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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Sezernierung von Proteinen aus
Säugetierzellen.
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Säugetierzellen
werden im steigenden Ausmaß dazu
benutzt, kommerziell signifikante Mengen von rekombinanten Proteinen
in Zellfabriken und in transgenen Tieren zu erzeugen. Es gibt zahlreiche
Beispiele, in welchen normalerweise sezernierte Proteine auf diesem
Weg hergestellt werden (Bock et al 1982, Michel et al 1985, Lin
et al 1986, Devlin et al 1987, Shak et al 1990), sowie eine Zahl
von kommerziellen Vektoren zur Sezernierung von heterologen Proteinen.
Allerdings wurden solche Systeme weitgehend eher für die Produktion
von sekretierten Proteinen als für
die Herstellung von Proteinen, welche normalerweise intrazellular
vorhanden sind, verwendet und die Sekretion von intrazellularen
Proteinen in Säugetierexpressionssystemen
ist eine zunehmend wirksame Hilfe in der biotechnologischen Forschung
(James und Simpson, 1996). Dem vorliegenden Erfinder ist nur eine
Veröffentlichung
bekannt, welches erfolgreich die Sezernierung von einem intrazellulären Protein
aus Säugetierzellen
beschreibt (Lee et al, 1996). Dieses Protein (Sialyltransferase)
wird jedoch normalerweise im endoplasmatischen Reticulum (ER) synthetisiert
und die erfolgreiche Sezenierung beruht nicht auf einer anfänglichen
Neuausrichtung der mRNA.
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Es
ist wohl bekannt, dass spezifische mRNAs in spezifisch subzellularen
Orten zum Beispiel in Membranen translatiert werden, dass sekretierte
Proteine auf dem rauen endoplasmatischen Reticulum in Verbindung
mit Membran-gebundenen Polysomen translatiert werden (Blobel and
Dobberstein, 1975), und dass die mRNAs für Proteine wie c-myc (Hesketh et al,
1994, Metallothionein I (Mahon et al 1995), ribosomale Proteine und
Cyclin A (Hovland et al, 1995) in Verbindung mit cytoskeletal-gebundenen
Polysomen translatiert werden (für
den Überblick
siehe Hesketh 1996, Hovland et al 1996). Es erscheint nun, dass
der Protein-synthetische Apparat in wenigstens drei Polysom Population
freie (FP), cytoskeletal-gebundene (CBP) und Membran-gebundene (MBP)
Polysome aufgeteilt ist. Diese drei unterschiedlichen Populationen
von mRNAs können
aufgeteilt werden unter Verwendung einer aufeinanderfolgenden Detergenz/Salz
Extraktion (Vedeler et al 1991). Unterschiedliche Signale leiten
diese mRNAs zu ihrer Stelle für
die Translation. Im Falle der Membranen und der sezernierten Proteine
ist es wohl bekannt, dass das Signalpeptid benötigt wird, um den Ribosom-mRNA-Komplex
auf das endoplasmatische Reticulum zu richten, während jüngste Erkenntnisse gezeigt haben,
dass für
mRNAs, die im Cytoplasma lokalisiert oder mit dem Cytoskelet assoziiert
sind in der 3' untranslatierten
Region Signale vorliegen (Kislauskis et al 1994, Hesketh et al 1994,
Wilson et al 1995, Veyrune et al 1996).
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung ist ein RNA-Molekül
vorgesehen, welches ein Säugetiersignal-Peptid
kodiert, welches wirksam an ein Säugetierintrazellularprotein
gebunden ist, wobei das Signalpeptid ermöglicht, dass das Protein auf
deren endoplasmatischen Reticulum in einer Weise synthetisiert wird,
dass es sekretiert werden kann, wobei das Molekül eine untranslatierte Region
von der mRNA für
ein sezerniertes Protein an seinem 3' Ende aufweist.
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Ohne
durch Theorie gebunden zu sein wird angenommen, dass das Signalpeptid
anfänglich
vorgesehen ist, und dann die Translation von der mRNA gestoppt oder
verlangsamt wird, um den Signalpeptid zu ermöglichen, an ein Signalerkennungsteilchen
zu binden und die Ribosomen, die mit der mRNA verbunden sind, an
das endoplasmatische Reticulum zu lenken. Die Translation startet
dann wieder beschleunigt, um den Rest des Proteins zu ermöglichen,
translatiert zu werden.
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Der
Begriff „Protein" wird hierin im weitesten
Sinne verwendet, um Anteile, die Aminosäuren, die durch Peptidbindungen
angebunden sind, mitzuumfassen. Er schließt daher Peptide und Polypeptide
mit ein.
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Die
vorliegende Erfindung ist in weiten Bereichen anwendbar. Im Prinzip
kann die Sequenz von jeglichem natürlich vorkommenden Säugetier-Signal-Peptid,
das normalerweise mit einem Protein das von Säugetierzellen sezerniert wird,
in Verbindung steht, verwendet werden, um entsprechende RNA Moleküle zu konstruieren,
die ein Säugetiersignal-Peptid
für die
Verwendung in der vorliegenden Erfindung kodieren.
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Varianten
solcher natürlich
vorkommender Signalpeptide die verwendet werden können, um
ein solches Protein zu sezernieren, können auch verwendet werden
und werden für
die Zwecke der vorliegenden Erfindung als innerhalb des Umfangs
des Begriffes „Säugetiersignal-Peptid" liegen, angenommen.
Solche bevorzugte Varianten haben wenigstens 50% Aminosäure Identität mit natürlich vorkommenden
Säugetiersignal-Peptid Sequenzen.
