DE69830177T2

DE69830177T2 - Latent-reaktive polymere mit biologisch aktiven gruppen

Info

Publication number: DE69830177T2
Application number: DE69830177T
Authority: DE
Inventors: L. David CLAPPER; J. Melvin SWANSON; Sheau-Ping Hu; A. Richard AMOS; P. Terrence EVERSON
Original assignee: Surmodics Inc
Current assignee: Surmodics Inc
Priority date: 1997-08-15
Filing date: 1998-08-11
Publication date: 2006-02-23
Anticipated expiration: 2018-08-12
Also published as: EP1577670A3; EP2148201A1; JP5175383B2; JP2003532434A; AU734759B2; EP1577670A2; CA2300176C; JP2012063361A; DE69830177D1; WO1999008717A3; AU9197398A; US6121027A; EP1003561A2; JP5175013B2; EP1003561B1; US20030181423A1; US6514734B1; EP2148201B1; CA2300176A1; EP1577670B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
In einem Aspekt betrifft diese Erfindung Reagentien, die verwendet werden können, um Biomaterialoberflächen zu modifizieren oder neue Biomaterialien herzustellen. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Biomaterialien mit Oberflächen, die hergestellt oder modifiziert worden sind, um gewünschte bioaktive Funktionen bereitzustellen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Biomaterialien sind seit langem verwendet worden, um biomedizinische Vorrichtungen zur Verwendung in sowohl in-vitro- als auch in-vivo-Anwendungen herzustellen. Eine Vielzahl von Biomaterialien kann für die Herstellung solcher Vorrichtungen verwendet werden, einschließlich Keramikwerkstoffen, Metallen, Polymeren und Kombinationen derselben. Historisch gesehen wurden solche Biomaterialien als geeignet zur Verwendung bei der Herstellung biomedizinischer Vorrichtungen angesehen, wenn sie eine geeignete Kombination solcher grundlegenden Eigenschaften bereitstellten wie Inertheit, geringe Toxizität und die Fähigkeit, zu gewünschten Vorrichtungen hergestellt zu werden. (Hanker, J. S. und B. L. Giammara, Science 242: 885–892, 1988).
Als das Ergebnis jüngerer Fortschritte können Vorrichtungen nunmehr mit Oberflächen bereitgestellt werden, die verschiedene wünschenswerte Eigenschaften haben, z.B. um bessere Grenzflächen mit umgebendem Gewebe oder Lösungen zu bilden. Zum Beispiel sind Ansätze entwickelt worden, um die Bindung spezifischer Zellen oder Moleküle an Vorrichtungsoberflächen zu fördern. Eine Vorrichtungsoberfläche kann zum Beispiel mit einer bioaktiven Gruppe versehen sein, die in der Lage ist, verschiedene Moleküle oder Zellen anzuziehen und/oder zu binden. Beispiele für solche bioaktiven Gruppen schließen Antigene zur Bindung an Antikörper, Liganden zur Bindung an Zelloberflächenrezeptoren und Enzymsubstrate zur Bindung an Enzyme ein.
Solche bioaktiven Gruppen sind auf den Oberflächen von Biomaterialien in einer Vielzahl von Weisen bereitgestellt worden. In einem Ansatz können Biomaterialien aus Molekülen hergestellt werden, die nach der Herstellung selbst die gewünschten bioaktiven Gruppen auf den Oberflächen von Vorrichtungen präsentieren. Wünschenswerte bioaktive Gruppen sind jedoch typischerweise hydrophil und können in die meisten Metalle oder hydrophoben polymeren Biomaterialien nicht in wirksamen Konzentrationen eingebaut werden, ohne die Strukturintegrität solcher Biomaterialien zu stören.
Ein alternativer Ansatz umfaßt die Zugabe von bioaktiven Gruppen zu den Oberflächen von Biomaterialien, z.B. nachdem sie zu medizinischen Vorrichtungen hergestellt worden sind. Solche bioaktiven Gruppen können gelegentlich durch Adsorption hinzugefügt werden. Gruppen, die durch Adsorption hinzugefügt worden sind, können jedoch typischerweise auf den Oberflächen nicht mit hohen Gehalten oder für längere Zeiträume zurückgehalten werden.
Die Retention solcher bioaktiven Gruppen auf einer Oberfläche kann durch kovalente Bindung dieser Gruppen an die Oberfläche verbessert werden. U.S.-Patente Nrn. 4,722,906, 4,979,959, 4,973,493 und 5,263,992 betreffen zum Beispiel Vorrichtungen, bei denen biokompatible Agentien über eine photoreaktive Gruppe und eine chemische Verknüpfungseinheit kovalent an die Biomaterialoberfläche gebunden sind. U.S.-Patente Nrn. 5,258,041 und 5,217,492 betreffen die Bindung von Biomolekülen an eine Oberfläche durch die Verwendung langkettiger chemischer Spacer. U.S.-Patente Nrn. 5,002,582 und 5,263,992 betreffen die Herstellung und Verwendung polymerer Oberflächen, bei denen polymere Agentien, die wünschenswerte Eigenschaften bereitstellen, über eine photoreaktive Einheit kovalent an die Oberfläche gebunden sind. Insbesondere zeigen die Polymere selbst die gewünschten Eigenschaften und sind, in der bevorzugten Ausführungsform, frei von anderen (z.B. bioaktiven) Gruppen.
Andere haben Photochemie verwendet, um die Oberflächen biomedizinischer Vorrichtungen zu modifizieren, z.B. um Gefäßtransplantate zu beschichten. (Siehe z.B. Kito, H. et al., ASAIO Journal 39: M506–M511, 1993. Siehe auch Clapper, D. L., et al., Trans. Soc. Biomat. 16: 42, 1993).
Cholakis und Sefton synthetisierten ein Polymer mit einer Polyvinylalkohol(PVA)-Hauptkette und bioaktiven Heparingruppen. Das Polymer wurde an Polyethylen-Schlauch über nicht-latente reaktive Chemie gekoppelt, und die resultierende Oberfläche wurde in einer Reihe von in-vitro- und in-vivo-Tests auf Thromboresistenz bewertet. Aus welchen Gründen auch immer lieferte das Heparin im Polymer, das von Cholakis und Sefton hergestellt worden war, keine wirksame Aktivität. (Cholakis, C. H. und M. V. Sefton, J. Biomed. Mater. Res. 23: 399–415, 1989. Siehe auch Cholakis, C. H., et al., J. Biomed. Mater. Res. 23: 417–441, 1989).
Schließlich offenbaren Kinoshita et al. die Verwendung reaktiver Chemie, um Polyacrylsäure-Hauptketten auf porösem Polyethylen zu erzeugen, wobei anschließend Collagen-Moleküle an Carboxyl-Einheiten auf den Polyacrylsäure-Hauptketten gekoppelt werden (siehe Kinoshita, Y., et al., Biomaterials 14: 209–215, 1993).
Im allgemeinen wird die resultierende Beschichtung in den obengenannten Situationen in Form bioaktiver Gruppen bereitgestellt, die mittels kurzer linearer Spacer kovalent an Biomaterialoberflächen gekoppelt sind. Dieser Ansatz funktioniert mit bioaktiven Gruppen mit großem Molekulargewicht, wie etwa Collagen und Fibronectin, gut, wo die Verwendung von kurzen Spacern gewünscht ist und die Größe der bioaktiven Gruppe, verglichen mit derjenigen des Spacers selbst, recht groß ist.
Die oben beschriebenen Ansätze, mit der möglichen Ausnahme von Kinoshita et al., sind jedoch nicht optimal zum Aufbringen bioaktiver Gruppen mit kleinem Molekulargewicht. Kinoshita scheint Moleküle mit kleinem Molekulargewicht aufzubringen, obgleich er ein arbeitsaufwendiges mehrstufiges Verfahren beschreibt, das sowohl Ausbeute als auch Reproduzierbarkeit nachteilig beeinflussen kann.
Bioaktive Gruppen mit kleinem Molekulargewicht werden typischerweise in Form von entweder kleinen Bereichen bereitgestellt, die von viel größeren Molekülen abgeleitet sind (z.B. von Fibronectin abgeleitete Zellbindungspeptide), oder als kleine Moleküle, die normalerweise frei diffundieren, um ihre Wirkungen zu erzeugen (z.B. Antibiotika oder Wachstumsfaktoren). Es scheint, daß kurze Spacer die Bewegungsfreiheit solcher kleinen bioaktiven Gruppen unzuträglich begrenzen können und ihrerseits ihre Aktivität beeinträchtigen, wenn sie immobilisiert sind. Was klar benötigt wird, sind Verfahren und Zusammensetzungen zur Bereitstellung verbesserter Konzentrationen von bioaktiven Gruppen, und insbesondere Gruppen mit kleinem Molekulargewicht, auf einer Biomaterialoberfläche in einer Weise, die verbesserte Bewegungsfreiheit der bioaktiven Gruppen erlaubt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wendet sich den oben beschriebenen Bedürfnissen zu durch Bereitstellung eines polybifunktionellen Reagens, das eine Mehrzahl von Molekülen umfaßt, wobei jedes eine Polymer-Hauptkette umfaßt, die (a) eine Mehrzahl von photoreaktiven Seiteneinheiten, die durch Einwirkung einer geeigneten Energiequelle aktiviert werden können, und (b) zwei oder mehr bioaktive Seitengruppen, die zu spezifischen, nicht-kovalenten Wechselwirkungen mit komplementären Gruppen in der Lage sind, trägt, wobei das Reagens bei Aktivierung der photoreaktiven Einheiten ein vernetztes Material oder eine vernetzte Oberflächenbeschichtung bilden kann, um die Anziehung solcher komplementären Gruppen zu fördern, wobei die Polymer-Hauptkette ein synthetisches Polymer oder Copolymer umfaßt, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Acrylkunststoffen, Vinylkunststoffen, Nylons, Polyurethanen, Polyethern und biologisch abbaubaren Polymeren besteht, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Polydioxanonen, Polyanhydriden und Polyorthoestern besteht, und wobei das Reagens durch Copolymerisation eines Basismonomers mit Monomeren, die photoreaktive Seiteneinheiten enthalten, und mit Monomeren, die die gewünschte bioaktive Gruppe enthalten, hergestellt wird, um ein Reagens mit einem gewünschten Verhältnis von Polymer-Hauptkette, photoreaktiven Einheiten und bioaktiven Gruppen zu liefern. Das Reagens schließt vorzugsweise eine Polymer-Hauptkette mit hohem Molekulargewicht, vorzugsweise linear, ein, an die eine optimale Dichte von sowohl bioaktiven Gruppen als auch photoreaktiven Einheiten gebunden ist. Das Reagens erlaubt, daß nützliche Dichten von bioaktiven Gruppen an eine Biomaterialoberfläche über eine oder mehrere photoreaktive Gruppen gebunden werden können. Die Hauptkette ihrerseits stellt eine Spacerfunktion von ausreichender Länge bereit, um die bioaktiven Gruppen mit größerer Bewegungsfreiheit zu versehen als derjenigen, die ansonsten erreicht werden könnte, z.B. durch die Verwendung individueller Spacer (wie oben beschrieben).
Als ein zusätzlicher Vorteil erlaubt das vorliegende Reagens die Bildung inter- und intramolekularer kovalenter Bindungen innerhalb und/oder zwischen Polymer-Hauptketten und der Biomaterialoberfläche, wodurch eine optimale und kontrollierbare Kombination solcher Eigenschaften wie Beschichtungsdichte, Bewegungsfreiheit, Haftfestigkeit und Stabilität bereitgestellt wird.
Zusätzlich zu seiner Verwendung bei der Modifizierung einer Biomaterialoberfläche stellt ein Reagens der Erfindung ebenso andere Vorteile bereit. Die photoreaktiven Einheiten erlauben, daß individuelle Polymermoleküle wirksam mit benachbarten Polymermolekülen gekoppelt (z.B. vernetzt) werden können. Diese Vernetzungseigenschaft erlaubt, daß die Polymere dicke Beschichtungen auf Biomaterialoberflächen erzeugen und/oder unabhängige Filme und Schüttgüter, entweder in vitro oder in vivo, erzeugen.
Die vorliegende Erfindung offenbart auch ein Verfahren zum Synthetisieren eines polybifunktionellen Reagens und zur Bereitstellung einer beschichteten Oberfläche, wie etwa der Oberfläche eines Biomaterials oder einer biomedizinischen Vorrichtung, die aus solch einem Biomaterial hergestellt ist. Die beschichtete Oberfläche, die Moleküle des polybifunktionellen Reagens daran gebunden aufweist, um die Vorrichtung mit wünschenswerten Eigenschaften oder Attributen zu versehen.
