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Diese
Erfindung betrifft Präparate
von Viren, beispielsweise für
Vakzinen oder andere pharmazeutische oder forschungsbezogene Zwecke,
ihre Stabilisierung und Verfahren zur Herstellung solche Präparate sowie
ihre Verwendung, beispielsweise als Vakzine oder als Virusvektor.
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Hintergrund
der Erfindung und Stand der Technik
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Das
Einfrieren und/oder Gefriertrocknen von lebensfähigen Viruspräparaten
für Labor-
oder Impfzwecke, um ihre Aktivität
zu erhalten, ist bekannt.
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Zahlreiche
Verfahren sind bekannt, um Lebendviruspräparate, wie beispielsweise
Herpesviruspräparate,
für Vakzinen
und andere Zwecke herzustellen.
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Die
US 5.024.836 (91.06.18)
(Merck & Co. Inc.:
WJ McAleer et al.) beschreibt eine stabile, gefriergetrocknete Lebendherpesvirusvakzine,
die etwa 0,5 % bis etwa 8 Feuchtigkeit aufweist, und beansprucht
eine gasinjizierte, gefriergetrocknete Lebendvakzine eines attenuierten
Varicella-Virus, die 2 % bis 8 % Feuchtigkeit aufweist.
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Die
US 5075110 (91.12.24) und
EP 0.353.108 (Institut Merieux:
AJ Francon et al.) beschreiben die Stabilisierung von attenuierten
gefriergetrockneten Vakzinen mit Amid- oder Thioamid-Gefriertrocknungsexzipienten,
wie beispielsweise Harnstoff.
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Die
EP 0.048.194 (Merck & Co. Inc.: MR
Hilleman et al.) beschreibt Gefriertrocknungsverfahren, bei denen
die Gefriertrocknungsdauer und -kosten durch Einfrieren der äußeren Hülle einer
Flüssigvakzine
vor der Gefriertrocknung verringert werden, indem die Phiole liegend
in einem Flüssigkeitsbad
rotiert wird, das auf einer Temperatur unter dem eutektischen Punkt
der Vakzine gehalten wird.
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Die
US 4.338.335 (82.07.06)
und
EP 0.028.563 (Merck & Co. Inc.: WJ
McAlleer et al.) beschreiben Stabilisatoren für Flüssigvakzinen und stabilisierte,
flüssige
Lebendvirusvakzinen, die ein lebendes Virus, teilweise hydrolysierte
Gelatine, ein Monosaccharid oder Disaccharid, ein Zellkulturmedium,
L-Glutaminsäure,
L-Arginin und einen Puffer zur Beibehaltung eines pH von etwa 6,0
bis etwa 6,5 enthalten.
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Die
EP 0.008.255 (Merck & Co. Inc.: WJ McAleer
et al.) beschreibt eine Herpesvirusvakzine und ihre Herstellung,
insbesondere eine Vakzine gegen die Mareksche Krankheit. Das Virus
wird in Gegenwart eines pH-geregelten gepufferten Stabilisators
gefriergetrocknet, sodass die Vakzine mit destilliertem Wasser wiederhergestellt
werden kann.
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Die
EP 0.295.043 (88.12.14)
(Kitasato Institute: S Makino et al.) beschreibt eine stabilisierte
attenuierte Lebendvakzine, die zumindest einen lebenden attenuierten
einfaches Virus, das aus Masern-, Mumps- oder Rötelnviren ausgewählt ist,
und als Stabilisator Lactose, Saccharose, D-Sorbit, Natriumglutamat
und Gelatinehydrolysat umfasst.
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Die
EP 0.252.059 (Smithkline
Biologicals S.A.: E D'Hondt)
beschreibt Stabilisatoren für
attenuierte Vakzinen, die Lactose, Sorbit, Dextran, Caseinhydrolysat,
L-Glutamat, EDTA und einen Puffer mit einem pH von 6,7–7,2 enthalten.
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Die
WO 96/29.096 (Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc.: H Kuma et al.)
beschreibt die Herstellung von Gentransferpräparaten durch Gefriertrocknen
eines Gemischs aus einem rekombinanten Virusvektor mit zumindest
einem Additiv, ausgewählt aus
Arginin, Glutaminsäure
(oder einem Natriumsalz davon), Serin, Glucose, Inosit, Lactose,
Mannit, Sorbit, Trehalose und Xylose.
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Die
US 4.985.244 (91.01.15)
(Kitasato Institute: S Makino et al.) beschreibt eine stabilisierte,
attenuierte Lebendvakzine mit verbesserter Wärmestabilität, die einfache lebende attenuierte
Masern-, Mumps- oder Rötelnvirenvakzinen
umfassen, die in ei nem Medium-199 als Zellkultur gezüchtet wurden, oder
eine kombinierte attenuierte Lebendvakzine, die mit Lactose, Saccharose,
D-Sorbit, Natriumglutamat und Gelatinehydrolysat stabilisiert ist.
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Die
US 4.622.222 (86.11.11)
(Phylaxia Oltoanyagtermelo Vallalat: E Horvth et al.) beschreibt eine
gefriergetrocknete Vakzine gegen das Enten-Hepatitisvirus unter
Verwendung eines attenuierten Virus sowie ihre Herstellung unter
Verwendung von infizierten Entenembryos, einschließlich das
Gefriertrocknens des sterilen Virusmaterials mit Kollidon, Gelatine,
Glucose und Saccharose.
