DE69905488T2

DE69905488T2 - Prostaglandin-konjugate zur behandlung von knochenkrankheiten

Info

Publication number: DE69905488T2
Application number: DE69905488T
Authority: DE
Inventors: Laurent Gil; Yongxin Han; Rejean Ruel; N. Young
Original assignee: Merck Frosst Canada and Co
Current assignee: Merck Frosst Canada and Co
Priority date: 1998-11-20
Filing date: 1999-11-18
Publication date: 2003-12-24
Anticipated expiration: 2019-11-19
Also published as: WO2000031084A1; DE69905488D1; EP1131327B1; ES2191475T3; ATE232874T1; US6121253A; AU762396B2; CA2351679A1; JP2002530411A; AU1255600A; EP1131327A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind Analoga der natürlichen Prostaglandine PGD&sub1; und PGD&sub2;, PGE&sub2;, PGE&sub1; und PGF2alpha, die sich zur Behandlung von Osteoporose eignen. Prostaglandine sind alicyclische Verbindungen, die mit der Grundverbindung Prostansäure verwandt sind. Die Kohlenstoffatome des Grund-Prostaglandins sind der Reihe nach vom Carboxyl-Kohlenstoffatom durch den Cyclopentylring zum endständigen Kohlenstoffatom an der benachbarten Seitenkette durchnumeriert. Normalerweise befinden sich die benachbarten Seitenketten in der trans-Ausrichtung. PGE&sub2; hat die folgende Struktur:
Die Gegenwart einer Oxo-Gruppe am C-9 des Cyclopentylrestes ist ein Kennzeichen für ein Prostaglandin der E-Klasse, wobei PGE&sub2; eine ungesättigte trans-Doppelbindung in der C&sub1;&sub3;-C&sub1;&sub4;- und eine cis-Doppelbindung in der. C&sub5;-C&sub6;-Stellung enthält. Das US-Patent Nr. 4 171 331 lehrt 1- und 2-substituierte Analoga bestimmter Prostaglandine. Offenbart sind trans-1- und -2-Di(niedrigalkyl)phosphono-, 1- und 2-Chlor-, -Brom- und -Iod-, 1- und 2-Thio- und 1- und 2-Amino- Analoga von PGE&sub1;.
Das US-Patent Nr. 3 927 197 offenbart die Bildung verschiedener Säurederivate von Prostaglandinen, wie z. B. Amide, Carboxylataminsalze und das 2-Decarboxy-2-(2,3,4,5-tetryol-1-yl)-Derivat.
Osteoporose ist die üblichste Form von metabolischer Knochenerkrankung und wird üblicherweise bei postmenopausalen Frauen beobachtet, sie tritt jedoch auch bei älteren Männern und Frauen oder bei jungen Personen auf. Üblicherweise ist die Erkrankung gekennzeichnet durch Frakturen des Handgelenks und der Wirbelsäule, wohingegen femorale Frakturen das vorherrschende Merkmal von seniler Osteoporose sind. Der physische ursächliche Faktor, der die Frakturanfälligkeit erzeugt, ist der allmähliche Knochenschwund. Offensichtlich wird das normale Gleichgewicht der Knochenresorptionsaktivität der Osteoklasten (knochenauflösende oder -resorbierende Zellen) und der Knochenbildungsaktivität der Osteoblasten (knochenbildende Zellen) durch das Fortschreiten der Erkrankung gestört, so daß die von den Osteoklasten erzeugten Hohlräume von den Osteoblasten nicht gefüllt werden. Eine Reihe von pharmazeutischen Verbindungen ist im Stand der Technik bekannt, die die Osteoklastenaktivität hemmen, so daß der Knochenschwund verringert wird. Zum Beispiel sind die Bisphosphonate als eine Klasse zur Inhibierung von Knochenschwund geeignet und deshalb wichtig bei der Behandlung von Erkrankungen, die in Zusammenhang mit Knochenschwund stehen, einschließlich Osteoporose. Ein schwierigeres Behandlungsregime oder schwierigerer Behandlungsbereich war die wirksame Beschleunigung oder Stimulation von Knochenbildung, um das Knochenwachstum aufrechtzuerhalten oder geschwächte Knochen zu stärken.
Es ist jedoch klar, daß die Aktivität von Osteoblasten und Osteoklasten von einem komplexen Mechanismus koordiniert und gesteuert und von einer Reihe von Hormonen und Prostaglandinen beeinflußt wird. Siehe Rasze et al., Ann. Rev. Physiol., 43: 225 (1981); US-Patent Nr. 4 921 697, welches lehrt, daß die Inhibierung der Prostaglandinerzeugung durch IFN-Gamma eine wirksame Behandlung von Osteoporose und anderen Knochenresorptionserkrankungen ist, da Prostaglandine bei Knochenschwund oder -resorption beteiligt waren. Die Literatur schlägt auch vor, daß Prostaglandine eine wichtige Rolle bei der Knochenbildung spielen können. Siehe W. Harvey und A. Bennett, "Prostaglandins in Bone Resorption" CRC Press, Seite 37 (1988). Osteoblasten sind für die Durchführung des Knochenbildungsprozesses verantwortlich. Es ist bewiesen worden, daß die In-vivo- Knochenbildung bei Tieren durch systemische Injektion von PGE&sub2; stimuliert wird. Siehe Rodan G. J. Cell Biochem. Suppl. 0 (15, Teil F), 160 (1991).
Die Wirkungen von alleine verabreichten Prostaglandinen ist im Stand der Technik offenbart worden. Ueno et al. Bone, 6, 79-86 (1985), verabreichten PGE&sub2; an rasch wachsende Ratten in Dosierungen von 1, 3 und 6 mg PGE&sub2;/kg/Tag. Die Ergebnisse zeigten einen Anstieg der Hartgewebemasse in der sekundären Spongiosa der proximalen Tibia-Metaphyse und einen Anstieg der Trabekelzahl. Jee et al., Bone and Mineral, 15, 33-55 (1991), offenbarten, daß 60, 120 und 180 Tage lange subkutane Injektionen von PGE&sub2; eine gesteigerte diaphyseale Tibia-Knochenmasse und eine erhöhte Knochenaktivität erzeugten. Die Autoren berichteten, daß die anabolischen Wirkungen von PGE&sub2; die periosteale und kortikoendosteale Knochenmasse erhöhen und bei täglicher Verabreichung von PGE&sub2; die transiente Steigerung der Knochenmasse unterstützen. Es ist bekannt, daß die Dauer und die Konzentration, in denen PGs die Knochenzellen erreichen, kaum steuerbar sind. Es ist auch bekennt, daß die systemische Injektion oder Infusion von PGs eine Alternative ist, die beträchtliche Nachteile aufweist, da die Lungen PGs wirksam aus dem Kreislauf entfernen. Siehe W. Harvey und A. Bennett, "Prostaglandins in Bone Resorption" CRC Press, S. 37 (3388).
Es ist auch bekannt, daß die Toxizität von Prostaglandinen aufgrund der systemischen Verteilung des verabreichten Arzneistoffes den pharmazeutischen Nutzen dieser Verbindungen verringert oder herabsetzt. Die Zufuhr hoher Dosen von Prostaglandinen, die aufgrund der kurzen Halbwertszeit dieser Verbindungen notwendig wäre, könnte zu unerwarteten Nebenwirkungen führen. Ueno et al. berichteten, daß, wenn PGE&sub2; systemisch durch subkutane Injektionen an Ratten verabreicht wurde, bei Dosen von 3 mg/kg/Tag oder höher Diarrhöe und Rötung der Extremitäten zusammen mit Gewichtsverlust auftraten. Zusätzlich wurden bedeutende Senkungen der Serumphosphatwerte von 1 mg PGE&sub2; festgestellt. Jee et al. berichteten, daß die Langzeitverabreichung von PGE&sub2;, das durch subkutane Injektion verabreicht wurde, zu Weichgewebegewichtsanstiegen in Nebennieren, Leber, Nieren und Lungen führte. Das US-Patent Nr. 4 621 100 offenbart Nebenwirkungen nach der oralen Dosierung mit PGE&sub2;, einschließlich dünnem Stuhl, Diarrhöe, Erbrechen, entzündete Skleren und erhöhte alkalische Serumphosphatasewerte.
Frost et al. offenbaren in "Treatment of Osteoporose by Manipulation of Coherent Bone Cell Populations", Clinical Orthopedics and Related Research, 143, 227 (1979), ein theoretisches Modell, das vorschlägt, daß es möglich sein sollte, die Aktivität und den Metabolismus von Knochenzellen zunächst durch Verabreichung knochenzellenaktivierender Mittel und dann durch Verabreichung eines knochenresorptionsinhibierenden Mittels zu synchronisieren. Dieses vorgeschlagene Modell geht davon aus, daß die Knochenbildungsinhibierung nicht stattfindet, da kein knochenresorptionsinhibierendes Mittel während der Knochenbildungsphase der Knochenneubildungseinheit verabreicht wird. Die EPA-Anmeld.-Nr. 0 381 296 lehrt die Verwendung eines Kits, bei dem sich einer Knochenaktivierungsperiode oder einem Knochenaktivierungsbehandlungsregime ein Knochenresorptionsinhibierungsregime anschließt. Beispiele für knochenaktivierende Verbindungen, die in dieser Druckschrift genannt werden, sind u. a. Nebenschilddrüsenhormon (PTH), anorganisches Phosphat, Wachstumshormon, Fluorid, Schilddrüsenhormon (z. B. Thyroxin), bestimmte Vitamin-D-Metaboliten und Prostaglandine (PGE&sub2; in einem Dosisregime von 10 mg/kg pro Tag). Siehe auch die US 5 118 667. Beispiele für knochenresorptionsinhibierende Polyphosphonate sind u. a. Ethan-1-hydroxy-1,1-diphosphonsäure, Methandiphosphonsäure, Pentan-1-hydroxy-1,1-diphosphonsäure, Methandichlordiphosphonsäure, Methanhydroxydiphosphonsäure, Ethan-1-amino-1,1-diphosphonsäure, Propan-N,N-dimethyl-3-amino-1-hydroxy-1,1-diphosphonsäure, Propan-3,3-dimethyl-3-amino-1-hydroxy-1,1-diphosphonsäure, Phenylaminomethandiphosphonsäure, N,N-Dimethylaminomethandiphosphonsäure, N-(2-Hydroxyethyl)aminomethandiphosphonsäure, Butan-4-amino-1- hydroxy-1,1-diphosphonsäure (nach PGE&sub2; verabreicht in einer Dosierung pro Tag von 0,005 mg P/kg), Pentan-5-amino-1-hydroxy-1,1- diphosphonsäure und Hexan-6-amino-1-hydroxy-1,1-diphosphonsäure. Kombinationen aus einem Methylenbisphosphonat, gekoppelt an eine medizinische Verbindung, wie z. B. ein nichtsteroidales Antiphlogistikum (NSAID), sind offenbart worden. Siehe die Japanische Patentveröffentlichung Nr. H2-104593.
Das US-Patent Nr. 5 409 911, erteilt am 25. April 1995, beschreibt Prostaglandinbisphosphonatverbindungen, die sich zur Behandlung von Knochenstörungen eignen, und ist hiermit durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit mitumfaßt. Die in dem US-Patent Nr. 5 409 911 offenbarten Verbindungen stellen die simultane Zufuhr eines knochenaktivierenden Mittels, wie z. B. eines Prostaglandins, das chemisch an eine knochenresorptionsinhibierende Verbindung gekoppelt ist, welche das knochenaktiverende Mittel selektiv an den Zielbereich führt, zur Verfügung. Bei der allmählichen Hydrolyse der Verbindung sind die hydrolysierten Produkte in der Lage, eine knochenresorptionsinhibierende Wirkung (über die Bisphosphonate) und Knochenwachstums- oder -wachstumsstimulierungswirkung (über PGE&sub2;) zur Verfügung zu stellen.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls dafür ausgelegt, sowohl ein Prostaglandin als auch ein Bisphosphonat den Ziel-Knochenbereichen zuzuführen. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung besitzen jedoch unerwarteterweise ein kritisches Gleichgewicht aus chemischer Stabilität und Labilität. Diese Verbindungen besitzen die erforderliche Stabilität, um ihre Formulierung zu einem fertigen pharmazeutischen Präparat zu ermöglichen, Lager- und Aufbewahrungsstabilität des pharmazeutischen Präparats und Verabreichungsstabilität, und auch die erwünschte Labilität, um zu ermöglichen, daß der verabreichte Wirkstoff in vivo hydrolysiert, wobei die Prostaglandin- und Bisphosphonatkomponenten freigesetzt werden. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung binden sich wirksam sowohl in vitro als auch in vivo an Knochen und setzen PEG&sub2; mit einer annehmbaren Geschwindigkeit frei. Die vorliegende Erfindung ermöglicht auch die wirksamere Zufuhr von PGE&sub2; an die Zielregion und überwindet daher die schweren Nebenwirkungsnachteile, die mit der Verabreichung größerer Mengen PGE&sub2; alleine verbunden sind. Zusätzlich hat systemisch verabreichtes PGE&sub2; eine kurze Halbwertszeit. Die vorliegende Erfindung überwindet die im Stand der Technik vorherrschenden Nachteile und stellt gleichzeitig eine Verbindung zur Verfügung, die das Knochenwachstum fördert und die Knochenresorption aufhält, so daß eine Behandlung für Osteoporose und verwandte Störungen des Calciummetabolismus zur Verfügung gestellt wird.
Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, neue Prostaglandin-Bisphosphonat-Konjugate zur Verfügung zu stellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, solche Verbindungen zur Verfügung zu stellen, die in der Lage sind, ein Prostaglandin lokal den Knochen zuzuführen und allmählich zu hydrolysieren, so daß ein Knochenresorptionsinhibitor und ein Knochenbildungsverstärker direkt den Knochen zugeführt werden können.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, Verfahren zur Behandlung und/oder Reduzierung des Risikos der Erlangung von Krankheitsstadien oder -zuständen, die mit abnormaler Knochenresorption in Verbindung stehen, zur Verfügung zu stellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, Verfahren zur Behandlung und/oder Reduzierung des Risikos der Erlangung von Osteoporose zur Verfügung zu stellen.
Diese und andere Ziele werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung leicht ersichtlich werden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Das Hauptziel der beanspruchten Erfindung ist, Verbindungen innerhalb des Umfangs der Erfindung als chemische Zufuhrstoffe für Prostaglandine zu verwenden. Diese Erfindung beansprucht ein neues chemisches Verfahren zur simultanen Zufuhr eines Knochenbildungsverstärkers, wie z. B. eines Prostaglandins, und eines Knochenresorptionsinhibitors, wie z. B. eines Aminobisphosphonats. Die Erfindung ist eine Prostaglandinbisphosphonatverbindung, die, wenn sie systemisch verabreicht wird, eine hohe Knochenaffinität besitzt. Die Verbindungen der Erfindung werden dann hydrolysiert, um ein Bisphosphonat und ein Prostaglandin zu bilden. Die Erfindung eignet sich zur Prävention und Behandlung von Osteoporose und hat den bedeutenden Vorteil, daß geringere Prostaglandin-Dosen an ein Säugetier oder einen Patienten, der diese benötigt, verabreicht werden können, da das Prostaglandin einer Wirkstelle zugeführt wird, bevor es metabolisiert wird. Dieses Verfahren verhindert auch die unerwünschten Nebenwirkungen, die mit höheren Prostaglandin- Dosen verbunden sind. Die Erfindung betrifft auch Verbindungen der folgenden Formel:
und Mischungen davon und die pharmazeutisch annehmbaren Salze davon, wobei:
A ein dioxygenierter Cyclopentanrest ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
X ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
Y ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