Die photoreaktiven Einheiten können aktiviert werden, um das polybifunktionelle Reagens an eine Oberfläche zu binden, indem abstrahierbare Wasserstoffatome in solcher Weise bereitgestellt werden, daß die bioaktiven Seitengruppen ihre gewünschte bioaktive Funktion beibehalten. Vorzugsweise wird das Reagens an die Oberfläche in einem „einstufigen" Verfahren gebunden, d.h. durch Aufbringen eines Reagens auf die Oberfläche und dort Aktivieren einer oder mehrerer seiner photoreaktiven Gruppen, um eine Beschichtung zu bilden. Im Gegensatz dazu würde ein „zweistufiges" Verfahren einen ersten Schritt der Immobilisierung einer polymeren Hauptkette über photochemische Mittel und einen zweiten Schritt der Bindung (z.B. thermochemisch) von zwei oder mehr bioaktiven Gruppen an die immobilisierte Hauptkette umfassen.
Bevorzugte polybifunktionelle Reagentien der Erfindung können verwendet werden, um die Oberflächen existierender Biomaterialien zu beschichten und/oder neue Biomaterialien zu erzeugen, z.B. durch die Herstellung von Schüttgüter. In jedem Fall können sie die Oberflächeneigenschaften einer biomedizinischen Vorrichtung verbessern, indem sie kovalent an die Vorrichtungsoberfläche gebundene Gruppen bereitstellen. Bevorzugte bioaktive Gruppen ihrerseits wirken, indem sie entweder nicht-kovalent an spezifische komplementäre Abschnitte von Molekülen oder Zellen binden, die mit solchen Gruppen in Kontakt kommen, oder auf diese wirken.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein polybifunktionelles Reagens der Erfindung mit einer polymeren Hauptkette, einer Mehrzahl von photoreaktiven Einheiten und zwei oder mehr bioaktiven Gruppen synthetisiert. Das polymere Molekül der Erfindung wird in Kontakt gebracht mit der Oberfläche eines zuvor ausgebildeten Biomaterials oder in Kontakt mit einem weiteren polymeren Molekül der Erfindung. Die photoreaktiven Einheiten werden über eine äußere Stimulation aktiviert, um, mittels der Erzeugung aktiver Spezies, eine kovalente Bindung zwischen dem Reagensmolekül und entweder der Biomaterialoberfläche oder einem weiteren Reagensmolekül zu bilden. Ein Biomaterial kann zum Beispiel in einer Lösung befeuchtet werden, die ein geeignetes Reagens enthält (typischerweise für 0,1–5 Minuten), und dann Licht ausgesetzt werden (typischerweise für 0,1–2 Minuten), um kovalente Kopplung zu erreichen.
Bevorzugte bioaktive Gruppen funktionieren, indem sie die Bindung spezifischer Moleküle oder Zellen an die Oberfläche fördern. Bevorzugte bioaktive Gruppen schließen Proteine, Peptide, Kohlehydrate, Nukleinsäuren und andere Moleküle, die in der Lage sind, nicht-kovalent an spezifische oder komplementäre Abschnitte von Molekülen oder Zellen zu binden, ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Beispiele für solche spezifische Bindung schließen Zelloberflächenrezeptoren, die an Liganden binden, Antigene, die an Antikörper binden, und Enzymsubstrate, die an Enzyme binden, ein. Vorzugsweise umfaßt die polymere Hauptkette eine synthetische polymere Hauptkette, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Additionspolymeren, wie etwa den Vinylpolymeren, besteht. Bevorzugter umfassen die Photogruppen jeweils ein reversibles photoaktivierbares Keton.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Wie hierin verwendet, werden die folgenden Begriffe und Wörter die folgenden zugeschriebenen Bedeutungen haben:
„Biomaterial" wird sich auf ein Material beziehen, das in wäßrigen Systemen im wesentlichen unlöslich ist und das eine oder mehrere Oberflächen für Kontakt mit Fluiden, die biologische Moleküle enthalten, bereitstellt, z.B, wäßrige in-vivo- oder in-vitro-Systeme, die Gewebe, Zellen oder Biomoleküle enthalten;
„Vorrichtung" wird sich auf ein funktionelles Objekt beziehen, das aus einem Biomaterial hergestellt ist;
„Beschichtung" wird sich auf eine oder mehrere Polymerschichten auf einer Biomaterialoberfläche beziehen und insbesondere auf eine oder mehrere Schichten, die auf einer Biomaterialoberfläche durch Aktivierung eines polybifunktionellen Reagens der vorliegenden Erfindung immobilisiert worden sind;
„polybifunktionelles Reagens", wenn verwendet im Zusammenhang mit dem vorliegend beanspruchten Reagens, wird sich auf ein Molekül beziehen, das eine Polymer-Hauptkette umfaßt, an die eine oder mehrere photoreaktive Einheiten und zwei oder mehr bioaktive Gruppen kovalent gebunden sind;
„eine photoreaktive Einheit" wird sich auf eine chemische Gruppe beziehen, die auf eine spezifische angewendete äußere Energiequelle reagiert, um die Erzeugung aktiver Spezies zu durchlaufen, was zu kovalenter Bindung an ein benachbartes Molekül oder eine Biomaterialoberfläche führt;
„bioaktive Gruppe" wird sich auf ein Molekül mit einer gewünschten spezifischen biologischen Aktivität beziehen, wie etwa eine Bindung oder enzymatische (katalytische) Aktivität;
„Polymer-Hauptkette" wird sich auf ein natürliches Polymer oder ein synthetisches Polymer beziehen, das z.B. aus Additions- oder Kondensationspolymerisation stammt.
Bevorzugte Reagentien der Erfindung umfassen ein synthetisches Polymer, das als eine Hauptkette dient, eine Mehrzahl von photoreaktiven Seiteneinheiten, die aktiviert werden können, um kovalente Bindung an Oberflächen oder benachbarte Polymermoleküle bereitzustellen, und zwei oder mehr biologisch aktive Seiteneinheiten mit niedrigem Molelculargewicht (bioaktive Gruppen).
Hauptkette. Die Polymer-Hauptkette kann entweder synthetisch oder natürlich vorkommend sein und ist vorzugsweise ein synthetisches Polymer, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Oligomeren, Homopolymeren und Copolymeren besteht, die aus Additions- oder Kondensationspolymerisation stammen. Natürlich vorkommende Polymere, wie etwa Polysaccharide und Polypeptide, können ebenso verwendet werden. Bevorzugte Hauptketten sind biologisch inert, indem sie keine biologische Funktion bereitstellen, die mit ihrer Verwendung in der beschriebenen Art und Weise inkonsistent oder dafür schädlich ist.
Solche Polymer-Hauptketten können Acrylkunststoffe, wie etwa diejenigen, die aus Hydroxyethylacrylat, Hydroxyethylmethacrylat, Glycerylacrylat, Glycerylmethacrylat, Acrylsäure, Methacrylsäure, Acrylamid oder Methacrylamid polymerisiert sind; Vinylkunststoffe, wie etwa Polyvinylpyrrolidon und Polyvinylalkohol; Nylons, wie etwa Polycaprolactam; Derivate von Polylauryllactam, Polyhexamethylenadipamid und Polyhexamethylendodecandiamid und Polyurethane; Polyether, wie etwa Polyethylenoxid, Polypropylenoxid und Polybutylenoxid; und biologisch abbaubare Polymere, wie etwa Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Polydioxanon, Polyanhydride und Polyorthoester, einschließen.
Die polymere Hauptkette wird ausgewählt, um eine Hauptkette bereitzustellen, die in der Lage ist, eine Mehrzahl von photoreaktiven Einheiten und zwei oder mehr bioaktive Gruppen zu tragen. Die polymere Hauptkette ist auch ausgewählt, um zwischen der Oberfläche und den verschiedenen photoreaktiven Einheiten und bioaktiven Gruppen einen Spacer bereitzustellen. Auf diese Weise kann das Reagens an eine Oberfläche oder an ein benachbartes Reagensmolelcül gebunden werden, um die bioaktiven Gruppen mit ausreichend Bewegungsfreiheit zu versehen, um optimale Aktivität zu zeigen. Die Polymer-Hauptketten sind vorzugsweise wasserlöslich, wobei Polyacrylamid und Polyvinylpyrrolidon besonders bevorzugte Polymere sind.
Photoreaktive Einheiten. Polybifunktionelle Reagentien der Erfindung tragen eine Mehrzahl von latenten reaktiven (vorzugsweise photoreaktiven) Seiteneinheiten, die kovalent an die Polymer-Hauptkette gebunden sind. Photoreaktive Einheiten sind hierin definiert, und bevorzugte Einheiten sind ausreichend stabil, um unter Bedingungen gelagert zu werden, bei denen sie solche Eigenschaften beibehalten. Siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 5,002,582, dessen Offenbarung hierin durch Bezugnahme miteinbezogen ist. Latente reaktive Einheiten können ausgewählt werden, die auf verschiedene Abschnitte des elektromagnetischen Spektrums ansprechen, wobei diejenigen, die auf ultraviolette und sichtbare Abschnitte des Spektrums ansprechen (hierin als „photoreaktiv" bezeichnet), besonders bevorzugt sind.
Photoreaktive Einheiten sprechen auf spezifische angewendete äußere Stimuli an, um die Erzeugung aktiver Spezies zu durchlaufen, mit resultierender kovalenter Bindung an eine benachbarte chemische Struktur, z.B. wie bereitgestellt durch dasselbe oder ein unterschiedliches Molekül. Photoreaktive Einheiten sind diejenigen Gruppen von Atomen in einem Molekül, die ihre kovalenten Bindungen unter Lagerbedingungen unverändert beibehalten, die aber, bei Aktivierung durch eine äußere Energiequelle, kovalente Bindungen mit anderen Molekülen bilden.
Die photoreaktiven Einheiten erzeugen aktive Spezies, wie etwa freie Radikale und insbesondere Nitrene, Carbene und angeregte Zustände von Ketonen, bei Absorption äußerer elektrischer, elektromagnetischer oder kinetischer (thermischer) Energie. Photoreaktive Einheiten können ausgewählt werden, um auf verschiedene Abschnitte des elektromagnetischen Spektrums anzusprechen, und photoreaktive Einheiten, die auf z.B. ultraviolette und sichtbare Abschnitte des Spektrums ansprechen, sind bevorzugt und werden hierin gelegentlich als „photochemische" Einheit bezeichnet.
Photoreaktive Arylketone sind besonders bevorzugt, wie etwa Acetophenon, Benzophenon, Anthrachinon, Anthron und Anthron-ähnliche Heterocyclen (d.h. heterocyclische Analoga von Anthron, wie etwa diejenigen mit N, O oder S in der 10-Position) oder ihre substituierten (z.B. ringsubstituierten) Derivate. Die funktionellen Gruppen solcher Ketone sind bevorzugt, da sie ohne weiteres in der Lage sind, den hierin beschriebenen Aktivierungs/Inaktivierungs/Reaktivierungs-Zyklus zu durchlaufen. Benzophenon ist eine besonders bevorzugte photoreaktive Einheit, da es zu photochemischer Anregung mit der anfänglichen Bildung eines angeregten Singulettzustandes in der Lage ist, der Intersystem-Crossing zum Triplett-Zustand durchläuft. Der angeregte Triplett-Zustand kann sich in Kohlenstoff-Wasserstoff-Bindungen durch Abstraktion eines Wasserstoffatoms (zum Beispiel von einer Trägeroberfläche) einschieben, wodurch ein Radikalenpaar geschaffen wird. Anschließender Kollaps des Radikalenpaares führt zur Bildung einer neuen Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung. Wenn eine reaktive Bindung (z.B. Kohlenstoff-Wasserstoff) für Bindung nicht zur Verfügung steht, ist die durch ultraviolettes Licht induzierte Anregung der Benzophenon-Gruppe reversibel und das Molekül kehrt bei Entfernung der Energiequelle zum Grundzustands-Energieniveau zurück. Photoaktivierbare Arylketone, wie etwa Benzophenon oder Acetophenon, sind insofern von besonderer Wichtigkeit, als diese Gruppen mehrfacher Reaktivierung in Wasser unterliegen und daher erhöhte Beschichtungseffizienz liefern. Daher sind photoreaktive Arylketone besonders bevorzugt.
