979).
El ditranol se inyecta por vía intradérmica a
dosis de 20 \mug en el lomo de cobayas que se han afeitado
previamente. En el lado opuesto al lomo, antes de la inyección de
la misma cantidad de ditranol, se extienden AH solo o
acetil-L-carnitina sola (AC) o AH y
AC juntos o el complejo AH y AC.
Para diseminar estos compuestos se usa una mezcla
de lanolina y monoestearato de etilenglicol. Después de 48 horas de
este tratamiento, mediante la evaluación del área de inflamación
cutánea inducida por ditranol se probó que el AH es capaz de
inhibir el área de inflamación aproximadamente un 30%. Por el
contrario, el AL solo no posee actividad protectora alguna.
La combinación de AC y AH induce un efecto
inhibidor más evidente sobre la inflamación inducida por
ditranol.
La administración simultánea de AC y AH induce un
efecto inhibidor en la superficie del área de inflamación de
aproximadamente el 50%. Cuando se usa el complejo de AH que
contienen la misma cantidad de AH y AC se hace evidente de forma
global una inhibición muy significativa (alrededor del 75%).
Mediante estos experimentos se probó el
sorprendente y potente efecto protector inducido por el complejo
AH/AC en comparación con el ejercido por los compuestos únicos
solos o juntos (Tabla 1).
Este efecto inesperado y sorprendente ejercido
por el complejo de AH y AC en comparación con sus componentes
usados solos o juntos, se ha demostrado con otra prueba diferente,
la de la teleocidina, que como otros sorbolmiristatos, si se
inyecta, induce en la piel de ratones importantes alteraciones y la
formación de reacciones tumorales (Fujikl H., Biochem. Biophys. Res.
Commun., 90, 976, 1979). Estas alteraciones cutáneas la enzima
ornitinadescarboxilasa, y este incremento está relacionado con la
gravedad del daño cutáneo inducido.
En estos experimentos, la teleocidina se inyecta
en la piel afeitada del lomo de ratones a una dosis de 5
\mug/ratón disueltos en 0,2 cm^{3} de solución.
El AH y la AC, administrados solos o juntos, o en
la forma de un complejo según la invención, se diseminan cinco
minutos antes que la teleocidina en los lomos de los animales. Se
aplican dosis de ornitinadescarboxilasa en la epidermis
homogeneizada de los animales, cinco horas después de la inyección
de teleocidina, según el procedimiento de O'Brien y Nakadate
(O'Brien T.G., Cancer Res., 35, 1662, 1975- Nakadate T. Cancer
Res., 42, 2841, 1982). La concentración proteica de un extracto de
epidermis se evalúa siguiendo el procedimiento descrito por Lowry
(Lowry O. H., J. Biol. Chem., 193, 265, 1951).
Como se muestra en la Tabla 2, en estos
experimentos también se muestra un efecto sorprendente, inesperado
y más potente del complejo de AH y AC según la invención en
comparación con los dos componentes distintos.
Actividad antiinflamatoria sobre la inflamación inducida por ditranol | |
Tratamiento | % de inhibición del área flogística en comparación con los controles |
AC 50 mg | 9 \pm 0,19 |
AC 100 mg | 14 \pm 0,34 |
AH 10 mg | 39 \pm 1,6 |
AH 50 mg | 38 \pm 2,9 |
AC 100 mg + AH 50 mg | 52 \pm 4,9 |
Complejo AH/AC 50 mg | 65 \pm 5,1 |
Complejo AH/AC 100 mg | 78 \pm 6,8 |
Incremento de la actividad ornitinadescarboxilasa inducida por teleocidina | |
Tratamiento | Actividad orinitinadescarboxilasa (nmol de CO_{2}/60 min/mg proteína) |
AC 50 mg | 5 \pm 0,45 |
AC 100 mg | 11 \pm 1,49 |
AH 10 mg | 21 \pm 2,8 |
AH 50 mg | 31 \pm 4,1 |
AC 100 mg + AH 50 mg | 41 \pm 4,9 |
Complejo AH/AC 50 mg | 55 \pm 5,7 |
Complejo AH/AC 100 mg | 75\pm 6,9 |
Se ha reconocido que la sequedad de la
conjuntiva, aislada o asociada con otra enfermedad ocular o
extraocular, es capaz de inducir daño local sobre el epitelio
corneano que puede, entre otras cosas, perder su función de barrera.