R¹ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus H, C1-C10-Alkyl und Si(CH&sub3;)&sub2;tBu,
R² ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus H und C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkyl,
R³ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus H, Tetrahydropyran und Si(CH&sub3;)&sub2;tBu,
R&sup4; und R&sup5; unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus H, C1-C10-Alkyl, Phenyl, Benzyl, C1-C10-Alkoxy und CF&sub3;,
und n eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine therapeutisch wirksame Menge der Verbindungen der vorliegenden Erfindung und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Knochenresorptionsinhibierung bei einem Säugetier, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge der Verbindungen der vorliegenden Erfindung an ein Säugetier, das diese benötigt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Behandlung oder Reduzierung des Risikos der Erlangung eines Krankheitsstatus oder -zustandes, der mit Knochenresorption in Verbindung steht, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge der Verbindungen der vorliegenden Erfindung an das Säugetier.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Steigerung der Knochenbruchheilungsrate bei einem Säugetier, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge der Verbindungen der vorliegenden Erfindung an ein Säugetier, das diese benötigt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Steigerung der Rate erfolgreicher Knochentransplantate bei einem Säugetier, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge der Verbindungen der vorliegenden Erfindung an ein Säugtier, das diese benötigt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Steigerung der Knochenbildungsrate bei einem Säugetier, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge der Verbindungen der vorliegenden Erfindung an ein Säugetier, das diese benötigt.
Diese Erfindung betrifft euch ein Verfahren zur Behandlung oder Prävention von Osteoporose durch Verabreichung einer pharmazeutisch wirksamen Menge der Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung. Sie betrifft ein Verfahren zur Steigerung der Knochenbruchheilungsrate bei einem Säugetier mit einem Knochenbruch durch systemische Verabreichung einer pharmazeutisch wirksamen Menge der Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung und ein Verfahren zur Steigerung der Rate erfolgreicher Knochentransplantate, umfassend die Verabreichung einer pharmazeutisch wirksamen Menge der Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung an ein Säugtier, das diese benötigt. Diese Erfindung betrifft vorteilhafterweise ein Verfahren, um ein Prostaglandin gemäß der vorliegenden Erfindung einem Säugetierorganismus, der diese Behandlung benötigt, mittels eines Bisphosphat-Zufuhrmittels zuzuführen, wobei das Prostaglandin die Knochenbildungsrate erhöht und somit wirksam Osteoporose, Knochenbrüche behandelt und wirksam die Rate erfolgreicher Knochentransplantate steigert.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen, die als chemische Zufuhrmittel wirksam sind, und Verbindungen, die sich zur Behandlung und Prävention von Osteoporose und Calciummetabolismusstörungen eignen. Die Verbindungen der Erfindung können auch eine doppelte Wirkung als Knochenwachstumsverstärker und als Knochenresorptionsinhibitor besitzen. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden durch die folgenden chemischen Formeln beschrieben:
und Mischungen davon, und die pharmazeutisch annehmbaren Salze davon, wobei:
A ein dioxygenierter Cyclopentanrest ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
X ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
Y ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
R¹ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus H, C1-C10-Alkyl und Si(CH&sub3;)&sub2;tBu,
R² ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus H und C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkyl,
R³ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus H, Tetrahydropyran und Si(CH&sub3;)&sub2;tBu,
R&sup4; und R&sup5; unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus H, C1-C10-Alkyl, Phenyl, Benzyl, C1-C10-Alkoxy und CF&sub3;,
und n eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist.
Bei der vorliegenden Erfindung sind die Verbindungen vorzugsweise ausgewählt aus der folgenden Formel:
und Mischungen davon und den pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon, wobei:
A ein dioxygenierter Cyclopentanrest ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
X ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
R¹ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus H, C1-C10-Alkyl und Si(CH&sub3;)&sub2;tBu,
R² ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus H und C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkyl,
R³ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus H, Tetrahydropyran und Si(CH&sub3;)&sub2;tBu,
R&sup4; und R&sup5; unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus H, C1-C10-Alkyl, Phenyl, Benzyl, C1-C10-Alkoxy und CF&sub3;, und n eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist.
Bei den Verbindungen der vorliegenden Erfindung ist M vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus
Vorzugsweise ist M
Bei den Verbindungen der vorliegenden Erfindung ist A vorzugsweise
Bei den Verbindungen der vorliegenden Erfindung ist n vorzugsweise null.
Bei den Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind R¹, R³, R&sup4; und R&sup5; vorzugsweise jeweils H.
Bei den Verbindungen der vorliegenden Erfindung ist R² vorzugsweise n-C&sub5;H&sub1;&sub1;.
Nichtlimitierende Beispiele für Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind: PGE&sub2;-Bisphosphonat-Konjugate, PGE&sub2;- Bisphosphonatsulfoxid-Konjugate und Bis-(PGE&sub2;)-Bisphosphonat- Konjugate.
Eine Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Inhibierung von Knochenresorption bei einem Säugetier, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge der Verbindungen der vorliegenden Erfindung an ein Säugetier, das diese benötigt.
Eine nichtlimitierende Klasse der Ausführungsform ist die, bei der das Säugetier ein Mensch ist.
Eine zweite Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung oder Reduzierung des Risikos der Erlangung eines Krankheitsstatus oder -zustandes, der mit Knochenresorption in Verbindung steht, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge der Verbindungen der vorliegenden Erfindung an das Säugetier.
Eine nichtlimitierende Klasse der zweiten Ausführungsform ist die, bei der das Säugetier ein Mensch ist.
Eine nichtlimitierende Unterklasse der Klasse der zweiten Ausführungsform ist die, bei der der Erkrankungsstatus oder -zustand ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Osteoporose, glukokortikoid-induzierter Osteoporose, Paget-Krankheit, abnormal erhöhtem Knochen-Turnover, periodontaler Erkrankung, Zahnausfall, Knochenbrüchen, rheumatoider Arthritis, periprothetischer Osteolyse, Osteogenesis imperfecta, metastatischer Knochenerkrankung, Hyperkalzämie durch Malignizität und multiplem Myelom.
Eine dritte Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Steigerung der Knochenbruch-Heilungsrate bei einem Säugetier, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge der Verbindungen der vorliegenden Erfindung an ein Säugetier, das diese benötigt.
Eine vierte Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Steigerung der Rate erfolgreicher Knochentransplantate bei einem Säugetier, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge der Verbindungen der vorliegenden Erfindung an ein Säugtier, das diese benötigt.
Eine fünfte Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Steigerung der Knochenbildungsrate bei einem Säugetier, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge der Verbindungen der vorliegenden Erfindung an ein Säugetier, das diese benötigt.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist eine knochenbildungssteigernde und knochenresorptionsinhibierende pharmazeutische Zusammensetzung, die eine annehmbare knochenbildungssteigernde und knochenresorptionsinhibierende Menge einer wie oben beschriebenen Verbindung der Erfindung oder einer Mischung davon oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält.
Prostaglandine der PGD-, PGE&sub2;-, PGE&sub1;- und PGF2a-Klasse oder andere geeignete Prostaglandine mit einem Carbonsäurerest in der 1- Stellung und einer Hydroxylgruppe in der 15-Stellung des PG-Restes können mit einem Aminobisphosphonat, wie z. B. ABP, oder dessen Salzen umgesetzt werden, um die in der vorliegenden Erfindung beanspruchten Verbindungen zu bilden. Jedes bekannte Bisphosphonat, das eine Aminfunktionalität besitzt, die in der Lage ist, an ein Prostaglandin anzukoppeln, und das in vivo auf Knochen zielt, kann bei dieser Erfindung als ein chemisches Zufuhrmittel verwendet werden, gleichgültig ob das spezielle Bisphosphonat Knochenresorptionsinhibierungswirkung besitzt oder nicht.
Die beanspruchten Verbindungen können zur Behandlung einer Reihe von Calciummetabolismusstörungen verwendet werden, einschließlich:
(1) Ein Verfahren zur Behandlung oder Prävention von Osteoporose durch Verabreichung einer pharmazeutisch wirksamen Menge von Verbindungen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
(2) Ein Verfahren zur Steigerung der Knochenbruch-Heilungsrate bei einem Säugetier mit einem Knochenbruch durch systemische Verabreichung einer pharmazeutisch wirksamen Menge von Verbindungen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
(3) Ein Verfahren zur Steigerung der Rate erfolgreicher Knochentransplantate, umfassend die Verabreichung einer pharmazeutisch wirksamen Menge von Verbindungen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung an ein Säugetier, das diese benötigt.
(4) Ein Verfahren zur Behandlung von periodontaler Erkrankung oder Alveolarknochenschwund durch Verabreichen einer pharmazeutisch wirksamen Menge von Verbindungen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
Die Bisphosphonate, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind u. a. beliebige Aminoalkylbisphosphonate, wie z. B. Alendronat, Pamidronat ((3-Amino-1-hydroxypropyliden)- bisphosphonsäure-Dinatriumsalz), Pamidronsäure, Risedronat ((1- Hydroxy-2-(3-pyridinyl)ethyliden)bisphosphonat), YM 175 [(Cycloheptylamino)methylenbisphosphonsäure], Piridronat, Aminohexanbisphosphonat, Tiludronat, BM-210955, CGP-42446 und EB-1053.
Das neue Verfahren zur Zufuhr von Prostaglandinen an die Stelle, an der eine Knochenwachstumstimulierung erwünscht ist, mittels der Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung offenbart und beansprucht werden, erfordert die tägliche Zufuhr von etwa 0,0001 bis etwa 1 mg Prostaglandin. Der bevorzugte Bereich, um ein erhöhtes Knochenvolumen zu erzielen, beträgt zwischen 0,1 Mikrogramm und 0,3 Mikrogramm PGE&sub2; pro Tag. Die kortikale Knochenmasse kann auch durch Anwendung einer PGE&sub2;-Äquivalentdosis von 0,3 Mikrogramm pro Tag erhöht werden. Die mittels des neuen, in der vorliegenden Erfindung beanspruchten Verfahrens zugeführten Mengen stellen eine deutliche Verbesserung gegenüber den 3 mg/Tag dar, die notwendig sind, um eine äquivalente Knochenbildungswirkung zu erzielen, wenn ein Prostaglandin systemisch verabreicht wird.
Die Prostaglandine, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind u. a., ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, PGE&sub2;, PGE&sub1; und deren Analoga und PGF2α und dessen Analoga. Die Erfindung umfaßt auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Verbindungen innerhalb des Umfangs der Erfindung als. Wirkstoffe enthalten, und diejenigen Füllstoffe oder anderen inaktiven Bestandteile, die die Fachleute als wichtig für die sichere und wirksame Zufuhr der beanspruchten Zusammensetzung an (einen) Patienten, der/die diese benötigt/benötigen, ansehen.
Schutzgruppen, die bei der Synthese von Verbindungen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind u. a., ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, THP. Andere gut bekannte Alkohol-Schutzgruppen sind u. a. Benzylhalogenide, MEM und Alkylcarbonylhalogenide.
Die folgenden Beispiele zeigen sowohl die Synthesen von einigen der Verbindungen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung als auch die spezifische Fähigkeit der beanspruchten Verbindungen, in vitro und in vivo auf Knochenzellen zu zielen. Die Beispiele zeigen, daß die Aufnahme von mit ¹&sup4;C/³H doppelt markierter Verbindung, die nachstehend gezeigt ist und in der vorliegenden Erfindung beansprucht wird, in menschlichem Knochenpulver in vitro innerhalb von einer Minute in fötalem Rinderserum erfolgt. Etwa 77% des ¹&sup4;C-Restes und 53% des ³H-Restes der nachstehend gezeigten Verbindung wird von dem Knochenpulver aufgenommen. Die Dissoziation des PG-Restes vom Bisphosphonat von menschlichem Knochenpulver in fötalem Rinderserum erfolgt mit einer Geschwindigkeit von etwa 5%/Tag bei 37ºC. Sowohl die Radiomarkierungsversuche als auch die Radioimmunoassay-Versuche bestätigen die Freisetzung des Prostaglandins vom Bisphosphonat am Ort der Knochenzelle.
Die In-vivo-Versuche zeigen auch, daß die in der vorliegenden Erfindung offenbarten und beanspruchten Verbindungen zum Knochen transportiert werden. Zum Beispiel wurde die Aufnahme der nachstehend gezeigten markierten Verbindung in den Ratten-Tibia oder -Femura nach der intravenösen Verabreichung einer einzigen Dosis gezeigt. Die bei diesem Versuch verwendeten Tiere wurden nach 24 Stunden, 14 und 28 Tagen, nachdem die in der vorliegenden Erfindung beanspruchten Verbindungen verabreicht worden waren, getötet. Die Radioaktivität des ¹&sup4;C und des ³H wurde nach der Einäscherung der langen Knochen gemessen, um den Prozentsatz der im Knochen eingelagerten Verbindung zu messen. Die Beispiele zeigen weiter, daß die Verbindungen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung die Produktion von Lysylpyridinolinen (LP) innerhalb bestimmter Zeiträume deutlich inhibieren. Hohe LP-Spiegel sind normalerweise mit dem Abbau von Knochenkollagen verbunden.
