DE69832688T2

DE69832688T2 - Hochselektive butyrylcholinesterase inhibitoren zur behandlung und zur diagnose von demenz und alzheimers krankheit

Info

Publication number: DE69832688T2
Application number: DE69832688T
Authority: DE
Inventors: H. Nigel GREIG; Qian-Sheng Yu; Arnold Brossi; T. Timothy SONCRANT; Marvin Hausman
Original assignee: National Institutes of Health NIH; Axonyx Inc
Current assignee: National Institutes of Health NIH; Axonyx Inc
Priority date: 1997-07-09
Filing date: 1998-07-09
Publication date: 2006-09-07
Anticipated expiration: 2018-07-10
Also published as: PL191402B1; CA2264750C; HUP0003852A3; DK0949920T3; IL128877A; DE69832688D1; AU8293198A; SI0949920T1; HUP0003852A2; US20020094999A1; PL332078A1; AU749088B2; CZ81699A3; WO1999002154A1; JP2001500165A; CZ297533B6; ATE311876T1; BR9806184A; EP0949920B1; US6410747B1

Description

Hintergrund der Erfindung
Es wurde darauf hingewiesen, dass kognitiven Störungen, die mit der normalen Alterung und der Alzheimer-Krankheit verbunden sind, Defekte im cholinergischen System zugrunde liegen (Bartus et al., Science 217:408–417 (1982); Fisher et al., Neurobiol. Aging. 13:9–23 (1992)). Viele Forschungsarbeiten konzentrierten sich auf die Entwicklung einer cholinomemetischen Ersatztherapie als möglicher Behandlung dieser Störungen. Unter diesen wurden Cholinesterase-Inhibitoren, wie Physostigmin (Phy) und Tetrahydroaminoacridin (ThA) im Hinblick auf erinnerungsverbessernde Effekte untersucht, und zwar sowohl in tierischen Patienten (Rupniak et al., Neurobiol. Aging. 11:09–613; 1990); Murray et al., Psychopharmacology 105:134–136) (1991) als auch menschlichen Patienten (Mohs et al., J. Am. Geriatr. Soc. 3: 749–757 (1985); Summers et al., N. Engl. J. Med. 315:1241–1245 (1986).
Andere Mittel wurden als selektive Inhibitoren von Acetylcholinesterase (AChE) vorgeschlagen. So wurde Heptylphysostigmin (Heptyl-Phy) dahingehend beschrieben, dass es eine größere Lipophilie, eine länger andauernde inhibitorische Wirkung auf Cholinesterase und nachhaltigere Zunahmen von Acetylcholin im Gehirn mit geringerer Toxizität hat als die Stammverbindung (Brufani et al., Pharmacol. Biochem. Behav. 26:625–629) (1987). Es herrscht jedoch eine Besorgnis darüber, ob das therapeutische Fenster von Heptyl-Phy für eine klinische Anwendung ausreichend groß ist. Phenserin ((–)-N-Phenylcarbamoyl)eserolin) wurde als überlegener selektiver AChE-Inhibitor identifiziert, der somit als Mittel für die Therapie kognitiver Störungen geeignet ist, die mit der Alterung und der Alzheimer-Krankheit verbunden sind (US Patent Nr. 5409948, erteilt am 25. April 1995).
Im US Patent Nr. 5171750, erteilt am 15. Dezember 1992, wird eine Reihe von substituierten Phenserinen offenbart, die – wie angegeben wird – entweder selektive Inhibitoren von AChE oder Butyrylcholinesterase (BChE) sind. Es wurde festgestellt, dass das Cumylcarbamat (4'-Isopropylphenylcarbamat)-Derivat von (–)-Physovenol eine umgekehrte Enzym-Spezifität hat, d.h. es hemmte BChE selektiv gegenüber AChE. Im Patent wird darauf hingewiesen, dass die Verbindungen der Erfindung "zur Behandlung cholinergischer Störungen, wie Glaukom, Myasythenia Gravis, Alzheimer-Krankheit und als Antidot bei einer Vergiftung mit Organophosphaten" brauchbar sind. Es gibt keinen Hinweis darauf, welcher Typ von Inhibitor verwendet werden soll, um die speziellen Erkrankungen zu behandeln, es gibt jedoch eine weitere derartige Offenbarung, dass AChE, das in roten Blutzellen, im Gehirn und Nervengeweben gefunden wird, ein spezifischeres Enzym zu sein scheint, das dafür bekannt ist, Acetylcholin (ACh) in vivo zu hydrolysieren, als dies bei BChE der Fall ist, das im Serum, in der Bauchspeicheldrüse und der Leber gefunden wird. Der deutliche cholinergische Verlust bei AD ist mit dramatischen Reduktionen der Enzyme Cholinacetyl-Transferase, das in die Synthese des cholinergischen Neurotransmitters Acetylcholin, Ach, verwickelt ist, und von AChE verbunden, das die Wirkung von Ach beendet (Perry et al., Brit. Med. J., 26150:1457–1459, 1978; Whitehouse et al., Science 215:1237–1239, 1982).
Das US Patent Nr. 5378723, erteilt am 3. Januar 1995, beschreibt eine Reihe von Thiaphysovenol-Carbaminsäure-Derivaten, von denen angegeben wird, dass sie eine hohe Wirksamkeit zur Hemmung von AChE und BChE aufweisen. Es wurde angegeben, dass die Verbindungen dieser Erfindung – wie im Fall von US 5,171,750 oben – zur Behandlung von Erkrankungen, wie Glaukom, Myasythenia Gravis, Alzheimer-Krankheit und einer Vergiftung mit Organophosphaten brauchbar sind. Wie oben liegt kein spezieller Hinweis darüber vor, welcher Typ von Inhibitoren bei welcher speziellen Erkrankung verwendet werden soll.
Geula und Mesulam machen in einer Veröffentlichung mit dem Titel "Cholinestereases and the Pathology of Alzheimer's Disease", Alzheimer's Disease and Associated Disorders, Band 9, Ergänz. 2, S. 23–28 (1995) die folgenden Beobachtungen. Zusammengefasst: "Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist begleitet von einem deutlichen Verlust der Acetylcholinesterase (AChE)-Aktivität, die mit kortikalen cholinergischen Axonen und cholinozeptischen Neuronen verbunden ist. Gleichzeitig mit diesem Verlust tritt eine Cholinesterase (ChE)-Aktivität im AD-Cortex in Form einer AChE- und BChE-Aktivität auf, die mit Plaques, Verwirrtheit und Amyloid-Angiopathie verbunden ist. Unsere Beobachtungen haben gezeigt, dass die ChEs, die mit den pathologischen Läsionen von AD (ADChEs) verbunden sind, unterschiedliche enzymatische Eigenschaften besitzen und ziemlich wahrscheinlich aus einer anderen Quelle stammen, verglichen mit den ChEs, die mit normalen Neuronen und Axonen verbunden sind. Die ADChEs haben sehr wahrscheinlich nicht-cholinergische Funktionen, die in die Pathogenese von AD verwickelt sind". In einem weiteren Abschnitt, S. 26, stellen die Autoren fest: "Diese Beobachtungen weisen darauf hin, dass die Glia eine mögliche Quelle des ChE und insbesondere des BChE sind, die mit den pathologischen Schädigungen von AD verbunden sind". Sie weisen auch darauf hin, dass ein hohes Verhältnis von BChE zu AChE im positiven Glia (Nervenstützgewebe) eine zulässige oder ursächliche Rolle in der Neuropathologie dieser Krankheit spielen kann. Es ist möglich, dass andere Pools von ChE existieren, die enzymatische Eigenschaften haben, die denen von AD-ChEs ähnlich sind oder mit denselben identisch sind. Diese Möglichkeit bleibt unerforscht."
Fachleute haben darauf hingewiesen, dass BChE in signifikant höheren Mengen in AD- Plaques gefunden wird, als in Plaques von altersangepassten, nicht dementen Gehirnen. Darüber hinaus wurde gefunden, dass BChE die Aggregation von β-Amyloidpeptid (Aβ) verändert. Es wurde angenommen, dass, da AChE durch hohe Konzentrationen an Acetylcholin (ACh) gehemmt wird, während BChE unbeeinflusst bleibt, es gut sei kann, dass BChE eine wichtige Rolle spielt bei der in vivo Regulierung synaptischer Konzentrationen an ACh im Gehirn von AD-Patienten. Ein BChE-Inhibitor, der in das Gehirn eingeträufelt wurde, hat eine signifikante Zunahme des Gehalts an extrazellulärem Ach erzeugt (Glacobini et al., Proc. Soc. Neurosci., 22:293, 1996).
