JP2001515725A

JP2001515725A - タンパク質分泌の調節

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Publication number: JP2001515725A
Application number: JP2000510875A
Authority: JP
Inventors: タウラーアルバート; フレイザープライムイアン; エドワードヘスキースジョン
Original assignee: ロウエットリサーチサービシーズリミティッド
Priority date: 1997-09-05
Filing date: 1998-09-04
Publication date: 2001-09-25
Anticipated expiration: 2018-09-04
Also published as: GB9718908D0; EP1009834B1; US6881832B1; DK1009834T3; JP4436563B2; ES2273435T3; ATE344327T1; DE69836336D1; WO1999013090A1; DE69836336T2; AU8991098A; EP1009834A1

Abstract

(57)【要約】哺乳動物シグナルペプチドを用いて、正常には分泌されない哺乳動物タンパク質の分泌を助けることができる。哺乳動物細胞から正常には分泌されないタンパク質をコードするｍＲＮＡの３’ＵＴＲ中に正常に存在するシグナルを不活性化させることにより、遊離の及び細胞骨格に結合したポリソームに向かうそのようなｍＲＮＡ分子の割合を低下させることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、哺乳動物細胞からのタンパク質の分泌に関する。

【０００２】哺乳動物細胞株は、細胞工場及びトランスジェニック動物において組換えタン
パク質の商業上相当な量を製造するため、その使用が次第に増加しつつある。正
常に分泌されるタンパク質がこのようにして製造されつつあるという例が非常に
多くあり（ボック(Bock)ら 1982,ミシェル(Michel)ら 1985,リン(Lin) ら 1986,
デブリン(Devlin)ら 1987,シャク(Shak)ら 1990)、また異種タンパク質の分泌用
のベクターが多数市販されている。しかしながら、そのような系は大抵、正常に
は細胞内にあるタンパク質ではなく分泌性タンパク質の製造に使用されており、
したがって哺乳動物の発現系における細胞内タンパク質の分泌は、バイオテクノ
ロジーによる研究では重要性が増加している目標である（ジェームス(James) と
シンプソン(Simpson), 1996)。本発明者らは、哺乳動物細胞からの細胞内タンパ
ク質の分泌に成功したことを記載する文献（リー(Lee) ら，1996) は一つしか知
らない。しかしながら、このタンパク質（シアリルトランスフェラーゼ）は小胞
体（ＥＲ）で正常に合成され、分泌の成功はｍＲＮＡの最初の指示の書き直し（
転送）に依存するものではなかった。

【０００３】特異的なｍＲＮＡが細胞内の特異的な位置で翻訳されることは、よく確立され
ており、例えば、膜及び分泌タンパク質は、膜結合ポリソームに会合して粗面小
胞体上で翻訳され（ブローベル(Blobel)とドッベルスタイン(Dobberstein), 197
5)、ｃ−ｍｙｃ（ヘスキース(Hesketh) ら，1994) 、メタロチオネインＩ（マホ
ン(Mahon) ら 1995)、リボソームタンパク質及びサイクリンＡ（ホフラント(Hov
land) ら，1995) 等のタンパク質に対するｍＲＮＡは、細胞骨格に結合したポリ
ソームに会合して翻訳される（概説に関しては、ヘスキース 1996, ホフラント
ら 1996 を参照のこと) 。現在、タンパク質合成装置は、少なくとも三つのポリ
ソーム集団、すなわち、遊離ポリソーム（ＦＰ）、細胞骨格結合ポリソーム（Ｃ
ＢＰ）及び膜結合ポリソーム（ＭＢＰ）に区画分けされるようである。ｍＲＮＡ
のこれらの三つの集団を、連続的な界面活性剤／塩抽出を用いて分離することが
できる（ベデラー(Vedeler) ら 1991)。異なるシグナルがこれらのｍＲＮＡをそ
れらの翻訳のための部位に向ける。膜タンパク質及び分泌性タンパク質の場合、
シグナルペプチドがリボソーム−ｍＲＮＡ複合体を小胞体に標的化することが必
要であることは、十分確立されたが、一方、細胞質に局在するｍＲＮＡ又は細胞
骨格に会合したｍＲＮＡに関しては３’非翻訳領域にシグナルが存在するという
証拠が最近示された（キスラウスキス(Kislauskis)ら 1994, ヘスキースら 199
4, ウイルソン(Wilson)ら 1995, ベイルーン(Veyrune) ら 1996)。

【０００４】本発明によれば、哺乳動物細胞から正常には分泌されないタンパク質に機能的
に連結している哺乳動物のシグナルペプチドをコードするＲＮＡ分子であって、
該タンパク質が該哺乳動物細胞から分泌され得るように、該シグナルペプチドが
該タンパク質の少なくとも一部を小胞体で合成させるものであるＲＮＡ分子を提
供する。

【０００５】理論に束縛されることなく、該シグナルペプチドが最初に提供され、次いで、
ｍＲＮＡの翻訳が停止するか又は速度を下げて、このシグナルペプチドをシグナ
ル認識粒子に結合させ、そしてｍＲＮＡと会合したリボソームを小胞体に向けさ
せるものと思われる。次いで、翻訳が再開するか又は速度を上げて、残りのタン
パク質が翻訳されるようにする。

【０００６】本明細書において「タンパク質」という用語は、ペプチド結合により連結され
たアミノ酸を含有する部分を含むように広い意味で用いられる。したがって、「
タンパク質」は、ペプチド及びポリペプチドを含む。

【０００７】本発明は、広範に適用可能である。原理的には、哺乳動物細胞から分泌される
タンパク質と正常に連結している天然に生ずるいかなる哺乳動物シグナルペプチ
ドの配列も、本発明で使用するための哺乳動物シグナルペプチドをコードする適
当なＲＮＡ分子を設計するために使用することができる。