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Die
US 4.500.512 (85.02.19)
(Institut Pasteur: M Barme) beschreibt stabilisierte Vakzinen, die Lebendviren
enthalten, insbesondere für
das Gelbfiebervirus, und Stabilisatoren, die Phosphatpuffer, Calcium-
und Magnesiumionen, Lactose, Sorbit und Aminosäure, ausgewählt aus Histidin, Alanin, Valin, Threonin,
Arginin, Methionin, Hydroxyprolin, Lysin, Isoleucin, Phenlyalanin,
Serin, vorzugsweise Histidin und Alanin, enthalten. Die stabilisierte
Vakzine ist gefriergetrocknet.
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Die
US 3.985.615 (Osaka Res
Foundation: T Kubo et al.) beschreibt die Herstellung von lebenden, attenuierten
Varicella-Viren zur Verwendung als Vakzine durch Kultivierung, welche
eine Passage in primären
Embryonengewebezellen von Meerschweinchen umfasst. Die
US 5.024.836 (Merck: WJ McAleer et
al.) betrifft die Herstellung von gefriergetrockneten Vakzinepräparaten,
die darauf basieren.
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Die
US 5.792.643 (97.03.28)
und WO 95/10.601 (Viagene SM Hermann et al.) offenbaren die Konservierung
von infektiösen
rekombinanten Viren unter Verwendung eines Saccharids, eines Struktur-Additivs
mit hohem Molekulargewicht, eines Puffer und von Wasser, wobei das
Gemisch auf unter den eutektischen Punkt oder die Glastemperatur
abgekühlt
wird und Wasser durch Sublimation auf weniger als 10 % Wassergehalt
verringert wird.
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Die
WO 93/18.790 (LK Csatary) beschreibt gefriergetrocknete Virusvakzinen
(z.B. eine MDV-Vakzine) mit modifizierter Stärke, wie beispielsweise Hydroxyethylstärke mit
einem Molekulargewicht von 100.000 – 300.000, die vor der Gefriertrocknung
als Schutzkolloid zugesetzt wird.
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Die
JP 06.234.659 (94.08.23)
(ZH Handai Biseibutsubyo Kenkyukai) offenbart eine stabilisierte Lebendvakzine,
die ein attenuiertes oder rekombinantes Lebendvaricellavirus und
einen Stabilisator umfasst, der frei von Ca2+-Ionen und Mg2+-Ionen
ist, vorzugsweise mit Gelatine oder einem Gelatinehydrolysat oder
einem Chelatbildner, wie z.B. EDTA.
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Die
EP 0.290.197 (88.11.09)
(Merck & Co. Inc.:
RZ Maigetter et al.) offenbart eine stabile gasinjizierte gefriergetrocknete
Lebendherpesvirusvakzine, die 0,5 – 8 % Feuchtigkeit aufweist,
was eine Lagerung eher bei herkömmlichen
Kühlschrankbedingungen,
d.h. 5 °C,
als bei Gefrierbedingungen (-20 °C)
ermöglicht.
Die Gasinjektion während
des primären
Zyklus des Gefriertrocknungsvorgangs und das Trocknen mit höheren Feuchtigkeitswerten
verringert die Gefriertrocknungsdauer, typischerweise auf 7 – 11 h für den primären und
sekundären
Zyklus zusammen.
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Die
DD-209.738 (Cent Cerc Bioprep: IV Patrascu) offenbart die Herstellung
einer Herpesvirusvakzine gegen die Mareksche Krankheit durch (a) Kultivieren
von Embryozellen auf Dextran-Mikrokügelchen); (b) Inokulieren der
Kultur bei 80 % Konfluenz mit dem Truthahn-Herpesvirusstamm FC-126; (c)
Gewinnen der infizierten Zellen in einem SPGA-Medium (Saccharose,
Phosphat, Glutamat, Rinderalbuminfraktion V), wenn die zytopathische
Wirkung 80 % erreicht; (d) Pulsen und Zentrifugieren, um eine erste
Ernte der Vakzine zu gewinnen; (e) Resuspendieren des Niederschlags
in einem SPGA-Medium und Wiederholen des Schritts (d), um eine zweite Vakzineernte
zu erhalten (um die Vakzineausbeute zu erhöhen); (f) Einfrieren der vereinigten
Vakzinen bei -100 °C,
bevor der Virustiter bestimmt wird; und (g) Verdünnen mit einem SPGA-Medium
und Gefriertrocknen.
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Die
JP 06.234.659-A (ZH Handai Biseibutsubyo Kenkyukai) beschreibt in
einem Beispiel die Herstellung einer Herpesvirusvakzine auf menschlichen
diploiden Fibroblasten-MRC-5-Zellen, die in einem MEM-Medium bei
37 °C kultiviert
wurden; umfassend das Inokulieren eines Oka-Stamm-Varicella-Virus-Einsaat-Virus
bei einem MOI von 0,03 in MRC-5-Zellen und 2 Tage langes Kultivieren
bei 37 °C.
Das Virus wird dann in einer Lösung
suspendiert, die NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4,
Saccharose, L-Glutamat, Gelatine, Gelatinehydrolysat und EDA-3Na
enthält.
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Die
WO 98/28.000 (Merck & Co.,
Inc., Rahway, NJ, US: DB Volkin et al.) beschreibt Vakzineformulierungen
(z.B. Masern, Mumps, Röteln, VZV
oder Herpes simplex), die Polyalkohol mit 6 Kohlenstoffen, Disaccharid
und einen Puffer umfassen.