Es wurde auch gefunden, dass in 3 AD-Proben Plaques, die vom kompakten oder neuritischen Typ waren, fast immer mit einer intensiven BChE-Aktivität verbunden waren. Es wurde geschlossen, dass die BChE-Aktivität im Zwischenstadium der Plaques-Bildung auftritt und dass sie daher einen der Faktoren ausmachen kann, die in die Transformation einer anfänglich gutartigen Aβ-Abscheidung in eine kompakten neuritische Form verwickelt sind, die mit neuraler Degeneration und Demenz verbunden ist.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Es wurde unerwartet gefunden – und stellt somit die Basis der vorliegenden Erfindung dar –, dass hochselektive BChE-Inhibitoren durch systemische Verabreichung verwendet werden können, um kognitive Störungen zu verhindern oder zu behandeln, die mit der Alterung und der Alzheimer-Krankheit in einem Wirt verbunden sind. Da zuvor festgestellt wurde, dass die BChE-Aktivität primär in peripheren Organen vorliegt, wie Bauchspeicheldrüse, Leber und Serum oder im Kreislauf, und die Inhibition derselben mit Nebenwirkungen verbunden war, die in der ersten Generation der Alzheimer-Krankheitstherapie beobachtet wurden (Liston et al., Proc. Soc. Neurosci., 20:608, 1994); Soreq & Zachnt, Human Cholionesterase und ?, Academic Press, New York, S. 21–29 (1993) Ref.) wurde auf die Verwendung von hochselektiven BChE-Inhibitoren zur Behandlung oder Prävention kognitiver Störungen, die mit der Alterung und der Alzheimer-Krankheit verbunden sind, nicht in der Technik hingewiesen. Ein weiterer Faktor, der nicht auf die mögliche Verwendung hochselektiver BChE-Inhibitoren zur Behandlung kognitiver Erkrankungen des Gehirns und des CNS hinwies, war das erwartete Verteilungsmuster solcher Mittel. In der Technik verfügbare Daten deuten darauf hin, dass solche Verbindungen vorzugsweise an periphere Organe gebunden werden, wo der Hauptteil ihrer Substrataktivität sitzt. Es wurde daher nicht erwartet, dass klinisch brauchbare Konzentrationen an hochselektiven BChE-Inhibitoren, die systematisch einem Patienten verabreicht werden, die Blut-Gehirn-Schranke passieren würden und im Gehirn verfügbar wären, da (I) man erwarten würde, dass solche Verbindungen an systemisches Enzym gebunden werden, bevor sie das Gehirn erreichen, wodurch ihr Zugang eingeschränkt ist, und (II) die meisten in der Technik bekannten BChE-Inhibitoren nicht leicht in das Gehirn eintreten. Tatsächlich wurden bis jetzt Inhibitoren von BChE in großem Maße als Pestizide in der Landwirtschaft verwendet (Soreq und Zachut, Human Cholinesterases and Anticholinesterases, Academic Press, N.Y., S. 21–29, 1993).
Der Ausdruck "hochselektiv", wie er hierin verwendet wird, soll solche BChE-Inhibitoren einschließen, deren Verhältnis von IC(50)-Werten gegenüber menschlichem Plasma BChE, verglichen mit ihren IC(50)-Werten gegenüber menschlichem Erythrozyt-AChE größer als etwa 15:1 war.
Die IC(50)-Werte für solche Inhibitoren können unter Verwendung von Methoden bestimmt werden, die in der Technik wohlbekannt sind. In einem solchen Assay wird die pharmakologische Aktivität jeder Verbindung als ein IC(50) – definiert als die Konzentration in nanomol, die notwendig ist, um 50% der Enzym-Aktivität von AChE und BChE zu hemmen – separat bestimmt. Zur Bestimmung der IC(50)-Werte wurde die Enzym-Aktivität jeder Konzentration als Prozentgehalt derjenigen ausgedrückt, die in Abwesenheit jeder Verbindung bestimmt wurde. Dies wird dann in ein Logit-Format überführt, wobei Logit = ln(% Aktivität/[100%-Aktivität]) war, und als Funktion der log-Konzentration der Verbindung aufgetragen. IC(50)-Werte (d.h. Logit = ln(50/[100 – 50] = 0) wurden nur aus den Korrelationskoeffizienten (r²) von kleiner als –0,985 bestimmt, und wenn eine Inhibition von mehr als 50% aus Duplikatproben erreicht wurde. Das Selektivitätsverhältnis wird dann durch Vergleich der IC(50)-Werte, die für jede Verbindung mit AChE erhalten wurden, mit denjenigen für BChE bestimmt.
Kurze Beschreibung der Figuren
Die 1A, 1B und 1C stellen eine tabellarische Auflistung der chemischen Strukturen von Verbindungen dar, die auf ihre Aktivität getestet wurden, und sie schließen Verbindungen mit erwünschter Selektivität auf BChE gemäß der vorliegenden Erfindung ein.
2 ist ein Immunoplot eines Assays, um die Auswirkung angegebener Verbindungen auf die in vitro Sekretion von βAPP zu bestimmen.
3 ist ein Diagramm, welches zeigt, dass Cymserin CSF (Zerebrospinalflüssigkeit)-βAPP-Gehalte in Ratten reduziert.
4 ist ein Diagramm, welches die Blut/Gehirn-Schranken-Verteilung in einer Ratte im Laufe der Zeit nach der Verabreichung von 1 mg/kg I.V. Cymserin zeigt.
5 ist ein Diagramm, welches erläutert, dass Cymserin die kognitive Leistungsfähigkeit in Ratten verbessert.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die hochselektiven BChE-Inhibitoren, die in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, sind solche Verbindungen in der Tabelle 1, bei denen eine Selektivität für BChE von 15 oder mehr angegeben ist, während ihre Strukturen in den 1A, 1B und 1C bereitgestellt sind (zusammen mit ihrem Selektivitätsverhältnis), die für die Verbindung der Erfindung wiederum eine Selektivität auf BChE von 15 oder mehr ist. Für strukturelle Vergleichszwecke sind andere verwandte Verbindungen auch in der Tabelle 1 und in den 1A, 1B und 1C aufgeführt, die nicht die erwünschte Selektivität auf BChE aufweisen.
Unter den in der Tabelle 1 und der 1 aufgeführten Verbindungen befinden sich bestimmte neue Verbindungen, die Butyrylcholinesterase hemmen. Die neuen Verbindungen der Erfindung sind die Folgenden (die Zahl in Klammern entspricht der Zahl der Verbindung in Tabelle 1): N⁸-Benzylnorcymserin⁽³³⁾, N⁸-Norcymserin⁽³⁷⁾, N¹,N⁸-Bisnorcymserin(41), N¹,N⁸-Bisbenzylnorphysostigmin(42), N¹,N⁸-Bisbenzylnorphenserin(43) und N¹,N⁸-Bisbenzylnorcymserin(45). Diese neuen Verbindungen wurden wie folgt synthetisiert:
(–)-(3aS)-8-Benzyl-1,3a-dimethyl-1,2,3,3a,8,8a-hexahydropyrrolo[2,3-b]indol-5-yl-N-4'-isopropylphenylcarbamat (N⁸-Benzylnorcymserin, Verbindung 33).
(–)-(3aS)-8-Benzyl-1,3a-dimethyl-1,2,3,3a,8,8a-hexahydropyrrolo[2,3-b]indol-5-ol¹ (33 mg, 0,112 mmol) wurde in Ether (2 ml) gelöst, und Na (1 mg) wurde zugegeben. Die Mischung wurde 1 min bei RT gerührt, dann wurde 4-Isopropylphenylisocyanat (18,1 mg, 0,112 mmol) zugegeben. Die Mischung wurde 5 min bei RT gerührt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels wurde der Rückstand chromatographiert (CH₂Cl₂MeOH = 20/1), um 33 (40 mg, 80,0% als Schaum zu ergeben: [α_D] –60,0° (c = 0,2, CHCl₃); ¹H NMR (CDCl₃) δ 7,40–7,08 (m, 9H, Ar-H), 6,80 (d, J = 2,2 Hz, 1H, C4-H), 6,70 (dd, J = 2,2, 8,5 Hz, 1H, C6-H), 6,15 (d, J = 8,5 Hz, 1H, C7-H), 4,45 und 4,35 (AB, J = 16,6 Hz, 2H, Ph-CH₂), 4,25 (s, 1H, C8a-H), 2,80 (m, 1H, Ph-CH<), 2,68 (m, 2H, C1-H₂), 2,32 (s, 3H, N1-CH₃), 1,90 (m, 2H, C2-H₂), 1,35 (s, 3H, C3a-CH₃), 1,15 (d, J = 7,0 Hz, 6H, >CMe₂); EI-MS m/z (relative Intensität): 294 (MH⁺-ArNHCO, 65), 280 (2,2), 265 (3,6), 237 (75), 207 (58), 160 (34), 91 (100) HR-MS m/z, berechnet für: C₂₉H₃₃N₃O₂ 455,2573; gefunden 455,2569.
(–)-(3aS)-1,3a-Dimethyl-1,2,3,3a,8,8a-hexahydropyrrolo[2,3-b]indol-5-yl-N-4'-isopropylphenylcarbamat (N⁸-Norcymerserin, Verbindung 37).
Verbindung 33 (22 mg, 0,048 mmol) wurde in einer Mischung von MeOH (1 ml), H₂O (1 ml) und TFA (0,5 ml) gelöst. Palladiumhydroxid auf Kohlenstoff (5 mg) wurde zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 1 h unter Wasserstoff bei atmosphärischem Druck und RT gerührt, und dann wurde der Katalysator abfiltriert. Das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt, um einen Rückstand zu ergeben, der in H₂O gelöst wurde, durch Na₂CO₃ basisch gemacht wurde, mit Ether extrahiert wurde, dann über Na₂SO₄ getrocknet wurde. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels wurde der Rückstand auf einer präparativen TLC (Silicagel) CH₂Cl₂/MeOH = 10/1) chromatographiert, um Produkt 37 zu ergeben.