Die Azide stellen eine bevorzugte Klasse latenter reaktiver Einheiten dar und schließen Arylazide (C₆R₅N₃), wie etwa Phenylazid und insbesondere 4-Fluor-3-nitrophenylazid, Acylazide (-CO-N₃), wie etwa Benzoylazid und p-Methylbenzoylazid, Azidoformiate (-O-CO-N₃), wie etwa Ethylazidoformiat, Phenylazidoformiat, Sulfonylazide (-SO₂-N₃), wie etwa Benzosulfonylazid, und Phosphorylazide (RO)₂PON₃, wie etwa Diphenylphosphorylazid und Diethylphosphorylazid, ein. Diazoverbindungen stellen eine weitere Klasse photoreaktiver Einheiten dar und schließen Diazoalkane (-CHN₂), wie etwa Diazomethan und Diphenyldiazomethan, Diazoketone (-CO-CHN₂), wie etwa Diazoacetophenon und 1-Trifluormethyl-1-diazo-2-pentanon, Diazoacetate (-O-CO-CHN₂), wie etwa t-Butyldiazoacetat und Phenyldiazoacetat, und beta-Keto-alpha-diazoacetate (-CO-CN₂-CO-O-), wie etwa t-Butyl-alpha-diazoacetoacetat, ein. Weitere photoreaktive Einheiten schließen die aliphatischen Azoverbindungen, wie etwa Azobisisobutyronitril, die Diamine (-CHN₂), wie etwa 3-Trifluormethyl-3-phenyldiazirin, die Ketene (-CH=C=O), wie etwa Keten und Diphenylketen, ein.

Bei Aktivierung der photoreaktiven Einheiten werden die Beschichtungs-Adhäsionsmoleküle durch kovalente Bindungen durch Reste der photoreaktiven Gruppen kovalent aneinander und/oder die Materialoberfläche gebunden. Beispielhafte photoreaktive Gruppen und deren Reste bei Aktivierung sind wie folgt dargestellt.

Photoreaktive Gruppe	Restfunktionalität
Arylazide	Amin R-NH-R'
Acrylazide	Amid R-CO-NH-R'
Azidoformiate	Carbamat R-O-CO-NH-R'
Sulfonylazide	Sulfonamid R-SO₂-NH-R'
Phosphorylazide	Phosphoramid (RO)₂PO-NH-R'
Diazoalkane	Neue C-C-Bindung
Diazoketone	Neue C-C-Bindung und Keton
Diazoacetate	Neue C-C-Bindung und Ester
beta-Keto-alpha-diazoacetate	Neue C-C-Bindung und beta-Ketoester
Aliphtisches Azo	Neue C-C-Bindung
Diamine	Neue C-C-Bindung
Ketene	Neue C-C-Bindung
Photoaktivierte Ketone	Neue C-C-Bindung und Alkohol

Bioaktive Gruppen. Bioaktive Gruppen mit niedrigem Molekulargewicht der vorliegenden Erfindung sind typischerweise diejenigen, die dazu gedacht sind, die Funktion oder Leistung einer bestimmten biomedizinischen Vorrichtung in einer physiologischen Umgebung zu verbessern oder zu verändern. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die bioaktive Gruppe ausgewählt aus der Gruppe, die aus Zellanheftungsfaktoren, Wachstumsfaktoren, Antithrombosefaktoren, Bindungsrezeptoren, Liganden, Enzymen, Antibiotika und Nulcleinsäuren besteht. Ein Reagensmolekül dieser Erfindung schließt wenigstens zwei bioaktive Seitengruppen ein. Die Verwendung von zwei oder mehr bioaktiven Seitengruppen ist jedoch gegenwärtig bevorzugt, da das Vorhandensein mehrerer solcher Gruppen pro Reagensmolekül dazu neigt, die Verwendung solcher Reagentien zu erleichtern.
Wünschenswerte Zellanheftungsfaktoren schließen Anheftungspeptide (unten definiert) sowie große Proteine oder Glykoproteine (typischerweise 100–1.000 Kilodaltons Größe) ein, die in ihrem nativen Zustand fest an ein Substrat oder eine benachbarte Zelle gebunden sein können, sich an einen spezifischen Zelloberflächenrezeptor binden können und mechanisch eine Zelle an das Substrat oder eine benachbarte Zelle anheften können. Natürlich vorkommende Anheftungsfaktoren sind primär Proteine mit großem Molekulargewicht, mit Molekulargewichten über 100.000 Daltons.
Anheftungsfaktoren binden sich an spezifische Zelloberflächenrezeptoren und heften mechanisch Zellen an das Substrat (hierin als „Substrat-Adhäsionsmoleküle" bezeichnet) oder an benachbarte Zellen (hierin als „Zell-Zell-Adhäsionsmoleküle" bezeichnet) an [Alberts, B. et al., Molecular Biology of the Cell, 2nd ed., Garland Publ., Inc., New York (1989)]. Zusätzlich zur Förderung der Zellanheftung kann jeder Typ von Anheftungsfaktor andere Zellreaktionen fördern, einschließlich Zellmigration und -differentiation. Geeignete Anheftungsfaktoren für die vorliegende Erfindung schließen Substrat-Adhäsionsmoleküle, wie etwa die Proteine Laminin, Fibronectin, Collagene, Vitronectin, Tenascin, Fibrinogen, Thrombospondin, Osteopontin, von-Willibrand-Faktor und Knochen-Sialoprotein, ein.
Weitere geeignete Anheftungsfaktoren schließen Zell-Zell-Adhäsionsmoleküle („Cadherine") ein, wie etwa N-Cadherin und P-Cadherin.
Anheftungsfaktoren, die in dieser Erfindung nützlich sind, umfassen typischerweise Aminosäuresequenzen oder funktionelle Analoga derselben, die die biologische Aktivität einer spezifischen Domäne eines nativen Anheftungsfaktors besitzen, wobei das Anheftungspeptid typischerweise etwa 3 bis etwa 20 Aminosäuren lang ist. Native Zellanheftungsfaktoren haben typischerweise eine oder mehrere Domänen, die sich an Zelloberflächenrezeptoren binden und die Zellanheftungs-, Migrations- und Differentiationsaktivitäten der Stammmoleküle erzeugen. Diese Domänen bestehen aus spezifischen Aminosäuresequenzen, von denen mehrere synthetisiert worden sind und über die berichtet worden ist, daß sie die Anheftung, Ausbreitung und/oder Proliferation von Zellen fördern. Diese Domänen und funktionellen Analoga dieser Domänen werden „Anheftungspeptide" genannt.
Beispiele für Anheftungspeptide aus Fibronectin schließen RGD (arg-gly-asp) [Kleinman, H. K. et al., Vitamins and Hormones 47: 161–186, 1993], REDV (arg-glu-asp-val) [Hubbell, J. A., et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 665: 253–258, 1992] und C/H-V (WQPPRARI oder trp-gln-pro-pro-arg-ala-arg-ile) [Mooradian, D. L., et al., Invest. Ophth. & Vis. Sci. 34: 153–164, 1993] ein, sind aber nicht hierauf beschränkt.
Beispiele für Anheftungspeptide aus Laminin schließen YIGSR (tyr-ile-gly-ser-arg) und SIKVAV (ser-ile-lys-val-ala-val) [Kleinman, H. K. et al., Vitamins and Hormones 47: 161–186, 1993] und F-9 (RYVVLPRPVCFEKGMNYTVR oder arg-tyr-val-val-leu-pro-arg-pro-val-cys-phe-glu-lys-gly-met-asn-tyr-thr-val-arg) [Charonis, A. S., et al., J. Cell Biol. 107: 1253–1260, 1988] ein, sind aber nicht hierauf beschränkt.
Beispiele für Anheftungspeptide aus Collagen Typ IV schließen HEP-III (GEFYFDLRLKGDK oder gly-glu-phe-tyr-phe-asp-leu-arg-leu-lys-gly-asp-lys) [Koliakos, G. G., et al., J. Biol. Chem. 264: 2313–2323, 1989] ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Wünschenswerterweise haben Anheftungspeptide, die in dieser Erfindung verwendet werden, zwischen etwa 3 und etwa 30 Aminosäurereste in ihren Aminosäuresequenzen. Vorzugsweise haben Anheftungspeptide nicht mehr als etwa 15 Aminosäurereste in ihren Aminosäuresequenzen.
Weitere wünschenswerte bioaktive Gruppen, die in der Erfindung vorliegen, schließen Wachstumsfaktoren, wie etwa Fibroblasten-Wachstumsfaktor, epidermalen Wachstumsfaktor, Plättchen-entstammende Wachstumsfaktoren, transformierende Wachstumsfaktoren, Gefäßendothel-Wachstumsfaktoren, knochenmorphogenetische Proteine und andere Knochenwachstumsfaktoren, neuralen Wachstumsfaktoren und dergleichen ein.
Noch weitere wünschenswerte bioaktive Gruppen, die in der Erfindung vorliegen, schließen Antithrombosemittel ein, die Thrombusbildung oder Akkumulation an mit Blut in Kontakt kommenden Vorrichtungen hemmen. Wünschenswerte Antithrombosemittel schließen Heparin und Hirudin (die das Gerinnen von Kaskadenproteinen, wie etwa Thrombin, hemmen) sowie Lysin ein. Weitere wünschenswerte Antithrombosemittel schließen Prostaglandine, wie etwa PGI₂, PGE₁ und PGD₂ ein, die Plättchenadhäsion und -aktivierung hemmen. Noch weitere wünschenswerte Thrombosemittel schließen fibrinolytische Enzyme, wie etwa Streptokinase, Urokinase und Plasminogenaktivator, ein, die Fibringerinnsel zersetzen. Eine weitere wünschenswerte bioaktive Gruppe besteht aus Lysin, das sich spezifisch an Plasminogen bindet, das seinerseits Fibringerinnsel zersetzt.
Weitere wünschenswerte bioaktive Gruppen, die in der Erfindung vorliegen, schließen Bindungsrezeptoren, wie etwa Antikörper und Antigene ein. Antikörper, die auf einer Biomaterialoberfläche vorliegen, können an spezifische Antigene aus wäßrigen Medien, die mit den immobilisierten Antikörpern in Kontakt kommen, binden und diese daraus entfernen. In ähnlicher Weise können Antigene, die auf einer Biomaterialoberfläche vorliegen, sich an spezifische Antikörper aus wäßrigen Medien, die mit den immobilisierten Antigenen in Kontakt kommen, binden und diese daraus entfernen.
Weitere wünschenswerte bioaktive Gruppen bestehen aus Rezeptoren und ihren entsprechenden Liganden. Zum Beispiel binden sich Avidin und Streptavidin spezifisch an Biotin, wobei Avidin und Streptavidin Rezeptoren sind und Biotin ein Ligand ist. In ähnlicher Weise binden sich Fibroblasten-Wachstumsfaktoren und Gefäßendothel-Wachstumsfaktor mit hoher Affinität an Heparin und transformierender Wachstumsfaktor beta und bestimmte knochenmorphogenetische Proteine binden sich an Collagen Typ IV. Auch eingeschlossen sind Immunoglobulin-spezifische Bindungsproteine, die aus bakteriellen Quellen stammen, wie etwa Protein A und Protein G, und synthetische Analoga derselben.
Noch weitere wünschenswerte bioaktive Gruppen, die in der Erfindung vorliegen, schließen Enzyme ein, die sich an Substratmoleküle, die in wäßrigen Medien vorliegen, die mit den immobilisierten Enzymen in Kontakt kommen, binden und spezifische Veränderungen in diesen katalysieren können. Weitere wünschenswerte bioaktive Gruppen bestehen aus Nukleinsäuresequenzen (z.B. DNA, RNA und cDNA), die selektiv komplementäre Nukleinsäuresequenzen binden. Oberflächen, die mit spezifischen Nukleinsäuresequenzen beschichtet sind, werden in Diagnosetests verwendet, um das Vorhandensein komplementärer Nukleinsäuresequenzen in Testproben zu identifizieren.
Noch weitere wünschenswerte bioaktive Gruppen, die in der Erfindung vorliegen, schließen Antibiotika ein, die mikrobielles Wachstum auf Biomaterialoberflächen hemmen. Bestimmte wünschenswerte Antibiotika können mikrobielles Wachstum durch Bindung an spezifischen Komponenten auf Bakterien hemmen. Eine besonders wünschenswerte Klasse von Antibiotika sind die antibiotischen Peptide, die mikrobielles Wachstum zu hemmen scheinen, indem sie die Permeabilität der Plasmamembran über Mechanismen verändern, die zumindest teilweise keine spezifische komplementäre Liganden-Rezeptor-Bindung involvieren könnten [Zazloff, M., Curr. Opinion Immunol. 4: 3–7, 1992].