【０００８】また、そのようなタンパク質を分泌させるために使用可能なそのような天然に
生ずるシグナルペプチドの改変体を使用してもよく、そしてそれは本発明の目的
にとって、「哺乳動物シグナルペプチド」という用語の範疇内にあると考えられ
る。そのような改変体は、天然に生ずる哺乳動物シグナルペプチド配列と少なく
とも５０％のアミノ酸配列の同一性を有することが好ましい。配列の同一性の程
度は少なくとも７５％であることがより好ましい。少なくとも９０％又は少なく
とも９５％の配列同一性が最も好ましい。本発明のための配列同一性は、ウイス
コンシンシーケンス・アナリシス・パッケージ(Wisconsin Sequence Analysis P
ackage) ＧＣＧ８．０の「ＢＥＳＴＦＩＴ」プログラムを用いることにより決定
することができる。

【０００９】好ましいシグナルペプチド配列は、ラットアルブミン（データベース寄託番号
Ｊ００６９８）、ウシ成長ホルモン、ラクトアルブミン及び他のミルクタンパク
質を含む。

【００１０】当業者は、利用可能なデータベース配列又は刊行物から多くのタンパク質のシ
グナル配列を確認することができる。これらの配列が発表されていない場合でさ
えも、例えば、配列ホモロジー研究を用いて、候補のアミノ酸配列と既知のシグ
ナル配列のアミノ酸配列とを比較することができる。

【００１１】本発明の好ましい態様においては、ＲＮＡ分子は、小胞体以外の細胞内の位置
に又は遊離の及び／又は細胞骨格に結合したポリソームにこの分子を向けうる配
列を含まないか、又は含むとしても、それは小胞体以外の細胞内の位置に又は遊
離の及び／又は細胞骨格に結合したポリソームに分子を向ける際には、（対応す
る天然に生ずる配列と比べて）その有効性を低下させるように改変された形状で
そのような配列を含んでいる。

【００１２】本発明のこの好ましい態様においては、小胞体にタンパク質を向けるシグナル
配列と、小胞体以外の細胞内の位置に又は遊離の及び／又は細胞骨格に結合した
ポリソームにタンパク質をコードするＲＮＡを向けるＲＮＡ配列との間の競合の
可能性を回避することができ、あるいは少なくとも小胞体に向けられるタンパク
質の確率を増加させるように変化させることができる。

【００１３】これは、哺乳動物細胞から正常には分泌されないタンパク質をコードする天然
のＲＮＡに存在する対応領域と比べて３’非翻訳（ＵＴＲ）領域の全部又は一部
に欠失、挿入又は置換を有するＲＮＡ分子を提供することにより達成できる。特
定の細胞内位置に又は遊離の若しくは細胞骨格に結合したポリソームに向けられ
たＲＮＡ分子の３’ＵＴＲ領域に存在するシグナルは、そのようなｍＲＮＡのそ
れらへの局在化を少なくともある程度まで制御すると信じられており、そしてそ
のような領域中の突然変異は、そのシグナルを不活性化することができる。ＲＮ
Ａ分子の３’ＵＴＲ領域中のシグナルは、前記ｍＲＮＡ分子の３’ＵＴＲ領域内
の配列の欠失又は突然変異並びにレポーター遺伝子への連結及び培養中の哺乳動
物細胞へのトランスフェクション後のハイブリダイゼーション試験によるｍＲＮ
Ａ分布の検出による局在可能性の測定により同定することができる。

【００１４】転写して前記ＲＮＡ分子を提供することができるＤＮＡ分子もまた本発明の範
疇にある。必須ではないが、それらは、ベクターの形（例えば、プラスミド、フ
ァージ又はコスミド）で提供されてもよい。

【００１５】前記のＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含有する哺乳動物細胞もまた本発明の範疇にあ
る。哺乳動物細胞は、細胞培養又は非ヒト動物中に存在してもよい。本明細書に
おいて使用される「細胞培養」という用語は、動物には存在せず、適当な条件下
でタンパク質を発現させるために使用されうる一以上の細胞を意味する。通常、
そのような細胞は、緩衝化された条件下で適当な生育培地中に維持されるであろ
う。細胞培養は、哺乳動物繊維芽細胞の培養、ＣＨＯ、ＢＨＫ又は骨髄腫の細胞
培養であってもよい。非ヒト動物は、トランスジェニック動物であってもよい。
（「トランスジェニック動物」という用語は、核転移された動物を含む。）トラ
ンスジェニック動物は、そのミルク中に異質タンパク質を分泌してもよい。

【００１６】また、本発明は、本発明の核酸分子を用いてタンパク質を発現する工程及び哺
乳動物細胞にタンパク質を分泌させる工程を含む哺乳動物細胞からタンパク質を
得る方法をも含む。次いで、前記タンパク質を、既知の精製技術により精製する
ことができる。

【００１７】哺乳動物細胞から正常には分泌されないタンパク質に連結した哺乳動物シグナ
ル配列を含有するキメラタンパク質は、本発明の別の側面である。そのようなタ
ンパク質は、本発明のＲＮＡ分子を翻訳することにより製造することができる。

【００１８】本発明の他の側面に加えて、本発明は前記核酸分子にハイブリダイズする核酸
分子を提供する。これらは、プローブ、プライマー又は発現等を変化させるのに
使用されるアンチセンス分子等として有用である。

【００１９】そのようなハイブリダイズする核酸分子は、少なくとも１０ヌクレオチド長が
望ましく、少なくとも２５又は少なくとも５０ヌクレオチド長が好ましい。それ
らは、厳格なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる
。厳格なハイブリダイゼーション条件の一例は、試みられたハイブリダイゼーシ
ョンが約０．９モルの塩溶液を用いて約３５℃〜約６５℃の温度で行なわれる場
合である。しかしながら、当業者は、プローブ長、塩基の組成、存在するイオン
の型等のような変数を考慮に入れるためにパラメーターを適当に変化させること
ができる。