(12 mg, 65,7%) in Form eines Gummis: [α_D ²⁰] –73,8° (c = 0,2, CHCl₃); ¹H NMR (CDCl₃) δ 7,30 (d, J = 8,5 Hz, 2H, C2'-H und C6'-H), 7,10 (d, J = 8,5 Hz, 2H, C3'-H und C5'-H), 6,80–6,70 (m, 2H, C4-H und C6-H), 6,50 (d, J = 8,5 Hz, C7-H), 4,65 (s, 1H, C8a-H), 2,85 (m, 2H, C2-H₂), 2,64 (m, 1H, -HC<), 2,48 (s, 3H, N1-CH₃), 2,00–1,90 (m, 2H, C3-H₂), 1,42 (s, 3H, C3a-CH₃), 1,20 (d, J = 7,0 Hz, 6H, >CMe₂);
EI-MS m/z (relative Intensität): 204 (MH⁺-ArNHCO, 99), 189 (25), 174 (8,3), 117 (10). HR-MZ m/z, berechnet für C₂₂H₂₇N₃O₂: 365,2105, gefunden 365,2100.
(–)-(3aS)-1,8-Dibenzyl-3a-methyl-1,2,3,3a,8,8a-hexahydropyrrolo[2,3-b]indol-5-yl-N-4'-isopropylphenylcarbamat (Verbindung 45).
(–)-(3aS)-1,8-Dibenzyl-3a-methyl-1,2,3,3a,8,8a-hexahydropyrrolo[2,3-b]indol-5-ol² (68 mg, 0,18 mmol) wurde in wasserfreiem Ether (2 ml) gelöst, und ein Stück Na-Metall (etwa 1 mg) wurde zugegeben. Die Mischung wurde 1 min bei RT gerührt, dann wurde 4-Isopropylphenylisocyanat (30 mg, 0,18 mmol) zugegeben, und es wurde während einer Zeitspanne von 5 min gerührt. Die Verdampfung des Lösungsmittels ergab ein Rohprodukt 20, das direkt chromatographiert wurde, um 45 (89 mg, 91,3%) als Gummi zu ergeben. [α_D] –44,7° (C = 0,5, CHCl₃); ¹H NMR (CDCl₃) δ 7,29 (d, J = 8,5 Hz, 2H, C2'-H und 6'-H), 7,14 (d, J = 8,5 Hz, 2H, C3'-H und C5'-H), 6,78 (d, J = 2,2 Hz, 1H, C4-H), 6,70 (dd, J = 2,5 Hz, 8,5 Hz, 1H, C6-H), 6,15 (d, J = 8,5 Hz, 1H, C7-H), 4,48 (s, 1H, C8a-H), 4,30–4,15 (AB, J = 16,6 Hz, 2H, Ph-CH₂-N8), 3,73 (s, 2H, Ph-CH₂-N1), 2,80 (m, 1H, -HC<), 2,70 (m, 2H, C2-H₂), 1,90 (m, 2H, C3-H₂), 1,40 (s, 3H, C3a-CH₃), 1,15 (d, J = 7,0 Hz, gH); EI-MS m/z (relative Intensität): 370 (MH⁺-ArNHCO-, 1,0), 294 (90), 279 (10), 237 (8,0), 174 (95), 160 (92), 132 (60), 104 (55), 91 (100), HR-MZ m/z, berechnet für C₃₅H₃₇N₃O₂ 531,2888; gefunden 531,2907.
(–)-(3aS)-3a-Methyl-1,2,3,3a,8,8a-hexahydropyrrolo[2,3-b]indol-5-yl-N-4'-isopropylphenylcarbamat (Verbindung 41).
Verbindung 45 (42 mg, 0,078 mmol) wurde in Isopropanol (1 ml) gelöst, und Pd(OH)₂/C (5 mg) wurde zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde während einer Zeitspanne von 60 h unter Wasserstoff bei atmosphärischem Druck und RT gerührt, dann wurde der Katalysator abfiltriert. Die Verdampfung des Lösungsmittels ergab einen Rückstand, der chromatographiert wurde (CH₂Cl₂/MeOH = 10/1), um die polarste Verbindung, Verbindung 41, (14 mg, 51,0%) in Form eines Gummis zu ergeben. [α_D ²⁰] –71,1° (C = 0,3, CHCl₃); ¹H NMR (CDCl₃) δ 7,29 (d, J = 8,5 Hz, 2H, C2'-H und 6'-H), 7,10 (d, J = 8,5 Hz, 2H, C3'-H und C5'-H), 6,80 (m, 2H, C4-H und C6-H), 6,55 (d, J = 8,5 Hz, C7-H), 5,20 (s, 1H, C8a-H), 2,90 (m, 1H, Ph-CH<), 2,80 (m, 2H, C2-H₂), 2,13 (m, 2H, C3-H₂), 1,45 (s, 3H, C3a-CH₃), 1,18 (d, J = 7,0 Hz, >CMe₂); EI-MS m/z (relative Intensität): 190 (MH⁺-ArNHCO-, 98), 174 (10), 160 (70), 146 (100), 133 (11), 117 (15), 103 (5,0), 91 (14); HR-MS (NH₃) m/z, berechnet für C₂₁H₂₅N₃O₂: 351,1948, gefunden 351,1941.
(–)-(3aS)-1,8-Dibenzyl-3a-methyl-1,2,3,3a,8,8a-hexahydropyrrolo[2,3-b]indol-5-yl-N-methylcarbamat (Verbindung 42).
(–)-(3aS)-1,8-Dibenzyl-3a-methyl-1,2,3,3a,8,8a-hexahydro-5-methoxypyrrolo[2,3-b]indol (47,5 mg, 0,13 mmol) wurde in wasserfreiem Ether (2 ml) gelöst, und ein Stück Na-Metall (etwa 1 mg) wurde zugegeben. Die Mischung wurde 1 min bei RT gerührt, dann wurde Methylisocyanat (14,6 mg, 0,26 mmol) zugegeben, und die Mischung wurde 10 min lang gerührt. Die Verdampfung des Lösungsmittels ergab ein Rohprodukt, das direkt chromatographiert wurde, um 42 (50,0 mg, 90,0%) in Form eines Gummis zu ergeben. [α_D ²⁰] –58,2° (C = 0,7, CHCl₃); ¹H NMR (CDCl₃) δ 7,40–7,20 (m, 10H, Ar-H), 6,75 (d, J = 2,2 Hz, 1H, C4-H), 6,64 (d, J = 8,5 Hz, 1H, C6-H), 6,24 (d, J = 8,5 Hz, 1H, C7-H), 4,65 (s, 1H, N-H), 4,40 (s, 1H, C8a-H), 4,35–4,20 (AB, J = 16,6 Hz, 2H, Ph-CH₂-N8), 3,70 (s, 2H, Ph-CH₂-N1), 2,80 (d, J = 3,9 Hz, 3H, NH-CH₃), 2,70 (m, 2H, C2-H₂), 1,90 (m, 2H, C3-H₂), 1,35 (s, 3H, C3a-CH₃); EI-MS, m/z, (relative Intensität): 370 (MH⁺-CH₃NHCO-, 33), 354 (1,5), 279 (8,5), 264 (3,0), 91 (100); Analyse (C₂₇H₂₉N₃O₃) C, H, N.
(–)-(3aS)-1,8-Dibenzyl-3a-methyl-1,2,3,3a,8,8a-hexahydropyrrrolo[2,2-b]indol-5-yl-N-phenylcarbamat (Verbindung 43).
(–)-(3aS)-1,8-Dibenzyl-3a-methyl-1,2,3,3a,8,8a-hexahydro-5-methoxypyrrolo[2,3-b]indol-5-ol (40,7 mg, 0,11 mmol) wurde in wasserfreiem Ether (2 ml) gelöst, und ein Stück Na-Metall (etwa 1 mg) wurde zugegeben. Die Mischung wurde 1 min bei RT gerührt, dann wurde Phenylisocyanat (13,1 mg, 0,11 mmol) zugegeben und 5 min gerührt. Die Verdampfung des Lösungsmittels ergab ein Rohprodukt, das direkt chromatographiert wurde, um 43 (48 mg, 89,1%) in Form eines Gummis zu ergeben. [α_D ²⁰] –59,1° (C = 0,7, CHCl₃); ¹H NMR (CDCl₃) δ 7,40–6,90 (m, 15H, Ar-H), 6,75 (d, J = 2,5 Hz, 1H, C4-H), 6,73 (d, J = 8,5 Hz, 1H, C6-H), 6,17 (d, J = 8,5 Hz, 1H, C7-H), 4,45 (s, 1H, C8a-H), 4,30–4,20 (AB, J = 16,6 Hz, 2H, Ph-CH₂-N8), 3,72 (s, 2H, Ph-CH₂-N1), 2,70 (m, 2H, C2-H₂), 1,90 (m, 2H, C3-H₂), 1,38 (s, 3H, C3a-CH₃); EI-MS, m/z, (relative Intensität): 370 (MH⁺-PhNHCO-, 31), 354 (1,0), 279 (8,0), 264 (2,0), 91 (100), Analyse (C₂₇H₂₉N₃O₃) C, H, N.
Die Synthese der restlichen Verbindungen, die in der Tabelle 1 aufgeführt sind, ist bekannt und kann in den zitierten Literaturstellen für jede der in der 1 aufgeführten Verbindung gefunden werden.
