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Hintergrund
der Erfindung
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Die
Notwendigkeit, schwächende
Knochenstörungen
wie z.B. Osteoporose zu behandeln, hat zu eingehender Forschung über den
Mechanismus und die Regulierung der ununterbrochenen Knochenbildung
und -resorption geführt.
Im Besonderen ist ein angemessenes Gleichgewicht zwischen Osteoblasten,
die dazu dienen, Knochengewebe zu bilden, und Osteoklasten, die
dazu dienen, Knochengewebe zu resorbieren, notwendig, um die strukturelle
Unversehrtheit und das richtige Funktionieren des Skeletts trotz
des ununterbrochenen Metabolismus aufrechtzuerhalten. Jegliche Veränderungen
in diesem Metabolismus-Gleichgewicht wie z.B. eine gesteigerte Knochenresorption
(entweder absolut oder eine Steigerung über eine verringerte Knochenbildung
gegenüber
der Knochenresorption) können
zu Knochenerkrankungen oder -störungen
führen.
Eine der häufigsten
Erkrankungen, die sich aus diesem Ungleichgewicht ergibt, ist Osteoporose,
die durch eine Abnahme der Knochenmasse und Verschlechterung der
Skelettmikroarchitektur gekennzeichnet ist, was zu einer erhöhten Zerbrechlichkeit
und Anfälligkeit
für Frakturen
führt.
Andere Erkrankungen, die sich aus Änderungen bei der Knochenresorption
ergeben oder an denen diese Änderungen
anderweitig beteiligt sind, schließen Paget-Krankheit, primäre und sekundäre Nebenschilddrüsenüberfunktion,
humorale Hyperkalzämie
bei bösartiger
Erkrankung, verschiedene Krebsarten, wobei die Resorption erhöht ist,
und rheumatoide Arthritis ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
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Wegen
der schweren Störungen,
die sich aus einem metabolischen Ungleichgewicht ergeben können, sind
Forscher an der Untersuchung des Knochenmetabolismus und des Mechanismus,
durch den Knochenresorption und -bildung erfolgt, interessiert gewesen,
um letztlich eine Strategie für
die Hemmung der Resorption zu entwickeln und/oder um die Knochenmasse
und/oder die Knochen-Mikroarchitektur zu verbessern, indem die Osteoblastenaktivität stimuliert
wird. Jedoch wird die Tätigkeit
von sowohl Osteoklasten als auch Osteoblasten von einer Reihe von
komplexen Faktoren gesteuert und somit hat sich die Entwicklung
selektiver Therapeutika als eine schwierige Aufgabe erwiesen.
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Eine
Herangehensweise, die für
die Entwicklung von neuen Therapeutika für Knochenstörungen gewählt worden ist, ist die Hemmung
der Osteoklasten-Protonenpumpe. Baron und Mitarbeiter haben früher nachgewiesen,
dass diese Protonenpumpe eine vakuoläre H+-ATPase
ist (siehe Blair et al., Science 1989, 245, 855-857; Finbow et al.,
Biochem. J. 1997, 324, 697-712; Forgac, M. Soc. Gen. Physiol. Ser.
1996, 51, 121-132). Es ist gezeigt worden, dass Osteoklasten, um
Knochenresorption zu bewirken, letztlich den pH-Wert in dem verschlossenen
Mikrokompartiment, das unter ihrer Anhaftungsstelle an der Knochenoberfläche liegt, absenken
(siehe Baron et al., J. Cell. Biol. 1985, 101, 2210-2222), was somit
zu der sauren Umgebung führt, die
notwendig ist, um das Mineral des Knochens zu lösen und den Abbau der Knochenmatrix
durch Proteasen zu ermöglichen.
Der Osteoklast verwendet letztlich eine Protonenpumpe (ein ATP-abhängiger Transport
von Protonen), um diese Ansäuerung
zu erreichen, und somit sollte jegliche therapeutische Hemmung der
Osteoklasten-Protonenpumpe zu einer Abnahme des Knochenverlusts
oder -umsatzes führen.
Als Folge haben sich viele neue, für die Verminderung der Knochenresorption
entwickelte Therapeutika auf die Hemmung der Protonenpumpe konzentriert,
um Osteoklastenaktivität
und übermäßige Knochenresorption
zu verhindern. Für eine
Diskussion der vakuolären
H+-ATPase und von Hemmstoffen der vakuolären H+-ATPase, siehe Farina et al., Exp. Opin.
Ther. Patents 1999, 9, 157-168 und David, P. und Baron, R. „The Vacuolar
H+-ATPase: A Potential Target for Drug Development
in Bone Diseases" Exp.
Opin. Invest. Drugs 1995, 4, 725-740.
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Außer auf
die Hemmung der Protonenpumpe sind Untersuchungen auch auf die Steuerung
der Signalübertragung
gerichtet gewesen, um letztlich die Osteoklasten- oder Osteoblastenfunktion
zu beeinflussen. Beispielsweise haben Untersuchungen Beweise geliefert,
dass Src-Proteinkinasen
bei der Osteoklastenfunktion eine entscheidende Rolle spielen, und
es ist in verschiedenen Zellarten gezeigt worden, dass die Phosphorylierung
von Proteinen, von denen vorgeschlagen wurde, dass sie an der Architektur
des Zellskeletts beteiligt sind oder sie regulieren, durch Src und
verwandte Kinasen eine wichtige Anforderung für deren richtige Funktion ist
(siehe beispielsweise „A
Novel Inhibitor of the Tyrosine Kinase Src Suppresses Phosphorylation of
Its Major Cellular Substrates and Reduces Bone Resorption In Vitro
and in Rodent Models In Vivo" Missbach et
al., Bone 1999, 24, 437-449). Weil das Zellskelett eine wichtige
Rolle bei der Osteoklastenbeweglichkeit, der Anhaftung und der Bildung
des verschlossenen Bereichs spielt, ist es wahrscheinlich, dass
diese Zellskelettproteine die Osteoklastenfunktion beeinflussen
können.
Somit ist wahrscheinlich, dass Wirkstoffe, die Interaktionen mit
Src oder verwandten Kinasen hemmen oder fördern, die Zellskelettproteine
beeinflussen und letztlich die Osteoklastenfunktion beeinflussen.
Von mehreren Verbindungen ist berichtet worden, dass sie Hemmstoffe
der Tyrosin-Src-Kinase sind und somit bei der Hemmung der Osteoklasten-vermittelten
Knochenresorption von gewissem Nutzen sein können (siehe beispielsweise
Missbach et al., Bone 1999, 24, 437-449; Connolly et al., Bioorg. & Med. Chem. Lett.
1997, 7, 2415-2420; Trump-Kallmeyer et al., J. Med. Chem. 1998, 41,
1752-1763; Klutchko et al., J. Med. Chem. 1998, 41, 3276-3292; Legraverend
et al., Bioorg. & Med.
Chem. 1999, 7, 1281-1293; Chang et al., Chem. & Biol. 1999, 6, 361-375; Lev et al.
Nature 1995, 376, 737-784; Palmer et al., J. Med. Chem. 1997, 40,
1519-1529. SU 412 765 offenbart ein biologisch aktives (N)-phosphoryliertes
Purinylderivat.
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Wie
vorstehend beschrieben, beziehen viele der bestehenden Therapeutika,
die für
die Behandlung von Knochenstörungen
wie z.B. Osteoporose entwickelt worden sind, die Hemmung der Osteoklastenaktivität ein. Beispielsweise
glaubt man, dass Östrogene,
Bisphosphonate, Calcitonin, Flavonoide, selektive Östrogenrezeptormodulatoren
durch die Hemmung der Osteoklastenaktivität wirken. Zusätzlich sind
seit neuerem neue Therapeutika entwickelt worden, um eine schnelle
Zunahme des Knochenmineralgehalts zu fördern, indem sie die Osteoblastenaktivität fördern. Derartige
Beispiele schließen
Peptide aus der Parathormonfamilie, Strontiumranelat und Wachstumshormon
und Insulinähnlichen
Wachstums-Faktor ein (siehe beispielsweise „Promising New Agents in Osteoporosis", Reginster et al.,
Drugs R & D 1999,
3, 195-201). Leider ist jedoch ein signifikantes Problem vieler
dieser Therapeutika, dass sie nicht spezifisch genug für Knochengewebe
sind und somit zu unerwünschten,
schädigenden
Nebenwirkungen führen
können.
Signifikante Probleme bei Bisphosphonaten beispielsweise sind gut
bekannt. Siehe z.B. Ezra und Golomb, Advanced Drug Delivery Reviews 2000,
42, 175-195.
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Offensichtlich
wird, wie durch die Anzahl der unterschiedlichen Herangehensweisen
an die verfügbaren
Therapeutika bewiesen wird, der Knochenmetabolismus von vielen verschiedenen
Faktoren gesteuert. Ein gemeinsames Thema ist jedoch der Wunsch,
selektive Hemmstoffe oder Verstärker
der Osteoklasten- beziehungsweise Osteoblastenaktivität zu entwickeln.
Obwohl in die Richtung der Entwicklung von Therapeutika für Osteoporose
und anderen Knochenstörungen
Fortschritte gemacht wurden, bleibt die Notwendigkeit bestehen,
wirksame und selektive Wirkstoffe zu entwickeln, die minimale Nebenwirkungen
aufweisen. Allgemeiner gesagt bleibt die Notwendigkeit bestehen,
Verbindungen zu entwickeln, die die zellulären Signalübertragungswege regulieren
können,
um komplexe biologische Prozesse zu hemmen oder zu fördern, um
Erkrankungen, die durch derartige Signalgebung vermittelt werden,
zu behandeln und/oder ihnen vorzubeugen.
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Beschreibung der Erfindung
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1. Allgemeine
Beschreibung der erfindungsgemäßen Verbindungen
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Diese
Erfindung betrifft eine neue Familie von Verbindungen, die ein breites
Spektrum an nützlichen biologischen
und pharmakologischen Wirkungen entfalten. Diese schließen Verbindungen
der allgemeinen Formel (I), wie nachstehend weiter definiert, ein:
wobei
R
A für Wasserstoff
oder eine aliphatische, heteroaliphatische, Aryl- oder Heteroaryleinheit
steht;
R
B für eine Aryl- oder Heteroaryleinheit
steht, die eine oder mehrere Phosphor enthaltende Einheiten umfasst, wie
nachstehend definiert;
R
C für Wasserstoff,
Halogen, eine aliphatische, heteroaliphatische, Aryl- oder Heteroaryleinheit
oder -ZR steht, wobei Z für
-O-, -S- oder -NR steht, wobei jedes Vorkommen von R ohne weiteren
alphanumerischen hochgestellten Index unabhängig für Wasserstoff oder eine substituierte
oder unsubstituierte aliphatische, heteroaliphatische, Aryl- oder
Heteroaryleinheit steht;
R
D für Wasserstoff
steht;
wobei in jedem der vorstehenden Reste jede aliphatische
oder heteroaliphatische Einheit verzweigt oder unverzweigt, cyclisch
oder acyclisch, substituiert oder unsubstituiert sein kann und jede
Aryl- und Heteroaryleinheit substituiert oder unsubstituiert sein
kann;
wobei die unmittelbar nachstehend diskutierten drei Einschränkungen
gelten.
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2. Erfindungsgemäße Verbindungen
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
sind Verbindungen, wie sie gerade vorstehend in Teil 1 beschrieben
werden, in welchen die Phosphor enthaltende Einheit in R
B eine Aryl- oder Heteroaryleinheit ist,
die mindestens einen der in Serie II dargelegten Substituenten trägt:
wobei
jedes Vorkommen von K unabhängig
-O- oder -S- ist;
jedes Vorkommen von Y unabhängig -O-,
-S-, -NR- oder eine chemische Bindung ist;
jedes Vorkommen
von R
1 unabhängig eine substituierte oder
unsubstituierte aliphatische, heteroaliphatische, Aryl- oder Heteroaryleinheit
ist oder, ausgenommen in YR
1-Einheiten,
in welchen Y eine kovalente Bindung ist, R
1 auch
H sein kann;
jedes Vorkommen von R
2 unabhängig R
1, -PK(YR
1)(YR
1), -SO
2(YR
1) oder -C(O)(YR
1)
ist;
jedes Vorkommen von G unabhängig -O-, -S-, -NR- oder M
x ist;
jedes Vorkommen von M unabhängig eine
substituierte oder unsubstituierte Methyleneinheit ist und jede M-M'-Einheit elektronisch
gesättigt
oder ungesättigt
sein kann;
jedes Vorkommen von x unabhängig eine ganze Zahl von 1
bis 6 ist; und
jedes Vorkommen von M
Y unabhängig eine
Methingruppe oder eine Niederalkyleinheit, die eine Methingruppe enthält und gegebenenfalls
weiter substituiert sein kann, ist.
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Die
Phosphor enthaltende Einheit kann an jeder verfügbaren Ringposition vorhanden
sein. Als Beispiel wird die Anbindung in der para-Stellung eines
Arylrings in den nachstehend in Serie IIa(i) abgebildeten Strukturen
veranschaulicht.
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Die
vorhergehende Verbindungsklasse wird durch die Unterklasse davon,
in welcher R
B eine Aryl- oder Heteroaryleinheit
ist, die mindestens einen der in Serie IIa dargelegten Substituenten
trägt,
veranschaulicht:
in welchen
jedes Vorkommen von R
6 eine unabhängig ausgewählte aliphatische,
heteroaliphatische, Aryl- oder Heteroaryleinheit oder Niederalkylester
von Phosphonaten ist;
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Diese
Klasse und Unterklasse werden weiter beispielhaft dargestellt durch
diejenigen Verbindungen, in welchen R1 für H oder
Niederalkyl steht; M -CH2-, -CH(OH)-, -CH(Halogen)-
oder -C(Halogen)2- ist; R6 Niederalkyl
ist und R für
H steht. Halo und Halogen stellen Fluor, Chlor, Brom und Iod dar.
Die folgenden Strukturen veranschaulichen mehrere beispielhafte
Arten von Verbindungen dieser Unterklasse. Andere werden dem Leser
ohne weiteres ersichtlich sein.
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Eine
andere Verbindungsklasse von speziellem Interesse besteht aus Verbindungen
mit der Struktur der Formel I, in welcher
R
A für Wasserstoff
oder eine aliphatische, heteroaliphatische, Aryl- oder Heteroaryleinheit
steht;
R
B eine aliphatische, heteroaliphatische,
Aryl- oder Heteroaryleinheit umfasst, die mindestens einen Substituenten
der Serie IIb trägt:
R
C für
Wasserstoff, Halogen, eine aliphatische, heteroaliphatische, Aryl-
oder Heteroaryleinheit oder -ZR steht, wobei Z für -O-, -S- oder NR steht, wobei
jedes Vorkommen von R ohne weiteren alphanumerischen hochgestellten
Index unabhängig
für Wasserstoff
oder eine substituierte oder unsubstituierte aliphatische, heteroaliphatische,
Aryl- oder Heteroaryleinheit steht;
R
D für Wasserstoff
steht;
wobei in jedem der vorstehenden Reste jede aliphatische
oder heteroaliphatische Einheit verzweigt oder unverzweigt, cyclisch
oder acyclisch und substituiert oder unsubstituiert sein kann und
jede Aryl- und Heteroaryleinheit substituiert oder unsubstituiert
sein kann; Eine andere Verbindungsklasse von speziellem Interesse
besteht aus Verbindungen, wie in der in vorausgehenden Klasse beschrieben,
außer
dass R
D für Wasserstoff, Halogen oder
-YR steht, wobei Y O, S, NR oder eine chemische Bindung ist, und
R für einen
Einheit steht, die nicht in einer Cyanogruppe oder in einem N-substituierten
oder unsubstituierten Amino-, Amidino-, Guanidino- oder Guanidinoalkylrest
endet; und wobei in jedem der vorstehenden Reste jede aliphatische
oder heteroaliphatische Einheit verzweigt oder unverzweigt, cyclisch
oder acyclisch und substituiert oder unsubstituiert sein kann und
jede Aryl- und Heteroaryleinheit substituiert oder unsubstituiert
sein kann, außer
wenn es gegenteilig vorgeschrieben ist.
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Verbindungsklassen
von speziellem Interesse bestehen aus Verbindungen mit der Struktur
der Formel I, in welcher
- 2. RA niederaliphatisch
ist und verzweigt oder unverzweigt, cyclisch oder acyclisch sein
kann und gegebenenfalls substituiert sein kann mit einem oder mehreren
Substituenten, ausgewählt
aus einem niederaliphatischen Rest (der substituiert oder unsubstituiert
sein kann), -OR, -SR, -NRR',
-C(O)YR und -Y-C(O)Y'R, wobei
Y für O,
S, NR oder eine Bindung steht und R für H steht oder eine substituierte
oder unsubstituierte aliphatische, heteroaliphatische, Aryl- oder
Heteroaryleinheit ist.
- 3. RA niederaliphatisch ist und substituiert
sein kann mit einem oder mehreren Hydroxy-, Alkoxy-, Aralkoxy-, Carbamyl-,
Amino-, substituierten Amino-, Acyl-, Cyano-, Halogen-, Nitro- oder Sulforesten
und/oder mit einer oder mehreren Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Cycloalkyl-,
Aryleinheiten, heterocyclischen Einheiten, Aryloxy- oder Aralkyleinheiten,
die selbst substituiert sein können
mit einem oder mehreren Hydroxy-, Alkoxy-, Aralkoxy-, Carbamoyl-,
Amino-, substituierten Amino-, Acyl-, Cyano-, Halogen-, Nitro- oder
Sulforesten.
- 4. Die Verbindung nach vorstehendem 2, in welcher RA für Mx-Aryl oder einen Mx-Heterocyclus steht,
wobei M ein substituiertes oder unsubstituiertes Methylen ist, x
eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist, die Aryleinheit einen oder mehrere
Substituenten tragen kann und der Heterocyclus eine substituierte
oder unsubstituierte, aromatische oder nicht-aromatische heterocyclische
Einheit ist, umfassend einen 5- bis 7-gliedrigen Ring, der ein oder
mehrere Heteroatome trägt.
- 5. Die Verbindung nach vorstehendem 3, wobei Mx für Methylen,
Ethylen oder Propylen steht und die Aryleinheit für o-, m-
oder p-Hydroxy-, 2,3-Dihydroxy-, 2,4-Dihydroxy-, 2,5-Dihydroxy-, 3,4-Dihydroxy-
oder 3,5-Dihydroxyphenyl steht.
- 6. Die Verbindung nach Vorstehendem, wobei RC für -OR steht,
wobei R H, aliphatisch, heteroaliphatisch, Aryl oder Heteroaryl
ist.
- 7. Die Verbindung nach Vorstehendem, wobei RC für -R*, -NR*
oder -OR* steht, in welchen R* für
einen aliphatischen C1-C8-Rest
steht, der verzweigt oder unverzweigt, cyclisch oder nicht-cyclisch
sein kann und der substituiert sein kann mit einem oder mehreren
Hydroxy-, Alkoxy-, Aralkoxy-, Carbamyl-, Amino-, substituierten
Amino-, Acyl-, Cyano-, Halogen-, Nitro- oder Sulforesten und/oder mit einer
oder mehreren Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Cycloalkyl-, Aryleinheiten,
heterocyclischen Einheiten, Aryloxy- oder Aralkyleinheiten, die
selbst substituiert sein können
mit einem oder mehreren Hydroxy-, Alkoxy-, Aralkoxy-, Carbamyl-, Amino-,
substituierten Amino-, Acyl-, Cyano-, Halogen-, Nitro- oder Sulforesten.
- 8. Die Verbindung nach Vorstehendem, wobei RC für -R*, -NR*
oder -OR* steht, in welchen R* eine aliphatische C1-C8-Einheit umfasst, substituiert mit einem
oder mehreren Resten, ausgewählt
aus Folgenden: einem substituierten oder unsubstituierten Amin oder
einer 5- bis 7-gliedrigen
heterocyclischen Einheit, welche selbst gegebenenfalls substituiert
sein kann.
- 9. Die Verbindung nach Vorstehendem, in welcher RB einen
Substituenten trägt, wobei jedes R1 unabhängig für H, Alkyl,
Arylalkyl, Aryl oder eine Prodrugeinheit steht.
- 10. Die Verbindung nach Vorstehendem, in welcher RB einen
Substituenten trägt, wobei jedes R1 unabhängig für H, Alkyl,
Arylalkyl, Aryl oder eine Prodrugeinheit steht.
- 11. Die Verbindung nach Vorstehendem, in welcher RB einen
Substituenten trägt, wobei jedes R1 unabhängig für H, Alkyl,
Arylalkyl, Aryl oder eine Prodrugeinheit steht.
- 12. Die Verbindung nach Vorstehendem, in welcher RB einen
Substituenten trägt, wobei jedes R6 unabhängig für Alkyl,
Arylalkyl, Aryl oder eine Prodrugeinheit steht.
- 13. Die Verbindung nach einem aus dem Vorstehenden, in welcher
RB einen Substituenten trägt, wobei R1 für H, Alkyl
Arylalkyl oder eine Prodrugeinheit steht und R6 aliphatisch,
heteroaliphatisch, Aryl oder Heteroaryl oder eine Prodrugeinheit
ist.
- 14. Die Verbindung nach Vorstehendem, in welcher RB einen
Substituenten trägt, wobei jeder Rest R6 unabhängig
aliphatisch, heteroaliphatisch, Aryl oder Heteroaryl oder eine Prodrugeinheit
ist.
- 15. Die Verbindung nach einem aus dem Vorstehenden, in welcher
RB einen Substituenten trägt, wobei jedes R1 für H, Alkyl,
Arylalkyl, Aryl oder eine Prodrugeinheit steht und Y und M die zuvor
angegebene Bedeutung haben.
- 16. Die Verbindung nach einem aus dem Vorstehenden, in welcher
RB einen Substituenten trägt, wobei jedes R1 unabhängig für H, H,
Alkyl, Arylalkyl, Aryl oder eine Prodrugeinheit steht und R aliphatisch,
heteroaliphatisch, Aryl oder Heteroaryl ist.
- 17. Die Verbindung (oder ein pharmazeutisch verträgliches
Derivat davon) der Formel: wobei
RA für Wasserstoff
oder eine aliphatische, heteroaliphatische, Aryl- oder Heteroaryleinheit
steht;
RC für Wasserstoff, Halogen, eine
aliphatische, heteroaliphatische, Aryl- oder Heteroaryleinheit oder
-ZR steht, wobei Z für
-O-, -S- oder NR steht, wobei jedes Vorkommen von R ohne weiteren
alphanumerischen hochgestellten Index unabhängig Wasserstoff oder eine
substituierte oder unsubstituierte aliphatische, heteroaliphatische,
Aryl- oder Heteroaryleinheit ist;
RD für Wasserstoff
steht; und
jedes Vorkommen von R6 eine
unabhängig
ausgewählte
aliphatische, heteroaliphatische, Aryl- oder Heteroaryleinheit ist;
wobei
in jedem der vorhergehenden Reste jede aliphatische oder heteroaliphatische
Einheit verzweigt oder unverzweigt, cyclisch oder acyclisch und
substituiert oder unsubstituiert sein kann und jede Aryl- und Heteroaryleinheit
substituiert oder unsubstituiert sein kann.
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Eine
Reihe von wichtigen Unterklassen der vorhergehenden Verbindungsklassen
verdient gesonderte Erwähnung.