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Die
US 3.915.794 (Recherche
et Industrie Therapeutique, Belgien: Z Nathan und J Petermans) beschreibt
stabile Viruspräparate,
die ein Herpesvirus der Gruppe B (z.B. Truthahn-Herpesvirus) und eine
gepufferte wässrige
Lösung
pH 6,5 – 7,5
umfassen, die Polyvinylpyrrolidon, Zucker, Glutamat und einen Chelatbildner
enthalten.
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Die
US 4.147.772 (79.04.03)
(Merck & Co. Inc.:
WJ McAleer et al.) beschreibt eine gefriergetrocknete Vakzine mit
einem pH zwischen etwa 6,0 und 6,5, die ein Lebendvirus, teilweise
hydrolysierte Gelatine (Molekulargewicht etwa 3.000), einen Polyalkohol
mit 6 Kohlenstoffen, ein Zellkulturmedium und einen sauren Puffer
umfasst.
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Die
US 5.665.362 und WO 92/05.263
(Cantab Pharmaceuticals Research Ltd.: SC Inglis et al.) und
US 5.837.261 und WO 94/21.807
(Cantab Pharmaceuticals Research: Inglis et al.) und darin zitierte Dokumente
beschreiben den Stand der Technik in Bezug auf gentechnisch inaktivierte
infektiöse
Herpesviren, wie beispielsweise das Herpes-simplex-Virus, z.B. zu
Impfzwecken und zur Bereitstellung von rekombinanten Zellen, und
Kultivierungsverfahren zu ihrer Herstellung. Andere Offenbarun gen
eines gentechnisch inaktivierten Herpesvirus und von Zellen zu seiner
Herstellung sind ebenfalls im Stand der Technik enthalten, wobei
weiter unten auf einige davon Bezug genommen wird.
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Die
Bereitstellung von weiteren Formen stabilisierter Viruspräparate,
beispielsweise zu Impfzwecken, bleibt wünschenswert.
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Die vorliegende
Erfindung
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Gemäß vorliegender
Erfindung wird eine stabilisierte, getrocknete pharmazeutische Zusammensetzung
bereitgestellt, umfassend ein Virus, das in einer wässrigen
Flüssigkeit
zur Injektion dispergierbar ist und Folgendes umfasst: ein infektiöses, gentechnisch
inaktiviertes Herpesvirus als aktive Vakzinekomponente; pflanzliches
Pepton; einen Puffer; und Saccharid oder Zuckeralkohol oder ein
anderes Mono- oder Oligosaccharid oder Derivat davon, z.B. Lactose
oder Sorbit. Die Zusammensetzung kann gegebenenfalls auch Dextran
oder ein anderes Polysaccharid mit einem Molekulargewicht über etwa 5.000
enthalten, das, falls gewünscht,
das pflanzliche Pepton ersetzen kann. Optionale weitere Bestandteile
können
eine weitere Aminosäure,
z.B. zweibasige Aminosäuren,
wie z.B. Natrium-L-glutamat oder -L-Aspartat, oder ein Gemisch von
Aminosäuren
umfassen. Zu den weiteren Bestandteilen, die gegebenenfalls geeignet
sind, gehören
jene, die in den oben genannten Dokumenten über den Stand der Technik angeführt sind,
vorzugsweise solche pflanzlichen oder mineralischen Ursprungs.
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In
bestimmten Beispielen können
die stabilisierten, getrockneten pharmazeutischen Zusammensetzungen
(i) ein infektiöses,
gentechnisch inaktiviertes Herpesvirus als aktive Komponente, beispielsweise
zur Verwendung als Vakzine oder als Virusvektor, z.B. für eine Gentherapie,
vorzugsweise HSV oder Varicella-Zoster-Virus, (ii) ein Polysaccharid
mit einem Molekulargewicht von über
etwa 5.000, vorzugsweise etwa 11.000 bis etwa 40.000, und weniger als
70.000, wie beispielsweise Dextran, und/oder eine Quelle gemischter
Aminosäuren
pflanzlichen oder bakteriellen Ur sprungs, wie beispielsweise pflanzliches
Pepton, z.B. Pepton, das durch enzymatische Hydrolyse von Sojabohnenprotein
hergestellt wird, (iii) einen Puffer, beispielsweise Tris-HCl, Bicarbonat,
Phosphat und/oder Citrat, und (iv) ein Monosaccharid oder einen
Zuckeralkohol, wie beispielsweise Lactose, Saccharose, Trehalose
oder Sorbit, enthalten. Bestimmte Beispiele können eines, nicht aber beide
der oben genannten Polysaccharidkomponenten und der Quelle gemischter
Aminosäuren enthalten.
Neben den oben genannten Komponenten kann die Zusammensetzung auch
zusätzliche
Bestandteile enthalten, die weitere Aminosäuren, wie beispielsweise zweibasige
Aminosäuren,
wie z.B. Natrium-L-glutamat oder -L-Aspartat, oder ein Gemisch von
Aminosäuren
umfassen. Beispiele für
zusätzliche
Bestandteile, die geeignete Komponenten der Zusammensetzungen gemäß vorliegender
Erfindung darstellen können,
sind jene, die in den oben genannten Dokumenten des Stands der Technik
angeführt
sind, insbesondere Beispiele pflanzlichen oder mineralischen Ursprungs.