Die in der vorliegenden Erfindung beanspruchten Verbindungen sind daher bei der Behandlung von Erkrankungen oder Zuständen geeignet, bei denen ein Knochenschwund oder -abbau oder -bruch stattgefunden hat. Die in der vorliegenden Erfindung beanspruchten Verbindungen führen, wie es die Beschreibung offenbart und die Schemata und Beispiele zeigen, verabreicht in reiner Form oder in einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wirksam eine knochenheilende oder knochenwachstumsfördernde Menge eines Prostaglandins einem Patienten oder einem Organismus, der eine solche Behandlung benötigt, zu. Zusätzlich können die Verbindungen auch als Knochenwachstumsverstärker und Knochenresorptionsinhibitoren verwendet werden, wenn das verwendete spezielle Bisphosphonat eine Knochenresorptionsinhibierende Wirkung zeigt oder wenn die gesamte Verbindung vor der Hydrolyse knochenresorptionsinhibierende Wirkung besitzt.
Die Bezeichnung "pharmazeutisch annehmbare Salze" soll nicht- toxische Salze der Verbindungen dieser Erfindung bedeuten, die im allgemeinen durch Umsetzung der freien Base mit einer geeigneten organischen oder anorganischen Säure hergestellt werden. Repräsentative Salze sind u. a. die folgenden Salze: Acetat, Benzolsulfonat, Benzoat, Hydrogencarbonat, Hydrogensulfat, Bitartrat, Borat, Bromid, Calciumedetat, Camsylat, Carbonat, Chlorid, Clavulanat, Citrat, Dihydrochlorid, Edetat, Edisylat, Estolat, Esylat, Fumarat, Glucoheptanat, Gluconat, Glutamat, Glycollylarsanilat, Hexylresorcinat, Hydrabamin, Hydrobromid, Hydrochlorid, Hydroxynaphthoat, Iodid, Isothionat, Lactat, Lactobionat, Laurat, Malat, Maleat, Mandelat, Mesylat, Methylbromid, Methylnitrat, Methylsulfat, Mucat, Napsylat, Nitrat, Oleat, Oxalat, Pamoat, Palmitat, Pantothenat, Phosphat/Diphosphat, Polygalactouronat, Salicylat, Stearat, Subacetat, Succinat, Tannat, Tartrat, Teoclat, Tosylat, Triethiodid, Valerat.
Die Bezeichnung "pharmazeutisch wirksame Menge" soll die Menge eines Arzneistoffes oder pharmazeutischen Mittels bedeuten, die die biologische oder medizinische Wirkung auf ein Gewebe, System oder Tier hervorruft, die von einem Arzt oder Tierarzt gewünscht wird.
Die Bezeichnung "Aryl" soll ein mono- oder polycyclisches System bedeuten, das aus 5- und/oder 6gliedrigen aromatischen Ringen mit 0, 1, 2, 3 oder 4 Heteroatomen, ausgewählt aus N, O oder S, besteht und entweder unsubstituiert oder unabhängig mit R¹ bis R¹² substituiert ist. Die Bezeichnung "Alkyl" soll gerades oder verzweigtes C1-C30-Alkan, Alken oder Alkin bedeuten.
Die Bezeichnung "Alkoxy" soll einen Alkylteil umfassen, wobei Alkyl wie oben definiert ist.
Die Bezeichnungen "Arylalkyl" und "Alkylaryl" sollen einen Alkylteil, wobei Alkyl wie oben definiert ist, und einen Arylteil, wobei Aryl wie oben definiert ist, enthalten. Die C0-n oder C1-n- Bezeichnung, bei der n eine ganze Zahl von 1-10 bzw. 2-10 sein kann, bezieht sich auf die Alkylkomponente der Arylalkyl- oder Alkylaryl-Einheit.
Die Bezeichnung "Halogen" soll Fluor, Chlor, Iod und Brom umfassen.
Die Bezeichnung "Oxy" soll ein Sauerstoff(O)-Atom bedeuten.
Die Bezeichnung "Oxo" bedeutet ein bivalentes Sauerstoffatom (=O).
Die Bezeichnung "Thio" soll ein Schwefel(S)-Atom bedeuten.
Die Bezeichnung "substituiertes Phenyl" soll ein Phenyl bedeuten, das mit einem Halogen, Alkyl oder CF&sub3; substituiert ist.
Mit der Stelle, an der eine Knochenwachstumsstimulierung erwünscht ist, ist sowohl der Bereich, der an einen Knochenabschnitt oder an eine Knochengruppe, der/die eine Behandlung benötigt, in einem Menschen oder einem anderen Organismus, der diese benötigt, angrenzt als auch ein Bereich im Inneren des Knochens, einschließlich der Stelle eines Bruchs oder einer Öffnung, der/die in dem Knochen oder in der Knochengruppe natürlich vorkommt oder absichtlich erzeugt wurde, gemeint.
Die Bezeichnung "gebrochener Knochen" bedeutet alle Arten von gebrochenen Knochen, wie z. B. Grünholzfrakturen, komplizierte Brüche, laterale Frakturen, pathologische Frakturen, die von invasiven Tumoren stammen, Kompressionsfrakturen und Frakturen, die chirurgische Verfahren notwendig machen, um die Knochen wiederauszurichten.
Die Bezeichnung "Bisphosphonat-Zufuhrmittel", so wie sie hier verwendet wird, bedeutet ein beliebiges bekanntes Bisphosphonat, das wirksam auf Knochen zielt und in der Lage ist, wie hierin beschrieben mit Prostaglandin zu reagieren. Die Bisphosphonat- Zufuhrmittel umfassen alle kommerziell bekannten Bisphosphonate, die bei der Behandlung von Osteoporose verwendet werden, und umfassen ferner diejenigen, die speziell in dieser Offenbarung genannt werden. Die obige Bezeichnung umfaßt auch diejenigen Bisphosphonate, die auf Knochen zielen und sicher und wirksam sind, gleichgültig ob das Bisphosphonat bei der Behandlung von Osteoporose geeignet ist oder nicht.
In den nachstehenden Schemata und Beispielen haben die verschiedenen Reagenziensymbole die folgenden Bedeutungen:
BOC(Boc): t-Butyloxycarbonyl
THP: Tetrahydropyran
Pd-C: Palladium-auf-Aktivkohle-Katalysator
DMF: Dimethylformamid
DMSO: Dimethylsulfoxid
DCC: 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid.
CBZ(CBz): Carbobenzyloxy oder Benzyloxycarbonyl
CH&sub2;Cl&sub2;: Methylenchlorid
CHCl&sub3;: Chloroform11
CH&sub3;CN: Acetonitril
EtOH: Ethanol
CDI: Carbonyldiimidazol
MeOH: Methanol
EtOAc: Ethylacetat
HOAc: Essigsäure
EDC: 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid
LDA: Lithiumdiisopropylamid
THF: Tetrahydrofuran
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können in solchen oralen. Formen wie Tabletten, Kapseln (jeweils einschließlich Formulierungen mit zeitlich festgelegter und verzögerter Abgabe), Pillen, Pulvern, Granulaten, Elixieren, Tinkturen, Suspensionen, Sirupen und Emulsionen verabreicht werden. Ähnlich können sie in intravenöser (sowohl als Bolus als auch als Infusion), intraperitonealer, subkutaner oder intramuskulärer Form verabreicht werden, wobei alle Anwendungsformen den Durchschnittsfachleuten auf den pharmazeutischen Gebieten gut bekannt sind. Eine wirksame, jedoch nichttoxische Menge der erwünschten Verbindung kann als ein Antiosteoporosemittel oder als Knochenbruchheilungsmittel eingesetzt werden.
Die Verbindungen der Erfindung können an Patienten verabreicht werden, bei denen die Prävention von Osteoporose oder anderen knochenbezogenen Störungen erwünscht ist.
Das Dosisregime bei der Verwendung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung wird gemäß einer Vielzahl von Faktoren ausgewählt, einschließlich Typ, Spezies, Alter, Gewicht, Geschlecht und medizinischem Zustand des Patienten, der Schwere des zu behandelnden Zustandes, des Verabreichungsweges, der Nieren- und Leber-Funktion des Patienten und der verwendeten speziellen Verbindung oder eines Salzes davon. Ein Arzt oder Tierarzt mit durchschnittlichen Fähigkeiten kann leicht die wirksame Menge des Arzneistoffes, die benötigt wird, um das Fortschreiten des Zustandes zu verhindern, zu bekämpfen oder aufzuhalten, ermitteln und verschreiben.
Bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung können die Verbindungen, die hier im Detail beschrieben sind, den Wirkstoff bilden, und sie werden typischerweise mit geeigneten pharmazeutischen Verdünnungsmitteln, Hilfsstoffen oder Trägern (hierin gemeinsam als "Träger"-Materialen bezeichnet), welche im Hinblick auf die vorgesehene Verabreichungsform, d. h. Oraltabletten, Kapseln, Elixiere, Sirupe und dergleichen, und in Übereinstimmung mit herkömmlichen pharmazeutischen Praktiken geeignet ausgewählt werden, vermischt verabreicht.
Zum Beispiel kann zur oralen Verabreichung in Form einer Tablette oder Kapsel die wirksame Arzneistoffkomponente mit einem oralen, nichttoxischen pharmazeutisch annehmbaren inerten Träger, wie z. B. Lactose, Stärke, Saccharose, Glucose, Methylcellulose, Magnesiumstearat, Dicalciumphosphat, Calciumsulfat, Mannit, Sorbit und dergleichen, kombiniert werden; zur oralen Verabreichung in flüssiger Form können die oralen Arzneistoffkomponenten mit irgendeinem oralen, nichttoxischen pharmazeutisch annehmbaren inerten Träger, wie z. B. Ethanol, Glycerin, Wasser und dergleichen, kombiniert werden. Ferner können auch, falls erwünscht oder notwendig, geeignete Bindemittel, Gleitmittel, Sprengmittel, Elektrolyte und Farbmittel der Mischung beigemengt werden. Die vorliegende Zusammensetzung kann in Form von Tabletten, Capletten, Gelkapseln, Kapseln, Elixieren, Sirupen oder Suspensionen verabreicht werden. Zur oralen Verabreichung können die Wirkstoffe mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel, wie z. B. Lactose, Saccharose, Cellulose, Dicalciumphosphat, Calciumsulfat, Mannit und, in einer flüssigen Zusammensetzung, Ethylalkohol vermischt werden. Annehmbare Emulgier- oder Suspensionsmittel, wie z. B. PVP, Gelatine, natürliche Zucker, Maissüßmittel, natürliche und synthetische Gummen, wie z. B. Akaziengummi, Natriumalginat, Guargummi, Agar, Bentonit, Carboxymethylcellulose-Natrium, Polyethylenglycol und Wachse können ebenfalls mit den Wirkkomponenten vermischt werden. Wo notwendig, können Gleitmittel, wie z. B. Magnesiumstearinsäure, Talk oder Magnesiumstearat, und Sprengmittel oder Supersprengmittel, wie z. B. Stärke, Natriumstärkeglycolat oder vernetztes PVP, ebenfalls enthalten sein. Elektrolyte, wie z. B. Dicalciumphosphat, Natriumbenzoat, Natriumacetat und Natriumchlorid, können ebenfalls verwendet werden. Sprengmittel sind auch u. a., ohne Einschränkung, Stärke, Methylcellulose, Agar, Bentonit, Xanthangummi und dergleichen.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch in Form von Liposomabgabesystemen, wie z. B. kleinen einlamellaren Vesikeln, großen einlamellaren Vesikeln und multilamellaren Vesikeln, verabreicht werden. Liposome können aus einer Vielzahl von Phospholipiden, wie z. B. Cholesterin, Stearylamin oder Phosphatidylcholinen, gebildet werden.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch mit löslichen Polymeren als auf ein Ziel ausrichtbare Arzneistoffträger gekoppelt werden. Solche Polymere können u. a. Polyvinylpyrrolidon, Pyrancopolymer, Polyhydroxypropylmethacrylamidphenol, Polyhydroxyethylaspartamidphenol oder Polyethylenoxidpolylysin, substituiert mit Palmitoylresten, sein. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können ferner an eine Klasse biologisch abbaubarer Polymere gekoppelt sein, die geeignet sind, um eine gesteuerte Arzneistoffabgabe zu erzielen, zum Beispiel Polymilchsäure, Polyglycolsäure, Copolymere aus Polymilch- und Polyglycolsäure, Polyepsilon-caprolacton, Polyhydroxybuttersäure, Polyorthoester, Polyacetale, Polydihydropyrane, Polycyanoacrylate und vernetzte oder amphipatische Blockcopolymere von Hydrogelen.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch zusammen mit geeigneten Antiosteoporose-Arzneistoffen verabreicht werden, um synergistische Wirkungen bei der Behandlung verschiedener Pathologien zu erzielen. Sie können auch mit bekannten Bisphosphonaten oder anderen geeigneten Verbindungen, die zur Behandlung von Osteoporose, knochenbezogener Störungen oder Knochenbrüchen verwendet werden, kombiniert werden.
Die neuen Verbindungen der vorliegenden Erfindung wurden gemäß den Verfahren der Schemata und Beispiele, die in dieser Beschreibung beschrieben sind, hergestellt, wobei geeignete Materialien verwendet wurden, und sie werden ferner durch die folgenden spezifischen Beispiele veranschaulicht. Die bevorzugtesten Verbindungen der Erfindung sind irgendwelche oder alle der speziell in diesen Beispielen und Schemata angegebenen Verbindungen. Diese Verbindungen sollen jedoch nicht als die einzige Gattung, die als die Erfindung betrachtet wird, aufgefaßt werden, und jede beliebige Kombination der Verbindungen oder ihrer Reste kann ihrerseits eine Gattung bilden. Die folgenden Beispiele veranschaulichen weiter Details der Herstellung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung. Die Fachleute werden leicht erkennen, daß bekannte Variationen der Bedingungen und Verfahren der folgenden präparativen Verfahren verwendet werden können, um diese Verbindungen herzustellen. Alle Temperaturen sind, sofern nichts anderes angegeben ist, in Grad Celsius angegeben.
Alle Reagenzien und trockenen Lösungsmittel werden aus kommerziellen Quellen erhalten und ohne weitere Reinigung verwendet. ([5,6,8,11,12,14,15-³H(N)]-PGE&sub2; wird von New England Nuclear bezogen, und 3-[¹³C]-3-Amino-1-hydroxypropan-1,1-diphosphonat(¹&sup4;C-Alendronat)(¹&sup4;C-ABP) wird von Merck Research Laboratories, Rahway, NJ, synthetisiert). Alle Reaktionen wurden unter einem positive n Stickstoffdruck durchgeführt. Die Flashchromatographie wird auf Kieselgel (Merck, 230-400 Mesh) durchgeführt. Bond-Elut-C18-Pak- Patronen werden von Varian Inc. bezogen und vor der Verwendung mit CH&sub3;CN, Methanol und Wasser gewaschen. ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren werden auf einem Bruker-ARX-400- oder AMX-300-Gerät aufgezeichnet. Die Infrarotspektren werden an einem Perkin-Elmer-681-Spektrometer aufgezeichnet. Die Schmelzpunkte werden an einer Mettler-FPGl- Apparatur gemessen und sind unkorrigiert. Niedrigauflösende Massenspektren und Elementaranalysen werden von Oneida Research Services erhalten. Hochauflösende Massenspektren wurden an der Biomedical Mass Spectrometry Unit, McGill University, mit einem ZAB-2F-HS- Gerät erhalten. BEISPIEL 1

