DE69918283T2

DE69918283T2 - Stabilisierte herpesvirusformulierung

Info

Publication number: DE69918283T2
Application number: DE1999618283
Authority: DE
Inventors: Alison Claire VARLEY; Thomas Peter LOUDON
Original assignee: Cantab Pharmaceuticals Research Ltd
Current assignee: Cantab Pharmaceuticals Research Ltd
Priority date: 1998-04-24
Filing date: 1999-04-26
Publication date: 2005-07-21
Anticipated expiration: 2019-04-27
Also published as: EP1071438A2; US6258362B1; WO1999055348A3; CA2329000C; WO1999055348A2; EP1071438B1; GB9808922D0; PT1071438E; JP2002512970A; ES2224646T3; CA2329000A1; ATE269712T1; AU3718299A; DK1071438T3; DE69918283D1

Description

Diese Erfindung betrifft Präparate von Viren, beispielsweise für Vakzinen oder andere pharmazeutische oder forschungsbezogene Zwecke, ihre Stabilisierung und Verfahren zur Herstellung solche Präparate sowie ihre Verwendung, beispielsweise als Vakzine oder als Virusvektor.
Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik
Das Einfrieren und/oder Gefriertrocknen von lebensfähigen Viruspräparaten für Labor- oder Impfzwecke, um ihre Aktivität zu erhalten, ist bekannt.
Zahlreiche Verfahren sind bekannt, um Lebendviruspräparate, wie beispielsweise Herpesviruspräparate, für Vakzinen und andere Zwecke herzustellen.
Die US 5.024.836 (91.06.18) (Merck & Co. Inc.: WJ McAleer et al.) beschreibt eine stabile, gefriergetrocknete Lebendherpesvirusvakzine, die etwa 0,5 % bis etwa 8 Feuchtigkeit aufweist, und beansprucht eine gasinjizierte, gefriergetrocknete Lebendvakzine eines attenuierten Varicella-Virus, die 2 % bis 8 % Feuchtigkeit aufweist.
Die US 5075110 (91.12.24) und EP 0.353.108 (Institut Merieux: AJ Francon et al.) beschreiben die Stabilisierung von attenuierten gefriergetrockneten Vakzinen mit Amid- oder Thioamid-Gefriertrocknungsexzipienten, wie beispielsweise Harnstoff.
Die EP 0.048.194 (Merck & Co. Inc.: MR Hilleman et al.) beschreibt Gefriertrocknungsverfahren, bei denen die Gefriertrocknungsdauer und -kosten durch Einfrieren der äußeren Hülle einer Flüssigvakzine vor der Gefriertrocknung verringert werden, indem die Phiole liegend in einem Flüssigkeitsbad rotiert wird, das auf einer Temperatur unter dem eutektischen Punkt der Vakzine gehalten wird.
Die US 4.338.335 (82.07.06) und EP 0.028.563 (Merck & Co. Inc.: WJ McAlleer et al.) beschreiben Stabilisatoren für Flüssigvakzinen und stabilisierte, flüssige Lebendvirusvakzinen, die ein lebendes Virus, teilweise hydrolysierte Gelatine, ein Monosaccharid oder Disaccharid, ein Zellkulturmedium, L-Glutaminsäure, L-Arginin und einen Puffer zur Beibehaltung eines pH von etwa 6,0 bis etwa 6,5 enthalten.
Die EP 0.008.255 (Merck & Co. Inc.: WJ McAleer et al.) beschreibt eine Herpesvirusvakzine und ihre Herstellung, insbesondere eine Vakzine gegen die Mareksche Krankheit. Das Virus wird in Gegenwart eines pH-geregelten gepufferten Stabilisators gefriergetrocknet, sodass die Vakzine mit destilliertem Wasser wiederhergestellt werden kann.
Die EP 0.295.043 (88.12.14) (Kitasato Institute: S Makino et al.) beschreibt eine stabilisierte attenuierte Lebendvakzine, die zumindest einen lebenden attenuierten einfaches Virus, das aus Masern-, Mumps- oder Rötelnviren ausgewählt ist, und als Stabilisator Lactose, Saccharose, D-Sorbit, Natriumglutamat und Gelatinehydrolysat umfasst.
Die EP 0.252.059 (Smithkline Biologicals S.A.: E D'Hondt) beschreibt Stabilisatoren für attenuierte Vakzinen, die Lactose, Sorbit, Dextran, Caseinhydrolysat, L-Glutamat, EDTA und einen Puffer mit einem pH von 6,7–7,2 enthalten.
Die WO 96/29.096 (Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc.: H Kuma et al.) beschreibt die Herstellung von Gentransferpräparaten durch Gefriertrocknen eines Gemischs aus einem rekombinanten Virusvektor mit zumindest einem Additiv, ausgewählt aus Arginin, Glutaminsäure (oder einem Natriumsalz davon), Serin, Glucose, Inosit, Lactose, Mannit, Sorbit, Trehalose und Xylose.
Die US 4.985.244 (91.01.15) (Kitasato Institute: S Makino et al.) beschreibt eine stabilisierte, attenuierte Lebendvakzine mit verbesserter Wärmestabilität, die einfache lebende attenuierte Masern-, Mumps- oder Rötelnvirenvakzinen umfassen, die in ei nem Medium-199 als Zellkultur gezüchtet wurden, oder eine kombinierte attenuierte Lebendvakzine, die mit Lactose, Saccharose, D-Sorbit, Natriumglutamat und Gelatinehydrolysat stabilisiert ist.