Zusammenfassung von Tabelle 1: Ausführliche Untersuchungen haben gezeigt, dass während das klassische Anticholinesterasephysostigmin (1) keine Selektivität der hemmenden Wirkung zwischen den zwei Enzym-Untertypen, Acetyl-(AChE) und Butyrylcholinesterase (BChE), aufweist, spezifische Substitutionen in der 4' (para)-Position, (4,5), des (–)-Phenylcarbamats von Physostigmin (2) Verbindungen mit einer Selektivität für die BChE-Inhibition bereitstellen. Dies ist unerwartet, da andere 4'-Substitutionen, (6), oder eine ähnliche Substitution in anderen Positionen, wie an der 2'-(ortho)-Position (3,7) keine Selektivität für BChE bereitstellen. Neuere Untersuchungen haben gezeigt, dass die 3'-Substitution ebenso keine BChE-Selektivität bereitstellt, z.B. hat 3'-Methylcarbamoyleserolin ein IC₅₀ von AChE 27nM und BChE 165nM, tatsächlich stellt eine Substitution in den 2'-, 2',4'-, 3'-, 2',3'-, 3',5'- oder 2',4',6'-Positionen keine BChE-Selektivität bereit. Zusätzliche Untersuchungen haben gezeigt, dass – unabhängig – Substitutionen in der N¹-Position von Physostigmin (1), wie N¹-Norphysostig min (8), N¹-Benzylnorphysostigmin (12), N¹-Phenethylnorphysostigmin (16) und N¹-Allylnorphysostigmin (20) BChE-Selektivität bereitstellen, verglichen mit Physostigmin (1). Dies ist unerwartet, da bei anderen Substitutionen, wie Amine (21), dies nicht der Fall ist. Der Ersatz der N¹-Gruppe von Physostigmin (1), um Thiaphysovenin (22) und Physovenin (26) zu ergeben, stellt unerwarteterweise auch eine Selektivität der hemmenden Wirkung auf BChE bereit. Weitere Untersuchungen haben gezeigt, dass – unabhängig – eine Substitution in der N⁸-Position von Physostigmin (1), um N⁸-Benzylnorphysostigmin (30) und N⁸-Norphysostigmin (34) bereitzustellen, potente und selektive Inhibitoren von BChE erzeugen. Eine Kombination der beschriebenen Modifikationen stellt Verbindungen bereit [11, 15, 16, 19, 25, 29, 33, 37], die eine äußerst hohe Selektivität für die BChE- gegenüber der AChE-Hemmungswirkung aufweisen oder erwartungsgemäß aufweisen werden. Andere brauchbare Verbindungen für den Zweck der Erfindung schließen die Verbindungen [12, 20 und 22] ein.
Zusammensetzungen, die in den Verfahren der Erfindung verwendet werden sollen, schließen Zusammensetzungen ein, in denen der Wirkstoff in einer effektiven Menge enthalten ist, um seinen beabsichtigten Zweck zu erreichen. Die Verbindungen können in irgendeiner pharmazeutisch annehmbaren Menge verabreicht werden, z.B. in Mengen im Bereich von 0,001 g bis etwa 1 g pro Kilogramm Körpergewicht. Basierend auf den hierin dargelegten Informationen kann die Bestimmung effektiver Mengen durch den Fachmann erfolgen. Die Verbindungen werden im Allgemeinen in pharmazeutischen Zusammensetzungen (Gew.-%) verwendet, die den Wirkstoff mit einem Träger oder Vehikel in der Zusammensetzung in einer Menge von etwa 0,1 bis 99 Gew.-% und vorzugsweise von etwa 25–85 Gew.-% enthalten.
Entweder fluide oder feste Einheits-Dosierungsformen können leicht für die orale Verabreichung hergestellt werden. Z.B. können die hochselektiven BChE-Inhibitoren mit konventionellen Inhaltsstoffen, wie Dicalciumphosphat, Magnesiumaluminiumsilicat, Magnesiumstearat, Calciumsulfat, Stärke, Talkum, Lactose, Akaziengummi, Methylcellulose und funktionell ähnlichen Materialien als pharmazeutischen Füllstoffen oder Trägern vermischt werden. Gegebenenfalls kann eine Formulierung mit verzögerte Freisetzung verwendet werden. In älteren oder verwirrten Patienten werden Formulierungen mit verzögerte Freisetzung sogar bevorzugt. Kapsel können formuliert werden, indem man die Verbindung mit einem inerten pharmazeutischen Verdünnungsmittel vermischt und diese Mischung in eine Hartgelatinekapsel einführt, die die richtige Größe hat. Wenn Weichkapseln erwünscht sind, kann eine Aufschlämmung der Verbindung mit einem annehmbaren Pflanzenöl, einem Petroläther oder einem anderen inerten Öl durch Eingeben in eine Gelatinekapsel eingekapselt werden.
Suspensionen, Sirups und Elixiere können für die orale Verabreichung von fluiden Einheits-Dosierungsformen verwendet werden. Ein fluides Präparat, das Öl einschließt, kann für öllösliche Formen verwendet werden. Ein Pflanzenöl, wie Maisöl, Erdnussöl oder ein Blumenöl, z.B. zusammen mit Geschmacksstoffen, Süßstoffen und irgendwelchen Konservierungsmitteln erzeugt ein annehmbares fluides Präparat. Ein Tensid kann Wasser zugefügt werden, um einen Sirup für fluide Dosierungseinheiten zu bilden. Hydroalkoholische pharmazeutische Präparate, die einen annehmbaren Süßstoff, wie Zucker, Saccharin oder einen biologischen Süßstoff, und einen Geschmacksstoff aufweisen, können in Form eines Elixiers verwendet werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen für parenterale Verabreichung und Zäpfchen-Verabreichung können unter Verwendung von Standardtechniken des Standes der Technik auch erhalten werden.
Bevorzugte Anwendungen der Verbindungen gemäß der Erfindung sind als Pharmazeutika für die orale Verabreichung geeignet. Eine andere bevorzugte Anwendung der Verbindungen liegt bei transdermalen parenteralen Formulierungen, die besonders brauchbar sind zur Prävention oder Behandlung von cholinergischen Störungen, wie Alzheimer-Krankheit. Demgemäß sind Zusammensetzungen, die für die Verabreichung in diesen Bereichen geeignet sind, insbesondere in der Erfindung eingeschlossen. Die obigen parenteralen Lösungen oder Suspensionen können transdermal verabreicht werden und mittels eines Hautpflasters abgegeben werden. Falls es erwünscht ist, können sie durch Injektion in einem zweckmäßigen Vehikel wie Sesamöl verabreicht werden.
Demgemäß kann das Einfügen der Wirkstoffe und einer Matrix mit einer langsamen Freisetzung für die transdermale Verabreichung durchgeführt werden. Die Verbindungen können in Mengen von etwa 0,01 bis 99% der Zusammensetzung und vorzugsweise von 25 bis 85 Gew.-% des Wirkstoffs in dem Vehikel oder Träger transdermal verabreicht werden.
Transdermale therapeutische Systeme sind selbständige Dosierungsformen, die, wenn sie auf die intakte Haut aufgetragen sind, dem Systemkreislauf einen Wirkstoff (Wirkstoffe) mit einer gesteuerten Rate abgeben. Vorteile der Verwendung der transdermalen Route schließen die Folgenden ein: verstärkte therapeutische Wirksamkeit, Reduktion der Dosierungshäufigkeit, Reduktion von Nebenwirkungen aufgrund der Optimierung der Blutkonzentration gegenüber dem Zeitprofil, erhöhte Annehmlichkeit für den Patienten aufgrund der Eliminierung von mehrfachen Dosierungszeitplänen, Umleitung des hepatischen "Erstschritt"-Metabolismus, Vermeiden von Magen-Darm-Unverträglichkeiten und Bereitstellen einer vorhersehbaren und ausdehnbaren Aktivitätsdauer. Die Hauptfunktion der Haut besteht jedoch darin, als Sperre gegenüber eintretenden Verbindungen zu wirken. Als Konsequenz wird die transdermale Therapie für eine beschränkte Anzahl von Wirkstoffen bevorzugt, die die erwünschten physiochemischen Eigenschaften für die Diffusion durch die Hautbarriere besitzen. Ein effektives Verfahren zum Überwinden der Sperrfunktion der Haut besteht darin, einen Penetrationsverstärker in der Formulierung des transdermalen therapeutischen Systems einzuschließen.
Der Penetrationsverstärker ist eine chemische Verbindung, die, wenn sie in einer Formulierung eingeschlossen ist, temporär die Permeabilität der Haut für eine Medikamentenlinie erhöht und ermöglicht, dass eine größere Menge des Medikaments in einer kürzeren Zeitspanne absorbiert wird. Über einige unterschiedliche Typen von Penetrationsverstärkern wurde berichtet, wie Dimethylsulfoxid, n-Decylmethylsulfoxid, N,N-Dimethylaceatamid, N,N-Dimethylformamid, 1-Dodecylazacycloheptan-2-on (Azone), Propylenglycol, Ethanol, Pyrrolidone, wie N-Methyl-2-pyrrolidon (NMP) und Tenside.
