DE3313049A1

DE3313049A1 - Pharmakologisch wirksame biphosphonate, verfahren fuer ihre herstellung und diese enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen

Info

Publication number: DE3313049A1
Application number: DE19833313049
Authority: DE
Inventors: Sergio Rosini; Giorgio Pisa Staibano
Original assignee: Istituto Gentili SpA
Current assignee: MSD Overseas Manufacturing Co Ireland ULC
Priority date: 1982-04-15
Filing date: 1983-04-12
Publication date: 1983-11-17
Also published as: DE19675047I2; DE3313049C2

Description

Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von Biphosphonsäure und ihren Salzen. Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die zur Behandlung der Urolithiasis geeignet sind und die fähig sind, die Knochenreabsorption zu inhibieren.
Es ist bekannt, daß kondensierte Phosphate in niederen Konzentrationen den Niederschlag von Calciumkarbonat aus Lösungen verhindern können; zusätzlich zu diesem Effekt sind kondensierte Phosphate und unter ihnen Pyrophosphate dazu geeignet, die Ausfällung von Calciumphosphat zu inhibieren, wenn sie in niedrigen Konzentrationen zu Lösungen von Calciumphosphat zugegeben werden. Diese inhibierende -Wirkung manifestiert sich sowohl in Abwesenheit als auch in Gegenwart von kristallinem Apatit.
Zusätzlich verzögern kondensierte Phosphate die Transformierung von Calciumphosphat von der amorphen Phase in die kristalline Phase, ohne jedoch die Bildung der amorphen Phase zu beeinflussen. Der bezeichnete Effekt in-vitro des Pyrophosphats (PP) auf Calciumphosphat in Konzentrationen nahe den Konzentrationen, die in biologischen Flüssigkeiten gefunden werden, läßt erwarten, daß Pyrophosphate weiche Gewebe von der Mineralisierung schützen können. In Knochen könnte das Pyrophosphat (PP) auch den Vorschritt der Calcifizierung regulieren und damit den Einfluß der Transformierung des Calciums und Phosphats. Das PP im Knochen, das schon mineralisiert worden ist, beeinflußt die Bewegung von Calcium und Phosphat gegen das Innere und das Äußere des Knochens. Trotz allem Wissens, daß man hinsichtlich PP erlangt hat, sind die Ergebnisse seines therapeutischen Gebrauchs unmöglich wegen der schnellen Hydrolyse, der di: Substanz unterliegt sowohl bei oraler Verabfolgung als auch bei systemischer Verabfolgung.
In Anbetracht des großen, mit PP verbundenem Interesses ist eine Untersuchung durchgeführt worden, um Substanzen herzustellen, die zwar eine ähnliche Wirkung haben, aber gegen Hydrolyse beständig sind. Dieses Ziel ist teilweise durch die Synthese von Biphosphonaten erreicht worden, d.h. von Substanzen, die die Gruppierung P-C-P anstelle der Gruppierung P-O-P enthalten. Die Wirkung der Biphosphonate auf Calciumsalze ist ähnlich der Wirkung von PP; tatsächlich zeigen sie in niederen Konzentrationen die folgenden Wirkungen: - sie inhibieren die Ausfällung von Calciumphosphat aus Lösungen, - sie blockieren die Transformierung von amorphen Calciumphosphonaten in kristalline Form, ohne jedoch die Bildung der anfänglichen Phase zu inhibieren, - sie blockieren die Ansammlung von Hydroxylapatitkristallen, - sie verzögern den Grad der Auflösung von Hydroxylapatitkristallen, nachdem die letzteren die Biphosphonaten aus den Lösungen absorbiert haben.
Einige pharmakologische und chemische Studien in der wissenschaftlichen Literatur zeigen jedoch, daß trotz gewisser Analogien in der Wirkung einige Biphosphonate, die bis jetzt zur Behandlung der Osteopathie eingesetzt worden sind, einige ziemlich schwere Nachteile zeigen hinsichtlich dem Toxizitätsgrad bei Tieren und der Verträglichkeit oder der Einführung von negativen kollateralen Nebeneffekten bei Menschen.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß einige biphosphorige Säuren der allgemeinen Formel I in der R ein Fluoratom oder ein linearer oder verzweigter Alkylrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen ist, der gegebenenfalls substituiert sein kann durch einen Substituenten wie Aminogruppen und/oder Fluoratomen, und in der R' eine Hydroxygruppe oder ein Fluoratom ist, und ihre Salze mit Alkalimetallen, organischen Basen und basischen Aminosäuren sehr geeignet sind zur Behandlung der Urolithiasis und als Inhibitoren der Knochenreabsorption, weil sie eine hohe Aktivität zeigen, die nicht mit den obigen Nebeneffekten hinsichtlich des Pyrophosphats (PP) verbunden ist.