Insbesondere ist der Grad der Sequenz-Itensität wenigstens 75%. Am meisten
bevorzugt sind Sequenz-Identitäten
von wenigstens 90% oder wenigstens 95%. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung
kann die Sequenz-Identität
durch Verwendung von dem „BESTFIT" Programm der Firma
Wisconsin Sequence Analysis Package GSG 8.0 bestimmt werden.
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Bevorzugte
Signalpeptid Sequenzen können
von einem Wachstumshormon, einem Milchprotein oder Albumin, wie
Rattenalbumin (Datenbank Zugangsnummer J00698), Rinderwachstumshormon,
Lactalbumin und anderen Milchproteinen stammen.
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Ein
Fachmann ist in der Lage, die Signalsequenzen von vielen verfügbaren Datenbanken
Sequenzen oder Publikationen sicherzustellen. Selbst wenn diese
Sequenzen nicht publiziert sind, können zum Beispiel Sequenzhomologie-Studien
verwendet werden, um eine Kandidaten Aminosäure-Sequenz mit einer Aminosäure-Sequenz
von bekannten Signalsequenzen zu vergleichen.
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Eine
mögliche
Konkurrenz zwischen einer Signalsequenz, die ein Protein zu dem
endoplasmatischen Reticulum leitet, und einer RNA Sequenz, welche
das Protein kodierende RNA an eine intrazelluläre Örtlichkeit die von den endoplasmatischen
Reticulum verschieden ist, oder zu freien und/oder zu cytoskeletal
gebundenen Polysomen zu lenken, kann gemäß der vorliegenden Erfindung
vermieden oder zumindest geändert
werden, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass das Protein zu dem
endoplasmatischen Reticulum gelenkt wird.
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Dies
wird dadurch erreicht, dass das RNA Molekül mit einer 3' untranslatierten
(UTR) Region von der mRNA für
ein sezerniertes Protein versehen wird. Von Signalen, die in 3' UTR Regionen von
RNA Molekülen vorhanden
sind, die auf spezifische subzellulare Örtlichkeiten oder auf freie
cytoskeletal gebundene Polysomen gerichtet sind, wird angenommen,
dass sie die Lokalisierung von solchen mRNAs steuern und zwar wenigstens
zu einem gewissen Teil und dass Mutationen in diesen Regionen die
Signale inaktivieren können.
Die Signale in der 3'UTR
Region von RNA-Molekülen
können
durch Deletion oder Mutation von Sequenzen innerhalb der 3'UTR Region der genannten
RNA-Molekülen
und Versuche von Lokalisationsmöglichkeiten
durch Binden an ein Reporter-Gen und Transaktion in Säugetierzellen
in der Kultur gefolgt von Hybridisierungsversuchen um die mRNA Verteilung
zu ermitteln, identifiziert werden.
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DNA-Moleküle, die
in der Lage sind transkribiert zu werden, um die oben diskutierten
RNA Moleküle zu
ergeben, sind auch innerhalb des Umfanges der vorliegenden Erfindung.
Sie könne
in Form eines Vektors (z.B. ein Plasmis, Phage oder Cosmid) vorgesehen
werden, obwohl dies nicht wesentlich ist.
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Ebenfalls
innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung ist eine Säugetierzelle,
welche ein DNA oder RNA Molekül,
wie oben beschrieben, enthält.
Die Säugetierzelle
liegt in einer Zellkultur oder in einem nicht-menschlichen Tier
vor. Der Begriff „Zellkultur", wie er hierin verwendet
wird, bedeutet eine oder mehrere Zellen, die in einem Tier nicht
vorhanden sind und verwendet werden können, um Proteine unter geeigneten Bedingungen
zu exponieren. Üblicherweise
werden solche Zellen in einem geeigneten Wachstumsmedium unter gepufferten
Bedingungen gehalten. Die Zellkultur kann zum Beispiel eine Kultur
von Säugetier-Fibroblasten,
ein CHO, BHK oder Myeloma Zellkulturen sein. Das nicht-menschliche Tier
kann ein transgenes Tier sein. (Der Begriff „transgenes Tier" schließt transkaryotische
Tiere ein). Es kann heterologe Proteine in seiner Milch sekretieren.
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Die
vorliegende Erfindung enthält
auch ein Verfahren zur Gewinnung eines Proteins aus einer isolierten
Säugetierzelle,
welches den Schritt der Expression des Proteins unter Verwendung
eines Nukleinsäure-Moleküls der vorliegenden
Erfindung und der Ermöglichung
der Zelle das Protein zu sezernieren, aufweist. Das Protein kann
dann durch herkömmliche
Reinigungstechniken gereinigt werden.
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Gewünschtenfalls
können
solche Hybridisierungs-Nukleinsäuremoleküle wenigstens
10 Nukleotide lang sein und bevorzugt wenigstens 25 oder mindestens
50 Nukleotide lang sein. Sie können
unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren. Ein
Beispiel von stringenten Hybridisierungs-Bedingungen ist, wenn die
versuchte Hybridisierung bei einer Temperatur von etwa 35°C bis etwa
65°C unter
Verwendung einer Salzlösung,
welche etwa 0,9 Molar ist ausgeführt
wird. Allerdings werden Fachleute in der Lage sein, solche Parameter
soweit erforderlich zu variieren, um Variable wie Probenlänge, Basenzusammensetzung,
Typen der vorhandenen Ionen und dergleichen zu variieren.