Biomaterialien. Bevorzugte Biomaterialien schließen diejenigen ein, die aus synthetischen Polymeren hergestellt sind, einschließlich Oligomeren, Homopolymeren und Copolymeren, die aus entweder Additions- oder Kondensationspolymerisationen stammen. Beispiele für geeignete Additionspolymere schließen Acrylkunststoffe, wie etwa diejenigen, die aus Methylacrylat, Methylmethacrylat, Hydroxyethylmethacrylat, Hydroxyethylacrylat, Acrylsäure, Methacrylsäure, Glycerylacrylat, Glycerylmethacrylat, Methacrylamid und Acrylamid polymierisiert sind; Vinylkunststoffe, wie etwa Ethylen, Propylen, Styrol, Vinylchlorid, Vinylacetat, Vinylpyrrolidon und Vinylidendifluorid, ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Beispiele für Kondensationspolymere schließen Nylons, wie etwa Polycaprolactam, Polylauryllactam, Polyhexamethylenadipamid und Polyhexamethylendodecandiamid, und auch Polyurethane, Polycarbonate, Polyamide, Polysulfone, Poly(ethylenterephtalat), Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Polydimethylsiloxane und Polyetheretherketone ein, sind aber nicht hierauf beschränkt.
Bestimmte natürliche Materialien sind ebenfalls geeignete Biomaterialien, einschließlich menschlichem Gewebe, wie etwa Knochen, Knorpel, Haut und Zähne; und andere organische Materialien, wie etwa Holz, Cellulose, komprimierter Kohlenstoff und Gummi.
Weitere geeignete Biomaterialien bestehen aus Substanzen, die keine abstrahierbaren Wasserstoffe besitzen, mit denen die Photogruppen kovalente Bindungen bilden können. Eine solche Klasse von Biomaterialien kann zur Beschichtung über Photochemie geeignet gemacht werden, indem eine geeignete Primerbeschichtung aufgebracht wird, die sich an die Biomaterialoberfläche bindet und ein geeignetes Substrat zur Bindung durch die Photogruppen liefert. Ein Untersatz dieser Gruppe schließt Metalle und Keramikwerkstoffe ein, die Oxidgruppen auf ihren Oberflächen haben und zur Kopplung über Photochemie geeignet gemacht sind, indem eine Primerbeschichtung zugegeben ist, die sich an die Oxidgruppen bindet und abstrahierbare Wasserstoffe liefert. Die Metalle schließen Titan, rostfreien Stahl und Cobalt-Chrom ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Die Keramikwerkstoffe schließen Siliciumnitrid, Siliciumcarbid, Zirconiumdioxid und Aluminiumoxid sowie Glas, Siliciumdioxid und Saphir ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Eine geeignete Klasse von Primern für Metalle und Keramikwerkstoffe besteht aus Organosilan-Reagentien, die sich an die Oxidoberfläche binden und Kohlenwasserstoffgruppen liefern (Brzoska, J. B., et al., Langmuir 10: 4367–4373, 1994). Die Forscher haben auch entdeckt, daß -SiH-Gruppen geeignete Alternativen zur Bindung von Photogruppen sind.
Eine zweite Klasse von Biomaterialien, die einen organischen Primer erfordern, sind die Edelmetalle, die Gold, Silber, Kupfer und Platin einschließen. Funktionelle Gruppen mit hoher Affinität zu Edelmetallen schließen -CN, -SH und -NH₂ ein, und organische Reagentien mit diesen funktionellen Gruppen werden verwendet, um organische Monoschichten auf solche Metalle aufzubringen (Grabar, K. C., et al., Anal. Chem. 67: 735–743, 1995).
Eine weitere Klasse von Biomaterialien, die keine abstrahierbaren Wasserstoffe besitzt, sind faserartig oder porös. Die Erfindungspolymere bilden kovalent vernetzte Polymer-Netzwerke, die die Poren füllen oder Filme um einzelne Fasern herum bilden und daher physikalisch eingeschlossen sind. Expandiertes Polytetrafluorethylen ist solch ein Biomaterial.
Biomaterialien können verwendet werden, um eine Reihe von Vorrichtungen herzustellen, die mit bioaktiven Gruppen unter Verwendung eines polybiofunktionellen Reagens der vorliegenden Erfindung beschichtet werden können. Implantatvorrichtungen sind eine allgemeine Klasse von geeigneten Vorrichtungen und schließen Gefäßvorrichtungen, wie etwa Transplantate, Stents, Katheter, Ventile, künstliche Herzen und Herzunterstützungsvorrichtungen; orthopädische Vorrichtungen, wie etwa Gelenkimplantate, Frakturreparaturvorrichtungen und künstliche Sehnen; dentale Vorrichtungen, wie etwa Dentalimplantate und Frakturreparaturvorrichtungen; ophthalmische Vorrichtungen, wie etwa Linsen und Glaucom-Drainageshunts; und andere Katheter, synthetische Prothesen und künstliche Organe ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Weitere geeignete biomedizinische Vorrichtungen schließen Dialyseschläuche und -membranen, Blutoxygenatorschläuche und -membranen, Blutbeutel, Nahtmaterialien, Membranen, Zellkulturvorrichtungen, chromatographische Trägermaterialien, Biosensoren und dergleichen ein.
Herstellung von Reagentien. Die Fachleute, denen man die vorliegende Lehre gibt, werden die Art und Weise erkennen, auf die Reagentien der vorliegenden Erfindung unter Verwendung herkömmlicher Techniken und Materialien hergestellt werden können. In einem bevorzugten Verfahren wird eine Polymer-Hauptkette durch die Copolymerisation eines Basis-Monomers, wie etwa Acrylamid oder N-Vinylpyrrolidon, mit Monomeren mit photoreaktiven und/oder thermochemisch reaktiven Seitengruppen hergestellt. Die durch diese Copolymerisation hergestellten Polymere werden dann mit dem bioaktiven Molekül durch Reaktion durch die thermochemisch reaktiven Gruppen derivatisiert. Ein Beispiel für eine solche Kopplung ist die Reaktion zwischen einem N-Oxysuccinimid(NOS)-Ester auf der polymeren Hauptkette mit einer Amingruppe auf dem bioaktiven Molekül.
Ein alternatives bevorzugtes Verfahren umfaßt die Herstellung von Monomeren, die die gewünschte bioaktive Gruppe sowie eine polymerisierbare Funktion, wie etwa eine Vinylgruppe, enthalten. Solche Monomere können dann mit Monomeren, die photoreaktive Gruppen enthalten, und mit einem Basis-Monomer, wie etwa Acrylamid oder N-Vinylpyrrolidon, copolymerisiert werden.
Ein bevorzugtes Verfahren, das verwendet wird, um latente reaktive Peptidpolymere zu synthetisieren, umfaßt die Synthese von N-substituierten Methacrylamid-Monomeren, die jeweils Peptid (Peptid-Monomer) und ein Methacrylamid-Monomer enthalten, das ein substituiertes Benzophenon enthält (4-Benzoylbenzoeäsure, BBA). Die Peptid-Monomere wurden durch Umsetzen der Sulfhydryl-Einheit jeden Peptids mit der Maleiimid-Einheit von N-[3-(6-Maleimidylhexanamido)propyl]methacrylamid (Mal MAm) hergestellt. Dann wurde jedes Peptid-Monomer mit Acrylamid und dem Monomer, das BBA enthält (BBA-APMA), copolymerisiert, um das endgültige latente reaktive Peptidpolymer herzustellen.
Verschiedene Parameter können eingestellt werden, um Reagentien mit einem gewünschten Verhältnis (entweder auf Mol- oder Gewichtsbasis) von polymerer Hauptkette, photoreaktiven Einheiten und bioaktiven Gruppen bereitzustellen. Die Hauptkette selbst wird zum Beispiel typischerweise zwischen etwa 40 und etwa 400 Kohlenstoffatome pro reaktive Gruppe und vorzugsweise zwischen etwa 60 und etwa 300 Kohlenstoffatome bereitstellen.
Im Hinblick auf die bioaktive Gruppe kann die Länge der Hauptkette in Abhängigkeit von solchen Faktoren variieren wie der Größe der bioaktiven Gruppe und der gewünschten Beschichtungsdichte. Für relativ kleine bioaktive Gruppen (MG weniger als 3.000) wird die polymere Hauptkette zum Beispiel typischerweise im Bereich von etwa 5 bis etwa 200 Kohlenstoffatome pro bioaktive Gruppe liegen und vorzugsweise zwischen etwa 10 und etwa 100. Für größere bioaktive Gruppen, wie diejenigen mit einem Molekulargewicht zwischen etwa 3.000 und etwa 50.000, stellt die bevorzugte Hauptkette im Durchschnitt zwischen etwa 10 und etwa 5.000 Kohlenstoffatome pro bioaktive Gruppe und vorzugsweise zwischen etwa 50 und 1.000 Kohlenstoffatome bereit. In jedem Fall werden die Fachleute, denen man die vorliegende Beschreibung gibt, in der Lage sein, die geeigneten Bedingungen zu bestimmen, um eine optimale Kombination von Dichte und Bewegungsfreiheit der bioaktiven Gruppen bereitzustellen.
Beschichtungsverfahren. Reagentien der vorliegenden Erfindung können auf Biomaterialoberflächen unter Verwendung von Techniken (z.B. Tauchen, Sprühen, Bürsten) innerhalb der Fähigkeiten der Fachleute auf diesem Gebiet aufgebracht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird zunächst das polybifunktionelle Reagens synthetisiert und dann mit einem zuvor gebildeten Biomaterial in Kontakt (d.h. ausreichende Nähe, um Bindung zu erlauben) gebracht. Die photoreaktive Gruppe wird über eine äußere Stimulation (z.B. Einwirkung einer geeigneten Lichtquelle) aktiviert, um, über Erzeugung freier aktiver Spezies, eine kovalente Bindung zwischen dem Reagens und entweder einem weiteren polybifunktionellen Reagensmolekül oder der Biomaterialoberfläche zu bilden. Dieses Beschichtungsverfahren wird hierin als das „einstufige Beschichtungsverfahren" bezeichnet, da photoreaktive Kopplungschemie ein Erfindungs-Polymer an eine Biomaterialoberfläche bindet und keine anschließenden Schritte erforderlich sind, um die bioaktive Gruppe hinzuzufügen. Die äußere Stimulation, die wünschenswerterweise eingesetzt wird, ist elektromagnetische Strahlung und ist vorzugsweise Strahlung in den ultravioletten, sichtbaren oder infraroten Bereichen des elektromagnetischen Spektrums.
Photoaktivierbare Polymer der Erfindung können auch verwendet werden, um Bioeinheiten in Mustern auf den Oberflächen von Biomaterialien zu immobilisieren, zum Beispiel durch Verwendung von Techniken, die zuvor für die Erzeugung von Beschichtungsmustern mit Merkmalen von 50–350 mm Größe beschrieben sind. (Siehe Matsuda, T. und T. Sugawara, J. Biomed. Mater. Res. 29: 749–756 (1995)). Hydrophile Muster, die die Anheftung und das Wachstum von Endothelzellen hemmen, können zum Beispiel erzeugt werden durch: 1) Synthetisieren latenter reaktiver hydrophiler Polymere, 2) Hinzugeben der latenten reaktiven Polymere zu Gewebekultur-Polystyrolplatten, 3) Bestrahlen der Polymere durch eine Musterphotomaske und 4) Entfernen nicht-immobilisierter Polymere durch Waschen mit einem geeigneten Lösemittel.
Solch ein Ansatz kann mit Polymeren der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, um Muster spezifischer Bioeinheiten zu immobilisieren. Mikroarrays spezifischer Bindungsmoleküle (z.B. Antikörper, Antigene/Haptene, Nukleinsäuresonden, etc.) können zum Beispiel auf optischen, elektrochemischen oder Halbleiter-Sensoroberflächen immobilisiert werden, um simultane Multianalyt-Testfähigkeiten oder Mehrfachempfindlichkeitsbereichtests für einzelne Analyten bereitzustellen. Gemusterte Immobilisation liefert auch ein nützliches Werkzeug zur Entwicklung eines „Labors auf einem Chip", bei dem aufeinanderfolgende Verarbeitungs-/Reaktionsschritte entlang eines Fluidbewegungsweges in einem mehrstufigen Mikrovolumentestsystem eintreten. Musterbildung von Zellanheftungsfaktoren, zum Beispiel denjenigen, die die Anheftung von neuralen Zellen an Elektroden fördern, werden die Entwicklung von: 1) neuen Generationen ultrasensitiver Biosensoren und 2) künstlichen Gliedmaßen, die direkt vom Nervensystem des Patienten gesteuert werden, erlauben.