Tribenzylorthoformiat

Benzylalkohol (390 ml, 3,6 mol) wird zu einer Lösung von Triethylorthoformiat (150 ml, 0,9 mol) in Benzol (350 ml) bei Raumtemperatur zugegeben. Anschließend wird Trifluoressigsäure (6,8 ml, 0,09 mol) bei Raumtemperatur zugegeben und die Mischung langsam unter vermindertem Druck destilliert (35ºC, 20 mm Hg), bis die flüchtigen Bestandteile (EtOH, C&sub6;H&sub6;, TFA) abdestilliert sind. Überschüssiger Benzylalkohol wird abdestilliert (75ºC, 0,1 mm Hg), und der Rückstand besteht im wesentlichen aus Tribenzylorthoformiat, das abdestilliert (170-185 C, 0,1 mm Hg) werden kann, das aber auch roh im nächsten Schritt verwendet werden kann. ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 7,40 (15H, s), 5,50 (1H, s), 4,74 (6H, s). ¹³C-NMR (CDCl&sub3;): δ 137,8, 128,9, 128,1, 111,8, 66,5.

Tetrabenzylmethylendiphosphonat (1)

Eine Mischung aus Methylendiphosphonsäure (14,8 g, 0,08 mol) und Tribenzylorthoformiat (226 g, 0,68 mol) wird 2 Stunden lang auf 150ºC erhitzt, abgekühlt, mit Ethylacetat (125 ml) verdünnt und auf eine Kieselgelsäule (4,5 l) gegossen. Die Elution mit Ethylacetat ergibt 34,6 g (77%) Tetrabenzylmethylendiphosphonat 1 als ein Öl. IR (unverdünnt) 3100-2900 cm&supmin;¹. ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 7,29 (20H, m), 4,98 (8H, m), 2,50 (2H, t, J = 24,0 Hz). ¹³C-NMR (CDCl&sub3;): δ 136,1, 128,9, 128,8, 128,2, 128,1, 68,4, 26,4 (t, J = 138,4 Hz). MS (FAB, NaI) m/z (relative Intensität): 537 (MH&spplus;, 96), 447 (7), 181 (100). HRMS (FAB, NaI): berechn. für C&sub2;&sub9;H&sub3;&sub1;P&sub2;O&sub6; (MH&spplus;) 537, 1596; gefunden 537,1594. Anal. berechn. für C&sub2;&sub9;H&sub3;&sub1;P&sub2;O&sub6;: C, 64,91; H, 5,64; P, 11,55; gefunden: C, 64,69; H, 5,85; P, 11,26.

Tetrabenzyl-2-(4-carbomethoxyphenyl)ethan-1,1-diphosphonat (2)

Natriumhydrid (60%) (291 mg, 7,3 mmol) wird portionsweise zu einer Lösung von Tetrabenzylmethylendiphosphonat (1) (3,0 g, 5,5 mmol) in DMF (10,0 ml) bei Raumtemperatur zugegeben. Die Mischung wird bei Raumtemperatur 60 Minuten lang gerührt und mit einer Lösung von Methyl-p-brommethylbenzoat (1,9 g, 8,4 mmol) in THF (2,0 ml) versetzt. Die Mischung wird bei Raumtemperatur 30 Minuten lang gerührt und mit einer Lösung aus gesättigtem Ammoniumchlorid (15 ml), Wasser (100 ml) und einer (1 : 1)-Mischung aus Ether : Hexanen (100 ml) versetzt. Die abgetrennte wäßrige Schicht wird mit einer (1 : 1)-Mischung aus Ether : Hexanen (3 · 100 ml) extrahiert, und die vereinten organischen Schichten werden gewaschen (Salzlösung), getrocknet (MgSO&sub4; wasserfr.), filtriert und eingedampft. Die Flashchromatographie (EtOAc : Hexane (1 : 1)) des Rückstandes ergibt monoalkyliertes Produkt 2 (1,8 g, 47%) zusammen mit dialkyliertem Produkt 3 (670 mg, 14%). Die Spektraldaten für die Verbindungen 2 und 3 sind nachstehend angegeben.
2: IR (unverdünnt) 3100-2890, 1720 cm&supmin;¹. ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 7,80 (2H, d, J = 7,0 Hz), 7,33 (20H, m), 7,10 (2H, d, J = 7,0 Hz), 4,92 (8H, m), 3,88 (3H, s), 3,26 (2H, td, J = 16,7, 6,4 Hz), 2,71 (1H, tt, J = 24,0, 6,4 Hz). ¹³C-NMR (CDCl&sub3;) δ 166,8, 144,4, 136,0, 129,5, 128,9, 128,5, 128,4, 128,2, 128,1, 68,1 (dd, J = 24,1, 6,6 Hz), 51,9, 40,8, 39,6 (t, J = 132,5 Hz), 31,3 (t, J = 6,2 Hz). MS (FAB, NaI) m/z (relative Intensität): 685 (42), 301 (10), 181 (100). HRMS (FAB, NaI) berechn. für C&sub3;&sub8;H&sub3;&sub9;P&sub2;O&sub8; (MH&spplus;) 685, 2120; gefunden 685, 2122.
3: IR (unverdünnt) 3100-2890, 1725 cm&supmin;¹. ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 7,79 (4H, d, J = 7,0 Hz), 7,40 (2H, d, J = 7,0 HZ), 7,33 (20H, m), 4,85 (8H, m), 3,86 (6H, s), 3,40 (4H, t, J = 16,0 Hz). ¹³C-NMR (CDCl&sub3;): δ 168,9, 141,5, 135,9, 131,7, 128,8, 128,7, 128,5, 128,4, 128,2, 68,2 (t, J = 2,9 Hz), 51,9, 49,3 (t, J = 130,9 Hz), 38,3 (t, J = 6,2 Hz). MS (FAB, NaI) m/z (relative Intensität): 833 (23), 603 (16), 449 (11), 181 (100). HRMS (FAB, NaI): berechn. für C&sub4;&sub7;H&sub4;&sub7;P&sub2;O&sub1;&sub0; (MH&spplus;) 833,2645; gefunden 833,2642. BEISPIEL 2

Tetrabenzyl-2-(4-carboxyphenyl)ethan-1,1-diphosphonat (4)

Eine Lösung von Lithiumhydroxid (84 mg, 2,0 mmol) in Wasser (1,0 ml) wird zu einer Lösung von Methylester 2 (455 mg, 0,6 mmol) in 1,4-Dioxan (1,0 ml) bei Raumtemperatur zugegeben. Die Mischung wird bei Raumtemperatur 5 Stunden lang gerührt und mit einer 1 N HCl-Lösung (10 ml) versetzt. Das Dioxan wird unter vermindertem Druck abgedampft und die Mischung mit EtOAc (20 ml) verdünnt. Die abgetrennte wäßrige Schicht wird mit EtOAc (3 · 50 ml) extrahiert, und die vereinten organischen Schichten werden gewaschen (Salzlösung), getrocknet (MgSO&sub4; wasserfr.), filtriert und eingedampft. Die Flashchromatographie (HOAc : EtOH : EtOAc (0,1 : 1 : 9)) des Rückstandes ergibt Carbonsäure 4 (210 mg, 48%). ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 9,65 (1H, br. s), 7,98 (2H, d, J = 8,1 Hz), 7,26 (20H, s), 7,13 (2H, d, J = 8,1 Hz), 4,95 (8H, m), 3,31 (2H, td, J = 16,7, 6,4 Hz), 2,82 (1H, tt, J = 24,0, 6,4 Hz). ¹³C-NMR (CDCl&sub3;): δ 170,0, 144,6 (t, J = 7,6 Hz), 135,9, 135,8, 130,1, 129,0, 128,6, 128,5, 128,4, 128,3, 128,2, 128,1, 68,3 (dd, J = 19,6, 6,5 Hz), 39,4 (t, J = 133,2 Hz), 31,2 (br. s).