Sobre la base de un experimento preliminar con conejos, en el que
se probó la eficacia de una combinación de 1:1 p/p de ácido
hialurónico/carnitina en la prevención de erosiones inducidas por
vapores de yodo, se llevó a cabo un ensayo clínico con 27 pacientes
con "sequedad de ojo" tratados con ácido hialurónico sólo o
con ácido hialurónico/carnitina. Según el protocolo, cada paciente
recibió durante 4 semanas una medicación (ácido hialurónico) en
forma de colirio en un ojo y un tratamiento diferente (ácido
hialurónico/carnitina) en el otro ojo, de forma que cada uno de los
pacientes también actuaba como control. Dos semanas después del
comienzo del tratamiento, así como al final (4 semanas) se llevaron
a cabo una evaluación subjetiva y exploraciones clínicas, asociados
con una prueba de fluoresceína. Los resultados obtenidos probaron
que el ácido hialurónico solo no proporcionaba ventajas
significativas en la mejora de los síntomas que afectan a los
pacientes ni en el mantenimiento de la función de barrera eficaz en
el epitelio corneano. Por el contrario, la fluorofotometría del
ojo tratado con ácido hialurónico/carnitina para evaluar la
captación de fluoresceína en áreas específicas de la córnea mostró
una mejora significativa de la función de barrera, ya tras 2
semanas de tratamiento en las áreas inferiores de la córnea y tras
4 semanas en las zonas centrales.
Las úlceras vasculares de las extremidades
inferiores son patologías multidisciplinares.
Por úlcera se entiende la pérdida de sustancia
relacionada con cambios hemodinámicos, hemoreológicos y de
coagulación; la implicación de la microcirculación, primaria o
secundaria, es importante en la génesis de una úlcera y causa un
deterioro del trofismo tisular, con pérdida de tejido.
A menudo, las úlceras son la manifestación de una
serie de patologías subyacentes a una circulación sanguínea
insuficiente, que causa hipoxia. De hecho, mediante oximetría
transcutánea se hace evidente que, en el caso de las lesiones
vasculares, la pO_{2} alcanza 5-10 mm de Hg,
niveles capaces de afectar en gran medida las capacidades
metabólicas celulares y la producción de energía. Además, los
leucocitos proliferan y ejercen su actividad fagocítica a una
pO_{2} de 30-40 mm Hg.
El tratamiento todavía es un problema sin
resolver, que no resiste el gran número de ayudas farmacológicas y
físicas.
Desde el punto de vista estadístico, según
numerosos estudios, las úlceras tróficas de las extremidades
inferiores afectan al 1-3% de la población, con un
5% máximo entre los sujetos mayores de sesenta años de edad. Los
factores más frecuentes causantes de úlceras son las flebopatías,
las arteriopatías, la diabetes con la neuropatía microanglo
relacionada. Las áreas afectadas son, en orden de frecuencia, la
cara medial del tobillo seguido por la cara lateral del tobillos,
la parte trasera y frontal, la pantorrilla y los pies. La duración
media de una úlcera en de aproximadamente 26 semanas, con un
intervalo variable de 4 a 30 años, y las recaídas son muy
frecuentes.
El proceso de cicatrización implica inflamación
con migración celular, neovascularización y regeneración; la
reparación celular está mediada por varios factores que actúan como
estimuladores de la regeneración tisular.
Es fundamental la observación de las
características de la úlcera con el fin de prever su evolución, y
particularmente importantes es la caracterización según: el sitio,
la forma, el tamaño, el número, los bordes, el tejido de
granulación, la epidermidis periulcerativa.
Úlceras venosas: son ulceraciones más o
menos profundas relacionadas con la hipertensión secundaria a la
enfermedad varicosa o la trombosis venosa. El primum movens
es una hipertensión venosa crónica que afecta a los microvasos, con
el consiguiente enlentecimiento de la circulación y modificaciones
funcionales y estructurales.
Úlceras arteriales: principalmente están
relacionadas con la enfermedad aterosclerótica periférica. Las
ulceraciones son lesiones tróficas que afectan a los sujetos con
arteriosclerosis obliterante crónica. Aparecen cuando se produce
una disminución del flujo sanguíneo superior al 50%, en el que ya
no es posible la compensación por la microcirculación y se pone en
peligro el ya precario equilibrio hemodinámico.
El protocolo usado es el siguiente:
1) Administraciones tópicas de una combinación de
ácido hialurónico y carnitina (1:1 en peso); o de carnitina sola o
de ácido hialurónico solo, previa humidificación de la lesión con
suero salino durante un periodo de 10 minutos. En los primeros
tratamientos, es posible usar ácido hialurónico a una concentración
superior que la carnitina, para estimular la limpieza de la úlcera.