【００２０】本発明は、ほとんど天然に生ずる哺乳動物シグナルペプチド又はその改変体を
参照しながら上述したけれども、その最も広い範疇では、哺乳動物細胞で機能す
ることができる全てのシグナルペプチドを使用することができる。これらは、天
然又は非天然に生ずるものであってもよい。それらは、原核生物（大腸菌等）に
は天然に生じないものが好ましい（必須ではないが）。

【００２１】本発明を、添付の図面のみを参照しながら実施例により記述する。

【００２２】図１は、材料と方法に記載された構築物の概略図を示す。親ベクターは、ｐｃ
ＤＮＡ３である。黒塗り四角は、ウサギベータ−グロビンの天然の５’ＵＴＲを
表す。ＳＳは、ラットアルブミンシグナル配列である。

【００２３】図２は、トランスフェクトした細胞から単離したポリソーム由来の全ＲＮＡの
ノーザンハイブリダイゼーションを示す。すべてのレーンは、１０μｇのＲＮＡ
を負荷した。このフィルターをウサギベータ−グロビンｃＤＮＡプローブとハイ
ブリダイズし、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ−ＭＰを用いて−７０℃で３日間のオートラ
ジオグラフィーすることにより特異的なバンドが検出された。Ｆは遊離のポリソ
ーム、Ｃは細胞骨格結合ポリソーム、Ｍは膜結合ポリソームである。

【００２４】図３は、トランスフェクトした細胞におけるグロビンｍＲＮＡの分布を定量的
に示す。結果は、キャンベラ・パッカード・インスタントイメージャーを用いる
直接の放射能画像化から得られた単位１８ＳｒＲＮＡ当たりの任意単位のｍＲＮ
Ａで表す。各実験に対し、遊離のポリソーム中の生成量を１００として生成値を
規格化した。結果は、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝４）である。グループを、スチ
ューデント「ｔ」検定を用いて比較した。すなわち、膜結合ポリソーム中の転写
物の生成量は、両側検定を用いてＧＧ細胞とＳＳＧＧ細胞との間で（ｐ＝０．０
１）、及びＧＭ細胞とＳＳＧＭ細胞との間で有意の相違があり（ｐ＜０．０５）
そして片側検定を用いてＳＳＧＭ細胞とＳＳＧＧ細胞との間で有意の相違があっ
た。

【００２５】図４は、転写物のｍＲＮＡ安定性を示す。細胞を７０％コンフルエンスまで生
育させ、転写をアクチノマイシンＤで阻害した。ＲＮＡを各時点で抽出し、次い
で、ノーザンブロッティングで分析した。キャンベラ・パッカード・インスタン
トイメージャーを用いる直接の放射能画像化により定量を行なった。結果は、平
均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．であり、最初の生成量のパーセントとして現す。ＧＧとＳＳＧＧ（ｎ＝６）

【００２６】図５は、トランスフェクトしたＬｔｋ^-細胞のポリソームプロフィールを示す
。可溶性の界面活性剤／塩抽出した物質を、１５％〜４０％スクロース勾配に重
層し、２０００００×ｇで１時間遠心分離した。フローセルを用いる２６０ｎｍ
での吸光度を測定することにより、ポリソームプロフィールを測定した。

【００２７】図６は、ＳＳＧＡのノーザンハイブリダイゼーション及び定量を示す。図６Ａ：ｐｃＫＳＳＧＡでトランスフェクトしたＬｔｋ^-細胞のノーザンハイブ
リダイゼーション。すべてのレーンは、２０μｇのＲＮＡを負荷した。フィルタ
ーをウサギベータ−グロビンｃＤＮＡプローブでハイブリダイズした。図６Ｂ：ｍＲＮＡの生成量の定量。結果は、直接の放射能画像化から得られた単位１８ＳｒＲＮＡ当たりの任意単位
のｍＲＮＡで表し、各実験に対し遊離のポリソーム中の生成量を１００として生
成量を取ることにより規格化した。結果は、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝３）であ
る。

【００２８】実施例三段階を含むアプローチ：ウサギベータ−グロビン５’非翻訳領域及びレポー
ター遺伝子としてのコーディング配列に連結した、アルブミンシグナルペプチド
配列及び異なる３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）配列を有する一連のベクターを構
築すること、これらの構築物を安定なトランスフェクションにより細胞に導入す
ること、次に、ｍＲＮＡの細胞下位置並びにその安定性及び翻訳効率を決定する
こと。

【００２９】材料と方法細菌及び細胞培養：標準的な手法により、プラスミドをクローニングして増殖
させた。ＣＨＯ・Ｋ１細胞は、ハムのＦ１２培地で生育させ、マウスの繊維芽細
胞株であるＬｔｋ^-細胞は、ダルベッコの最小イーグル培地で生育させた。１０
％ウシ胎仔血清で培地を補足し、５％ＣＯ₂の雰囲気下で生育させた。細胞は、
分画用に９０ｍｍのペトリ皿で及びトランスフェクション用に３５ｍｍのペトリ
皿で増殖させた。