Jene Unterklassen schließen
Unterklassen der vorhergehenden Klassen ein, in welchen:
- (d) RA niederaliphatisch
ist und verzweigt oder unverzweigt, cyclisch oder acyclisch sein
kann und gegebenenfalls substituiert sein kann mit einem oder mehreren
Substituenten, ausgewählt
aus einem niederaliphatischen Rest (der substituiert oder unsubstituiert
sein kann), -OR, -SR, -NRR',
-C(O)YR und -Y-C(O)Y'R, wobei
Y für O,
S, NR oder eine Bindung steht und R für H steht oder eine substituierte
oder unsubstituierte aliphatische, heteroaliphatische, Aryl- oder Heteroaryleinheit
ist (Beispielsweise kann RA ein niederaliphatischer
Rest sein, der substituiert sein kann mit einem oder mehreren Hydroxy-,
Alkoxy-, Aralkoxy-, Carbamyl-, Amino-, substituierten Amino-, Acyl-,
Cyano-, Halogen-, Nitro- oder Sulforesten und/oder mit einer oder
mehreren Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Cycloalkyl-, Aryleinheiten,
heterocyclischen Einheiten, Aryloxy- oder Aralkyleinheiten, die
selbst substituiert sein können
mit einem oder mehreren Hydroxy-, Alkoxy-, Aralkoxy-, Carbamyl-,
Amino-, substituierten Amino-, Acyl-, Cyano-, Halogen-, Nitro- oder
Sulforesten. Dies schließt
den Satz von Verbindungen ein, in welchen RA für Mx-Aryl oder einen Mx-Heterocyclus
steht, wobei M ein substituiertes oder unsubstituiertes Methylen
ist, x eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist, die Aryleinheit einen oder
mehrere Substituenten tragen kann und der Heterocyclus eine substituierte
oder unsubstituierte, aromatische oder nichtaromatische heterocyclische
Einheit ist, umfassend einen 5- bis 7-gliedrigen Ring, der ein oder
mehrere Heteroatome trägt,
einschließlich
unter anderem Ausführungsformen,
in welchen Mx für Methyl, Ethyl oder Propyl
steht und die Aryleinheit für
o-, m- oder p-Hydroxy-, 2,3-Dihydroxy-, 2,4-Dihydroxy-, 2,5-Dihydroxy-,
3,4-Dihydroxy- oder 3,5-Dihydroxyphenyl steht;
- (e) RC für -OR steht, wobei R H, aliphatisch,
heteroaliphatisch, Aryl oder Heteroaryl ist;
- (f) RC für -R*, -NR* oder -OR* steht,
in welchen R* für
einen aliphatischen C1-C8-Rest
steht, der verzweigt oder unverzweigt, cyclisch oder nicht-cyclisch
sein kann und der substituiert sein kann mit einem oder mehreren
Hydroxy-, Alkoxy-, Aralkoxy-, Carbamyl-, Amino-, substituierten
Amino-, Acyl-, Cyano-, Halogen-, Nitro- oder Sulforesten und/oder
mit einer oder mehreren Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Cycloalkyl-,
Aryleinheiten, heterocyclischen Einheiten, Aryloxy- oder Aralkyleinheiten,
die selbst substituiert sein können
mit einem oder mehreren Hydroxy-, Alkoxy-, Aralkoxy-, Carbamoyl-,
Amino-, substituierten Amino-, Acyl-, Cyano-, Halogen-, Nitro- oder
Sulforesten;
- (g) RC für -R*, NR* oder -OR* steht,
in welchen R* eine aliphatische C1-C8-Einheit umfasst, substituiert mit einem
oder mehreren Resten, ausgewählt
aus folgenden: einem substituierten oder unsubstituierten Amin oder
einer 5- bis 7-gliedrigen heterocyclischen Einheit, welche selbst
gegebenenfalls substituiert sein kann;
- (h) RB einen Substituenten trägt, wobei jedes R1 unabhängig für H, Alkyl,
Arylalkyl, Aryl oder eine Prodrugeinheit, wie auf den Seiten 32
und 33 definiert, steht;
- (i) RB umfasst, wobei jedes R1 unabhängig
für H,
Alkyl, Arylalkyl, Aryl oder eine Prodrugeinheit, wie auf den Seiten 32
und 33 definiert, steht;
- (j) RB umfasst, wobei jedes R1 unabhängig
für H,
Alkyl, Arylalkyl, Aryl oder eine Prodrugeinheit, wie auf den Seiten 32
und 33 definiert, steht;
- (k) RB umfasst, wobei jedes R6 unabhängig
für Alkyl,
Arylalkyl, Aryl oder eine Prodrugeinheit, wie auf den Seiten 32
und 33 definiert, steht;
- (l) RB umfasst, wobei R1 für H, Alkyl,
Arylalkyl oder eine Prodrugeinheit steht und R6 für Alkyl,
Arylalkyl, Aryl oder eine Prodrugeinheit steht, wie auf den Seiten
32 und 33 definiert;
- (m) RB umfasst, wobei jedes R6 unabhängig
für Alkyl,
Arylalkyl, Aryl oder eine Prodrugeinheit, wie auf den Seiten 32
und 33 definiert, steht;
- (n) RB umfasst, wobei jedes R1 für
H, Alkyl, Arylalkyl oder eine Prodrugeinheit, wie auf den Seiten
32 und 33 definiert, steht und Y und M die zuvor angegebene Bedeutung
haben;
- (o) RB umfasst, wobei jedes R1 unabhängig
für H,
Alkyl, Arylalkyl, Aryl oder eine Prodrugeinheit, wie auf den Seiten 32
und 33 definiert, steht und R aliphatisch, heteroaliphatisch, Aryl
oder Heteroaryl ist.
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Wie
sich der Leser bewusst werden wird, schließen Verbindungen von besonderem
Interesse unter anderem diejenigen ein, die sich die Kennzeichen
von einer oder mehreren der vorhergehenden Unterklassen teilen.
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Manche
jener Unterklassen werden durch die folgenden Arten von Verbindungen
veranschaulicht: III.
Verbindungen der Formel:
wobei
R
A für Wasserstoff
oder eine aliphatische, heteroaliphatische, Aryl- oder Heteroaryleinheit
steht;
R
C für Wasserstoff, Halogen, eine
aliphatische, heteroaliphatische, Aryl- oder Heteroaryleinheit oder
-ZR steht, wobei Z für
-O-, -S- oder NR steht, wobei jedes Vorkommen von R ohne weiteren
alphanumerischen hochgestellten Index unabhängig Wasserstoff oder eine
substituierte oder unsubstituierte aliphatische, heteroaliphatische,
Aryl- oder Heteroaryleinheit ist;
R
D für Wasserstoff
steht; und wobei in jedem der vorhergehenden Reste jede aliphatische
oder heteroaliphatische Einheit verzweigt oder unverzweigt, cyclisch
oder acyclisch und substituiert oder unsubstituiert sein kann und
jede Aryl- und Heteroaryleinheit substituiert oder unsubstituiert
sein kann;
und jedes Vorkommen von R
6 eine
unabhängig
ausgewählte
aliphatische, heteroaliphatische, Aryl- oder Heteroaryleinheit ist.
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Manche
der vorhergehenden Verbindungen können in verschiedenen isomeren
Formen vorkommen. Die Erfindung umschließt die Verbindungen als individuelle
Isomere, im Wesentlichen frei von anderen Isomeren, und, in einer
anderen Ausführungsform,
als Gemische aus verschiedenen Isomeren, z.B. racemische Stereoisomerengemische.
Außer
den vorstehend erwähnten
Verbindungen an sich umschließt
diese Erfindung auch pharmazeutisch verträgliche Derivate dieser Verbindungen
und Zusammensetzungen, die eine oder mehrere erfindungsgemäße Verbindungen
und einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Excipienten oder Zusatzstoffe
umfassen.
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Erfindungsgemäße Verbindungen,
die von besonderem Interesse sind, schließen diejenigen ein, die
- • die
Src-Kinase oder eine andere Kinase von Interesse mit einem IC50-Wert von 100 nM oder weniger hemmen (wie
mit irgendeinem wissenschaftlich annehmbaren Kinase-Hemmtests bestimmt),
- • eine
gegebene Kinase mit einem mindestens 100-fach niedrigeren IC50-Wert als ihren IC50-Werten für andere
Kinasen von Interesse hemmen,
- • messbar
bevorzugt gegenüber
anderen Geweben an Knochen binden,
- • nachweisbar
das Gleichgewicht zwischen Knochenwachstum und Knochenresorption
(zugunsten von Knochenwachstum) in irgendeinem wissenschaftlich
annehmbaren Tiermodell verbessern,
- • PTH-induzierte
Knochenresorption in einem wissenschaftlich annehmbaren Tiermodell
zu mindestens 50% (gegenüber
PTH-behandelten Tieren, die die Verbindung nicht erhalten) hemmen,
wenn sie in Dosen von 25 mg Verbindung/kg Tiergewicht einmal oder
zweimal täglich
vorzugsweise in Dosen von 10 mg/kg und stärker bevorzugt in Dosen von
1 mg/kg verabreicht werden,
- • oder
eine cytotoxische oder wachstumshemmende Wirkung auf in vitro gehaltene
Krebszelllinien oder in Tierversuchen unter Verwendung eines wissenschaftlich
annehmbaren Krebszell-Xenograftmodells an den Tag legen.
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Diese
Erfindung stellt auch ein Arzneimittel bereit, das mindestens eine
der vorhergehenden Verbindungen oder ein pharmazeutisch verträgliches
Derivat davon als Hemmstoffe der Knochenresorption durch Osteoklasten,
als Hemmstoffe von Tumorwachstum und Tumormetastase, zur Behandlung
und Prophylaxe von Erkrankungen oder unerwünschten Zuständen, die
durch eine durch die Verbindung gehemmte Kinase vermittelt werden,
und mindestens einen pharmazeutisch verträglichen Excipient oder Zusatzstoff
umfasst. Vorzugsweise ist der Excipient oder Zusatzstoff pharmazeutisch
harmlos.
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Die
Erfindung stellt weiterhin die Verwendung einer erfindungsgemäßen Verbindung
zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung von Knochenresorption,
Hemmung von Tumorwachstum und/oder Tumormetastase oder für die Behandlung
und Vorbeugung von Erkrankungen oder unerwünschten Zuständen bereit, die
von einer Kinase vermittelt werden, die durch eine der vorhergehenden
Verbindungen gehemmt wird. Die Verwendung bezieht das Verabreichen
einer therapeutisch wirksamen Menge der Verbindung oder eines pharmazeutisch
verträglichen
Derivats davon an einen Menschen oder ein Tier, der/das dessen bedarf,
ein. Eine derartige Verabreichung stellt eine Verwendung gemäß der Erfindung
zur Hemmung von Knochenresorption durch Osteoklasten oder zur Hemmung
von Tumorwachstum und/oder Tumormetatase oder einer anderen proliferativen
Erkrankung dar. Allgemein stellt eine derartige Verabreichung die
Verwendung gemäß der Erfindung
zur Behandlung und Prophylaxe von Erkrankungen dar, die von einer
Kinase vermittelt werden, die durch eine der vorhergehenden Verbindungen
oder ein pharmazeutisch verträgliches
Derivat davon gehemmt wird.
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Die
von dieser Erfindung bereitgestellten Verbindungen sind auch verwendbar
als Standards und Reagenzien bei der Charakterisierung von verschiedenen
Kinasen, besonders der Kinasen der Src-Familie, aber nicht darauf
beschränkt;
der Untersuchung der Rolle derartiger Kinasen in biologischen und
pathologischen Phänomenen;
der Untersuchung von intrazellulären
Signalübertragungswegen,
die von derartigen Kinasen vermittelt werden; der vergleichenden
Beurteilung von neuen Kinase-Hemmstoffen; der Untersuchung von verschiedenen
Krebsarten in Zelllinien und Tiermodellen; und der Untersuchung
der Knochenbiologie, einschließlich
der konkurrierenden Kräfte
der Resorption und Erzeugung von Knochen.
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3. Verbindungen
und Definitionen
-
Wie
vorstehend diskutiert, stellt diese Erfindung eine neue Familie
von Verbindungen mit einem Spektrum an biologischen Eigenschaften
bereit. Erfindungsgemäße Verbindungen
weisen biologische Wirkungen auf, die für die Behandlung von Erkrankungen,
einschließlich
mit Knochen in Beziehung stehender Störungen und proliferativer Erkrankung,
einschließlich
Krebs, relevant sind. Allgemeiner gesagt sind die Verbindungen bei
der Regulierung der Signalübertragungswege
verwendbar. Beispielsweise sind bestimmte erfindungsgemäße Verbindungen
zur Hemmung von Proteinkinasen verwendbar, einschließlich insbesondere
der Tyrosinkinase Src.
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Erfindungsgemäße Verbindungen
umfassen jene vorstehend dargelegten, hier beschriebenen und solche
Verbindungen, die zum Teil durch die hier anderswo offenbarten verschiedenen
Klassen, Unterklassen und Spezies veranschaulicht sind.
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Der
Leser mit normalen Kenntnissen auf dem Fachgebiet ist sich bewusst,
dass in den erfindungsgemäßen Verbindungen
asymmetrische Zentren vorkommen können. Somit können erfindungsgemäße Verbindungen
und Arzneimittel davon in Form eines individuellen Enantiomers,
Diastereomers oder geometrischen Isomers vorliegen oder in der Form
eines Stereoisomerengemisches. In bestimmten Ausführungsformen
sind die erfindungsgemäßen Verbindungen
enantiomerenreine Verbindungen, im Wesentlichen frei von anderen Enantiomeren.
In bestimmten anderen Ausführungsformen
wird ein Gemisch aus Stereoisomeren oder Diastereomeren erhalten.
-
Zusätzlich stellt
die vorliegende Erfindung pharmazeutisch verträgliche Derivate der vorhergehenden Verbindungen
und Methoden zur Behandlung eines Individuums unter Verwendung dieser
Verbindungen, von Arzneimitteln davon oder eines der beiden in Kombination
mit einem oder mehreren zusätzlichen
Therapeutika bereit. Die Wendung „pharmazeutisch verträgliches
Derivat", wie hier
verwendet, bezeichnet jegliches/n pharmazeutisch verträgliche/n
Salz, Ester oder Salz eines derartigen Esters einer derartigen Verbindung
oder jegliches andere Addukt oder Derivat, das auf Verabreichung
an einen Patienten hin fähig
ist, (direkt oder indirekt) eine Verbindung, wie hier anderweitig
beschrieben, oder einen Metaboliten oder Rest davon bereitzustellen. Pharmazeutisch
verträgliche
Derivate schließen
somit unter anderem Prodrugs ein. Ein Prodrug ist ein Derivat einer
Verbindung, gewöhnlich
mit signifikant verminderter pharmakologischer Aktivität, das eine
zusätzliche Einheit
enthält,
die für
die Entfernung in vivo empfänglich
ist und das Stammmolekül
als die pharmakologisch wirksame Spezies ergibt. Ein Beispiel für ein Prodrug
ist ein Ester, der in vivo gespalten wird, um eine Verbindung von
Interesse zu ergeben. Prodrugs von vielen verschiedenen Verbindungen
und Materialien und Verfahren zur Derivatisierung der Stammverbindungen,
um die Prodrugs zu erschaffen, sind bekannt und können an
die vorliegende Erfindung angepasst werden. Bestimmte beispielhafte
Arzneimittel und pharmazeutisch verträgliche Derivate werden nachstehend
in größeren Einzelheiten
diskutiert werden.
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Bestimmte
erfindungsgemäße Verbindungen
und Definitionen von spezifischen funktionellen Gruppen werden nachstehend
auch in größeren Einzelheiten
beschrieben. Für
die Zwecke dieser Erfindung werden die chemischen Elemente gemäß dem Periodensystem
der Elemente, CAS-Version,
Handbook of Chemistry and Physics, 75te Aufl.,
Umschlaginnenseite, identifiziert und spezifische funktionelle Gruppen
werden, wie dort beschrieben, definiert. Zusätzlich werden allgemeine Prinzipien
der organischen Chemie sowie spezifische funktionelle Einheiten
und die Reaktivität
in „Organic
Chemistry"; Thomas
Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999, beschrieben,
dessen gesamter Inhalt hier durch Bezugnahme aufgenommen ist. Darüber wird sich
der Fachmann mit normalen Kenntnissen bewusst werden, dass die Syntheseverfahren,
wie hier beschrieben, viele verschiedene Schutzgruppen nutzen können. Mit
dem Begriff „Schutzgruppe", wie hier verwendet,
ist gemeint, dass eine spezielle funktionelle Einheit, z.B. O, S,
oder N, vorübergehend
blockiert wird, so dass eine Umsetzung selektiv an einer anderen
reaktiven Stelle in einer multifunktionellen Verbindung ausgeführt werden
kann. In bevorzugten Ausführungsformen
reagiert eine Schutzgruppe selektiv in guter Ausbeute, um ein geschütztes Substrat
zu geben, das gegenüber
den geplanten Umsetzungen stabil ist; die Schutzgruppe muss selektiv
in guter Ausbeute mit ohne weiteres verfügbaren, vorzugsweise ungiftigen
Reagenzien, die die anderen funktionellen Gruppen nicht angreifen,
entfernt werden; die Schutzgruppe bildet ein leicht trennbares Derivat
(stärker
bevorzugt ohne die Erzeugung von neuen stereogenen Zentren); und
die Schutzgruppe weist ein Minimum an zusätzlicher Funktionalität auf, um
weitere Reaktionsstellen zu vermeiden. Wie hier ausführlich beschrieben,
können
Sauerstoff-, Schwefel-, Stickstoff- und Kohlenstoff-Schutzgruppen
genutzt werden. Beispielhafte Schutzgruppen werden hier ausführlich beschrieben,
jedoch ist es selbstverständlich,
dass die vorliegende Erfindung nicht auf diese Schutzgruppen beschränkt sein
soll; vielmehr können
viele verschiedene zusätzliche äquivalente
Schutzgruppen unter Verwendung der vorstehenden Kriterien ohne weiteres
erkannt und in dem erfindungsgemäßen Verfahren
genutzt werden. Zusätzlich
werden viele verschiedene Schutzgruppen in „Protective Groups in Organic
Synthesis", Dritte
Aufl., Greene, T.W. und Wuts, P.G., Hrsg., John Wiley & Sons, New York:
1999, beschrieben, dessen gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen
ist.
-
Man
ist sich bewusst, dass die Verbindungen, wie hier beschrieben, mit
jeglicher Anzahl an Substituenten oder funktionellen Einheiten substituiert
sein können,
wie in Zusammenhang mit speziellen erfindungsgemäßen Klassen, Unterklassen oder
Spezies angegeben ist. Im Allgemeinen bezeichnen der Begriff „substituiert", ob der Begriff „gegebenenfalls" vorausgeht oder
nicht, und in den erfindungsgemäßen Formeln
enthaltene Substituenten den Ersatz von Wasserstoffresten in einer
gegebenen Struktur durch den Rest eines genau angegebenen Substituenten.
Wenn mehr als eine Position in jeglicher gegebenen Struktur mit
mehr als einem Substituenten, ausgewählt aus einer genau angegebenen
Gruppe, substituiert sein kann, kann der Substituent an jeder Position
entweder gleich oder verschieden sein. Wie hier verwendet, soll
der Begriff „substituiert" alle zulässigen Substituenten
der organischen Verbindungen einschließen. Allgemein schließen die
zulässigen Substituenten
acyclische und cyclische, verzweigte und unverzweigte, carbocyclische
und heterocyclische, aromatische und nicht-aromatische Substituenten
der organischen Verbindungen ein. Für die Zwecke dieser Erfindung
können
Heteroatome wie z.B. Stickstoff Wasserstoffsubstituenten und/oder
jegliche hier beschriebenen zulässigen
Substituenten der organischen Verbindungen tragen, die die Valenzen
der Heteroatome absättigen.
Darüber
hinaus soll diese Erfindung auf keine Weise durch die zulässigen Substituenten
der organischen Verbindungen eingeschränkt werden. Kombinationen von
Substituenten und Variablen, die von dieser Erfindung ins Auge gefasst
werden, sind vorzugsweise diejenigen, die zur Bildung stabiler Verbindungen
führen,
die in der Behandlung von mit Knochen in Beziehung stehenden Störungen und
Krebs oder zur Hemmung von einer oder mehreren Proteinkinasen verwendbar
sind. Der Begriff „stabil", wie hier verwendet,
bezeichnet vorzugsweise Verbindungen, die ausreichende Stabilität besitzen,
um die Herstellung zu ermöglichen,
und die die Unversehrtheit der Verbindung für einen ausreichenden Zeitraum
aufrechterhalten, um nachgewiesen zu werden, und vorzugsweise für einen
ausreichenden Zeitraum, um für
einen oder mehrere der hier ausführlich beschriebenen
Zwecke verwendbar zu sein.
-
Der
Begriff „aliphatisch", wie hier verwendet,
schließt
sowohl gesättigte
als auch ungesättigte,
geradkettige (d.h. unverzweigte), verzweigte, cyclische oder polycyclische
aliphatische Kohlenwasserstoffe ein, die gegebenenfalls mit einer
oder mehreren funktionellen Gruppen substituiert sind. Wie sich
der Fachmann mit normalen Kenntnissen bewusst werden wird, soll „aliphatisch" hier Alkyl-, Alkenyl-,
Alkinyl-, Cycloalkyl-, Cycloalkenyl- und Cycloalkinyleinheiten einschließen, ist
aber nicht darauf beschränkt.
Somit schließt,
wie hier verwendet, der Begriff „Alkyl" sowohl geradkettige, verzweigte als
auch cyclische Alkylreste ein. Eine analoge Vereinbarung gilt für andere
generische Begriffe wie z.B. „Alkenyl", „Alkinyl" und dergleichen.
Der Leser sollte beachten, dass, obwohl die Begriffe „Alkyl", „Alkenyl", „Alkinyl" und dergleichen
oft verwendet werden, um im Übrigen
unsubstituierte Kohlenwasserstoffe zu beschreiben, dieses Dokument
jene Begriffe mit Bezug auf die erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet,
um sowohl substituierte als auch unsubstituierte Reste zu umschließen.
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Sofern
nicht anderweitig genau angegebenen, enthalten Alkyl- und andere
aliphatische Reste vorzugsweise 1 bis 8 und oft 1 bis 3 benachbarte
aliphatische Kohlenstoffatome. Veranschaulichende aliphatische Reste
schließen
somit beispielsweise Methyl-, Ethyl-, Allyl, n-Propyl-, Isopropyl-, Cyclopropyl-, -CH2-Cyclopropyl-, Methallyl-, n-Butyl-, sec-Butyl-,
Isobutyl-, tert-Butyl-, Cyclobutyl-, -CH2-Cyclobutyl-,
n-Pentyl-, sec-Pentyl-, Isopentyl-, tert-Pentyl-, Cyclopentyl-, -CH2-Cyclopentyl-,
n-Hexyl-, sec-Hexyl-, Cyclohexyl-, -CH2-Cyclohexyl-Einheiten
und dergleichen, die wieder einen oder mehrere Substituenten tragen
können,
ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Benzyl, Phenethyl, heteroaromatische
Analoga und substituierte Derivate derartiger Einheiten werden somit
als substituierte aliphatische Einheiten betrachtet. Alkenylreste
schließen
beispielsweise Ethenyl, Propenyl, Butenyl, 1-Methyl-2-buten-1-yl und dergleichen
ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Repräsentative Alkinylreste schließen Ethinyl,
2-Propinyl(Propargyl), 1-Propinyl und dergleichen ein, sind aber nicht
darauf beschränkt.
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Der
Begriff „Alkoxy" oder „Thioalkyl", wie hier verwendet,
bezeichnet einen Alkylrest, wie vorher definiert, der durch ein
Sauerstoffatom oder durch ein Schwefelatom an die Stammmoleküleinheit
gebunden ist. Beispiele für
Alkoxy schließen
Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Isopropoxy, n-Butoxy, tert-Butoxy, Neopentoxy
und n-Hexoxy ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Beispiele für Thioalkyl
schließen
Methylthio, Ethylthio, Propylthio, Isopropylthio, n-Butylthio und
dergleichen ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
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Der
Begriff „Alkylamino" bezeichnet einen
Rest, der die Struktur -NHR' aufweist,
wobei R' Alkyl ist,
wie hier definiert. Beispiele für
Alkylamino schließen
Methylamino, Ethylamino, iso-Propylamino
und dergleichen ein, sind aber nicht darauf beschränkt. In
bestimmten Ausführungsformen
werden in der vorliegenden Erfindung C1-C3-Alkylaminoreste genutzt.
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Manche
Beispiele für
Substituenten für
die vorstehend beschriebenen aliphatischen (und anderen) Einheiten
der erfindungsgemäßen Verbindungen
schließen
ein, sind aber nicht beschränkt
auf F, Cl, Br, I, OH, NO2, CN, C(O)-Alkyl,
C(O)-Aryl, C(O)-Heteroaryl, CO2-Alkyl, CO2-Aryl, CO2-Heteroaryl,
CONH2, CONH-Alkyl, CONH-Aryl, CONH-Heteroaryl,
OC(O)-Alkyl, OC(O)-Aryl,
OC(O)-Heteroaryl, OCO2-Alkyl, OCO2-Aryl, OCO2-Heteroaryl,
OCONH2, OCONH-Alkyl, OCONH-Aryl, OCONH-Heteroaryl,
NHC(O)-Alkyl, NHC(O)-Aryl, NHC(O)-Heteroaryl, NHCO2-Alkyl,
NHCO2-Aryl, NHCONH-Heteroaryl, SO2-Alkyl, SO2-Aryl,
C3-C6-Cycloalkyl, CF3, CH2CF3,
CHCl2, CH2OH, CH2CH2OH, CH2NH2, CH2SO2CH3, Aryl, Heteroaryl,
Benzyl, Benzyloxy, Aryloxy, Heteroaryloxy, Alkoxy, Methoxymethoxy,
Methoxyethoxy, Amino, Benzylamino, Arylamino, Heteroarylamino, Alkylamino,
Thio, Arylthio, Heteroarylthio, Benzylthio, Alkylthio oder Methylthiomethyl.
Zusätzliche
Beispiele für allgemein
anwendbare Substituenten werden durch die in den Beispielen, die
hier beschrieben werden, gezeigten spezifischen Ausführungsformen
veranschaulicht.
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Im
Allgemeinen bezeichnen die Begriffe „Aryl" und „Heteroaryl", wie hier verwendet,
stabile mono- oder polycyclische, heterocyclische, polycyclische
und polyheterocyclische ungesättigte
Einheiten, die vorzugsweise 3 bis 14 Kohlenstoffatome aufweisen,
von denen jedes substituiert oder unsubstituiert sein kann. Substituenten
schließen
jeglichen der zuvor erwähnten
Substituenten, d.h. die für
aliphatische Einheiten oder für
andere Einheiten, wie hier offenbart, aufgezählten Substituenten, die zur
Bildung einer stabilen Verbindung führen, ein, sind aber nicht
darauf beschränkt.
In bestimmten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung bezeichnet „Aryl" ein mono- oder bicyclisches carbocyclisches
Ringsystem mit einem oder zwei aromatischen Ringen, einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf Phenyl, Naphthyl, Tetrahydronaphthyl, Indanyl, Indenyl und dergleichen.
In bestimmten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff „Heteroaryl", wie hier verwendet,
ein cyclisches aromatisches Radikal mit fünf bis zehn Ringatomen, von
denen ein Ringatom ausgewählt
ist aus S, 0 und N; kein, ein oder zwei Ringatome sind zusätzliche
Heteroatome, unabhängig
ausgewählt
aus S, O und N; und die restlichen Ringatome sind Kohlenstoff wobei
das Radikal über
jedes beliebige der Ringatome an den Rest des Moleküls gebunden
ist, wie beispielsweise Pyridyl, Pyrazinyl, Pyrimidinyl, Pyrrolyl,
Pyrazolyl, Imidazolyl, Thiazolyl, Oxazolyl, Isooxazolyl, Thiadiazolyl,
Oxadiazolyl, Thiophenyl, Furanyl, Chinolinyl, Isochinolinyl und
dergleichen.