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Obwohl
die vorliegende Erfindung voranstehend weitgehend unter Bezugnahme
auf natürlich
vorkommende Säugetiersignalpeptide
oder Varianten davon beschrieben ist, können in der breitesten Form
alle Signalpeptide verwendet werden, die in der Lage sind, in Säugetierzellen
zu wirken. Diese können
natürliche
oder nicht natürlichen
Ursprungs sein. Vorzugsweise, (jedoch nicht wesentlich) treten sie
nicht natürlicher
Weise in prokaryotischen Organismen (z.B. E. Coli) auf.
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Die
vorliegende Erfindung wird nun nur als Beispiel unter Hinweis auf
die angeschlossenen Figuren beschrieben, in welchen:
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1 ein
schematisches Diagramm der Konstrukte zeigt, das in „Material
und Methoden" beschrieben ist.
Der Elternvektor ist pcDNA3. Das dunkel ausgefüllte Viereck zeigt die native
5'UTR von Kaninchen
Beta-Globulin. SS ist die Ratten Albumin Signal Sequenz.
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2 eine
Northern Hybridisierung von Gesamt RNA von Polysomen zeigt, die
von transfektierten Zellen isoliert sind. Alle Bahnen sind mit 10 μg RNA beladen;
der Filter wurde mit einer Kaninchen Beta-Globulin cDNA Sonde hybridisiert
und spezifische Banden wurden durch autoradiographie by –70°C für 3 Tage unter
Verwendung von Hyperfilm-MP ermittelt. F, freie Polysome; C, cytoskeletal-gebundene
Polysome; M, Membran-gebundene Polysome.
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3 eine
Quantifizierung der Verteilung von Globin mRNA in transfektierten
Zellen zeigt. Die Resultate sind in willkürlichen Einheiten mRNA pro
Einheit 18S rRNA ausgedrückt,
welche von einer Direkt-Radioaktivitäts-Anzeige unter Benutzung
von Canberra Packard Instantimager erhalten wurden. Mengenwerte
wurden normalisiert, indem die Menge an freien Polysomen als 100
für jedes
Experiment angenommen wurde. Resultate sind Mittelwerte ± S.E.M.
[Standardabweichung](n = 4). Die Gruppen wurden unter Verwendung
von „Students
t" Tests verglichen:
Transkriptmenge in den Membran-gebundenen Polysomen war signifikant
unterschiedlich zwischen GG und SSGG Zellen (p = 0,01), GM und SSGM
(p < 0,05) unter
Verwendung eines zweiseitigen Tests und zwischen SSGM und SSGG unter
Verwendung von einem einseitigen Test ermittelt.
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4 die
mRNA Stabilität
der Transkripte zeigt. Die Zellen wurden zu 70% Zusammenfluss gezüchtet und
die Transkription mit Actinomycin D gehemmt. RNA wurde zu Zeitpunkten
extrahiert und dann durch Northern Blotting analysiert. Die Quantifizierung
wurde durch Direkt-Radioaktivitäts-Anzeige
unter Verwendung von Canberra Packard Instantimager ausgeführt. Die
Resultate sind Mittelwerte ± S.E.M
und sind als Prozentsatz von der ursprünglichen Menge ausgedrückt.
GG
und SSGG (n = 6).
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5 polysome
Profile von transfektierten Ltk– Zellen
zeigt. Lösliches
Detergenz/Salz- extrahiertes Material wurde in Schichten bis zu
einem 15%–40%
Sucrose Gradienten geschichtet und für eine Stunde bei 200 000 × g zentrifugiert.
Polysome Profile wurden durch Messung der Absorption bei 260 nm
unter Benützung einer
Durchflusszelle beobachtet.
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6 eine Northern Hybridisierung und Quantifizierung
von SSGA zeigt.
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6A:
Northern Hybridisierung von Ltk– Zellen
die mit pcKSSGA transfektiert sind. Alle Bahnen wurden mit 20 μg RNA beladen.
Der Filter wurde mit einer Kaninchen Beta-Globin cDNA Sonde hybridisiert.
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6B:
Quantifizierung von mRNA Menge.
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Die
Resultate sind in freien Einheiten von mRNA Menge per Einheit 18S
rRNA ausgedrückt,
die von Direkt-Radioaktivitäts-Anzeige
erhalten waren und durch Annahme der Menge von freien Polysomen
mit 100 für
jedes Experiment normalisiert. Die Resultate sind Mittelwerte ± S:E:M.
(n = 3).
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Beispiele
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Der
eingeschlagene Versuch schließt
drei Stufen ein: Eine Serie von Vektoren mit dem Albumin Signalpeptid
und verschiedenen 3' untranslatierten
Regionen (3'UTR)
Sequenzen konstruieren, die an Kaninchen Beta-Globin 5' untranslatierte
Region gebunden sind, und eine Kodierungssequenz als Reportergen;
diese Konstrukte in Zellen durch stabile Transkription einfügen und
dann den subzellularen Ort der mRNA, deren Stabilität und translationale
Wirksamkeit bestimmen.
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Materialien und Verfahren
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Bakterien
und Zellkulturen: Plasmide wurden geklont und in Standardverfahren
propagiert. CHO K1 Zellen wurden in Ham's F12 Medium gezüchtet und Ltk– Zellen,
eine Maus Fibroblastenlinie, wurde in Dulbecco's minimal Eagle's Medium gezüchtet. Die Medien wurden mit
10% fötalem
Kälberserum
ergänzt
und in einer Atmosphäre
von 5% CO2 gezüchtet. Die Zellen wurden in
90 mm Petrischalen zur Fraktionierung und in 35 mm Petrischalen
für die
Transfektion gezüchtet.