Einige Biphosphonsäuren sind in der Literatur beschrieben worden. Insbesondere können Biphosphonsäuren der allgemeinen Formel I, in der R ein unsubstituierter Alkylrest und R' eine Hydroxygruppe ist, hergestellt werden durch Umsetzung eines Acylhalogenids oder des Anhydrids einer Säure mit phosphoriger Säure oder Phosphortrichlorid. Di-eses Verfahren ist, obwohl es gute Ausbeuten gibt, wenn R eine Ethylgruppe ist, weniger geeignet zum Erlangen der analogen Verbindungen, die einen Alkylrest mit einem höheren Molekulargewicht enthalten, und es ist praktisch unbrauchbar, wenn der Rest R eine Alkylgruppe ist, die durch funktionelle Gruppen-substituiert ist.
Zusätzlich ist dieses Verfahren offensichtlich nicht geeitlnet, Verbindungen der Formel I herzustellen, in der R und'oder R Fluoratomen sind. Es wurde jetzt ge-funden, daß es möglich ist, Verbindungen er allgemeinen Formel I, in der R eine Aminoalkylgruppe und R' eine Hydroxygruppe ist, mit ausgezeichneten Ausbeuten und mit einem hohen Reinheitsgrad herzustellen, wenn man eine Aminosäure mit phosphoriger Säure zum Zwecke der Blockierung der reaktionsfähigen Aminogruppe und dann mit Phosphortrichlorid umsetzt. Das Zwischenprodukt wird dann hydrolysiert, und das Produkt wird in üblicher Weise isoliert.
Anstelle des Gemisches von phosphoriger Säure und Phosphortrichlorid ist es möglich, nur Phosphortrichlorid unter Zusatz der stöchiometrischen Menge Wasser, um die entsprechende phosphorige Säure zu bilden, zu verwenden.
Wenn immer es möglich ist, kann man die Aminosäure durch einen Vorläufer, der zur Bildung der Aminosäure durch Hydrolyse fähig ist, verwenden, wie z.B. Valerolactam oder das entsprechende Polyamid im Falle der 5-Aminovaleriansäure oder des Pyrolidons im Falle von 4-Amino-buttersäure. Die Reaktion wird vorzugsweise in Gegenwart eines aprotischen organischen Lösungsmittels ausgeführt, wie z.B. ein aliphatischer oder aromatischer Kohlenwasserstoff oder der entsprechende chlorierte Kohlenwasserstoff, -aber sie kann auch in Abwesenheit eines Lösungsmittels ausgeführt werden.
Während der Reaktion bildet sich eine pastenförmige, feste, nicht genau definierte Zusammensetzung, aus der die gewünschte Aminobiphosphonsäure durch Hydrolyse mit Wasser oder wässriger Hol erhalten wird.
Das vorstehend beschriebene Verfahren kann leicht für eine industrielle Herstellung der Säuren der Formel I angepaßt werden. Die Herstellung der Biphosphonsäuren der allgemeinen Formel I, in der R und R' beides Fluoratome sind, kann leicht und mit hohen Ausbeuten durchgeführt werden durch Hydrolysieren der entsprechenden Ester der allgemeinen Formel II: F2cflPo(oR" >2 (11) in der R" ein Alkylrest ist, der linear oder verzweigt sein kann und der zwischen 1 und 4 Kohlenstoffatomen enthält. Die Ester der Formel II werden durch Umsetzen der entsprechenden Ester der -Bromodifluoromethanphosphonsäure (die von Dibromodifluoromethan und einem Trialkylphosphit erhalten wird) mit einem Dialkylphosphit eines Alkalimetalls, wie z.B.
Natrium, erhalten gemäß der nachstehenden Reaktionsgleichung Die Hydrolyse der Ester der Formel II zu den entsprechenden Biphosphonsäuren wird mit Wasser und Mineralsäure ausgeführt. Die bevorzugten Verbindungen, die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten werden, sind: 5-Amino-1-hydroxypentan-1,1-biphosphonsSure 4-Amino-1-hydroxybutan-1,1-biphosphonsSure Difluoro-methanbiphosphonsäure und ihre Natrium-, Anilin- und Lysinsalze.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
BEISPIEL 1 Ein Gemisch, bestehend aus 117 Gramm (1,0 Mol) 5-Aminovaleriansäure, 123 Gramm (1,5 Mol) phosphorige Säure und 500 ml wasserfreies Chlorbenzol, wird bereitet.
Das Gemisch wird in einem siedenden Wasserbad bis auf 100cd in der Weise erhitzt, um den Feststoff fast vollständig zu lösen. Unter Aufrechterhaltung der Temperatur auf 1000C und unter heftigem Rühren werden langsam 206 Gramm (1,5 Mol) Phosphortrichlorid zugegeben. Etwa 30 Minuten nach beendeter Zugabe beginnt die Bildung einer dichten Phase, die die Tendenz hat, sich zu vermehren und mit der Zeit zu erhärten.
Das Gemisch wird weiter 3 Stunden bei 100°C gehalten, und es darf dann unter Rühren abkühlen. Auf diese Weise bricht das feste Material in kleine Stücke auf und kann filtriert werden und mit Chlorbenzol gewaschen werden. Der so erhaltene hygroskopische Feststoff wird dann in 500 ml Wasser aufgelöst und eine Stunde lang am Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen wird die Lösung mit Aktivkohle behandelt und dann filtriert. Die rohe Säure wird durch Zugabe eines Uberschusses an warmem Methanol ausgefällt, und nach der Abtrennung wird das Produkt aus einem Liter Wasser bei 100°C kristallisiert.
Die Ausbeute beträgt 165 Gramm (63% der Theorie) 5-Amino--1-hydroxypentan-1,1-biphosphonsäure in Form eines weißen kristallinen Pulvers mit einem Schmelzpunkt von 235°C.
