DE2816349C2

DE2816349C2 -

Info

Publication number: DE2816349C2
Application number: DE19782816349
Authority: DE
Inventors: William Joseph Ambler Pa. Us Macaleer; Henry Zvi Wyncote Pa. Us Markus
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1978-04-14
Filing date: 1978-04-14
Publication date: 1989-07-27
Also published as: DE2816349A1

Description

Die Erfindung betrifft verbesserte stabilisierte, flüssige oder lyphilisierte Lebendvirus-Impfstoffe.

Die US-PS 31 56 620 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines Tollwutvirus-Impfstoffes, bei dem lebender Tollwutvirus in einem Gewebekulturmedium von Hühnerembryozellen in Gegenwart von mindestens 0,5% hydrolysierter, löslicher Gelatine gezüchtet wird. Gemäß Beispiel 1 wird dabei eine sehr spezifische 2stufige Züchtung vorgenommen, wobei das Züchtungsmedium in jeder Stufe 0,5% Lactalbumin-Hydrolysat und lösliche, hydrolysierte Stärke enthält. In dieser Druckschrift findet sich kein Hinweis darauf, daß bei derartigen Züchtungen ein mehrwertiger Alkohol mit 6 Kohlenstoffatomen verwendet werden kann.

Die US-PS 32 14 340 beschreibt einen Masern-Impfstoff, der als Stabilisator Sorbit enthält. In dieser Druckschrift findet sich kein Hinweis auf die Verwendung eines sauren Puffers oder von hydrolysierter Gelatine.

Aufgabe der Erfindung ist es, Lebendvirus-Impfstoffe bereitzustellen, deren Stabilität im Vergleich zu bekannten Impfstoffen noch wesentlich verbessert ist.

Der Gegenstand der Erfindung ist in den Patentansprüchen definiert.

Beispiele für entsprechende Lebendviren sind Masern-, Mumps-, Röteln-, Windpocken-, Polio- und Hepatitis-Viren sowie Herpes simplex 1 und 2 und Kombinationen aus zwei oder mehr dieser Viren.

Die hydrolysierte Gelatine wird verwendet, um eine lösliche, nicht-gelierende Proteinmatrix mit geringer oder keiner pyrogener oder antigener Wirkung zu erhalten. Unter teilweise hydrolysierter Gelatine sind der partiellen Hydrolyse unterworfene Hydrolyseprodukte von Gelatine mit einem Molekulargewicht von etwa 3000 zu verstehen. Dieses Hydrolyseprodukt von Gelatine weist etwa die gleiche Aminosäurezusammensetzung wie Gelatine selbst auf. Im Gegensatz zu Gelatine, die geliert, aber in kaltem Wasser unlöslich ist, zeigt hydrolysierte Gelatine keine Gelbildung und ist in kaltem Wasser und anderen üblichen Flüssigkeiten, wie Milch oder Orangensaft, löslich. Wäßrige Lösungen mit einem Gehalt bis zu etwa 10 Prozent hydrolysierter Gelatine zeigen keine merkliche Viskositätszunahme. Bei Konzentrationen über etwa 10 Prozent nimmt die Viskosität langsm zu. Lösungen mit einer Konzentration von etwa 50 Prozent sind sehr viskos. Nachstehend ist die typische Aminosäurezusammensetzung von hydrolysierter Gelatine angegeben:

Alanin\|8,5%
Arginin	7,9%
Asparaginsäure	5,7%
Cystin	0,08%
Glutaminsäure	9,5%
Glycin	22,8%
Histidin	0,77%
Hydroxyprolin	13-14%
Isoleucin	1,3%
Leucin	2,9%
Lysin	4,2%
Methionin	0,78%
Phenylalanin	2,0%
Prolin	13,8%
Serin	3,3%
Threonin	1,9%
Tyrosin	0,40%
Valin	2,4%

Teilweise hydrolysierte Gelatine läßt sich durch enzymatische Hydrolyse von Gelatine unter Einwirkung von proteolytischen Enzymen, beispielsweise Papain, Chymopapain oder Bromelin, erhalten. Es können aber auch andere übliche Hydrolyseverfahren angewendet werden, beispielsweise die Säurehydrolyse.