Die US 4.622.222 (86.11.11) (Phylaxia Oltoanyagtermelo Vallalat: E Horvth et al.) beschreibt eine gefriergetrocknete Vakzine gegen das Enten-Hepatitisvirus unter Verwendung eines attenuierten Virus sowie ihre Herstellung unter Verwendung von infizierten Entenembryos, einschließlich das Gefriertrocknens des sterilen Virusmaterials mit Kollidon, Gelatine, Glucose und Saccharose.
Die US 4.500.512 (85.02.19) (Institut Pasteur: M Barme) beschreibt stabilisierte Vakzinen, die Lebendviren enthalten, insbesondere für das Gelbfiebervirus, und Stabilisatoren, die Phosphatpuffer, Calcium- und Magnesiumionen, Lactose, Sorbit und Aminosäure, ausgewählt aus Histidin, Alanin, Valin, Threonin, Arginin, Methionin, Hydroxyprolin, Lysin, Isoleucin, Phenlyalanin, Serin, vorzugsweise Histidin und Alanin, enthalten. Die stabilisierte Vakzine ist gefriergetrocknet.
Die US 3.985.615 (Osaka Res Foundation: T Kubo et al.) beschreibt die Herstellung von lebenden, attenuierten Varicella-Viren zur Verwendung als Vakzine durch Kultivierung, welche eine Passage in primären Embryonengewebezellen von Meerschweinchen umfasst. Die US 5.024.836 (Merck: WJ McAleer et al.) betrifft die Herstellung von gefriergetrockneten Vakzinepräparaten, die darauf basieren.
Die US 5.792.643 (97.03.28) und WO 95/10.601 (Viagene SM Hermann et al.) offenbaren die Konservierung von infektiösen rekombinanten Viren unter Verwendung eines Saccharids, eines Struktur-Additivs mit hohem Molekulargewicht, eines Puffer und von Wasser, wobei das Gemisch auf unter den eutektischen Punkt oder die Glastemperatur abgekühlt wird und Wasser durch Sublimation auf weniger als 10 % Wassergehalt verringert wird.
Die WO 93/18.790 (LK Csatary) beschreibt gefriergetrocknete Virusvakzinen (z.B. eine MDV-Vakzine) mit modifizierter Stärke, wie beispielsweise Hydroxyethylstärke mit einem Molekulargewicht von 100.000 – 300.000, die vor der Gefriertrocknung als Schutzkolloid zugesetzt wird.
Die JP 06.234.659 (94.08.23) (ZH Handai Biseibutsubyo Kenkyukai) offenbart eine stabilisierte Lebendvakzine, die ein attenuiertes oder rekombinantes Lebendvaricellavirus und einen Stabilisator umfasst, der frei von Ca2+-Ionen und Mg2+-Ionen ist, vorzugsweise mit Gelatine oder einem Gelatinehydrolysat oder einem Chelatbildner, wie z.B. EDTA.
Die EP 0.290.197 (88.11.09) (Merck & Co. Inc.: RZ Maigetter et al.) offenbart eine stabile gasinjizierte gefriergetrocknete Lebendherpesvirusvakzine, die 0,5 – 8 % Feuchtigkeit aufweist, was eine Lagerung eher bei herkömmlichen Kühlschrankbedingungen, d.h. 5 °C, als bei Gefrierbedingungen (-20 °C) ermöglicht. Die Gasinjektion während des primären Zyklus des Gefriertrocknungsvorgangs und das Trocknen mit höheren Feuchtigkeitswerten verringert die Gefriertrocknungsdauer, typischerweise auf 7 – 11 h für den primären und sekundären Zyklus zusammen.
Die DD-209.738 (Cent Cerc Bioprep: IV Patrascu) offenbart die Herstellung einer Herpesvirusvakzine gegen die Mareksche Krankheit durch (a) Kultivieren von Embryozellen auf Dextran-Mikrokügelchen); (b) Inokulieren der Kultur bei 80 % Konfluenz mit dem Truthahn-Herpesvirusstamm FC-126; (c) Gewinnen der infizierten Zellen in einem SPGA-Medium (Saccharose, Phosphat, Glutamat, Rinderalbuminfraktion V), wenn die zytopathische Wirkung 80 % erreicht; (d) Pulsen und Zentrifugieren, um eine erste Ernte der Vakzine zu gewinnen; (e) Resuspendieren des Niederschlags in einem SPGA-Medium und Wiederholen des Schritts (d), um eine zweite Vakzineernte zu erhalten (um die Vakzineausbeute zu erhöhen); (f) Einfrieren der vereinigten Vakzinen bei -100 °C, bevor der Virustiter bestimmt wird; und (g) Verdünnen mit einem SPGA-Medium und Gefriertrocknen.
Die JP 06.234.659-A (ZH Handai Biseibutsubyo Kenkyukai) beschreibt in einem Beispiel die Herstellung einer Herpesvirusvakzine auf menschlichen diploiden Fibroblasten-MRC-5-Zellen, die in einem MEM-Medium bei 37 °C kultiviert wurden; umfassend das Inokulieren eines Oka-Stamm-Varicella-Virus-Einsaat-Virus bei einem MOI von 0,03 in MRC-5-Zellen und 2 Tage langes Kultivieren bei 37 °C. Das Virus wird dann in einer Lösung suspendiert, die NaCl, KCl, Na₂HPO₄, KH₂PO₄, Saccharose, L-Glutamat, Gelatine, Gelatinehydrolysat und EDA-3Na enthält.
Die EP 0.573.107 , US 5.360.736 und US 5.607.852 (Merck: PA Friedman et al.) beschreiben Verfahren zur Herstellung einer attenuierten Varicella-Zoster-Virusvakzine.
Die WO 98/28.000 (Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, US: DB Volkin et al.) beschreibt Vakzineformulierungen (z.B. Masern, Mumps, Röteln, VZV oder Herpes simplex), die Polyalkohol mit 6 Kohlenstoffen, Disaccharid und einen Puffer umfassen.