Die obigen Verbindungen können in dem Reservoir allein oder in Kombination mit pharmazeutischen Trägern vorliegen. Die pharmazeutischen Träger, die für die Zwecke der Erfindung annehmbar sind, sind die in der Technik bekannten Träger, die das Medikament, den Wirt oder das Material, das die Arzneimittel-Abgabevorrichtung umfasst, nicht beeinträchtigen. Geeignete pharmazeutische Träger schließen die Folgenden ein: steriles Wasser, Salzlösung, Dextrose, Dextrose in Wasser oder Salzlösung, Kondensationsprodukte von Rizinusöl und Ethylenoxid, wobei etwa 30 bis 35 mol Ethylenoxid pro mol Rizinusöl kombiniert werden, flüssige Säure, Niederalkanole, Öle wie Maisöl, Erdnussöl, Sesamöl und dergleichen mit Emulgatoren wie Mono- oder Diglyceride einer Fettsäure; oder ein Phosphatid, z.B. Lecithin und dergleichen, Glycole, Polyalkylenglycole, wässrige Medien in Gegenwart eines Suspendiermittels, z.B. Natriumcarboxymethylcellulose, Natriumalginat, Poly(vinylpyrrolidon) und dergleichen, allein oder mit geeigneten Dispergiermitteln, wie Lecithin, Polyoxyethylenstearat und dergleichen. Der Träger kann auch Hilfsstoffe, wie Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Netzmittel, Emulgatoren und dergleichen, zusammen mit Penetrationsverstärkern und den Verbindungen der Erfindung enthalten.
Die effektive Dosis für Säuger kann aufgrund solcher Faktoren wie Alter, Gewicht, Aktivitätspegel oder Zustand der zu behandelnden Versuchsperson variieren. Typischerweise beträgt eine effektive Dosierung einer Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung etwa 1 – 800 mg, wenn sie einmal bis dreimal täglich entweder durch eine orale oder rektale Dosis verabreicht wird. Dies sind etwa 0,002 bis etwa 50 mg pro Kilogramm des Gewichts des Patienten, die pro Tag verabreicht werden. Vorzugsweise werden etwa 10 bis etwa 300 mg einmal bis dreimal täglich für einen erwachsenen Menschen oral oder rektal verabreicht. Die erforderliche Dosis ist beträchtlich geringer, wenn sie parenteral verabreicht wird. Vorzugsweise etwa 0,01 bis etwa 150 mg können intramuskulär oder transdermal einmal oder zweimal täglich einem erwachsenen Menschen verabreicht werden.
Verbindungen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können in Mengen von etwa 0,01 bis etwa 99 Gew.-% der Zusammensetzung und vorzugsweise von etwa 25–85 Gew.-% topisch verabreicht werden. Das Verfahren gemäß der Erfindung umfasst die Verabreichung einer effektiven Menge einer Verbindung gemäß der Erfindung oder einer effektiven Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der Erfindung an einen Säuger, für den eine solche Behandlung notwendig ist.
In der vorliegenden Untersuchung untersuchten wir die Auswirkungen einer chronischen Cymserin-Behandlung (5 Tage) auf die Leistungsfähigkeit von gealterten Fischer-344 (F344)-Ratten (21–22 Monate alt) in einem 14-Einheiten-T-Labyrinth, das als Stone-Labyrinth bezeichnet wird. Die Verwendung des Stone-Labyrinth-Beispiels für diese Untersuchung kann durch zwei frühere Beobachtungen gestützt werden: (1) die bekannte Verwicklung des cholinergischen Systems in die Leistungsfähigkeit, wie durch pharmakologische und Läsions-Untersuchungen gezeigt wurde; und (2) die deutliche altersbezogene Abnahme der Leistungsfähigkeit, die bei verschiedenen Nagerstämmen, einschließlich des Fischer 344 (F344)-Stamms, gezeigt wird. Die Verwendung der F344 Ratte für diese Untersuchung ist auch aufgrund der dokumentierten altersbezogenen Abnahme an cholinergischen Markern in speziellen Gehirnbereichen und der gezeigten Verbesserung der Erinnerungsfähigleit von gealterten Ratten aus diesem Stamm nach verschiedenen cholinergischen Behandlungen gerechtfertigt.
Männliche F344 Ratten im Alter von 21–22 Monaten wurden von Harian-Sprague-Dawley unter Vertrag vom National Institute on Aging erhalten. Sie wurden zu zweit pro Käfig in einem Vivarium im Gerontology Research Center unter speziellen pathogen-freien Bedingungen gehalten, wie zuvor charakterisiert wurde.
Wie oben beschrieben wurde, ist das Stone-Labyrinth aus lichtdurchlässigem Kunststoff mit einem Gitterboden aufgebaut, der für schnell abschaltende Fußschläge verdrahtet ist, und von grauen Wänden umgeben, um die Verfügbarkeit von zusätzlichen Labyrinth-Hinweisen zu reduzieren. Die einzige andere Apparatur war eine gerade Laufbahn (2 m), die zum Vortraining verwendet wurde. Ähnlich dem Labyrinth bestand die Laufbahn auch aus lichtdurchlässigem Kunststoff und enthielt einen Gitterboden, der für schnell abschaltende Fußschläge verdrahtet ist, und sie war von grauen Wänden umgeben.
Beginnend am Tag 1 erhielten die Ratten eine einzige tägliche i.p. Injektion von entweder 0,9% NaCl als Salz-Kontrollgruppe oder Cymserintartrat, gelöst in Salzlösung, die in Dosierungen von 0,5 und 1,0 mg/kg verabreicht wurde und an den Tagen 2 bis 5 fortgesetzt wurde. An den Tagen 3 bis 5 wurden Injektionen 30 min vor dem Testen des Verhaltens verabreicht.
Beginnend am Tag 2 wurden Ratten einem Training im aktivem Einwege-Vermeiden in der geraden Laufbahn unterzogen. Bei jedem Versuch musste sich die Ratte von der Startbox zur Zielbox in 10 Sekunden bewegen, um den Beginn des Fußsschlags (0,8 mA) zu vermeiden. Ratten erhielten 10 Versuche am Tag 2 und 10 Versuche am Tag 3. Das Training war beendet, sobald die Ratte ein Leistungsfähigkeitskriterium von 8 Vermeidungen in 10 fortlaufenden Versuchen innerhalb eines Maximums von 30 Versuchen erfüllte. Nur Ratten, die dieses Kriterium erfüllen, wurden im Stone-Labyrinth am nächsten Tag getestet.
Ratten erhielten ein Training im Stone-Labyrinth, das als eine 4-Versuchssitzung während des Morgens und Nachmittags an den Tagen 4 und 5 festgelegt wurde. Während jedes Versuchs musste die Ratte sich von einer Startbox zu einer Zielbox durch fünf Labyrinth-Segmente bewegen, die jeweils durch Guillotine-Türen getrennt waren. Die Verstärkungsbedingung erforderte, dass die Ratte jedes Segment innerhalb von 10 Sekunden überwand, um den Beginn eines milden Fußschlags (0,8 mA) zu vermeiden, der beendet wurde, wenn das Tier sich durch die Tür in das nächste Segment bewegte. Nach dem Eintreten in die nachfolgenden Segmente wurde die Tür vom vorhergehenden Segment geschlossen, um ein Zurücklaufen zu vermeiden. Aufgezeichnet als Abweichungen vom korrekten Weg, waren Fehler die primäre abhängige Variable und sie wurden automatisch durch eine Reihe von Infrarotsensoren gezählt, die mit einem Mikroprozessor verbunden sind. Die Laufzeit von der Startbox zum Ziel wurde auch automatisch aufgezeichnet. Die Frequenz und Dauer des Fußschlags wurden mit einer mechanisch betriebenen Uhr aufgezeichnet.
Während des Vortrainings wurden keine Effekte der Medikamenten-Behandlung beobachtet. Die mittleren (s.e.m.) Vermeidungen waren bei allen Ratten 67% (1,7), 65% (2,8), 63% (3,8) und 61% (3,9) für die Kontrolle und die Cymserin-Gruppen mit 1, 2 bzw. 3 mg/kg. Eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) ergab keinen signifikanten Gruppenunterschied bezüglich dieses Paramaters, F(3,40) < 1,0.
Eine Cymserin-Behandlung reduzierte signifikant die Anzahl der Fehler, die in dem Stone-Labryrinth gemacht wurden, verglichen mit der Kontrollbedingung (5). Dieser Effekt war während der letzten Trainigsblöcke am stärksten ausgeprägt und schien für die 3 mg/kg-Dosis am wenigsten effizient zu sein. Eine statistische Bestätigung wurde in den Ergebnissen einer vier (Medikamentengruppe) mal vier (Versuchsblock)-ANOVA unter wiederholtem Messen des letzten Faktors bereitgestellt. Die Ergebnisse ergaben einen signifikanten Haupteffekt von Gruppe, F(3,42) = 3,41, p = 0,03, einen signifikanten Haupteffekt von Versuchsblock, F(3,126) = 151,6, p < 0,0001, aber die Gruppe-mal-Gruppe-Wechselwirkung erreichte keine statistische Signifikanz F(9, 126) = 1,55, p = 0,13. So wurden einzelne Fehlervergleiche in allen Versuchen gemacht. Nur die Gruppen mit 1 und 2 mg/kg wiesen eine signifikant verbesserte Leistungsfähigkeit auf, verglichen mit den Kontrollen.