【００３０】ベクターの構築：すべての構築物（図１）は、表１に記載されたプライマーを用
いたＰＣＲクローニングによりウサギベータ−グロビンコーディング配列から誘
導し、そして全てが天然のグロビン５’ＵＴＲを含んでいた。各構築物は、ＡＢ
Ｉ３７３Ａシークェンサー及びサイクルシーケンスを用いる配列決定により確認
した。天然の５’及び３’ＵＴＲを持つウサギベータ−グロビンを発現するプラ
スミドであるｐｃＫＧＧの構築は、以前に記載された（マホン(Mahon) ら，1997
) 。ｐｃＫＧＭは、マウスｃ−ｍｙｃの３’ＵＴＲを持つグロビンを発現し、以
下のように作製された。グロビンをコードする領域の一部及びｃ−ｍｙｃの３’
ＵＴＲの全体を、プライマーＫＰ４及びＫＰ５並びに鋳型としてプラスミドＭＰ
１３を用いるＰＣＲにより増幅した（ベイルン(Veyrune) ら 1996)。このＫＰ４
はグロビンをコードする領域でＢａｍＨＩ部位を維持し、ＫＰ５はｃ−ｍｙｃの
ポリＡシグナルの下流にＸｂａＩ部位を創出する。１ｎｇの鋳型、１．５ｍＭの
ＭｇＣｌ₂中２０ｐｍｏｌの各プライマー及び４ユニットのＴａｑポリメラーゼ
（パーキン・エルマー）を用いて、反応は、９４℃１分間、５５℃１分間及び７
２℃２分間のサイクルで行った。断片及びｐｃＫＧＧをＢａｍＨＩとＫｐｎＩで
消化し、標準的方法を用いて連結した（サンブルック(Sambrook)ら 1989)。

【００３１】シグナル配列構築物の作製には、ＡＵＧコドンにおける適当な制限部位の創出
が必要であった。これは、プライマーＫＰ６及びＫＰ７を用いるＰＣＲにより達
成された。このＫＰ６が７３１位でｐｃＤＮＡの配列に適合し、ＫＰ７がＡＵＧ
及び読み取り枠を維持しながらＮｄｅＩ部位を創出する。鋳型はｐｃＫＧＧであ
り、反応は前記した条件を用いた。反応産物を精製し、次いで、５μｇを、プラ
イマーＫＰ８（ＢａｍＨＩ部位を含むグロビンコーディング領域中の配列をカバ
ーする）、鋳型として１μｇのｐｃＫＧＧ及び前記したサイクルを用いるＰＣＲ
メガプライムに使用した。得られた断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＫｐｎＩと
ＢａｍＨＩ部位にサブクローニングし、ｐＢＳ−Ｎｄｅを作製した。

【００３２】シグナル配列は、ラットアルブミンシグナル配列（ＳＳ１及びＳＳ２）に対応
する合成オリゴヌクレオチドをアニーリングさせることにより提供された。挿入
物をｐＢＳ−ＮｄｅのＮｄｅＩ部位に連結させ、ｐＢＳ−ＳＳを作製した。次い
で、５’ＵＴＲ、アルブミンシグナル配列及びグロビンコーディング領域をカバ
ーするｐＢＳ−ＳＳからＢａｍＨＩ部位までのＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ断片を、適
当に消化したｐｃＫＧＧ及びｐｃＫＧＭに連結し、ｐｃＫＳＳＧＧ及びｐｃＫＳ
ＳＧＭを作製した。

【００３３】アルブミン３’ＵＴＲを、制限酵素によりラットアルブミン遺伝子から取り出
し、制限されたグロビンベクターをＶｅｎｔポリメラーゼで処理した後、平滑末
端化連結によりこのアルブミン３’ＵＴＲを導入した。ｐｃＫＳＳＧＡは、ｐｃ
ＫＳＳＧＧ及びｐｃＫＳＳＧＭについて記述されたように構築した。

【００３４】トランスフェクション：トランスフェクションは、製造業者の指示に従い、Ｌｉ
ｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（登録商標）（ギブコ）で行なった。細胞を、５ｘ１０ ⁵ 細胞／皿の密度で３５ｍｍのペトリ皿にサブ培養し、７０〜８０％コンフルエ
ンスまで生育させた。この細胞を、無血清培地中１μｇのプラスミドＤＮＡ及び
６〜１０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥで重層した。５時間後に、血清を１
０％の最終濃度まで添加した。２４時間目にこの培地を完全培地と交換し、７２
時間目に２００μｇ／ｍｌのＧ４１８での選択を開始した。一旦安定にトランス
フェクトした後は、細胞は１００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で維持された。この細
胞株を、トランスフェクトした構築物に合わせて命名し、例えば、ｐｃＫＧＧで
トランスフェクトした細胞はＧＧと称する。

【００３５】細胞分画：Ｌｔｋ−細胞を７０％コンフルエンスまで生育させ、ラバーポリース
マンを用いて集め、連続的な界面活性剤／塩抽出手法により分画した（ベデラー
ら, 1991；ヘスキースら，1994) 。ポリソームを、４０％スクロースの１５ｍｌ
クッションを通す３２，０００ｇでの１７時間遠心分離により、モノソーム及び
より軽いリボ核タンパク質粒子から分離した（ホフラントら，1995) 。

【００３６】ＲＮＡ抽出及びＲＮＡゲル電気泳動：チョムクジンスキー(Chomczynski) とサッ
チ(Sacchi)(1987)の酸／グアニジニウム／フェノール／クロロホルム法により、
全ＲＮＡを抽出し、その標品をＡ２６０／Ａ２８０により評価した。次いで、Ｒ
ＮＡを、変性２．２Ｍのホルムアルデヒド、１．２％アガロースゲルによる電気
泳動により分離し（サンブルック(Sambrook)ら 1989)、毛細管ブロッティングに
よりナイロン膜（ジーンスクリーン、ＮＥＮデュポン社）に転写した。ＲＮＡを
ＵＶ光により膜に固定し、乾燥させて保存した。