En los tratamientos siguientes, se han usado unas concentraciones de
las dos moléculas tales que se pueda hacer un mejor uso del papel de
la carnitina en la normalización del trofismo tisular. El
tratamiento normalmente comenzó durante la hospitalización y
después se continuó en la clínica de terapia analgésica.
Como norma, los pacientes se someten a tal
tratamiento sin problemas; algunos sujetos sufrieron episodios de
ligeras irritaciones de corta duración y, a veces, de quemaduras
locales durante las primeras sesiones del tratamiento.
Los pacientes incluidos en este ensayo procedían
de los Departamentos de Medicina y Cirugía, donde habían recibido
sin éxito varios tratamientos médicos (mesiglicano, Connactivina,
mucopolisacáridos).
Se trataron 18 mujeres y 12 varones, de 62 a 80
años de edad, con úlceras tróficas de varios tamaños y en
diferentes sitios, en cualquier caso en las extremidades o los
pies.
Los resultados se puntuaron del siguiente modo:
MUY BUENOS, cuando la úlcera cicatrizó por completo; BUENOS, cuando
se consiguió al menos un 50% de reducción de la lesión; NULOS,
cuando, tras 30 días de tratamiento, no se produjeron cambios
significativos en la lesión.
Los resultados fueron los siguientes:
MUY BUENOS: en 15 pacientes, es decir un 50%;
BUENOS: en 11 pacientes, es decir un 36,7%,
NULOS: en 4 pacientes, es decir un 13,3%.
En el caso del tratamiento con ácido hialurónico
solo o con carnitina sola, los resultados fueron marcadamente
peores, en sólo el 16% de los pacientes tratados durante el mismo
tiempo con ácido hialurónico se obtuvo una respuesta puntuada como
BUENA, mientras que en ningún paciente se observó una respuesta MUY
BUENA. Además, desde el punto de vista histológico, las biopsias de
los pacientes tratados con la combinación de ácido
hialurónico/carnitina mostraron una normalización de la capa de la
epidermis que no se pudo observar en los controles.
Por último, e ha probado la eficacia terapéutica
del uso de una combinación de ácido hialurónico/carnitina incluso
en las ulceraciones crónicas, es decir, las presentes durante al
menos un año. Después de 23 semanas, el 89% de las lesiones más
difíciles de curar estaban completamente cerradas en comparación
con el 15% de las tratadas con el tratamiento tradicional, que
principalmente consistía en ejercer presión, usar ácido hialurónico
y mantener la lesión húmeda.
No se produjo sustancialmente ninguna
complicación, considerando los síntomas mencionados
anteriormente.
En vista de los resultados obtenidos, se puede
afirmar que el protocolo terapéutico sugerido es completamente
satisfactorio en casi todos los pacientes, y tal evidencia es
incluso más significativa al considerar que el tratamiento médico
previo no había ejercido ningún resultado favorable. Los cuatro
pacientes en los que no se obtuvieron resultados (nulos) se
sometieron con éxito a un transplante cutáneo.
Los casos descritos a continuación se refieren a
algunos sujetos con anemia drepanocítica, una hemoglobinopatía
frecuente en la población africana de regiones de malaria, en el
que son evidentes las grandes áreas ulcerativas con pérdida de
sustancia en las extremidades inferiores.
El término anemia drepanocítica comprende un
grupo grande de trastornos hematológicos con síntomas y genotipos
diferentes. La forma más habitual es la herencia homocigota de
hemoglobina S (que deriva de la sustitución de valina con ácido
glutámico en la posición 6 de la cadena de
\beta-hemoglobina). Más raramente, la anemia
drepanocítica se debe a la heterocigosis doble para la hemoglobina
S y para la talasemia y la hemoglobina C. La formación de fibras
intracelulares, que derivan de la polimerización de la hemoglobina
S, causa la típica deformación falciforme de los eritrocitos. Esto
tiene como resultado la rigidez de los eritrocitos, lo que
deteriora la microcirculación y la vasooclusión. Además, tales
cambios estructurales conllevan la reducción de la supervivencia de
los eritrocitos y, por tanto, una anemia hemolítica crónica.
La anemia drepanocítica aparece en los dos
primeros años de visa. Los síntomas se pueden dividir en dos
categorías principales, los relacionados con la hemolisis y los
derivados de los acontecimientos vasooclusivos. Por tanto, en estos
pacientes se pueden observar con facilidad las úlceras vasculares
tórpidas normalmente resistentes a los tratamientos terapéuticos
tradicionales.
El tratamiento que se lleva a cabo en estos
sujetos con la combinación de ácido hialurónico/carnitina
produce resultados terapéuticos extremadamente favorables, con
"restitutio ad integrum" del área dañada en periodos de tiempo
relativamente cortos.