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Man
ist sich bewusst, dass Aryl- und Heteroarylreste (einschließlich bicyclischer
Arylreste) unsubstituiert oder substituiert sein können, wobei
die Substitution den Ersatz von einem, zwei oder drei der Wasserstoffatome
darauf unabhängig
durch eine oder mehrere beliebige der folgenden Einheiten einschließt, einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf F, Cl, Br, I, OH, NO2, CN, C(O)-Alkyl,
C(O)-Aryl, C(O)-Heteroaryl, CO2-Alkyl, CO2-Aryl, CO2-Heteroaryl,
CONH2, CONH-Alkyl, CONH-Aryl, CONH-Heteroaryl,
OC(O)-Alkyl, OC(O)-Aryl, OC(O)-Heteroaryl, OCO2-Alkyl,
OCO2-Aryl, OCO2-Heteroaryl,
OCONH2, OCONH-Alkyl, OCONH-Aryl, OCONH-Heteroaryl,
NHC(O)-Alkyl, NHC(O)-Aryl, NHC(O)-Heteroaryl, NHCO2-Alkyl,
NHCO2-Aryl, NHCONH-Heteroaryl, SO2-Alkyl, SO2-Aryl,
C3-C6-Cycloalkyl,
CF3, CH2CF3, CHCl2, CH2OH, CH2CH2OH, CH2NH2, CH2SO2CH3, Aryl, Heteroaryl, Benzyl, Benzyloxy, Aryloxy,
Heteroaryloxy, Alkoxy, Methoxymethoxy, Methoxyethoxy, Amino, Benzylamino,
Arylamino, Heteroarylamino, Alkyl-amino, Thio, Arylthio, Heteroarylthio,
Benzylthio, Alkylthio oder Methylthiomethyl. Zusätzliche Beispiele für allgemein
anwendbare Substituenten werden durch die in den Beispielen, die
hier beschrieben werden, gezeigten spezifischen Ausführungsformen
veranschaulicht.
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Der
Begriff „Cycloalkyl", wie hier verwendet,
bezeichnet ausdrücklich
Reste mit drei bis sieben, vorzugsweise drei bis zehn Kohlenstoffatomen.
Geeignete Cycloalkyle schließen
Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl und
dergleichen ein, die, wie im Fall der anderen aliphatischen, heteroaliphatischen
oder heteroyclischen Einheiten, gegebenenfalls substituiert sein
können,
sind aber nicht darauf beschränkt.
F, Cl, Br, I, OH, NO2, CN, C(O)-Alkyl, C(O)-Aryl,
C(O)-Heteroaryl, CO2-Alkyl, CO2-Aryl,
CO2-Heteroaryl, CONH2,
CONH-Alkyl, CONH-Aryl,
CONH-Heteroaryl, OC(O)-Alkyl, OC(O)-Aryl, OC(O)-Heteroaryl, OCO2-Alkyl,
OCO2-Aryl, OCO2-Heteroaryl,
OCONH2, OCONH-Alkyl, OCONH-Aryl, OCONH-Heteroaryl, NHC(O)-Alkyl,
NHC(O)-Aryl, NHC(O)-Heteroaryl, NHCO2-Alkyl,
NHCO2-Aryl, NHCONH-Heteroaryl, SO2-Alkyl, SO2-Aryl,
C3-C6-Cycloalkyl,
CF3, CH2CF3, CHCl2, CH2OH, CH2CH2OH, CH2NH2, CH2SO2CH3, Aryl, Heteroaryl, Benzyl, Benzyloxy, Aryloxy,
Heteroaryloxy, Alkoxy, Methoxymethoxy, Methoxyethoxy, Amino, Benzylamino, Arylamino,
Heteroarylamino, Alkylamino, Thio, Arylthio, Heteroarylthio, Benzylthio,
Alkylthio oder Methylthiomethyl. Zusätzliche Beispiele für allgemein
anwendbare Substituenten werden durch die in den Beispielen, die hier
beschrieben werden, gezeigten spezifischen Ausführungsformen veranschaulicht.
-
Der
Begriff „heteroaliphatisch", wie hier verwendet,
bezeichnet aliphatische Einheiten, die ein oder mehrere Sauerstoff-,
Schwefel-, Stickstoff-, Phosphor- oder Siliciumatome enthalten,
z.B. anstelle von Kohlenstoffatomen. Heteroaliphatische Einheiten
können
verzweigt, unverzweigt oder cyclisch sein und schließen gesättigte und
ungesättigte
Heterocyclen wie z.B. Morpholino, Pyrrolidinyl etc. ein. In bestimmten
Ausführungsformen
sind die heteroaliphatischen Einheiten substituiert durch unabhängigen Ersatz
von einem oder mehreren der Wasserstoffatome darauf durch eine oder
mehrere Einheiten, einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf F, Cl, Br, I, OH, NO2, CN, C(O)-Alkyl,
C(O)-Aryl, C(O)-Heteroaryl, CO2-Alkyl, CO2-Aryl, CO2-Heteroaryl,
CONH2, CONH-Alkyl, CONH-Aryl, CONH-Heteroaryl,
OC(O)-Alkyl, OC(O)-Aryl, OC(O)-Heteroaryl,
OCO2-A1kyl, OCO2-Aryl,
OCO2-Heteroaryl, OCONH2,
OCONH-Alkyl, OCONH-Aryl,
OCONH-Heteroaryl, NHC(O)-Alkyl, NHC(O)-Aryl, NHC(O)-Heteroaryl,
NHCO2-Alkyl, NHCO2-Aryl,
NHCONH-Heteroaryl, SO2-Alkyl, SO2-Aryl, C3-C6-Cycloalkyl, CF3,
CH2CF3, CHCl2, CH2OH, CH2CH2OH, CH2NH2, CH2SO2CH3, Aryl, Heteroaryl,
Benzyl, Benzyloxy, Aryloxy, Heteroaryloxy, Alkoxy, Methoxymethoxy,
Methoxyethoxy, Amino, Benzylamino, Arylamino, Heteroarylamino, Alkylamino,
Thio, Arylthio, Heteroarylthio, Benzylthio, Alkylthio oder Methylthiomethyl.
Zusätzliche
Beispiele für
allgemein anwendbare Substituenten werden durch die in den Beispielen,
die hier beschrieben werden, gezeigten spezifischen Ausführungsformen
veranschaulicht.
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Der
Begriff „Halogen", wie hier verwendet,
bezeichnet ein aus Fluor, Chlor, Brom und Iod ausgewähltes Atom.
-
Der
Begriff „Halogenalkyl" bezeichnet einen
Alkylrest, wie vorstehend definiert, mit einem, zwei oder drei daran
gebundenen Halogenatomen und wird durch derartige Reste wie Chlormethyl,
Bromethyl, Trifluormethyl und dergleichen beispielhaft dargestellt.
-
Der
Begriff „Heterocycloalkyl" oder „Heterocyclus", wie hier verwendet,
bezeichnet einen nicht-aromatischen 5-, 6- oder 7-gliedrigen Ring
oder einen bi- oder tri-cyclischen Rest, der kondensierte sechsgliedrige Ringe
mit zwischen einem und drei Heterotamen, unabhängig ausgewählt aus Sauerstoff, Schwefel
und Stickstoff umfasst, wobei (i) jeder 5-gliedrige Ring 0 bis 1
Doppelbindung aufweist und jeder 6-gliedrige Ring 0 bis 2 Doppelbindungen
aufweist, (ii) die Stickstoff- und Schwefelheteroatome gegebenenfalls
oxidiert sein können, (iii)
das Stickstoffheteroatom gegebenenfalls quaternisiert sein kann
und (iv) jeder beliebige der vorstehenden heterocyclischen Ringe
an einen Benzolring kondensiert sein kann. Repräsentative Heterocyclen schließen Pyrrolidinyl,
Pyrazolinyl, Pyrazolidinyl, Imidazolinyl, Imidazolidinyl, Piperidinyl,
Piperazinyl, Oxazolidinyl, Isoxazolidinyl, Morpholinyl, Thiazolidinyl,
Isothiazolidinyl und Tetrahydrofuryl ein, sind aber nicht darauf
beschränkt. In
bestimmten Ausführungsformen
wird ein „substituierter
Heterocycloalkyl- oder Heterocyclus-" Rest genutzt und, wie hier verwendet,
bezeichnet einen Heterocycloalkyl- oder Heterocyclusrest, wie vorstehend
definiert, substituiert durch den unabhängigen Ersatz von einem, zwei
oder drei der Wasserstoffatome darauf durch, aber nicht beschränkt auf
F, Cl, Br, I, OH, NO2, CN, C(O)-Alkyl, C(O)-Aryl,
C(O)-Heteroaryl, CO2-Alkyl, CO2-Aryl,
CO2-Heteroaryl, CONH2,
CONH-Alkyl, CONH-Aryl,
CONH-Heteroaryl, OC(O)-Alkyl, OC(O)-Aryl, OC(O)-Heteroaryl, OCO2-Alkyl,
OCO2-Aryl, OCO2-Heteroaryl,
OCONH2, OCONH-Alkyl, OCONH-Aryl, OCONH-Heteroaryl, NHC(O)-Alkyl,
NHC(O)-Aryl, NHC(O)-Heteroaryl, NHCOZ-Alkyl,
NHCO2-Aryl, NHCONH-Heteroaryl, SO2-Alkyl, SO2-Aryl,
C3-C6-Cycloalkyl,
CF3, CH2CF3, CHCl2, CH2OH, CH2CH2OH, CH2NH2, CH2SO2CH3, Aryl, Heteroaryl, Benzyl, Benzyloxy, Aryloxy,
Heteroaryloxy, Alkoxy, Methoxymethoxy, Methoxyethoxy, Amino, Benzylamino,
Arylamino, Heteroarylamino, Alkylamino, Thio, Arylthio, Heteroarylthio,
Benzylthio, Alkylthio oder Methylthiomethyl. Zusätzliche Beispiele für allgemein
anwendbare Substituenten werden durch die in den Beispielen, die
hier beschrieben werden, gezeigten spezifischen Ausführungsformen
veranschaulicht.
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„Phosphor
enthaltende Einheit":
Wie hier verwendet, schließt
die Wendung „Phosphor
enthaltende Einheit" Phosphite,
Phosphonite, Phosphenite, Phosphine, Phosphate, Phosphonate, Phosphenate,
Phosphinoxide, Bisphosphonate, Thiophosphate, Thiophosphonate, Thiophosphenate,
Thiophosphinoxide, Mono- oder (wo erlaubt) Di- oder Tri-amide und
Ester von jedem beliebigen der Vorhergehenden sowie die in Serie
II, IIa, IIb, IIc und III und dem begleitenden Text und in den verschiedenen
hier offenbarten Klassen, Unterklassen und Spezies der Verbindungen
offenbarten Phosphor enthaltenden Einheiten ein, ist aber nicht
darauf beschränkt.
-
4. Syntheseüberblick
-
Der
Praktiker hat eine gut etablierte Literatur der Purinchemie von
der er, in Kombination mit der Information, die in den vielen, folgenden
Beispielen enthalten ist, zur Orientierung über Synthesestrategien, Schutzgruppen
und andere Materialien und Verfahren, die zur Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen,
einschließlich
RA-, RB-, RC- und RD-Substituenten
enthaltender Verbindungen, verwendbar sind, Gebrauch machen kann.
Die folgenden Literaturstellen und die darin zitierten Literaturstellen
können
von besonderem Interesse sein: US-Patente Nr. 5,365,886; 5,434,150;
5,565,566; 5,869,468; 6,057,305; 5,444,068; 5,635,525; 5,866,702;
5,962,479; 6,057,326; 5,994,361; 6,110,923; 6,028,076; 6,084,095
und 6,107,300; WO 00/43394, 90/09178, 00/44750, 97/49689, 95/35297,
95/19774, 97/35539, 97/16452, 00/49018, 97/20842, 98/16528, 99/07705,
99/62908 und 00/55161 und EP 155911, 478292, 531597, 853084, 454427,
778277, 773023 und 882727.
-
Verschiedene
Lösungsphasen-
und Festphasensynthesen werden in Einzelheiten in den Beispielen, die
folgen, offenbart, welche interessante und hilfreiche Beispiele
für viele
repräsentative
chemische Umwandlungen und Totalsynthesen bereitstellen.
-
Lösungsphasen-Umwandlungen
schließen
unter anderem Schemata, die auf den folgenden basieren, ein: A.
Anbindung einer aliphatischen Einheit an das Ringatom #2 eines Purins:
-
Diese
Methode stellt ein generisches Mittel zur Anbindung einer aliphatischen
Einheit an die Purinposition 2 durch eine Kohlenstoff-Kohlenstoffbindung
bereit. B.
Herstellung von Thioanaloga
C.
Ausarbeitung von R
C-Einheiten Syntheseschema:
andere
Beispiele:
Andere
veranschaulichende anionische Reste:
-
In
dem vorstehenden Schema ist M ein Spacer zwischen dem Purin und
dem anionischen Rest und kann ein substituierter oder unsubstituierter
aliphatischer, heteroaliphatischer, Aryl- oder Heteroarylrest sein und
somit C-C-, O-C-, N-C- und S-C-Verknüpfungen zu dem Kohlenstoffatom
an Position 2 des Purinrings bereitstellen. Um dies weiter zu veranschaulichen,
ein 1-Amino-2-halogenethan kann mit einer herkömmlichen Boc-gruppe N-geschützt, danach
in das ZnHalogenreagenz umgewandelt, auf dem in vorstehendem Schema A
gezeigten Weg an das gewünschte
2-Jodpurin angebunden, danach von Schutzgruppen befreit werden.
Der gleiche Weg kann für
aliphatische Einheiten, die andere Substituenten tragen (geschützt, wenn
es angebracht ist), verwendet werden.
-
D. Herstellung von „P-N-P"-Einheiten
-
(R1O)2PO-NR-PO(OR1)2 enthaltende Verbindungen
können
aus den entsprechenden Aminen mit (RO)2ClP,
wie in Phosphorus, Sulfur Silicon Relat. Elem. 91(1-4), 169-77 (1994)
beschrieben, hergestellt werden.
-
Zusätzliche
Syntheseanleitung wird in den Beispielen, die folgen, bereitgestellt,
gerade vor den Ansprüchen.
-
5. Prodrugs
-
Zahlreiche
geeignete Prodrugeinheiten und Information, die deren Auswahl, Synthese
und Verwendung betrifft, sind gut bekannt, angefangen mit Niederalkylestern
von Phosphonaten und verwandten Einheiten. Andere Prodrugeinheiten
von Interesse schließen
die folgenden ein:
-
6. Verwendungen, Formulierungen,
Verabreichung
-
Arzneimittel
-
Wie
vorstehend diskutiert, stellt diese Erfindung neue Verbindungen
bereit, die biologische Eigenschaften aufweisen, die sie für die Behandlung
von Knochenstörungen
und Krebs interessant machen. Jene biologischen Eigenschaften schließen unter
anderem Anti-Resorptionsaktivität in verschiedenen
Knochenresorptionstests und Aktivität gegen Krebszellen ein. Demgemäß werden
in einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung Arzneimittel bereitgestellt, die eine
beliebige der hier beschriebenen Verbindungen (oder ein Prodrug,
pharmazeutisch verträgliches
Salz oder ein anderes pharmazeutisch verträgliches Derivat davon) umfassen
und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen. In bestimmten Ausführungsformen
umfassen diese Zusammensetzungen gegebenenfalls weiterhin ein oder
mehrere zusätzliche
Therapeutika. In einer anderen Ausführungsform kann eine erfindungsgemäße Verbindung
an einen Patienten, der dessen bedarf, verabreicht werden, in Kombination
mit der Verabreichung eines oder mehrerer anderer Therapeutika.
Beispielsweise können
zusätzliche
Therapeutika zur gemeinsamen Verabreichung oder der Einschluss mit
einer erfindungsgemäßen Verbindung
in ein Arzneimittel ein Wirkstoff gegen Krebs oder ein zugelassener
Wirkstoff für
die Behandlung einer Knochenstörung
sein, wie hier in größeren Einzelheiten
diskutiert.
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Man
ist sich auch bewusst, dass bestimmte der erfindungsgemäßen Verbindungen
in freier Form für die
Behandlung oder ggf. als ein pharmazeutisch verträgliches
Derivat davon vorkommen können.
Gemäß der vorliegenden
Erfindung schließt
ein pharmazeutisch verträgliches
Derivat pharmazeutisch verträgliche
Salze, Ester, Salze von derartigen Estern oder ein Prodrug oder
anderes Addukt oder Derivat einer erfindungsgemäßen Verbindung ein, das bei
Verabreichung an einen Patienten, der dessen bedarf, fähig ist,
direkt oder indirekt eine Verbindung, wie anderweitig hier beschrieben,
oder einen Metaboliten oder Rest davon bereitzustellen, ist aber
nicht darauf beschränkt.
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Wie
hier verwendet, bezeichnet der Begriff „pharmazeutisch verträgliches
Salz" diejenigen
Salze, die im Rahmen des gesunden ärztlichen Urteils für die Verwendung
in Kontakt mit den Geweben von Menschen und niederen Tieren ohne übermäßige Toxizität, Reizung,
allergische Reaktion und dergleichen geeignet sind und ein angemessenes,
vernünftiges
Nutzen/Risiko-Verhältnis aufweisen.
Pharmazeutisch verträgliche
Salze von Phosphonaten und anderen Phosphor enthaltenden Verbindungen,
Aminen, Carbonsäuren
und andern Arten von Verbindungen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
Beispielsweise beschreiben S. M. Berge, et al. pharmazeutisch verträgliche Salze
in Einzelheiten in J. Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19 (1977),
hier durch Bezugnahme aufgenommen. Die Salze können in situ während der
letzten Isolierung und Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindungen
hergestellt werden oder separat, indem die freie Basenfunktion mit
einer geeigneten organischen Säure
umgesetzt wird. Beispiele für
pharmazeutisch verträgliche,
ungiftige Säureadditionssalze
sind Salze einer Aminogruppe, gebildet mit anorganischen Säuren wie
z.B. Salzsäure,
Bromwasserstoffsäure,
Phosphorsäure,
Schwefelsäure
und Perchlorsäure
oder mit organischen Säuren
wie z.B. Essigsäure, Oxalsäure, Maleinsäure, Weinsäure, Citronensäure, Bernsteinsäure oder
Malonsäure
oder durch Verwendung anderer Verfahren, die auf dem Fachgebiet
verwendet werden, wie z.B. Ionenaustausch. Andere pharmazeutisch
verträgliche
Salze schließen
Adipat-, Alginat-, Ascorbat-, Aspartat-, Benzolsulfonat-, Benzoat-,
Bisulfat-, Borat-, Butyrat-, Camphorat-, Camphersulfonat-, Citrat-,
Cyclopentanpropionat-, Digluconat-, Dodecylsulfat-, Ethansulfonat-,
Formiat-, Fumarat-, Glucoheptonat-, Glycerophosphat-, Gluconat-,
Hernisulfat-, Heptanoat-, Hexanoat-, Hydrojodid-, 2-Hydroxyethansulfonat-,
Lactobionat-, Lactat-, Laurat-, Laurylsulfat-, Malat-, Maleat-, Malonat-,
Methansulfonat-, 2-Naphthalinsulfonat-, Nicotinat-, Nitrat-, Oleat-,
Oxalat-, Palmitat-, Pamoat-, Pektinat-, Persulfat-, 3-Phenylpropionat-,
Phosphat-, Pikrat-, Pivalat-, Propionat-, Stearat-, Succinat-, Sulfat-,
Tartrat-, Thiocyanat-, p-Toluolsulfonat-, Undecanoat-, Valeratsalze
und dergleichen ein. Repräsentative
Alkali- oder Erdalkalimetallsalze schließen Natrium-, Lithium-, Kalium-,
Calcium-, Magnesiumsalze und dergleichen ein. Weitere pharmazeutisch
verträgliche
Salze schließen
ggf. ungiftige Ammonium-, quartäre
Ammonium- und Aminkationen,
gebildet unter Verwendung von Gegenionen wie z.B. einem Halogenid,
Hydroxid, Carboxylat, Sulfat, Phosphat, Nitrat, Niederalkylsulfonat
und Arylsulfonat, ein.
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Zusätzlich bezeichnet,
wie hier verwendet, der Begriff „pharmazeutisch verträglicher
Ester" Ester, die in
vivo hydrolisieren, und schließt
diejenigen ein, die ohne weiteres im menschlichen Körper gespalten
werden und die Stammverbindung oder ein Salz davon zurücklassen.
Geeignete Esterreste schließen
beispielsweise diejenigen ein, die sich von pharmazeutisch verträglichen
aliphatischen Carbonsäuren
ableiten, insbesondere Alkan-, Alken-, Cycloalkan- und Alkandisäuren, in
denen jede Alkyl- oder Alkenyleinheit vorteilhafterweise nicht mehr
als 6 Kohlenstoffatome aufweist. Beispiele für spezielle Ester schließen Formiate,
Acetate, Propionate, Butyrate, Acrylate und Ethylsuccinate ein.
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Wie
vorstehend beschrieben, umfassen die erfindungsgemäßen Arzneimittel
zusätzlich
einen pharmazeutisch verträglichen
Träger,
der, wie hier verwendet, jegliche und alle Lösungsmittel, Verdünnungsmittel oder
anderes flüssiges
Vehikel, Dispergier- oder Suspendierhilfsstoffe, grenzflächenaktive
Mittel, isotonische Mittel, Verdickungsmittel oder Emulgatoren,
Konservierungsstoffe, feste Bindemittel, Schmiermittel und dergleichen,
wie für
die spezielle gewünschte
Darreichungsform geeignet, einschließt. Remington's Pharmaceutical
Sciences, 15. Auflage, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton,
Pa., 1975) offenbart verschiedene Träger, die bei der Formulierung
von Arzneimitteln verwendet werden, und bekannte Techniken für die Herstellung davon.
Außer
sofern ein beliebiges herkömmliches
Trägermedium
mit den antiviralen erfindungsgemäßen Verbindungen inkompatibel
ist, wie z.B. indem es eine unerwünschte biologische Wirkung
hervorruft oder anderweitig nachteilig mit (einer) beliebigen anderen
Komponente(n) des Arzneimittels interagiert, wird dessen Verwendung
als innerhalb des Umfangs dieser Erfindung befindlich betrachtet.
Manche Beispiele für
Materialien, die als pharmazeutisch verträgliche Träger dienen können, schließen ein,
sind aber nicht beschränkt
auf, Zucker wie z.B. Lactose, Glucose und Saccharose; Stärken wie
z.B. Maisstärke
und Kartoffelstärke;
Cellulose und ihre Derivate wie z.B. Natriumcarboxymethylcellulose,
Ethylcellulose und Celluloseacetat; Tragantpulver; Malz; Gelatine;
Talkum; Excipienten wie z.B. Kakaobutter und Suppositorienwachse; Öle wie z.B.
Erdnussöl, Baumwollsamenöl; Safloröl; Sesamöl; Olivenöl; Maisöl und Sojabohnenöl; Glykole
wie z.B. Propylenglykol; Ester wie z.B. Ethyloleat und Ethyllaurat;
Agar; Puffersubstanzen wie z.B. Magnesiumhydroxid und Aluminiumhydroxid;
Alginsäure;
pyrogenfreies Wasser; isotonische Kochsalzlösung; Ringerlösung; Ethylalkohol
und Phosphatpufferlösungen
sowie andere ungiftige, kompatible Schmiermittel wie z.B. Natriumlaurylsulfat
und Magnesiumstearat sowie Farbstoffe, Freisetzungsmittel, Beschichtungsmittel,
Süß-, Geschmacks-
und Duftstoffe, Konservierungsstoffe und Antioxidantien können, gemäß dem Urteil
des Herstellers auch in der Zusammensetzung vorhanden sein.
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Verwendungen
erfindungsgemäßer Verbindungen
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Wie
hier diskutiert, ist von den erfindungsgemäßen Verbindungen gezeigt worden,
dass sie die Tyrosinkinaseaktivität von Src, unter anderen Tyrosinkinasen,
hemmen (siehe hier die beispielhafte Darstellung). Von verschiedenen
erfindungsgemäßen Verbindungen
ist gezeigt worden, dass sie die Osteoklastenaktivität hemmen
und das Gleichgewicht zwischen Knochenresorption und Knochenwachstum
zum Positiven neigen, d.h. weg vom Netto-Knochenverlust. Als solche können die
erfindungsgemäßen Verbindungen
in der Behandlung von Knochenstörungen
verwendbar sein. Es ist derzeit bevorzugt, dass die Verbindungen,
die für
derartige Indikationen verwendet werden, erfindungsgemäße Verbindungen
sind, die eine oder mehrere freie OH- oder SH-Gruppen auf den, oder
angrenzend an die, Phosphor enthaltende(n) Einheit oder Einheiten,
die diese Verbindungen kennzeichnen, aufweisen. Somit werden derartige
Verbindungen oft eine oder mehrere -YR1-Einheiten,
in welchen R1 für H steht, enthalten. In einer
anderen Ausführungsform
können
auch Prodrugs derartiger Verbindungen gewählt werden. In jedem Fall wird
eine therapeutisch wirksame Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung
an ein Individuum, das dessen bedarf, als eine Methode zur Behandlung
der Knochenstörung
des Individuums verabreicht.
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Von
einer Reihe von erfindungsgemäßen Verbindungen
ist auch festgestellt worden, dass sie wirksame in-vitro-Aktivität gegen
Krebszelllinien, einschließlich
unter anderem K-562-Leukämiezellen, NCI-H249-Lungenkrebszellen,
T-47D-Brusttumorzellen und vielen anderen, besitzt. Beobachtete
Wirksamkeiten waren in herkömmlichen
in-vitro-Tests ungefähr
so niedrig wie 0,1 μM.