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Vektorkonstruktion:
Alle Konstrukte (1) wurden von Kaninchen β-Globin Kodierungssequenzen durch
PCR Klonierung mit Primern abgeleitet, die in Tabelle 1 beschrieben
sind, und alle enthielten native Globin 5'R UTR. Jedes Konstrukt wurde durch Sequenzierung
unter Verwendung eines ABI 373A Sequenzierers und Zyklussequenzierung
sequenziert. Die Konstruktion von pcKGG, ein Plasmid welches Kaninchen
Beta-Globin mit nativen 5' und
3'UTRs exprimiert,
wurde früher
beschrieben (Mahon et al., 1997). pcKGM exprimiert Globin mit 3'UTR von Maus c-myc
und wurde wie folgt hergestellt. Ein Teil der Globin-kodierenden
Region und die gesamte c-myc 3'UTR
wurde durch PCR unter Verwendung von Primern KP4 und KP5 amplifiziert, wobei
KP4 eine BamHI Stelle in der Globin-kodierenden Region aufrechterhält und K5
eine XbaI Stelle stromabwärts
von dem c-myc poly-A-Signal
schafft und unter Verwendung des Plasmid MP13 als Matrize (Veyrune et
al 1996). Unter Verwendung von 1 ng Matrize und 20 pmol von jedem
Primer in 1,5 mM MgCl2 und 4 Einheiten Taq
Polymerase (PerkinElmer), wurde die Reaktion bei 94°C für 1 Minute,
55°C für 1 Minute
und 72°C für 2 Minuten
im Zyklus ausgeführt.
Das Fragment und pcKGG wurden mit BamHI und KpnI verdaut und unter Verwendung
von Standardmethoden ligiert (Sambrook et al 1989).
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Bei
der Herstellung der Signalsequenz benötigt die Konstrukte die Schaffung
von einer geeigneten Restriktionsstelle an den AUG Kodon. Dies wurde
durch PCR unter Verwendung von Primern KP6 und KP7 erreicht; KP6
bringt die Sequenz von pcDNA3 an Position 731 in Übereinstimmung
und KP7 schafft eine NdeI Stelle während das AUG und der Leserahmen
aufrechterhalten wurden. Die Matrize war pcKGG, und die Reaktion
wurde unter den Bedingungen ausgeführt, wie sie oben angegeben
sind. Das Ergebnis der Reaktion wurde gereinigt, dann wurden 5 μg in einem
PCR Megaprime mit Primer KP8 (eine Sequenz in der Globin-kodierenden
Region die eine BamHI Stelle enthält, ist abgedeckt) verwendet,
1 μg pcKGG
als Matrize und die Zyklen wie oben beschrieben. Das resultierende
Fragment wurde subkloniert in pBluescript in den KpnI und BamHI
Stellen und schuf pBS-Nde.
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Die
Signalsequenz wurde durch Annealing von synthetischen Oligodeoxynukleotiden,
die mit jenen der Ratten-Albuminsignalsequenz (SS1 und SS2) korrespondieren,
verschmolzen. Das Insert wurde in die NdeI Stelle von pBS-Nde unter
Schaffung von pBS-SS legiert. Das KpnI-BamHI Fragment von pBS-SS,
welches die 5'UTR
abdeckt, die Albuminsignalsequenz und die Globin-kodierende Region
BamHI Stelle wurden dann in die entsprechend verdaute pcKGG und
pcKGM ligiert, um pcKSSGG und pcKSSGM zu schaffen.
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Das
Albumin 3'UTR wurde
von Ratten-Albumin-Gen durch Restriktion entfernt und nach der Behandlung
des restringierten Globinvektor mit Vent-Polymerase wurde die Albumin
3'UTR durch stumpfendige
Ligierung eingefügt.
pcKSSGA wurde wie für
pcKSSGG und pcKSSGM beschrieben konstruiert.
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Transfektion:
Die Transfektionen wurden mit LipofectAMINETM (Gibco)
gemäß den Herstellerinstruktionen
ausgeführt.
Die Zellen wurden auf 35 mm Petrischalen subgezüchtet mit einer Dichte von
5 × 105 Zellen pro Platte und bis 10–80% Zusammenfluss
wachsen gelassen. Die Zellen wurden mit 1 μg von Plasmid-DNA und 6–10 μl LipofectAMINE
in Serum-freien Medium überlagert.
Nach 5 Stunden wurde Serum bis zu 10% der Endkonzentration zugesetzt.
Nach 24 Stunden wurde das Medium durch Komplettmedium ersetzt und
die Selektion mit 200 μg/ml
G418 wurde nach 24 Stunden begonnen. Die Zellen wurden in 100 μg/ml G418
gehalten, sobald sie stabil transfektiert waren. Die Zelllinien
wurden nach dem transfektierten Konstrukt benannt, z.B. die Zellen
die mit pcKGG transfektiert waren sind GG genannt, usw.
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Zellfraktionen:
Ltk-Zellen wurden zu 70% Zusammenfluss wachsen gelassen, unter Verwendung
eines Gummiwischers geerntet und durch aufeinander folgende Detergenz/Salz-Extraktionsverfahren
fraktioniert (Vedeler et al, 1991; Hesketh et al 1994). Polysomen
wurden von Monosomen und leichten Ribonukleoprotein-Partikeln durch
Zentrifugieren bei 32.000 g für
17 Stunden durch einen 15 ml Polster von 40% Sucrose (Hovland et
al, 1995) getrennt.