Beispiele für mehrwertige Alkohole mit 6 Kohlenstoffatomen sind Sorbit, Mannit und Dulcit. Besonders bevorzugt wird Sorbit.

Als saure Puffer können beliebige physiologisch verträgliche Puffer verwendet werden, mit denen der gewünschte pH-Wert von etwa 6 bis etwa 6,5 aufrechterhalten werden kann. Beispiele dafür sind Phosphat-, Acetat- und Citratpuffer. Besonders bevorzugt wird Phosphatpuffer.

Der Stabilisator wird vor der Verwendung mit dem etwa 3 bis etwa 8fachen und vorzugsweise mit dem etwa 5,5fachen seiner Menge mit destilliertem Wasser verdünnt.

Unter dem Ausdruck "Zellkulturmedium" ist ein Nährmedium zu verstehen, das ein in vitro-Wachstum von Zellen ermöglicht. Beispiele für entsprechende Nährmedien sind: Medium 199, Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Biol. & Med., Bd. 73 (1950), S. 1 bis 8; Eagle-Basalmedium, Eagle, Science, Bd. 122 (1955), S. 501 bis 504; In Vitro, Bd. 6 (1970), Nr. 2; Modifiziertes Eagle-Medium nach Dulbecco, Dulbecco et al., Virology, Bd. 8 (1959), S. 396; Smith et al., J. Virol., Bd. 12 (1960), S. 185 bis 196; In Vitro, Bd. 6 (1970), Nr. 2; Minimum-Essentialmedium (Eagle), Science, Bd. 130 (1959), S. 432; und RMPI-Medien, Moore et al., Bd. 199 (1967), S. 519 bis 524; In Vitro, Bd. 6 (1970), S. 2.

Der erfindungsgemäß verwendete Stabilisator enthält die nachstehenden Bestandteile in den angegebenen Mengen.

Bestandteile
Gewichtsteile
Teilweise hydrolysierte Gelatine
2-5
Mehrwertiger Alkohol	2-55
Nährmedium (Feststoffe)	0,5-1,7
Physiologisch verträgliche Puffer zur Einstellung des pH-Werts auf 6,0 bis 6,5	ausreichende Menge

In flüssigen Impfstoffen ist Sorbit im allgemeinen in einer Menge in der Nähe der Obergrenze des angegebenen Bereichs vorhanden, während in lyophilisierten Impfstoffen der Sorbitanteil im allgemeinen in der Nähe der Untergrenze dieses Bereiches liegt.

Bevorzugt sind Impfstoffe, in denen der Stabilisator aus 3,6 Gewichtsteilen teilweise hydrolysierter Gelatine, 3,6 Gewichtsteilen Sorbit, 1,1 Gewichtsteilen Medium 199 und einer zur Einstellung des pH-Werts auf 6,0 bis 6,5 erforderlichen Menge Phosphatpuffer oder aus 3,6 Gewichtsteilen teilweise hydrolysierter Gelatine, 53 Gewichtsteilen Sorbit, 1,1 Gewichtsteilen Medium 199 und einer zur Einstellung des pH-Werts auf 6,0 bis 6,5 erforderlichen Menge Phosphatpuffer besteht.

Nachstehend sind spezielle Beispiele für die Zusammensetzung von Stabilisatoren für Virus-Impfstoffe angegeben. Das Präparat B wird für lyophilisierte Impfstoffe bevorzugt.