Derartige Verbindungen können
somit zur Behandlung von Krebs verwendbar sein und stellen zusätzlich Verfahren
für die
Hemmung von Zell- (vorzugsweise Tumor-) wachstum bereit und stellen
Verfahren für
das Abtöten
von Tumorzellen bereit. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst das Verabreichen
einer therapeutisch wirksamen Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung
an ein Individuum, das dessen bedarf. Es ist derzeit bevorzugt,
dass in einem oder mehreren jeglicher in der Verbindung für diese
Indikation vorhandenen – YR1-Reste R1 von H
verschieden ist.
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In
bestimmten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung ist eine „therapeutisch wirksame Menge" der Erfindungsverbindung
oder des Arzneimittels die Menge, die nachweisbar für die Abtötung von
Tumorzellen oder die Hemmung ihres Wachstums wirksam ist, oder sie
ist eine Menge, die für
die Hemmung der Osteoklastenaktivität wirksam ist, wobei man von
dieser Aktivität
glaubt, dass sie an der Auswirkung von Knochenstörungen beteiligt ist, obwohl
die vorliegende Erfindung nicht an irgendeine spezielle Theorie
gebunden sein soll.
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Die
Verbindungen und Zusammensetzungen können gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren
mit jeglicher Menge und auf jeglichem Weg der Verabreichung, die
für die
Abtötung
von Tumorzellen oder die Hemmung ihres Wachstums oder zur Behandlung
von Knochenstörungen
wirksam sind, verabreicht werden. Somit bezeichnet der Ausdruck „wirksame
Menge", wie hier
verwendet, eine ausreichende Menge an Wirkstoff, um Tumorzellen
abzutöten
oder ihr Wachstum zu hemmen oder um Knochenstörungen zu behandeln und/oder
ihnen vorzubeugen. Die genaue notwendige Menge wird von Individuum
zu Individuum variieren, je nach Spezies, Alter und Allgemeinzustand
des Individuums, der Schwere der Infektion, dem speziellen Wirkstoff
gegen Krebs, dessen Art der Verabreichung und dergleichen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen
gegen Krebs werden vorzugsweise in Dosierungseinheit-Form wegen
der Leichtigkeit der Verabreichung und Einheitlichkeit der Dosierung
formuliert. Der Ausdruck „Dosierungseinheit-Form", wie hier verwendet,
bezeichnet eine physikalisch abgeteilte Einheit des Wirkstoffs gegen
Krebs, der für
den zu behandelnden Patienten angemessen ist. Es versteht sich jedoch
von selbst, dass der Gesamttagesgebrauch der erfindungsgemäßen Verbindungen
und Zusammensetzungen von dem behandelnden Arzt im Rahmen des gesunden ärztlichen
Urteils bestimmt werden wird. Die spezifische therapeutisch wirksame
Dosishöhe
für jeden
speziellen Patienten oder Organismus wird von vielen verschiedenen
Faktoren abhängen,
einschließlich
der Störung,
die behandelt wird, und der Schwere der Störung; der Aktivität der eingesetzten
spezifischen Verbindung; der eingesetzten spezifischen Zusammensetzung;
dem Alter, Körpergewicht,
allgemeinen Gesundheitszustand, Geschlecht und der Ernährung des
Patienten; dem Zeitpunkt der Verabreichung, Weg der Verabreichung
und der Ausscheidungsrate der eingesetzten spezifischen Verbindung;
der Behandlungsdauer; den in Kombination oder zufällig mit
der eingesetzten spezifischen Verbindung verwendeten Arzneistoffen;
und ähnlicher,
in der Medizin gut bekannter Faktoren.
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Darüber hinaus
können
nach der Formulierung mit einem angemessenen pharmazeutisch verträglichen
Träger
in einer gewünschten
Dosierung die erfindungsgemäßen Arzneimittel
an Menschen und andere Tiere oral, rektal, parenteral, intrazisternal,
intravaginal, intraperitoneal, topisch (wie durch Pulver, Salben,
oder Tropfen), bukkal, als Mund- oder Nasenspray oder dergleichen
verabreicht werden, je nach der Schwere der Infektion, die behandelt
wird. In bestimmten Ausführungsformen
können
die erfindungsgemäßen Verbindungen
oral oder parenteral mit Dosierungshöhen von etwa 0,01 mg/kg bis
etwa 50 mg/kg und vorzugsweise von etwa 1 mg/kg bis etwa 25 mg/kg
des Körpergewichts
des Individuums pro Tag einmal oder mehrmals am Tag verabreicht
werden, um die gewünschte
therapeutische Wirkung zu erhalten.
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Flüssige Darreichungsformen
zur oralen Verabreichung schließen
pharmazeutisch verträgliche
Emulsionen, Mikroemulsionen, Lösungen,
Suspensionen, Sirupe und Elixiere ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Außer den
Wirkverbindungen können
die flüssigen
Darreichungsformen auf dem Fachgebiet gebräuchliche inerte Verdünnungsmittel
wie beispielsweise Wasser oder andere Lösungsmittel, Lösungsvermittler
und Emulgatoren wie z.B. Ethylalkohol, Isopropylalkohol, Ethylcarbonat,
Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglykol, 1,3-Butylenglykol,
Dimethylformamid, Öle
(im Besonderen Baumwollsamen-, Erdnuss-, Mais-, Keim-, Oliven-,
Rizinus- und Sesamöl),
Glycerin, Tetrahydrofurfurylalkohol, Polyethylenglykole und Sorbitanfettsäureester
und Gemische davon enthalten. Außer inerten Verdünnungsmitteln
können
die Zusammensetzungen zum Einnehmen auch Hilfsstoffe wie z.B. Netzmittel,
Emulgatoren und Suspendiermittel, Süß-, Geschmacks- und Duftstoffe
einschließen.
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Injektionspräparate,
beispielsweise sterile injizierbare wässrige oder ölige Suspensionen,
können
gemäß der bekannten
Technik mit geeigneten Dispergier- oder Netzmitteln und Suspendiermitteln
formuliert werden. Das sterile Injektionspräparat kann auch eine sterile
injizierbare Lösung,
Suspension oder Emulsion in einem ungiftigen, parenteral verträglichen
Verdünnungsmittel
oder Lösungsmittel
sein, beispielsweise als eine Lösung
in 1,3-Butandiol. Unter den verträglichen Vehikeln und Lösungsmitteln,
die eingesetzt werden können, sind
Wasser, Ringerlösung,
Natriumchloridlösung
nach U.S.P. und isotonische Natriumchloridlösung. Außerdem werden sterile, fette Öle herkömmlich als
ein Lösungsmittel
oder Suspensionsmedium eingesetzt. Für diesen Zweck kann jegliches
milde, fette Öl
eingesetzt werden, einschließlich
synthetischer Mono- oder Diglyceride. Außerdem werden Fettsäuren wie
z.B. Ölsäure bei
der Herstellung von Injektionspräparaten
verwendet.
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Die
injizierbaren Formulierungen können
sterilisiert werden, beispielsweise durch Filtration durch einen
Bakterienfilter oder durch das Einbringen sterilisierender Wirkstoffe
in Form von sterilen festen Zusammensetzungen, die vor Gebrauch
in sterilem Wasser oder einem anderen sterilen, injizierbaren Medium
gelöst oder
dispergiert werden können.
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Um
die Wirkung eines Arzneistoffs zu verlängern, ist es oft wünschenswert,
die Resorption des Arzneistoffs aus der subkutanen oder intramuskulären Injektion
zu verlangsamen. Dies kann durch Verwendung einer flüssigen Suspension
eines kristallinen oder amorphen Materials mit schlechter Wasserlöslichkeit
erreicht werden. Die Resorptionsrate des Arzneistoffs hängt dann
von seiner Lösungsgeschwindigkeit
ab, die wiederum von der Kristallgröße und der kristallinen Form
abhängen
kann. In einer anderen Ausführungsform wird
verzögerte
Resorption einer parenteral verabreichten Arzneistoffform erreicht,
indem der Arzneistoff in einem Öl-Vehikel
gelöst
oder suspendiert wird. Injizierbare Depotformen werden hergestellt,
indem Mikroeinschluss-Matrizen des Arzneistoffs in bioabbaubaren
Polymeren wie z.B. Polylactid-Polyglykolid
gebildet werden. Abhängig
vom Verhältnis
des Arzneistoffs zum Polymer und der Beschaffenheit des eingesetzten
speziellen Polymers kann die Geschwindigkeit der Arzneistofffreisetzung
gesteuert werden. Beispiele für
andere bioabbaubare Polymere schließen Poly(orthoester) und Poly(anhydride)
ein. Injizierbare Depotformulierungen werden auch hergestellt, indem
der Arzneistoff in Liposomen oder Mikroemulsionen, die mit Körpergeweben kompatibel
sind, eingeschlossen wird.
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Zusammensetzungen
für rektale
oder vaginale Verabreichung sind vorzugsweise Zäpfchen, die hergestellt werden
können
durch das Mischen der erfindungsgemäßen Verbindungen mit geeigneten
nicht-reizenden Excipienten oder Trägern wie z.B. Kakaobutter,
Polyethylenglykol oder einem Suppositorienwachs, die bei Umgebungstemperatur
fest, aber bei Körpertemperatur
flüssig
sind und deshalb im Rektum oder der Vagina schmelzen und die Wirkverbindung
freisetzen.
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Feste
Darreichungsformen zur oralen Verabreichung schließen Kapseln,
Tabletten, Pillen, Pulver und Granulate ein. In derartigen festen
Darreichungsformen wird die Wirkverbindung gemischt mit mindestens
einem inerten, pharmazeutisch verträglichen Excipient oder Träger wie
z.B. Natriumcitrat oder Dicalciumphosphat und/oder a) Füllstoffen
oder Streckmitteln wie z.B. Stärken,
Lactose, Saccharose, Glucose, Mannit und Kieselsäure, b) Bindemitteln wie beispielsweise
Carboxymethylcellulose, Alginaten, Gelatine, Polyvinylpyrrolidinon,
Saccharose, und Gummi arabicum, c) Feuchthaltemitteln, wie z.B.
Glycerin, d) Sprengmitteln wie z.B. Agaragar, Calciumcarbonat, Kartoffel-
oder Tapiokastärke,
Alginsäure,
bestimmten Silicaten und Natriumcarbonat, e) Lösungsverzögerern wie z.B. Paraffin, f)
Resorptionsbeschleunigern wie z.B. quartären Ammoniumverbindungen, g)
Netzmitteln wie beispielsweise Cetylalkohol und Glycerinmonostearat,
h) Absorptionsmitteln wie z.B. Kaolin- und Bentonitton, und i) Schmiermitteln
wie z.B. Talkum, Calciumstearat, Magnesiumstearat, festen Polyethylenglykolen,
Natriumlaurylsulfat und Gemischen davon. Im Fall von Kapseln, Tabletten
und Pillen kann die Darreichungsform auch Puffersubstanzen umfassen.
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Feste
Zusammensetzungen einer ähnlichen
Art können
auch als Füllstoffe
in gefüllten
Weich- und Hartgelatinekapseln
unter Verwendung derartiger Excipienten wie Lactose oder Milchzucker
sowie Polyethylenglykolen von hoher relativer Molekülmasse und
dergleichen eingesetzt werden. Die festen Darreichungsformen von
Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen und Granulaten können mit Überzügen und
Hüllen
wie z.B. magensaftresistenten Überzügen und
anderen, auf dem Gebiet der pharmazeutischen Formulierung gut bekannten Überzügen, hergestellt
werden. Sie können
gegebenenfalls Trübungsmittel
enthalten und können
auch so zusammengesetzt sein, dass sie den/die Wirkstoff(e) nur,
oder bevorzugt, in einem bestimmten Teil des Darmtrakts, gegebenenfalls
verzögert,
freisetzen. Beispiele für
Einbettungs-Zusammensetzungen,
die verwendet werden können,
schließen
polymere Substanzen und Wachse ein. Feste Zusammensetzungen einer ähnlichen
Art können
auch als Füllstoffe
in gefüllten
Weich- und Hartgelatinekapseln unter Verwendung derartiger Excipienten
wie Lactose oder Milchzucker sowie von Polyethylenglykolen von hoher
relativer Molekülmasse und
dergleichen eingesetzt werden.
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Die
Wirkverbindungen können
auch in mikroverkapselter Form mit einem oder mehreren Excipienten, wie
vorstehend angegeben, vorliegen. Die festen Darreichungsformen von
Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen und Granulaten können mit Überzügen und
Hüllen
wie z.B. magensaftresistenten Überzügen, die
Freisetzung kontrollierenden Überzügen und
anderen, auf dem Gebiet der pharmazeutischen Formulierung gut bekannten Überzügen hergestellt
werden. In derartigen festen Darreichungsformen kann die Wirkverbindung
mit mindestens einem inerten Verdünnungsmittel wie z.B. Saccharose,
Lactose oder Stärke
zusammengemischt sein. Derartige Darreichungsformen können auch,
wie normalerweise üblich,
zusätzliche
Substanzen außer
den inerten Verdünnungsmitteln
umfassen, z.B. Schmiermittel für
die Tablettierung und andere Hilfsstoffe für die Tablettierung wie z.B.
Magnesiumstearat und mikrokristalline Cellulose. Im Fall von Kapseln,
Tabletten und Pillen können
die Darreichungsformen auch Puffersubstanzen umfassen. Sie können gegebenenfalls
Trübungsmittel enthalten
und können
auch so zusammengesetzt sein, dass sie den/die Wirkstoffe) nur,
oder bevorzugt, in einem bestimmten Teil des Darmtrakts, gegebenenfalls
verzögert,
freisetzen. Beispiele für
Einbettungs-Zusammensetzungen,
die verwendet werden können,
schließen
polymere Substanzen und Wachse ein.
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Darreichungsformen
zur topischen oder transdermalen Verabreichung einer erfindungsgemäßen Verbindung
schließen
Salben, Pasten, Cremes, Lotionen, Gele, Pulver, Lösungen,
Sprays, Inhalationsmittel oder Pflaster ein. Die Wirkkomponente
wird unter sterilen Bedingungen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger und
jeglichen benötigten
Konservierungsstoffen oder Puffersubstanzen, wie es erforderlich
sein kann, zusammengemischt. Ophthalmische Formulierung, Ohrentropfen
und Augentropfen werden auch als innerhalb des Umfangs dieser Erfindung
befindlich betrachtet. Zusätzlich
zieht die vorliegende Erfindung die Verwendung von transdermalen
Pflastern in Betracht, die den zusätzlichen Vorteil aufweisen,
kontrollierte Abgabe einer Verbindung an den Körper bereitzustellen. Derartige
Darreichungsformen können
hergestellt werden, indem die Verbindung in dem richtigen Medium
gelöst
oder verteilt wird. Resorptionverstärker können auch verwendet werden,
um den Fluss der Verbindung durch die Haut zu erhöhen. Die
Geschwindigkeit kann gesteuert werden, indem entweder eine geschwindigkeitskontollierende
Membran bereitgestellt wird oder die Verbindung in einer Polymermatrix
oder einem Gel dispergiert wird.
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Wie
vorstehend diskutiert, sind in einer Ausführungsform die erfindungsgemäßen Verbindungen
als Wirkstoffe gegen Krebs verwendbar und somit können sie
in der Behandlung von Krebs verwendbar sein, indem sie Tumorzelltod
bewirken oder das Wachstum der Tumorzellen hemmen. Im Allgemeinen
sind die Erfindungswirkstoffe gegen Krebs in der Behandlung von
Krebs und anderen proliferativen Störungen verwendbar, einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf Brustkrebs, Gebärmutterhalskrebs,
Dickdarm- und Mastdarmkrebs, Leukämie, Lungenkrebs, Melanom,
multiples Myelom, non-Hodgkin-Lymphom, Eierstockkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs,
Prostatakrebs und Magenkrebs, um einige zu nennen. In bestimmten
Ausführungsformen sind
die Erfindungswirkstoffe gegen Krebs wirksam gegen Leukämiezellen
und Melanomzellen und sind somit für die Behandlung von Leukämien (z.B.
myeloische, lymphatische, granulozytäre und lymphoblastische Leukämie) und
malignen Melanomen verwendbar. In immer noch anderen Ausführungsformen
sind die Erfindungswirkstoffe gegen Krebs gegen solide Tumore wirksam
und töten
auch Zellen, die mehrfach gegen Arzneistoffe resistent sind, (MDR-Zellen)
und/oder hemmen deren Wachstum.
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Es
ist auch selbstverständlich,
dass die erfindungsgemäßen Verbindungen
und Arzneimittel in Kombinationstherapien eingesetzt werden können, das
heißt,
die Verbindungen und Arzneimittel können gleichzeitig mit, vor
oder nach einem oder mehreren anderen gewünschten Therapeutika oder medizinischen
Verfahren verabreicht werden. Die spezielle Kombination von Therapien
(Therapeutika oder Verfahren) zum Einsetzen in einem Kombinationsbehandlungsschema
wird die Kompatibilität
der gewünschten
Therapeutika und/oder Verfahren und die gewünschte therapeutische Wirkung,
die erreicht werden soll, berücksichtigen.
Es ist auch selbstverständlich,
dass die eingesetzten Therapien eine gewünschte Wirkung für dieselbe
Störung
erreichen können
(beispielsweise kann eine Erfindungsverbindung gleichzeitig mit
einem anderen Wirkstoff gegen Krebs verabreicht werden), oder sie
können
verschiedene Wirkungen erreichen (z.B. die Kontrolle jeglicher Nebenwirkungen).
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Beispielsweise
schließen
andere Therapien oder Wirkstoffe gegen Krebs, die in Kombination
mit den Erfindungswirkstoffen gegen Krebs verwendet werden können, ein:
Operation, Radiotherapie (in nur ein paar Beispielen, g-Bestrahlung,
Neutronenstrahlradiotherapie, Elektronenstrahlradiotherapie, Protonentherapie, Brachytherapie
und systemische radioaktive Isotope, um einige zu nennen), endokrine
Therapie, Modifikatoren der biologischen Reaktion (Interferone,
Interleukine und Tumornekrosefaktor (TNF), um einige zu nennen), Hyperthermie
und Kryotherapie, Wirkstoffe, um jegliche Nebenwirkungen abzuschwächen (z.B.
Antiemetika) und andere zugelassene chemotherapeutische Arzneistoffe,
einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf Alkylantien (Mechlorethamin, Chlorambucil, Cyclophosphamid,
Melphalan, Ifosfamid), Antimetaboliten (Methotrexat), Purinantagonisten
und Pyrimidinantagonisten (6-Mercaptopurin, 5-Fluoruracil, Cytarabin,
Gemcitabin), Spindelgifte (Vinblastin, Vincristin, Vinorelbin, Paclitaxel),
Podophyllotoxine (Etoposid, Irinotecan, Topotecan), Antibiotika
(Doxorubicin, Bleomycin, Mitomycin), Nitrosoharnstoffe (Carmustin,
Lomustin), anorganische Ionen (Cisplatin, Carboplatin), Enzyme (Asparaginase)
und Hormone (Tamoxifen, Leuprolid, Flutamid und Megestrol), um einige
zu nennen. Für
eine umfassendere Diskussion der aktualisierten Krebstherapien siehe http://www.nci.nih.gov/,
für eine
Liste der von der FDA zugelassenen onkologischen Arzneistoffe auf http://www.fda.gov/cder/cancer/druglistframe.htm
und The Merck Manual, 17. Aufl. 1999, dessen gesamter Inhalt hiermit
durch Bezugnahme aufgenommen ist.
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Wie
vorstehend diskutiert, sind in einer anderen Ausführungsform
die erfindungsgemäßen Verbindungen
verwendbar in der selektiven Behandlung oder Vorbeugung von Knochenstörungen und
können
die Behandlung über
Hemmung der Osteoklastenaktivität,
Förderung
der Osteoblastenaktivität
oder Förderung
oder Hemmung von anderen zellulären
Ereignissen, die für
den gesunden Knochenmetabolismus notwendig sind, bewirken. In bestimmten
bevorzugten Ausführungsformen
sind diese Verbindungen für
die Behandlung oder Vorbeugung von Erkrankungen und Leiden im Zusammenhang
mit metabolischen Störungen
des Knochens wie z.B. Überaktivität der Osteoklasten
verwendbar. In immer noch anderen bevorzugten Ausführungsformen sind
die erfindungsgemäßen Verbindungen
auf Src-Kinase zielende Hemmstoffe und hemmen somit die Knochenresorption
durch Osteoklasten.
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Die
vorliegende Erfindung stellt deshalb die Verwendung einer wirksamen
ungiftigen Menge einer Erfindungsverbindung oder eines Arzneimittels
davon zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung, Prophylaxe
und/oder Vorbeugung von Knochen- und anderen verwandten Störungen bereit.
Wie vorstehend erwähnt,
sind, obwohl die Erfindungsverbindungen die Behandlung über mehrere
Mechanismen (d.h. Hemmung der Osteoklastenaktivität, Förderung
der Osteoblastenaktivität
oder Regulierung von anderen zellulären Ereignissen, die für den gesunden
Knochenmetabolismus notwendig sind) bewirken, diese Verbindungen
in bestimmten bevorzugten Ausführungsformen
selektive Hemmstoffe der Osteoklastenaktivität.
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In
einer weiteren Ausführungsform
stellt die vorliegende Erfindung einen Hemmstoff von Säuger-Osteoklasten,
beispielsweise eine beliebige der erfindungsgemäßen Verbindungen oder ein Arzneimittel
davon, bereit. In immer noch einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende
Erfindung Verbindungen oder Arzneimittel bereit, die selektive Src-Kinasehemmstoffe
sind. Im Besonderen umfasst das erfindungsgemäße Verfahren die Bereitstellung
einer beliebigen der erfindungsgemäßen Verbindungen oder eines
Arzneimittels davon für
die Verwendung in der Behandlung von und/oder Prophylaxe von Osteoporose
und verwandten osteopenischen Erkrankungen.
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Es
ist selbstverständlich,
dass die vorliegende Erfindung außer der Behandlung oder Vorbeugung
von Osteoporose, insbesondere Osteoporose im Zusammenhang mit den
peri- und postmenopausalen Zuständen,
auch die Behandlung und Prophylaxe oder Vorbeugung von Paget-Krankheit,
Hyperkalzämie
im Zusammenhang mit Knochenneoplasmen und anderen Arten von osteoporotischen
Erkrankungen und verwandten Störungen
in Betracht zieht, einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf Involutionsosteoporose, Typ-I oder postmenopausale Osteoporose,
Typ-II- oder senile Osteoporose, juvenile Osteoporose, idiopathische
Osteoporose, endokrine Abnormalität, Schilddrüsenüberfunktion, Hypogonadismus,
Eierstockagenesie oder Ullrich-Turner-Syndrom, Hyperkortizismus
oder Cushing-Syndrom, Nebenschilddrüsenüberfunktion, Knochenmarkabnormalitäten, multiples
Myelom und verwandte Störungen,
systemische Mastozytose, disseminiertes Karzinom, Gaucher-Krankheit,
Abnormalitäten
des Bindegewebes, Osteogenesis imperfecta, Homocystinurie, Ehlers-Danlos-Syndrom, Marfan-Syndrom,
Menke-Syndrom, Immobilisierung oder Gewichtslosigkeit, Sudeck-Dystrophie, chronisch-obstruktive
Lungenerkrankung, dauernde Heparinverabreichung und Dauereinnahme
von Antikonvulsiva.
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Behandlungs-Kits
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In
anderen Ausführungsformen
betrifft die vorliegende Erfindung einen Kit für die bequeme und wirksame
Ausführung
der erfindungsgemäßen Verfahren.
Im Allgemeinen umfasst die Arzneimittelpackung oder der Kit einen
oder mehrere Behälter,
gefüllt
mit einem oder mehreren der Bestandteile der erfindungsgemäßen Arzneimittel.
Derartige Kits sind hauptsächlich
für die
Abgabe von festen Formen zum Einnehmen wie z.B. Tabletten oder Kapseln
geeignet. Ein solcher Kit schließt vorzugsweise eine Reihe
von Einheitsdosierungen ein und kann auch eine Karte einschließen, auf
der die Dosierungen in der Reihenfolge angeordnet sind, wie sie verwendet
werden sollen. Falls gewünscht,
kann eine Gedächtnisstütze bereitgestellt
werden, beispielsweise in Form von Zahlen, Buchstaben oder anderen
Markierungen oder mit einem eingefügten Kalender, womit die Tage
des Behandlungsplans festgelegt werden, an denen die Dosierungen
verabreicht werden können.
In einer anderen Ausführungsform
können
Placebo-Dosierungen
oder Calcium-Nahrungsergänzungen,
entweder in einer ähnlichen
oder von den ersetzten Purin-Dosierungen unterschiedenen Form, eingeschlossen
werden, um einen Kit bereitzustellen, bei dem jeden Tag eine Dosierung
genommen wird. Gegebenenfalls kann zusammen mit (einem) derartigen
Behälter(n)
eine Mitteilung in der Form vorliegen, die von einer Regierungsbehörde, die
die Herstellung, die Verwendung oder den Verkauf von Pharmazeutika
regelt, vorgeschrieben ist, wobei die Mitteilung die Zulassung durch
die Behörde
für die
Herstellung, die Verwendung oder den Verkauf für die Verabreichung an Menschen
widerspiegelt.
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Die
repräsentativen
Beispiele, die folgen, sollen helfen, die Erfindung zu veranschaulichen
und sollen den Umfang der Erfindung nicht begrenzen, noch sollten
sie so ausgelegt werden. Tatsächlich
werden Fachleuten verschiedene Modifikationen der Erfindung und
viele weitere Ausführungsformen
davon, außer
den hier gezeigten und beschriebenen, aus dem gesamten Inhalt dieses
Dokuments, einschließlich
der Beispiele, die folgen, und der Bezugnahmen auf die zitierte
wissenschaftliche und Patentliteratur, offensichtlich werden. Es sollte
weiterhin selbstverständlich
sein, dass der Inhalt der zitierten Literaturstellen hier durch
Bezugnahme aufgenommen ist, um zu helfen, den Stand der Technik
zu veranschaulichen.