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RNA-Extraktion
und RNA-Gelelektrophorese: Gesamte RNA wurde durch Säure/Guanidinium/Phenol/Chloroformverfahren
von Chomczynski und Sacchi (1987), extrahiert, und die Präparate wurden
durch A260/A280 bewertet. RNA wurde dann durch Elektrophorese durch
ein denaturierendes 2.2 M Fomaldehyd, 1,2% Agarosegel separiert
(Sambrook et al 1989) und auf eine Nylonmembran (Genescreen, NEN
Dupont, Ltd) durch kapillares Blotting transferiert. Die RNA wurde
an den Membranen durch UV-Licht fixiert und trocken gelagert.
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Northern
Hybridisierung und DNA-Sonden: Die Membranen wurden vorhybridisiert
bei 42°C
für mindestens
6 Stunden mit 0,1 mg/ml denaturierten Lachssperma-DNA in 50% Formamid,
10% Dextransulfat, 0,2% bovines Serumalbumin, 0,2% Polyvinylpyrrolidon,
0,2% Ficoll, 0,1% Natrium-Pyrophosphat, 1% SDS und 50 mM Tris HCl,
pH 7,5. Die beta-Globin
cDNA-Sonde ist früher
schon beschrieben (Veyrune et al 1996). Die c-myc Sonde war eine
cDNA der 3 Exons des Mausgens (Hesketh et al, 1994) und war ein
Geschenk von Dr. M. Cole (Princeton University, New Jersey USA),
die Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase (GAPDH) Sonde, war ein
0,78 kb PstI-XbaI Fragment der menschlichen cDNA (American Tissue
Culture Collection, Zugangsnummer 57090) und die 18S rRNA-Sonde war ein 1,4kb
BamHI Fragment der cDNA, die von Dr. R. Fulton, Beatson Institute,
Glasgow, erhalten würde.
20–30
ng der Sonde wurden mit 32P dCTP durch Zufallsprimung
(Megaprime kit von Amersham International UK) markiert. Die markierte
Sonde wurde dem Hybridisierungsmix zugesetzt und über Nacht
bei 42°C
hybridisiert. Die Filter werden kurz bei Raumtemperatur in 2XSSC gewaschen
um die Hybridisierungsmischung zu entfernen. Die Waschungen bei
65°C waren
Sondenspezifisch wie folgt: Globin-1X SSC 0,5% SDS 2X 30 min., c-myc-0,5X
SSC, 1% SDS 2X 1hr., GAPDH-1X SSC, 1% SDS 2X 1 hr., 185-0,2X SSC,
1% SDS. Eine kurze Endwaschung in 0,1X SSC entfernt SDS. Spezifische
Hybridisierung wurde ermittelt und auf einem Canberra Packard Instantimager
quantifiziert. Die Menge von spezifisch gebundenen Sonden wurden
für nicht
spezifische Bindung korrigiert und die Daten wurden pro Einheit von
rRNA wie durch Hybridisierung an die 18S rRNA Sonde ausgedrückt. Bevor
erneut sondiert wurde, wurden die Filter durch Erhitzung auf 95°C in 0,1%
SDS für
10 Minuten gestrippt.
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mRNA-Stabilität: mRNA-Stabilität wurde
durch Messung der Menge über
eine 2–12
Stunden Periode gefolgt von der Inhibierung der Transkription bestimmt.
Die Zellen wurden auf 70% Zusammenfluss wachsen gelassen und die
Transkription wurde durch Zusatz von Aktinomycin D (5 μg/ml) inhibiert.
RNA wurde wie oben beschrieben extrahiert.
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Polysomproteine
und Translationseffizienz: Die Zellen wurden bis zu 70% Zusammenfluss
wachsen gelassen, in ein Medium unter Verwendung eines Gummiwischers
abgeschabt, dann bei 2000 rpm für
5 min. bei 4°C
pelletiert. Die Zellen wurden dann in DEPC PBS gewaschen und wie
zuvor beschrieben pelletiert. Die Zellen wurden in einer Lösung von
10 mM TEA (Triethanolamin) pH 7,6, 130 mM KCL, 5 mM MgCl2, 0,5 mM CaCl2,
0,25 mM Sucrose mit 0,5% Deoxycholat und 0,5% Triton X100 auf Eis
10 Minuten inkubiert. Die Nuklei wurden durch Zentrifugieren bei
3000 rpm für
10 min bei 4°C
pelletiert. 0,3 ml des Überstandes
wurden auf eine 7 ml 15%–40%
Sucrose Gradient aufgegeben und bei 200.000 × g für 1 Stunde zentrifugiert und
durch Messung der Absorption bei 260 nm unter Verwendung einer Durchflusszelle
die auf ein Zeiss PM 2A Spektrophotometer montiert war und mit einem
W + W Rekorder gekoppelt war, überwacht.
Der Auslauf der Durchflusszelle wurde gesammelt und jeder Gradient
in drei Fraktionen aufgesplittet, nämlich in Polysome, Monosome,
und Rest (untranslatiertes Material). Die Polysome wurden durch
Zentrifugierung bei 32000 × g
für 17 Stunden
pelletiert und RNA wurde von den Pellets extrahiert. Monosomale
RNA wurde mit Isopropanol und Ammoniumacetat ausgefällt. dann
wie vorher stehend beschrieben extrahiert.