PGE2-TBDPS-Ester-Bisphosphonat-Konjugat (7a)

Frisch destilliertes Oxalylchlorid (1,5 Äquivalente) wird zu einer Lösung der Säure 4 (177 ng, 0,264 mmol) und DMF (10 ul, 0,132 mmol) in Dichlormethan (1 ml) bei 0ºC zugegeben. Nach 10minütigem Rühren werden die flüchtigen Bestandteile unter Hochvakuum abgedampft und der Rückstand, Säurechlorid 5, direkt verwendet. IR (unverdünnt): 1770, 1740 cm&supmin;¹. 5 wird in Dichlormethan (100 ul) gelöst, auf -20ºC abgekühlt und mit 50 ul Pyridin versetzt, gefolgt von PGE&sub2;-TBDPS in Pyridin (350 ul) und Dichlormethan (100 ul). Nach 10minütigem Rühren bei -10ºC und 0,5 Stunden lang bei 0ºC wird eine gesättigte Ammoniumchloridlösung zugegeben und die Mischung mit EtOAc-Acetat (3 · 5 ml) extrahiert. Die organischen Extrakte werden mit Salzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird durch HPLC (ZORBAX, 21-5 · 25 cm, 20 ml/Minute, EtOAc : Hexan (80/20) als Elutionsmittel) gereinigt. Die erste Fraktion entspricht dem C-11-Regioisomer 7b (66,4 mg, 18%). Die zweite Fraktion ist das erwünschte C-15-Regioisomer 7a (156,4 mg, 42%). Die Ethylacetat-Elution ergibt das bisacylierte Produkt (20 mg) und gewinnt PGE&sub2;-TBDPS (55,3 mg, 31,4%) zurück.
C-15-Isomer 7b: IR (unverdünnt) 3400, 3060-2860, 1740-1720 cm&supmin;¹. ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 7,78 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,66, 7,64 (4H, 2d, J = 7,9 Hz), 7,43-7,18 (26H, m), 7,11 (2H, d, J = 8,2 Hz), 5,67, 5,39 (4H, 2 m), 5,28 (1H, m), 4,93 (8H, m), 4,05 (1H, m), 3,28 (2H, td, J = 16,6, 6,4 Hz), 2,72 (1H, tt, J = 24,0, 6,4 Hz), 2,71 (1H, m), 2,44 (2H, t, J = 7,5 Hz), 2,41-1,22 (19H, m), 1,09 (9H, s), 0,86 (3H, m). ¹H-NMR (CD&sub3;COCD&sub3;): δ 7,85 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,73, 7,72 (4H, 2d, J = 7,7 Hz), 7,48-7,26 (28H, m), 5,87 und 5,78 (2H, 2dd, J = 15,5, 7,8 Hz bzw. J = 15,5, 6,5 Hz), 5,52, 5,40 (3H, m), 5,03 (8H, m), 4,31 (1H, d, J = 5,1 Hz), 4,16 (1H, m), 3,33 (2H, td, J = 16,4, 6,6 Hz), 3,05 (1H, tt, J = 23,7, 6,6 Hz), 2,67-1,20 (19H, m), 1,10 (9H, s), 0,87 (3H, m). ¹³C-NMR (CD&sub3;COCD&sub3;): δ 214,3, 173,0, 165,9, 145,7 (t, J = 7,8 Hz), 137,5 (dd, J = 9,0, 6,9 Hz), 136,0, 130,1, 129,2, 75,5, 72,4, 68,5 (m), 54,8, 53,9, 39,8 (t, J = 131,1 Hz), 47,5, 35,9, 35,4, 33,9, 32,3, 27,3, 25,8, 25,7, 23,2, 19,6, 14,3. MS (FAB, NaI) m/z (relative Intensität): 1265 (M + Na&spplus;, 24), 1243 (13), 1192 (17), 819 (13), 761 (16), 671 (100), 581 (62). HRMS (FAB, NaI): berechn. für C&sub7;&sub3;H&sub8;&sub5;P&sub2;SiO&sub1;&sub2; (MH&spplus;) 1243,5286; gefunden 1243,5287. C-11-Isomer 7b: IR (unverdünnt) 3400, 3060-2860, 1740- 1720 cm&supmin;¹. ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 7,75 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,64 (4H, m), 7,46-7,18 (26H, m), 7,11 (2H, d, J = 8,3 Hz), 5,62-5,21 (5H, 4 m), 5,28 (1H, m), 4,93 (8H, m), 4,06 (1H, d, J = 6,6 Hz), 4,00 (1H, m), 3,27 (2H, td, J = 16,7, 6,5 Hz), 3,00 (1H, dd, J = 18,3, 6,8 Hz), 2,79-1,11 (19H, m), 1,09 (9H, s), 0,81 (3H, br. t, J = 6,7 Hz).

PGE&sub2;-Bisphosphonatester-Konjugat (8)

Eine Lösung von PGE&sub2;-TBDPS-Ester-Konjugat 7a (145 mg, 0,117 mmol) in THF (4 ml) und 0,2 N HCl (1 ml) wird bei Raumtemperatur 4 Stunden lang gerührt und mit Salzlösung verdünnt, mit EtOAc (4 · 10 ml) extrahiert. Die Extrakte werden vereint, im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch Ringchromatographie (EtOAc/Hexan = 80/20) gereinigt, um die entsprechende Säure zu ergeben (110 mg, 94%). 17: IR (unverdünnt) 3680-3200, 3000-2840, 1740 cm&supmin;¹. ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 7,79 (2H, d, J = 8,0 Hz), 7,25 (20H, m), 7,13 (2H, d, J = 8,0 Hz), 5,68 (2H, 2 m), 5,37 (3H, m), 4,92 (8H, m), 4,07 (1H, m), 3,26 (2H, td, J = 16,6, 6,2 Hz), 2,84 (1H, tt, J = 24,0, 6,2 Hz), 2,68. (1H, br. dd, J = 18,4, 7,4 Hz), 2,41-1,22 (19H, m), 1,09 (9H, s), 0,86 (3H, m). ¹³C-NMR (CDCl&sub3;): δ 214,8, 176,7, 165,2, 144,4 (t, J = 7,6 Hz); 135,8 (dd, J = 9,0, 6,9 Hz), 131,5, 129,3, 128,6, 128,5, 128,2, 74,9, 72,0, 68,3, 54,5, 53,2, 39,2 (t, J = 132,9 Hz), 46,2, 34,5, 33,4, 31,6, 31,1, 26,6, 25,1, 24,9, 24,6, 22,5, 14,0. MS (FAB, NaI) m/z (relative Intensität): 1027 (M + Na&spplus;, 31), 671 (100). HRMS (FAB, NaI): berechn. für C&sub5;&sub7;H&sub6;&sub7;F&sub2;O&sub1;&sub2; (MH&spplus;): 1005,4108; gefunden: 1005,4106.

PGE&sub2;-Bisphosphonat-Konjugat (9)

Eine Lösung der Säure 8 (36 mg, 0,036 mmol) in EtOH (420 ml) und EtOAc (80 ml) in einem 3-ml-Borsilicat-Reagenzglas unter Stickstoff wird in ein 20ºC-Wasserbad eingetaucht. Zu der Lösung wird Pd/C (5% Pd-Gehalt, 5,7 mg. 0,036 mmol) zugegeben, gefolgt von 1,4-Cyclohexadien (136 ml, 1,44 mmol), und die resultierende Mischung wird bei Raumtemperatur 4,5 Stunden lang gerührt und in ein 1,5-ml-Eppendorf-Kunststoffröhrchen überführt und zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und der Rückstand zweimal mit Ethanol (1 ml) gewaschen. Die Überstände werden vereint, mit 0,5 N Ammoniumacetat (144 ml, 0,072 mmol) neutralisiert und eingeengt.
Das Rohprodukt (~90%ig rein gemäß ¹H-NMR) kann auf zweierlei Arten gereinigt werden: 1) Durch C18-Minisäulen (6 ml Varian Bond Elute) mit Wasser (5 ml), 30% MeOH/Wasser (5 ml), 60% MeOH/Wasser (5 ml) und MeOH (5 ml). Das erwünschte Produkt wird mit der 30% MeOH/- Wasser-Fraktion eluiert. Die Fraktion wird gefriergetrocknet, um die Verbindung 9 (21 mg, 76%) als ein hellgelbes flockiges Pulver zu ergeben. 2) Durch HPLC unter Verwendung einer Waters-PrepPak- uBondapak®-C18-Säule (25 · 100 nm, 10 ml/Minute, Gradientenzusammensetzung: 0,5 N NH&sub4;OAc/CH&sub3;CN. = 90/10 auf 70/30 in 10 Minuten und 70/30 10 Minuten lang, UV-Detektion: 254 nm). Die so erhaltenen Fraktionen werden gefriergetrocknet, um das erwünschte Produkt, 9, zu ergeben. ¹H-NMR (D&sub2;O): δ 7,82 (2H, d, J = 7,9 Hz), 7,37 (2H, d, J = 7,9 Hz), 5,65 (2H, m), 5,37 (2H, m), 5,19 (1H, m), 4,05 (1H, m), 3,03 (2H, m), 2,65 (1H, dd, J = 18,8, 7,5 Hz), 2,42-1,16 (21H, m), 0,71 (3H, m). ¹³C-NMR (D&sub2;O): δ 222,1, 180,0, 169,5, 133,9, 133,0, 130,4, 130,3, 77,2, 72,1, 53,2, 42,1, 40,4, 35,1, 34,6, 34,5, 32,4, 32,1, 31,8, 25,2, 25,1, 22,9, 14,3. MS (FAB, NaI) m/z (relative Intensität): 667 (M + Na&spplus;, 4), 645 (2), 399 (4), 311 (11), 293 (14), 177 (60), 136 (100). HRMS (FAB, NaI): berechn. für C&sub2;&sub9;H&sub4;&sub3;P&sub2;O&sub1;&sub2; (MH&spplus;) 645,2231; gefunden: 654,2230. BEISPIEL 3

3-Acetylthiopropyliodid (10)

Zu einer Lösung von 1,3-Diiodpropan (10 g, 33,8 mmol) in 10 ml wasserfreiem DMF bei 0ºC unter Stickstoff wird mittels einer Kanüle innerhalb von 15 Minuten eine Lösung von Kaliumthioacetat (1,3 g, 11,3 mmol) in 5 ml DMF zugegeben und die Mischung 0,5 Stunden lang bei 0ºC gerührt, mit Wasser (20 ml) gequencht und mit Ether (3 · 20 ml) extrahiert. Die Extrakte werden vereint, mit Salzlösung gewaschen und über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und eingeengt. Der Rückstand wird durch Flashchromatographie gereinigt (Kieselgel, EtOAc : Hexan/5 : 95-10 : 90), um Iodid 10 (2,5 g, 90%) als ein hellgelbes Öl zu ergeben. IR (unverdünnt) 2960, 2920, 1689, 1418, 1350, 1210, 1130 cm&supmin;¹; ¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ 2,00 (2H, m), 2,26 (3H, s), 2,87 (2H, t, J = 7 Hz), 3,13 (2H, t, J = 6,9 Hz); ¹³C-NMR (CDCl&sub3;) δ 4,35, 29,70, 30,63, 32,97, 195,09.

Tetraisopropyl-4-acetylthiobutan-1,1-diphosphonat (11)

Zu einer Lösung von Tetraisopropylmethylendiphosphonat (9,35 g, 27 mmol) in wasserfreiem DMF (30 ml) wird NaH (0,96 g, 32 mmol) portionsweise zugegeben und die resultierende Suspension 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt. Zu der obigen Lösung wird anschließend tropfenweise eine Lösung von Iodid 10 in DMF (7 ml) zugegeben, und die Mischung wird. 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, mit gesättigtem wäßrigem Ammoniumchlorid gequencht und mit EtOAc (3 · 60 ml) extrahiert. Die Extrakte werden vereint, mit Salzlösung gewaschen und über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird der Kughrör-Destillation unterworfen, um das nicht umgesetzte Ausgangsmaterial zu entfernen. Der Destillationsrückstand wird durch Flashchromatographie. (Kieselgel, EtOH : CH&sub2;Cl&sub2;/0 : 100-3 : 97) gereinigt, um das Bisphosphonat 11 (4,5 g, 36%) als ein farbloses Öl zu ergeben. IR (unverdünnt) 2980, 2930, 2875, 1692, 1381, 1370, 1248 cm&supmin;¹; ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 1,27 (24H, m), 1,73-1,92 (4H, m), 2,06 (1H, tt, J = 24,1, 5,8 Hz), 2,23 (3H, s), 2,80 (2H, t, J = 7 Hz), 4,70 (4H, m); ¹³C-NMR (CDCl&sub3;): δ 23,06, 23,11, 23,16, 23,42, 24,30 (t, J = 5 Hz), 27,85, 28,06 (t, J = 6,6 Hz), 29,71, 37,18 (t, J = 135 Hz), 70,10 (d, J = 6,9 Hz), 70,25 (d, J = 7 Hz), 194,11; MS (FAB) m/z (relative Intensität) 461 (MH&spplus;, 46), 251 (100); HRMS berechn. für C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub9;O&sub7;P&sub2;S (MH&spplus;) 461, 1891, gefunden 461,1892.