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Die
folgenden Beispiele enthalten wichtige zusätzliche Information, beispielhafte
Darstellung und Anleitung, die an die Anwendung dieser Erfindung
in ihren verschiedenen Ausführungsformen
und den Äquivalenten
davon angepasst werden können.
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Beispiele Beispiel
1 [3-Aminopropyl)ethoxyphosphinoylmethyl]phosphonsäurediethylester
[(3-Benzyloxypropyl)ethoxyphosphinoylmethyl]phosphonsäurediethylester:
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In
einen Ofen-getrockneten Kolben wurden 10,25 g (44,7 mmol) (3-Brompropoxymethyl)benzol
und 7,67 mL (44,7 mmol) Triethylphosphit zugegeben. Der Kolben wurde
mit einem Kurzwegdestillationsaufsatz ausgestattet, zur Entfernung
von Bromethan, und das Gemisch bei 150 °C für 4 h erhitzt. Der Reaktionsansatz wurde
auf Umgebungstemperatur abgekühlt
und danach mit 120 mL absolutem Ethanol und 1,8 N KOH (120 mL, 216
mol) verdünnt.
Der Destillationsaufsatz wurde durch einen Rückflusskühler ersetzt und die Lösung für 5 h unter
Rückfluss
erhitzt. Der Reaktionsansatz wurde abgekühlt, danach in vacuo konzentriert.
Die basische wässrige
Schicht wurde mit EtOAc (2×)
extrahiert und danach mit conc. HCl auf pH-Wert 3 angesäuert. Die wässrige Schicht wurde mit EtOAc
(3×) extrahiert
und die vereinigten Extrakte wurden über MgSO4 getrocknet und
konzentriert. Das so erhaltene Rohprodukt (8,24 g) wurde wie es
war in der nächsten
Umsetzung verwendet. 31P-NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 34,113.
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Zu
einer Lösung
des rohen Phosphonats (8,24 g, 32,5 mmol) in 100 mL CH2Cl2, unter einer N2-Atmosphäre, wurden
10,8 mL (113,8 mmol) Oxalylchlorid zugegeben. DMF (mehrere Tropfen)
wurde langsam zugegeben, um die Umsetzung zu starten. Nachdem die
Gasentwicklung aufgehört
hatte, wurde der Reaktionsansatz für 30 Min. bei Umgebungstemperatur
gerührt.
Auf Konzentration in vacuo hin wurde der Rückstand mehrere Male mit Hexan
verrieben, danach in 167 mL wasserfreiem THF gelöst. In einem gesonderten Kolben
wurde zu einer gekühlten
(–78 °C, unter
N2) Lösung
von Diethyl-methylphosphonat (10,25 mL, 69,9 mmol) in 337 mL wasserfreiem
THF 2,5 M n-Butyllithium (27,95 mL, 69,9 mmol) zugetropft. Das Reaktionsgemisch
wurde für
30 Min. bei –78 °C gerührt, zu
welchem Zeitpunkt das in situ erzeugte Säurechlorid zugetropft wurde.
Die Lösung
wurde für
zusätzliche
2,5 h bei –78 °C gerührt, mit
5 mL Eisessig gequencht und danach auf Umgebungstemperatur erwärmt. Wasser wurde
zu dem Reaktionsgemisch zugegeben und das THF wurde in vacuo entfernt.
Die wässrige
Schicht wurde mit EtOAc (3×)
extrahiert und die vereinigten organischen Stoffe mit gesättigter
NaHCO3-Lösung,
Salzlösung
gewaschen, danach über
MgSO4 getrocknet und konzentriert. Das Rohprodukt
wurde mit Kieselgelchromatographie gereinigt (eluiert mit 50:1 CH2Cl2/MeOH) und brachte
6,15 g eines gelben Öls
ein. 31P-NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 51,479,
26,291.
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[(3-Aminopropyl)ethoxyphosphinoylmethyl]phosphonsäurediethylester:
-
Zu
einer Lösung
von [(3-Benzyloxypropyl)ethoxyphosphinoylmethyl]phosphonsäurediethylester
(5,7 g, 14,5 mmol) in 100 mL EtOH wurden 1,2 g Palladium-an-Kohle
zugegeben. Das Gemisch wurde mit H2 gespült und bei
Umgebungstemperatur (H2-Ballon) für 1 h gerührt. Das
Reaktionsgemisch wurde durch Celite filtriert und das Lösungsmittel
abgezogen, was 3,5 g eines blassgelben Öls lieferte. 31P-NMR
(300 MHz, DMSO-d6) d 52,219, 26,317.
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Zu
einer gekühlten
(0 °C, unter
N2) Lösung
des rohen Alkohols (3,5 g, 14,5 mmol) in 53 mL CH2Cl2 wurden 2,4 mL (17,4 mmol) Triethylamin
zugegeben, gefolgt von 1,25 mL (16 mmol) Methansulfonylchlorid. Das
Reaktionsgemisch wurde auf Umgebungstemperatur erwärmt und
für 1 h
gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde danach mit Wasser gequencht und die Schichten
getrennt. Die organische Schicht wurde mit Wasser und Salzlösung gewaschen, über Na2SO4 getrocknet und
konzentriert. Das rohe orange-gelbe Öl (5,5 g) wurde wie es war
in der nächsten
Umsetzung verwendet. 31P-NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 51,135,
26,614.
-
Zu
einer Lösung
des rohen Mesylats (5,5 g, 14,4 mmol) in 17 mL DMF wurden 4,7 g
(72,4 mmol) Natriumazid zugegeben. Die so erhaltene Aufschlämmung wurde
bei 55 °C
erhitzt und über
Nacht gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde mit EtOAc verdünnt und mit Wasser (2×) gewaschen.
Die vereinigten organischen Stoffe wurden danach über Na2SO4 getrocknet und
konzentriert. Das rohe Azid (2,61 g) wurde wie es war in der nächsten Umsetzung
verwendet. 31P-NMR (300 MHz, DMSO-d6) d 51,230, 26,183.
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Zu
einer Lösung
des rohen Azids (2,61 g, 8 mmol) in 100 mL EtOH wurden 0,8 g Palladium-an-Kohle zugegeben.
Das Gemisch wurde mit H2 gespült und bei
Umgebungstemperatur (H2-Ballon) für 16 h gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde
durch Celite filtriert und das Lösungsmittel
abgezogen, was 2,3 g eines gelben Öls lieferte: 1H-NMR
(300 MHz, DMSO-d6) δ 4,03 (m, 6H), 2,84-2,52 (m,
4H), 1,91-1,80 (m, 2H), 1,65-1,61 (m, 2H), 1,23 (m, 9H). 31P-NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 51,757,
26,344.
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Beispiel
2 [(4-Aminophenyl)ethoxyphosphinoylmethyl]phosphonsäurediethylester
-
[(4-Nitrophenyl)ethoxyphosphinoylmethyl]phosphonsäurediethylester:
-
Ein
Gemisch aus Diethyl-(ethoxyphosphinyl)methylphosphonat (2,35 g,
9,62 mmol), Et3N (3,8 mL, 27,5 mmol), 1-Iod-4-nitrobenzol
(2,28 g, 9,17 mmol) und Pd(PPh3)4 (265 mg, 0,229 mmol) in CH3CN
(14 mL) unter N2 wurde bei 80 °C für 2,5 h
gerührt.
Nach dem Abkühlen
auf RT wurde das Reaktionsgemisch in 50 mL 1 N wäss. HCl gegossen und mit CH2Cl2 extrahiert.
Der Extrakt wurde mit H2O (50 mL) und Salzlösung (50
mL) gewaschen. Die wässrigen
Waschflüssigkeiten
wurden einmal mit CH2Cl2 rück-extrahiert
und die vereinigten Extrakte wurden über Na2SO4 getrocknet und konzentriert. Das Rohmaterial
wurde mit Flash-Chromatographie an
Kieselgel gereinigt. Elution mit 30:1 CHCl3-MeOH,
gefolgt von 20:1 CHC13-MeOH und zuletzt
15:1 CHCl3-MeOH, brachte 3,28 g des gewünschten
(Arylphosphinylmethyl)phosphonats ein.
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[(4-Aminophenyl)ethoxyphosphinoylmethyl]phosphonsäurediethylester:
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Ein
Gemisch aus [(4-Nitrophenyl)ethoxyphosphinoylmethyl]phosphonsäurediethylester
(940 mg, 2,57 mmol) und SnCl2·2H2O (2,9 g, 12,9 mmol) in EtOH (~10 mL) wurde
bei 70 °C
für 44
Min. gerührt
und danach bei Umgebungstemperatur konzentriert. Der Rückstand
wurde in CH2Cl2 aufgenommen
und mit halb-gesättigter
wäss. NaHCO3-Lösung
(40 mL), H2O (40 mL) und Salzlösung (40
mL) gewaschen. Die wässrigen
Waschflüssigkeiten
wurden einmal mit CH2Cl2 rück-extrahiert
und die vereinigten Extrakte wurden über K2CO3 getrocknet und konzentriert. Das Rohmaterial
wurde mit Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt. Elution mit
20:1 CHCl3-MeOH, gefolgt von 15:1 CHCl3-MeOH, brachte 657 mg des Produkts ein.
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Beispiel
3 Synthese
von Phenyldialkylphosphinoxiden
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Beispiel 4
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In
einer Ausführungsform
können
Verbindungen, wie hier offenbart und beschrieben, mit Lösungsphase-Verfahren
gemäß dem nachstehend
in Umrissen dargelegten Schema synthetisiert werden: Lösungsphase-Purinsyntheseschema
Beispiel
5 (nicht in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen) ({2-[6-(3-Chlorphenylamino)-9-isopropyl-9H-purin-2-ylamino]ethoxy}hydroxyphosphorylmethyl)phosphonsäure
-
6-Chlor-2-fluor-9H-purin:
-
Eine
0,3 M wässrige
Lösung
von NaNO2 (200 mL, 60 mmol) wurde zu einer
gekühlten
(–15 °C), kräftig gerührten Suspension
von 2-Amino-6-chlor-9H-purin (6,0 g, 35,4 mmol) in 120 mL HBF4 (48 Gew.-% in H2O, 0,92
mol) über
75 Min. zugetropft. Der blassgelbe Reaktionsansatz wurde bei RT
für 20
Min. gerührt
und danach wieder auf –15 °C abgekühlt und
mit wässriger
NaOH (50 Gew.-% in H2O) auf pH-Wert = 6,0
neutralisiert. Das Wasser wurde in vacuo entfernt und der so erhaltene
orange Feststoff an Kieselgel chromatographiert (90:10 CH2Cl2:MeOH, Rf 0,50). Das Endprodukt wurde als weißer Feststoff
erhalten (3,0 g, 49,1 %).
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6-Chlor-2-fluor-9-isopropyl-9H-purin:
-
6-Chlor-2-fluor-9H-purin
(517,7 mg, 3 mmol), 2-Propanol (198,3 mg, 3,3 mmol), PPh3 (866 mg, 3,3 mmol) wurden unter N2 in einem 50 mL-Rundkolben bei 0 °C gemischt.
DEAD (575 mg, 3,3 mmol) wurde über eine
Spritze zu dem Gemisch zugetropft. Die Temperatur wurde auf RT angehoben
und das Gemisch wurde über
Nacht gerührt.
Das Lösungsmittel
wurde in vacuo entfernt und der so erhaltene Rückstand wurde an Kieselgel
chromatographiert (CH2Cl2/EtOAc,
4:1, Rf 0,62). Das Produkt wurde als ein
weißer
Feststoff erhalten (411 mg, 64 %).
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(3-Chlorphenyl)(2-fluor-9-isopropyl-9H-purin-6-yl)amin:
-
6-Chlor-2-fluor-9-isopropyl-9H-purin
(214 mg, 1 mmol) wurde mit 3-Chloranilin (127,6 mg, 1 mmol) in 12
mL n-BuOH gemischt. DIEA (357,6 mg, 2,8 mmol) wurde zugegeben und
die Lösung
wurde bei 90 °C über Nacht
erhitzt. Das Lösungsmittel
wurde in vacuo entfernt und der Rückstand wurde an Kieselgel
chromatographiert (CH2Cl2/EtOAc
2:2, Rf 0,44), um das Produkt als einen
weißen
Feststoff zu erhalten (148 mg, 48 %).
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2-(6-(3-Chlorphenylamino-9-isopropyl-9H-purin-2-ylamino)ethanol:
-
(3-Chlorphenyl)(2-fluor-9-isopropyl-9H-purin-6-yl)amin
(92 mg, 0,3 mmol) und Ethanolamin (92 mg, 1,5 mmol) wurden in 5
mL nBuOH/DMSO (4/1 Vol./Vol.) gemischt und bei 120 °C über Nacht
erhitzt. Das Lösungsmittel
wurde in vacuo entfernt. Der Rückstand
wurde an Kieselgel chromatographiert (EtOAc, Rf 0,45), um
das Produkt als einen grünlichen
Feststoff zu erhalten (24 mg, 90 %).
-
({2-[6-(3-Chlorphenylamino)-9-isopropyl-9H-purin-2-ylamino]ethoxy}hydroxyphosphorylmethyl)phosphonsäure:
-
2-(6-(3-Chlorphenylamino-9-isopropyl-9H-purin-2-ylamino)ethanol
(180 mg, 0,52 mmol) wurde in 3 mL Trimethylphosphat bei 0 °C gelöst. Methylenbis(phosphonsäuredichlorid)
(514 mg, 2,1 mmol) wurde in einem Anteil zugegeben und der Reaktionsansatz
wurde bei 0 °C
für 16
Std. gerührt.
Die Lösung
wurde mit 5 N Ammoniak auf pH-Wert 6,0 neutralisiert. Das so erhaltene
Gemisch wurde mit RP-HPLC gereinigt. Gefriertrocknung ließ einen
weißen
Feststoff zurück
(147 mg, 56 %).
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Beispiel
6 (nicht in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen) ({2-[6-(3-Chlorphenylamino)-9-isopropyl-9H-purin-2-ylamino]-3-methylbutoxy}hydroxyphosphorylmethyl)phosphonsäure
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Die
Titelverbindung wurde auf eine ähnliche
Weise wie die in Beispiel 5 beschriebene synthetisiert. ES-MS: m/z
546 (M-H).
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Beispiel
7 (nicht in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen) ({3-[6-(3-Chlorphenylamino)-9-isopropyl-9H-purin-2-ylamino]propoxy}hydroxyphosphorylmethyl)phosphonsäure
-
Die
Titelverbindung wurde auf eine ähnliche
Weise wie die in Beispiel 5 beschriebene synthetisiert. ES-MS: m/z
518 (M-H).
-
Beispiel
8 (nicht in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen) ({4-[6-(3-Chlorphenylamino)-9-isopropyl-9H-purin-2-ylamino]butoxy}hydroxyphosphorylmethyl)phosphonsäure
-
Die
Titelverbindung wurde auf eine ähnliche
Weise wie die in Beispiel 5 beschriebene synthetisiert. ES-MS: m/z
532 (M-H).
-
Beispiel
9 (nicht in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen) ({2-[6-(3-Chlorphenylamino)-9-isopropyl-9H-purin-2-ylamino]-3-methylbutoxy}hydroxyphosphorylmethyl)phosphonsäure
-
Die
Titelverbindung wurde auf eine ähnliche
Weise wie die in Beispiel 5 beschriebene synthetisiert. ES-MS: m/z
560 (M-H).
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Beispiel
10 (nicht in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen) ({2-[6-(3-Chlorphenylamino)-9-methyl-9H-purin-2-ylamino]-3-methylbutoxy}hydroxyphosphorylmethyl)phosphonsäure
-
Die
Titelverbindung wurde auf eine ähnliche
Weise wie die in Beispiel 5 beschriebene synthetisiert. ES-MS: m/z
518 (M-H).
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Beispiel
11 [(4-{2-Ethoxy-9-[2-(3-hydroxyphenyl)ethyl]-9H-purin-6-ylamino}phenyl)hydroxyphosphinoylmethyl]phosphonsäure
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2-[3-(tert-Butyldimethylsilanyloxy)phenyl]ethanol:
-
Zu
einer Lösung
von 3-Hydroxyphenethylalkohol (6,0 g, 43,4 mmol) in 275 mL CH2Cl2 wurden 6,55
g (43,4 mmol) TBDMS-Cl (tert-Butyldimethylsilylchlorid) zugegeben,
auf 0 °C
abgekühlt,
danach 7,0 mL (86,8 mmol) Pyridin zugegeben. Das Reaktionsgemisch
wurde bei Umgebungstemperatur über
Nacht gerührt.
Auf Konzentration hin wurde das rohe Gemisch mit Kieselgel-Flash-Chromatographie
(eluiert mit Hexan, danach 5% EtOAc/Hexan) gereinigt, was 8,9 g
eines klaren Öls
lieferte: 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 9,17
(s, 1H), 7,04 (m, 1H), 6,60 (m, 3H), 3,73 (t, J = 6,9 H2,
2H), 2,65 (t, J = 6,9 H2, 2H), 0,83 (s,
9H), –0,03
(s, 6H).
-
9-{2-[3-(tert-Butyldimethylsilanyloxy)phenyl]ethyl}-6-chlor-2-fluor-9H-purin:
-
Zu
einem Kolben, der 1,26 g (7,3 mmol) 6-Chlor-2-fluor-9H-purin und
3,82 g (14,6 mmol) Triphenylphosphin, unter einer N2-Atmosphäre, enthielt,
wurde eine Lösung
von 2-[3-(tert-Butyldimethylsilanyloxy)phenyl]ethanol
(3,7 g, 14,6 mmol) in 40 mL THF zugegeben. Zu dem gekühlten (0 °C) Reaktionsgemisch
wurde eine Lösung
von Diethyl-azodicarboxylat (2,3 mL, 14,6 mmol) in 40,0 mL THF zugegeben
und man ließ die
so erhaltene Lösung
bis Umgebungstemperatur über
Nacht rühren.
Auf Quenchen mit H2O (~1,0 mL) hin wurde das
Lösungsmittel
entfernt und das rohe Gemisch wurde mit Kieselgel-Flash-Chromatographie
(eluiert mit 10% EtOAc/Hexan, danach 15% EtOAc/Hexan) gereinigt,
was 1,71 g eines weißen
Feststoffs lieferte: 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8,52
(s, 1H), 7,11 (t, J = 7,8 H2, 1H), 6,76
(d, J = 7,6 Hz, 1H), 6,65-6,62 (m, 1H), 6,49 (m, 1H), 4,48 (t, J
= 6,8 H2, 2H), 3,12 (t, J = 6,8 H2, 2H), 0,88 (s, 9H), 0,06 (s, 6H); 19F-NMR (DMSO-d6) δ –48,23.
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[(4-Aminophenyl)hydroxyphosphinoylmethyl]phosphonsäure:
-
sEine
Lösung
von [(4-Aminophenyl)ethoxyphosphinoylmethyl]phosphonsäurediethylester
(2,78 g, 8,29 mmol) in 250 mL conc. HCl wurde für 5 h unter Rückfluss
(Apparat ausgerüstet
mit einer NaOH-Falle) erhitzt. Die Lösung wurde über Destillation konzentriert,
was einen klebrigen, gelb-weißen
Feststoff lieferte, der ohne Reinigung im nächsten Schritt verwendet wurde:
m/z 252 (M+H).
-
[(4-{2-Fluor-9-[2-(3-hydroxyphenyl)ethyl]-9H-purin-6-ylamino}phenyl)hydroxyphosphinoylmethyl]phosphonsäure:
-
Ein
verschlossener Druckkolben, gespült
mit N2, der ein Gemisch aus roher [(4-Aminophenyl)hydroxyphosphinoylmethyl]phosphonsäure (8,29
mmol), 9-{2-[3-(tert-Butyldimethylsilanyloxy)phenyl]ethyl}-6-chlor-2-fluor-9H-purin
(3,37 g, 8,29 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin
(7,2 mL, 41,5 mmol) in 45,0 mL DMSO enthielt, wurde bei 110-120 °C für 13 h erhitzt.
Auf Entfernung überschüssigen N,N-Diisopropylethylamins
hin (N2-Strom, schwache Hitze) wurde die
schwach braune Lösung
auf Umgebungstemperatur abgekühlt
und 500 mL H2O zugegeben, was eine milchige,
schmutzig-weiße
Lösung
hervorrief. Weitere Ausfällung
erfolgte auf Zugabe von TFA (End-pH-Wert = 1-2) hin, zu welchem
Zeitpunkt das Gemisch erhitzt (100 °C Heizplatte) und für ~20 Min.
kräftig
gerührt,
heiß filtriert,
danach mit angesäuertem
H2O (TFA, pH-Wert = 1-2; 4×20 mL),
EtOH (2×20
mL) und Et2O (4×20 mL) gewaschen wurde. Isolierung
einer zweiten Charge aus dem konzentrierten Filtrat auf die gleiche
Weise wie vorstehend beschrieben, gefolgt von Entfernung überschüssigen Lösungsmittels
in vacuo), lieferte 2,47 g eines schmutzig-weißen Feststoffs: m/z 506 (M-H).
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[(4-{2-Ethoxy-9-[2-(3-hydroxyphenyl)ethyl]-9H-purin-6-ylamino}phenyl)hydroxyphosphinoylmethyl]phosphonsäure:
-
Zu
einem gekühlten
Kolben (0 °C)
unter einer N2-Atmosphäre, der 0,096 g (4,02 mmol)
Natriumhydrid enthielt, wurden 2,0 mL absoluter Ethanol zugegeben.
Nachdem das Sprudeln aufgehört
hatte, wurde die Lösung
mit einer Pipette in einen gekühlten
(0 °C) Druckkolben,
unter einer N2-Atmosphäre, der ein Gemisch aus [(4-{2-Fluor-9-[2-(3-hydroxyphenyl)ethyl]-9H-purin-6-ylamino}phenyl)hydroxyphosphinoylmethyl]phosphonsäure (0,199
g, 0,39 mmol) in 2,0 mL absolutem Ethanol enthielt, überführt. Auf
das Verschließen
des Reaktionsgefäßes hin
wurde das so erhaltene Gemisch bei Umgebungstemperatur für ~10 Min.
gerührt,
danach bei 80 °C über Nacht
erhitzt. Ethanol wurde über
einen N2-Strom (schwache Hitze) entfernt
und die so erhaltene dicke Suspension wurde in 25 mL H2O
(mit 10%iger NaOH auf pH-Wert ~8 eingestellt) gelöst, filtriert
(0,2 μm, PTFE-Filter)
und mit RP-HPLC (CH3CN/H2O)
gereinigt. Gefriertrocknung lieferte einen weißen Feststoff (0,105 g): m/z
532 (M-H).
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Beispiel
12 [Hydroxy-(4-{9-[2-(3-hydroxyphenyl)ethyl]-2-methoxy-9H-purin-6-ylamino}phenylphosphinoylmethyl]phosphonsäure
-
Die
Titelverbindung wurde auf eine ähnliche
Weise wie die für
Beispiel 11 beschriebene synthetisiert. Das Produkt wurde als ein
weißer
Feststoff erhalten: m/z 518 (M-H).
-
Beispiel
13 [Hydroxy-(4-{9-[2-(3-hydroxyyphenyl)ethyl]-2-isopropoxy-9H-purin-6-ylamino}phenyl)phosphinoylmethyl]phosphonsäure
-
Die
Titelverbindung wurde auf eine ähnliche
Weise wie die für
Beispiel 11 beschriebene synthetisiert. Das Produkt wurde als ein
weißer
Feststoff erhalten: m/z 546 (M-H).
-
Beispiel
14 (Hydroxy-{4-[9-methyl-2-(piperidin-4-ylmethoxy)-9H-purin-6-ylamino]phenyl}phosphinoylmethyl)phosphonsäure
-
Die
Titelverbindung wurde auf eine ähnliche
Weise wie die für
Beispiel 11 beschriebene synthetisiert. Das Produkt wurde als ein
weißer
Feststoff erhalten: 495 m/z (M-H).
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Beispiel
15 {[4-(9-Ethyl-2-isopropoxy-9H-purin-6-ylamino)phenyl]hydroxyphosphinoylmethyl}phosphonsäure
-
Die
Titelverbindung wurde auf eine ähnliche
Weise wie die für
Beispiel 11 beschriebene synthetisiert. Das Produkt wurde als ein
weißer
Feststoff erhalten: 454 m/z (M-H).
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Beispiel
16 ({4-[9-Ethyl-2-(piperidin-4-ylmethoxy)-9H-purin-6-ylamino]phenyl}hydroxyphosphinoylmethyl}phosphonsäure
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Die
Titelverbindung wurde auf eine ähnliche
Weise wie die für
Beispiel 11 beschriebene synthetisiert. Das Produkt wurde als ein
weißer
Feststoff erhalten: 509 m/z (M-H).
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Beispiel
17 [(4-{2-(2-Dimethylaminopropylamino)-9-[2-(3-hydroxyphenyl)ethyl]-9H-purin-6-ylamino}phenyl)hydroxyphosphinoylmethyl]phosphonsäure
-
[(4-{2-(2-Dimethylaminopropylamino)-9-[2-(3-hydroxyphenyl)ethyl]-9H-purin-6-ylamino}phenyl)hydroxyphosphinoylmethyl]phosphonsäure:
-
Ein
Reaktionsgefäß, gespült mit N2, das eine biphasische Lösung von [(4-{2-Fluor-9-[2-(3-hydroxyphenyl)ethyl]-9H-purin-6-ylamino}phenyl)hydroxyphosphinoylmethyl]phosphonsäure (0,2
g, 0,39 mmol), 3-(Dimethylamino)propylamin (0,121 g, 1,18 mmol)
und N,N-Diisopropylethylamin
(0,69 mL, 3,94 mmol) in 2,0 mL DMSO enthielt, wurde bei 120 °C für 13 h erhitzt.