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Resultate
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Neuausrichtung
von Globin mRNA durch Albuminsignalsequenz: Zu Beginn wurden 4 Plasmide
konstruiert und zwar auf Basis des Kaninchen-Beta-Globins 5'UTR und der kodierenden
Region gemeinsam mit entweder dem nativen 3'UTR oder dem c-myc 3'UTR und beides mit oder ohne die Albuminsignalsequenz. Diese
Konstrukte wurden in Ltk-Fibroblasten
eingebracht und es wurden stabile tranfektierte Zelllinien gebildet. Die
Expression des transfektierten Gens wurde durch Northern Hybridisierung
untersucht um Globintranskripte zu ermitteln, und von allen vier
Genen wurde gefunden, dass sie exprimiert sind. Wir fanden das höchste Niveau
von Globin-Expression bei 70% Zusammenschluss (Daten nicht gezeigt)
und alle nachfolgenden Experimente wurden in diesem Stadium des
Wachstums ausgeführt.
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Es
wurde eine Detergenz/Salz-Fraktionierung durchgeführt, um
die Aufteilung der Transkripte zwischen FP, CBP und MBP zu untersuchen.
Jede Zelllinie wurde fraktioniert, die Polysomen pelletiert und
dann die RNA von den Pellets extrahiert und analysiert durch Northern
Hybridisierung auf Menge von Globintranskripten. Wie in 2 gezeigt,
wurde in den Kontrollzelllinien (GG) der Globintranskrip weitgehend
in freien Polysomen gefunden. Im Gegensatz dazu wurde dieses Transkript
in Zellen, die das Globintranskript mit der Albuminsignalsequenz
(SSGG) expremieren, hauptsächlich
in der MBP/ER gefunden. Das SSGM-Transkript wurde also mit der höchsten Menge
in der MBP/ER Fraktion gefunden.
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Neusondierung
von Filtern mit der 18S rRNA Sonde ermöglichte die Korrektur von RNA
Ladung und die Quantifikation von Hybridisationsdaten durch Einheits-RNA.
Die Menge von Globintranskripten in FP, CB, und MBP war 2,5 ± 0,4,
2,9 ± 1,0
bzw. 2,1 ± 0,9
(mittlere Werte von vier separaten Experimenten ± s.e.m., welche als willkürliche Einheit
von c.p.m. Globin-Sonden-gebunden/c.p.m. 18S Sonden-gebunden ausgedrückt ist)
in GG-Zellen und 0,9 ± 0,2,
1,3 ± 0,2
bzw. 2,5 ± 0,8
in SSGG Zellen. Da die relative Transkriptionsverteilung eher als
das gesamte Expressionsniveau, der wichtigste Parameter in diesen
Experimenten war, wurde diese Datenbank in Bezug auf die Menge in
der FP-Fraktion ausgedrückt;
wie in 3 gezeigt bestätigen
diese Daten, dass der Zusatz von Albumin-Signalsequenz die Globin mRNA zu der
ER (p = 0,01) umleitet.
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In
den GM-Zellen war die Menge an Globintranskripten in FP, CBP und
MBP 2,6 ± 0,7,
2,8 ± 0,9
und 1,6 ± 0,5
(Mittelwert von wenigstens vier separaten Experimenten ± s.e.m.
ausgedrückt
in willkürlichen
Einheiten von c.p.m. Globinsondenbindungen) und in SSGM-Zellen war die Menge
der Verteilung 2,5 ± 1,1,
2,3 ± 0,8 bzw.
3,0 ± 1,4.
Die Analysen dieser Daten wurden als Menge relativ zu jener in FP
ausgedrückt
und zeigten, dass die GM-Transkripte
weitgehend in CBP vorhanden sind, wie früher gefunden wurde (Hesketh
et al., 1994) aber dass, im Gegensatz dazu, die SSGM-Transkripte
als ähnlich
im Vergleich zur Menge in CBP und MBP gefunden wurden (3).
Die Menge von Globintranskripten in MBP war signifikant größer in SSGM-Zellen als
in GM-Zellen, wobei die Fähigkeit
der Signalsequenzen, Transkripte zu der ER rückzuleiten gezeigt wurden.
Allerdings war die Menge in MBP in SSGM-Zellen im Vergleich zu GM-Zellen
signifikant geringer (p < 0,05)
als die erhöhte
Menge in SSGG-Zellen im Vergleich zu GG-Zellen. Daher obwohl die
Signalsequenz die Globin-kodierende Region und 5'UTR mit der angehefteten c-myc 3'UTR umleitete, war
die Gegenwart von c-myc 3'UTR
und auch die Signalsequenz auf das Ausmaß, in welchem die Rückumwandlung
erfolgt ist, reduziert. Dies legt nahe, dass eine Konkurrenz zwischen
einem ER-Lokalisierungssignal (Signalpeptid) und einem cytoskeletalen
Lokalisierungssignal (c-myc 3'UTR;
Veyrune et al.; 1996) herrscht.
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Zusatz
der Signalsequenz hat keine Wirkung auf mRNA Stabilität oder Translationswirksamkeit:
Da es theoretisch möglich
war, dass die Manipulation von 5'Signalen
die Stabilität
der Globin nRNA verändert
haben kann, bestimmten wir die Stabilität der chimären Transkripte. Jede Zelllinie
wurde auf 70% Zusammenfluss wachsen gelassen und dann mit Actinomycin
D behandelt, um weitere Transkription zu hemmen; RNA Reichtum wurde
durch Northern Blotting gemessen. Da Globin eine hoch-stabile Nachricht
(Aviv et al. 1976) ist, wurden die Mengen von GG und SSGG Transkripten über einen
Zeitraum von 12 Stunden gemessen. Wie in 4 gezeigt,
veränderte
der Zusatz von Albuminsignalsequenzen die Stabilität der Globin
mRNA nicht signifikant. In ähnlicher
Weise zeigten die Analysen von GM SSGM Zelllinien, dass der Zusatz
der Signalsequenzen zu den Globintranskripten mit der c-myc 3'UTR die nRNA (Daten
nicht gezeigt) nicht destabilisieren. Das Neusondieren des Filters
entdeckte GAPDH nRNA und zeigte an, dass die Transkription in allen
vier Zelllinien (Daten nicht gezeigt) behindert waren.