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Zusammensetzungen
gemäß vorliegender Erfindung
umfassen Beispiele, die frei von Protein sind (mit Ausnahme der
proteinbildenden Teile der aktiven Vakzinekomponente), insbesondere
frei von Gelatine oder anderem tierischem Protein oder seinem Hydrolysat
oder anderem Material tierischen Ursprungs. Umfassen die Zusammensetzungen
eine Quelle gemischter Aminosäuren,
wie beispielsweise tierisches Pepton, können sie frei von Materialien
mit einem Molekulargewicht von über
etwa 2.000 sein, beispielsweise frei von Materialien mit einem Molekulargewicht über etwa
1.500 (mit Ausnahme des materialbildenden Teils der aktiven Vakzinekomponente).
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Es
zeigte sich, dass gefriergetrocknete Zusammensetzungen, wie sie
hierin beschrieben sind, am Ende von zweckmäßigen Lagerzeiten bei mäßigen Temperaturen,
z.B. über
0 °C, z.B.
bei etwa 8 °C, nach
dem Gefriertrocknen der Zusammensetzung gute Beibehaltung des Titers
aufweisen. Unter bestimmen Testbedingungen behielten die getrockneten
Zusammensetzungen ohne Einschränkungen
bei 8 °C
16 Wochen oder 52 Wochen lang einen Titer eines infektiösen Virus
innerhalb von 0,5 eines Logarithmus des Titers bei, der direkt nach
dem Gefriertrocknen vorhanden war, z.B. bei Titern im Bereich von
105 bis 106 pfu/ml
in Bezug auf das Flüssigvolumen
vor dem Gefriertrocknen.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung von pflanzlichem
Pepton oder anderen gemischten Aminosäuren pflanzlichen oder bakteriellen
Ursprungs, die frei von tierischem Protein oder tierischem Proteinhydrolysat
sind, oder anderen Materialien tierischen Ursprungs in Zusammensetzungen
zur Stabilisierung eines Virus und bei der Herstellung von getrockneten,
stabilisierten Viruszusammensetzungen für eine Vakzine und andere hierin
genannte Verwendungen.
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Pflanzliches
Pepton, zur Herstellung von Zusammensetzungen gemäß vorliegender
Erfindung geeignet und zur Zeit bevorzugt, kann beispielsweise im
Wesentlichen aus einem Präparat
bestehen, dass durch hydrolytische Verdauung mit Protease aus reinem,
genießbarem,
lösungsmittelextrahiertem
Sojamehl hergestellt wurde, um ein Produkt mit einem mittleren Molekulargewicht
im Bereich von etwa 300 – 400
zu erhalten, das im Wesentlichen frei von Bestandteilen mit höherem Molekulargewicht über etwa 2.000
ist. Ein lösliches
Kohlenhydrat pflanzlichen Ursprungs kann auch in solch einem Peptonpräparat vorhanden
sein. Alternativ dazu können
gemischte Aminosäuren
pflanzlichen oder bakteriellen Ursprungs wie oben beschrieben anstelle
des Peptons verwendet werden.
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Zusammensetzungen
gemäß vorliegender Erfindung
können
im Allgemeinen gemäß allgemein bekannten
pharmazeutischen Verfahren hergestellt werden, sodass sie annehmbare
Standards, beispielsweise in Bezug auf die Sterilität, erreichen.
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Der
Gesamtgehalt von Komponenten im getrockneten Präparat kann so gewählt sein,
dass die Zusammensetzung bei ihrer Wiederherstellung mit einer sterilen
Flüssigkeit
zur Injektion, beispielsweise Wasser zur Injektion oder Salzlösung zur
Injektion, verwendet werden kann, um eine Injektion bereitzustellen,
die eine annehmbare Annäherung
an eine isotonische Konzentration darstellt. Eine exakte isotonische
Konzentration stellt etwa 330 mOsm bereit, und in Übereinstimmung
mit derzeitigen Praktiken kann es eine annehmbare Annäherung sein,
um diese beispielsweise innerhalb eines Bereichs von etwa 100 – 600 mOsm,
im Allgemeinen innerhalb etwa 250 – 450 mOsm zu erreichen. "Isotonisch" bezieht sich hierin
normalerweise auf solch eine Annäherung.
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Die
Virusdosis in einem gefriergetrockneten Präparat gemäß einem Beispiel der Erfindung
kann so gewählt
sein, dass in der wiederhergestellten Flüssigkeit zur Injektion eine
Dosis von beispielsweise etwa 103 bis etwa
108 pfu des Virus erhalten werden. Ein häufig gewähltes Beispiel
für ein
Dosisvolumen zur Injektion ist etwa 0,5 ml.
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Das
gefriergetrocknete Präparat
kann aus einer flüssigen
Zusammensetzung hergestellt werden, die entweder die gleiche Konzentration
ihrer Hauptkomponenten aufweist wie die wiederherzustellende Flüssigkeit
oder eine höhere
oder niedrigere Konzentration aufweist.
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Der
Feuchtigkeitsgehalt des gefriergetrockneten Produkts kann im Bereich
von 0,5 bis 15 % und unter etwa 10 %, beispielsweise unter etwa
5 %, beispielsweise bei bis zu etwa 2 % oder darunter, liegen.