Auf Entfernung des überschüssigen N,N-Diisopropylethylamins,
unter vermindertem Druck, hin, wurden zu der schwach braunen Lösung ~10
mL H2O zugegeben, was eine milchige, schmutzig-weiße Lösung hervorrief.
Weitere Ausfällung
erfolgte auf Zugabe von TFA (End- pH-Wert = 1-2) hin, zu welchem
Zeitpunkt das Gemisch für
~20 Min. kräftig
gerührt,
filtriert, danach mit angesäuertem
H2O (TFA, pH-Wert = 1-2; 4×20 mL),
EtOH (2×20
mL) und Et2O (4×20 mL) gewaschen wurde. Der so
erhaltene Feststoff wurde in ~30 mL H2O
(mit 10%iger NaOH auf pH-Wert ~9 eingestellt) gelöst, filtriert
(0,2 μm,
PTFE-Filter) und mit RP-HPLC (CH3CN/H2O) gereinigt. Gefriertrocknung lieferte
einen schmutzig-weißen Feststoff,
isoliert als sein TFA-Salz (0,082 g): m/z 588 (M-H).
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Beispiel
18 ({4-[2-(trans-4-Aminocyclohexylamino)-9-isopropyl-9H-purin-6-ylamino]phenyl}hydroxyphosphinoylmethyl}phosphonsäure
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Die
Titelverbindung wurde auf eine ähnliche
Weise wie die für
Beispiel 17 beschriebene synthetisiert. Das Produkt wurde als ein
weißer
Feststoff erhalten: 522 m/z (M-H).
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Beispiel
19 [(4-{2-Ethylamino-9-[2-(3-hydroxyphenyl)ethyl]-9H-purin-6-ylamino}phenyl)hydroxyphosphinoylmethyl]phosphonsäure
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Die
Titelverbindung wurde auf eine ähnliche
Weise wie die für
Beispiel 17 beschriebene synthetisiert. Das Produkt wurde als ein
weißer
Feststoff erhalten: 531 m/z (M-H).
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Beispiel
20 [Hydroxy-(4-{9-[2-(3-hydroxyphenyl]ethyl]-2-[(tetrahydrofuran-S-2-ylmethyl)amino]-9H-purin-6-ylamino}phenyl)phosphinoylmethyl]phosphonsäure
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Die
Titelverbindung wurde auf eine ähnliche
Weise wie die für
Beispiel 17 beschriebene synthetisiert. Das Produkt wurde als ein
weißer
Feststoff erhalten: 587 m/z (M-H).
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Beispiel
21 [Hydroxy-(4-{9-[2-(3-hydroxyphenyl)ethyl]-2-[(tetrahydrofuran-R-2-ylmethyl)amino]-9H-purin-6-ylamino}phenyl)phosphinoylmethyl]phosphonsäure
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Die
Titelverbindung wurde auf eine ähnliche
Weise wie die für
Beispiel 17 beschriebene synthetisiert. Das Produkt wurde als ein
weißer
Feststoff erhalten: 587 m/z (M-H).
-
Beispiel
22 ({4-[2-(4-Aminocyclohexylamino)-9-ethyl-9H-purin-6-ylamino]phenyl}hydroxyphosphinoylmethyl}phosphonsäure
-
Die
Titelverbindung wurde auf eine ähnliche
Weise wie die für
Beispiel 17 beschriebene synthetisiert. Das Produkt wurde als ein
weißer
Feststoff erhalten: 508 m/z (M-H).
-
Beispiel
23 [(4-{9-Ethyl-2-[2-(1H-imidazol-4-yl)ethylamino]-9H-purin-6-ylamino}phenyl)hydroxyphosphinoylmethyl]phosphonsäure
-
Die
Titelverbindung wurde auf eine ähnliche
Weise wie die für
Beispiel 17 beschriebene synthetisiert. Das Produkt wurde als ein
weißer
Feststoff erhalten: 505 m/z (M-H).
-
Beispiel
24 [(4-{9-Ethyl-2-[(piperidin-4-ylmethyl)amino]-9H-purin-6-ylamino}phenyl)hydroxyphosphinoylmethyl]phosphonsäure
-
Die
Titelverbindung wurde auf eine ähnliche
Weise wie die für
Beispiel 17 beschriebene synthetisiert. Das Produkt wurde als ein
weißer
Feststoff erhalten: 508 m/z (M-H).
-
Beispiel 25
-
In
einer anderen Ausführungsform
können
Verbindungen, wie hier offenbart und beschrieben, mit Festphase-Parallelsynthese
synthetisiert werden, beispielsweise an einer Quest 210-Syntheseanlage (Argonaut
Technologies); gemäß dem nachstehend
in Umrissen dargelegten Schema:
-
Festphase-Purinsyntheseschema
-
Beispiel
26 [(4-{2-(2-Dimethylaminoethylamino)-9-[2-(3-hydroxyphenyl)ethyl]-9H-purin-6-ylamino}phenyl)hydroxyphosphinoylmethyl]phosphonsäure
-
Herstellung des Etherharzes
(1a):
-
Zu
einem Teflon®-RG
(Reaktionsgefäß), das
0,3 g (0,96 mmol/g, 0,29 mmol) Wang-Harz enthielt, wurde eine Lösung von
3-[2-(tert-Butyldimethylsilanyloxy)ethyl]phenol (0,73 g, 2,9 mmol)
und Triphenylphosphin (0,38 g, 1,44 mmol) in 1,4 mL THF zugegeben.
Das RG wurde auf 0 °C
abgekühlt
(Julabo-Kühlapparat)
und danach wurden, unter einer N2-Atmosphäre, 2,0
mL (1,44 mmol) einer 0,72 M Lösung
von DEAD (Diethyl-azodicarboxylat) in THF zugegeben. Das Harzgemisch
wurde, unter Rütteln, über 2 h
auf Umgebungstemperatur erwärmt
und danach für
zusätzliche
20 h gerüttelt,
woraufhin das RG entleert und das Harz nacheinander mit THF (5×5,0 mL),
DMA (5×5,0
mL), CH2Cl2 (5×5,0 mL),
Et2O (2×5,0
mL), CH2Cl2 (1×5,0 mL),
Et2O (1×5,0
mL) und CH2Cl2 (2×5,0 mL)
gewaschen wurde. Überschüssiges Lösungsmittel
wurde über
einen N2-Strom über Nacht entfernt, was das
Etherharz 1a lieferte. Die folgenden analytischen Daten wurden auf
Spaltung von 1a (3-5 mg) mit 30% TFA/CH2Cl2 (~5 Min.) hin erhalten: 83% HPLC-Reinheit;
HPLC-RT (Retentionszeit, Min.) stimmt mit im Handel erhältlichem
3-Hydroxyphenethylalkohol (TBS-Rest bei TFA-Spaltung entfernt) überein.
-
Herstellung des Purinharzes
(1b):
-
Zu
dem Etherharz 1a (0,29 mmol) wurden 6,6 mL (6,57 mmol) einer 1,0
M Lösung
von TBAF (Tetrabutylammoniumfluorid) in THF zugegeben. Das Harzgemisch
wurde für
2 h geschüttelt,
woraufhin das RG entleert und das Harz nacheinander mit THF (5×5,0 mL),
DMA (5×5,0
mL), CH2Cl2 (5×5,0 mL),
Et2O (2×5,0
mL), CH2Cl2 (1×5,0 mL),
Et2O (1×5,0
mL) und CH2Cl2 (2×5,0 mL)
gewaschen wurde. Überschüssiges Lösungsmittel wurde über einen
N2-Strom über Nacht entfernt, was das
entschützte
Harz lieferte. Ein Harz-Aliquot (3-5 mg) wurde mit 30% TFA/CH2Cl2 (~5 Min.) gespalten,
um die Unversehrtheit der harzgebundenen Verbindung zu überprüfen: 80%
HPLC-Reinheit; HPLC-RT (Retentionszeit, Min.) stimmt mit im Handel
erhältlichem
3-Hydroxyphenethylalkohol überein.
-
Zu
dem getrockneten Harz (0,29 mmol) wurde eine homogene Suspension
von 6-Chlor-2-fluor-9H-purin
(0,50 g, 2,9 mmol) und Triphenylphosphin (0,38 g, 1,44 mmol) in
1,75 mL THF zugegeben. Das RG wurde auf 0 °C abgekühlt (Julabo-Kühlapparat)
und danach, unter einer N2-Atmosphäre, 2,0
mL (1,44 mmol) einer 0,72 M Lösung
von DEAD (Diethyl-azodicarboxylat) in THF zugegeben. Das Harzgemisch
wurde, unter Rütteln, über 1,5
h auf Umgebungstemperatur erwärmt
und danach für
zusätzliche
22 h gerüttelt,
woraufhin das RG entleert und das Harz nacheinander mit THF (5×5,0 mL),
DMA (5×5,0
mL), CH2Cl2 (5×5,0 mL),
Et2O (2×5,0 mL),
CH2Cl2 (1×5,0 mL),
Et2O (1×5,0
mL) und CH2Cl2 (2×5,0 mL)
gewaschen wurde. Überschüssiges Lösungsmittel
wurde über
einen N2-Strom über Nacht entfernt, was das
Purinharz 1b lieferte. Die folgenden analytischen Daten wurden auf
Spaltung von 1b (3-5 mg) mit 30% TFA/CH2Cl2 (~5 Min.) hin erhalten: 65% HPLC-Reinheit,
~5:1 Haupt-/Neben-Peaks (kein apparenter 3-Hydroxyphenethylalkohol-HPLC-Peak).
-
Herstellung des Purinharzes
(1c):
-
Zu
dem Purinharz 1b (0,29 mmol) wurde eine Lösung von [(4-Aminophenyl)ethoxyphosphinoylmethyl]phosphonsäurediethylester
(0,97 g, 2,88 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin
(0,25 mL, 1,44 mmol) in 3,0 mL 1:1 n-Butanol/DMSO zugegeben. Das
verschlossene RG wurde bei 110 °C
für 16
h erhitzt, woraufhin das RG auf Umgebungstemperatur abgekühlt, entleert
und das Harz nacheinander mit DMA (5×5,0 mL), CH2Cl2 (5×5,0
mL), Et2O (2×5,0 mL), CH2Cl2 (1×5,0
mL), Et2O (1×5,0 mL) und CH2Cl2 (2×5,0
mL) gewaschen wurde. Überschüssiges Lösungsmittel
wurde über
einen N2-Strom über Nacht entfernt, was das
aminierte Purinharz 1c lieferte. Die folgenden analytischen Daten
wurden auf Spaltung von 1c (3-5 mg) mit 30% TFA/CH2Cl2 (~5 Min.) hin erhalten: m/z 592 (M+H).
-
[(4-{2-(2-Dimethylaminoethylamino)-9-[2-(3-hydroxyphenyl)ethyl]-9H-purin-6-ylamino}phenyl)hydroxyphosphinoylmethyl]phosphonsäure:
-
Zu
dem aminierten Purinharz 1c (0,29 mmol) wurde eine Lösung von
N,N-Dimethylethylendiamin
(0,25 g, 2,88 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin (0,25 mL, 1,44
mmol) in 3,0 mL 1:1 n-Butanol/DMSO zugegeben. Das verschlossene
RG wurde bei 110 °C
für 16
h erhitzt, woraufhin die Heizung ausgeschaltet, das RG sofort entleert
und das Harz (noch heiß)
nacheinander mit DMA (5×5,0
mL), CH2Cl2 (5×5,0 mL,
bei Umgebungstemperatur), Et2O (2×5,0 mL),
CH2Cl2 (1×5,0 mL),
Et2O (1×5,0
mL) und CH2Cl2 (2×5,0 mL)
gewaschen wurde. Überschüssiges Lösungsmittel
wurde über
einen N2-Strom über Nacht entfernt, was das
bis-aminierte Purinharz lieferte.
-
Zu
dem bis-aminierten Purinharz (0,29 mmol) wurden 5,6 mL 30% TFA/CH2Cl2 (2 % Triisopropylsilan) zugegeben.
Das Harzgemisch wurde für
1 h gerüttelt,
woraufhin das Filtrat gesammelt und das Harz mit CH2Cl2 (3×5,0
mL) gewaschen wurde. Die vereinigten Filtrate wurden konzentriert
(Savant speed-vac), 3-4 mL CH2Cl2 zugegeben, danach wieder konzentriert,
was ein dunkelgelbes Öl
lieferte.
-
Das Öl wurde
in 6,6 mL CH3CN gelöst, auf 0 °C abgekühlt, danach wurden 1,0 mL (7,2
mmol) TMSI (Iodtrimethylsilan) zugegeben. Die so erhaltene gelbe
Lösung
(etwas Niederschlag) wurde bei –20 °C für 2 h gelagert
(regelmäßiges Verwirbeln),
danach bei 0 °C
für 1 h,
woraufhin 0,4 ml (2,81 mmol) TMSI zugegeben und die Umsetzung bei
0 °C für 3 h fortgesetzt
wurde. Das überschüssige TMSI
wurde bei 0 °C
mit ~4 mL 20%iger, wässriger
NaHSO3-Lösung
gequencht, der pH-Wert mit 10%iger NaOH auf 11-12 eingestellt und
das CH3CN durch Rotationsverdampfung entfernt.
Der pH-Wert wurde mit TFA wieder auf 10-11 eingestellt, woraufhin
die Lösung
filtriert (0,2 μm,
PTFE-Filter) und mit RP-HPLC (CH3CN/H2O) gereinigt wurde. Gefriertrocknung lieferte
einen weißen
Feststoff, isoliert als sein TFA-Salz (0,035 g): 1H-NMR
300 MHz, DMSO-d6) δ 9,76 (s, 1H), 9,33 (br s, 1H),
8,07-7,65 (m, 5H), 7,08-6,59 (m, 5H), 4,27 (m, 2H), 3,66 (m, 2H),
3,32 (m, 2H), 3,04 (m, 2H), 2,85 (s, 6H), 2,37 (m, 2H); m/z 576
(M+H).
-
Beispiel
27 [(4-{2-(trans-4-Aminocyclohexylamino)-9-[2-(3-hydroxyphenyl)ethyl]-9H-purin-6-ylamino}phenyl)hydroxyphosphinoylmethyl]phosphonsäure
-
Die
Titelverbindung wurde auf eine ähnliche
Weise wie die für
Beispiel 26 beschriebene synthetisiert. Der weiße Feststoff wurde als sein
TFA-Salz isoliert: m/z 602 (M+H).
-
Beispiel
28 [Hydroxy-(4-{9-[2-(3-hydroxyphenyl)ethyl]-2-[2-(3H-imidazol-4-yl)ethylamino]-9H-purin-6-ylamino}phenyl)phosphinoylmethyl]phosphonsäure
-
Die
Titelverbindung wurde auf eine ähnliche
Weise wie die für
Beispiel 26 beschriebene synthetisiert. Der weiße Feststoff wurde als sein
TFA-Salz isoliert: m/z 599 (M+H).
-
Beispiel
29 [Hydroxy-(4-{2-(2-hydroxyethylamino)-9-[2-(3-hydroxyphenyl)ethyl]-9H-purin-6-ylamino}phenyl)phosphinoylmethyl]phosphonsäure
-
Die
Titelverbindung wurde auf eine ähnliche
Weise wie die für
Beispiel 26 beschriebene synthetisiert. Das Produkt wurde als ein
weißer
Feststoff erhalten: m/z 549 (M+H).
-
Beispiel
30 (5-{2-(trans-4-Aminocyclohexylamino)-9-[2-(3-hydroxyphenyl)ethyl]-9H-purin-6-ylamino}-2-phosphonophenyl)phosphonsäure
-
Die
Titelverbindung wurde auf eine ähnliche
Weise wie die für
Beispiel 26 beschriebene synthetisiert. Der weiße Feststoff wurde als sein
TFA-Salz isoliert: m/z 604 (M+H).
-
Beispiel
31 (5-{9-[2-(3-Hydroxyphenyl)ethyl]-2-[2-(3H-imidazol-4-yl)ethylamino]-9H-purin-6-ylamino}-2-phosphonophenyl)phosphonsäure
-
Die
Titelverbindung wurde auf eine ähnliche
Weise wie die für
Beispiel 26 beschriebene synthetisiert. Der weiße Feststoff wurde als sein
TFA-Salz isoliert: m/z 601 (M+H).
-
Beispiel
32 (5-{2-(2-Dimethylaminoethylamino)-9-[2-(3-hydroxyphenyl)ethyl]-9H-purin-6-ylamino}-2-phosphonophenyl)phosphonsäure
-
Die
Titelverbindung wurde auf eine ähnliche
Weise wie die für
Beispiel 26 beschriebene synthetisiert. Der weiße Feststoff wurde als sein
TFA-Salz isoliert: m/z 578 (M+H).
-
Beispiel
33 (nicht in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen) [Hydroxy-(3-{9-[2-(4-hydroxyphenyl)ethyl-6-phenylamino-9H-purin-2-ylamino}propyl)phosphinoylmethyl]phosphonsäure
-
Die
Titelverbindung wurde auf eine ähnliche
Weise wie die für
Beispiel 26 beschriebene synthetisiert. Das Produkt wurde als ein
weißer
Feststoff erhalten: m/z 547 (M+H).
-
Beispiel
34 (nicht in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen) [Hydroxy-(3-{9-[2-(3-hydroxyphenyl]-6-phenylamino-9H-purin-2-ylamino}propyl)phosphinoylmethyl]phosphonsäure
-
Die
Titelverbindung wurde auf eine ähnliche
Weise wie die für
Beispiel 26 beschriebene synthetisiert. Das Produkt wurde als ein
weißer
Feststoff erhalten: m/z 547 (M+H).
-
Beispiel
35 (nicht in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen) (Hydroxy-{3-[9-(3-hydroxybenzyl)-6-phenylamino-9H-purin-2-ylamino]propyl}phosphinoylmethyl)phosphonsäure
-
Die
Titelverbindung wurde auf eine ähnliche
Weise wie die für
Beispiel 26 beschriebene synthetisiert. Das Produkt wurde als ein
weißer
Feststoff erhalten: m/z 533 (M+H).
-
Beispiel
36 (nicht in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen) [6-(3-Chlorphenylamino)-9-(3-hydroxybenzyl)-9H-purin-2-ylamino]propyl}hydroxyphosphinoylmethyl)phosphonsäure
-
Die
Titelverbindung wurde auf eine ähnliche
Weise wie die für
Beispiel 26 beschriebene synthetisiert. Das Produkt wurde als ein
weißer
Feststoff erhalten: m/z 567 (M+H).
-
Beispiel
37 (nicht in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen) [(3-{6-(3-Chlorphenylamino)-9-[2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]-9H-purin-2-ylamino}propyl)hydroxyphosphinoylmethyl]phosphonsäure
-
Die
Titelverbindung wurde auf eine ähnliche
Weise wie die für
Beispiel 26 beschriebene synthetisiert. Das Produkt wurde als ein
weißer
Feststoff erhalten: m/z 581 (M+H).
-
Beispiel
38 (nicht in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen) [(3-{6-(3-Chlorphenylamino)-9-[2-(3-hydroxyphenyl)ethyl]-9H-purin-2-ylamino}propyl}hydroxyphosphinoylmethyl]phosphonsäure
-
Die
Titelverbindung wurde auf eine ähnliche
Weise wie die für
Beispiel 26 beschriebene synthetisiert. Das Produkt wurde als ein
weißer
Feststoff erhalten: m/z 581 (M+H).
-
Beispiel
39 In
einer anderen Ausführungsform
können
Verbindungen, wie offenbart und hier beschrieben, gemäß dem nachstehend
in Umrissen dargelegten Schema synthetisiert werden: Purin-Syntheseschema
-
Beispiel
40 {[4-(2-Cyclopentyl-9-isopropyl-9H-purin-6-ylamino)phenyl]hydroxyphosphinoylmethyl}phosphonsäure
-
6-Chlor-9-isopropyl-9H-purin-2-ylamin:
-
Zu
6-Chlor-9H-purin-2-ylamin (20 g, 0,12 Mol) in DMF (200 mL) bei –11 °C wurde NaH
(5,7 g, 0,14 Mol, 60%) anteilsweise über 1 h zugegeben. Das Gemisch
wurde für
1 h gerührt,
danach wurde 2-Iodpropan (14,2 mL, 0,14 Mol) zugetropft. Die Lösung wurde
auf RT erwärmt,
für 18
h gerührt,
mit ges. NH4Cl-Lösung gequencht und mit EtOAc
extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit Wasser, ges. NaCl-Lösung gewaschen, danach über MgSO4 getrocknet und filtriert. Konzentration
ergab ein Öl,
das mit Kieselgelchromatographie (60% EtOAc/Hexan) zu einem weißen Feststoff
gereinigt wurde (13,4 g, 54%): MS [M + H]+ 212;
Smp. 135-136 °C.
-
6-Chlor-2-iod-9-isopropyl-9H-purin:
-
6-Chlor-9-isopropyl-9H-purin-2-ylamin
(2,7 g, 12,8 mmol), CuI (1,2 g, 13,4 mmol), I2 (3,3
g, 12,8 mmol), Isoamylnitrit (10,6 mL) und CH2I2 (5,3 g, 39,3 mmol) in THF (60 mL) wurden
für 75
Min. unter Rückfluss
erhitzt. Das Gemisch wurde auf RT abgekühlt, durch Celite filtriert
und auf Kieselgel adsorbiert. Reinigung mit Chromatographie (60%
EtOAc/Hexan) ergab einen schmutzig-weißen Feststoff (13,4 g, 54%):
MS [M + H]+ 323; Smp. 104 °C.
-
{Ethoxy-[4-(2-iod-9-isopropyl-9H-purin-6-ylamino)phenyl]phosphinoylmethyl}phosphonsäurediethylester:
-
6-Chlor-2-iod-9-isopropyl-9H-purin
(1,7 g, 5,2 mmol), [(4-Aminophenyl)ethoxyphosphinoylmethyl]phosphonsäurediethylester
(2,6 g, 7,7 mmol) und DIPEA (2,7 mL, 15,5 mmol) wurden in EtOH (27
mL) gelöst
und in einem verschlossenen Rohr bei 105 °C für 48 h erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde
das EtOH abgezogen. Der Rückstand
wurde in Wasser gegossen und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten
Extrakte wurden mit Wasser, ges. NaCl-Lösung gewaschen, danach über MgSO4 getrocknet und filtriert. Konzentration
ergab ein Öl,
das mit Kieselgelchromatographie (11% MeOH/EtOAc) zu einem glasigen
Feststoff gereinigt wurde (1,8 g, 53%): MS [M + H]+ 621.
-
{{4-(2-Cyclopentyl-9-isopropyl-9H-purin-6-ylamino)phenyl]ethoxyphosphinoylmethyl}phosphonsäurediethylester:
-
Zu
{Ethoxy-[4-(2-iod-9-isopropyl-9H-purin-6-ylamino)phenyl]phosphinoylmethyl)phosphonsäurediethylester
(0,30 g, 0,48 mmol) in DMF (3,9 mL) wurde PdCl2(PPh3)4 (17 mg, 0,024
mmol) zugegeben, gefolgt von Cyclopentylzinkbromid (0,5 M THF, 3,9
mL, 1,9 mmol). Das Gemisch wurde bei RT für 1 h gerührt, in Wasser gegossen und
mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit Wasser,
ges. NaCl-Lösung
gewaschen, danach über
MgSO4 getrocknet und filtriert. Das Material
wurde ohne Reinigung in der nächsten
Umsetzung verwendet.
-
{[4-(2-Cyclopentyl-9-isopropyl-9H-purin-6-ylamino)phenyl]hydroxyphosphinoylmethyl}phosphonsäure:
-
Zu
{[4-(2-cyclopentyl-9-isopropyl-9H-purin-6-ylamino)phenyl]ethoxyphosphinoylmethyl}phosphonsäurediethylester
(0,34 g, 0,6 mmol) in CH3CN (3 mL) bei 0 °C wurde TMSI
(0,98 mL, 7,2 mmol) zugegeben. Das Gemisch wurde für 1 h gerührt, mit
Wasser und Na2S2O5 gequencht. Der pH-Wert der Lösung wurde
mit der tropfenweise Zugabe von 2N NaOH auf 7,5 eingestellt und
mit RP-HPLC (CH3CN/H2O)
gereinigt. Gefriertrocknung ergab einen weißen Feststoff (0,14 g, 59%,
zwei Schritte): MS [M + H]+ 480.
-
Beisipiel 41
-
In
noch einer anderen Ausführungsform
können
Verbindungen, wie hier offenbart und beschrieben, gemäß dem nachstehend
in Umrissen dargelegten Schema synthetisiert werden: Purin-Syntheseschema
Beispiel
42 [4-(2-Cyclopentyl-9-isopropyl-9H-purin-6-ylamino)phenyl]phosphonsäurediethylester
-
(4-Aminophenyl)phosphonsäurediethylester:
-
(4-Nitrophenyl)phosphonsäurediethylester
(7,6 g, 29,1 mmol) und SnCl2 (29,6 g, 0,13
mmol) wurden für
1h unter Rückfluss
erhitzt. Das Gemisch wurde in CH2Cl2 (500 mL) gegossen und mit ges. Na2CO3-Lösung auf
pH-Wert 8 eingestellt. Das so erhaltene Gemisch wurde durch Celite
(CH2Cl2-Waschflüssigkeit)
filtriert und die Schichten getrennt. Die wässrige Schicht wurde mit CH2Cl2 extrahiert und
die vereinigten Extrakte wurden mit Wasser, ges. NaCl-Lösung gewaschen,
danach über
MgSO4 getrocknet und filtriert. Konzentration
ergab einen hellgelben Feststoff (5,9 g, 88%): MS [M + H]+ 230; Smp. 117-118 °C.