Die US 3.915.794 (Recherche et Industrie Therapeutique, Belgien: Z Nathan und J Petermans) beschreibt stabile Viruspräparate, die ein Herpesvirus der Gruppe B (z.B. Truthahn-Herpesvirus) und eine gepufferte wässrige Lösung pH 6,5 – 7,5 umfassen, die Polyvinylpyrrolidon, Zucker, Glutamat und einen Chelatbildner enthalten.
Die US 4.147.772 (79.04.03) (Merck & Co. Inc.: WJ McAleer et al.) beschreibt eine gefriergetrocknete Vakzine mit einem pH zwischen etwa 6,0 und 6,5, die ein Lebendvirus, teilweise hydrolysierte Gelatine (Molekulargewicht etwa 3.000), einen Polyalkohol mit 6 Kohlenstoffen, ein Zellkulturmedium und einen sauren Puffer umfasst.
Die US 5.665.362 und WO 92/05.263 (Cantab Pharmaceuticals Research Ltd.: SC Inglis et al.) und US 5.837.261 und WO 94/21.807 (Cantab Pharmaceuticals Research: Inglis et al.) und darin zitierte Dokumente beschreiben den Stand der Technik in Bezug auf gentechnisch inaktivierte infektiöse Herpesviren, wie beispielsweise das Herpes-simplex-Virus, z.B. zu Impfzwecken und zur Bereitstellung von rekombinanten Zellen, und Kultivierungsverfahren zu ihrer Herstellung. Andere Offenbarun gen eines gentechnisch inaktivierten Herpesvirus und von Zellen zu seiner Herstellung sind ebenfalls im Stand der Technik enthalten, wobei weiter unten auf einige davon Bezug genommen wird.
Die Bereitstellung von weiteren Formen stabilisierter Viruspräparate, beispielsweise zu Impfzwecken, bleibt wünschenswert.
Die vorliegende Erfindung
Gemäß vorliegender Erfindung wird eine stabilisierte, getrocknete pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend ein Virus, das in einer wässrigen Flüssigkeit zur Injektion dispergierbar ist und Folgendes umfasst: ein infektiöses, gentechnisch inaktiviertes Herpesvirus als aktive Vakzinekomponente; pflanzliches Pepton; einen Puffer; und Saccharid oder Zuckeralkohol oder ein anderes Mono- oder Oligosaccharid oder Derivat davon, z.B. Lactose oder Sorbit. Die Zusammensetzung kann gegebenenfalls auch Dextran oder ein anderes Polysaccharid mit einem Molekulargewicht über etwa 5.000 enthalten, das, falls gewünscht, das pflanzliche Pepton ersetzen kann. Optionale weitere Bestandteile können eine weitere Aminosäure, z.B. zweibasige Aminosäuren, wie z.B. Natrium-L-glutamat oder -L-Aspartat, oder ein Gemisch von Aminosäuren umfassen. Zu den weiteren Bestandteilen, die gegebenenfalls geeignet sind, gehören jene, die in den oben genannten Dokumenten über den Stand der Technik angeführt sind, vorzugsweise solche pflanzlichen oder mineralischen Ursprungs.
In bestimmten Beispielen können die stabilisierten, getrockneten pharmazeutischen Zusammensetzungen (i) ein infektiöses, gentechnisch inaktiviertes Herpesvirus als aktive Komponente, beispielsweise zur Verwendung als Vakzine oder als Virusvektor, z.B. für eine Gentherapie, vorzugsweise HSV oder Varicella-Zoster-Virus, (ii) ein Polysaccharid mit einem Molekulargewicht von über etwa 5.000, vorzugsweise etwa 11.000 bis etwa 40.000, und weniger als 70.000, wie beispielsweise Dextran, und/oder eine Quelle gemischter Aminosäuren pflanzlichen oder bakteriellen Ur sprungs, wie beispielsweise pflanzliches Pepton, z.B. Pepton, das durch enzymatische Hydrolyse von Sojabohnenprotein hergestellt wird, (iii) einen Puffer, beispielsweise Tris-HCl, Bicarbonat, Phosphat und/oder Citrat, und (iv) ein Monosaccharid oder einen Zuckeralkohol, wie beispielsweise Lactose, Saccharose, Trehalose oder Sorbit, enthalten. Bestimmte Beispiele können eines, nicht aber beide der oben genannten Polysaccharidkomponenten und der Quelle gemischter Aminosäuren enthalten. Neben den oben genannten Komponenten kann die Zusammensetzung auch zusätzliche Bestandteile enthalten, die weitere Aminosäuren, wie beispielsweise zweibasige Aminosäuren, wie z.B. Natrium-L-glutamat oder -L-Aspartat, oder ein Gemisch von Aminosäuren umfassen. Beispiele für zusätzliche Bestandteile, die geeignete Komponenten der Zusammensetzungen gemäß vorliegender Erfindung darstellen können, sind jene, die in den oben genannten Dokumenten des Stands der Technik angeführt sind, insbesondere Beispiele pflanzlichen oder mineralischen Ursprungs.
Zusammensetzungen gemäß vorliegender Erfindung umfassen Beispiele, die frei von Protein sind (mit Ausnahme der proteinbildenden Teile der aktiven Vakzinekomponente), insbesondere frei von Gelatine oder anderem tierischem Protein oder seinem Hydrolysat oder anderem Material tierischen Ursprungs. Umfassen die Zusammensetzungen eine Quelle gemischter Aminosäuren, wie beispielsweise tierisches Pepton, können sie frei von Materialien mit einem Molekulargewicht von über etwa 2.000 sein, beispielsweise frei von Materialien mit einem Molekulargewicht über etwa 1.500 (mit Ausnahme des materialbildenden Teils der aktiven Vakzinekomponente).