Elementaranalyse gefunden: C = 2269; H = 571; N = 5>14; P = 23,70 ber. für C5H15NO7P2: C = 22,82; H = 5,75; N = 5,32; P = 23,54 Infrarotspektrum Absorptionsbande bei 3220, 1660 und 1510 cm ¹H-NMR-Spektrum (TMS als Standard) 6= 1,8 ppm (6H); # = 3,0 ppm (2H) BEISPIEL 2 In einen 150 Liter-Glasreaktor werden 9,4 kg 5-Aminovaleriansäure, 9,9 kg phosphorige Säure und 40 Liter wasserfreies Chlorbenzol eingeführt. Das Gemisch wird unter Rühren auf 90 bis 1000C erhitzt, und 16,5 kg Phosphortrichlorid werden innerhalb von 30 Minuten zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird nach dreistündigem Stehen bei 1100C auf 800C abgekühlt, und dann werden 50 Liter Wasser so zugegeben, um alles feste Material zu lösen. Die organische Phase darf abkühlen und sich von der wässrigen Phase trennen. Nach der Behandlung der wässrigen Phase mit Aktivkohle und Filtration wird überschüssiges Methanol unter Rühren so zugegeben, daß die rohe Aminobiphosphonsäure ausfällt. Das Gemisch wird filtriert, und das Produkt wird aus 60 Liter siedendem Wasser umkristallisiert. Als Produkt werden 12,4 kg kristallines Material aus 5-Amino-1-hydroxypentan-1,1-biphosphonsäure erhalten.
BEISPIEL 3 Ein Gemisch von 1 Mol 4-Aminobuttersäure, 1,5 Mol phosphorige Säure und 500 ml wasserfreies Chlorbenzol wird auf 1000C erhitzt. Bei dieser Temperatur wird Phosphortrichlorid in einer Menge von 1,5 Mol unter starkem Rühren zugegeben.
Das Gemisch wird 3 1/2 Stunden lang bei 1000C gerührt, bis sich die dichte Phase vollständig gebildet hat, und darf dann abkühlen. Der Feststoff wird abfiltriert, mit einer kleinen Menge Chlorbenzol gewaschen und in Wasser gelöst.
Die Lösung wird 1 Stunde lang bis zum Siedepunkt erhitzt, wird dann abgekühlt und mit Aktivkohle entfärbt. Das Material wird filtriert, und das Produkt wird mit einem Uberschuß an heißem Methanol ausgefällt. Das so erhaltene rohe Material wird am Rückfluß 8 Stunden lang in 20%iger Salzsäure erhitzt. Die Salzsäure wird durch Destillation entfernt, und der Rückstand wird aus Wasser umkristallisiert. Das Produkt ist 4-Amino-1-hydroxybutan-1,1-biphosphonsäure in der Form eines weißen kristallinen Pulvers, das aufgrund der nachstehend aufgeführten Eigenschaften die nachstehend angegebene Struktur hat: Elementaranalyse C% H% N% P% gefunden: 17,88 5,62 4,93 23,94 ber. für ABDP: 19,28 5,26 5;64 24,86 ber. für ABDPH20: 17,98 5,66 5p24 23,19 Bestimmung des Feuchtigkeitsgehaltes Die Probe, die nach der Karl-Fischer-Methode untersucht worden ist, hatte einen Wassergehalt von etwa 3,9 Gew.-%.
Potentiometrische Titration Die Kurve der potentiometrischen Tritration wird durch Zugabe von 0,1n NaOH zu einer Lösung von 203 mg der in 75 ml Wasser gelösten Probe erhalten. Das Profil dieser Kurve ist charakterisiert durch zwei klare Endpunkte bei pH 4,4 und 9 entsprechend einer Reagenzzugabe von 7,5 bzw.
15,2 ml. Aus den erhaltenen Werten berechnet sich ein Äquivalentgewicht von 270 für die erste Neutralisation und von 264 für die zweite Neutralisation und ein durchschnittliches Äquivalentgewicht von 267. Das Molekulargewicht von ABDP-H20 ist 267,114.
Complexometrische Titration Die complexometrische Titration wird mit Thoriumnitrat und mit 41,47 mg der Verbindung ausgeführt. Die zeigt einen Farbwechsel nach 5,4 ml Reagenzzugabe. Aufgrund dieses Wertes ist der Schluß möglich, daß die untersuchte Substanz ein Äquivalentgewicht von 134 hatte, was in Ubereinstimmung ist mit der Gegenwart von zwei Phosphorigsäuregrupnen in dem Molekül des Monohydrates.
Infrarotspektrum Das mittels einer KBr-Tablette aufgenommene Infrarotspektrum zeigt charakteristische Banden bei: -1 lappen der 3600 bis 2500 cm 1 eine komplexe Bande aufgrundvon Uher-/ Schwingung von sauren und alkoholischen OH-Grupnen,NH3-Gruppen und 1650,1605,1500 aliphatischen CH-Banden aufgrund der Deformation der NH2-Gruppe, die teilweise in Salzform vorliegt wegen der Gegenwart von Phosphonsäuregruppen, 1160 Streckschwingung der P-O-Bande, 1040 Streckschwingung der C-O-Bande, 960, 930 Streckschwingung der P-O-Bande, 600 - 400 Skelettbanden, die im wesentlichen den Molekülteil einschließen, der die Phosphoratome enthält.
Kernmagnetisches Protonenresonanzspektrum ( H-NMR) Das 1H-NMR-Spektrum, berechnet in D2O/D2SO4, liefert zwei vergrößerte Signale bei & 2,6 ppm (CH2-4 und CH2- # aufgrund der NH2-Gruppe) und 3,5 ppm (CH2- α aufgrund der NH2-Gruppe) bei einer relativen Intensität von 2 : 1.