La Prueba de las cuatro bolas es una prueba
estándar de desgaste usado por los ingenieros durante muchas
décadas (Instituto del Petróleo). Extreme pressure properties:
friction and wear tests for lubricants, Four ball machine. En:
Standard Methods for Analysis of Petroleum and related Products,
volumen I. Chichester, Wiley, 1990, páginas 256). Su descripción
formal como prueba sencilla para determinar las propiedades
antidesgaste de los aceites y grasas industriales "en condiciones
de presión extrema", es decir, presión extrema según los
estándar de ingeniería, indicó que podría ser muchos órdenes de
magnitud demasiado grave para un lubricante biológico al comparar
las cargas típicas de la ingeniería y la fisiología. Por tanto, fue
de lo más sorprendente y bienvenido cuando los datos preliminares
mostraron que el líquido sinovial sintético no solo superó las
pruebas, sino que lo hizo mejor que varios lubricantes
industriales, (Hills, B. A., Hyaluronic acid lubricating compounds.
Patente australiana nº 620821, 1992). En consecuencia, se adoptó
esta prueba como una prueba extrema necesaria para diferenciar las
capacidades
antidesgaste.
antidesgaste.
La "máquina de las cuatro bolas para el
lubricante en condiciones de presión extrema" se ha descrito en
procedimientos de pruebas estándar (véase la referencia anterior).
Si la lubricación es mala en estas cargas extremas (carga vertical
de 40 kg) o se rompe tras un periodo de tiempo, la cuarta bola se
fusiona con las otras tres y la prueba se para automáticamente. Si
esto no se produce, la prueba continúa durante 1 hora y, mediante
un microscopio móvil, se miden los diámetros de las cicatrices en
cada uno de los dos planos de cada una de las tres bolas fijas en
dos planos mutuamente perpendiculares. Los resultados se comunican
como la media de seis valores obtenidos, el diámetro medio de la
cicatriz (DMC). La velocidad de deslizamiento es de 23,3 cm/s para
una tensión Hertz inicial de 3.400 MPa que se reduce a
aproximadamente 700 MPa para un DMC de 0,8 mm; este valor
corresponde a un volumen de simetría del desgaste de
aproximadamente 2 x 10^{-2} mm^{3} (Willermet P. A. y Kandah S.
J., Wear asymmetry-A comparison of the wear volumes
of the rotating and the stationary balls in the
four-ball machine. Trans. Am. Soc. Lubricating Eng.
28: 173-178, 1982). La prueba se repite tres veces
en cada muestra. Los aceites más lubricantes proporcionan valores
de aproximadamente 0,35 mm, mientras que los mejores lubricantes
acuosos poseen un intervalo típico de aproximadamente
0,8-0,9 mm (Castrol Mean Scar Daimeters for Typical
Commercial Lubricants, Sidney: Castrol (Australia) Pty. Ltd). Los
lubricantes malos tales como agua o suero salino no completan la
prueba; las bolas se fusionan tras sólo 10-1 2
segundos.
Se probaron los siguientes fluidos:
- 1.
- Se aspiró fluido sinovial de la articulación de la rodilla de voluntarios sanos. El fluido con cualquier indicio de sangre se desechó. Se juntó los fluidos de todas las articulaciones para adquirir los 9 ml necesarios para cada prueba y se usaron inmediatamente para el ensayo. El intervalo de pH de los grupos fue de 6,5-6,9.
- 2.
- Una solución de hialuronano (10 mg/ml; Healon, LKB-Pharmacia) se tamponó hasta u pH 6,7.
- 3.
- Una solución de carnitina o sus acil derivados (es decir, acetil-, propionil-, palmitoíl-, etc.) se tamponó hasta un pH 6,7.
- 4.
- Se preparó un fluido sinovial sintético mediante el uso de diferentes cantidades de AH y de carnitinas. Por ejemplo, e mezclaron 10 mg/ml de AH y 10 mg/ml de carnitina o sus derivados y se tamponaron hasta un pH de 6,7.
\bullet Media= EME |
Dado que los lubricantes que reducen la fricción
no necesariamente reducen el desgaste, los inventores han abordado
la nueva propiedad de una asociación química entre el AH y los
derivados para disminuir de forma significativa el desgaste.
El valor del fluido sinovial se acercó a los de
los mejores aceites lubricantes, 0,35 mm, y excedió los valores
para la "reserva basal" de aceites lubricantes; incluso más
impresionante fue el hecho de que el DMC de o,66 mm fue inferior al
de cualquiera de los lubricantes comercializados con base acuosa.