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Außerdem stellt
die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines stabilisierten,
getrockneten pharmazeutischen Präparats
aus einer infektiösen, gentechnisch
inaktivierten Herpesvirusvakzine, die in einer wässrigen Flüssigkeit zur Injektion dispergierbar
ist, bereit, umfassend das Gefriertrocknen einer sterilen, wässrigen
Zusammensetzung, die (i) als aktive Vakzinekomponente infektiöses, gentechnisch inaktiviertes
Herpesvirus, z.B. ein Herpes-simplex-Virus oder Varicella-Zoster-Virus,
(ii) oben genanntes pflanzliches Pepton, (iii) einen Puffer, wie beispielsweise
Tris-HCl, Phosphat und/oder Citrat, und (iv) Saccharid oder einen
Zuckeralkohol, wie beispielsweise Lactose oder Sorbit, umfasst.
Die Zusammensetzung kann gegebenenfalls auch (v) Dextran oder ein
anderes Polysaccharid, beispielsweise mit einem Molekulargewicht über 5.000,
umfassen, das gegebenenfalls anstelle des pflanzlichen Peptons verwendet
werden kann.
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Das
Gefriertrocknen des Produkts kann über einen beliebigen geeigneten
Zeitraum gemäß einem herkömmlichen
Gefriertrocknungsverfahren durchgeführt werden, beispielsweise
bei einer Temperatur unter der Glastemperatur der gefrorenen Flüssigkeit, die
gefriergetrocknet werden soll, und das Produkt kann in Form eines
festen, getrockneten Kuchens in einer Glasphiole vorliegen, vorzugsweise
unter sterilen Bedingungen. Der Gefriertrocknungsvorgang kann allgemein
bekannte Verfahrensschritte umfassen, um Zweistufentrocknung durchzuführen, wobei ein
erster Schritt des Sublimierens des Wassergehalts bei einer Temperatur
von beispielsweise etwa – 40 °C oder darunter
stattfindet, wonach die Temperatur der Zusammensetzung auf eine
höhere
Temperatur erhöht
wird, beispielsweise 0 bis +10 °C,
wobei das Trocknen zu diesem Zeitpunkt weit genug fortgeschritten
ist, dass der durch die teilweise getrocknete Zusammensetzung gebildete
Kuchen seine Gestalt bei einer höheren
Temperatur beibehalten kann, wobei während und nach solch einer
Temperaturerhöhung,
immer noch unter reduziertem Druck, eine weitere Menge Wasser entfernt
wird. In der Praxis zeigte sich, dass eine Verringerung des Wassergehalts
auf einen Wert im Bereich von etwa 2 bis etwa 9 Gew.-% leicht erreicht
werden kann und für
die Produktstabilität
ausreicht.
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Das
Produkt kann je nach Bedarf mit einer sterilen, wässrigen
Flüssigkeit,
beispielsweise Wasser zur Injektion, rehydratisiert werden.
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Weiters
wird gemäß vorliegender
Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Flüssigpräparats aus einer Virusvakzine
zur Injektion bereitgestellt, welches das Dispergieren oder Lösen eines
oben spezifizierten sterilen gefriergetrockneten Präparats, z.B.
eines stabilisierten, getrockneten pharmazeutischen Präparats eines
rekombinanten Herpes-simplex-Virus, in einer wässrigen Flüssigkeit zur Injektion umfasst,
um eine flüssige
Zusammensetzung mit annähernd
isotonischer Konzentration herzustellen.
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Beispiele
für die
vorliegende Erfindung sind stabilisierte, getrocknete Präparate von
aktivem Herpesvirus, die durch Trocknen von flüssigen, wässrigen Präparaten erhalten werden, die
folgende Stabilisatoren enthalten (Gew./Vol.): Disaccharid 2 – 12 %, z.B.
Saccharose, Lactose und/oder Trehalose, vorzugsweise zumindest zwei
Disaccharide, jeweils zu zumindest 2 %; gegebenenfalls ein Monosaccharid oder
einen Monosaccharid-Zuckeralkohol, z.B. 1,5 – 4 % Sorbit; gegebenenfalls
1 – 5
% Dextran; gegebenenfalls 0,05 – 0,7
% Natriumglutamat oder -aspartat; und 1 – 4 % pflanzliches Pepton.
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Die
Zusammensetzungen können
außerdem andere
Materialien, wie beispielsweise andere Kolloide, die vorhanden waren,
vorzugsweise Polysaccharide oder Polysaccharidderivate, wie z.B.
Hydroxyethylstärke,
umfassen.
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Das
Virus der Formulierungen kann im Allgemeinen ein Lebendvirus, das
vorzugsweise attenuiert oder gentechnisch inaktiviert ist, umfassen.
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Das
Virus ist ein infektiöses,
gentechnisch inaktiviertes Herpesvirus und kann beispielsweise eines
der gentechnisch inaktivierten Viren sein, die in der WO 92/05.263
(Immunology Ltd.: Inglis et al.), in LH Nguyen, D Knipe et al.,
J. Virol. 66(12), 7067-7072
(Dez. 1992); in der WO 94/01.573 (Akzo: Peeters et al.), in der
WO 94/03.595 (Akzo: Visser et al.), in der WO 94/21.807 (Cantab
Pharmaceuticals Research Ltd.: Inglis et al.), in der WO 95/18.852 (Harvard
College und Dana-Farber Cancer Institute: D Knipe et al.), in der
WO 96/04.395 (Lynxvale Ltd.: P Speck) und in der WO 96/26.267 (Cantab
Pharmaceuticals Research Ltd.: MEG Boursnell et al.) angeführt sind.