Kernmagnetisches Kohlenstoffresonanzsnektrum (13C-NMR) 13 Das C-NMR-Spektrum, bestimmt in D20/D2S04, liefert Signale bei # 20 ppm (CH2- aufgrund der NH2-Gruppe), 28 ppm (CH2- # aufgrund der NH2-Gruppe), 39 ppm (CH2- X aufgrund der NH2 -Gruppe) und ein zentrales Triplet bei 72 ppm (C- g aufgrund der NH2-Gruppe, JC-P 156 Hz).
Kernmagnetisches Phosphorresonanzspektrum (31P-NMR) 31 Das P-NMR-Spektrum, bestimmt in D20/D2S04, liefert ein einzelnes Signal bei 9 ppm, das zeigt, daß zwei Phosphoratome chemisch und magnetisch äquivalent sind.
BEISPIEL 4 Natrium-diisopropylphosphit und Diisopropyl-bromodifluoromethanphosphonat werden nach den üblichen Methoden zur Herstellung des Tetraisopropylesters von Difluoromethanbiphosphonsäure umgesetzt, der als eine farblose und geruchlose Flüssigkeit mit einem Siedepunkt von 1170C (0,2 Torr) erhalten wird.
9F-NMR-Spektrum: = 21,6 (Triplet, CF2, J = 86,67) 31P-NMR-Spektrum: = 16,1 (Triplet,JF-P = 14,6); H3P04 85% als externer Standard.
Der so erhaltene Ester wird zu Difluoromethanbishosphonsäure hydrolysiert, welche in kristalliner Form erhalten wird und in einem Vakuumexsikkator über 205 getrocknet wird.
Die Substanz ist ein sehr hygroskopischer Feststoff mit einem Schmelzpunkt von 90°C.
Die Säure/Base-Titrationskurve zeigt zwei klare Endpunkte bei pH 3,9 und 10,1, die dem Binatrium- und Tetranatriumsalzen entsprechen, und einen einzelnen Endpunkt bei pH 6,8, der dem Trinatriumsalz entspricht. Das Molekulargewicht beträgt entsprechend den oben erwähnten Tritrationswerten 210,3 (theoretisch 211,99), BEISPIEL 5 Zu einer Suspension von 263 Gramm 5-Amino-1-hydroxy-pentan--1,1-biphosphonsäure in einem Liter Wasser wird unter Kühlen eine Lösung zugegeben, die aus 40 Gramm Natriumhydroxid in 500 ml Wasser bereitet worden ist. Man erhält eine klare Lösung, welche nach der Entfärbung mit Kohlenstoff, der Filtration und.der Konzentration drei Tage unter leichtem Rühren im Kalten gehalten wird. Der so erhaltene kristalline Feststoff wird filtriert, mit kleinen Portionen kalten Wassers und dann mit Methanol gewaschen. Nach dem Trocknen bei 1100C erhält man 199 Gramm des Mononatriumsalzes von 5-Amino-1-hydroxy-pentan-1,1-biphosphonsäure.
BEISPIEL 6 Aus Difluoromethanbiphosphonsäure erhält man gemäß den üblichen Methoden das Trinatrium-difluoro-methanbiphosphonat als ein kristallines weißes Pulver, das in Wasser löslich ist. Das Molekulargewicht, bestimmt durch Säure/Base-Titration, ist 274,0 (theoretisch 277,9). Die 0,1-molare wässrige Lösung hat einen pH von 6,8.
Elementaranalyse gef.: C= 4,30; H = 0,52; P = 23,01; F = 12,90 ber. für a306P2 : C = 4,32; H = 0,36; P = 22,29; F = 13,67.
p BEISPIEL 7 Aus Difluoromethanbiphosphonsäure erhält man gemäß den üblichen Methoden das Anilin-difluoromethanbiphosphonat.
Die Substanz schmilzt nach der Umkristallisation aus Ethanol bei 163 bis 1650C.
Elementaranalyse gef.: C = 50,88; H = 6,02; N = 9,19; P = 9,90 ber. für C25H32F2N4O6P2.H2O (Tetraanilinsalz als Monohydrat) : C = 50,80; H = 5,57; N = 9,11; P = 10,08 UV-Spektrum (in wässriger Lösung) Absorptionsmaximum bei 279 nm; # - 3241.
BEISPIEL 8 Aus Difluoromethanbiphosphonsäure erhält man nach dem Verfahren von Beispiel 7 das Lysin-difluoromethanbiphosphonat.
Das Dilysinsalz, welches aus Wasser ausfällt, wird als ein weißes amorphes Pulver erhalten, das in Wasser sehr löslich und hygroskopisch ist. Eine 0,1 m Lösung hat einen pH von 4,0.
Elementaranalyse gef.: C = 30203; H = 6>42; N = 10,87; P = 13,01 ber. für C13H32F2N4O10P2: C = 30,96; H = 6,39; N = 11,11; P = 12,28.
Toxikologische Untersuchung Diese Untersuchung wurde mit den folgenden Substanzen der vorliegenden Erfindung durchgeführt: 4-Amino-1-hydroxybutan-1,1-bisphosphonsäure (AHBUBP) 5-Amino-1-hydroxypentan-1,1-biphosphonsäure (AHPEBP) Difluoromethanbiphosphonsäure als Natriumsalu (F2MBP).
Als Vergleiche wurden die folgenden Substanzen verwendet: 6-Amino-1-hydroxyhexan-1,1-biphosphonsäure (AHEXBP) hergestellt nach der italienischen Patentanmeldung Nr.
19673 A/81 Dichloromethanbiphosphonsäure als das Natriumsalz (Cl2MBP) (bekannt).
Akute Toxizität Für diese Untersuchung wurden schweizer Mäuse, beides männlich und weiblich, verwendet. Während des Experimentes wurden die Tiere nach der Methode von Altromin in der Form von Tabletten gefüttert. Zur oralen und intraperitonealen Verabfolgung wurden 5%ige Gummi-Arabikum-Lösungen verwendet, während Salzlösungen von pH 4 für die intravenösen Injektionen verwendet wurden.
Die vorläufigen Werte von DL50 werden nach der graphischen Methode ermittelt. Die Tabelle 1 gibt die Werte der DL50 bei schweizer Mäusen in ml/kg wieder.
TABELLE 1 - DL50 bei schweizer Mäuse in ml/kg