Mientras que el AH o las carnitinas solos no mostraron signos de
capacidades antidesgaste en estas condiciones, al usar AH con
derivados de carnitina se conservó un valor del DMC similar al
valor medido para el fluido sinovial. Por ejemplo, en presencia de
palmitoíl-L-carnitina y AH, se
obtuvo un valor de 0,51 mm. Los análisis estadísticos no mostraron
diferencias significativas entre los valores para acetil-,
propionil- o palmitoíl-L-carnitina,
aunque los resultados con
palmitoíl-L-carnitina fueron
bastante mejores. Por otro lado, se ha mostrado que la carnitina y
el AH poseía un valor peor, de 1,57 mm, lo que demuestra que los
residuos acilo eran importantes para las propiedades
antidesgaste.
Los valores del DMC para la mezcla de AH más
derivados de carnitina podrían atribuirse sólo a la adquisición de
sinergismo entre los dos componentes. Es más, al medir el
coeficiente de fricción cinética en condiciones de carga, la misma
muestra mostró una propiedad lubricante soberbia, proporcionando
coeficientes de fricción cinética tan bajos como de
0,002-0,005 en condiciones de carga elevada, es
decir, dentro del intervalo fisiológico.
En el estudio se incluyeron treinta y cinco
sujetos. Los criterios de exclusión fueron septicemia, trastornos
del tejido conjuntivo, artritis reumatoide, enfermedades de
deposición de cristales, defectos congénitos o hereditarios
conocidos, inmovilización durante varias semanas así como
tratamiento con corticoides y fármacos citotóxicos.
Las muestras de tejido obtenidas de cada donante
se cortaron en trozos de 3-6 mg en medio Eagle
modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con penicilina (5.000
UI. ml^{-1}). El tejido se lavó tres veces con este medio de
cultivo. Los trozos de cartílago se tomaron al azar, se pesaron y
se distribuyeron en pocillos diferentes de placas de cultivo de
múltiples pocillos (típicamente de entre 30 y 60 mg de
tejido/pocillo). No se cultivaron piezas adicionales, pero se
guardaron a -20ºC para valorar los contenidos iniciales en
proteoglicanos (PG) y AH del cartílago. A continuación, a cada
pocillo se añadió medio de cultivo complementado con un 20% (v/v)
de suero bovino fetal (medio de cultivo A) y las placas de cultivo
se colocaron en un incubador humidificado con una proporción entre
aire:CO_{2} de 90%:10% (v/v), durante 48 horas a 37ºC.
Para cada experimento se usó cartílago de un
individuo y los cultivos tisulares se realizaron por triplicado: es
decir, para el cultivo control, así como para cada cultivo de AH,
acetil-carnitina (ALC) o AH + ALC, se cultivaron 3
explantes cartilaginosos por separado. Los valores comunicados son
la media de los tres cultivos del triplicado.
Después de 2 días de cultivo, se aspiró el medio
de cultivo y los explantes se lavaron 3 veces con 1 ml de DMEM. Los
explantes se resuspendieron en medio de cultivo con 5% de SBF (1 ml
50 mg^{-1} de tejido) complementado con
glucosamina-^{3}H (50 \muCi ml^{-1}) (medio de
cultivo B). A cada pocillo, se añadió una solución de AH,
acetil-carnitina (ALC) o AH + ALC (10 ml/ml en
medio de cultivo), hasta alcanzar la concentración final de 100
\mug de ALC. El cultivo control recibió medio solo. Después se
incubaron los pocillos de cultivo durante 12 horas.
Tras un día de cultivo en medio A, las piezas de
cartílago se aspiraron sin medio, se lavaron 3 veces con 1 ml de
DMEM, se resuspendieron en medio de cultivo B (1 ml 50 mg^{-1} de
tejido) y se cultivaron durante 12 horas. Después del marcaje con
pulsos, las piezas de cartílago se lavaron con DMEM y se
resuspendieron en medio de cultivo A. A cada pocillo (10 \mul
ml^{-1}) se añadió medio solo o las moléculas adecuadas (AH, ALC
o AH + ALC) disueltas en medio, como se ha indicado anteriormente,
y se realizó un periodo de seguimiento durante 24 horas.
Al final del marcaje con pulsos y de los periodos
de seguimiento no radioactivos, se eliminaron los medios de cultivo
y las piezas de cartílago se lavaron con cloruro sódico
0,15M/acetato sódico 0,05M, a pH 6,0 (tampón A). Se combinaron los
medios y los correspondientes lavados. Se añadieron PG bovinas
nasales (500 \mug ml^{-1}) y hialuronano (10 \mug ml^{-1}).