Zusätzlich zum Stabilisator sind vorzugsweise geringe Mengen an NaHCO₃ und Phenolrot vorhanden. In den vorstehenden Präparaten kann NaHCO₃ in einer Menge von etwa 1,2 g und Phenolrot in einer Menge von etwa 0,01 g enthalten sein. Selbstverständlich können die Verhältnisse und die Konzentrationen der einzelnen Bestandteile der vorstehend genannten Präparate variiert werden. Im allgemeinen wird ein Volumteil Impfstoff mit etwa 2 bis etwa 12 Volumteilen Stabilisator verdünnt.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

80 ml Masern-Viruskonzentrat, das bei -70°C gelagert worden ist, wird in einem Wasserbad bei 25°C aufgetaut und sodann bei 4 bis 8°C gelagert. Das flüssige Viruskonzentrat wird sodann in 2 Anteile von jeweils 40 ml aufgeteilt.

a) Ein 40-ml-Anteil dieser Virusflüssigkeit wird mit 210 ml des vorstehend erwähnten sterilen Stabilisators B verdünnt. Das Präparat wird unter aseptischen Bedingungen und unter einer laminaren Strömungshaube gehalten. Zur Verhinderung von Mikroorganismenwachstum wird das Präparat mit 10,5 mg Neomycin versetzt. Der verdünnte Impfstoff wird auf 2 ml fassende Glasampullen (0,7 ml Impfstoff pro Ampulle) verteilt, die unmittelbar danach abgeschmolzen werden und sodann bei 4 bis 8°C gelagert werden.
b) Der zweite 40-ml-Anteil wird wie der erste Anteil behandelt, mit der Abänderung, daß anstelle des Stabilisatorpräparats B ein handelsübliches Standard-Impfstoffverdünnungsmittel (SPGA) verwendet wird. Die Lagerstabilität der Impfstoffe ist in der nachstehenden Tabelle angegeben.

Beispiel 2

32 ml Masern-Viruskonzentrat, das bei -70°C gelagert worden ist, wird in einem Wasserbad bei 25°C aufgetaut und sodann bei 4 bis 8°C aufbewahrt. Das flüssige Viruskonzentrat wird sodann in zwei Anteile von jeweils 16 ml aufgeteilt.

a) Ein 16-ml-Anteil dieser Virusflüssigkeit wird mit 48 ml des sterilen Stabilisatorpräparats B verdünnt. Das Präparat wird unter aseptischen Bedingungen und unter einer laminaren Strömungshaube gehalten. Zur Verhinderung von Mikroorganismenwachstum wird das Präparat mit 2,5 g Neomycin versetzt. Der verdünnte Impfstoff wird in 2 ml fassende Glasampullen (0,7 ml Impfstoff pro Ampulle) aufgeteilt, die unmittelbar danach abgeschmolzen werden und sodann bei 37°C gelagert werden.
b) Der zweite 16-ml-Anteil wird wie der erste Anteil behandelt, mit der Abänderung, daß anstelle des Stabilisatorpräparats B das Stabilisatorpräparat A verwendet wird. Die Lagerstabilität der Impfstoffe ist in nachstehender Tabelle angegeben.

Beispiel 3

80 ml Masern-Viruskonzentrat, das bei -70°C ml gelagert worden ist, wird in einem Wasserbad bei 20°C aufgetaut und sodann bei 4 bis 8°C gelagert. Das flüssige Viruskonzentrat wird in zwei Anteile von jeweils 40 ml aufgeteilt.

a) Ein 40-ml-Anteil dieser Virusflüssigkeit wird in 210 ml des sterilen Stabilisatorpräparats verdünnt. Das Präparat wird unter aseptischen Bedingungen und unter einer laminaren Strömungshaube gehalten. Zur Verhinderung von Mikroorganismenwachstum wird das Präparat mit 10,5 mg Neomycin versetzt. Der verdünnte Impfstoff wird in 3 ml fassende Glasfläschchen (0,7 ml Impfstoff pro Ampulle) gefüllt. Die Fläschchen werden lyophilisiert, zugestöpselt und bei 37°C aufbewahrt.
b) Der zweite 40-ml-Anteil wird wie der erste Anteil behandelt, mit der Abänderung, daß anstelle des Stabilisatorpräparats B ein handelsübliches Standard-Verdünnungsmittel (Mediium 199 mit einem Gehalt an SPGA) verwendet wird.

Die Lagerstabilität dieser Impfstoffe ist in nachstehender Tabelle angegeben.