-
[4-(2-Iod-9-isopropyl-9H-purin-6-ylamino)phenyl]phosphonsäurediethylester:
-
Identisch
mit dem von Beispiel 40, außer
dem Substrat. Glasiger Feststoff (0,95 g, 60%): MS [M + H]+ 516.
-
[4-(2-Cyclopentyl-9-isopropyl-9H-purin-6-ylamino)phenyl]phosphonsäurediethylester:
-
Identisch
mit dem von Beispiel 40, außer
dem Substrat. Gereinigt mit RP-HPLC (CH3CN/H2O). Gefriertrocknung ergab einen weißen Feststoff
(45 mg, 63%): MS [M + H]+ 458.
-
Die
zusätzlichen
beschriebenen Phosphor enthaltenden Einheiten können gemäß den nachstehend in Umrissen
dargelegten Schemata synthetisiert werden: Beispiel
43 [4-Aminomethyl-2-(diethoxyphosphoryl]phenyl]phosphonsäurediethylester
-
(3,4-Dihydrozybenzyl)carbaminsäure-tert-butylester:
-
4-Aminomethylbenzol-1,2-diol-Hydrobromid
(5,6 g, 25,2 mmol) wurde in CH3CN/H2O 1:1 (100 mL) gelöst. NaHCO3 (4,3
g, 50,4 mmol) wurde zugegeben, gefolgt von Boc2O
(5,5 g, 25,2 mmol). Das Gemisch wurde für 18 h gerührt, konzentriert und mit EtOAc
extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat
getrocknet und zu einem gelbbraunen Feststoff konzentriert, der
ohne Reinigung in der nächsten
Umsetzung verwendet wurde.
-
Trifluormethansulfonsäure-5-(tert-butoxycarbonylaminomethyl)-2-trifluormethansulfonyloxyphenylester:
-
(3,4-Dihydroxybenzyl)carbaminsäure-tert-butylester
(5,5 g, 23,0 mmol), N-Phenyltrifluormethansulfonimid (26,9 g, 75
mmol) und Et3N (14,9 mL, 107 mmol) wurden
in CH2Cl2 (80 mL) gelöst und für 24 h gerührt. Das
Gemisch wurde in Wasser gekippt und die Schichten getrennt. Die
wässrige
Schicht wurde mit Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten Extrakte
wurden mit Wasser gewaschen, über
Magnesiumsulfat getrocknet, konzentriert und mit Kieselgelchromatographie
(Hexan/EtOAc 3:1) gereinigt, was das Produkt als ein braunes Öl ergab
(9,0 g, 78%).
-
[4-(tert-Butoxycarbonylaminomethyl)-2-(diethoxyphosphoryl)phenyl]phosphonsäurediethylester:
-
sTrifluormethansulfonsäure-5-(tert-butoxycarbonylaminomethyl)-2-trifluormethansulfonyloxyphenylester
(5 g, 10,0 mmol), Diethylphosphit (2,8 mL, 20,3 mmol), N-Methylmorpholin
(2,7 mL, 25,1 mmol) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0)
(1,2 g) wurden in wasserfreiem Acetonitril (100 mL) gelöst und in
einem verschlossenen Rohr bei 90 °C
für 48
h erhitzt. Nach dem Abkühlen
wurde das Gemisch mit EtOAc (200 mL) verdünnt und mit Wasser, 1 N HCl
und Salzlösung
gewaschen. Die organische Schicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet,
konzentriert und mit Kieselgelchromatographie (5% MeOH/CHCl3) gereinigt, was das Produkt als ein farbloses Öl ergab
(2,0 g, 42%). 1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 1,35
(m, 12 H), 3,79 (bs, 2H), 3,96 (m, 8H), 7,45 (m, 1H), 7,91 (m, 2H).
-
[4-Aminomethyl-2-(diethoxyphosphoryl)phenyl]phosphonsäurediethylester:
-
[4-(tert-Butoxycarbonylaminomethyl)-2-(diethoxyphosphoryl)phenyl]phosphonsäurediethylester
(2,0 g, 4,2 mmol) wurde in TFA/CH2Cl2 (25%, 20 mL) gelöst und für 3 h gerührt. Das Gemisch wurde unter
einem N2-Strom eingeengt, in EtOAc gelöst und mit
ges. NaHCO3-Lösung gewaschen. Die organische
Schicht wurde über
Magnesiumsulfat getrocknet und zu einem braunen Öl konzentriert (0,9 g, 2,3
mmol), das ohne Reinigung in der nächsten Umsetzung verwendet
wurde.
-
Beispie144: 1-(Bis-diethylphosphonomethylen)-4-aminobenzol
-
Diethyl-(4-(N-trifluoracetylaminobenzyl)phosphonat
-
Zu
Diethyl-(4-aminobenzyl)phosphonat (10 g) in wasserfreiem Dichlormethan
(100 mL) wurde Pyridin (4,0 mL) zugegeben, gefolgt von Trifluoressigsäureanhydrid
(7,0 mL) und bei RT über
Nacht (~18 Std.) gerührt. Das
Reaktionsgemisch wurde sorgfältig
mit einer gesättigten,
wässrigen
Natriumbicarbonatlösung
(10 mL), Salzlösung
(10 mL) gewaschen und das Dichlormethan wurde getrocknet (Na2SO4), was das Produkt
einbrachte (93%). MS: 338 (M-1).
-
-
Diethyl-(4-(N-trifluoracetylamino)-α-brombenryl)phosphonat
-
Zu
dem Diethyl-(4-(N-trifluoracetylaminobenzyl)phosphonat (9,75 g,
41,13 mmol) in wasserfreiem Tetrachlorkohlenstoff (100 mL) wurde
NBS (1,6 g, 41,13 mmol) zugegeben und unter intensivem sichtbaren
Licht unter Rühren
zum Rückfluss
erhitzt, während
welcher Zeit sich ein weißer
Niederschlag bildete. Der Reaktionsansatz wurde auf RT abgekühlt und
danach filtriert. Das Filtrat wurde auf die Hälfte konzentriert, danach über Nacht
im Gefrierfach zum Kristallisieren stehen gelassen. Das kristalline
Produkt wurde durch Filtration abgetrennt (7,2 g, 60%). MS: 416,
418 (M-1 Br79Br80).
-
-
1-(Bis-diethylphosphonomethylen-4-(N-trifluoracetylamino)benzol
-
Zu
Diethyl-(4-(N-trifluoracetylamino)-α-brombenzyl)phosphonat (7,2
g, 17,22 mmol) in wasserfreiem THF (50 mL) wurde Triethylphosphit
(0,82 mL, 17 mmol) zugegeben und unter Rückfluss für 4 h gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde
auf RT abgekühlt
und konzentriert. Der Rückstand
wurde in siedendem Ethylether aufgenommen und auf RT abgekühlt. Der
Feststoff wurde abfiltriert, um 6,0 g Produkt einzubringen (73%). Blassrosa
Feststoff. MS: 476 (M+H), 475 (M-H).
-
-
1-(Bis-diethylphosphonomethylen)-4-aminobenzol
-
Das
vorstehende 1-(Bis-diethylphosphonomethylen-4-(N-trifluoracetylamino)benzol
(1,2 g, 2,52 mmol) in NaOH-Lösung
(0,1 N, 10 mL) wurde für
5 h auf 60 °C
erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf RT abgekühlt und mit Methylenchlorid
extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden über Natriumsulfat
getrocknet und konzentriert, um das Produkt einzubringen (0,85 g,
97%). MS: 412 (M+23).
-
Beispiel
45: G.
Bis-3,4-(diethylphosphonyl)-β-phenylethylamin
5
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N-t-Butoxycarbonyl-3-hydroxytyramin
-
Zu
einer Lösung
von 3-Hydroxytyramin-Hydrochlorid (5,0 g, 26,36 mmol) in Dioxan/Wasser
(50/30 mL) bei 0 °C
wurde Natriumbicarbonat (6,64g, 79,08 mmol) zugegeben und für 10 Min.
gerührt.
Dazu wurde Boc-Anhydrid (7,48 g, 34,275 mmol) zugegeben und bei
RT für
18 h gerührt.
Nach der Entfernung von Dioxan in vacuo, wurde die Aufschlämmung in
Wasser (~60 mL) aufgenommen und in Ethylacetat (25 mL × 3) extrahiert.
Die organischen Stoffe wurden mit 1N HCl (10 mL × 2), gefolgt von Salzlösung (10
mL), gewaschen, getrocknet (Natriumsulfat) und konzentriert, welche
bei Abkühlung
im Kühlschrank
am nächsten
Tag kristallisierten (3,87 g, 57%). MS: 252 (M-H).
-
-
N-t-Butoxycarbonyl-bis-3,4-O-triflyl-β-phenylethylamin
-
Zu
einer Lösung
von N-Boc-3-Hydroxytyramin (3,87 g, 15,28 mmol) in wasserfreiem
Dichlormethan (70 mL) wurde Triethylamin (61,12 mmol) zugegeben,
gefolgt von N-Phenyltriflamid
(16,37 g, 45,84 mmol), und bei RT für 24 h gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde
mit Dichlormethan (100 mL) verdünnt
und nacheinander mit 1N HCl (3 × 10
mL) und Salzlösung
(10 mL) gewaschen und getrocknet (Natriumsulfat). Nach Konzentration
des Dichlormethanextrakts wurde das braune Öl an Kieselgel unter Verwendung
von Hexan/Ethylacetat (10-100%) chromatographiert, was das Produkt
als ein viskoses Öl
gab (6,32 g, 80%). MS: 516 (M-H).
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N-t-Butoxycarbonyl-bis-3,4-(diethylphosphonyl)-β-phenylethylamin
-
Zu
dem N-t-Butoxycarbonyl-bis-3,4-O-triflyl-β-phenylethylamin (6,32 g, 12,21
mmol) in Acetonitril in einer Argonatmosphäre wurden vorsichtig Diethylphosphit
(3,46 mL, 26,87 mmol), N-Methylmorpholin (3,09 mL, 30,54 mmol),
Tetrakistriphenylphosphinpalladium(0) (1,41 g, 1,221 mmol) zugegeben
und nach dem Spülen der
Lösung
mit Argon für
10 Min. wurde zugestöpselt
und für
2 Tage auf 90 °C
erhitzt. Das Acetonitril wurde konzentriert und der Rückstand
wurde mit Ethylacetat verdünnt.
Die organische Schicht wurde mit Citronensäure (10%, 10 mL × 2), Salzlösung (10
mL) gewaschen und getrocknet (Natriumsulfat). Das gelbe Gummi nach
der Konzentration des Ethylacetats wurde mit Flash-Säulenchromatographie
an Kieselgel unter Verwendung von Ethylacetat in Hexan (33%-100%),
gefolgt von Ethylacetat/Methanol (9/1), gereinigt, was ein blassgelbes
Gummi gab (992 mg, 16,5%). MS: 492(M-H).
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-
Bis-3,4-(diethylphosphonyl)-β-phenylethylamin
-
Zu
dem N-t-Butoxycarbonyl-bis-3,4-(diethylphosphonyl)-β-phenylethylamin
(0,992 g, 2,01 mmol) in Dichlormethan (10 mL) wurde TFA (25% in
Dichlormethan, 2,5 mL) zugegeben. Nach 1,5 h wurden die Lösungsmittel
in vacuo entfernt und der Rückstand
wurde mit gesättigter
Natriumbicarbonatlösung
und Dichlormethan (5 mL und 50 mL) verdünnt. Die wässrige Schicht wurde mit Dichlormethan
(25 mL × 2)
rück-extrahiert.
Die vereinigten organischen Stoffe wurden konzentriert, was ein
blassbraunes Gummi gab (0,758 g, 96%), das für den nächsten Schritt rein genug war.
MS: 392 (M-H), 416 (M+23).
-
Beispiel 46: Synthese
von beispielhaften Alkylpurinverbindungen:
-
Es
ist selbstverständlich,
dass in bestimmten beispielhaften Ausführungsformen Purinderivate,
in denen RC eine Alkyleinheit darstellt,
gemäß der in
dem nachstehend abgebildeten Schema beschriebenen, allgemeinen Methodik
hergestellt werden können.
-
Synthese
von R
3 Alkylpurinen
-
Beispiel 47: Verbindungen
-
Bestimmte
Erfindungsverbindungen, wie hier ausführlich beschrieben, werden
wie folgt gezeigt, jedoch ist es selbstverständlich, dass die vorliegende
Erfindung nicht durch jene nachstehend abgebildeten Verbindungen
eingeschränkt
werden soll. Es ist selbstverständlich,
dass viele verschiedene Verbindungen unter Verwendung der Techniken,
wie hier beschrieben, synthetisiert werden können. Bestimmte jener Verbindungen
werden nachstehend abgebildet; jedoch soll die vorliegende Erfindung
nicht durch diese Verbindungen eingeschränkt werden.
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-
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Bestimmte
andere beispielhafte Verbindungen, wie nachstehend abgebildet, können auf
eine ähnliche Weise
wie die hier durch Beispiele erläuterte
synthetisiert werden:
-
Es
ist auch selbstverständlich,
dass, außer
den vorstehend aufgeführten
Verbindungen, die vorliegende Erfindung auch diejenigen Verbindungen
umfasst, in denen RA ein Niederalkylrest
ist oder eine verzweigte aliphatische oder heteroaliphatische Einheit
ist. In bestimmten Ausführungsformen
ist RA Methyl oder Ethyl und in bestimmten
anderen Ausführungsformen
ist RA Isopropyl.
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Beispiel 48: In-vitro-
und In-vivo-Tests und beispielhafte biologische Daten:
-
Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
können
in vielen verschiedenen Tests beurteilt werden, um ihre biologischen
Wirkungen zu bestimmen. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Verbindungen
auf ihre Fähigkeit
getestet werden, die Src-Kinase oder andere Proteinkinasen zu hemmen,
an Knochen zu binden, Knochenresorption zu hemmen oder anderweitig
die relative Dynamik der Knochenhomöostase zu verbessern. Die Verbindungen
können
auch auf ihre cytotoxischen und wachstumshemmenden Wirkungen auf
Tumorzellen von Interesse beurteilt werden.
-
A. Anti-Resorptions-Zelltest
(Kaninchen-Osteoklast):
-
Oberschenkelknochen,
Schienbeinknochen und Schulterblätter
wurden von 3-4 Tage alten weißen Neuseeland-Kaninchen
(Millbrook Farms, Amherst, MA) isoliert. Die Knochen wurden zerhackt
und in a-MEM (Gibco-BRL), das 0,55 g/L NaHCO3,
10 mM HEPES (Gibco-BRL), 50 Einheiten/ml Penicillin und 0,05 mg/ml Streptomycin,
pH-Wert 7,1, enthielt, klein geschnitten. Man ließ die Knochenbruchstücke durch
die Schwerkraft absetzen, der Überstand
wurde gesammelt und bei 400 U/Min. (Beckman GS-6KR) für zwei Minuten
zentrifugiert und das Zellpellet wurde in dem gleichen Medium, ergänzt mit
10% HIFBS (Hyclone), resuspendiert. Für Bindungsvorversuche wurden
0,75 ml der Zellsuspension zu Vertiefungen zugegeben, die Pottwal-Dentinplatten
enthielten, die für
2 Stunden mit 0,75 ml Kulturmedium, das eine 2×-Konzentration der Testverbindung enthielt,
vorinkubiert worden waren. In einer anderen Ausführungsform wurden 0,75 ml der
Zellsuspension zu jeder Vertiefung zugegeben, die Dentinscheiben
enthielt, die mit 0,75 ml Kulturmedium alleine vorinkubiert worden
waren, und die Testverbindung wurde nach der Adhäsionsphase zugegeben. Das Pottwaldentin
wurde in 1 mm × 6
mm große,
kreisförmige
Platten geschnitten. Die Adhäsionphase
wurde für
30 Minuten bei 37°C und
5% CO2 ausgeführt und danach wurden das Medium
und nicht-anhaftende Zellen und Zelltrümmer durch Absaugen entfernt.
Frisches Kulturmedium, das serienmäßig verdünnte Testverbindungen enthielt,
wurde zugegeben und die Zellen wurden auf dem Dentin für 24 Stunden
bei 37°C
und 5% CO2 inkubiert. Nach der Resorptionsphase
wurden die Dentinscheiben für
30 Sekunden in 0,5%igem Natriumhypochlorit eingeweicht, anhaftende
Zellen abgewischt und danach für
30-45 Sekunden mit 1 %igem Toluidinblau angefärbt. Die Resorption wurde mit
einem Lichtreflexionsmikroskop und automatisierter Bildanalyse gemessen.
Die resorbierte Fläche
wurde auf der gesamten 6 mm-Platte gemessen. Die restlichen Zellen
in den 24-Mulden-Platten wurden auf Tartrat-resistente saure Phosphatase
(TRAP) angefärbt
und auch visuell auf das Vorhandensein von Fibroblasten beurteilt.
Versuche wurden ausgeführt,
die dreifache Proben für
jede Konzentration der getesteten Verbindung mit fünf unbehandelten
Kontrollproben pro Platte enthielten. Die IC50-Werte
wurden berechnet, bezogen auf die %-Resorption in Gegenwart der
Verbindung, gegenüber
den mit Vehikel alleine behandelten Kontrollproben. Die Daten wurden
aus mindestens drei unabhängigen
Versuchen, die jeweils dreifache Proben enthielten, berechnet.
-
Allgemein
sind in diesem Test IC50-Werte unter etwa
10 μM von
speziellem Interesse, während
Ergebnisse unter 500 nM bevorzugt sind und Ergebnisse unter etwa
100 nM besonders bevorzugt sind.
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Bestimmte
Ausführungsformen,
in welchen RC eine Einheit -NR ist, wobei
R eine niederaliphatische Einheit ist, die substituiert ist mit
(a) einem Pyridinring, der einen-PO(OR1)2-Substituenten
trägt,
oder (b) einem -CX[PO(YR1)2]2-Substituenten, wobei X H, -OH oder Niederalkyl
bedeutet; RA eine cyclische oder acyclische aliphatische
oder heteroaliphatische Einheit ist oder eine gegebenenfalls mit
einer oder mehreren Hydroxyleinheiten substituierte Aryl- oder Alkylaryleinheit
ist; und RB eine substituierte oder unsubstituierte
Aryleinheit ist, haben zu IC50-Werten im
Bereich von etwa 4 μM
bis etwa 100 μM
geführt.
In bestimmten jener Ausführungsformen
ist R1 ein Wasserstoffatom und in bestimmten
anderen Ausführungsformen
ist mindestens eines der R1 eine Alkyleinheit.
-
Beurteilung
von Verbindungen der Formel:
in denen R
A eine
cyclische oder acyclische aliphatische oder heteroaliphatische Einheit
oder eine gegebenenfalls mit einer oder mehreren Hydroxyleinheiten
substituierte Alkylaryleinheit ist; R
C eine
mit einer cyclischen oder acyclischen aliphatischen oder heteroaliphatischen
Einheit, die eine oder mehrere substituierte oder unsubstituierte
Aminoeinheiten aufweist, substituierte Aminoeinheit ist oder eine
Hydroxyl-, Halogen-, Alkoxy- oder Heterocycluseinheit ist; diese
haben IC
50-Werte im Bereich von etwa 1 μM bis etwa
100 μM ergeben.
-
Andere
Verbindungen, in denen RB ein Phenylring
ist, der einen p-CH[PO(YR1)2]2-Substituenten trägt, oder eine Aryleinheit mit
einer -PO(YR1)2-Einheit
in sowohl der meta- als auch der para-Stellung ist; RA eine cyclische
oder acyclische, aliphatische Einheit oder eine gegebenenfalls mit
einer oder mehreren Hydroxyleinheiten substituierte Alkylaryleinheit
ist; und RC eine Aminoeinheit ist, die mit
einer gegebenenfalls mit einer oder mehreren Amino- oder substituierten
Aminoeinheiten substituierten cyclischen oder acyclischen aliphatischen oder
heteroaliphatischen Einheit substituiert ist, haben IC50-Werte
im Bereich von –1 μM bis etwa
20 μM ergeben.
-
B. Kinasetests
-
Außer ihrer
Fähigkeit,
die Knochenresorption zu hemmen, sind die erfindungsgemäßen Verbindungen auch
fähig,
die Proteinkinaseaktivität
zu hemmen.
-
Das
folgende Beispiel schildert ein allgemeines Verfahren zur Bestimmung
der Wirkung der Erfindungsverbindungen auf die Phosphorylierung
von einem Ziel der Kinase.
-
Eine
gereinigte oder teilweise gereinigte Kinase wird mit einem Peptid,
das die Zielsequenz der Kinase umfasst, unter Bedingungen inkubiert,
die für
die Kinase geeignet sind, ihre Zielsequenz von Aminosäuren (d.h.
Protein, Peptid) zu phosphorylieren. Die speziellen Bedürfnisse
der Kinase können
von einem Fachmann empirisch bestimmt werden oder die Bedingungen,
die für
eine spezielle Kinase (siehe beispielsweise Tabelle I in Boutin „Tyrosine
protein kinase assays" J.
Chromatography B 684:179-199, 1996; hier durch Bezugnahme aufgenommen)
veröffentlicht
worden sind, können
verwendet werden. Das Ausmaß der
Phosphorylierung des Zielpeptids wird in Gegenwart und Abwesenheit
der Erfindungsverbindung bestimmt und kann in Gegenwart variierender
Konzentrationen der Erfindungsverbindung bestimmt werden. Die Phosphorylierungsrate
kann mit jeglichen, auf dem Fachgebiet bekannten Mitteln, einschließlich elektrophoretischer
Tests, chromatographischer Tests, Phosphocellulose-Tests etc., bestimmt
werden.
-
In
einem Elektrophoresetest wird ein radiomarkierter Phosphatdonor
wie z.B. ATP oder GTP mit dem Peptidsubstrat in Gegenwart einer
Kinase inkubiert. Das phosphorylierte Substrat wird gegen den Phosphatdonor
(z.B. ATP, GTP) über
Dünnschicht-Elektrophorese
getrennt (Hunter J. Biol. Chem. 257:4843, 1982; hier durch Bezugnahme
aufgenommen). Jegliche Matrix kann in dem Elektrophoreseschritt
verwendet werden, einschließlich
Polyacrylamid, Cellulose etc. Das Ausmaß der Phosphorylierung kann
danach durch Autoradiographie oder Szintillationszählung bestimmt
werden.
-
Der
markierte Phosphatdonor kann durch Standard-Chromatographietechniken
von der phosphorylierten Aminosäuresequenz
getrennt werden. Jegliche Matrix kann verwendet werden, um die Trennung
zu bewirken, einschließlich
Ionenaustauschharze, PEI-Cellulose, Kieselgel etc.. Standard-Säulenchromatographieverfahren
können
verwendet werden oder HPLC-Verfahren können für schnellere, sauberere Trennungen
verwendet werden. Die radiomarkierten Peptide werden mit Szintillationszählung nachgewiesen,
um die Phosphorylierungsrate zu bestimmen.
-
Ein
anderes Verfahren, das historisch das beliebteste ist, ist der Phosphocellulosepapiertest,
erstmalig von Witt et al. (Witt et al. Anal. Biochem. 66:253, 1975;
hier durch Bezugnahme aufgenommen) beschrieben. Dieses Verfahren
ist gut an die Durchmusterung von Hemmstoffen angepasst (Traxler
et al. J. Med. Chem. 34:2328, 1991; hier durch Bezugnahme aufgenommen).
-
Immunologische
Verfahren können
auch verwendet werden, um die Phosphorylierung eines Peptid- oder
Proteinsubstrats nachzuweisen. Beispielsweise können bei der Detektion oder
Ausfällung
von phosphorylierten Aminosäuresequenzen
anti-Phosphotyrosin-Antikörper
verwendet werden. Das Verfahren hat den Vorteil, keine Verwendung
von radiomarkiertem ATP zu erfordern.
-
Beim
Vergleich der Phosphorylierungsraten in Ggenwart und Abwesenheit
der Testverbindung sollte die Verbindung zu mindestens einer 25%
Abnahme der Phosphorylierungsrate führen, stärker bevorzugt zu mindestens
einer 50% und am meisten bevorzugt zu mindestens einer 75% Abnahme.
Diese Abnahmen werden vorzugsweise bei mikromolaren Konzentrationen
der Verbindung erhalten und stärker
bevorzugt bei nanomolaren Konzentrationen (z.B. weniger als 100
nM). Außerdem
kann ein quantitativer Kinaseaktivitätstest unter Verwendung einer
96-Mulden-Platte
bestimmt werden. Das folgende Beispiel ist von dem von Asthagiri et
al. (Anal. Biochem. 269:342-347, 1999; hier durch Bezugnahme aufgenommen)
beschriebenen Test angepasst worden. Dieser Test erlaubt die Durchmusterung
von einer großen
Anzahl potentieller Kinasehemmstoffe mit hohem Durchsatz.
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Die
Oberfläche
einer Mikrotiterplatte wird mit gegen die zu untersuchende Kinase
gerichteten Antikörpern
beschichtet. Reacti-Bind-Protein A-beschichtete Vertiefungen (Pierce,
Rockford, IL) werden über
Nacht bei 4°C
mit 50 μL
von 10 μg/ml
Antikörper
in Blockierungspuffer, der 1% BSA, 50 mM Tris (pH-Wert 7,5), 150 mM
NaCl und 0,05% Triton enthält,
inkubiert. Die Vertiefungen werden danach dreimal mit Blockierungspuffer gewaschen.