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Wirkung
der Signalsequenz auf mRNA-Stabilität: Da es theoretisch möglich war,
dass die Manipulation von 5' und
3' Signalen die
Stabilität
der Globin mRNA verändert
haben können,
haben wir daher den Stabilitätseffekt
von zugesetzten Signalsequenzen auf mRNA Stabilität überprüft. Die
Zellen wurden zu 70% Zusammenfluss wachsen gelassen und dann mit
Actinomycin D behandelt, um weitere Transkription zu hemmen; RNA
Menge wurde durch Northern Blotting gemessen. Da Globin eine hoch-stabile
Nachricht ist (Aviv et al. 1976) wurde die Menge von GG und SSGG
Transkripten über
einen Zeitraum von 12 Stunden gemessen. Wie in 4 gezeigt,
hat der Zusatz von Albumin-Signal-Sequenz die Stabilität der Globin-mRNA
nicht signifikant verändert.
Neusondieren des Filters zur Auffindung von GAPDH mRNA (Daten nicht
gezeigt) zeigte, dass die Transkription in beiden Zelllinien inhibiert
wurde.
-
Translationseffizienz:
Um zu bestimmen, ob die Manipulation von Signalen innerhalb der
fremden Gene entweder die Translation allgemein oder die Translation
der modifizierten Gene im Speziellen beeinflusst hat, wurde der
Protein-Synthese-Apparat von allen vier Zelllinien einer Polysom-Profilanalyse
unterworfen. Die Zellen wurden mit Salz und Detergenz lysiert und
lösliches
Material auf einem 15%–40%
Sucrose-Gradienten aufgegeben. Die Polysomprofile wurden aufgezeichnet
und sind in 5 wiedergegeben, sind Polysom/Monosom-Verhältnisse
in Tabelle 2. Die Polysomprofile waren in allen vier Zelllinien
mit ähnlichem
Anteil der Ribosome, die in aktiven Polysomen vorhanden sind, ähnlich.
Die unterschiedlichen Peakhöhen
zeigen die Differenzen in der Gesamtmenge der RNA, die auf den Gradienten
aufgegeben wurde. Daher hat die Transfektion mit den vier Konstrukten
die gesamte Proteinsynthese nicht beeinflusst. Die Analyse der Anteile
der Globintranskripte in Polysom- und Monosom-Fraktionen aus dem
Sucrose-Gradienten (Tabelle 3) zeigt, dass der Zusatz von Signalsequenzen
die Translation der Transkripte nicht signifikant beeinflusst hat.
-
Der
Einfluss von der Albumin 3'UTR:
Die Resultate in 3 deuteten an, dass hier eine
Konkurrenz zwischen 5' und
3' zielgerichteten
Signalen vorhanden ist, aber wir waren besorgt, dass die beobachteten
Effekte auf irgend eine Form von Interaktion zwischen den Globin-kodierenden
Sequenzen und der c-myc 3'UTR zurückzuführen sind,
welche die Signalsequenzen daran hinderten, ihre Signalrollen auszuführen. Um
diese Frage anzugehen, konstruierten wir eine weiteren Vektor mit
unterschiedlichen 3'UTR,
nämlich
den 3'UTR des Albumingens:
Globin-kodierende Region mit sowohl der 3'UTR von Rattenalbumin mRNA und die Rattenalbumin-Signalsequenz
(SSGA). Das Plasmid wurde in Ltk-Zellen transfektiert und stabile
Zelllinien geschaffen. Die SSGA-Zellen wurden fraktioniert und wie
oben beschrieben analysiert. Wie in 6 gezeigt,
zeigten die Resultate, dass die SSGA-Transkripte sowohl Albumin 3'UTR als auch Signalsequenzen
enthielt, welche vorwiegend in den MBP/endoplasmatischer Retikulumfraktionen
gefunden worden. Das deutet darauf hin, dass die Einführung eines
fremden 3'UTR nicht
per se ausreicht, um die Umlenkung des Globintranskripts zu der ER
zu verhindern. Ein weiterer Vektor (GA) wurde hergestellt, in welchem
die Globin-Kodierungsequenz an ein Rattenalbumin 3'UTR gebunden war
aber ohne einer Signalsequenz; unglücklicher weise war eine weitere Analyse
nicht möglich,
weil wir nicht in der Lage waren, transfektierte Zellen, die dieses
Gen exprimieren, aufzufinden.
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Diskussion
-
Die
vorliegenden Resultate zeigen, dass durch eine Kombination von DNA-Rekombinationstechnologie
und Transfektion es möglich
ist, Zelllinien zu produzieren, in welchen die Globin-mRNA wieder
auf das endoplasmatische Retikulum zurück zielgerichtet ist. So leitete
in Ltk-Fibroblasten der Zusatz der Ratten-Albumin-Signalsequenz
zu Globin mit dem nativen Globin 3'UTR die mRNA auf Membran-gebundene Polysome weiter.