os i.p. i.v.

AHBUBP > 2,000 - 85

AHPEBP 1,500 75 85

AHEXBP > 2,000 125 75

F2MBP > 2,000 450 70

CL2MBP > 2,000 750 130

Nach der oralen Verabfolgung wird auch bei hoher Dosierung keine Veränderung im Verhalten der Tiere beobachtet, kein Todesfall ist zu vermerken, und das einzige Symptom ist eine gewisse Erweichung des Stuhlganges. Die Autopsie der getöteten Tiere zeigte eine geringe Veränderung der Nieren, die eine leichte und anämische Farbe hatten.
Nach der intravenösen Injektion sterben die Tiere bei der hohen Dosierung sofort unter Krämpfen und Dyspnoe.
Bei der Dosierung, die geringer ist als die lethale Dosis, sind die Krämpfe weniger augenscheinlich und dauern zwei Stunden; bei den Tieren traten nach der Rückkehr zur Normalität wenige Todesfälle nach zwei bis vier Tagen auf unter Dyspnoe, Haaraufstellung und reduzierter motorischer Aktivität. Die Autopsie zeigte bei den Nieren eine rosa oder gelbliche Farbe mit hämorrhagischen Flecken. Die weiblichen Tiere zeigen hypertrophische und hyperemische Ovarien. Die Schlußfolgerung ist, daß die neuen Biphosphonate eine akute Toxizität und eine mäßige chronische Toxizität aufweisen.
Inhibierung der Bildung von Kristallen Ein Modellsystem wird verwendet, um die Fähigkeit der Phosphonate, die Bildung von Kristallen in anorganischen Lösungen inhibieren, zu bewerten. Drei Lösungen wurden nach Fleisch bereitet.
1) 0,0107 m KH2PO4; 0,117 m KCl; 0,01 m Barbitursäure 2) 0,0056 m CaCl2; 0,138 m XCI; 0,01 Barbitursäure 3) 0,155 m KCl; 0,01 Barbitursäure.
Der pH wird mit Kaliumhydroxid auf 7,4 gebracht. Die Konzentration von Ca++ war 6,4 mg%, das ähnlich war dem Calcium in Blut, das der Ultrafiltration unterworfen worden ist, und die Konzentration des anorganischen Phosphats Pi ergab ein Produkt Ca++ x Pi = 80. Die Lösung wurde auf Ca++ und Phosphat analysiert und wurde jeweils in 12 ml-Erlenmeyerkolben verteilt. Die Kolben wurden in Gruppen eingeteilt, wie folgt: a) Vergleich b) AHEXBP 0,05 µM c) AHEXBP 0,25 µM d) AHEXBP 0,5 AM e) AHEXBP 2,5 µM f) AHEXBP 5,0 µM g) Cl2MBP 0,5 M( h) C12MBP 2,5 µM i) Cl2MBP 5,0 µM 1) F2MBP 0,5 5 m) F2MPB 2,5 µM n) F2MPB 5,0 µM o) AHPEBP 0,05 µM p) AHPEBP 0Z25 AM q) AHPEBP 0t5 µM r) AHPEBP 2,5 µM s) AHPEBP S10 µM t) AHBUBP 0,5 µM u) AHBUBP 2,5 »M v) AHBUBP 5,0 µM und dann wurden sie unter Rühren bei 37 0C zwei Tage lang inkubiert.
Am Ende der Inkubation werden die Lösungen durch "Milliporenfilter" geschickt, um die Kristalle zurückzuhalten, die während der Inkubation gebildet werden; das Filtrat wird dann auf Ca++ und Pi analysiert. Die Ergebnisse sind auch in Tabelle 2 angegeben als das Produkt aus Ca++ x Pi in der Lösung am Ende des Versuchs.
Die Daten zeigen, daß die Biphosphonate gemäß der vorliegenden Erfindung eine signifikante Inhibitorwirkung bei der Bildung und dem Wachstum von Apatitkristallen induzieren in einem Ausmaß, das von der Dosierung abhängig ist.