【００３７】ノーザンハイブリダイゼーション及びＤＮＡプローブ：膜を、４２℃で最小限
６時間、５０％ホルムアミド、１０％デキストラン硫酸、０．２％ウシ血清アル
ブミン、０．２％ポリビニルピロリドン、０．２％フィコール、０．１％ピロリ
ン酸ナトリウム、１％ＳＤＳ及び５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．５中０．１ｍｇ
／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡでプレハイブリダイズした。ベータ−グロビンｃＤ
ＮＡプローブは前に記述された（ベイルン(Veyrune) ら 1996)。ｃ−ｍｙｃプロ
ーブは、ネズミ遺伝子の３つのエキソンのｃＤＮＡであり（ヘスキースら，1994
) 、コール(M. Cole) 博士（プリンストン大学、ニュージャージー米国）から
恵与され、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プ
ローブは、ヒトｃＤＮＡ（アメリカンティッシュカルチャーコレクション、寄託
番号５７０９０）由来の０．７８ｋｂのＰｓｔＩ−ＸｂａＩ断片であり、そして
１８Ｓ・ｒＲＮＡプローブは、フルトン(R. Fulton) 博士、ビートソン研究所、
グラスゴーから入手したｃＤＮＡ由来の１．４ｋｂＢａｍＨＩ断片であった。２
０〜３０ｎｇのプローブを、ランダムプライミング（メガプライム・キット、ア
マシャム・インターナショナル、英国製）により³²Ｐ−ｄＣＴＰで標識化した。
標識化したプローブをプレハイブリダイゼーション混合物に添加し、４２℃で一
晩ハイブリダイズさせた。フィルターを２×ＳＳＣ中、室温で簡単に洗浄して、
ハイブリダイゼーション混合物を除いた。６５℃での洗浄は、以下のようにプロ
ーブ特異的であった、すなわち、グロビンは１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、３０
分を２回、ｃ−ｍｙｃは０．５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、１時間を２回、ＧＡＰＤ
Ｈは１×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、１時間を２回、１８Ｓは０．２×ＳＳＣ、１％Ｓ
ＤＳであった。０．１×ＳＳＣ中の最終の簡単な洗浄によりＳＤＳを除去した。
特異的なハイブリダイゼーションを検出し、キャンベラ・パッカード・インスタ
ントイメージャーで定量した。特異的に結合したプローブの量を、非特異的結合
に対して補正し、そのデータを、１８Ｓ・ｒＲＮＡプローブへのハイブリダイゼ
ーションにより測定されたｒＲＮＡの単位当たりで表した。再精査する前に、フ
ィルターを０．１％ＳＤＳ中１０分間９５℃まで加熱することによりきれいにし
た。

【００３８】ｍＲＮＡの安定性：ｍＲＮＡの安定性は、転写の阻害後２〜１２時間の期間に
わたる生成量を測定することにより決定した。細胞を７０％コンフルエンスまで
生育させ、アクチノマイシンＤの添加（５μｇ／ｍｌ）により転写を阻害した。
ＲＮＡを前記のように抽出した。

【００３９】ポリソームプロフィール及び翻訳効率：細胞を７０％コンフルエンスまで生育
させ、ラバーポリースマンを用いて培地中にはがし、次いで、４℃、２０００ｒ
ｐｍで５分間ペレット化した。細胞をＤＥＰＣ・ＰＢＳで洗浄し、前述のように
ペレット化した。その細胞を１０ｍＭのＴＥＡ（トリエタノールアミン）ｐＨ７
．６、１３０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．５ｍＭのＣａＣｌ₂、０
．２５ｍＭスクロースに０．５％デオキシコール酸塩及び０．５％トリトンＸ１
００を補足した溶液に再懸濁し、氷上で１０分間インキュベートした。その核を
、４℃、３０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によりペレット化した。０．３ｍ
ｌの上清を７ｍｌの１５％〜４０％スクロース勾配に重層し、２００，０００×
ｇで１時間遠心分離し、次いで、ツァイスＰＭ・２Ａ分光光度計に載せＷ＋Ｗ記
録計に連結したフロースルーセルを用いる２６０ｎｍでの吸光度を測定すること
によりモニターした。フローセルからの流出液を集め、各勾配を三つの画分、す
なわち、ポリソーム、モノソーム及び残りのもの（非翻訳物質）に分割した。ポ
リソームは、３２０００×ｇで１７時間の遠心分離によりペレット化し、ＲＮＡ
をペレットから抽出した。モノソームＲＮＡはイソプロパノールと酢酸アンモニ
ウムで沈澱させ、次いで、前に記述したように抽出した。

【００４０】結果アルブミンシグナル配列によるグロビンｍＲＮＡの転送：最初に、、ウサギベ
ータ−グロビン５’ＵＴＲと天然の３’ＵＴＲ又はｃ−ｍｙｃ３’ＵＴＲのいず
れかを有するコーディング領域に、それぞれアルブミンシグナル配列を加えるか
又は加えないかに基づいて四つのプラスミドを構築した。これらの構築物をＬｔ
ｋ−繊維芽細胞に導入して、安定なトランスフェクトした細胞株を確立した。ト
ランスフェクトした遺伝子の発現は、グロビン転写物を検出するためのノーザン
ハイブリダイゼーションにより評価して四つの遺伝子すべてが発現していること
がわかった。本発明者らは、７０％コンフルエンスでグロビン発現の最高のレベ
ルを見出し（データは示さず）、その後のすべての実験は、その段階の生育で行
なった。

【００４１】界面活性剤／塩による分画は、ＦＰ、ＣＢＰ及びＭＢＰ間の転写物の区画化を
研究するために行なった。各細胞株を分画し、ポリソームをペレット化し、次い
で、ＲＮＡをそのペレットから抽出し、グロビン転写物の生成量についてノーザ
ンハイブリダイゼーションにより分析した。図２に示すように、対照細胞株（Ｇ
Ｇ）では、グロビン転写物は遊離のポリソームに大部分見出された。対照的に、
アルブミンシグナル配列を有するグロビン転写物を発現する細胞（ＳＳＧＧ）に
おいては、この転写物は、ＭＢＰ／ＥＲに多く見出された。また、ＳＳＧＭ転写
物も、ＭＢＰ／ＥＲ画分中に最高の生成量で見出された。