Andere Variable der Leistungsfähigkeit (Laufzeit, Schlagfrequenz und Dauer) waren bei Cymserin-behandelten Ratten auch auf ein weniger konsistentes Maß reduziert als für Fehler beobachtet wurde. Die Daten für jede Variable wurden zuerst in einem vier (Medikamentengruppe) mal vier (Blöcke)-ANOVA unter wiederholtem Messen des letzten Blocks analysiert. Es ergab sich kein signifikanter Haupteffekt von Medikamenten aus diesen Analysen, jedoch war die Medikament × Block-Wechselwirkung in jeder derselben signifikant (p < 0,005). Somit wurden weiterhin die Daten unter Verwendung von t-Test-Vergleichen mit den Kontrollgruppen in jedem Block analysiert. Ratten, die mit 1,0 mg Cymserin/kg behandelt wurden, wiesen, verglichen mit den Kontrollen, eine signifikant reduzierte Laufzeit, Schlagfrequenz und Dauer an den Blöcken 3 und 4 auf. In der 2,0 mg/kg-Gruppe waren diese Leistungsfähigkeitsparameter an Block 4 signifikant reduziert. Die 3,0 mg/kg-Gruppe war nur bezüglich der Schlagdauer am Block 4 von den Kontrollen signifikant verschieden. Die Schlagdauer am Block 2 in der 1,0 mg/kg-Gruppe war auch signifikant reduziert. Zusammengefasst: Diese Leistungsfähigkeitsvariablen wurden nur während der letzten Versuche und am stärksten ausgeprägt in der 1,0 mg/kg-Gruppe signifikant beeinflusst. Einige motorische Nebenwirkungen, wie feinschlägiger Tremor, wurden in einigen Ratten nachgewiesen, die mit der 3 mg/kg-Dosis behandelt wurden, ansonsten wurden keine Nebenwirkungen bei mit Cymserin behandelten Ratten festgestellt.
Chronische Behandlung mit Cymserin verbesserten deutlich die Lernfähigkeit von gealterten Ratten im Stone-Labyrinth. Ratten, die Dosierungen von 1–2 mg/kg Cymserin erhielten, wiesen signifikant reduzierte Fehler auf sowie eine Verbesserung anderer Leistungsfähigkeitsvariabler während der letzten paar Versuche; diese Reaktion war wahrscheinlich auf die verstärkte cholinergische Neurotransmission durch die Wirkung dieses potenten langwirkenden Cholinesterase-Inhibitors zurückzuführen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf den Befund, dass hochselektive BChE-Inhibitoren zur Reduktion der β-Amyloid-Vorläuferprotein-Synthese und -Sekretion verwendet werden können. Die Alzheimer-Krankheit ist durch Abscheidungen von Amyloid-β-Peptid (Aβ) in Form von zerebrovaskulären Amyloid- und extrazellulären senilen Plaques gekennzeichnet. Der primäre Kern-Bestandteil von senilen Plaques ist Aβ-Peptid, ein selbst-aggregierendes Protein mit 39 bis 43 Resten, das sich von einer Gruppe größerer glykolisierter Transmembranproteine, β-APPs, von 695 bis 770 Aminosäuren, ableitet. β-APP ist die Quelle der toxischen Aβ-Peptide, die dafür bekannt sind, dass sie sich im Gehirn von AD-Patienten abscheiden. Mutationen des APP-Gens co-segregieren mit AD in bestimmten Familien, die β-APP695 bis β-APP770 implizieren, von denen einige die aktive Kunitz-Familie der Serinprotease-Inhibitor (KPI)-Domäne sowie Aβ und andere amyloidogene Fragmente von β-APP zentral in dem Krankheitsprozess enthalten (Selkoe, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53:438–447, 1994). β-APP wird durch alternative proteolytische Stoffwechselwege verarbeitet/metabolisiert, um unterschiedliche Abbauprodukte zu erzeugen. Diese schließen einen sekretorischen und einen lysosomalen/endosomalen Stoffwechselweg ein. In den sekretorischen Stoffwechselweg sind drei unterschiedliche Sekretasen verwickelt. Beim Menschen, nicht aber bei der Ratte, wird der Hauptteil von β-APP innerhalb des Aβ-Bereichs durch α-Sekretase gespalten, um nicht-amyloidogene, lösliches β-APP, sAPP, zu erzeugen, das bekanntermaßen eine Anzahl von wertvollen physiologischen Funktionen ausübt. Eine postulierte alternative Sekretase-Spaltung, γ-Sekretase, erzeugt ein verkürztes sAPPγ, das eine potentiell amyloidogene Sequenz enthält. Dies ist die bevorzugte Form, die in der Ratte gebildet wird, und eine weitere Spaltung im Menschen durch eine postulierte β-Sekretase erzeugt das Neurotoxin Aβ (Checler, J. Neurochem., 65:1431–1444, 1995).
Die Synthese, Verarbeitung und Sekretion von β-APP und seiner Derivate erfolgen in vivo im Gehirn, wobei die Produkte im Gehirn und CSF sowohl in menschlichen als auch tierischen Modellen nachweisbar sind, und zusätzlich dazu erfolgt sie in vitro in einer Gewebekultur, wobei die Produkte in dem konditionierten Medium von Zellkulturen und in den Zelllysaten nachweisbar sind. Faktoren, die Abscheidungen von Aβ regeln, sind für das Verständnis der zerebrovaskulären Änderungen bei AD von zentraler Bedeutung (Roberson & Harrell, Brain Res. Rev. 25:50–69, 1997). Diese Krankheit ist auch gekennzeichnet durch den dramatischen Verlust von cholinergischen Neuronen, die zum Cortex vorpsringen, und neurochemisch durch eine Reduktion an presynaptischen (Cholinacetyl-Transferase, ChAT)- Markern des cholinergischen Systems, insbesondere in den Bereichen des Gehirns, die mit der Erinnerung und dem Lernen verbunden sind (Perry et al., 1978, ebenda). Dies ist eine klare Beziehung zwischen dem Verlust an cholinergischer Übertragung zum Cortex und Hippocampus und der Synthese und Verarbeitung von β-APP (Wallace et al., PNAS, 88:8712–8716, 1993). Die cholinergischen Defizite bei AD wurden in der Ratte durch neurotoxische Läsionen im basalen Vorderhirn modelliert, wobei die gebräuchlichste die vom Nucleus basalis von Meynert (nbM) ist (Olton und Wenk in Psychopharmacology: The Third Generation of Progress (Herausg. Meltzer), Raven Press, NY, S. 941–954, 1987). Solche Läsionen in der Ratte, wie AD im Menschen, führen zu einem erschöpften cholinergischen System im Cortex von Tieren und zu kognitiven Störungen mit Merkmalen, die bei AD üblich sind (Kesner et al., Behav. Neurosci., 101:451–456, 1987). Weiterhin erhöhen cholinergische Vorderhirn-Läsionen signifikant die Pegel an β-APP m RNA im Cortex und an sezerniertem β-APP, das die volle Länge von Aβ enthält, im CSF von Ratten (Wallace et al., Mol. Brain Res. 10:173–178, 1991).
In einem Bericht von Lahiri et al. (ANN. N.Y., Acad. Science, 828:416–421, 1997) wurde die Möglichkeit untersucht, dass die Verarbeitung von βAPP durch unterschiedliche Cholinesterase-Inhibitoren gesteuert werden kann. Die Wirkstoffe, die zur Bestimmung der Auswirkungen von Cholinesterase-Inhibitoren auf die Sekretion von Formen sezerniertem βAPP aus einer Anzahl von Zelllinien untersucht wurden, d.h. Glioblastoma, HeLa, Neuroblastoma und PCl2, schlossen 3,4-Diaminopyridin, Metrifonat, Physostigmin (Verbindung 1, Tabelle 1) und Tacrin ein. Die beobachteten Ergebnisse führten zu der Feststellung, dass die Behandlung neuronaler Zellen mit Tacrin die Sekretion von βAPP steuert und sie reduziert, während keiner der anderen Wirkstoffe, alle klassischen Anticholinesterasen, eine Änderung einer solchen Sekretion erzeugte. Es wurde darauf hingewiesen, dass irgendeine Aktivität, die von diesen anderen Mitteln aufgezeigt wird, von ihrer Anticholinesterase-Aktivität unabhängig sein kann. Keine der Verbindungen, die in diesen Untersuchungen verwendet wurden, war ein hochselektiver BChE-Inhibitor.
In weiteren Untersuchungen wurden die Wirkungen von selektiven AChE (Verbindungen 2, 3 (Phenserin und Tolserin) (Tabelle 1) und BChE (Verbindung 4 (Cymserin) (Tabelle 1)-Inhibitoren gegenüber menschlichen Neuroplastome-Zelllinien untersucht. Sowohl sezernierte Gehalte, die in dem konditionierten Medium gemessen wurden, als auch zelluläre Gehalte an βAPP, die in den Zelllysaten gemessen wurden, wurden beurteilt und mit Gehalten verglichen, die in unbehandelten Zellen erreicht wurden. Cymserin reduziert zelluläre Gehalte an βAPP äußerst stark, was auf eine reduzierte Synthese und auch reduzierte sezernierte βAPP-Gehalte hinweist (2).