Ein Zelllysat, das die zu untersuchende Kinase enthält, wird
in Lysepuffer auf ein Gesamtvolumen von 50 μl verdünnt und für 3 Stunden bei 4°C inkubiert,
um dem Antikörper
zu ermöglichen,
die Kinase einzufangen. Um den Hintergrund zu messen, wird eine
getrennte Vertiefung nur mit Lysepuffer inkubiert und wird den ganzen
Test hindurch auf die gleiche Weise wie andere Proben gehandhabt.
Jede Vertiefung wird danach zweimal mit 200 μl Waschpuffer, der 50 mM Tris
(pH-Wert 7,5) und 150 mM NaCl enthält, gewaschen und weitere zwei
Male mit 200 μl
Kinase-Waschpuffer,
der 20 mM Tris (pH-Wert 7,5), 15 mM Magnesiumchlorid, 5 mM (3-Glycerinphosphat
(pH-Wert 7,3), 1 mM EGTA, 0,2 mM Natriumorthovanadat und 0,2 mM
DTT enthält.
Der Inhalt der Vertiefungen wird danach in 20 μl Kinase-Waschpuffer resuspendiert.
-
Zu
jeder Vertiefung werden danach 20 μl von 2 mg/ml Substrat, das
die Ziel-Aminosäuresequenz
der Kinase enthält,
zugegeben. Um die in-vitro-Umsetzung zu starten, werden 20 μl Kinase-Testpuffer,
der 20 mM Tris (pH-Wert 7,5), 15 mM Magnesiumchlorid, 5 mM (3-Glycerinphosphat
(pH-Wert 7,3), 1 mM EGTA, 0,2 mM Natriumorthovanadat, 0,2 mM DTT,
0,4 μM Proteinkinase
A-Inhibitorpeptid (Upstate Biotech, Lake Placid, NY), 4 μM Proteinkinase
C-Inhibitorpeptid (Upstate Biotech), 4 μM Calmidazolium (Upstate Biotech),
25 μM ATP und
6 μCi [32P]ATP enthält, zu zwei Vertiefungen zugegeben.
Zu einer der Vertiefungen wird die Testverbindung mit einer Konzentration,
die sich zwischen 1 mM und 1 nM bewegt, zugegeben. Die Reaktionsinhalte
werden unter Bewegung mit dem Jitterbug (Boekel, Feasterville, PA)
bei 37°C
gehalten. Nach 10 Minuten werden die Umsetzungen mit 60 μl 75 mM Phosphorsäure gequencht.
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[32P]-markiertes Substrat wird von nicht umgesetztem
[32P]-ATP getrennt, indem 40 μl des gequenchten
Reaktionsinhalts durch ein Phosphocellulosefilter unter Verwendung
des Millipore-Multiscreen-Systems (Millipore,
Bedford, MA) filtriert werden. Jeder Filter wird fünfmal mit
200 μl 75
mM Phosphorsäure
gewaschen und dreimal mit 200 μl
70%igem Ethanol. Man lässt
die Filter trocknen, bevor die Filter in Szintillationsfläschchen
herausgeschlagen werden. Die 32P-Mengen
dem Filterpapier werden unter Verwendung von CytoScint-Szintillationsflüssigkeit
(ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA) und einem RackBeta-Szintillationszähler (Wallac,
Gaithersburg, MD) quantifiziert. Die 32P-Messungen
werden abgeglichen, indem die mit der Hintergrundprobe verbundene
Radioaktivität
abgezogen wird, und die in Gegenwart und Abwesenheit der Testverbindung beobachteten
Messungen werden verglichen.
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Falls
gewünscht,
kann ein Test verwendet werden, der die Immunpräzipitation der Kinase einbezieht. Der
folgende derartige Test wurde von dem Verfahren nach Bondzi et al.
(Oncogene 19:5030-5033, 2000; hier durch Bezugnahme aufgenommen)
angepasst.
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Zellen,
die die Kinase von Interesse exprimieren, werden einmal in PBS gewaschen
und in Puffer, der 20 mM Tris (pH-Wert 7,9), 137 mM NaCl, 5 mM EDTA,
1 mM EGTA, 10 mM NaF, 1 mM Natriumpyrophosphat, 100 μM (3-Glycerinphosphat,
10 μg/m1
Aprotinin, 1 mM PMSF, 10% Glycerin und 1 Vol.-% Triton X-100 enthält, aufgelöst. Das
Lysat wird durch Zentrifugation bei 10.000 × g für 10 Minuten bei 4°C geklärt. Die
Proteinkonzentrationen werden mit dem BCA-Verfahren (Pierce, Rockford,
IL, USA) bestimmt. 500 μg
des Lysatproteins werden danach zu 2 μg des monoclonalen anti-Kinase-Antikörpers, der
gegen einen Anteil des Proteins gerichtet ist, zugegeben. Die Antikörper werden
vorher durch Inkubation für
eine Stunde bei 4°C
an einem langsamen Rotator an 100 μl Protein A + G-Agarosekügelchen
(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, KA, USA) gebunden. Steigende
Menge an Lysatprotein (0, 50, 100, 200, 400, 800 und 1600 μg) oder steigende
Mengen an anti-Kinase-Antikörper (0,
0,5, 1,0, 2,0 und 4,0 μg)
werden in dem Immunpräzipitationsschritt
verwendet. Der Immunkomplex wird dreimal in eiskaltem Lysepuffer,
einmal in eiskaltem Waschpuffer, der 10 mM HEPES (pH-Wert 7,4),
100 mM NaCl, 20 μg/ml
Aprotinin und 0,5% NP-40 enthält,
und einmal in eiskaltem Reaktionspuffer, der 20 mM Tris (pH-Wert
7,4), 20 mM NaCl, 1 mM DTT, 10 mM MgCl2 und
1 mM MnCl2 enthält, gewaschen. Die Kinasereaktion
wird in Gegenwart von 20 μM
ATP und 500 ng des Peptidsubstrats in einem Gesamtvolumen von 40 μl des Reaktionspuffers
bei 30°C
für 30
Minuten unter sanftem Rütteln
durchgeführt.
Die Kinasereaktion kann mit steigenden Inkubationsintervallen (0,
5, 10, 15, 20, 25 und 30 Minuten), steigenden Mengen des Substrats
(0, 100, 200, 400 und 500 ng) und steigenden Konzentrationen der
Testverbindung (0, 1, 10, 100, 1000, 10.000 und 100.000 ng) durchgeführt werden.
Die Kinasereaktion wird durch die Zugabe von 40 μl 2 × SDS-Probepuffer, gefolgt
von Kochen für
10 Minuten, beendet. Die Proben werden durch SDS-PAGE aufgelöst, auf
eine Immobilon-P-Membran
(Millipore Corp., Bedford, MA, USA) überführt und mit einem polyclonalen
Phosphosubstrat-Antikörper
sondiert. Der Antikörper
wird von dem Blot abgelöst
und nacheinander auf Kinase und Substrat mit anti-Kinase-Antikörper beziehungsweise
anti-Substrat-Antikörper wieder
sondiert. Die Detektion wird mit dem ECL-Plus-Chemilumineszenzsystem (Amersham, Arlington
Heights, IL, USA) erreicht und mit einer gekühlten Fuji-CCD-Kamera und dem
Aida 2.0-Softwarepaket (Raytest Inc., New Castle, DE, USA) sichtbar
gemacht.
-
Um
dies zu veranschaulichen, wird ein Src-Kinase-Hemmtest genutzt,
wie nachstehend ausführlich beschrieben:
Die
Verbindungen wurden mit der Szintillationsproximitätstest (SPA)-Technologie,
wie von Amersham entwickelt, auf ihre Fähigkeit, die Src-Kinase zu
hemmen, getestet. Die Reagenzien schließen ein: Streptavidin-SPA-Kügelchen
von Amersham, 2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure von Sigma, ATP von Boehringer Mannheim,
[33P]-ATP von NEN (NEG 602H), das Substrat – biotinyliertes
Peptidsubstrat 1 (PKS1) (cdc2-Peptid) von Pierce, das mit 12,5 μM (5×-Lösung) in
Kinasepuffer hergestellt wird, und das Enzym, menschliches, rekombinantes
c-Src mit 135 g/ml (Stammlösung),
das vor der Verwendung 1/40 in Kinasepuffer (3,38 μg/ml) verdünnt wird.
Die Puffer schließen
ein: (a) Kinasepuffer, der MES 30 mM, pH-Wert 6,8, MgCl2 10
mM, Orthovanadat 0,25 mM, PMSF 0,1 mM und DTT 1mM enthält; (b)
ATP-Puffer, der ATP 5 mM in MgCl2 50 mM-Puffer enthält (Stammlösung). Man
beachte, dass vor jeder Verwendung in MES auf 100 μM (5×-Lösung) verdünnt und
100 μCi/mL
[33P]-ATP zugegeben werden; und (c) PBS-Stopp-Puffer,
der ATP 0,1 mM, EDTA 40 mM, Triton 0,1 % enthält. Die Streptavidinkügelchen
werden mit 3,3 mg/ml in Stopp-Puffer suspendiert und durch Schütteln gemischt.
Die Kinasereaktion läuft
ab, indem zu den Vertiefungen auf der 96-Mulden-Platte schrittweise
das Folgende zugegeben wird: (a) 10 μl Kinasepuffer + 10% DMSO oder
die zu testende Verbindung mit verschiedenen Konzentrationen in
MES + 10 % DMSO, (b) 10 μl
Kinasepuffer, (c) 10 μl
Substrat 12,5 μM, (d)
10 μl Enzym
3,38 μg/ml
und (e) 10 μl
ATP 100 μM,
das 0,2 μCi
[33P]-ATP enthält. Inkubation für 2 Stunden bei
30°C wird
gefolgt von Zugabe von 150 μl
Stopp-Puffer, der 500 μg
Streptavidinkügelchen
enthält.
Die Inkubation läuft
für 30
Min. bei Raumtemperatur ab, gefolgt von Zentrifugation für 5 Min.
bei 2000 U/Min. und dem Lesen von einem Wallac-Microbeta-Szintillationszähler.
-
Beispielhafte in-vitro-Daten
für den
Src-Kinasehemmtest:
-
1)
Von vielen Verbindungen, einschließlich derjenigen der allgemeinen
Struktur:
mit verschiedenen Substituenten,
wie hier beschrieben, ist festgestellt worden, dass sie die Kinaseaktivität von Src
mit einem IC
50-Wert von etwa 1 nM bis etwa
1μM hemmen.
Jene Verbindungen schließen
Ausführungsformen
ein, in welchen R
B eine der beiden folgenden
Strukturen aufweist:
Andere Verbindungen mit inhibitorischer
Kinaseaktivität
in diesem Bereich schließen
diejenigen ein, in welchen R
C die allgemeine
Struktur:
aufweist,
in welcher M
x in diesem Fall eine Bindung
ist oder eine lineare oder verzweigte aliphatische Einheit und n
0 oder 1 ist, in welcher R
A eine cyclische
oder acyclische aliphatische Einheit ist und in welcher R
C eine Aminoeinheit ist, die mit einer gegebenenfalls
mit einer oder mehreren Aminoeinheiten substituierten cycloaliphatischen
oder cycloheteroaliphatischen Einheit substituiert ist. Aktivität in der
Höhe um
15 μM herum
wurde mit derartigen Verbindungen gesehen.
-
C. Hydroxylapatit-Test:
-
Hydroxylapatit
ist die Hauptmineralkomponente von Knochen. Hydroxylapatit-Adsorptionschromatographie
wird als ein Test verwendet, um das Potential, auf Knochen zu zielen,
von sowohl einzelnen auf Knochen zielenden Einheiten („Monomere") als auch von Pharmazeutika,
in die auf Knochen zielende Reste eingearbeitet sind, zu beurteilen.
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Verfahren:
Die Retentionszeit einer Testverbindung wird mit einem linearen
Gradienten von 10 mM Natriumphosphat, 0,15 N NaCl, pH-Wert = 6,8
bis 500 mM Natriumphosphat, 0,15 N NaCl, pH-Wert = 6,8 an einer TSK-Gel
HA 1000 Hochdruckflüssigchromatographiesäule (7,5
mm × 75
mm) gemessen. Die Retentionszeit der Verbindung wird in Form von
K = (Retentionszeit-Leerzeit)/Leerzeit ausgedrückt. Dieser K-Wert wird unter Verwendung
von zwei Referenzverbindungen, um die Inter-Säulen- und Inter-System-Abweichung
zu korrigieren, korrigiert, um einen K'-Wert zu erhalten.
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Referenzverbindungen:
K'-Werte wurden
für bekannte,
auf Knochen zielende Verbindungen, das Bisphosphonat Alendronat
und Tetrazyklin, bestimmt. Alendronat ergab eine K'-Wert von 3,7 und
Tetrazyklin ergab einen K'-Wert
von 2,0.
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D. In-Vivo-Testung der
antiresorptiven Aktivität
in Hyperkalzämie-Maus
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Ein
Maus-Hyperkalzämiemodell
zur Bestimmung der Wirksamkeit von Src-Kinasehemmstoffen wurde entwickelt.
Dieses Modell nützt
die intrinsischen Wirkungen von PTH (1-34) aus, um die resorptive
Aktivität
von Osteoklasten in vivo zu stimulieren. Kurz, die Verbindungen
werden jeweils Mäusen
subkutan injiziert, einmal oder zweimal pro Tag für fünf aufeinanderfolgende Tage.
Am dritten Tag der Behandlungen mit den Verbindungen beginnt die
PTH-Verabreichung. PTH (20 μg/kg)
wird viermal pro Tag gegeben, subkutan, bis zum Ende der Untersuchung.
Kontrolltiere erhalten PTH, erhalten aber keine Testverbindungen.
Blutproben werden den Tieren abgenommen, um Grundlinien- (vor PTH-Behandlung),
48-Stunden- und 72-Stunden-(nach
Beginn der PTH-Behandlung) Serumproben zu erhalten. Die Serumproben
werden mit dem Reagenz Arsenazo III (Sigma) für quantitative kolorimetrische
Tests auf die Calciumkonzentration analysiert. Die Serumcalciumspiegel
der behandelten Gruppen werden mit Serumcalciumspiegeln der Kontrollgruppen
verglichen und ein Prozentsatz der Hemmung der Hyperkalzämie wird
für jeden
Zeitpunkt berechnet. Wenn eine Verbindung bei der Hemmung der Osteoklastenaktivität wirksam
ist, sind die beobachteten Serumcalciumkonzentrationen niedriger
als bei Tieren, die nur PTH in Abwesenheit der Testverbindung erhalten.
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Beispielhafte In-vivo-Daten
für Maus-Hyperkalzämie:
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Eine
Reihe von erfindungsgemäßen Verbindungen
haben, wenn sie in dem Mausmodell, wie vorstehend beschrieben, beurteilt
wurden, in welchem die Verbindungen BID mit Mengen von 10 mg/kg
und 3 mg/kg verabreicht wurden und Serumcalciumspiegel an Tag 3
der Untersuchung geprüft
wurden, hemmende Wirkungen um 30 – 95% herum und um 10 bis 60%
herum (der PTH-induzierten Zunahme des Serumcalciums bei Kontrolltieren)
bei den höheren
beziehungsweise niedrigeren Dosen ergeben, was auf biologische Aktivität in den
Tieren hindeutet.
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E. Cytoxizität und Hemmung
des Tumorwachstums:
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Von
bestimmten erfindungsgemäßen Verbindungen
sind auch cytotoxische oder wachstumshemmende Wirkungen auf Tumor-
und andere Krebszelllinien bewiesen worden und sie können somit
in der Behandlung von Krebs und anderen proliferativen Zellerkrankungen
verwendbar sein. Die Verbindungen werden mit in-vivo- und in-vitro-Tests,
die Fachleuten gut bekannt sind, auf Antitumoraktivität getestet.
Generell werden Anfangsdurchmusterungen von Verbindungen, um Kandidaten
für Arzneistoffe
gegen Krebs zu identifizieren, in in-vitro-Zelltests durchgeführt. Verbindungen, für die anti-zellproliferative
Aktivität
erkannt wurde, können dann
anschließend
in ganzen Organismen auf Antitumoraktivität und Toxizität getestet
werden. Die Anfangsdurchmusterungen sind vorzugsweise Zelltests,
die schnell und kosteneffektiv durchgeführt werden können, gegenüber Tests,
die ganze Organismen verwenden. Für die Zwecke der vorliegenden
Erfindung wird der Begriff „antiproliferative
Verbindung" für Verbindungen
verwendet, die die Fähigkeit
aufweisen, das Fortschreiten der Zellen durch den Zellzyklus und
die Teilung zu hindern oder zu stoppen. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung
werden die Begriffe „Antitumor"-Aktivität und Aktivität „gegen
Krebs" untereinander
austauschbar verwendet.
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Verfahren
zur Bestimmung der Zellproliferation sind gut bekannt und können verwendet
werden, um Verbindungen mit antiproliferativer Aktivität zu identifizieren.
Im Allgemeinen sind Zellproliferations- und Zelllebensfähigkeitstests
so angelegt, dass sie ein nachweisbares Signal liefern, wenn die
Zellen metabolisch aktiv sind. Die Verbindungen werden auf anti-Zellproliferationsaktivität getestet,
indem auf eine Abnahme in der metabolischen Aktivität getestet
wird. Gebräuchliche
Verfahren zur Bestimmung der Zelllebensfähigkeit hängen beispielsweise ab von
der Unversehrtheit der Membran (z.B. Trypanblau-Ausschluß) oder
dem Einbau von Nucleotiden während
der Zellproliferation (z.B. BrdU oder 3H-Thymidin).
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Bevorzugte
Verfahren zur Testung der Zellproliferation nutzen Verbindungen,
die während
der Zellproliferation in eine nachweisbare Verbindung umgewandelt
werden. Besonders bevorzugte Verbindungen sind Tetrazoliumsalze
und schließen
MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid; Sigma-Aldrich,
St. Louis, MO), MTS (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium),
XTT (2,3-Bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilid),
INT, NBT und NTV (Bernas et al. Biochim. Biophys. Acta 1451(1):73-81,
1999) ohne Einschränkung
ein. Bevorzugte Tests, die Tetrazoliumsalze nutzen, weisen Zellproliferation
nach, indem sie das Produkt der enzymatischen Umwandlung der Tetrazoliumsalze
in blaue Formazanderivate, die ohne weiteres mit spektroskopischen
Verfahren nachgewiesen werden, nachweisen (Mosman, J. Immunol. Methods
65:55-63, 1983).
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Generell
beziehen bevorzugte Verfahren für
die Testung der Zellproliferation das Inkubieren der Zellen in einem
gewünschten
Wachstumsmedium mit und ohne die Verbindungen, die getestet werden
sollen, ein. Wachstumsbedingungen für verschiedene prokaryontische
und eukaryontische Zellen sind Fachleuten mit normalen Kenntnissen
bekannt (Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology,
Wiley and Sons, 1999; Bonifacino et al. Current Protocols in Cell
Biology, Wiley and Sons, 1999, beide hier durch Bezugnahme aufgenommen).
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Um
Zellproliferation nachzuweisen, werden die Tetrazoliumsalze zu den
inkubierten, kultivierten Zellen zugegeben, um die enzymatische
Umwandlung in das nachweisbare Produkt durch aktive Zellen zu ermöglichen.
Die Zellen werden verarbeitet und die optische Dichte der Zellen
wird bestimmt, um die Menge an Formazanderivaten zu messen. Darüber hinaus
sind im Handel erhältliche
Kits, einschließlich
der Reagenzien und Protokolle, beispielsweise von Promega Corporation
(Madison, WI), Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) und Trevigen (Gaithersburg,
MD) erhältlich.
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Jegliche
kultivierte Zelllinie kann verwendet werden, um Verbindungen auf
antiproliferative Aktivität
zu durchmustern. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung
schließen
genutzte Zelllinien ein, sind aber nicht beschränkt auf, beispielhafte, für die Bestimmung
der Fähigkeit
der Erfindungsverbindungen, die Zellproliferation zu hemmen, genutzte
Zelllinien schließen
ein, sind aber nicht beschränkt
auf COLO 205 (Dickdarmkrebs), DLD-1 (Dickdarmkrebs), HCT-15 (Dickdarmkrebs),
HT29 (Dickdarmkrebs), HEP G2 (Hepatom), K-562 (Leukämie), A549
(Lungenkrebs), NCI-H249 (Lungenkrebs), MCF7 (Brustkrebs), MDA-MB-231
(Brustkrebs), SAOS-2 (Osteosarkom), OVCAR-3 (Eierstockkrebs), PANC-1
(Bauchspeicheldrüsenkrebs),
DU-145 (Prostatakrebs), PC-3 (Prostatakrebs), ACHN (Nierenkrebs),
CAKI-1 (Nierenkrebs), MG-63 (Sarkom).
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Vorzugsweise
ist die Zelllinie eine Säuger-Zelllinie,
ist aber nicht auf Säugerzellen
beschränkt,
da eukaryontische Zellen niederer Ordnung wie z.B. Hefe auch verwendet
werden können,
um Verbindungen zu durchmustern. Bevorzugte Säuger-Zelllinien stammen von
Menschen, Ratten, Mäusen,
Kaninchen, Affen, Hamstern und Meerschweinchen, da Zelllinien von
diesen Organismen gut untersucht und charakterisiert sind. Jedoch
schränkt
die vorliegende Erfindung die Verwendung von Säuger-Zelllinien nicht auf nur
die aufgeführten
ein.
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Geeignete
Säuger-Zelllinien
leiten sich oft von Tumoren ab. Beispielsweise können die folgenden Tumorzellarten
Quellen für
Zellen für
die Kultivierung sein: Melanom, myeloische Leukämie, Karzinome der Lunge, Brust,
Eierstöcke,
des Dickdarms, der Nieren, Prostata, Bauchspeicheldrüse und Hoden,
Kardiomyocyten, Endothelzellen, Epithelzellen, Lymphocyten (T-Zelle
und B-Zelle), Mastzellen, Eosinophile, Zellen der Gefäßintima,
Hepatocyten, Leukocyten, einschließlich mononukleärer Leukocyten,
Stammzellen wie z.B. hämopoetische,
Nerven-, Haut-, Lungen-, Nieren-, Leber- und Muskelzelt-Stammzellen
(zur Verwendung bei der Durchmusterung auf Differenzierungs- und
Entdifferenzierungs-Faktoren), Osteoklasten, Knorpelzellen und andere Bindegewebszellen,
Keratinocyten, Melanocyten, Leberzellen, Nierenzellen und Fettzellen.
Nicht-limitierende Beispiele für
Säuger-Zelllinien,
die von Forschern häufig
verwendet worden sind, schließen
HeLa, NIH/3T3, HT1080, CHO, COS-1, 293T, WI-38 und CV-1/EBNA-1 ein.
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Andere
in-vitro-Zelltests können
verwendet werden, die auf einem Reportergen basieren, um metabolisch
aktive Zellen nachzuweisen. Nicht-limitierende Beispiele für Reportergen-Expressionssysteme
schließen grün-fluoreszierendes
Protein (GFP) und Luciferase ein. Als ein Beispiel für die Verwendung
von GFP, um potentielle Antitumor-Arzneistoffe zu durchmustern,
Sandman et al. (Chem. Biol. 6:541-51; hier durch Bezugnahme aufgenommen)
verwendeten HeLa-Zellen, die eine induzierbare Variante von GFP
enthielten, um Verbindungen nachzuweisen, die die Expression von
GFP hemmten und somit die Zellproliferation hemmten.
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Verbindungen,
für die
in in-vitro-Zelltests Antizellproliferationsaktivität nachgewiesen
wurde, werden danach in ganzen Organismen auf Antitumoraktivität getestet.
Vorzugsweise sind die Organismen Säugerorganismen. Gut charakterisierte
Säugersysteme
zur Untersuchung von Krebs schließen Nagetiere wie z.B. Ratten
und Mäuse
ein. Typischerweise wird ein Tumor von Interesse in eine Maus transplantiert,
die eine verminderte Fähigkeit
aufweist, eine Immunantwort gegen den Tumor zu mobilisieren, um
die Wahrscheinlichkeit der Abstoßung zu vermindern. Derartige
Mäuse schließen beispielsweise
nackte Mäuse
(athymisch) und SCID (schwerer kombinierter Immundefekt)-Mäuse ein.
Andere transgene Mäuse
wie z.B. Onkogene enthaltende Mäuse
können
in den vorliegenden Tests verwendet werden (siehe beispielsweise
USP 4,736,866 und USP 5,175,383). Für eine Übersicht und Diskussion über die
Verwendung von Nagetiermodellen zur Testung von Antitumor-Arzneistoffen,
siehe Kerbel (Cancer Metastasis Rev. 17:301-304, 1998-99).
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Im
Allgemeinen werden die Tumore von Interesse in einen Testorganismus
implantiert, vorzugsweise subkutan. Der Organismus, der den Tumor
enthält,
wird mit Dosen der Antitumor-Verbindungskandidaten
behandelt. Die Größe des Tumors
wird regelmäßig gemessen,
um die Wirkungen der Testverbindung auf den Tumor zu bestimmen.
Einige Tumorarten werden an anderen Stellen als subkutanen Stellen
implantiert (z.B. an intraperitonealen Stellen) und das Überleben
wird als Endpunkt gemessen. Parameter, die mit routinemäßiger Durchmusterung
getestet werden sollen, schließen
unterschiedliche Tumormodelle, verschiedene Tumor- und Arzneistoffwege
und Dosenmengen und den Zeitplan ein. Für eine Übersicht über die Verwendung von Mäusen beim
Nachweis von Antitumor-Verbindungen, siehe Corbett et al. (Invest
New Drugs 15:207-218, 1997; hier durch Bezugnahme aufgenommen).