Reagentien der Erfindung können kovalent an zuvor gebildete Biomaterialien gekoppelt werden, um als Oberflächenbeschichtungen zu dienen. Die vorliegenden Reagensmoleküle können auch kovalent an benachbarte Moleküle gekoppelt werden, um Filme oder biologische Schüttgüter herzustellen. Die Oberflächenbeschichtungen, Filme und biologische Schüttgüter, die aus der Kopplung über photoreaktive Einheiten resultieren, liefern nützliche Dichten von bioaktiven Gruppen auf der Oberfläche der resultierenden Biomaterialien.
Verwendung von Vorrichtungen. Bioaktive Polymere der vorliegenden Erfindung werden verwendet, um die Oberflächen existierender Biomaterialien zu modifizieren oder neue Biomaterialien zu erzeugen. Biomedizinische Vorrichtungen, die resultierende Biomaterialien enthalten, werden für eine Vielzahl von in-vitro- und in-vivo-Anwendungen verwendet. Biomedizinische Vorrichtungen, die Zellanheftungsgruppen oder Wachstumsfaktoren als Bioeinheiten besitzen, fördern zum Beispiel die Anheftung und/oder das Wachstum von Zellen auf in-vitro-Zellkulturvorrichtungen und verbessern die Gewebeintegration bei Implantatvorrichtungen, wie etwa Gefäßtransplantaten, orthopädischen Implantaten, dentalen Implantaten, Hornhautlinsen und Brustimplantaten. Biomedizinische Vorrichtungen, die Antithrombosefaktoren als Bioeinheiten besitzen, verhindern Thrombose auf den Oberflächen von mit Blut in Kontakt kommenden Vorrichtungen, wie etwa Kathetern, Herzklappen, Gefäßstents, Gefäßtransplantaten, Stenttransplantaten, künstlichen Herzen und Blutoxygenatoren.
Biomedizinische Vorrichtungen, wie etwa Harze oder Membranen, die Rezeptoren oder Liganden als Bioeinheiten besitzen, können für Affinitätsreinigung eines breiten Bereiches von Biomolekülen verwendet werden. Heparin (das auch eine antithrombotische Einheit ist) wird zum Beispiel verwendet, um mehrere Gerinnungsfaktoren, Proteaseinhibitoren, Lipoproteine, Wachstumsfaktoren, lipolytische Enzyme, extrazelluläre Matrixproteine und virale Hüllproteine zu binden und zu reinigen. Staphylococcales Protein A bindet spezifisch Immunoglobuline und hat sich als sehr nützlich zur Reinigung von Antikörpern erwiesen. Streptavidin ist ein Protein, das sich mit extrem hoher Affinität spezifisch an Biotin bindet. Streptavidin und Biotin sind ein sehr nützliches Paar von Reagentien als ein sekundäres Bindungspaar in Diagnosetests. Oftmals können Signalamplifikation, erhöhte Empfindlichkeit und schnellere Testleistung durch Verwendung immobilisierten Streptavidins erreicht werden.
Biomedizinische Vorrichtungen mit oberflächenbeschichteten Antikörpern oder Antigenen können in Diagnosetests verwendet werden, die von der Spezifität der Bindung für den empfindlichen Nachweis des komplementären Antigens oder Antikörpers abhängen. Die Antikörper oder Antigene können auf Membranen, Plastikröhren, Mikroplattenvertiefungen oder Festkörper-Biosensorvorrichtungen immobilisiert werden. Immobilisierte Antikörper sind auch wichtig zur Reinigung einer Vielzahl biopharmazeutischer Mittel. Proteine, die in Bakterien oder Pilzen durch Gentechnologie erzeugt werden, können durch Affinitätsreinigung mit immobilisierten Antikörpern gereinigt werden. Blutfraktionen, wie etwa Gerinnungsfaktor VIII (antihämophiler Faktor), werden ebenfalls durch immobilisierte Antikörper gereinigt.
Biomedizinische Vorrichtungen mit Oberflächen, die mit Nukleinsäuresequenzen beschichtet sind, können verwendet werden, um komplementäre Nukleinsäuresequenzen selektiv zu binden. Solche Vorrichtungen werden in Diagnosetests verwendet, um das Vorhandensein komplementärer Nukleinsäuresequenzen in Testproben zu identifizieren. Vorrichtungen mit oberflächenbeschichteten Enzymen als Bioeinheiten können für einen bereiten Bereich von Enzymreaktoren verwendet werden, um entweder Syntheseverfahren (z.B. die chirale Pharmazeutika herstellen) oder Abbau-/Umwandlungsverfahren (z.B. die Stärke abbauen und Glucose in Fructose umwandeln, zur Herstellung von Maissirup mit hohem Fructosegehalt) zu katalysieren.
Beschichtete antimikrobielle Mittel können verwendet werden, um bakterielles Wachstum auf den Oberflächen von Vorrichtungen zu hemmen. Solche antimikrobiellen Oberflächen können die Rate von Infektionen verringern, die mit Implantatvorrichtungen zusammenhängen, einschließlich mehrerer Typen von Kathetern (intravaskulär, peritoneal, Hämodialyse, Hydrocephalus und urologisch), arteriovenösen Shunts, Herzklappen, Gefäßtransplantaten, Tracheotomieschläuchen, orthopädischen Implantaten und Penisimplantaten. Mehrere in-vitro-Vorrichtungen können ebenfalls von solchen Oberflächen profitieren, z.B. durch Hemmen der Biofilmbildung. Diese schließen Kontaktlinsenkästchen, Wasserleitungen in Dentaleinheiten, Leitungen, die in der Lebensmittel- und pharmazeutischen Industrie verwendet werden, Lebensmittelverpackung, Tischoberflächen und andere Oberflächen, die für die Lebensmittelhandhabung verwendet werden, und Luftfilter ein.
BEISPIELE
Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele weiter beschrieben werden. Es wird für die Fachleute deutlich sein, daß viele Veränderungen in den beschriebenen Ausführungsformen vorgenommen werden können, ohne vom Schutzumfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Sofern nicht anders angegeben, sind alle Prozentanteile gewichtsbezogen.
Beispiel 1
Peptidpolymere
A. Synthese von 4-Benzoylbenzoylchlorid (BBA-Cl)
4-Benzoylbenzoesäure (BBA), 200,0 g (0,884 mol), wurde zu einem trockenen 2 Liter-Rundkolben zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 273 ml Thionylchlorid. Dimethylformamid (DMF), 684 μl, wurde dann zugegeben und die Mischung wurde für 3–4 Stunden unter Rückfluß gekocht. Nach Abkühlung wurde das überschüssige Thionylchlorid auf einem Rotationsverdampfer bei Wassersaugdruck abgezogen. Jegliches verbliebenes Thionylchlorid wurde durch wiederholte Verdampfung mit 3 × 100 ml Toluol entfernt. Das Endprodukt wurde dann aus 5:1 Hexan:Toluol umkristallisiert mit typischen Ausbeuten an BBA-Cl bei > 90% und einem Schmelzpunkt von 92–94°C.
B. Synthese von N-[3-(4-Benzoylbenzamido)propyl]methacrylamid (BBA-APMA)
N-[3-Aminopropyl)methacrylamid-Hydrochlorid (APMA-HCl, 120 g, 0,672 mol, von Eastman Kodak Co., Rochester, N. Y.) wurde zu einem trockenen 2 Liter-Dreihalsrundkolben, der mit einem Überkopfrührer ausgestattet war, zugegeben. Phenothiazin, 23–25 mg, wurde als ein Inhibitor zugegeben, gefolgt von 800 ml Chloroform. Die Suspension wurde auf einem Eisbad unter 10°C abgekühlt und 172,5 g (0,705 mol) BBA-Cl wurden als ein Feststoff zugegeben. Triethylamin, 207 ml (1,485 mol), in 50 ml Chloroform wurde dann tropfenweise über einen Zeitraum von 1–1,5 Stunden zugegeben. Das Eisbad wurde entfernt und das Rühren bei Umgebungstemperatur wurde für 2,5 Stunden fortgesetzt. Das Produkt wurde dann mit 600 ml 0,3 N HCl und 2 × 300 ml 0,07 N HCl gewaschen. Nach Trocknen über Natriumsulfat wurde das Chloroform unter verringertem Druck abgezogen und das Produkt wurde zweimal aus 4:1 Toluol:Chloroform unter Verwendung von 23–25 mg Phenothiazin bei jeder Umkristallisation, um Polymerisation zu verhindern, umkristallisiert. Typische Ausbeuten an BBA-APMA waren 90% mit einem Schmelzpunkt von 147–151°C.
C. Synthese von N-[3-(6-Maleimidohexanamido)propyl]methacrylamid (Mal-MAm)
6-Maleimidohexansäure wurde durch Auflösen von 6-Aminohexansäure (100,0 g, 0,762 mol) in 300 ml Essigsäure in einem 3 Liter-Dreihalskolben, der mit einem Überkopfrührer und einem Trockenrührer ausgestattet war, hergestellt. Maleinsäureanhydrid, 78,5 g (0,801 mol), wurde in 200 ml Essigsäure gelöst und zur 6-Aminohexansäure-Lösung zugegeben. Die Mischung wurde eine Stunde gerührt, während sie auf einem siedenden Wasserbad erhitzt wurde, was zur Bildung eines weißen Feststoffes führte. Nach Abkühlen über Nacht bei Raumtemperatur wurde der Feststoff durch Filtration gesammelt und mit 2 × 50 ml Hexan gespült. Typische Ausbeute der (Z)-4-Oxo-S-aza-2-undecendisäure betrug 90–95% mit einem Schmelzpunkt von 160–165°C.
(Z)-4-Oxo-S-aza-2-undecendisäure, 150,0 g (0,654 mol), Essigsäureanhydrid, 68 ml (73,5 g, 0,721 mol), und Phenothiazin, 500 mg, wurden zu einem 2 Liter-Dreihalsrundkolben, der mit einem Überkopfrührer ausgestattet war, zugegeben. Triethylamin (TEA), 91 ml (0,653 mol), und 600 ml Tetrahydrofuran (THF) wurden zugegeben und die Mischung wurde unter Rühren auf Rückfluß erhitzt. Nach insgesamt 4 Stunden Rückfluß wurde die dunkle Mischung auf < 60°C abgekühlt und in eine Lösung von 250 ml 12 N HCl in 3 Litern Wasser gegossen. Die Mischung wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und wurde dann durch ein Filtrationskissen (Celite 545, J. T. Baker, Jackson, TN) filtriert, um Feststoffe zu entfernen. Das Filtrat wurde mit 4 × 500 ml Chloroform extrahiert und die vereinigten Extrakte wurden über Natriumsulfat getrocknet. Nach Zugabe von 15 mg Phenothiazin, um Polymerisation zu verhindern, wurde das Lösungsmittel unter verringertem Druck abgezogen. Die 6-Maleimidohexansäure wurde aus 2:1 Hexan:Chloroform umkristallisiert, um typische Ausbeuten von 55–60% mit einem Schmelzpunkt von 81–85°C zu ergeben.
Der N-Oxysuccinimidester (NOS) von 6-Maleimidohexansäure wurde durch Auflösen von 1,0 g (4,73 mmol) 6-Maleimidohexansäure und 0,572 g (4,97 mmol) N-Hydroxysuccinimid (NHS) in 10 ml trockenem Dioxan, gefolgt von der Zugabe von 1,074 g (5,21 mmol) 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), hergestellt. Die Reaktionsmischung ließ man über Nacht bei Raumtemperatur rühren. Das 1,3-Dicyclohexylharnstoff-Nebenprodukt wurde durch Filtration entfernt und der Filterkuchen wurde mit 3 × 10 ml Dioxan gespült. Phenothiazin (0,2 mg) wurde zugegeben und die Lösung wurde unter verringertem Druck eingedampft. Der resultierende Feststoff wurde mit Hexan extrahiert, um jegliches überschüssige DCC zu entfernen, und dieses Produkt wurde ohne irgendeine zusätzliche Reinigung verwendet.