Eine Methodik, die verwendet werden kann, um die Fähigkeit einer ausgewählten Verbindung zur Steuerung von zellulären und sezernierten βAPP-Gehalten zu bestimmen, ist die Folgende:
1 – 1,5 × 10⁷ jeder Zelltype (neuronal und nicht neuronal) werden in ihrem entsprechenden Medium kultiviert. Vor der Zugabe des Wirkstoffs werden den Zellen Medien zugefügt, die nur 0,5% FBS (Serummangel) enthalten. Die Zellen werden dann entweder in Abwesenheit oder Gegenwart der Testverbindung inkubiert. Nach den Inkubationsperioden von 12 bis 48 Stunden wird das konditionierte Medium von jeder Platte gesammelt, und sowohl dasselbe als auch die Zellen werden 10 Minuten lang mit 800 g zentrifugiert. Das konditionierte Medium wird gesammelt, und die Zellen werden in einem Puffer lysiert, der 50 mM Tris-HCl (ph 8,0), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 2 mM PMSF, 0,5% Natriumdesoxycholat, jeweils 1 μl/ml Aprotonin, Leupetin und TLCK und 0,1 μg/ml Peptstatin A enthält. Die Zellen werden 10 min lang mit 11 000 g bei 4°C zentrifugiert. Proteine der überstehenden Lösung (Zelllysat) werden durch die Farbstoff-Bindungs methode von Bradford gemessen (Bradford, Anal. Biochem. 72:248–254, 1976).
Bezüglich der Polyacrylamidgel-Elektrophorese und des Immun-Blotting: In Kontrollversuchen wurde eine äquivalente Konzentration an Ethanol als Vehikel verwendet, die weniger als 1% im Medium darstellt. Verbindungs-Dosierungen von etwa 0,15 mM bis 0,5 mM können verwendet werden. 100 μl konditioniertes Medium oder 30 μg Protein aus dem gesamten Zelllysat werden auf 12% Polyacrylamidgel abgetrennt, das SDS (SDS-PAGE) enthält. Eine Immunoblot-Analyse wurde unter Verwendung des avidinbiotinylierten Komplex-Nachweis-Kits von Vector Laboratories durchgeführt, wie von Lahiri et al., J. Neurosci. Res. 12:777–787 (1994) beschrieben wird. Das verwendete Antiserum stammt von dem mAb22C11-Klon (Boehringer Mannheim), der alle reifen Formen von βAPP erkennt, die in Zellmembranen gefunden werden, sowie die Carboxyl-verkürzten, löslichen Formen, die in die konditionierten Medien und das APP-ähnliche Protein sezerniert werden. Zusätzlich dazu wird das mAb6E10 verwendet, das die Reste 1 bis 28 von Aβ erkennt. Um zu gewährleisten, dass Wirkstoffeffekte auf βAPP selektiv sind, und sich nicht unselektiv auf alle Proteine auswirken, kann ein Antikörper, der gegen menschliches Protease-Nexin II (PN-II) erzeugt wurde, und Anti-HSP-70 (ein Antikörper, der gegen das Hitzeschock-Protein-70, HSP-70, erzeugt wurde), verwendet werden. Biotinylierte sekundäre Antikörper, Pferde-Antimaus und Ziege-Antikaninchen (Boehringer Mannheim und Vector Labs) können auch verwendet werden. Die obige Assay-Methode wird verwendet, um festzustellen, welche der hochselektiven BChE-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung die Fähigkeit zur Steuerung der Synthese und Sekretion von sezernierten und zellulären Formen von βAPP aufweisen. Wie in 2 gezeigt wird, kann Cymserin βAPP-Gehalte äußerst stark reduzieren und tut dies, wenn es sowohl durch mAb 22C11 als auch 6E 10 gegenüber βAPP bewertet wird, ohne dass andere sekretorische Proteine wie HSP-70 beeinflusst werden.
Cymserin, ein Vertreter von selektiven BChE-Inhibitoren, verändert zusätzlich dazu die βAPP-Synthese/Verarbeitung in vivo. In Ratten mit Läsionen des cholinergischen Vorderhirns (Nucleus basalis von Meynert) werden βAPP-Gehalte sofort und äußerst stark im CSF erhöht (3, Kontrollgruppe mit Läsion gegenüber Kontrolle-Nachahmung), und zwar als Konsequenz eines erschöpften presynaptischen cholinergischen Systems, das AD modelliert, und reduzierter cholinergischer Projektionen zu höheren Gehirnzentren im Cortex und Hippocampus, wie zuvor gezeigt wurde (Wallace et al., 1993 & 1995 wie oben). Untersuchungen haben gezeigt, das im Unterschied zum Menschen, sezerniertes βAPP die volle Länge von Aβ enthält, aber nicht durch Sekretase-Wirkung in Ratten gespalten wird, um toxisches Aβ-Peptid zu erzeugen (Wallace et al., J. Neurosci. 15:4896–4905, 1995), und somit ist AD für den Menschen einzigartig. Daher bildet in Ratten die Erhöhung von βAPP, das die volle Länge von Aβ-Peptid enthält, eine erhöhte Produktion von Aβ im Menschen nach.
Die Verabreichung von Cymserin an Ratten mit cholinergischen Vorderhirnläsionen blockiert die Erhöhung von sezerniertem βAPP (3). Dies stimmt mit der in vitro Auswirkung von Cymserin auf βAPP überein und zeigt zusätzlich dazu, dass systemisch verabreichtes Cymserin, das über den intraperitonealen Weg 7 Tage lang zweimal täglich verabreicht wurde, leicht die Blut-Gehirn-Schranke passieren kann und in das Gehirn eintreten kann. Tatsächlich, wie in 4 gezeigt wird, tritt Cymserin leicht ein und wird im Gehirn in Mengen, die mehrere 40-fach höher sind als solche im Plasma, nach ihrer systemischen Verabreichung (1 mg/kg über den intravenösen Weg) gehalten. Zusätzlich dazu, wie in 3 gezeigt wird, reduzierte Cymserin die βAPP-Gehalte in Tieren ohne cholinergische Läsionen, d.h. in Cymserin allein gegenüber reinen Kontrollratten.
Eine Methodik, die verwendet werden kann, um die Fähigkeit einer ausgewählten Verbindung zu bestimmen, sezernierte βAPP-Gehalte in vivo zu steuern, ist wie folgt:
Für cholinergische Vorderhirnsystem-Läsionen erhalten Ratten eine einseitige subcortikale Läsion des Nucleus basalis von Meynert (nbM) durch Verwendung von N-Methyl-D-aspartat (NMDA) als Exzitotoxin. Bei dieser Durchführung werden Ratten betäubt und in eine stereotaxische Apparatur gegeben, wobei die obere Schneidezahn-Leiste mit der intra-auralen Linie nivelliert wurde. Eine Infusionskanüle vom Kaliber 33 wird in zwei Stellen innerhalb des nbM auf einer Seite des Gehirns herabgesenkt (AP Bregma, ML –2,8 mm, DV –8,0 mm re: Schädel und AP Bregma –0,8 mm, ML –3,0 mm bzw. DV –7,8 mm). Ein μl einer Lösung von 50 mM NMDA in PBS-Puffer (physiologischer pH) wird langsam in jede Stelle einfließen gelassen. Kontrollen für die Läsion sind das Vehikel allein und die kontralaterale Seite von NMDA-behandelten Tieren.
Das Sammeln von CSF für die Analyse von βAPP-Gehalten erfolgt durch Entnahme eines Aliquots aus dem Zisternenmagna von Ratten unmittelbar nach ihrem Tod. Eine Quantifizierung von βAPP erfolgt durch Immunoblot-Analyse unter Verwendung von mAb 22C11.
Die Bestimmung der zeitabhängigen Gehirn- und Plasma-Kinetik von Cymserin in den Ratten erfolgt durch Verabreichung der Verbindung in die Rosenvene von betäubten Tieren. Tiere wurden durch einen Überschuss an Betäubungsmittel zu speziellen Zeitpunkten getötet, und Blut- und Gehirnproben wurden sofort entnommen. Das Blut wird zentrifugiert (10 000 g, 2 min), Plasma wird gesammelt und zusammen mit der Probe des Gehirns bei –80°C aufbewahrt. Eine Quantifizierung der Konzentrationen an Cymserin erfolgt durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die hochselektiven BChE-Inhibitoren durch Einführen einer fluoreszierenden Markierungssubstanz modifiziert werden, und das sich ergebende markierte Reagens kann zum histochemischen Nachweis von Läsionen oder pathologischen Zuständen, die mit Alzheimer-Krankheit und anderen Demenzen verbunden sind, auf seziertem Gehirngewebe verwendet werden. Jede in der Technik bekannte, geeignete fluoreszierende Markierungssubstanz kann verwendet werden, wie z.B. Fluorescein. Das markierte Derivat des hochselektiven BChE-Inhibitors kann auf eine Weise hergestellt werden, die an sich bekannt ist, wie z.B. durch Umsetzung eines solchen Inhibitors mit 5-[4,6-Dichlortriazen-2-yl-amino]fluorescein, und das Reaktionsprodukt kann durch Verfahren gereinigt werden, die in der Technik an sich bekannt sind, wie z.B. Dünnschichtchromatographie.
Derivate des hochselektiven BChE-Inhibitors, die zur Durchführung von Gehirn-Scans verwendet werden können, insbesondere Positronemissionstomographie und Einzelphotonemissionstomographie, schließen die Folgenden ein: Verbindungen in der Tabelle 1 und Analoga derselben mit zweckmäßigen Resten, um ihnen entweder Fluoreszenz oder einen Nachweis für in vitro oder in vivo Bilderzeugung/Quantifizierung zu verleihen.