Las mezclas se dializaron contra tampón A y después se incubaron
con papaína (10 mg ml-1) durante 24 horas a 60ºC.
Las muestras de cartílago se resuspendieron en tampón A; a cada
vial se añadió papaína (0,1 mg/ml-1) y los tejidos
se digirieron durante 24 horas a 60ºC. Se obtuvieron alícuotas de
las muestras para realizar las determinaciones de hidroxiprolina o
se sometieron a cromatografía de intercambio iónico en un cartucho
Econo-Pak Q.
La columna Econo-Pak Q (5 ml) se
equilibró previamente en tampón A a un caudal de 2 ml
min-^{1}. Alícuotas de las muestras digeridas con
papaína (100-200 \mul para el digerido tisular y
0,5-1 ml para los digeridos del medio) se ajustaron
a 2 ml con tampón A y se aplicaron a la columna, que después se
lavó con 6 volúmenes de columna de tampón A. Las macromoléculas
aniónicas eluyeron de la columna a 2 ml min^{-1} con el siguiente
gradiente de NaCl (0,15-0,23 M en 2 minutos,
0,23-0,23 M en 15 minutos, 0,23-1,5
en 15 minutos) en acetato sódico 0,05M a pH 6,0. Se tomaron
fracciones de 2 ml y se analizaron en busca de radioactividad. El
rendimiento del radioisótopo en la cantidad combinada y las
fracciones del gradiente fue> 90%.
Dos picos marcados con ^{3}H eluyeron de la
columna de forma consistente: el pico A a NaCl 0,23 M y el pico B
a NaCl a aproximadamente 1 M: Para cada muestra (tejidos y medio)
las fracciones con los picos radiomarcados se agruparon por
separado, se calentaron a 80ºC durante 10 minutos y se aplicaron a
una columna (0,7 x 50 cm) de Sephadex G-50
equilibrada en tampón bicarbonato amónico 0,1M a pH 8,5. En cada
caso, más del 90% del material radiomarcado presente en ambos picos
A y B, eluyó en el volumen excluido de la columna
G-50. Por tanto, alícuotas de los picos A y B se
digirieron con Streptomyces hyaluronidasa (0,1
\mu/alícuota en acetato Na 0,05M a pH 5,0, durante 6 horas a
60ºC) y condroitinasa ABC (0,5 \mu/alícuota en
Tris-fluoruro 0,1M a pH 8,0, durante 6 horas a
37ºC) y los productos de la digestión se aplicaron a la columna
G-50. Por otro lado, los productos de la digestión
de la condroitinasa ABC también se incluyen en la columna
G-50, pero, en contraste con Streptomyces
hyaluronidasa, la condroitinasa ABC digieren las cadenas de AH
y de condroitina. En consecuencia, la cantidad de
AH-^{3}H presente en cada pico se calculó
mediante la multiplicación de la radioactividad total del pico por
el porcentaje relativo de material marcado radioactivamente que era
sensible a Streptomyces hyaluronidasa, mientras que la
cantidad de PG-^{3}H presente en cada pico se
calculó mediante la multiplicación de la radioactividad total del
pico por el porcentaje relativo de material marcado
radioactivamente que era resistente a la digestión con
Streptomyces hyaluronidasa y susceptible a la digestión con
condroitinasa ABC.
La hidroxiprolina se determinó mediante el
procedimiento de Woessner y el ácido hexuronato mediante el
procedimiento de Bitter y Muir. El AC se cuantificó mediante una
técnica específica de ensayo de radioabsorción.
La tasa de biosíntesis de PG y AC se determinó
mediante la suma de y PG-[^{3}H] y AH-[^{3}H] desintegraciones
por minuto (d.p.m.) que se encuentran en los tejidos y medio
digeridos con papaína y en los medios al final del periodo de 12
horas de marcaje en pulsos y se expresó como d.p.m. de PG-[^{3}H]
y AH-[^{3}H] por hora y por mg de hidroxiprolina. De hecho, la
pérdida de hidroxiprolina (y por tanto de colágeno) de las muestras
de tejido hacia el medio en un periodo de 72 horas de cultivo fue
menor del 5% de la cantidad presente en los trozos de cartílago
antes del cultivo. Al final del periodo de seguimiento no
radioactivo de 24 horas, la incorporación total de
glucosamina-[^{3}H] en el AG y las PG se determinó mediante la
suma de d.p.m. de AH-[^{3}H] y PG-[^{3}H] que se encuentran en
los medios y en las correspondientes muestras de tejido digerido
con papaína. La significación estadística de las diferencias
observadas entre grupos se evaluó mediante la prueba U de
Mann-Whitney, mientras que en cada grupo, la
significación de las diferencias en el metabolismo de PG y AH en
presencia de concentraciones diferentes de carnitina \pm AH se
evaluaron mediante la prueba de los rangos con signo de
Wilcoxon.