【００４２】１８Ｓ・ｒＲＮＡプローブでフィルターを再精査すると、ＲＮＡ負荷に関する
補正及び単位ＲＮＡ当たりのハイブリダイゼーションデータの定量化が可能にな
った。ＦＰ、ＣＢ及びＭＢＰにおけるグロビン転写物の生成量は、それぞれ、Ｇ
Ｇ細胞において２．５±０．４、２．９±１．０及び２．１±０．９（少なくと
も４回の別々の実験からの平均±ｓ．ｅ．ｍ．、結合した１８Ｓプローブのｃ．
ｐ．ｍ．当たりの結合したグロビンプローブのｃ．ｐ．ｍ．の任意の単位として
表す）であり、ＳＳＧＧ細胞において０．９±０．２、１．３±０．２及び２．
５±０．８であった。これらの実験において最も重要なパラメーターであったの
は、全体の発現レベルではなく相対的な転写物の分布であったので、これらのデ
ータを次に、ＦＰ画分での生成量と比較して図３に示すように表した。これらの
データから、アルブミンシグナル配列の付加がグロビンｍＲＮＡをＥＲに転送す
ることが確認される（ｐ＝０．０１）。

【００４３】ＧＭ細胞において、ＦＰ、ＣＢＰ及びＭＢＰにおけるグロビン転写物の生成量
は、それぞれ、２．６±０．７、２．８±０．９及び１．６±０．５（少なくと
も４回の別々の実験からの平均±ｓ．ｅ．ｍ．、結合したグロビンプローブのｃ
．ｐ．ｍ．の任意の単位として表す）であり、ＳＳＧＭ細胞においては、生成量
の分布は、それぞれ、２．５±１．１、２．３±０．８及び３．０±１．４であ
った。ＦＰにおけるものに比べた生成量として表されたこれらのデータの分析か
ら、ＧＭ転写物は以前（ヘスキースら、1994) に見出されたようにほとんどＣＢ
Ｐに存在するが、対照的に、ＳＳＧＭ転写物はＣＢＰ及びＭＢＰで同様の相対的
な生成量で見出される（図３）ことが示された。ＭＢＰにおけるグロビン転写物
の生成量は、ＧＭ細胞よりもＳＳＧＭ細胞において有意に多く、ＥＲに転写物を
転送するシグナル配列の能力を再び示す。しかしながら、ＧＭ細胞と比べたＳＳ
ＧＭ細胞におけるＭＢＰの生成量の増加は、ＧＧ細胞と比べたＳＳＧＧ細胞にお
ける生成量の増加よりも有意に少なかった（ｐ＜０．０５）。こうして、このシ
グナル配列は、付着したｃ−ｍｙｃ３’ＵＴＲを有するグロビンコーディング領
域及び５’ＵＴＲを転送するものの、ｃ−ｍｙｃ３’ＵＴＲとこのシグナル配列
の両方の存在は、転送が起こる程度を低下させた。これは、ＥＲ局在化シグナル
（シグナルペプチド）と細胞骨格局在化シグナル（ｃ−ｍｙｃ３’ＵＴＲ；ベイ
ルンら,1996)との間に競合が存在することを示唆する。

【００４４】シグナル配列の付加はｍＲＮＡの安定性及び翻訳効率に何の影響も有さない：５’シグナルの操作がグロビンｎＲＮＡの安定性を変えた可能性が理論的には存
在したので、本発明者らは、キメラ転写物の安定性を測定した。各細胞株を７０
％コンフルエンスまで生育させ、次いで、アクチノマイシンＤで処理してさらな
る転写を阻害した。ＲＮＡの生成量は、ノーザンブロッティングにより測定した
。グロビンは高度に安定なメッセージであるので（アビブ(Aviv)ら, 1976) 、Ｇ
Ｇ及びＳＳＧＧ転写物の生成量は１２時間の期間にわたって測定した。図４に示
すように、追加のアルブミンシグナル配列は、グロビンｍＲＮＡの安定性を有意
に変化させなかった。同様に、ＧＭ、ＳＳＧＭ細胞株の分析から、ｃ−ｍｙｃ３
’ＵＴＲを有するグロビン転写物へのシグナル配列の付加は、ｎＲＮＡを不安定
化させなかった（データは示さず）。フィルターの再精査から、ＧＡＰＤＨｎＲ
ＮＡが検出され、転写が四つの細胞株すべてにおいて阻害されたことが示された
（データは示さず）。

【００４５】ｍＲＮＡの安定性におけるシグナル配列の効果：５’及び３’シグナルの操作
がグロビンｍＲＮＡの安定性を変化させた可能性が理論的には存在したので、本
発明者らは、追加したシグナル配列のｍＲＮＡ安定性に対する安定効果を決定し
た。細胞を７０％コンフルエンスまで生育させ、次いで、アクチノマイシンＤで
処理してさらなる転写を阻害した。ＲＮＡの生成量は、ノーザンブロッティング
により測定した。グロビンは高度に安定なメッセージであるので（アビブ(Aviv)
ら, 1976) 、ＧＧ及びＳＳＧＧ転写物の生成量は、１２時間の期間にわたって測
定した。図４に示すように、アルブミンシグナル配列の付加は、グロビンｍＲＮ
Ａの安定性を有意に変化させなかった。ＧＡＰＤＨｍＲＮＡを検出するためのフ
ィルターの再精査（データは示さず）は、転写が両方の細胞株で阻害されたこと
を示した。

【００４６】翻訳の効率：外来性遺伝子内のシグナルの操作が翻訳全般に影響を与えたのか
それとも特定の改変された遺伝子の翻訳に影響を与えたのかを決定するために、
四つの細胞株のタンパク質合成装置をポリソームプロフィール分析に付した。細
胞を塩と界面活性剤で溶解し、可溶性物質を１５％〜４０％スクロース勾配に重
層した。ポリソームプロフィールを記録した。図５に示す。ポリソーム／モノソ
ーム比を表２に示す。ポリソームプロフィールは四つの細胞株全てにおいて非常
に類似しており、活性なポリソームに存在するリボソームの割合は類似していた
。ピークの高さが異なるのは、勾配に重層したＲＮＡの全量の相違を表す。した
がって、４つの構築物でのトランスフェクションは、タンパク質合成全体に影響
しなかった。スクロース勾配由来のポリソーム及びモノソーム画分におけるグロ
ビン転写物の割合の分析（表３）から、シグナル配列の付加が転写物の翻訳を有
意に変化させないことが示される。