TABELLE 2

Werte des Produkts Ca++ x Pi in Lösung

Substanz Konz. Vor der In- Nach der In-

µm kubation kubation

Vergleich 0,0 114,7 29

Cl2MBP 0,5 " 44,0

Cl2MBP 2,5 " 60,4

Cl2MBP 5,0 " 73,6

F2MBP 0,5 " 44,6

F2MBP 2,5 " 58,5

F2MBP 5,0 " 72,0

AHEXBP 0,05 " 30,0

AHEXBP 0,25 " 37,5

AHEXBP 0,5 " 59,6

AHEXBP 2,5 " 92,6

AHEXBP 5,0 " 95,3

AHPEBP 0,05 " 36,7

AHPEBP 0,25 " 37,1

AHPEBP 0,5 " 68,6

AHPEBP 2,5 " 94,0

AHPEBP 5,0 " 97,5

AHBUBP 0,5 " 53,2

AHBUBP 2,5 " 88,6

AHBUBP 5,0 " 93,5

Pharmakologische Untersuchungen Der Zweck dieser Untersuchung ist es, die Wirkung einer Serie von neuen Biphosphonaten auf eine Kultur von Hirnschalenzellen (skull cells) und auf die Knochenreabsorption und die Mineralisierung in vivo zu untersuchen.

Verwendete Methoden 1. Versuche mit Hirnschalenzellen Zellkultur: Die Zellen werden kultiviert nach der Methode von Fast et al. (Biochem. J. 172, 97-107, 1978). Auf dem Weg des Auszugs werden die von Wistar-Ratten entfernten Hirnschalen, die einen Tag alt sind, mit Collagenase digeriert.. Die freigesetzten Zellen werden auf eine Platte gebracht mit einer Konzentration von 200 000 Zellen pro ml Medium auf Scheiben "Klusters", geeignet für eine Kultur, wobei die Platten 24 Bohrlöcher mit einem Durchmesser von 1,6 cm zur Aufnahme von 0,5 ml Medium aufweisen. Die Zellen werden in dem essentiellen Minimummedium kultiviert, das 10% fötales Kalbsserum in einer Atmosphäre von 5% C02 bei 370 bis zum achten Tag enthält. Die Biphosphonate werden am ersten Tag zugegeben bis zum Ende des Versuchs. Das Mediumwird am ersten, vierten und siebten Tag gewechselt.
Zellenzählung Die Zellen werden mit einem Coulter-Zähler gezählt, nachdem sie von den Scheiben (disks) durch Digerieren mit einem Gemisch aus Collagenase und Trypsin freigesetzt worden sind.
Bestimmung des Laktats Am siebten Tag wird das Medium gewechselt, und die Zellen werden 16 Stunden lang inkubiert. Das während dieser Periode erzeugte Laktat wird in einem Extrakt in HCl04 des Mediums unter Verwendung von Lactatodehydrogenase bestimmt.
2. Versuche zur Knochenreabsorption und zur In-vivo-Calcifizierung Gruppen von fünf Wistar-Ratten mit einem Gewicht von 180 bis 200 Gramm werden sieben Tage lang mit 0,1, 1,0 und 10 mg von P/kg der folgenden Biphosphonsäuren behandelt: Difluoromethanbiphosphonsäure (F2MBP) (in der Form Na-Salzes); 4-Amino-1 -hydroxybutanbiphosphonsäure (AHBUBP); 5-Amino-1 -hydroxypentanbiphosphonsäure (AHPEBP); 6-Amino-1-hydroxyhexanbiphosphonsäure (AHEXBP); Dichloromethanbiphosphonsäure (C12MBP1 (in der Form des Natriumsalzes) (1 mg von P/kg).
Den Vergleichstieren wurde das Lösungsmittel mit NaCl verabfolgt. Alle diese Behandlungen wurden auf subkutanern Wege ausgeführt. Die Verbindungen wurden für die zwei niederen Konzentrationen in NaCl aufgelöst und für die höhere Konzentration in Wasser und wurden in einem Volumen von 0,2 ml/100 g verabfolgt. Die Tiere wurden mit Altromin 1314, das 1,1 g/100 g P und 250 IU/100 g an Vitam D3 enthält, gefüttert. Am achten Tag wurden die Tiere getötet, und das Schienbein wurde entfernt und in 50%igem Ethanol fixiert. Die Schienbeine wurden dann in anwachsenden Konzentrat Ionen von Ethanol entwässert und in Methylmethacrylat nach der Zugabe von Plastoid N getränkt. Die Frontalabsclnitte wurden entfernt und auf eine Dicke von 70 bis 80 /um geschnitten, und dann wurden die Abschnitte einer Mikroradiographie unterworfen. Diese Prozedur erlaubte es, die Dichte an Mineral in der trabekularen Metaphyse nach der Methode von Shenk et al., Calc. Tiss. Res. 11, 196-214, 1973, zu ermitteln.
Ergebnisse 1. Versuche mit Hirnschalenzellen Wie in Tabelle 3 gezeigt, bewirkt Cl2MBP eine Abnahme in der Anzahl der Zellen. Auf der anderen Seite hat F2MBP keine Wirkung oder eine sehr kleine Wirkung in dieser Hinsicht. Die Aminoderivate zeigen einen Unterschied, weil die Verbindungen mit einer ungeraden Zahl von Kohlenstoffatomen die zellulare Anzahl in einem viel größeren Ausmaß verringern als die Verbindungen mit einer geraden Zahl von Kohlenstoffatomen.