Das N-Succinimidyl-6-maleimidohexanoat, 414 mg (1,34 mmol), und N-(3-Aminopropyl)methacrylamid-Hydrochlorid, 200 mg (1,12 mmol), wurden mit 10 ml Chloroform verdünnt, gefolgt von der Zugabe von 153 μl (1,10 mmol) TEA über eine Zeitraum von 1 Stunde bei Raumtemperatur. Die Mischung ließ man über Nacht bei Raumtemperatur rühren. Das Produkt wurde durch Eindampfen isoliert und durch Silicagelflashchromatographie unter Verwendung eines 99:1, gefolgt von einem 97:3 Chloroform:Methanol-Gradienten gereinigt. Das Poolen der Fraktionen, Zugabe von 10 mg p-Methoxyphenol und Verdampfen des Lösemittels ergaben 261 mg Produkt. Massenspektrumanalyse einer Probe ergab M⁺ = 335 (10,7%) und NMR zeigte Protonenpeaks von Maleimid (6,6 ppm) und allylischem Methyl (2,0 ppm).
D. Synthese von Peptidmonomeren
Fünf Peptide wurden als Bioeinheiten verwendet. Jede Peptideinheit wurde durch Standard-Festphasensyntheseverfahren synthetisiert und ist unten durch seinen üblichen Namen, ein repräsentatives Literaturzitat, das Stammprotein, aus dem es identifiziert wurde, und die spezifische verwendete Sequenz (angegeben durch Standard-Einzelbuchstabennotation zur Identifizierung von Aminosäuren) identifiziert.
Für jede Peptidsequenz repräsentiert der Abschnitt der Sequenz, der nicht unterstrichen ist, die native Sequenz, die im Stammprotein vorhanden ist. Der Abschnitt der Sequenz, der unterstrichen ist, repräsentiert Aminosäuren, die hinzugefügt wurden, um spezifische funktionelle Gruppen bereitzustellen. Die Lysin-Reste (K) wurden hinzugefügt, um primäre Amine bereitzustellen (epsilon-Aminogruppen), die zur radioaktiven Markierung über reduktive Methylierung verwendet wurden. Cystein-Reste (C) wurden hinzugefügt, um Sulfhydrylgruppen bereitzustellen, die zur Kopplung jedes Peptids an Maleimidgruppen verwendet wurden, die auf Monomeren vorlagen, die anschließend dimerisiert wurden, um die Peptidpolymere herzustellen. C/H-II enthielt ausreichend Lysin-Reste in seiner nativen Sequenz und benötigte das Hinzufügen zusätzlicher Lysinreste nicht; in ähnlicher Weise enthielt F-9 einen Cystein-Rest als Teil seiner nativen Sequenz und benötigte das Hinzufügen eines zusätzlichen Cystein-Restes nicht.
Eine geeignete Menge Mal-MAm wurde aus einer Vorratslösung von Mal-MAm im Chloroform entnommen und wurde in einer Reaktionsphiole gegeben, unter Stickstoffstrom getrocknet und erneut in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst. Eine gleiche molare Menge von jedem Peptid wurde in entgastem 50 mM Acetatpuffer (pH 5) gelöst, zur Reaktionsphiole zugegeben und die Mischung wurde für 60–90 Minuten bei Raumtemperatur gerührt.
E. Synthese photoreaktiver Polyacrylamide unter Verwendung von Peptid-Monomeren (Peptid-Polymere)
BBA-APMA wurde in einer Konzentration von 10 mg/ml in DMSO gelöst und Acrylamid wurde in einer Konzentration von 100 mg/ml in Wasser gelöst. Die Peptid-Monomere wurden nicht gereinigt, nachdem sie synthetisiert worden waren, und blieben in Lösungen von Acetatpuffer gelöst, die DMSO enthielten, wie oben beschrieben. Die geeigneten molaren Mengen BBA-APMA-Monomer und Acrylamid wurden dann zu jeder Reaktionsphiole zugegeben. Jede Mischung wurde durch Wasserabsaugung für 15 Minuten entgast. Ammoniumpersulfat (10% Vorratslösung in Wasser) und N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED) wurden (in den unten angegebenen Mengen) zugegeben, um die Polymerisation zu katalysieren. Jede Mischung wurde erneut entgast und über Nacht bei Raumtemparatur in einem verschlossenen Exsikkator inkubiert. Jedes resultierende Peptid-Copolymer wurde gegen Wasser (unter Verwendung von Spectra/Por 50.000 MWCO-Dialyseschlauch von Spectrum Medical Industries, Houston, TX) bei 4°C dialysiert, um nicht-eingebaute Reaktanten zu entfernen, und dann lyophilisiert.
Die folgende Tabelle gibt die Menge von jedem Reaktanten an, die für jede Copolymerisation zugegeben wurde.
Die gewonnenen Mengen von jedem Peptid-Polymer nach Lyophilisation betrugen 72 mg RGD, 135 mg F-9, 100 mg C/H-II, 15,2 mg C/H-V und 17,8 mg HEP-III.
F. Kopplung von Peptid-Polymeren an Biomaterialien
Drei Biomaterialien wurden verwendet: Polystyrol (PS), Polyurethan (PU) und Silikongummi (SR). Abbrech-Polystyrolstreifen in der Größe einer 96-Well-Platte (Immulon I Removawell Strips von Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, VA) wurden verwendet, um die immobilisierten Gehalte von jedem Peptid-Polymer in Radiomarkierungsexperimenten zu bestimmen. Sowohl 24- als auch 48-Well-PS-Kulturplatten (die nicht-steril und nicht-plasmabehandelt waren) wurden von Corning Costar Corp. (Cambridge, MA) erhalten und zur Durchführung der Zellwachstums-Bioaktivitätstests verwendet. Flache PU-Blätter (Pellethane 55-D) und flache SR-Blätter wurden jeweils von Specialty Silicone Fabricators, Inc. (Paso Robles, CA) erhalten und gestanzt, um Scheiben mit Durchmessern von 6, 10 und 15 mm Durchmesser herzustellen, die entsprechend in die Vertiefungen von 96-, 48- und 24-Well-Kulturplatten paßten. Die Scheiben wurden in sowohl den Radiomarkierungstests als auch den Bioaktivitätstests verwendet.
Zwei unterschiedliche Protokolle wurden verwendet, um die Peptide (Peptid-Polymere oder Peptid-Reagenskontrollen) auf Biomaterialien aufzubringen, wobei der Hauptunterschied darin lag, ob die Peptide auf den Biomaterialien getrocknet wurden oder nicht, bevor sie bestrahlt wurden, um die latenten reaktiven Gruppen zu aktivieren. Bei dem trockenen Immobilisierungsprotokoll wurden die Peptide in 50% (v/v) Isopropanol (IPA) in Wasser verdünnt, zu Biomaterialien, wie unten angegeben, zugegeben und vor der Bestrahlung getrocknet. Beim nassen Immobilisierungsprotokoll wurden die Peptide in Wasser verdünnt, zu Biomaterialien, wie unten angegeben, zugegeben und vor der Bestrahlung nicht trocknen gelassen.
Bei jedem Immobilisierungsprotokoll betrug die endgültige zugegebene Konzentration an Peptid-Einheiten 50 μg/ml und die folgenden Volumina wurden pro Vertiefung jeden Typs von Kulturplatte zugegeben: 50 μl/Vertiefung bei 96-Well-Platten, 100 μ/Vertiefung bei 48-Well-Platten, 20 μl/Vertiefung bei 24-Well-Platten. Wie oben angegeben, wurden Scheiben aus PU und SR in die Böden der Platten für die Beschichtungs- und Bewertungsverfahren gegeben.
Die Proben wurden mit einer Dymax-Lampe (Modell Nr. PC-2, Dymax Corporation, Torrington, CT) bestrahlt, die einen Heraeus-Kolben (W. C. Heraeus GmbH, Hanau, Bundesrepublik Deutschland) enthielt, um die in jedem Polymer vorhandenen Photogruppen zu aktivieren und kovalente Bindung an das Biomaterial zu erzeugen. Die Bestrahlungsdauer betrug 1–2 Minuten bei einer Intensität von 1–2 mW/cm² im Wellenlängenbereich von 330–340 nm. Adsorptionskontrollen wurden ebenfalls mit Peptid-Polymeren und Peptid-Reagenskontrollen, die nicht bestrahlt wurden, erzeugt.
Im Anschluß an entweder Photoimmobilisierung oder Adsorption wurden die Peptid-Polymere bzw. Peptid-Reagenskontrollen umfassend auf einem Orbitalrüttler (~ 150–200 UPM) gewaschen, um Peptide zu entfernen, die nicht fest an das Substrat gebunden waren. Die Waschschritte schlossen ein: 1) eine Waschung über Nacht mit drei Wechseln der Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung (PBS), pH 7,3, die 1% Tensid Tween 20 enthielt, 2) ein 30-minütiger Wasch-/Sterilisierungsschritt in 70% (v/v) Ethanol in Wasser und 3) vier Waschungen in steriler PBS.
G. Quantifizierung immobilisierter Gehalte von Peptiden auf Biomaterialien
Zwei Peptid-Polymere (RGD-Polymer und F-9-Polymer) und ihre entsprechenden Peptid-Reagenskontrollen wurden mit Tritium durch reduktive Methylierung radioaktiv markiert und verwendet, um den Gehalt von jedem Peptid zu bestimmen, der auf jedem Biomaterial immobilisiert war. Peptid-Reagenskontrollen wurden nicht in Polymere eingebaut und bestanden aus RGD (Sequenz GRGDSPKKC) und F-9. Die vier mit Tritium markierten Peptide wurden entsprechend [³H]-RGD-Polymer, [³H]-F-9-Polymer, [³H]-RGD-Reagenskontrolle und [³H]-F-9-Reagenskontrolle genannt. Jedes mit Tritium markierte Peptid wurde auf jedes Biomaterial (PS-Abbrechstreifen, 6 mm-Scheiben aus PU und 6 mm-Scheiben aus SR) unter Verwendung des trockenen Immobilisierungsprotokolls und des hierin beschriebenen Waschverfahrens aufgebracht.
Nach dem Waschverfahren wurden die PS-Abbrechstreifen in einzelne Vertiefungen gebrochen, in Szintillationsphiolen (1 Vertiefung/Phiole) gegeben, in TMF gelöst und in Aquasol-2 Fluor (DuPont NEN^®, Boston, MA) gezählt, um die dpms/Probe zu bestimmen. Die PU-Scheiben wurden in THF gequollen und in Aquasol-2 gezählt. Die SR-Schreiben wurden in Soluene-350 Tissue Solubilizer gelöst und in Hionic Fluor (jeweils von Packard Instrument Co., Meriden, CT) gezählt. Nachdem die Biomaterialien durch Flüssigszintillationsspektrometrie gezählt waren, wurden die endgültigen Beladungsdichten jedes Peptids (ng/cm²) aus den bekannten spezifischen Aktivitäten (dpm/ng) jedes tritiierten Reagens berechnet. Eine Zusammenfassung der Beladungsdichteergebnisse ist in der Tabelle unten angegeben. Jeder Wert ist der Mittelwert von drei oder mehr Bestimmungen. Immobilisiert bezieht sich auf bestrahlte Proben. Adsorbiert bezieht sich auf nicht-bestrahlte Proben. ND = nicht bestimmt.
In allen Fällen zeigten die immobilisierten Peptid-Polymere (d.h. die Polymerbeschichtungen, die bestrahlt worden waren) die größten Beladungsdichten. Die Beladungsdichten der Peptid-Polymere waren auch abhängig vom Biomaterial, wobei die größten zurückbehaltenen Gehalte an Peptid-Polymeren auf PS und SR vorlagen und die niedrigsten zurückbehaltenen Gehalte auf PU vorlagen. In jedem Fall waren die zurückbehaltenen Gehalte an photoimmobilisierten Peptid-Polymeren in der Größenordnung von 1,5- bis 9-mal größer als die adsorbierten Peptid-Polymere und in der Größenordnung von 4,5- bis 39-mal größer als die adsorbierten Peptid-Reagenskontrollen.