【００４７】アルブミン３’ＵＴＲの影響：図３における結果は、５’ターゲッティングシ
グナルと３’ターゲッティングシグナルとの間に競合が存在することを示唆した
が、本発明者らは、観察された効果がグロビンコーディング配列と、そのシグナ
ル伝達の役割を果たすシグナル配列を抑制するｃ−ｍｙｃ３’ＵＴＲとの間の何
らかの形の相互作用によるものであることを懸念した。この疑問を解決するため
に、本発明者らは、異なる３’ＵＴＲ、すなわち、アルブミン遺伝子由来の３’
ＵＴＲを有するさらなるベクター、すなわち、ラットアルブミンｍＲＮＡの３’
ＵＴＲとラットアルブミンシグナル配列の両方を有するグロビンコーディング領
域（ＳＳＧＡ）を構築した。このプラスミドをＬｔｋ−細胞にトランスフェクト
し、安定な細胞株を確立した。ＳＳＧＡ細胞を、前記したように分画して分析し
た。図６に示すように、その結果は、アルブミン３’ＵＴＲとシグナル配列の両
方を含むＳＳＧＡ転写物がＭＢＰ／小胞体画分に優勢に回収されたことを示す。
このことは、グロビン転写物のＥＲへの転送を阻止するには外来性の３’ＵＴＲ
の導入それ自体では十分でないことを示す。グロビンコーディング配列がラット
アルブミン３’ＵＴＲに連結するがシグナル配列を持たないさらなるベクター（
ＧＡ）を作製したが、不幸にも、本発明者らはこの遺伝子を発現するトランスフ
ェクト細胞を検出することができなかったので、さらなる分析は不可能であった
。

【００４８】討論本発明の結果は、ＤＮＡ組換え技術とトランスフェクションとの組合せにより
、グロビンｍＲＮＡが小胞体に標的化し直される細胞株を作成することが可能で
あることを示す。こうして、Ｌｔｋ−繊維芽細胞では、天然のグロビン３’ＵＴ
Ｒを有するグロビンにラットアルブミンシグナル配列を付加することにより、そ
のｍＲＮＡは膜結合型ポリソームに転送された。これは、安定な細胞株において
、遊離のポリソームからＥＲへのｍＲＮＡの転送の最初の証明である。ヒストン
ｍＲＮＡのＭＢＰへの部分的な転送は、大腸菌シグナル配列を用いて哺乳動物細
胞（ヒーラ）で以前に証明されている（ザンベッティ(Zambetti)ら 1987)。また
、リー(Lee) と共同研究者(1996)らは、ＩｇＭシグナルペプチドを用いてＣＯＳ
−７細胞から活性なシアリルトランスフェラーゼを分泌させたが、この場合、天
然のシアリルトランスフェラーゼはＥＲで合成される。しかしながら、これらの
場合のいずれにおいても、トランスフェクションが一過性であったことは重要で
ある。

【００４９】遊離のポリソーム上で翻訳されるｍＲＮＡに加えて、相当の割合のｍＲＮＡが
細胞骨格に会合したポリソームで翻訳される（ヘスキース，1996) 。ｍＲＮＡの
細胞骨格への標的化は、３’ＵＴＲのシグナルによるものであることが示された
（ヘスキースら，1994; ベイルーンら, 1996; マホンら, 1997) 。図３に示すよ
うに、シグナルペプチドに加えて、細胞骨格標的化シグナルが転写物の３’ＵＴ
Ｒ中に存在するときは、膜結合ポリソームへの移行が減少する。これは、アルブ
ミン由来の異なる「外来性」３’ＵＴＲのグロビンへの付加（ＳＳＧＡ；図６）
がシグナル配列による転送を低下させなかったことから、「外来性」３’ＵＴＲ
の非特異的効果により生じたものではないように思われる。したがって、このデ
ータは、ハイブリッド転写物がシグナル配列と３’ＵＴＲ局在化シグナルの両方
を含む場合、５’シグナルと３’シグナルとの間に競合が存在することを示す。
こうして、ｃ−ｍｙｃ３’ＵＴＲ局在化シグナルは、シグナル配列を介するｍＲ
ＮＡの区画分けを妨害するように見える。

【００５０】これらのデータは、バイオテクノロジーに重要な関係を有する。第一に、これ
らのデータは、細胞内タンパク質をコードするｍＲＮＡがＥＲに転送される安定
な細胞株を形成させることが可能であることを証明する。第二に、これらのデー
タは、そのようなｍＲＮＡが３’ＵＴＲ局在化シグナルを含むときは、そのよう
なシグナルは効率的な転送を達成するために除去されなければならないことを示
す。

【００５１】アルブミン３’ＵＴＲでの本発明の結果により示されるように（図６）、特に
シグナル配列と同じ遺伝子が用いられるとき、分泌タンパク質のｍＲＮＡ由来の
３’ＵＴＲを含むベクターを用いることが最も適当でありうる。このようにして
、所望のコーディング領域を、５’ＵＴＲ／シグナル配列と分泌されるタンパク
質のｍＲＮＡ由来の３’ＵＴＲとの間に挿入し、シグナル競合の問題を根絶でき
る。