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Insbesondere
nützliche
Anwendungen umfassen die Stabilisierung von HSV, beispielsweise HSV-2,
z.B. in Form von inaktiviertem HSV-2, wie es beispielsweise in der
WO 94/21.807 (Cantab Pharmaceuticals: Inglis et al.) und der WO
96/26.267 (Cantab Pharmaceuticals Research Ltd.: MEG Boursnell et
al.) beschrieben ist, beispielsweise in Ausführungsformen, worin das Virus
exogenes genetisches Material trägt,
das für
einen Immunomodulator oder ein heterologes Antigen kodiert. Andere
Herpesviren, wie beispielsweise VZV, BHV und PRV, können ebenfalls
wie hierin beschrieben formuliert werden.
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Beispiele
für Zusammensetzungen
gemäß vorliegender
Erfindung können
beispielsweise Immunogene und Vakzinen und virale Vektorpräparate für In-vivo-
und Ex-vivo-Verwendungen umfassen. Die Zusammensetzungen können auch
andere Immunogene als das oben beschriebene Virus enthalten, beispielsweise
Immunomodulatoren, wie z.B. Interleukine, z.B. IL-12; und allgemein
bekannte Stabilisatoren und Exzipienten, wie sie für eine bestimmte
Anwendung wünschenswert
sind.
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Eine
Zusammensetzung, wie sie hierin beschrieben ist, kann vor dem Trocknungsschritt
durch einen Sterilisationsfilter laufen gelassen werden und steril
sein (abgesehen davon, dass sie beispielsweise beliebige gewünschte und
beabsichtigte biologische Aktivität aufweisen kann, wie beispielsweise
die des Virus selbst).
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Beispiele
für die
hierdurch bereitgestellten Zusammensetzungen können frei von Bestandteilen bovinen
Ursprungs, und in manchen Fällen
auch anderen (oder jeden) tierischen Ursprungs, sein.
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Hierdurch
bereitgestellte Zusammensetzungen können zweckdienliche Stabilität, beispielsweise in
Bezug auf den Anteil eines infektiösen Virus, das den Gefriertrocknungsvorgang überlebt,
und/oder in Bezug auf die Lagerstabilität des Gefriertrocknungsprodukts über längere Zeiträume, beispielsweise
bei Lagerung bei Temperaturen im Bereich von etwa 4 – 10 °C, z.B. etwa
8 °C, aufweisen.
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Die
Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele veranschaulicht,
die jedoch keineswegs zu Einschränkung
des Schutzumfangs der Erfindung dienen.
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Beispiel 1
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Ein
Flüssigpräparat eines
gentechnisch inaktivierten Herpes-simplex-Virus Typ 2 HSV-2 (siehe Beschreibung
der WO 94/21.807, wobei die Erfindung auch für andere Viren anwendbar ist)
kann gemäß einem
Beispiel der vorliegenden Erfindung gefriergetrocknet werden, indem
das Virus in einer wässrigen
Flüssigkeit
der folgenden Zusammensetzung dispergiert wird (Gew./Vol. in Wasser):
5 % Lactose, 5 % Saccharose, 1,8 % Sorbit, 0,1 % Natriumglutamat,
2 % pflanzliches Pepton, Puffer pH 5,5 – pH 8, vorzugsweise etwa pH
7 (etwa 50 bis 100 mM Tris-HCl, etwa 10 mM Natriumcitrat mit zusätzlichem Natriumchlorid,
z.B. bis zu etwa 138 mM, oder 10 mM Natrium- und Kaliumphosphat)
und das Produkt auf herkömmliche
Weise in herkömmlichen
Glasphiolen gefriergetrocknet wird.
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In
Varianten dieses Beispiels kann die Lactose durch Saccharose oder
Trehalose ersetzt oder weggelassen werden.
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Nach
etwa 16-wöchiger
Lagerung bei 8 °C wiesen
bestimmte gemäß diesem
Beispiel hergestellte Proben, in denen Phosphatpuffer vorhanden war,
einen Titer in pfu/ml (des ursprünglichen
Flüssigkeitsvolumens
vor dem Gefriertrocknen) innerhalb von 0,5 eines Logarithmus des
Titers auf, der direkt nach dem Gefriertrocknen vorhanden war, und
besaßen
einen Titer im Bereich von 105 bis 106 pfu/ml bezogen auf das Flüssigvolumen
vor dem Gefriertrocknen.
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In
einer Variante dieses Beispiel kann Tris-Puffer anstelle von Phosphatpuffer
verwendet werden.
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Beispiel 2
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Ein
gefriergetrocknetes Präparat
des gentechnisch inaktivierten HSV-2 des vorangegangenen Beispiels
kann wie im vorangegangenen Beispiel hergestellt werden, mit der
Ausnahme, dass die Flüssigkeit
vor dem Gefriertrocknen neben dem Virus Fol gendes umfasst: 2,5 %
Dextran (Molekulargewicht etwa 11.000 bis 40.000 oder mehr, vorzugsweise etwa
11.000), 0,5 % Natriumglutamat, 2,5 % Saccharose und einen Puffer
pH 5,5 – pH
8, vorzugsweise etwa pH 7, wie in Beispiel 1 beschrieben.
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In
einer Variante dieses Beispiels umfasst der Puffer ein M-199-Gewebekulturmedium,
und nach etwa 52-wöchiger
Lagerung bei 8 °C
wiesen gemäß diesem
Beispiel hergestellte Proben einen Titer in pfu/ml (des ursprünglichen
Flüssigkeitsvolumens vor
dem Gefriertrocknen) innerhalb von 0,5 eines Logarithmus des Titers
auf, der direkt nach dem Gefriertrocknen vorhanden war, und besaßen einen
Titer im Bereich von 105 bis 106 pfu/ml
bezogen auf das Flüssigvolumen
vor dem Gefriertrocknen.