H. Zellanheftungsaktivität von immobilisierten Peptiden
Kalbslungenarterienendothel(CPAE)-Zellen wurden von der ATCC (American Type Culture Collection, Rockwell, MD) bezogen und kultiviert, wie von der ATCC angegeben. Die Anheftungstests wurden in 48-Well-PS-Kulturplatten durchgeführt. Wenn PU und SR bewertet wurden, wurden Scheiben von jedem Material (mit oder ohne Beschichtungen) in die Böden der Kulturplattenvertiefungen gegeben. Wenn PS bewertet wurde, wurden die Böden der Vertiefungen beschichtet. Für jeden Test wurden nicht-beschichtete und Peptid-beschichtete Biomaterialien (PS, PU und SR) mit 50.000 Zellen pro Vertiefung in serumfreiem Medium, das 2 mg/ml Rinderserumalbumin enthielt (BSA-Fraktion V von Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) beimpft. Die Zellen ließ man für zwei Stunden an jedes Biomaterial anheften. Dann wurden die nicht-angehefteten Zellen durch Absaugung entfernt und die Vertiefungen wurden zweimal mit Hank's Balanced Salt Solution (Celox Corp., Hopkins, MN) gespült. Schließlich wurden die angehefteten Zellen quantifiziert durch die Zugabe von Kulturmedium, das einen Stoffwechselfarbstoff enthielt, MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid], der von einem gelben Tetrazoliumsalz in Gegenwart von lebensfähigen Zellen in ein unlösliches, purpurnes Formazan umgewandelt wird. Nach einer zweistündigen Inkubation im Kulturmedium, das MTT enthielt, wurde das Medium entfernt und der Formazan-Farbstoff, der innerhalb der lebensfähigen Zellen abgeschieden worden war, wurde (mit saurem Isopropanol) löslich gemacht und auf einem Spektrophotometer bei 570 nm abgelesen. Die Extinktion des Formazans ist direkt proportional zur Anzahl angehefteter, lebensfähiger Zellen, die pro Vertiefung vorhanden sind.
Die folgende Tabelle faßt die Ergebnisse von Zellanheftungstests zusammen, die immobilisierte Peptid-Polymere und adsorbierte Peptid-Reagenskontrollen vergleichen. In jedem Fall wurde die relative Anzahl von Zellen, die sich an die Peptid-beschichteten Biomaterialien anhefteten (wie bestimmt mit MTT-Farbstoff), durch die Anzahl Zellen geteilt, die sich an die nicht-beschichteten (UC) Biomaterialien anhefteten, um eine relative Zellanheftungsbewertung zu erhalten. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert von 1 bis 4 unterschiedlichen Experimenten, wobei jedes Experiment mit 3 oder 4 Replikaten durchgeführt wurde. Die Peptide wurden unter Verwendung des hierin beschriebenen nassen Immobilisierungsprotokolls auf PS immobilisiert und die Peptide wurden über das trockene Immobilisierungsprotokoll auf SR und PU immobilisiert. Immobil. Peptid-Polymer bezieht sich auf bestrahltes Peptid-Polymer. Adsorbiertes Peptid-Reagens bezieht sich auf nicht-bestrahltes Peptid-Reagens. ND = nicht bestimmt.
Diese Ergebnisse zeigen, daß die photoimmobilisierten Peptid-Polymere die Zellanheftung an alle drei Biomaterialien verstärkten. Die größten Verbesserungen wurden mit RGD-Polymer, das auf allen drei Biomaterialien photoimmobilisiert war, und F-9-Polymer, das auf PS photoimmobilisiert war, beobachtet (4,3- bis 10-fache Verbesserungen), wobei geringere Verbesserungen mit F-9-Polymer auf PU und C/H-V-Polymer auf SR und PU beobachtet wurden (1,3- bis 1,9-fache Verbesserungen). In jedem Falle, in dem adsorbierte Peptid- Reagenskontrollen mit photoimmobilisierten Peptid-Polymeren verglichen wurden, war die Zellanheftung auf den Peptid-Polymeren größer.
I. Zellwachstumsaktivität immobilisierter Peptide
Die Wachstumstests wurden in 24-Well-PS-Kulturplatten durchgeführt. Wenn PU und SR bewertet wurden, wurden Scheiben aus jedem Material (mit oder ohne Beschichtungen) in die Böden der Kulturplattenvertiefungen gegeben. Wenn PS bewertet wurde, wurden die Böden der Vertiefungen beschichtet. Für jeden Test wurden nicht-beschichtete und Peptid-beschichtete Biomaterialien (PS, PU und SR) mit CPAE-Zellen mit 1.500 Zellen pro Vertiefung beimpft und in vitro für 4 bis 7 Tage proliferieren gelassen. Dann wurde das Medium abgesaugt und das Zellwachstum wurde unter Verwendung von MTT-Farbstoff quantifiziert.
Die folgende Tabelle faßt die Ergebnisse zusammen, die Zellwachstum auf nicht-beschichteten Substraten, adsorbierten Peptiden und Peptid-Polymeren verglichen. Wie bei den Anheftungstests wurde die relative Anzahl von Zellen, die auf jedem Peptid-beschichteten Biomaterialien wuchsen, durch die Anzahl Zellen geteilt, die auf den nicht-beschichteten (UC) Biomaterial wuchsen, um eine relative Zellwachstumsbewertung zu erhalten. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert von 1 bis 4 unterschiedlichen Experimenten, wobei jedes Experiment mit 3 oder 4 Replikaten durchgeführt wurde. Das hierin beschriebene trockene Immobilisierungsprotokoll wurde verwendet, um alle bewerteten Peptide zu immobilisieren. Immobil. Peptid-Polymer bezieht sich auf bestrahltes Peptid-Polymer. Adsorbiertes Peptid-Reagens bezieht sich auf nicht-bestrahltes Peptid-Reagens. ND = nicht bestimmt.
Zusätzlich zu den in der Tabelle oben angegebenen Peptiden wurden C/H-II und HEP-III ebenfalls auf Wachstum auf PS bewertet. Bei diesen zwei Peptiden betrug das Wachstum auf adsorbierten Peptiden das 1,0- bis 1,1-fache desjenigen, das auf nicht-beschichtetem PS beobachtet wurde, und das Wachstum auf Peptid-Polymeren betrug das 10,5- und 13-fache desjenigen, das auf nicht-beschichtetem PS beobachtet wurde. Diese zwei Peptide (Polymere und Reagenskontrollen) wurden über das nasse Immobilisierungsprotokoll immobilisiert. Die Ergebnisse mit C/H-II und HEP-III sind die Mittelwerte von 1 bzw. 2 Experimenten, wobei jedes Experiment mit 4 Replikaten durchgeführt wurde.
Diese Wachstumstests zeigen, daß alle fünf Peptid-Polymere, die auf PS photoimmobilisiert waren, Wachstum förderten, das 1,5- bis 17,5-mal größer war als Wachstum auf nicht-beschichtetem PS. Auch verstärkten die drei Peptid-Polymere das Zellwachstum auf PU um das 3,9- bis 9,4-fache. Nur leichte Verbesserungen im Zellwachstum wurden auf SR beobachtet.
Beispiel 2
Hirudin-Polymer
A. Synthese von N-Succinimidyl-6-(4-benzoylbenzamido)hexanoat (BBA-EAC-NOS)
BBA-Cl (30,00 g, 0,123 mol), hergestellt wie beschrieben in Beispiel 1, wurde in 450 ml Toluol gelöst. Eine Menge (16,1 g, 0,123 mol) 6-Aminohexansäure (die hierin alternativ als ε-Aminocapronsäure bezeichnet werden wird oder als ihre abgekürzte Form EAC) wurde in 375 ml 1 N NaOH gelöst und diese Lösung wurde zur Lösung des Säurechlorids zugegeben. Die Mischung wurde für 45 Minuten bei Raumtemperatur kräftig gerührt, um eine Emulsion zu erzeugen. Das Produkt wurde dann mit 1 N HCl angesäuert und mit 3 × 450 ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter verringertem Druck eingedampft. Die 6-(4-Benzoylbenzamido)hexansäure wurde aus Toluol:Ethylacetat umkristallisiert, um 36,65 g Produkt, m. p. 106–109°C, zu ergeben.
Die 6-(4-Benzoylbenzamido)hexansäure (25 g, 73,7 mmol) wurde zu einem trockenen Kolben zugegeben und in 500 ml trockenem 1,4-Dioxan gelöst. NHS (15,5 g, 0,135 mol) wurde zugegeben und der Kolben wurde auf einem Eisbad unter einer trockenen N₂-Atmosphäre abgekühlt. DCC (27,81 g, 0,135 mol) in 15 ml 1,4-Dioxan wurde dann zugegeben und die Mischung wurde über Nacht gerührt. Nach Filtration, um den 1,3-Cyclohexylharnstoff zu entfernen, wurde das Lösemittel unter verringertem Druck abgezogen und das Produkt wurde zweimal aus Ethanol umkristallisiert, um 23,65 g eines weißen Feststoffes, m. p. 121–123°C, zu ergeben.
B. Synthese eines photoreaktiven Polyacrylamids, das Hirudin-Liganden enthält (Hirudin-Polymer)
Methacryloyl-EAC-BBA wurde hergestellt, indem 112 mg (0,629 mmol) APMA-HCl, 358 mg (0,818 mmol) BBA-EAC-NOS und 80 mg (104 μl, 0,692 mmol) TEMED in 22 ml DMSO umgesetzt wurden. Die Mischung wurde für 4,5 Stunden gerührt. Dann wurde das NOS-Polymer hergestellt, indem zu dieser Mischung 4,20 g (59,1 mmol) Acrylamid, 532 mg (3,15 mmol) N-Acryloxysuccinimid (Eastman Kodak, Rochester, N. Y.) und 64 mg (0,39 mmol) 2,2'-Azobisisobutyronitril (AIBN) zugegeben wurden. Die Mischung wurde mit Helium gespült und bei 50°C über Nacht inkubiert. Ein Teil der resultierenden Polymerlösung (10 ml) wurde mit 10 ml DMSO verdünnt und langsam zu kräftig gerührtem Aceton (200 ml) zugegeben, um das Polymer auszufällen. Das Polymer wurde gesammelt, mit Aceton gewaschen, um Verunreinigungen zu entfernen, und unter Vakuum getrocknet. Insgesamt 1,47 g wurden gewonnen.
Rekombinantes Hirudin mit einer Reinheit von mehr als 90% und einer Aktivität von 16.500 ± 2.000 ATU/mg wurde von Transgene Laboratories (Strasbourg, Frankreich) erhalten. (Siehe unten für Definition von ATU.) Hirudin ist ein Antithrombosemittel, das wirkt, indem es sich an Thrombin bindet und die proteolytische Aktivität von Thrombin hemmt. Hirudin (10,5 mg, 1,52 μmol) wurde in 1 ml 0,1 M Carbonatpuffer gelöst. Das NOS-Polymer (hergestellt wie oben beschrieben) wurde in DMSO mit 4 mg/ml gelöst. Dann wurden 2 mg des NOS-Polymers zur Hirudin-Lösung zugegeben und über Nacht gemischt. Die Hälfte der Reaktionsmischung wurde in einem Spectra/Por 50.000 MWCO-Schlauch gegen Wasser dialysiert, gefolgt von Lyophilisation. Insgesamt 5,9 mg Hirudin-Polymer wurden gewonnen, das 5,0 mg Hirudin und 0,2 mol BBA pro Mol Hirudin enthielt. Das Hirudin wurde mit einem BCA-Protein-Testkit (von Pierce Chemical Company, Rockford, IL) quantifiziert und der BBA-Gehalt wurde spektrophotometrisch bestimmt.
Ein Kontrollpolymer („Ethanolamin-Polymer") wurde hergestellt, indem anstelle von Hirudin Ethanolamin zum NOS-Polymer zugegeben wurde. Das resultierende Ethanolamin-Polymer ist ungeladen und wurde als eine Kontrolle in Experimenten verwendet, die die Bindung von Thrombin an ein ähnliches Polymer, das Ethanolamin anstelle von Hirudin enthielt, verglichen.
C. Test auf Aktivitäten von Hirudin und Hirudin-Polymer in Lösung
Die spezifischen Aktivitäten von Hirudin und Hirudin-Polymer wurden durch Standardprotokolle bestimmt, die von Transgene bereitgestellt wurden, und sind ausgedrückt als Antithrombin-Einheiten (ATUs) pro mg Hirudin. Eine ATU ist die Menge Hirudin, die erforderlich ist, um die proteolytische Aktivität einer NIH-Einheit Thrombin zu hemmen. Für diese Tests wurde eine bekannte Menge Rinderthrombin (175–350 NIH-Einheiten/mg, von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) mit einer Reihe von Verdünnungen von Hirudin oder Hirudin-Polymer vorinkubiert, und die zurückbleibende Thrombinaktivität wurde mit einem homogenen Substrat, Chromozym TH (von Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN), bestimmt. Die spezifischen Aktivitäten von getestetem Hirudin vor und nach Einarbeitung in das Hirudin-Polymer betrugen 11.710 bzw. 10.204 ATU/mg. Daher erzeugte die Einarbeitung von Hirudin in das Polymer nur eine 13%-ige Abnahme seiner Aktivität.