TABELLE 3 Wirkung auf dei Zellenzahl # S.E.M. (n)

% des Vergleichs

Konzentration (µm)

Verbindung

2.5 25 250

Cl2MBP 103,0 # 0,7 (4) 86,4 # 2,1 (12)*** 54,5 # 1,9 (12)***

F2MBP 88,1 # 1,4 (12)*** 92,4 # 1,9 (12)** 99,3 # 2,0 (16)

AHBUBP 100,5 # 1,6 (8) 101,0 # 1,5 (7) 74,2 # 4,7 (15)***

AHPEBP 102,7 # 2,8 (8) 42,6 # 5,1 (16)*** dead cells

AHEXBP 93,3 # 3,0 (8)* 95,2 # 2,2 (8) 87,0 # 3,4 (20)*

Anzahl der Vergleichzellen: 0,5548 106 Scheibe # 0,05 (55) (x # SEM (n)) Was die Produktion von Laktat anbetrifft, so verringert C12MBP sie bekanntermaßen. Auf der anderen Seite hat F2M8P keine Wirkung. Die Aminoderivate zeigen einen Anstieg in der Produktion von Laktat, eine Tatsache, die deutlicher hervortritt mit Verbindungen, die eine ungerade Zahl von Kohlenstoffatomen haben. Die Daten sind in der. Tabelle 4 angegeben.

TABELLE 4 - Wirkung auf die Produktion von Laktat # S.E.M. (n)

% des Vergleichs

Konzentration (µM)

Verbindung

2,5 25 250

Cl2MBP 87,5 # 4,0 (4)* 67,1 # 2,8 (12)*** 16,9 # 2,2 (12)***

F2MBP 112,1 # 4,4 (12)* 106,2 # 3,9 (12) 99,7 # 4,7 (16)

AHBUBP 88,0 # 1,5 (8)* 76,9 # 4,1 (7)*** 179,8 # 18,6 (15)***

AHPEBP 93,4 # 3,0 (8) 354,1 # 27,7 (16)*** tote Zellen

AHEXBP 109,4 # 6,0 (8) 108,3 # 4,5 (8) 164,7 # 7,7 (20)***

+ Bei einem Versuch war die Zellenzahl 51,26% des Vergleichs, bei drei Versuchen war sie 1 bis 3%. Diese Konzentration stellt die Grenze dar, bei der die Zellen absterben.

Produktion von Laktat: 3,83 µMol/106 Zellen # 0,10 (55) (x # SEM (n)) Versuche betreffend die Knochenreabsorption und Calzifizierung in vivo Ein Tier pro Gruppe wurde ausgewertet. Die Daten sind in Tabelle 5 angegeben.

TABELLE 5 - Wirkung auf die Knochenreabsorption und Mineralisierung von Knochen

Verbindung Dosis Reabsorption Minerallisierung

(mg)

F2MBP 10 - -

0,1 - -

AHBUBP 10 +++ -/+

1 ++/+++ -

0,1 + -

AHPEBP 10 Versuch abgebrochen wegen akuter Toxizität

1 +++ -

0,1 +++ -

AHEXBP 10 * +++

1 ++ -

0,1 - -

Cl2MBP 1 +/++ -

- = keine Inhibierung der Reabsorption oder Mineralisierung zwischen + und ++++ = Ansteigen bei der Inhibierung der Reabsorption oder Mineralisierung * = = Wirkung nicht bestimmt wegen Inhibierung der Mineralisierung Es erscheint, daß AHPEBP beim Inhibieren der Knochenreabsorption am aktivsten ist. Jedoch wurde bei der höheren Dosierung eine Toxizität beobachtet. Die Substanzen AHPUBP und AHEXBP sind auch bei der Reabsorption wirksam mit einem geringfügig besseren Ergebnis als bei Cl2MBP.