Dies ist die erste Demonstration von Umlenkung von einer mRNA von
freien Polysomen auf das ER in einer stabilen Zelllinie. Teilweise
Umleitungen von Histon mRNA zu MBP wurde früher gezeigt in Säugetierzellen
gezeigt (HeLa) und zwar unter Verwendung einer E. coli Signalsequenz
(Zambetti et al. 1987). Ebenso haben Lee und Mitarbeiter (1996)
aktive Sialyltransferase aus COS-7 Zellen sezerniert und zwar unter
Verwendung eines IgM Signalpeptides, jedoch in diesem Fall wurde
die native Sialyltransferase in dem ER synthetisiert. Wichtig ist
jedoch, dass in allen dieser Fällen
die Transfektion vorübergehend
war.
-
Es
ist nun klar, dass grundsätzlich
zu mRNA, die auf freie Polysome translatiert wurden, eine beachtliche
Menge von mRNAs in Polysome translatiert wurden, die mit dem Cytoskeleton
verbunden sind (Hesketh et al, 1996). Es wurde gezeigt, dass die
Zielrichtung der mRNAs auf das Cytoskeleton auf die Signal in der 3'UTR zurückzuführen sind
(Hesketh et al, 1994; Veyrune et al, 1996; Mahon et al, 1997). Wenn
zusätzlich
zu einem Signalpeptid ein cytoskeletales Zielrichtungssignal in
der 3'UTR des Transkriptes
vorhanden ist, ist, wie in 3 gezeigt,
die Verschiebung zu den Membran-gebundenen Polysomen vermindert.
Dies scheint nicht durch einen nicht-spezifischen Defekt von einer „fremden" 3'UTR verursacht zu
sein, da der Zusatz einer verschiedenen „fremden" 3'UTR,
jene von Albumin, zu Globin (SSGA; 6)
die Umleitung der Signalsequenz nicht verringert hat. Die Daten
legen daher nahe, dass, wenn ein Hybridtranskript sowohl eine Signalsequenz und
als auch 3'UTR Lokalisierungssignal
enthalten, eine Konkurrenz zwischen den 5' und dem 3' Signal vorhanden ist. Das c-myc 3'UTR Lokalisierungssignal
scheint daher mit mRNA-Sortierung über eine Signalsequenz in Wechselwirkung
zu sein.
-
Diese
Daten haben wesentlichen Einfluss auf die Biotechnologie. Erstens
zeigen sie, dass es möglich ist,
stabile Zelllinien zu schaffen, in welchen eine mRNA, die für ein intrazellulares
Protein kodiert, zu dem ER umgeleitet wird. Zweitens zeigen sie,
dass, wenn eine solche mRNA ein 3'UTR Lokalisierungssignal enthält, dann
ein solches Signal entfernt werden muss, um wirksame Umleitung zu
erzielen.
-
Wie
durch die vorliegenden Resultate mit der Albumin 3'UTR (6)
angedeutet, wäre
es äußerst angezeigt,
einen Vektor zu verwenden, welches eine 3'UTR von der mRNA für ein sezerniertes Protein
enthält, insbesondere
eine Form des selben Gens wie die verwendete Signalsequenz; auf
diese Weise wird die gewünschte
Kodierungsregion zwischen der 5'UTR/Signalsequenz
und 3'UTR von einem
mRNA für
ein sezerniertes Protein inseriert und das Problem der Signalkonkurrenz
ist aufgehoben.
-
Wenn
solche modifizierten Gene für
kommerzielle Zwecke zu verwenden sind, sollte idealer Weise die Signalmodifikation
die mRNA-Stabilität
und Transkriptionseffizienz nicht in einem größeren Ausmaß verringern. Die Daten in 4 & 5 zeigen,
dass die Zugabe der Signalsequenz zu Globin keinen Einfluss auf die
mRNA Stabilität
oder Translationseffizienz besitzt. Daher kann eine Umleitung mit
Beibehaltung der mRNA Stabilität
und Translation verbunden sein. Unter Verwendung von Luciferase
als Reporter haben wir gezeigt, dass eine Umleitung von der mRNA
durch die Albuminsignalsequenz durch Synthese eines immunologisch-erkennbaren
Proteins in der ER verbunden ist.
-
Abschließend zeigen
die vorliegenden Resultate, dass es möglich ist, eine mRNA auf das
ER umzuleiten, während
die Stabilität
und die Translation aufrecht erhalten ist.
-
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-
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-
-
Tabelle
1. Oligos, die beim Klonen der verschiedenen Expressionsvektoren
verwendet wurden, sind im Text beschrieben. Buchstaben in Kleinschrift
geben Wechsel wieder, die zur Erzielung von Restriktionsstellen
nötig sind.
-
-
Tabelle
2. Die Verteilung von Ribosomen in Polysome und Monosome. Die prozentuelle
Verteilung von Ribosomen wurde aus der Menge von A260-absorbierenden
Material berechnet, das in Polysomen und Monosomen vorhanden war,
welche durch Sucrose Dichte-Gradienten-Zentrifugation separiert
sind. Die Resultate sind Mittelwerte ± S.E.M. (n = 6 for GG und
SSGG, n = 9 für
GM und SSGM).
-
-
Tabelle
3. Die Verteilung von Globin-Transkripten in Polysome und Monosome.
RNA wurde von Polysomen extrahiert und aus dem Sucrosedichte-Gradienten
gewonnen (Profile gezeigt in 5) und auf
Globin mRNA Menge, durch Northern Blotting analysiert.