Es zeigte sich, dass gefriergetrocknete Zusammensetzungen, wie sie hierin beschrieben sind, am Ende von zweckmäßigen Lagerzeiten bei mäßigen Temperaturen, z.B. über 0 °C, z.B. bei etwa 8 °C, nach dem Gefriertrocknen der Zusammensetzung gute Beibehaltung des Titers aufweisen. Unter bestimmen Testbedingungen behielten die getrockneten Zusammensetzungen ohne Einschränkungen bei 8 °C 16 Wochen oder 52 Wochen lang einen Titer eines infektiösen Virus innerhalb von 0,5 eines Logarithmus des Titers bei, der direkt nach dem Gefriertrocknen vorhanden war, z.B. bei Titern im Bereich von 10⁵ bis 10⁶ pfu/ml in Bezug auf das Flüssigvolumen vor dem Gefriertrocknen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung von pflanzlichem Pepton oder anderen gemischten Aminosäuren pflanzlichen oder bakteriellen Ursprungs, die frei von tierischem Protein oder tierischem Proteinhydrolysat sind, oder anderen Materialien tierischen Ursprungs in Zusammensetzungen zur Stabilisierung eines Virus und bei der Herstellung von getrockneten, stabilisierten Viruszusammensetzungen für eine Vakzine und andere hierin genannte Verwendungen.
Pflanzliches Pepton, zur Herstellung von Zusammensetzungen gemäß vorliegender Erfindung geeignet und zur Zeit bevorzugt, kann beispielsweise im Wesentlichen aus einem Präparat bestehen, dass durch hydrolytische Verdauung mit Protease aus reinem, genießbarem, lösungsmittelextrahiertem Sojamehl hergestellt wurde, um ein Produkt mit einem mittleren Molekulargewicht im Bereich von etwa 300 – 400 zu erhalten, das im Wesentlichen frei von Bestandteilen mit höherem Molekulargewicht über etwa 2.000 ist. Ein lösliches Kohlenhydrat pflanzlichen Ursprungs kann auch in solch einem Peptonpräparat vorhanden sein. Alternativ dazu können gemischte Aminosäuren pflanzlichen oder bakteriellen Ursprungs wie oben beschrieben anstelle des Peptons verwendet werden.
Zusammensetzungen gemäß vorliegender Erfindung können im Allgemeinen gemäß allgemein bekannten pharmazeutischen Verfahren hergestellt werden, sodass sie annehmbare Standards, beispielsweise in Bezug auf die Sterilität, erreichen.
Der Gesamtgehalt von Komponenten im getrockneten Präparat kann so gewählt sein, dass die Zusammensetzung bei ihrer Wiederherstellung mit einer sterilen Flüssigkeit zur Injektion, beispielsweise Wasser zur Injektion oder Salzlösung zur Injektion, verwendet werden kann, um eine Injektion bereitzustellen, die eine annehmbare Annäherung an eine isotonische Konzentration darstellt. Eine exakte isotonische Konzentration stellt etwa 330 mOsm bereit, und in Übereinstimmung mit derzeitigen Praktiken kann es eine annehmbare Annäherung sein, um diese beispielsweise innerhalb eines Bereichs von etwa 100 – 600 mOsm, im Allgemeinen innerhalb etwa 250 – 450 mOsm zu erreichen. "Isotonisch" bezieht sich hierin normalerweise auf solch eine Annäherung.
Die Virusdosis in einem gefriergetrockneten Präparat gemäß einem Beispiel der Erfindung kann so gewählt sein, dass in der wiederhergestellten Flüssigkeit zur Injektion eine Dosis von beispielsweise etwa 10³ bis etwa 10⁸ pfu des Virus erhalten werden. Ein häufig gewähltes Beispiel für ein Dosisvolumen zur Injektion ist etwa 0,5 ml.
Das gefriergetrocknete Präparat kann aus einer flüssigen Zusammensetzung hergestellt werden, die entweder die gleiche Konzentration ihrer Hauptkomponenten aufweist wie die wiederherzustellende Flüssigkeit oder eine höhere oder niedrigere Konzentration aufweist.
Der Feuchtigkeitsgehalt des gefriergetrockneten Produkts kann im Bereich von 0,5 bis 15 % und unter etwa 10 %, beispielsweise unter etwa 5 %, beispielsweise bei bis zu etwa 2 % oder darunter, liegen.
Außerdem stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines stabilisierten, getrockneten pharmazeutischen Präparats aus einer infektiösen, gentechnisch inaktivierten Herpesvirusvakzine, die in einer wässrigen Flüssigkeit zur Injektion dispergierbar ist, bereit, umfassend das Gefriertrocknen einer sterilen, wässrigen Zusammensetzung, die (i) als aktive Vakzinekomponente infektiöses, gentechnisch inaktiviertes Herpesvirus, z.B. ein Herpes-simplex-Virus oder Varicella-Zoster-Virus, (ii) oben genanntes pflanzliches Pepton, (iii) einen Puffer, wie beispielsweise Tris-HCl, Phosphat und/oder Citrat, und (iv) Saccharid oder einen Zuckeralkohol, wie beispielsweise Lactose oder Sorbit, umfasst. Die Zusammensetzung kann gegebenenfalls auch (v) Dextran oder ein anderes Polysaccharid, beispielsweise mit einem Molekulargewicht über 5.000, umfassen, das gegebenenfalls anstelle des pflanzlichen Peptons verwendet werden kann.