4-Mercaptobutan-1,1-diphosphonsäure (12)

Eine Lösung von Bisphosphonat 11 (2,07 g, 4,5 mmol) in 40 ml 6 N HCl wird unter Stickstoff 6 Stunden lang am Rückfluß erhitzt und auf Räumtemperatur abgekühlt. Die Lösung wird unter Hochvakuum eingeengt, um 12 (1,1 g, 98%) als ein gelbliches Öl zu ergeben. ¹H- NMR (D&sub2;O, 400 MHz) δ 1,54-1,78 (4H, m), 2,08 (1H, tt, J = 23,6, 5,9 Hz), 2,31 (2H, t, J = 6,7 Hz); ¹³C-NMR (D&sub2;O, 100 MHz) δ 24,13, 24,63 (t, J = 4,5 Hz), 33,46 (t, J = 6,6 Hz), 37,75 (t, J = 128 Hz); MS (FAB) m/z (relative Intensität) 251 (MH&spplus;, 47), 217 (39), 136 (100); HRMS berechn. für C&sub4;H&sub1;&sub3;O&sub6;P&sub2;S (MH&spplus;) 250,9908, gefunden 250,9908. BEISPIEL 4

PGE&sub2;-t-Butyldiphenylsilylester (PGE&sub2;TBDPS) (6)

Zu einer Lösung von PGE&sub2; (352, 5 mg, 1 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (5 ml) bei 0ºC werden der Reihe nach t-Butyldiphenylsilylchlorid (275 ul, 1,1 mmol) und Triethylamin (278 ul, 2,0 mmol) durch eine Mikrospritze zugegeben. Die Mischung wird 2 Stunden lang bei 0ºC gerührt, dann wird das Lösungsmitte 1 abgedampft und der Rückstand durch Flashchromatographie auf Kieselgel mit Ethylacetat als Elutionsmittel gereinigt, um 592 mg (100%) PGE&sub2;-TBDPS-Ester (6)zu ergeben. ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 7,65, 7,37 (108, m), 5,59 (1H, dd, J = 15,7 Hz), 5,48 (1H, dd, J = 15,8 Hz), 5,38 (1H, m), 5,29 (1H, m), 4,05-3,97 (2H, m), 2,68 (1H, dd, J = 15,7 Hz), 2,44 (2H, dd, J = 7,7 Hz), 2,38-2,28 (6H, m), 2,14 (1H, dd, J = 17,9 Hz), 2,05 (3H, m), 1,70 (2H, m), 1,56-1,40 (2H, m), 1,35-1,24 (5H, m), 1,08 (9H, s), 0,86 (3H, t, J = 7 Hz).
Eine Probe des [5,6,8,11,12,14,15-³H(N)]-PGE&sub2;TBDPS-Esters wird durch Verdünnen von [5,6,8,11,12,14,15-³H(N)]-PGE&sub2; (1 mCi, 100-200 Ci/mmol) mit 100 mg PGE&sub2; hergestellt, um letztlich eine spezifische Aktivität von 3,53 mCi/mmol zu ergeben. Das PGE&sub2; wird wie oben in 89%iger Ausbeute in [³H]-PGE&sub2;-TBDPS-Ester (12) überführt.

15-Bromacetyl-PGE-TBDPS-Ester (13)

Zu einer Lösung von PGE&sub2;-TBDPS (3,3 g, 5,58 mmol) in wasserfreiem THF (9 ml) bei -25ºC werden Pyridin (0,54 ml, 6,7 mmol) und Bromacetylbromid (0,54 ml, 6,14 mmol) zugegeben, und die Suspension wird 10 Minuten lang bei -25ºC bis -20ºC gerührt. Die Mischung wird mit gesättigtem wäßrigem Ammoniumchlorid gequencht, auf Raumtemperatur erwärmt und mit EtOAc extrahiert. Die organische Schicht wird mit Salzlösung gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und im Vakuum eingeengt. Das Rohprodukt wird durch Flashchromatographie (Kieselgel, EtOAc : Hexan/10 : 90-40 : 60) gereinigt, um die erwünschte Verbindung 13 (1,93 g, 49%) als ein farbloses Öl zu ergeben. IR (unverdünnt) 3460, 2950, 2928, 2855, 1725, 1460, 1424, 1270 cm&supmin;¹; ¹H- NMR (CDCl&sub3;): δ 0,86 (3H, t, J = 6,7 HZ), 1,08 (9H, s), 1,22-1,35 (68, m), 1,52-1,77 (4H, m), 1,88 (1H, b), 2,04-2,12 (3H, m), 2,17 (1H, dd, J = 18,5, 9,4 Hz), 2,31 (1H, m), 2,35-2,50 (2H, m), 2,44 (2H, dd, J = 7,7, 7,3 Hz), 2,71 (1H, ddd, J = 18,4, 7,3 1 Hz), 3,77 (2H, s), 4,07 (1H, ddd, J = 9,3, 9,3, 8,5 Hz), 5,21 (1H, d, J = 6,9 Hz), 5,25-5,44 (2H, m), 5,55 (1H, dd, J = 15,4, 7,1 Hz), 5,66 (1H, dd, J = 15,4, 8,3 Hz), 7,34-7,47 (6H, m), 7,65 (4H, m); ¹³C-NMR (CDCl&sub3;): δ 13,99, 19,16, 22,50, 24,75, 24,87, 25,18, 26,30, 26,68, 26,96, 31,42, 34,25, 35,50, 46,28, 53,25, 54,35, 71,90, 76,90, 126,45, 127,73, 130,07, 131,08, 131,33, 131,95, 133,87, 135,32, 166,82, 172,76, 213,92; MS (APCI) m/z (relative Intensität) 730 (&sup8;¹Br) ([M + NH&sub4;]&spplus;, 15), 477 (63), 149 (100); MS (FAB) m/z (relative Intensität) 711 (MH&spplus;, 1), 135 (100); HRMS berechn. für C&sub3;&sub8;H&sub5;&sub2;O&sub6;SiBr (MH&spplus;) 711,2716, gefunden 711,2715.

PGE&sub2;-Bisphosphonat-Konjugat (14)

Zu einer Lösung von Bromid 13 (4,39 g, 6,16 mmol) in Dioxan (50 ml) bei Raumtemperatur und unter Stickstoff wird tropfenweise mittels einer Kanüle eine Lösung von Thiol 12 (2,23 g, 8,92 mmol) und Triethylamin (4,95 ml, 35,68 mmol) in Wasser (20 ml) zugegeben, und die klare Lösung wird bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt und eingeengt. Der Rückstand wird zwischen EtOAc und Wasser aufgetrennt. Die wäßrige Schicht wird zweimal mit EtOAc gewaschen und eingeengt. Der Rückstand wird durch Flashchromatographie (Kieselgel-C-18, MeOH : Wasser/0 : 100-60 : 40) gereinigt. Das erwünschte Produkt kommt in den 30% MeOH/Wasser-Fraktionen hervor, welche auf einem Kationenaustauscher (DOWEX 50 Na&spplus;-Form, 35 g) filtriert werden. Das Filtrat wird gefriergetrocknet, um das erwünschte Konjugat 14 als einen weißen klebrigen Feststoff zu ergeben (2,8 g, 66%). ¹H-NMR (D&sub2;O): δ 0,70 (3H, m), 1,16 (6H, m), 1,40-1,60 (4H, m), 1,67-1,80 (5H, m), 1,88 (2H, m), 2,01 (2H, dd, J = 8, 7,4 Hz), 2,08 (1H, dd, J = 18,7, 9,6 Hz), 2,22 (3H, m), 2,35 (1H, m), 2,51 (2H, m), 2,66 (1H, dd, J = 18, 7,3 Hz), 3,26 (2H, s), 4,03 (1H, m), 5,10-5,20 (2H, m), 5,37 (1H, m), 5,52 (1H, dd, J = 15,4, 7 Hz), 5,61 (1H, dd, J = 15,4, 8,3 Hz); ¹³C-NMR (D&sub2;O): δ 14,20, 22,81, 24,96, 25,25, 25,63 (t, J = 5 Hz), 26,59, 27,56, 29,47 (t, J = 7,5 Hz), 31,55, 32,75, 34,29, 34, 35, 37,78, 39,60 (t, J = 116 Hz), 46,93, 53,33, 55,11, 71,87, 77,92, 126,84, 132,25, 132,92, 134,54, 173,33, 183,81, 221,32; MS (FAB) m/z (relative Intensität) 709 ([M + Na]&spplus;, 2,7), 665 ([M + 2H - Na]&spplus;, 1,5), 687 ([M + H]&spplus;, 1,5), 115 (100); HRMS berechn. für C&sub2;&sub6;H&sub4;&sub2;O&sub1;&sub2;P&sub2;SNa&sub3; ([M + Na]&spplus;) 709, 1565, gefunden 709,1564.

PGE&sub2;-Bisbhosphonatsulfoxid-Konjugat (15)

Zu einer Lösung von Konjugat 14 (10 mg, 0,0145 mmol) in 1 ml MeOH wird bei Raumtemperatur eine 32%ige Peressigsäurelösung (3,37 ul, 0,016 mmol) zugegeben und die Mischung 10 Minuten lang gerührt. Anschließend wird Dimethylsulfid zugegeben, und nach 5 Minuten werden die Lösungsmittel der Reaktion entfernt, um Sulfoxid 15 zu ergeben (10,2 mg, 100%). ¹H-NMR (D&sub2;O): δ 0,69 (3H, m), 1,08-1,23 (6H, m), 1,43-1,65 (4H, m), 1,75-2,00 (7H, m), 2,07 (1H, dd, J = 18,3, 9,7 Hz), 2,14-2,25 (5H, m), 2,34 (1H, m), 2,65 (1H, dd, J = 19, 7,4 Hz), 2,89 (2H, m), 3,71 (1H, d, J = 14,6 Hz), 3,90 (1H, d, J = 14,6 Hz), 4,04 (1H, m), 5,13-5,27 (2H, m), 5,32 (1H, m), 5,51 (1H, dd, J = 15,4, 6,8 Hz), 5,61 (1H, dd, J = 15,4, 8,3 Hz); ¹³C-NMR (D&sub2;O): δ 14,45, 23,05, 25,18, 25,35, 25,47, 25,67, 27,22, 31,87, 34,49, 34,63, 39,47 (t, J = 117 Hz), 39,59, 46,73, 51,92, 53,73, 55,12, 55,97, 71,77, 78,68, 127,47, 131,92, 132,00, 135,83, 167,19, 179,20, 179,38; MS (FAB) m/z (relative Intensität) 747 ([M - H + 2Na]&spplus;, 3,5), 725 ([M + Na]&spplus;, 4), 703 ([M + H]&spplus;, 3), 115 (100); HRMS berechn. für C&sub2;&sub6;H&sub4;&sub3;O&sub1;&sub3;P&sub2;SNa&sub2; (MH&spplus;) 703, 1695, gefunden 703,1696. BEISPIEL 5

1,3,5-Tris(hydroxymethyl)benzol

Zu einer gerührten Lösung von Trimethyl-1,3,5-benzoltricarboxylat (10,45 g, 41,4 mmol) in 70 ml wasserfreiem THF wird bei Raumtemperatur eine 20 M Lösung von Boran-Methylsulfid-Komplex (25 ml, 248 mmol) zugegeben, und die Lösung wird 3 Stunden lang am Rückfluß erhitzt. Anschließend wird die Mischung langsam zu 50 ml MeOH zugegeben und die resultierende Mischung 10 Minuten lang auf 70ºC erwärmt, um das Methylsulfid zu entfernen. Das Abdampfen des Lösungsmittels, das zweimalige Waschen mit 50 ml MeOH und das Abdampfen von MeOH ergeben 1,3,5-Tris(hydroxymethyl)benzol (6,96 g, 100%)
¹H-NMR (D&sub2;O): δ 4,52 (6H, s), 7,15 (3H, s).

1,3,5-Tris(brommethyl)benzol (16)

Zu einer Suspension von 1,3,5-Tris(hydroxymethyl)benzol (3, 19 g, 18,98 mmol) in 75 ml wasserfreiem Ether bei 0ºC wird tropfenweise eine Lösung von Phosphortribromid (7 ml, 74,4 mmol) in 7 ml Ether zugegeben, und die Mischung wird 1,5 Stunden lang bei 0ºC und 4 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wird auf Eis gegossen und mit Ether extrahiert. Die vereinten Etherextrakte werden über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und eingedampft, um 1,3,5-Tris(brommethyl)benzol 16 (6,35 g, 94%) als einen weißen Feststoff zu ergeben. ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 4,42 (6H, s), 7,33 (3H, s).