Los contenidos en PG y AH de las muestras de
cartílago se distribuyeron en un amplio abanico de valores (media
\pm de = 0,77 \pm 0,09 y 0,05 \pm 0,03 para los contenidos de
PG y AH, respectivamente). En los diferentes experimentos de
seguimiento y de pulsos llevados a cabo en ausencia y en presencia
de los compuestos a probar, el análisis de las muestras de tejidos
y medios dio los siguientes resultados: el 50-70%
del material marcado presente en el pico A era sensible a
Streptomyces hyaluronidasa y, por tanto, se identificó como
AH-[3H]. Por otro lado, todo el material marcado presente en el pico
B se identificó como condroitín sulfato (y por tanto, como
proteoglicanos), dado que era consistentemente resistente a la
digestión con Streptomyces hyaluronidasa y susceptible a la
digestión completa con condroitinasa. En ausencia de AH y/o de
acetil-L-carnitina (ALC), las tasas
de síntesis de PG y AH se distribuyeron en un intervalo específico
de valores (38,11 \pm 8,1 para la síntesis de PG y de 3,9 \pm
0,8 para la síntesis de AH). Cuando se cultivaron los explantes de
cartílago marcado en ausencia de fármacos, la pérdida neta de
moléculas de AH-[^{3}H] y de PG-[^{3}H] fue de 33,5 \pm 7,3 y
25,3 \pm 5,9 respectivamente.
En presencia de AH o de
acetil-L-carnitina solos, se observó
un ligero incremento de la síntesis de PG y de AH pero sólo la
presencia de ambas moléculas al mismo tiempo fue capaz de aumentar
de forma significativa de la síntesis de PG y AH (tabla 4). En
cartílago normal, 100 \mug de AH y ALC respectivamente produjeron
un incremento significativo de la pérdida neta de PG y AH marcado
(p< 0,001). Es más, AH más ALC sí indujeron un cambio
significativo en la pérdida neta de PG y AH marcados (p < 0,01)
desde el cartílago durante el periodo de seguimiento de 24 horas
(tabla 5), mientras que el AH o el ALC solos sólo redujeron la
pérdida neta de AH marcado.
Estos resultados proporcionan, por primera vez,
pruebas de que en el cartílago articular, la asociación química de
AH y ALC es capaz de incrementar de forma concomitante la síntesis
de AH y de PG y reducir la pérdida de moléculas de AH recién
sintetizadas des tejido. De hecho, el equilibrio metábolico
negativo de AH conduce a cambios del tipo de osteoartritis (OA) en
el tejido articular normal, ya que la matriz de cartílago OA se
caracteriza por una depleción progresiva de su contenido en AH. En
consecuencia, el incremento de la síntesis de PG sin que se
produzca ninguna reducción en la pérdida neta de PG es un efecto
beneficioso, ya que la disminución de la concentración de PG es
proporcional a la gravedad del proceso de OS.
La adición de los dos componentes por separado
(en este caso, cualquier interacción química es extremadamente
probable o aleatoria en los ambientes acuosos en los que las
moléculas se añaden) no reveló ningún efecto agonista de las dos
sustancias. Por otro lado, la cinética de disociación de las
interacciones químicas entre AH y los derivados de carnitina
obtenidas en condiciones adecuadas in vitro es, también en
presencia de agua, extremadamente lenta y parece estar relacionada
con la presencia de residuos acilo. Esto implica que cualquier
lubricación límite de la articulación es, en realidad, un subtipo
conocido en ingeniería como "lubricación sólida lamelada". Por
último, probablemente los efectos biológicos adicionales presentes
en nuestro compuesto en comparación con la simple combinación de
los dos productos están relacionados con la presencia en el
microambiente celular de esta nueva especie química.
A continuación se exponen ejemplos de
composiciones farmacéuticas según la invención:
- viales de 1-2 ml para inyección
intraarticular, que contienen:
- A)
- 2-5 mg de AH + 2-5 mg de L-carnitina (o acetil-, propionil-, palmitoíl-L carnitina); o
- B)
- 4-10 mg del complejo 1:1 (p/p) de AH/L-carnitina (0 de AH/acetil-, propionil-, palmitoíl-L-carnitina); administrándose dicha inyección una o más veces a la semana;
- cápsulas para administración oral, que
contienen:
- C)
- 0,5-2 g de AH + 0,5-2 g de L-carnitina (o de acetil-, propionil-palmitoíl-L-carnitina); o
- D)
- 1-4 g del complejo 1:1 (p/p de AH/acetil-, propionil-, palmitoíl-L-carnitina); administrándose dichas cápsulas 1-3 veces al día en el caso de la enfermedad de Crohn, rectocolitis ulcerosa, enfermedad celíaca;
-gel para la administración tópica, que
contiene:
- E)
- 1-5% de AH + 1-5% de L-carnitina (o acetil-, propionil-, palmitoíl-L-carnitina); o
- F)
- 2-10% de complejo 1:1 (p/p) de AH/L-carnitina (o AH/acetil-, propionil-, palmitoíl-L-carnitina, para su aplicación 1-3 veces al día en el área de inflamación.