Das Gefriertrocknen des Produkts kann über einen beliebigen geeigneten Zeitraum gemäß einem herkömmlichen Gefriertrocknungsverfahren durchgeführt werden, beispielsweise bei einer Temperatur unter der Glastemperatur der gefrorenen Flüssigkeit, die gefriergetrocknet werden soll, und das Produkt kann in Form eines festen, getrockneten Kuchens in einer Glasphiole vorliegen, vorzugsweise unter sterilen Bedingungen. Der Gefriertrocknungsvorgang kann allgemein bekannte Verfahrensschritte umfassen, um Zweistufentrocknung durchzuführen, wobei ein erster Schritt des Sublimierens des Wassergehalts bei einer Temperatur von beispielsweise etwa – 40 °C oder darunter stattfindet, wonach die Temperatur der Zusammensetzung auf eine höhere Temperatur erhöht wird, beispielsweise 0 bis +10 °C, wobei das Trocknen zu diesem Zeitpunkt weit genug fortgeschritten ist, dass der durch die teilweise getrocknete Zusammensetzung gebildete Kuchen seine Gestalt bei einer höheren Temperatur beibehalten kann, wobei während und nach solch einer Temperaturerhöhung, immer noch unter reduziertem Druck, eine weitere Menge Wasser entfernt wird. In der Praxis zeigte sich, dass eine Verringerung des Wassergehalts auf einen Wert im Bereich von etwa 2 bis etwa 9 Gew.-% leicht erreicht werden kann und für die Produktstabilität ausreicht.
Das Produkt kann je nach Bedarf mit einer sterilen, wässrigen Flüssigkeit, beispielsweise Wasser zur Injektion, rehydratisiert werden.
Weiters wird gemäß vorliegender Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Flüssigpräparats aus einer Virusvakzine zur Injektion bereitgestellt, welches das Dispergieren oder Lösen eines oben spezifizierten sterilen gefriergetrockneten Präparats, z.B. eines stabilisierten, getrockneten pharmazeutischen Präparats eines rekombinanten Herpes-simplex-Virus, in einer wässrigen Flüssigkeit zur Injektion umfasst, um eine flüssige Zusammensetzung mit annähernd isotonischer Konzentration herzustellen.
Beispiele für die vorliegende Erfindung sind stabilisierte, getrocknete Präparate von aktivem Herpesvirus, die durch Trocknen von flüssigen, wässrigen Präparaten erhalten werden, die folgende Stabilisatoren enthalten (Gew./Vol.): Disaccharid 2 – 12 %, z.B. Saccharose, Lactose und/oder Trehalose, vorzugsweise zumindest zwei Disaccharide, jeweils zu zumindest 2 %; gegebenenfalls ein Monosaccharid oder einen Monosaccharid-Zuckeralkohol, z.B. 1,5 – 4 % Sorbit; gegebenenfalls 1 – 5 % Dextran; gegebenenfalls 0,05 – 0,7 % Natriumglutamat oder -aspartat; und 1 – 4 % pflanzliches Pepton.
Die Zusammensetzungen können außerdem andere Materialien, wie beispielsweise andere Kolloide, die vorhanden waren, vorzugsweise Polysaccharide oder Polysaccharidderivate, wie z.B. Hydroxyethylstärke, umfassen.
Das Virus der Formulierungen kann im Allgemeinen ein Lebendvirus, das vorzugsweise attenuiert oder gentechnisch inaktiviert ist, umfassen.
Das Virus ist ein infektiöses, gentechnisch inaktiviertes Herpesvirus und kann beispielsweise eines der gentechnisch inaktivierten Viren sein, die in der WO 92/05.263 (Immunology Ltd.: Inglis et al.), in LH Nguyen, D Knipe et al., J. Virol. 66(12), 7067-7072 (Dez. 1992); in der WO 94/01.573 (Akzo: Peeters et al.), in der WO 94/03.595 (Akzo: Visser et al.), in der WO 94/21.807 (Cantab Pharmaceuticals Research Ltd.: Inglis et al.), in der WO 95/18.852 (Harvard College und Dana-Farber Cancer Institute: D Knipe et al.), in der WO 96/04.395 (Lynxvale Ltd.: P Speck) und in der WO 96/26.267 (Cantab Pharmaceuticals Research Ltd.: MEG Boursnell et al.) angeführt sind.
Insbesondere nützliche Anwendungen umfassen die Stabilisierung von HSV, beispielsweise HSV-2, z.B. in Form von inaktiviertem HSV-2, wie es beispielsweise in der WO 94/21.807 (Cantab Pharmaceuticals: Inglis et al.) und der WO 96/26.267 (Cantab Pharmaceuticals Research Ltd.: MEG Boursnell et al.) beschrieben ist, beispielsweise in Ausführungsformen, worin das Virus exogenes genetisches Material trägt, das für einen Immunomodulator oder ein heterologes Antigen kodiert. Andere Herpesviren, wie beispielsweise VZV, BHV und PRV, können ebenfalls wie hierin beschrieben formuliert werden.
Beispiele für Zusammensetzungen gemäß vorliegender Erfindung können beispielsweise Immunogene und Vakzinen und virale Vektorpräparate für In-vivo- und Ex-vivo-Verwendungen umfassen. Die Zusammensetzungen können auch andere Immunogene als das oben beschriebene Virus enthalten, beispielsweise Immunomodulatoren, wie z.B. Interleukine, z.B. IL-12; und allgemein bekannte Stabilisatoren und Exzipienten, wie sie für eine bestimmte Anwendung wünschenswert sind.
Eine Zusammensetzung, wie sie hierin beschrieben ist, kann vor dem Trocknungsschritt durch einen Sterilisationsfilter laufen gelassen werden und steril sein (abgesehen davon, dass sie beispielsweise beliebige gewünschte und beabsichtigte biologische Aktivität aufweisen kann, wie beispielsweise die des Virus selbst).