Tetraisopropyl-2-(3,5-bis(brommethyl)phenyl)ethan-1,1-diphosphonat (17)

NaH (0,216 g, 5,4 mmol) wird bei Raumtemperatur zu einer Lösung von Tetraisopropylmethylendiphosphonat (1,77 g, 5,14 mmol) in 7 ml wasserfreiem DMF zugegeben, und die Suspension wird 30 Minuten lang unter Stickstoff gerührt. Die resultierende Lösung wird mittels einer Kanüle in eine Lösung von 1,3,5-Tris(brommethyl)benzol 16 (3,658, 10,2 mmol) in 8 ml wasserfreiem DMF überführt. Die Mischung wird 1,25 Stunden lang gerührt, mit einer gesättigten Lösung von Ammoniumchlorid gequencht und mit EtOAc (zweimal) extrahiert. Die Extrakte werden vereint, mit Salzlösung gewaschen und über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird durch Flashchromatographie (Kieselgel, MeOH : CH&sub2;Cl&sub2;/0 : 100-2 : 98) gereinigt, um Bisphosphonat 17 (2 g, 63%) als ein farbloses Öl zu ergeben. IR (unverdünnt) 2975, 2930, 2870, 1721, 1673, 1602, 1450, 1380, 1370 cm&supmin;¹; ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 1,11 (6H, d, J = 6,3 Hz), 1,14 (6H, d, J = 6,2 Hz), 1,19 (12H, d, J 6,2 Hz), 2,37 (1H, tt, J = 24, 6,2 Hz), 3,07 (2H, td, J = 16,4, 6,2 Hz), 4,31 (4H, s), 4,62 (4H, m), 7,12 (3H, s); ¹³C-NMR (CDCl&sub3;): δ 23,63, 23,66, 23,69, 23,73, 23,79, 23,93, 24,00, 31,17 (t, J 4,9 Hz), 32,66, 40,42 (t, J = 135 Hz), 70,94 (d, J = 4 Hz), 70,98 (d, J = 4 Hz), 71,11 (d, J = 4 H&sub2;), 71,28 (d, J = 4 Hz), 127,57, 129,76, 138,00, 141,24 (t, J = 7,5 Hz); MS (APCI) m/z (relative Intensität) 623 (&sup8;¹Br&sup8;¹Br), 621 (&sup8;¹Br&sup7;&sup9;Br), 619 (&sup7;&sup9;Br&sup7;&sup9;Br) (MH&spplus;, 58, 100, 59), 579 (53), 537 (42), 495 (35), 453 (43); MS (FAB) m/z. (relative Intensität) 623 (&sup8;¹Br&sup8;¹Br), 621 (&sup8;¹Br&sup7;&sup9;Br), 619 (&sup7;&sup9;Br&sup7;&sup9;Br) (MFU, 36, 71, 36), 453 (82), 371 (100); (MH&spplus;, 46); HRMS berechn. für C&sub2;&sub2;H&sub3;&sub9;O&sub6;P&sub2;Br&sub2; (MH&spplus;) 619,0588, gefunden 619,0589.

Tetraisopropyl-2-(3,5-bis(acetylthiomethyl)phenyl)ethan-1,1-diphosphonat (18)

Zu einer Lösung von Bisphosphonat 17 (2 g, 3,2 mmol) in 12 ml wasserfreiem DMF unter Stickstoff wird bei 0ºC mittels einer Kanüle eine Lösung von Kaliumthioacetat (1,1 g, 9,6 mmol) in 15 ml wasserfreiem DMF zugegeben. Die Mischung wird 1,50 Stunden lang bei 0ºC gerührt, mit Wasser gequencht und mit EtOAc extrahiert. Die organische Schicht wird über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, filtriert und eingedampft. Der Rückstand wird durch Flashchromatographie (Kieselgel, MeOH: CH&sub2;Cl&sub2;/0 : 100-2 : 98) gereinigt, um Bisthioacetat 18 (1,38 g, 70%) als ein hellgelbes Öl zu ergeben. IR (unverdünnt) 2980, 2932, 2230, 1692, 1600 cm&supmin;¹; ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 1,16 (6H, d, J = 6,2 Hz), 1,18 (6H, d, J = 6,2 Hz), 1,23 (12H, d, J = 6,2 Hz), 2,26 (6H, s), 2,40 (1H, tt, J = 24, 6,3 Hz), 3,07 (2H, td, J = 16,5, 6,3 Hz), 4,00 (4H, s), 4,67 (4H, m), 6,95 (1H, s), 6,99 (2H, s); ¹³C-NMR (CDCl&sub3;): δ 23,72, 23,75, 23,78, 23,84, 23,87, 23,90, 24,14, 30,25, 31,35 (t, J = 4,8 Hz), 33,17, 40,59 (t, J = 134 Hz), 70,98 (d, J = 3 Hz), 71,01 (d, J = 3 Hz), 71,15 (d, J = 3 Hz), 71,28 (d, J = 3 Hz), 127,24, 128,55, 137,62, 140,99 (t, J = 7,6 Hz), 194,77; MS (APCI) m/z (relative Intensität) 611 (MH&spplus;, 100), 569 (63); 527 (58), 485 (37), 453 (31); MS (FAB) m/z (relative Intensität) 611 (MH&spplus;, 100); HRMS berechn. für C&sub2;&sub6;H&sub4;&sub5;O&sub8;P&sub2;S&sub2; (MH&spplus;) 611,2031, gefunden 611,2029.

2-(3,5-Bis(thiomethyl)phenyl)ethan-1,1-diphosphonsäure (19)

Eine Lösung von Bisthioacetat 18 (0,647 g, 1,06 mmol) in 20 ml 6N HCl wird unter Stickstoff 6 Stunden lang am Rückfluß erhitzt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Lösung wird direkt unter Hochvakuum eingeengt, um die Bisthioldiphosphonsäure 19 (0,373 g, 98%) als einen amorphen Feststoff zu ergeben.
¹H-NMR (D&sub2;O): δ 2,46 (1H, tt, J = 23, 6,4 Hz), 3,00 (2H, dt, J = 16,6, 6,4 Hz), 3,55 (4H, s), 7,04 (3H, s); ¹³C-NMR (D&sub2;O): δ 28,75, 31,41, 40,47 (t, J = 126 Hz), 126,73, 127,99, 141,46, 142,74; MS (APCI) m/z (relative Intensität) 359 (MH&spplus;, 85), 325 (100); HRMS berechn. für C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub7;O&sub6;P&sub2;S&sub2; (MH&spplus;) 356,9941, gefunden 358, 9942.

Bis(PGE&sub2;)bisphosphonat-Konjugat (20)

Zu einer Lösung von Bromid 13 (103 mg, 0,144 mmol) in Dioxan (1 ml) bei Raumtemperatur und unter Stickstoff wird tropfenweise durch eine Kanüle eine Lösung von Thiol 19 (25,8 mg, 0,072 mmol) und Triethylamin (50 ul, 0,36 mmol) in Wasser (0,5 ml) zugegeben, und die Lösung wird bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt und eingeengt. Der Rückstand wird zwischen EtOAc und Wasser aufgetrennt. Die wäßrige Schicht wird zweimal mit EtOAc gewaschen und auf einem Kationenaustauscher (DOWEX 50 Na&spplus;-Form) filtriert. Das Filtrat wird eingeengt und der Rückstand durch Flashchromatographie (Kieselgel-C18, MeOH : Wasser/0 : 100-60 : 40) gereinigt. Das erwünschte Produkt wird in den 30% und 60% Methanol/Wasser-Fraktionen eluiert, die nach der Gefriertrocknung das erwünschte Konjugat 20 (44 mg, 52%) als einen hellgelben klebrigen Feststoff ergeben. ¹H-NMR (D&sub2;O): δ 0,73 (6H, m), 1,17 (12H, m), 1,43 (4H, m), 1,54 (4H, m), 1,83 (4H, m), 1,98-2,20 (13H, m), 2,36 (2H, m), 2,63 (2H, dd, J = 18,5, 7,6 Hz), 3,00 (2H, m), 3,05 (4H, s), 3,67 (4H, s), 3,98 (2H, m), 5,07-5,20 (4H, m), 5,32 (2H, m), 5,50 (2H, dd, J = 15,4, 7,3 Hz), 5,61 (2H, dd, J = 15,4, 8,4 Hz) 6,87 (1H, s), 7,17 (2H, s); ¹³C-NMR (D&sub2;O): δ 14,57; 23,13, 25,33, 25,60, 26,80, 27,68, 32,03, 32,20, 33,57, 34,80, 36,57, 38,01, 42,15 (t, J = 113 Hz), 53,41, 53,49, 55,11, 71,82, 77,50, 126,77, 128,04, 129,62, 131,99, 132,86, 134,97, 137,92, 144,66, 172,53, 183,67, 220,66; MS (FAB) m/z (relative Intensität) 1230 ([M + 2Na]&spplus;, 0,8), 1208 ([M + Na]&spplus;, 0,5),379 (8), 114 (100).

BEISPIEL 6

Hydrolyse von Konjugat 9 in Rattenplasma

In einem typischen Versuch wird eine Stammlösung von Konjugat 9 (50 ul, 18 ug, 0,02 uCi) zu 1 ml Rattenplasmalösung (mit PBS auf 50% verdünnt) bei 37ºC zugegeben, und die Mischung wird gevortext und bei 37ºC 15. Minuten, 1 Stunde, 2 Stunden und 4 Stunden lang inkubiert. Nach jedem Zeitintervall werden 200 ul des Inkubats in ein 1-ml-Eppendorf-Röhrchen pipettiert und mit 200 ul Acetonitril verdünnt. Die Suspension wird bei 14000 U/Minute 3 Minuten lang zentrifugiert, und 200 ml des Überstandes werden in die Kieselgelsäule (entweder mit Toluol oder Isopropylalkohol vorkonditioniert) pipettiert. Anschließend wird die Säule mit 2 ml Methanol eluiert, und die gesammelte Lösung wurde an einem Beckmann-2000-β-Szintillationszähler gezählt. Die ermittelte Radioaktivität, dividiert durch die ursprüngliche Beladung, stellt den Hydrolyse-Prozentsatz dar. Die gleichen Versuche werden unter Verwendung von 50%igem gekochtem Plasma (mit PBS verdünnt) als Kontrolle und PBS als Kontrolle durchgeführt.

BEISPIEL 7

Hydrolyse der Konjugate 14, 15 und 20 in Rattenplasma

In einer Reihe von Versuchen, die im wesentlichen wie oben beschrieben ablaufen, wobei jedoch 100%iges Rattenplasma verwendet wird, werden die ³H-markierten Konjugate 14 (36 ug, 0,1 uCi), 15 (38 ug, 0,1 uCi) und 20 (62 ug, 0,2 uCi) in frisch heparinisiertem Rattenplasma bei 37ºC inkubiert. Die Aliquote (100 ul) werden wie zuvor aufgearbeitet und die eluierte ³H-Markierung gezählt.

BEISPIEL 8

Charakterisierung von bei der Hydrolyse von Konjugat 20 freigesetztem ³H

Eine Stammlösung von 0,4 uCi Konjugat 20 oder [³H]-PGE&sub2; (0,4 uCi) wird entweder in frischem Rattenplasma, in gekochtem Plasma oder in PBS (ml) bei 37ºC inkubiert. Nach 4 Stunden oder 24 Stunden werden 100-ul-Aliquote entnommen, mit Acetonitril (100 ul) verdünnt, gevortext und zentrifugiert. 100 ul des Überstands werden durch HPLC (C-18, 0,5% HOAc in Wasser, 66%: Acetonitril 33%, 1 ml/Minute) abgetrennt, wobei der Abfluß durch einen On-Line-Szintillationsdetektor und einen UV-Detektor überwacht wird. Unter diesen Bedingungen wird keine Radioaktivität eluiert, wenn 0,2 uCi Konjugat 20 (62 ug) aufgetragen werden. (Es ist notwendig, 0,4 mg unmarkiertes 20 mit 0,1 uCi-markiertem 20 zu vermischen, um 0,05 pci aus der HPLC zu gewinnen.) Radioaktivitätspeaks werden durch Co-Elution mit authentischem [³H]-PGE&sub2; und kaltem PGA&sub2; identifiziert. Eine authentische PGB&sub2;-Probe wird durch 24stündige Inkubation von PGE&sub2; (2,4 mg) mit 1 ml Rattenplasma bei 37ºC hergestellt. Die durch HPLC gereinigte Probe wird passende ¹H-NMR-, Uv- und MS- Spektren besitzen. Um Radioaktivitätspeaks zu identifizieren, die an der Lösungsmittelfront bei der 24stündigen Inkubation von Konjugat 20 in frischem Rattenplasma eluieren, wird die Fraktion gesammelt und destilliert. Das gesammelte Destillat besitzt 60% des ursprünglichen Zählwerts.