Ein signifikanter Unterschied besteht hinsichtlich der Mineralisierung, weil AHEXBP eine starke Inhibierung der Mineralisierung in der Dosis von 10 mg P/kg induziert, wäElrend AHBUBP keine Wirkung oder nur eine geringfügige Wirkung oder nur eine Wirkung in einem sehr kleinen Ausmaß hat.
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Aminoverbindungen mit einer ungeraden Anzahl von Kohlenstoffatomen einigermaßen toxisch sind, aber sie sind viel wirksamer bei der Inhibierung der Knochenreabsorption. Die Verbindungen mit einer geraden Anzahl von Kohlenstoffatomen haben eine geringfügig bessere Wirkung als Cl2MBP. Eine andere signifikante Tatsache ist-, daß AHBUBP nicht induziert oder nur zu einem sehr kleinen Ausmaß induziert bei der Inhibierung der Mineralisierung bei einer hohen Dosis, während AHEXBP eine hohle Inhibierung zeigt. Demzufolge scheint AHBUBP stabiler zu sein für den Gebrauch bei Krankheiten mit einem Anstieg in der Knochenreabsorption beim Menschen. Schließlich ist die Beoabchtung interessant, daß F2MBP keine Wirkung auf die Knochenreabsorption oder auf die Knochenmineralisierung hat, und in Anbetracht der Tatsache, daß es das Wachstum in vitro der Apatitkristalle inhibiert, kann es erfolgreich bei Bedingungen der Urolithiasis verwendet werden.
Tatsächlich war ein Biphosphonat, das zum Inhibieren des Wachstums der Kristalle ohne Auswirkungen auf den Knochen fähig war, lange Zeit Gegenstand der Forschung. Deshalb ist der Schluß zu ziehen, daß die zwei Substanzen AHBUBP und AiiPEBP dazu bestimmt sind, Arzneimittel zu werden, die zum Inhibieren der Knochenreabsorption fähig sind, und das F2MBP bei der Behandlung der Urolithiasis nützlich ist.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung können bereitet werden zum Gebrauch in der Form von Kapseln oder Tabletten oder in Lösung zur oralen Verabfolgung oder zum systemischen Gebrauch. Die Zusammensetzungen werden vorteilhafterweise zusammen mit inerten Trägern bereitet, z.B. wie Zucker (Sacharose, Glucose, Laktose), Stärke und Derivate, Cellulose und Derivate, Gummis, Fettsäuren und ihre Salze, Polyalkohole, Talk, aromatische Ester.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können verabfolgt werden auf dem oralen Wege in Dosen von 25 bis 3 200 mg/Tag oder auf parenteralem Wege in Dosen von 15 bis 300 mg/Tag.
Eine Behandlung wird sieben Tage lang oder drei Monate lang durchgeführt und erforderlichenfalls wiederholt.

Claims

Pharmakologisch wirksame Biphosphonate, Verfahren für ihre Herstellung und diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen Patentansprüche Y @1. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung der Urolithiasis und zur Inhibierung der Knochenreabsorntion, die als wirksamen Inhaltsstoff eine Biphosphonsäure der allgemeinen Formel I in der R ein Fluoratom oder ein geradliniger oder verzweigter Alkylrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen ist und wobei der Alkylrest gegebenenfalls substituiert ist durch wenigstens einen Substituenten, der eine Aminogruppe, ein Fluoratom oder beides Aminogruppen und Fluoratome sein kann, und in der R' eine Hydroxygruppe oder ein Fluoratom ist, und/oder ihre Salze mit einem Alkalimetall oder einer organischen Base oder einer basischen Aminosäure enthält.
2. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß sie zur oralen Verabfolgung geeignet ist.
3. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß sie zur systemischen Verabfolgung geeignet ist.
4. Verfahren zur Herstellung einer Biphosphonsäure der allgemeinen Formel I nach Anspruch 1, in der R ein Aminoalkylrest und R' eine Hydroxygruppe ist, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß man eine Aminosäure oder einen Vorläufer davon mit phosphoriger Säure und Phosphortrichlorid in einem inerten Lösungsmittel umsetzt, das Reaktionsprodukt hydrolisiert und daß man die Biphosphonsäure aus dem Reaktionsgemisch isoliert.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch g e ke n n -z e i c h n e t , daß die Aminosäure und phosphorige Säure und das Phosphortrichlorid im Verhältnis von 1 : 1,5 : 1,5 umgesetzt werden.
6. 5-Amino-1-hydroxypentan-1 ,1-biphosphonsäure.
7. 4-Amino-1-hydroxybutan-1,1-biphosphonsäure.
8. Dufluormethanbiphosphonsäure.