Beispiele für die hierdurch bereitgestellten Zusammensetzungen können frei von Bestandteilen bovinen Ursprungs, und in manchen Fällen auch anderen (oder jeden) tierischen Ursprungs, sein.
Hierdurch bereitgestellte Zusammensetzungen können zweckdienliche Stabilität, beispielsweise in Bezug auf den Anteil eines infektiösen Virus, das den Gefriertrocknungsvorgang überlebt, und/oder in Bezug auf die Lagerstabilität des Gefriertrocknungsprodukts über längere Zeiträume, beispielsweise bei Lagerung bei Temperaturen im Bereich von etwa 4 – 10 °C, z.B. etwa 8 °C, aufweisen.
Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele veranschaulicht, die jedoch keineswegs zu Einschränkung des Schutzumfangs der Erfindung dienen.
Beispiel 1
Ein Flüssigpräparat eines gentechnisch inaktivierten Herpes-simplex-Virus Typ 2 HSV-2 (siehe Beschreibung der WO 94/21.807, wobei die Erfindung auch für andere Viren anwendbar ist) kann gemäß einem Beispiel der vorliegenden Erfindung gefriergetrocknet werden, indem das Virus in einer wässrigen Flüssigkeit der folgenden Zusammensetzung dispergiert wird (Gew./Vol. in Wasser): 5 % Lactose, 5 % Saccharose, 1,8 % Sorbit, 0,1 % Natriumglutamat, 2 % pflanzliches Pepton, Puffer pH 5,5 – pH 8, vorzugsweise etwa pH 7 (etwa 50 bis 100 mM Tris-HCl, etwa 10 mM Natriumcitrat mit zusätzlichem Natriumchlorid, z.B. bis zu etwa 138 mM, oder 10 mM Natrium- und Kaliumphosphat) und das Produkt auf herkömmliche Weise in herkömmlichen Glasphiolen gefriergetrocknet wird.
In Varianten dieses Beispiels kann die Lactose durch Saccharose oder Trehalose ersetzt oder weggelassen werden.
Nach etwa 16-wöchiger Lagerung bei 8 °C wiesen bestimmte gemäß diesem Beispiel hergestellte Proben, in denen Phosphatpuffer vorhanden war, einen Titer in pfu/ml (des ursprünglichen Flüssigkeitsvolumens vor dem Gefriertrocknen) innerhalb von 0,5 eines Logarithmus des Titers auf, der direkt nach dem Gefriertrocknen vorhanden war, und besaßen einen Titer im Bereich von 10⁵ bis 10⁶ pfu/ml bezogen auf das Flüssigvolumen vor dem Gefriertrocknen.
In einer Variante dieses Beispiel kann Tris-Puffer anstelle von Phosphatpuffer verwendet werden.
Beispiel 2
Ein gefriergetrocknetes Präparat des gentechnisch inaktivierten HSV-2 des vorangegangenen Beispiels kann wie im vorangegangenen Beispiel hergestellt werden, mit der Ausnahme, dass die Flüssigkeit vor dem Gefriertrocknen neben dem Virus Fol gendes umfasst: 2,5 % Dextran (Molekulargewicht etwa 11.000 bis 40.000 oder mehr, vorzugsweise etwa 11.000), 0,5 % Natriumglutamat, 2,5 % Saccharose und einen Puffer pH 5,5 – pH 8, vorzugsweise etwa pH 7, wie in Beispiel 1 beschrieben.
In einer Variante dieses Beispiels umfasst der Puffer ein M-199-Gewebekulturmedium, und nach etwa 52-wöchiger Lagerung bei 8 °C wiesen gemäß diesem Beispiel hergestellte Proben einen Titer in pfu/ml (des ursprünglichen Flüssigkeitsvolumens vor dem Gefriertrocknen) innerhalb von 0,5 eines Logarithmus des Titers auf, der direkt nach dem Gefriertrocknen vorhanden war, und besaßen einen Titer im Bereich von 10⁵ bis 10⁶ pfu/ml bezogen auf das Flüssigvolumen vor dem Gefriertrocknen.
In Varianten dieses Beispiel kann Saccharose durch Trehalose ersetzt werden.
Nach etwa 54-wöchiger Lagerung bei 8 °C wiesen bestimmte gemäß diesem Beispiel hergestellte Proben, in denen Trehalose vorhanden war, einen Titer in pfu/ml (des ursprünglichen Flüssigkeitsvolumens vor dem Gefriertrocknen) innerhalb von 0,5 eines Logarithmus des Titers auf, der direkt nach dem Gefriertrocknen vorhanden war.
Beispiel 3
Ein gefriergetrocknetes Präparat eines gentechnisch inaktivierten HSV-2 gemäß Beispiel 1 kann wie in Beispiel 1 hergestellt werden, wobei die Komponenten aus Beispiel 2 verwendet werden, mit der Ausnahme, dass die Dextrankomponente Dextran mit einem Molekulargewicht von etwa 40.000 ist.
Nach etwa 54-wöchiger Lagerung bei 8 °C wiesen bestimmte gemäß diesem Beispiel hergestellte Proben einen Titer in pfu/ml (des ursprünglichen Flüssigkeitsvolumens vor dem Gefriertrocknen) innerhalb von 0,5 eines Logarithmus des Titers auf, der direkt nach dem Gefriertrocknen vorhanden war.
Beispiel 4
Ein gefriergetrocknetes Präparat des gentechnisch inaktivierten HSV-2 aus Beispiel 1 kann wie in Beispiel 1 hergestellt werden, mit der Ausnahme, dass die Flüssigkeit vor dem Gefriertrocknen neben dem Virus Folgendes umfasst: 2,5 % Dextran (Molekulargewicht etwa 11.000), 0,5 % Natriumglutamat, 2,5 % Saccharose und 0,1 M Tris-Puffer, vorzugsweise etwa pH 7,5.