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In
Varianten dieses Beispiel kann Saccharose durch Trehalose ersetzt
werden.
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Nach
etwa 54-wöchiger
Lagerung bei 8 °C wiesen
bestimmte gemäß diesem
Beispiel hergestellte Proben, in denen Trehalose vorhanden war,
einen Titer in pfu/ml (des ursprünglichen
Flüssigkeitsvolumens
vor dem Gefriertrocknen) innerhalb von 0,5 eines Logarithmus des
Titers auf, der direkt nach dem Gefriertrocknen vorhanden war.
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Beispiel 3
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Ein
gefriergetrocknetes Präparat
eines gentechnisch inaktivierten HSV-2 gemäß Beispiel 1 kann wie in Beispiel
1 hergestellt werden, wobei die Komponenten aus Beispiel 2 verwendet
werden, mit der Ausnahme, dass die Dextrankomponente Dextran mit
einem Molekulargewicht von etwa 40.000 ist.
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Nach
etwa 54-wöchiger
Lagerung bei 8 °C wiesen
bestimmte gemäß diesem
Beispiel hergestellte Proben einen Titer in pfu/ml (des ursprünglichen
Flüssigkeitsvolumens
vor dem Gefriertrocknen) innerhalb von 0,5 eines Logarithmus des
Titers auf, der direkt nach dem Gefriertrocknen vorhanden war.
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Beispiel 4
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Ein
gefriergetrocknetes Präparat
des gentechnisch inaktivierten HSV-2 aus Beispiel 1 kann wie in
Beispiel 1 hergestellt werden, mit der Ausnahme, dass die Flüssigkeit
vor dem Gefriertrocknen neben dem Virus Folgendes umfasst: 2,5 %
Dextran (Molekulargewicht etwa 11.000), 0,5 % Natriumglutamat, 2,5
% Saccharose und 0,1 M Tris-Puffer, vorzugsweise etwa pH 7,5.
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In
Varianten dieses Beispiel kann das Natriumglutamat weggelassen werden.
Dieses Beispiel ist frei von Proteinen, mit Ausnahme aller proteinbildenden
Teile der aktiven Vakzinekomponente.
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Nach
etwa 25-wöchiger
Lagerung bei 8 °C wiesen
bestimmte gemäß diesem
Beispiel hergestellte Proben einen Titer in pfu/ml (des ursprünglichen
Flüssigkeitsvolumens
vor dem Gefriertrocknen) innerhalb von 0,5 eines Logarithmus des
Titers auf, der direkt nach dem Gefriertrocknen vorhanden war, und
besaßen
einen Titer im Bereich von 105 bis 106 pfu/ml bezogen auf das Flüssigvolumen
vor dem Gefriertrocknen.
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Beispiel 5
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Ein
gefriergetrocknetes Präparat
des gentechnisch inaktivierten HSV-2 aus Beispiel 1 kann wie in
Beispiel 1 hergestellt werden, mit der Ausnahme, dass die Flüssigkeit
vor dem Gefriertrocknen neben dem Virus Folgendes umfasst: 2,5 %
Dextran (Molekulargewicht etwa 40.000), 0,5 % Natriumglutamat, 5 %
Saccharose und 0,05 M Tris-Puffer, vorzugsweise etwa pH 7,5.
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Dieses
Beispiel ist frei von Proteinen, mit Ausnahme aller proteinbildenden
Teile der aktiven Vakzinekomponente.
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Nach
etwa 40-wöchiger
Lagerung bei 8 °C wiesen
bestimmte gemäß diesem
Beispiel hergestellte Proben einen Titer in pfu/ml (des ursprünglichen
Flüssigkeitsvolumens
vor dem Gefriertrocknen) innerhalb von 0,5 eines Logarithmus des
Titers auf, der direkt nach dem Gefriertrocknen vorhanden war, und
besaßen
einen Titer im Bereich von 105 bis 106 pfu/ml bezogen auf das Flüssigvolumen
vor dem Gefriertrocknen.
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Beispiel 6
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Ein
gefriergetrocknetes Präparat
des gentechnisch inaktivierten HSV-2 aus Beispiel 1 kann wie in
Beispiel 1 hergestellt werden, mit der Ausnahme, dass die Flüssigkeit
vor dem Gefriertrocknen neben dem Virus Folgendes umfasst: 2,5 %
Dextran (Molekulargewicht etwa 40.000), 0,5 % Natriumglutamat, 2,5
% Saccharose und 0,1 M Tris-Puffer, vorzugsweise etwa pH 7,5.
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In
Varianten dieses Beispiels kann das Natriumglutamat weggelassen
werden.
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Dieses
Beispiel ist frei von Proteinen, mit Ausnahme aller proteinbildenden
Teile der aktiven Vakzinekomponente.
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Nach
etwa 40-wöchiger
Lagerung bei 8 °C wiesen
bestimmte gemäß diesem
Beispiel hergestellte Proben einen Titer in pfu/ml (des ursprünglichen
Flüssigkeitsvolumens
vor dem Gefriertrocknen) innerhalb von 0,5 eines Logarithmus des
Titers auf, der direkt nach dem Gefriertrocknen vorhanden war.