Beispiel 4

Gemäß Beispiel 3 hergestellte lyophilisierte Fläschchen werden in destilliertem Wasser (0,7 ml pro Fläschchen) hergerichtet (rekonstruiert) und bei 2 bis 8°C aufbewahrt.

Die Lagerstabilität dieser Impfstoffe ist in nachstehender Tabelle angegeben.

Beispiel 5

Um den Nachweis zu erbringen, daß die erfindungsgemäß eingesetzten Stabilisatorbestandteile eine Stabilisierungswirkung ergeben, die über die reine Summenwirkung der Einzelbestandteile hinausgeht, wurde folgender Versuch durchgeführt.

Ein Masernvirus-Konzentrat, das bei -70°C gelagert worden war, wurde in einem Wasserbad von 25°C aufgetaut und sodann bei 4- 8°C belassen. Dieses Viruskonzentrat wurde in 5 Aliquotanteile aufgeteilt. Die einzelnen Anteile wurden jeweils mit 3 Volumenteilen einer Lösung mit einem Gehalt an folgenden Bestandteilen verdünnt:

Aliquotanteil 1: Hydrolysierte Gelatine, Sorbit und Medium 199
Aliquotanteil 2: Sorbit, Puffer und Medium 199
Aliquotanteil 3: Puffer und Medium 199
Aliquotanteil 4: Hydrolysierte Gelatine, Sorbit und Medium 199
Aliquotanteil 5: Hydrolysierte Gelatine, Sorbit, Puffer und Medium 199

Die Aliquotanteile 1 und 3 enthielten die genannten Bestandteile in den für Präparat B im allgemeinen Teil der Beschreibung angegebenen Mengen. Die Aliquotanteile 2, 4 und 5 enthielten Puffer und Medium 199 in den gleichen Mengen wie das Präparat B, jedoch die doppelten Mengen an Sorbit und hydrolysierter Gelatine. Der ursprüngliche Titer der einzelnen Aliquotanteile betrug etwa 2000 TCID₅₀/0,1 ml. Die Aliquotanteile wurden dann 48 Stunden bei 37°C gelagert. Im Anschluß daran wurde der Virustiter der Aliquotanteile bestimmt. Es wurden folgende Ergebnisse erzielt:

Aliquotanteil
Virustiter nach 48 Stunden bei 37°C,

angegeben als % des ursprünglichen Titers
1\|2%
2	3%
3	4%
4	16%
5	49%

Es zeigt sich, daß beim anspruchsgemäß verwendeten Vier komponenten-Stabilisator (Aliquotanteil 5) der Titer unter den angegebenen ungünstigen Temperaturbedingungen mehr als dreimal so hoch ist als beim nächstbesten 3-Komponentensystem (Aliquotanteil 4).

Claims

1. Stabilisierte Impfstoffe, enthaltend einen inaktivierten oder abgeschwächten Virus und einen Stabilisator auf der Basis von hydrolysierter Gelatine, dadurch gekennzeichnet, daß der Stabilisator folgende Bestandteile enthält,

(a) 2-5 Gewichtsteile teilweise hydrolysierte Gelatine,
(b) 2-55 Gewichtsteile eines mehrwertigen Alkohols mit 6 Kohlenstoffatomen,
(c) 0,5-1,7 Gewichtsteile eines Zellkulturmediums und
(d) eine zur Einstellung des pH-Werts auf 6,0-6,5 erforderliche Menge eines physiologisch verträglichen Puffers.

2. Stabilisierte Impfstoffe nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er als mehrwertigen Alkohol mit 6 Kohlenstoffatomen Sorbit enthält.

3. Stabilisierter Impfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er als Puffer Phosphatpuffer enthält.

4. Stabilisierter Impfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er als Virus Masern-, Mumps-, Röteln-, Windpocken-, Polio- oder Hepatitis-Virus, Herpes simplex 1, Herpes simplex 2 oder Kombinationen davon enthält.

5. Stabilisierter Impfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er 2-12 Volumteile Stabilisator pro 1 Volumteil Impfstoff enthält.