【００５２】そのような改変遺伝子が市販目的に使用されるべきものである場合、理想的に
はシグナルの改変は、いかなる主要な程度にもｍＲＮＡの安定性と翻訳の効率を
減少させるべきでない。図４と５におけるデータは、グロビンへのシグナル配列
の付加がｍＲＮＡの安定性と翻訳の効率に何の効果も持たなかったことを示す。
したがって、標的化のし直しは、ｍＲＮＡの安定性及び翻訳の維持と両立させる
ことができる。レポーターとしてルシフェラーゼを用いて、本発明者らは、アル
ブミンシグナル配列によるｍＲＮＡの標的化のし直しが、ＥＲ中で免疫学的に認
識可能なタンパク質の合成を伴うことを示した。

【００５３】結論として、本発明の結果は、安定性と翻訳を維持しながらｍＲＮＡのＥＲへ
の標的化のし直しが可能であることを示す。

【００５４】参考文献アビブ、バローチ、バストスとレビー(Aviv, H., Valloch, V., Bastos, R.,
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【００５５】ボニュー、ピカゼック、マルティ、カニー、ブランチャード、フォート、ジー
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胞における細胞外分泌に効果的な発現ベクター。Mol. Cells 6. 552-556 。

【００５９】リン、リン、ライ、ブラウン、イグリー、スマリング、フォックス、チェン、
カストロ、サッグス(Lin, F-K., Lin, C-H., Lai, P-H., Browne, J.K., Egrie,
J.C., Smalling, R., Fox, J.M., Chen, K.K., Castro, M., Suggs, S.)、(198
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ける発現。Bio/Technology 3, 561-566 。

【００６０】プライム、パートリッジ、ヨハンセン、ヨーダー、タウラー、ヘスキース(Pry
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【００６２】ザンベッティ、スタインとスタイン(Zambetti, G., Stein, G., and Stein, J
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【００６３】

【表１】

【００６４】

【表２】

【００６５】

【表３】

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年３月６日（２０００．３．６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【請求項２】該シグナル配列が成長ホルモン、ミルクタンパク質又はアル
ブミンから選択されるシグナル配列である、請求項１記載のＲＮＡ分子。

【請求項３】転写されて請求項１又は請求項２記載のＲＮＡ分子を生ずる
ことができるＤＮＡ分子。

【請求項４】先行する請求項のいずれかに記載の分子にハイブリダイズす
ることができる核酸分子。

【請求項５】ベクターの形態である、先行する請求項いずれかに記載の分
子。

【請求項６】細胞培養中又は非ヒト動物中に存在するとき、先行する請求
項いずれかに記載の分子を含んでいる哺乳動物細胞。

【請求項７】哺乳動物細胞からタンパク質を取得する方法であって、請求
項１〜請求項３又は請求項５いずれかに記載の分子を用いてその細胞中にタンパ
ク質を発現させる工程、及びその細胞にそのタンパク質を分泌させる工程を含ん
で成る方法。

【請求項８】正常では哺乳動物細胞から分泌されないタンパク質に連結し
ている哺乳動物シグナルペプチドを含むキメラタンパク質であって、該分子が請
求項１又は請求項２記載のＲＮＡ分子を翻訳することにより生産され得るもので
あるキメラタンパク質。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者イアンフレイザープライムノルウェー国、エヌオウ−5009 ベルゲン、アルスタットバイエン 19番地、ユニバーシティオブベルゲン、デパートメントオブバイオケミストリーアンドモレキュラーバイオロジー (72)発明者ジョンエドワードヘスキースイギリス国、エヌイー１７アールユー、ニューカースル、キングズロード、ユニバーシティオブニューカースル、デパートメントオブニュートリショナルアンドバイオロジカルサイエンシーズ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】哺乳動物細胞から正常では分泌されないタンパク質に機能的
に連結している哺乳動物シグナルペプチドをコードするＲＮＡ分子であって、該
シグナルペプチドが少なくとも該タンパク質の一部をそれが分泌され得るように
小胞体上で合成させるものであるＲＮＡ分子。
【請求項２】分子を細胞内の小胞体以外の場所に、又は遊離のポリソーム
及び／又は細胞骨格結合ポリソームに向ける配列を含まず、又はそのような配列
を含むが細胞内の小胞体以外の位置に、又は遊離のポリソーム及び／又は細胞骨
格結合ポリソームに向けるその効率が対応する天然に生ずる配列と比べて低下す
るように改変された形態で含む、請求項１記載のＲＮＡ分子。
【請求項３】哺乳動物細胞から正常では分泌されない該タンパク質をコー
ドする天然のＲＮＡ中に存在する対応する領域と比べて、３’非翻訳領域の全て
又は一部に欠失、挿入又は置換を含む、請求項２記載のＲＮＡ分子。
【請求項４】該シグナル配列が成長ホルモン、ミルクタンパク質又はアル
ブミンから選択されるシグナル配列である、先行する請求項のいずれかに記載の
ＲＮＡ分子。
【請求項５】転写されて先行する請求項のいずれかに記載のＲＮＡ分子を
生ずることができるＤＮＡ分子。
【請求項６】先行する請求項いずれかに記載の分子にハイブリダイズする
ことができる核酸分子。
【請求項７】ベクターの形態である、先行する請求項いずれかに記載の分
子。
【請求項８】細胞培養中又は非ヒト動物中に存在するとき、先行する請求
項いずれかに記載の分子を含んでいる哺乳動物細胞。
【請求項９】哺乳動物細胞からタンパク質を取得する方法であって、請求
項１〜請求項５又は請求項７いずれかに記載の分子を用いてその細胞中にタンパ
ク質を発現させる工程、及びその細胞にそのタンパク質を分泌させる工程を含ん
で成る方法。
【請求項１０】正常では哺乳動物細胞から分泌されないタンパク質に連結
している哺乳動物シグナルペプチドを含むキメラタンパク質であって、該分子が
請求項１〜請求項４いずれか１項に記載のＲＮＡ分子を翻訳することにより生産
され得るものであるキメラタンパク質。
【請求項１１】実質的に以上に記述された発明。