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Beispiel 7
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Ein
gefriergetrocknetes Präparat
des gentechnisch inaktivierten HSV-2 aus Beispiel 1 kann wie in
Beispiel 1 hergestellt werden, mit der Ausnahme, dass die Flüssigkeit
vor dem Gefriertrocknen neben dem Virus Folgendes umfasst: 5 % Lactose,
2,5 Saccharose, 1,8 % D-Sorbit, 0,1 % Natriumglutamat, 2 % pflanzliches
Pepton und 0,05 M Tris-Puffer, vorzugsweise etwa pH 7,5.
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In
einer Variante dieses Beispiels kann das Natriumglutamat weggelassen
werden. Dieses Beispiel ist frei von Proteinen, mit Ausnahme aller
proteinbildenden Teile der aktiven Vakzinekomponente.
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Nach
etwa 25-wöchiger
Lagerung bei 8 °C wiesen
bestimmte gemäß diesem
Beispiel hergestellte Proben einen Titer in pfu/ml (des ursprünglichen
Flüssigkeitsvolumens
vor dem Gefriertrocknen) innerhalb von 0,5 eines Logarithmus des
Titers auf, der direkt nach dem Gefriertrocknen vorhanden war.
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Beispiel 8
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Ein
gefriergetrocknetes Präparat
des gentechnisch inaktivierten HSV-2 aus Beispiel 1 kann wie in
Beispiel 1 hergestellt werden, mit der Ausnahme, dass die Flüssigkeit
vor dem Gefriertrocknen neben dem Virus Folgendes umfasst: 5 % Lactose,
5 % Saccharose, 1,8 % D-Sorbit, 2 % pflanzliches Pepton und 0,1
M Tris-Puffer, vorzugsweise etwa pH 7,5.
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Dieses
Beispiel ist frei von Proteinen, mit Ausnahme aller proteinbildenden
Teile der aktiven Vakzinekomponente.
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Nach
etwa 25-wöchiger
Lagerung bei 8 °C wiesen
bestimmte gemäß diesem
Beispiel hergestellte Proben, bei denen Natriumglutamat weggelassen
und das Gelatinehydrolysat durch pflanzliches Pepton ersetzt wurde,
einen Titer in pfu/ml (des ursprünglichen
Flüssigkeitsvolumens
vor dem Gefriertrocknen) innerhalb von 0,5 eines Logarithmus des Titers
auf, der direkt nach dem Gefriertrocknen vorhanden war.
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Beispiele
für Zusammensetzungen
gemäß vorliegender
Erfindung können
geeigneterweise unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren gefriergetrocknet
werden, die auf dem Gebiet des Gefriertrocknens von biologischem
Material allgemein bekannt sind.
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Beispielsweise
kann das folgende Gefriertrocknungsverfahren in Zusammenhang mit
Zusammensetzungen gemäß vorliegender
Erfindung, beispielsweise gemäß den oben
genannten Beispielen, verwendet werden, das nachstehend erläutert ist
und keineswegs zur Einschränkung
des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung dient.
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Eine
Viruszusammensetzung zum Gefriertrocknen, wie es hierin beschrieben
ist, wird zuerst 2 Stunden lang bei -60 °C gefroren und dann unter Verwendung
des folgenden Trocknungsverfahrens unter reduziertem Druck von 100
Mtorr getrocknet:
Die Temperatur der Zusammensetzung wird über einen
Zeitraum von einer Stunde nach und nach auf -42 °C erhöht und weitere 60 Stunden lang
bei diesem Wert gehalten. Dann wird die Temperatur über einen
Zeitraum von 5 Stunden auf +5 °C
erhöht
und etwa weitere 7 Stunden lang bei diesem Wert gehalten. Schließlich wird
die Temperatur über
einen Zeitraum von einer Stunde auf +10 °C erhöht und etwa weitere 7 Stunden
bei diesem Wert gehalten.
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Ein
alternatives und manchmal bevorzugtes Trocknungsverfahren sieht
wie folgt aus: Die Zusammensetzung wird gefroren, indem ihre Temperatur über einen
Zeitraum von einer Stunden auf -40 °C gesenkt und weitere 2 Stunden
bei diesem Wert gehalten wird. Die Zusammensetzung kann dann einem Schritt
unterzogen werden, der dazu dient, eine Vergrößerung von Eiskristallen herbeizuführen: Die Temperatur
wird über
einen Zeitraum von etwa 45 min auf -15 °C erhöht und weitere 2 Stunden bei
diesem Wert gehalten. Dann kann die Temperatur über einen Zeitraum von 25 min
wieder auf -40 °C
gesenkt werden, wonach die Zusammensetzung unter reduziertem Druck
von 50 Mtorr unter Verwendung des folgenden Trocknungsverfahrens
getrocknet werden kann. Die Temperatur wird 2 Stunden lang bei -40 °C gehalten,
dann über
einen Zeitraum von 45 min auf -15 °C erhöht und eine weitere Stunde
bei die sem Wert gehalten. Dann wird die Temperatur über einen Zeitraum
von einer Stunde auf -35 ° gesenkt
und weitere 32 Stunden bei diesem Wert gehalten. Dann kann die Temperatur
auf über
einen Zeitraum von 3 Stunden +5 °C
erhöht
und weitere 8 Stunden auf diesem Wert gehalten werden.
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In
einer Variante dieses Beispiels kann die Temperatur nach dem Frieren
der Zusammensetzung anstelle von auf -15 °C auf 0 °C erhöht werden.