Ejemplos de composiciones cosméticas según la
invención son geles similares a E) y F), o lociones, cremas,
mascarillas de belleza y similares, que contienen cantidades
similares de los dos componentes ácido
hialurónico/L-carnitina ( o acetil-, propionil-,
palmitoíl-L-carnitina) o,
preferentemente, de los correspondientes complejos según la
invención.
Claims (22)
1. Complejos de ácido hialurónico con carnitina o
acilcarnitinas.
2. Complejos de ácido hialurónico con
L-carnitina o
acil-L-carnitinas.
3. Complejos de ácido hialurónico con
acil-L-carnitina seleccionada del
grupo constituido por
acetil-L-carnitina,
propionil-L-carnitina y
palmitoíl-L-carnitina.
4. Complejos según las reivindicaciones
1-3, en los que el ácido hialurónico tiene un peso
molecular promedio en peso (M_{w}) que varía de aproximadamente 2
x 10^{5} a 3 x 10^{6}.
5. Complejos según las reivindicaciones
1-4, en los que los dos componentes se encuentran
presentes en proporciones variables de 1:3 a 3:1.
6. Complejos según la reivindicación 5, en los
que los dos componentes se encuentran en cantidades ponderales
equivalentes.
7. Complejos según las reivindicaciones
1-5, caracterizados porque el ácido
hialurónico tiene un peso molecular promedio en peso (M_{w})
variable de aproximadamente 2 x 10^{5} a aproximadamente 3 x
10^{6}.
8. Un procedimiento para la preparación de
complejos según las reivindicaciones precedentes, que se
caracteriza porque los dos componentes se mezclan en un
disolvente y la mezcla se somete a ultrasonidos y, posteriormente, a
centrifugación, con la recuperación del sobrenadante.
9. Un procedimiento según la reivindicación 8,
que se caracteriza porque el disolvente está compuesto por
suero salino tamponado con fosfato (PBS) a un pH sustancialmente
neutro.
10. Un procedimiento según la reivindicación 8,
que se caracteriza porque el disolvente está compuesto por
etanol/PBS.
11. Un procedimiento según la reivindicaciones
8-10, que se caracteriza porque los
ultrasonidos se llevan a cabo durante un tiempo variable de 5 a 120
minutos a 50-150 W.
12. Un procedimiento según la reivindicación 11,
que se caracteriza porque los ultrasonidos se llevan a cabo
durante un tiempo de 10 a 30 minutos.
13. Un procedimiento según la reivindicaciones
8-12, que se caracteriza porque los
ultrasonidos se llevan a cabo a temperaturas variables de 15 a
50ºC.
14. Un procedimiento según la reivindicaciones
8-13, que se caracteriza porque la
centrifugación se lleva a cabo a aproximadamente 3.000 g, durante un
tiempo de 5 a 30 minutos.
15. Composiciones farmacéuticas que contienen uno
o más complejos según las reivindicaciones 1-7.
16. Composiciones farmacéuticas según la
reivindicación 15, con actividad protectora sobre los tejidos y la
membrana plasmática celular y actividades antiinflamatorias y
antioxidantes.
17. Composiciones farmacéuticas según la
reivindicación 15, para usar en el tratamiento de la sinovitis y la
gonartrosis, la enfermedad de Crohn, la rectocolitis y la
enfermedad celíaca.
18. Composiciones farmacéuticas según la
reivindicación 15, para usar en el tratamiento de patologías del
epitelio corneano.
19. Composiciones farmacéuticas según la
reivindicación 15, para el tratamiento de las úlceras de las
extremidades inferiores.
20. Composiciones que contienen los complejos
según las reivindicaciones 1-7, para la
administración oral en forma de complementos alimentarios.
21. Composiciones según la reivindicación 20,
que además contienen vitaminas, coenzimas, sustancias minerales y
antioxidantes.
22. Composiciones cosméticas que contienen los
complejos según las reivindicaciones 1-7.
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