In Varianten dieses Beispiel kann das Natriumglutamat weggelassen werden. Dieses Beispiel ist frei von Proteinen, mit Ausnahme aller proteinbildenden Teile der aktiven Vakzinekomponente.
Nach etwa 25-wöchiger Lagerung bei 8 °C wiesen bestimmte gemäß diesem Beispiel hergestellte Proben einen Titer in pfu/ml (des ursprünglichen Flüssigkeitsvolumens vor dem Gefriertrocknen) innerhalb von 0,5 eines Logarithmus des Titers auf, der direkt nach dem Gefriertrocknen vorhanden war, und besaßen einen Titer im Bereich von 10⁵ bis 10⁶ pfu/ml bezogen auf das Flüssigvolumen vor dem Gefriertrocknen.
Beispiel 5
Ein gefriergetrocknetes Präparat des gentechnisch inaktivierten HSV-2 aus Beispiel 1 kann wie in Beispiel 1 hergestellt werden, mit der Ausnahme, dass die Flüssigkeit vor dem Gefriertrocknen neben dem Virus Folgendes umfasst: 2,5 % Dextran (Molekulargewicht etwa 40.000), 0,5 % Natriumglutamat, 5 % Saccharose und 0,05 M Tris-Puffer, vorzugsweise etwa pH 7,5.
Dieses Beispiel ist frei von Proteinen, mit Ausnahme aller proteinbildenden Teile der aktiven Vakzinekomponente.
Nach etwa 40-wöchiger Lagerung bei 8 °C wiesen bestimmte gemäß diesem Beispiel hergestellte Proben einen Titer in pfu/ml (des ursprünglichen Flüssigkeitsvolumens vor dem Gefriertrocknen) innerhalb von 0,5 eines Logarithmus des Titers auf, der direkt nach dem Gefriertrocknen vorhanden war, und besaßen einen Titer im Bereich von 10⁵ bis 10⁶ pfu/ml bezogen auf das Flüssigvolumen vor dem Gefriertrocknen.
Beispiel 6
Ein gefriergetrocknetes Präparat des gentechnisch inaktivierten HSV-2 aus Beispiel 1 kann wie in Beispiel 1 hergestellt werden, mit der Ausnahme, dass die Flüssigkeit vor dem Gefriertrocknen neben dem Virus Folgendes umfasst: 2,5 % Dextran (Molekulargewicht etwa 40.000), 0,5 % Natriumglutamat, 2,5 % Saccharose und 0,1 M Tris-Puffer, vorzugsweise etwa pH 7,5.
In Varianten dieses Beispiels kann das Natriumglutamat weggelassen werden.
Dieses Beispiel ist frei von Proteinen, mit Ausnahme aller proteinbildenden Teile der aktiven Vakzinekomponente.
Nach etwa 40-wöchiger Lagerung bei 8 °C wiesen bestimmte gemäß diesem Beispiel hergestellte Proben einen Titer in pfu/ml (des ursprünglichen Flüssigkeitsvolumens vor dem Gefriertrocknen) innerhalb von 0,5 eines Logarithmus des Titers auf, der direkt nach dem Gefriertrocknen vorhanden war.
Beispiel 7
Ein gefriergetrocknetes Präparat des gentechnisch inaktivierten HSV-2 aus Beispiel 1 kann wie in Beispiel 1 hergestellt werden, mit der Ausnahme, dass die Flüssigkeit vor dem Gefriertrocknen neben dem Virus Folgendes umfasst: 5 % Lactose, 2,5 Saccharose, 1,8 % D-Sorbit, 0,1 % Natriumglutamat, 2 % pflanzliches Pepton und 0,05 M Tris-Puffer, vorzugsweise etwa pH 7,5.
In einer Variante dieses Beispiels kann das Natriumglutamat weggelassen werden. Dieses Beispiel ist frei von Proteinen, mit Ausnahme aller proteinbildenden Teile der aktiven Vakzinekomponente.
Nach etwa 25-wöchiger Lagerung bei 8 °C wiesen bestimmte gemäß diesem Beispiel hergestellte Proben einen Titer in pfu/ml (des ursprünglichen Flüssigkeitsvolumens vor dem Gefriertrocknen) innerhalb von 0,5 eines Logarithmus des Titers auf, der direkt nach dem Gefriertrocknen vorhanden war.
Beispiel 8
Ein gefriergetrocknetes Präparat des gentechnisch inaktivierten HSV-2 aus Beispiel 1 kann wie in Beispiel 1 hergestellt werden, mit der Ausnahme, dass die Flüssigkeit vor dem Gefriertrocknen neben dem Virus Folgendes umfasst: 5 % Lactose, 5 % Saccharose, 1,8 % D-Sorbit, 2 % pflanzliches Pepton und 0,1 M Tris-Puffer, vorzugsweise etwa pH 7,5.
Dieses Beispiel ist frei von Proteinen, mit Ausnahme aller proteinbildenden Teile der aktiven Vakzinekomponente.
Nach etwa 25-wöchiger Lagerung bei 8 °C wiesen bestimmte gemäß diesem Beispiel hergestellte Proben, bei denen Natriumglutamat weggelassen und das Gelatinehydrolysat durch pflanzliches Pepton ersetzt wurde, einen Titer in pfu/ml (des ursprünglichen Flüssigkeitsvolumens vor dem Gefriertrocknen) innerhalb von 0,5 eines Logarithmus des Titers auf, der direkt nach dem Gefriertrocknen vorhanden war.
Beispiele für Zusammensetzungen gemäß vorliegender Erfindung können geeigneterweise unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren gefriergetrocknet werden, die auf dem Gebiet des Gefriertrocknens von biologischem Material allgemein bekannt sind.