BEISPIEL 9

Bindung von Konjugat [³H]-14 an menschliches Knochenpulver und Freisetzung der Markierung

Doppelt markiertes Konjugat 14 ([¹³H]-PGE&sub2;/[¹&sup4;C]-Alendronat (21,64 uCi ¹&sup4;C und 19,05 uCi ³H) wird in 1 ml 100% fötales Rinderserum gegeben, um eine Endkonzentration von 3,5 uM zu ergeben. 200 uM dieser Lösung werden mit 10 mg Knochenpulver 1, 2, 3 und 5 Minuten lang unter kräftigem Rühren inkubiert. Die Mischung wird zentrifugiert (20 Sekunden), ein 125-ul-Aliquot wird von jeder Probe genommen und in 10 ml Atomlight in einem LKB-Flüssigszintillationszähler gezählt. 125 ul der radioaktiven Probe werden auch zur Zeit 0 gezählt. Die Aufnahme von Radioaktivität in das Knochenpulver wird durch Subtraktion der dpms in dem gezählten Medium zu den oben angegebenen Zeiten von den dpms zur Zeit 0 errechnet und diese Zahl durch die dpms zur Zeit 0 dividiert. Die Daten zeigen, daß etwa 76% des ¹&sup4;C-Restes und 53% des ³H-Restes von den Knochenteilchen innerhalb von 1 Minute aufgenommen werden.
Die Dissoziation von [³H]-PGE&sub2;/[¹&sup4;C]-Alendronat von menschlichem Knochenpulver in fötalem Rinderserum bei 37ºC wird durch 5minütige Inkubation von 10 mg menschlichem Knochenpulver mit 1 ul [³H]-PGE&sub2;/[¹&sup4;C]-ABP in 1 ml FBS gemessen. Die Mischung wird zentrifugiert (20 Sekunden), ein 100-ul-Aliquot wird entnommen und in Atomlight in einem LKB-Flüssigszintillationszähler gezählt. Der Rest der 900 ul Lösung wird abgezogen, das Knochenpulver wird einmal mit 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen, 1 ml frisches fötales Rinderserum wird zugegeben und mit dem Knochenpulver 15, 24, 39, 48, 59, 79 und 103 Stunden lang in einem Schüttelbad bei 37ºC inkubiert. 100-ul-Aliquote werden zu diesen Zeiten entnommen und in 10 ml Atomlight in einem LKB-Flüssigszintillationszähler gezählt. Die Abgabe von Radioaktivität von dem menschlichen Knochenpulver an das Medium wird wie folgt berechnet: dpms von 100 ul des [³H]-PGE&sub2;/[¹&sup4;C]-ABP bei 5 Minuten werden von dpms zur Zeit 0 subtrahiert. Die resultierenden dpms zeigen die Radioaktivität, die von dem Knochenpulver aufgenommen wurde. Die dpms, die durch Zählen von 100-ul-Aliquoten zum jeweiligen Zeitpunkt erhalten wurden, werden anschließend durch die dpms, die vom Knochen aufgenommen wurden, dividiert. 13% des ³H-Restes waren bei 15 Stünden an das Medium abgegeben worden, und bei 103 Stunden waren 32,9% der Radioaktivität an das Medium abgegeben worden. Etwa 5% des ³H-Restes werden pro Tag abgegeben, wohingegen die dpms des ¹&sup4;C-Restes in dem Medium während dieses Zeitrahmens nicht wesentlich verändert werden.

BEISPIEL 10

In-vivo-Aufnahme und Abgabe von [³H]-14 in Ratten-Tibia und -Femura

Beide Verbindungen werden intravenös durch die Schwanzvene an weibliche Sprague-Dawley-Ratten als eine radiomarkierte Verbindung verabreicht, was etwa 0,3 uCi/Tier entspricht. [³H]-Alendronat wird an neun Ratten verabreicht, und [³H]-PGE&sub2;/[¹&sup4;C]-ABP (doppelt markiertes Konjugat 14) wird an sieben Ratten verabreicht. Nach 1, 14 oder 28 Tagen werden die Tiere durch CO&sub2;-Inhalation getötet und die Tibia und Femura seziert, gewogen und anschließend bei -20ºC aufbewahrt. Die Menge an Radioaktivität, die im Knochen enthalten ist, wird durch Einäscherung in einer Packard-Verbrennungskammer nach vorhergehender 3tägiger Lufttrocknung der Knochen bei Umgebungstemperatur ermittelt. Der Prozentsatz an Verbindung, der vom Knochen zum jeweiligen Zeitpunkt festgehalten wird, wird auf Grundlage der Radioaktivität berechnet, in nmol/Gramm Knochen umgewandelt, wobei davon ausgegangen wird, daß das Skelett 8% des Körpergewichts ausmacht. Die Skelett-Retention wird als Prozent verabreichte Dosis ausgedrückt.

BEISPIEL 11

In-vivo-Assay von Konjugat 14 in einem Rattenmodell für Osteoporose

Kurz gesagt, werden drei Monate alte Sprague-Dawley-Ratten ovarektomiert und acht Wochen lang vor dem Behandlungsbeginn gehalten, um die Ausbildung von Osteopenie zu ermöglichen. Die Behandlungsgruppen erhalten 10 oder 100 mg/kg 14 iv (siehe nachstehende Tabelle). Die Kontrollgruppen umfassen: eine ovarektomierte Vehikel-Behandlungsgruppe, eine scheinbehandelte nichtovarektomierte Gruppe, Gruppe 4, welche äquimolare Dosen von nichtkonjugiertem Bisphosphonat (NCB), d. h. 4-Carboxymethylthiobutan-1,1- diphosphonsäure-Dinatriumsalz, plus PGE&sub3; erhält, und Gruppe 5 mit ausschließlich PGE&sub2;. Alle Tiere werden vier Wochen lang behandelt.
Die Tiere erhalten 14 und 4 Tage vor der Tötung das fluorszierende Knochenmarkierungscalcein (20 mg/kg ip). Die Femura, Tibia und Wirbel werden entfernt und in 70%igem EtOH fixiert. Der Femurknochenmineralgehalt (BMC) wird mit einem HOLOGIC-QDR-4500A- Röntgendensitometer gemessen. Die Femurlänge wird ebenfalls gemessen. Die Tibia werden ohne Entcalcifizierung durch Erhöhen der EtOH-Konzentrationen verarbeitet und unter Verwendung eines Hypercenter-XP-Gewebeautomaten in Methylmethacrylat eingebettet. Fünf Mikron dicke, mit Masson-Trichrome gefärbte Bereiche werden zur Messung der folgenden statischen histomorphometrischen Variablen der spongiösen Knochenstruktur verwendet. Knochenvolumen/- Gewebevolumen (KV/GV, %), Trabekelzahl (Tbz, #/mm), Trabekeldicke (Tbd, um), Trabekelabstand (Tba, um) werden gemessen oder direkt aus Primärmessungen des Gewebebereichs, Trabekelknochenbereichs und Trabekelknochenumfangs berechnet.
Für dynamische Fluorochrommarkierungsmessungen werden zehn Mikron dicke Bereiche ungestützt mit einem Deckglas versehen. Unter Epifluoreszenz betrachtet werden die Länge der mit Calcein markierten Knochenoberflächen und die Abstände zwischen den Markierungen gemessen. Die mineralisierende Oberfläche (MS/BS, %) wird als die halbe Länge einer einzelnen markierten Oberfläche plus der Länge der doppelt markierten Oberfläche gemessen und als Prozentsatz der gesamten Knochenoberfläche ausgedrückt. Dies mißt die relative Menge der Knochenoberfläche, bei der eine Bildung stattfindet. Die Mineralappositionstate (MAR, um/Tag) wird als der Mittelwert aus den äquidistanten Punkten zwischen der ersten und der zweiten Markierung, dividiert durch das Markierungsintervall (14 Tage), berechnet und ist eine Einschätzung der Rate der zellbasierten Bildung. Der Konchenbildungsraten-Oberflächenreferenzwert (BFR, BS, um³/um²/yr) oder das geschätzte 3D-Volumen an gebildetem Knochen pro gemessenem 2D-Knochenbereich wird als das Produkt aus der Mineralappositionsrate (MAR) und der mineralisierenden Oberfläche (MO), ausgedrückt pro Jahr, berechnet.
Die antiresorptive Wirkung von NCB, dem Bisphosphonat-Kern von 14, wird ebenfalls ermittelt, wobei das Rattenwachstumsmodell (Schenk-Assay) verwendet wird. Bei diesem Modell werden Ratten zehn Tage lang mit 0,3 oder 30 mg/kg sk behandelt. Nach der Nekropsie werden die Längen der Femura gemessen und die Femura bei 700ºC 24 Stunden lang eingeäschert. Die Inhibierung der Knochenresorption in Langknochen (Femur) von wachsenden Ratten führt zu einem erhöhten Knochenmineralgehalt, gemessen als Femuraschegewicht, längenberichtigt (mg/mm).
Die statistische Analyse wird durch Verwendung des Statview(Macintosh)-Pakets durchgeführt. Die Unterschiede zwischen zwei Gruppen werden durch Verwendung des Students-t-Tests getestet.
Bei drei oder mehreren Gruppen werden die Unterschiede unter Verwendung der One-Way-Varianzanalyse (ANOVA) getestet. Wenn eine Signifikanz gefunden wird, werden die Unterschiede der Gruppen- Mittelwerte durch Verwendung des Fisher-PLSD getestet, wobei p < 0,05 als signifikant angesehen wird.
Alle obigen Beispiele können von einem Fachmann modifiziert werden, um die Aktivität der von der vorliegenden Erfindung umfaßten Verbindungen zu messen.

Claims

1. Eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

und Mischungen davon, und die pharmazeutisch annehmbaren Salze davon, wobei:

A ein dioxygenierter Cyclopentanrest ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

X ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:

Y ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:

R¹ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus H, C1-C10-Alkyl und Si(CH&sub3;)&sub2;tBu,

R² ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus H und C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkyl,

R³ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus H, Tetrahydropyran und Si(CH&sub3;)&sub2;tBu,

R&sup4; und R&sup5; unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus H, C1-C10-Alkyl, Phenyl, Benzyl, C1-C10-Alkoxy und CF&sub3;,

und n eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist.

2. Eine Verbindung der Formel:

und Mischungen davon und die pharmazeutisch annehmbaren Salze davon, wobei:

X ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:

und n eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist.

3. Eine Verbindung gemäß Anspruch 2, wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:

4. Eine Verbindung gemäß Anspruch 3, wobei X

ist.

5. Eine Verbindung gemäß Anspruch 4, wobei n null ist und R&sup4; und R&sup5; jeweils H sind.

6. Eine Verbindung gemäß Anspruch 5, wobei A

ist.

7. Eine Verbindung gemäß Anspruch 6, wobei R¹ und R³ H sind.

8. Eine Verbindung gemäß Anspruch 7, wobei R² n-C&sub5;H&sub1;&sub1; ist.

9. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält.

10. Eine knochenbildungsfördernde und knochenresorptionsinhibierende pharmazeutische Zusammensetzung, die eine knochenbildungsfördernde und knochenresorptionsinhibierende Menge einer Verbindung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 oder eine Mischung davon in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält.

11. Eine Verbindung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 oder eine Mischung davon zur Verwendung bei der Behandlung oder zur Reduzierung des Risikos der Erlangung eines Krankheitsstatus oder -zustandes bei einem Säugetier, der mit Knochenresorption in Verbindung steht, oder zur Erhöhung der Knochenbruch-Heilungsrate bei einem Säugetier oder zur Erhöhung der Rate von erfolgreichen Knochentransplantaten bei einem Säugetier oder zur Erhöhung der Knochenbildungsrate bei einem Säugetier.

12. Eine Verbindung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 zur Verwendung als ein Antiosteoporosemittel.

13. Die Verwendung einer Verbindung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung von Knochenresorption bei einem Säugetier.

14. Die Verwendung gemäß Anspruch 13, wobei das Säugetier ein Mensch ist.

15. Die Verwendung einer Verbindung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder zur Reduzierung des Risikos der Erlangung eines Krankheitsstatus oder -zustandes bei einem Säugetier, der mit Knochenresorption in Verbindung steht.

16. Die Verwendung gemäß Anspruch 15, wobei das Säugetier ein Mensch ist.

17. Die Verwendung gemäß Anspruch 15, wobei der Krankheitsstatus oder -zustand ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Osteoporose, glukokortikoid-induzierter Osteoporose, Paget-Krankheit, abnormal erhöhtem Knochen-Turnover, periodontaler Erkrankung, Zahnausfall, Knochenbrüchen, rheumatoider Arthritis, periprothetischer Osteolyse, Osteogenesis imperfecta, metastatischer Knochenerkrankung, Hyperkalzämie durch Malignizität und multiplem Myelom.

18. Die Verwendung gemäß Anspruch 15, wobei der Krankheitsstatus oder -zustand Osteoporose oder glukokortikoid-induzierte Osteoporose ist.

19. Die Verwendung einer Verbindung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Medikaments zur Erhöhung der Knochenbruch-Heilungsrate bei einem Säugetier.

20. Die Verwendung einer Verbindung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Medikaments zur Erhöhung der Rate von erfolgreichen Knochentransplantaten bei einem Säugetier.

21. Die Verwendung einer Verbindung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Medikaments zur Erhöhung der Knochenbildungsrate bei einem Säugetier.