Somit können die folgenden radiopharmazeutischen Reagenzien mit zweckmäßiger Modifizierung – falls dies notwendig ist – unter Verwendung von in der Technik wohlbekannten Verfahren an irgendeinen der hochselektiven BChE-Inhibitoren gebunden werden: Thallium, Technetium, ¹³¹Iod oder ¹²³Iod, ¹³³Xenon, ⁴⁸¹Krypton, ⁶⁷Gallium, ¹¹¹Indium, ¹¹Kohlenstoff, ¹³Stickstoff und ¹⁸Fluor. Diese Isotope können z.B. als kalte Kits eingeführt werden und mit geeigneten Chemikalien wiederhergestellt werden. Die wiederhergestellten Verbindungen werden nach der Verabreichung an den Patienten im Körper verteilt, und zwar gemäß den physikalischen und chemischen Eigenschaften der speziellen Reagenzien sowie gemäß dem Rest, an den die radioaktive Markierung gebunden wird.
Diese Agenzien können für die Diagnose im Gehirn sowie der systemischen peripheren Bereiche des Körpers verwendet werden; ein Beispiel schließt die Abscheidung von peripherem Amyloid in der Milz sowie im Gehirn bei der Alzheimer-Krankheit ein. Das Anheften dieser radioaktiven Reagenzien unter Verwendung von in der Technik wohlbekannten Verfahren an Trägermoleküle, die die Blut-Gehirn-Schranke passieren, z.B. Cymserin, kann spezifische Diagnosemittel für die Neuropathologie erzeugen.
Ein Beispiel ist die Verwendung von Technetiumpertechnat, das zur Gehirn-Abbildung verwendet wird. Dieses Agens, kombiniert mit den hochselektiven Butyrylcholinesterase-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung, wird in bestimmten Bereichen des Gehirns lokalisiert, wie im Adergeflecht des Gehirns.
Der optimale Typ von Radiopharmazeutikum weist den größten Teil seiner Energie in Form von γ-Strahlung auf. Die Diagnosegerätschaft, die in der Nuklearmedizin verwendet wird, hat bestimmte optimale Nachweis-Energiepegel. Die meisten der radioaktiven Materialien, die in der Nuklearmedizin verwendet werden, werden durch Umwandlung stabiler Elemente in radioaktive Formen hergestellt. Die Umwandlung wird durch Kernreaktoren oder Cyclotrone durchgeführt, die die stabilen Elemente mit Protonen oder Neutronen bombardieren.
Fortschritte bei den filmlosen Detektoren ergeben Informationen über die Anzahl der Protonen, die auf ein empfindliches Element aufprallen. Diese Daten, kombiniert mit der Verwendung von Datenverarbeitungs-Algorithmen haben die Stärke der medizinischen Bilderzeugung erhöht. Die diagnostischen Bilderzeugungsvorrichtungen schließen die Folgenden ein: Computertomographie (CT), Positronemissionstomographie (PET), Einzelphotonemissioncomputertomographie (SPC), Digitale Substraktionsangiographie (DSA), angiographische Bilderzeugung mit Synchotronstrahlung und Bilderzeugung durch magnetische Resonanz (MRI).
Die hauptsächlichen Isotope, die zur Bilderzeugung verwendet werden, sind ¹¹Kohlenstoff, ¹⁵Sauerstoff, ¹³Stickstoff. Diese Reagenzien sind neutronenarme Positron-emittierende Isotope. Sie werden durch ein Cyclotron hergestellt und schnell in die Verbindungen der vorliegenden Erfindung eingefügt.
Somit sind eine Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung Verbindungen, die eine hochselektive Butyrylcholinesterase-hemmende Aktivität aufweisen, die durch Einfügen eines radiopharmazeutischen Reagenzes hergestellt werden, wodurch ein Reagens bereitgestellt wird, das zur Bilderzeugung in einem Patienten geeignet ist, um das Vorliegen von Läsionen oder pathologischen Zuständen nachzuweisen, die mit der Alzheimer-Krankheit verbunden sind. Solche Reagenzien können durch in der Technik bekannte sympathetische Wege eingeführt werden. So kann z.B. der Carbamoyl-Rest der hochselektiven Butyrylcholinesterase-Inhibitoren als ein α-Kohlenstoff¹¹-Rest unter Verwendung der allgemeinen Arbeitsweisen bereitgestellt werden, die von Bonnot, J., Label Corp. Radiopharm., 33 [4], 277–284 (1993) verwendet werden. Die sich ergebenden Verbindungen können dem Patienten parenteral verabreicht werden und gelangen zum Gehirn, wo sie sich selektiv an irgendwelche Läsionen oder pathologische Zustände binden und durch geeignete Bilderzeugungsgerätschaften, wie ein PET-Scan, nachgewiesen werden können.
Literaturstellen

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2. Brzostowska, M.; He, X.S.; Greig, N.H.; Rapoport, S.I.; Brossi, A. Phenylcarbamates of (–)-Eseroline, (–)-N¹ Noreseroline and (–)-Physovenol: Selective Inhibitors of Acetyl and, or Butylcholinesterase. Med. Chem. Res. 1992, 2, 238–248.
3. Yu, Q.S.; Atack. J.R.; Rapoport, S.I.; and Brossi, A. Synthesis and Anticholinesterase Activity of (–)-Physostigmine, (–)-Eseramine, and Other N(–)-Substituted Analogues of (–)-Physostigmine. J. Med. Chem. 1997, 31, 2297–2300.
4. He, X.S,; Greig, N.H.; Rapoport, S.I.; Brossi, A. and Li, Y.Q. and Yu, Q.S. Thiaphysovenine and Carbamate Analogues: A Hew Class of Potent Inhibitors of Cholinesterases. Med. Chem. Res. 1992, 2, 229–237.
5. Yu, S.Q.; Liu, C.; Brzostowska, M.; Chrisey, L.; Brossi, A.; Greig, N.H.; Atack, J.R.; Soncrant, T.T.; Rapoport, S.I. and Radunz H.E. Physovenines: Efficient Synthesis of (–)- and (+)-Physovenine and Synthesis of Carbamate Analogues of (–)Physovenine. Anticholinesterase Activity and Analgesic Properties of Optically Active Physovenines. Hei. Cim. Acta 1991, 74, 781–788.
6. Yu, Q.S.; Pei, X.F.; Holloway, H.W.; Greig, N.H.; Brossi, A. Total Syntheses and Anticholinesterase Activitiesof(3aS)-N(8)-Norphysostigmine, (3aS)-N(8)-Norphenserine, Their Antipodal Isomers, and Other N(8)-Substituted Analogues. J. Med. Chem. 1997, 40, 2895–2901.
7. Yu, Q.S.; Holloway, H.W, Greig, N.H. and Brossi, A. Syntheses and Anticholinesterase Activities of (3aS)-N(1), N(8)-Norphysostigmine, (3aS)-N(1), N(8)Norphenserine, Their Antipodal Isomers, and Other Potential Metabolites of Phenserine. J. Med. Chem. 1997, 40, 2895–2901.
8. Atack, J.R.; Yu, Q.S.; Soncrant, T.T.; Brossi, A. and Rapoport, S.I. Comparative Inhibitory Effects of Various Physostigmine Analogs Against Acetyl- and Butylcholinesterases. J. Pharmacology and Experimental Therapeutics 1989, 248, 194–202.

Claims

Verwendung eines Butyrylcholinesterase-Inhibitors zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Prävention oder Behandlung von kognitiven Störungen, die mit dem Altern oder mit Alzheimer-Krankheit verbunden sind, umfassend das Behandeln eines Patienten, bei dem die Gefahr einer solchen kognitiven Störung besteht oder der eine solche aufweist, mit einer effektiven Menge eines Butyrylcholinesterase-Inhibitors, wobei der Butyrylcholinesterase-Inhibitor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus N⁸-Benzylnorcymserin, N⁸-Norcymserin, N¹,N⁸-Bisnorcymserin, N¹,N⁸-Bisbenzylnorcymserin und ihren pharmazeutisch annehmbaren Salzen besteht.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei der Butyrylcholinesterase-Inhibitor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus N¹,N⁸-Bisbenzylnorcymserin und seinen pharmazeutisch annehmbaren Salzen besteht.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei der Butyrylcholinesterase-Inhibitor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus N¹,N⁸-Bisnorcymserin und seinen pharmazeutisch annehmbaren Salzen besteht.
Verbindung mit der Formel von N⁸-Benzylnorcymserin oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Verbindung mit der Formel von N⁸-Norcymserin oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Verbindung mit der Formel von N¹,N⁸-Bisnorcymserin oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Verbindung mit der Formel von N¹,N⁸-Bisbenzylnorcymserin oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 4 bis 7 umfasst.
Verwendung eines Butyrylcholinesterase-Inhibitors zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei einem Verfahren zur Senkung der Sekretion und Synthese von beta-Amyloid-Vorläuferprotein aus Zelllinien oder Geweben neuronalen Ursprungs, wobei das Verfahren das Verabreichen einer effektiven Menge eines Butyrylcholinesterase-Inhibitors an die Zelllinie oder das Gewebe neuronalen Ursprungs umfasst, wobei der Butyrylcholinesterase-Inhibitor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus N⁸-Benzylnorcymserin, N⁸-Norcymserin, N¹,N⁸-Bisbenzylnorcymserin, N¹,N⁸-Bisnorcymserin und ihren pharmazeutisch annehmbaren Salzen besteht.
Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei der Butyrylcholinesterase-Inhibitor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus N¹,N⁸-Bisnorcymserin und seinen pharmazeutisch annehmbaren Salzen besteht.