Beispielsweise kann das folgende Gefriertrocknungsverfahren in Zusammenhang mit Zusammensetzungen gemäß vorliegender Erfindung, beispielsweise gemäß den oben genannten Beispielen, verwendet werden, das nachstehend erläutert ist und keineswegs zur Einschränkung des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung dient.
Eine Viruszusammensetzung zum Gefriertrocknen, wie es hierin beschrieben ist, wird zuerst 2 Stunden lang bei -60 °C gefroren und dann unter Verwendung des folgenden Trocknungsverfahrens unter reduziertem Druck von 100 Mtorr getrocknet:
Die Temperatur der Zusammensetzung wird über einen Zeitraum von einer Stunde nach und nach auf -42 °C erhöht und weitere 60 Stunden lang bei diesem Wert gehalten. Dann wird die Temperatur über einen Zeitraum von 5 Stunden auf +5 °C erhöht und etwa weitere 7 Stunden lang bei diesem Wert gehalten. Schließlich wird die Temperatur über einen Zeitraum von einer Stunde auf +10 °C erhöht und etwa weitere 7 Stunden bei diesem Wert gehalten.
Ein alternatives und manchmal bevorzugtes Trocknungsverfahren sieht wie folgt aus: Die Zusammensetzung wird gefroren, indem ihre Temperatur über einen Zeitraum von einer Stunden auf -40 °C gesenkt und weitere 2 Stunden bei diesem Wert gehalten wird. Die Zusammensetzung kann dann einem Schritt unterzogen werden, der dazu dient, eine Vergrößerung von Eiskristallen herbeizuführen: Die Temperatur wird über einen Zeitraum von etwa 45 min auf -15 °C erhöht und weitere 2 Stunden bei diesem Wert gehalten. Dann kann die Temperatur über einen Zeitraum von 25 min wieder auf -40 °C gesenkt werden, wonach die Zusammensetzung unter reduziertem Druck von 50 Mtorr unter Verwendung des folgenden Trocknungsverfahrens getrocknet werden kann. Die Temperatur wird 2 Stunden lang bei -40 °C gehalten, dann über einen Zeitraum von 45 min auf -15 °C erhöht und eine weitere Stunde bei die sem Wert gehalten. Dann wird die Temperatur über einen Zeitraum von einer Stunde auf -35 ° gesenkt und weitere 32 Stunden bei diesem Wert gehalten. Dann kann die Temperatur auf über einen Zeitraum von 3 Stunden +5 °C erhöht und weitere 8 Stunden auf diesem Wert gehalten werden.
In einer Variante dieses Beispiels kann die Temperatur nach dem Frieren der Zusammensetzung anstelle von auf -15 °C auf 0 °C erhöht werden.

Claims

Stabilisierte, getrocknete pharmazeutische Zusammensetzung, die in einer wässrigen Flüssigkeit zur Injektion dispergierbar ist und die Folgendes umfasst: (i) infektiöses, genetisch inaktives Herpesvirus, (ii) zumindest eines aus (a) einem Polysaccharid oder Polysaccharid-Derivat, das ein Molekulargewicht von über etwa 5.000 aufweist, und (b) einer Quelle gemischter Aminosäuren pflanzlichen oder bakteriellen Ursprungs, (iii) einen Puffer und (iv) ein Monosaccharid, Oligosaccharid oder Derivat davon.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, die zusätzlich zumindest eine Aminosäure oder ein Aminosäuresalz enthält, beispielsweise L-Glutamat oder L-Aspartat.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, die ein Polysaccharid oder Polysaccharid-Derivat mit einem Molekulargewicht von über etwa 5.000 enthält.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, die frei von tierischem Protein ist.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, die frei von Protein (mit Ausnahme des Protein-bildenden Teils des Herpesvirus) ist.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, die ein Disaccharid, beispielsweise Lactose, Saccharose oder Trehalose, enthält.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, die (i) infektiöses, genetisch inaktives Herpesvirus, (ii) Dextran, (iii) Puffer, (iv) Natriumglutamat und (v) Saccharose umfasst.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, die ein Monosaccharid oder Monosaccharid-Derivat, beispielsweise Sorbit, enthält.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, die pflanzliches Pepton enthält.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, die Dextran mit einem Molekulargewicht im Bereich von etwa 5.000 bis etwa 70.000 enthält.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der Puffer ein Tris- oder ein Phosphat-Puffer ist.
Injizierbares pharmazeutisches Flüssigpräparat, das durch Dispergieren einer stabilisierten, getrockneten Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche in steriler Flüssigkeit zur Injektion, beispielsweise Wasser oder Kochsalzlösung, hergestellt worden ist.
Pharmazeutisch Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche zur Verwendung als Impfstoff.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, welches das Lyophilisieren einer wässrigen Flüssigkeit umfasst, die (i) infektiöses, genetisch inaktives Herpesvirus, (ii) ein Polysaccharid oder Polysaccharid-Derivat mit einem Molekulargewicht von über etwa 5.000 und/oder eine Quelle von gemischten Aminosäuren pflanzlichen oder bakteriellen Ursprungs, (iii) einen Puffer und (iv) ein Monosaccharid, Oligosaccharid oder Derivat davon umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die wässrige Flüssigkeit ein Disaccharid in einer Konzentration von 2 bis 12 % (Gew./Vol.) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, worin die wässrige Flüssigkeit pflanzliches Pepton in einer Konzentration im Bereich von etwa 1 bis etwa 4 % (Gew./Vol.) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, worin die wässrige Flüssigkeit Dextran in einer Konzentration von 1 bis 5 % (Gew./Vol.) umfasst.