D. Kopplung von Hirudin-Polymer und Ethanolamin-Polymer an Biomaterialien.
Flache Blätter aus drei Biomaterialien wurden verwendet: 1) Polyethylen (PE, primäres Referenzmaterial von den National Institutes of Health, Bethesda, MD), 2) SR (medizinische Qualität SILASTIC^® von Dow Corning Corporation, Midland, MI) und 3) PU (Tecoflex^® von ThermoCardiosystems, Woburn, MA). Proben jeden Biomaterials wurden in entweder Scheiben mit einem Durchmesser von 6 mm oder Quadrate mit 1 × 1 cm geschnitten. Um Oberflächenverunreinigungen vor den Beschichtungen zu entfernen, wurden die PU- und PE-Proben durch kurzes Eintauchen in IPA gewaschen und SR wurde 1 Stunde mit Hexan extrahiert und über Nacht getrocknet. Zusätzlich wurden die SR-Proben unmittelbar vor dem Aufbringen des Hirudin-Polymers oder Ethanolamin-Polymers mit einem Argonplasma behandelt (3 min, 250 Watt, 250 mTorr).
Das Hirudin-Polymer wurde auf 1–25 μg/ml in 75:25 (v/v) Wasser:IPA verdünnt und zu einer Seite jeder Biomaterialprobe zugegeben, die wie oben beschrieben gewaschen oder extrahiert war. Die zugegebenen Hirudin-Polymerlösungen wurden trocknen gelassen und wurden dann mit einer Dymax-Lampe bestrahlt. Um locker anhaftendes Hirudin-Polymer zu entfernen, das nach dem Beschichtungsverfahren zurückblieb, wurde jede Probe 3-mal für 15 Minuten und dann über Nacht in einer 1%-Lösung von Tween 20 in PBS gewaschen. Dann wurde das Tween 20 durch Spülen der Proben in entionisiertem Wasser entfernt.
Drei Typen Kontrollproben wurden ebenfalls hergestellt: 1) nicht-beschichtete Kontrollen, zu denen Hirudin-Polymer nicht zugegeben wurde, 2) Proben, zu denen das Hirudin-Polymer zugegeben, aber nicht bestrahlt wurde, und 3) SR-Proben, die mit dem Ethanolamin-Polymer beschichtet wurden. Für die letztere Kontrolle wurde das Ethanolamin-Polymer (hergestellt wie hierin beschrieben) in entionisiertem Wasser auf 1 oder 5 μg/200 μl verdünnt. Dann wurden 200 μl-Aliquote jeder Vorratslösung zu einer Seite von 1 cm²-Proben aus SR zugegeben, trocknen gelassen, photoaktiviert und in Tween 20/PBS und entionisiertem Wasser gewaschen, wie hierin für das Hirudin-Polymer beschrieben.
E. Quantifizierung der Hirudin-Beladung auf Biomaterialien
Hirudin wurde über reduktive Methylierung radioaktiv markiert, in ein Hirudin-Polymer eingearbeitet, wie hierin beschrieben, und verwendet, um die Menge an Hirudin-Polymer zu quantifizieren, die auf jedem von drei Biomaterialien immobilisiert war, wie hierin beschrieben. Um das zurückbehaltene Tritium zu zählen, wurden die Proben in THF gelöst, in Aquasol verdünnt und in einem Flüssigszintillationszähler Packard 1900CA gezählt. Die in der Tabelle unten angegebenen Ergebnisse zeigen, daß die Menge an zurückbehaltenem Hirudin-Polymer proportional zur zugegebenen Menge war, und die zurückbehaltene Menge nach Photoaktivierung ist das 2,3- bis 66-fache derjenigen, die ohne Photoaktivierung zurückbehalten wird. Jedes Ergebnis ist der Mittelwert von 4 Bestimmungen. N. A. = nicht getestet.
F. Test auf Aktivität von Hirudin-Polymerbeschichtungen auf Biomaterialien
Hirudin-Polymer, das nicht mit Tritium markiert worden war, wurde auf jedes Biomaterial aufgebracht, wie hierin beschrieben. Die Aktivität des immobilisierten Hirudin-Polymers wurde dann durch Quantifizierung der Bindung von zugesetztem, mit Tritium markiertem Thrombin (³H-Thr) getestet. Das ³H-Thr wurde durch Markierung von menschlichem Thrombin (4.000 NIH-Einheiten/mg Protein, von Sigma Chemical Co.) über reduktive Methylierung hergestellt. Jede beschichtete Probe wurde in einer Lösung von 2 μg/ml ³H-Thr in einem Tris-Puffer (0,05 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 0,1% PEG 3350, pH 8,5) für eine Stunde inkubiert und mit demselben Puffer gespült, der kein Thrombin enthielt, um nicht-gebundenes Thrombin zu entfernen. Die Proben wurden dann in THF gelöst, in Aquasol verdünnt und gezählt.
Die in der Tabelle unten angegebenen Ergebnisse zeigen, daß die Menge Thrombin, die durch Hirudin-beschichtete Biomaterialien zurückgehalten wurde, proportional war zur Menge an immobilisiertem Hirudin. Jedes Ergebnis ist der Mittelwert von 4 Bestimmungen. SR + EP¹ und SR + EP⁵ geben SR-Proben an, die mit dem Ethanolamin-Polymer beschichtet waren, zugegeben mit 1,0 bzw. 5 μg/cm². N. A. bedeutet nicht getestet. Kontrollexperimente wurden durchgeführt, indem Thrombin zu nicht-beschichteten Biomaterialien zugegeben wurde, und die Mengen Thrombin, die sich an nicht-beschichtetes PE, PU und SR banden, betrugen 0,01, 0,012 bzw. 0,006 μg/cm². Vergleiche der Thrombinbindung an nicht-beschichtetes PE und PU gegenüber denselben Biomaterialien, die mit 25 μg/cm² Hirudin-Polymer beschichtet sind, zeigen, daß die letzteren 200- bis 23-mal größere Thrombin-Bindung förderten. Schließlich zeigen die Ergebnisse mit SR, das mit dem Ethanolamin-Polymer beschichtet ist, daß die Hirudin-Einheit essentiell für die Bindung von Thrombin ist.
Beispiel 3
Heparin-Polymer
A. Synthese von N-Succinimidyl-6-maleimidohexanoat
6-Maleimidohexansäure, 20,0 g (94,7 mmol), wurde in 100 ml Chloroform gelöst, gefolgt von der Zugabe von 60,1 g (0,473 mol) Oxalylchlorid. Die resultierende Lösung wurde dann für 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das überschüssige Oxalylchlorid wurde unter verringertem Druck entfernt und das resultierende Säurechlorid wurde azeotrop mit 4 × 25 ml Chloroform destilliert, um das überschüssige Oxalylchlorid zu entfernen. Das Säurechloridprodukt wurde in 100 ml Chloroform gelöst, gefolgt von der Zugabe von 12,0 g (0,104 mol) NHS und einer langsamen Zugabe von 11,48 g (0,113 mol) TEA. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Nach Waschen der Reaktionsmischung mit 4 × 100 ml Wasser wurde die Chloroformlösung über Natriumsulfat getrocknet. Entfernen von Lösemittel ergab 24,0 g Produkt für eine 82% Ausbeute. Analyse auf einem NMR-Spektrometer war konsistent mit dem gewünschten Produkt, und es wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
B. Synthese eines photoreaktiven Polyacrylamids, das Hydrazid-Liganden enthält (Hydrazid-Polymer)
Acrylamid, 8,339 g (0,117 mol), wurde in 112 ml THF gelöst, gefolgt von 0,241 g (1,50 mmol) AIBN, 0,112 ml (0,74 mmol) TEMED, 1,284 g (3,70 mmol) BBA-APMA (hergestellt, wie hierin beschrieben) und 0,377 g (1,2 mmol) N-Succinimidyl-6-maleimidohexanoat (hergestellt, wie hierin beschrieben). Die Lösung wurde mit einer Heliumspülung für 4 Minuten, gefolgt von einer Argonspülung für 4 Minuten, von Sauerstoff befreit. Das verschlossene Gefäß wurde dann über Nacht bei 55°C erhitzt, um die Polymerisation abzuschließen. Das ausgefällte Polymer wurde durch Filtration isoliert und wurde durch Rühren für 30 Minuten mit 100 ml THF gewaschen. Das Endprodukt wurde durch Filtration gewonnen und in einem Vakuumofen getrocknet, um 9,64 g Feststoff, eine 96% Ausbeute, zu liefern.
Das obige Polymer (1,0 g) wurde in 50 ml 0,05 M Phosphatpuffer bei pH 8 gelöst und diese Lösung wurde zu einer zweiten Lösung zugegeben, die 0,696 g (5,89 mmol) Oxalsäuredihydrazid in 50 ml 0,05 M Phosphatpuffer bei pH 8 enthielt. Die vereinigten Lösungen wurden über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Produkt wurde in Dialyse gegen entionisiertes Wasser unter Verwendung eines Dialyseschlauches mit einem Molekulargewichtsschnitt von 6.000 bis 8.000 gegeben. Nach sechsmaligem Wechsel des Wassers über zwei Tage wurde das Polymer durch Lyophilisation isoliert, um 850 mg Produkt zu ergeben. Eine Analyse auf Hydrazidgruppen auf diesem Polymer ergab einen Wert von 0,0656 mol NH₂/g Polymer, 55% der Theorie.
C. Synthese eines photoreaktiven Polyacrylamids, das Heparin-Liganden enthält (Heparin-Polymer)
Es ist bekannt, daß eine kontrollierte Periodat-Oxidation der Uronsäure-Reste, die in Heparin vorhanden sind, funktionelle Aldehydgruppen erzeugen wird, während vernünftige Heparin-Aktivität beibehalten wird. Nicht-gebleichtes Heparin mit einer Aktivität von 152 Einheiten/mg (von Celsus Laboratories, Cincinnati, OH) wurde mit 250 mg/ml in 0,1 M Acetatpuffer (pH 5,5) gelöst und mit Natriumperiodat bei 200 mg/ml für 30 Minuten oxidiert, um freie Aldehydgruppen zu erzeugen. Übriges Periodat wurde durch die Zugabe von überschüssigem Methylenglykol inaktiviert. Das Ethylenglykol und Reaktionsprodukte mit kleinem Molekulargewicht wurden dann durch Dialysieren über Nacht bei 4° gegen 0,1 M Acetatpuffer (pH 5,5) unter Verwendung eines Spektra/Por-Dialyseschlauches mit einem Molekulargewichtsschnitt von 6.000 (von Spectrum Medical Industries) entfernt. Das oxidierte Heparin behielt 95 Einheiten/mg Aktivität zurück.
Die Konzentration von oxidiertem Heparin wurde auf 15 mg/ml in 0,1 M Acetatpuffer (pH 5,5) eingestellt und wurde über Nacht mit einem gleichen Volumen 20 mg/ml Photopolyhydrazid in Wasser bei Raumtemperatur umgesetzt. Das Heparin-Polymer wurde verwendet, um Biomaterialien ohne weitere Reinigung zu beschichten.
D. Immobilisierung von Heparin-Polymer auf regenerierter Cellulosemembran
Das Heparin-Polymer wurde synthetisiert wie hierin beschrieben und auf regenerierten Cellulosemembranen (RC-Membranen) mit einer Porengröße von 0,45 mm immobilisiert. RC-Membranen mit einem Durchmesser von einem Inch wurden mit Heparin-Polymer für 50 Minuten inkubiert, luftgetrocknet und dann bei 45 Sekunden auf jeder Seite bestrahlt. Die Scheiben wurden zunächst in 10 × PBS und dann in PBS gewaschen, um nicht-gebundenes Heparin-Polymer zu entfernen.
E. Bewertung der Thrombin-Hemmung durch Heparin-beschichtete Membranen
Die Antithromboseaktivität von Heparin beruht auf seiner Hemmung von Thrombin, das eine Protease ist, von der bekannt ist, daß sie an der Gerinnungskaskade teilnimmt. Heparin hemmt die Thrombinaktivität zunächst durch Bindung an Antithrombin III (ATIII). Dann bindet sich der Heparin/ATIII-Komplex an Thrombin und inaktiviert dieses, woraufhin das Heparin freigesetzt wird und sich an ein weiteres ATIII binden kann. Der Test auf Hemmung von Thrombin durch immobilisiertes Heparin wurde durchgeführt, indem die Spaltung eines chromogenen Peptidsubstrats durch Thrombin gemessen wurde, und verwendete zuvor beschriebene Methoden.
Jeder Test wurde in 1 ml PBS durchgeführt, der 0,85 mg BSA (Sigma Chemical Co.), 10 mU menschliches Thrombin (Sigma Chemical Co.), 100 mU/ml ATIII (Baxter Biotech, Chicago, IL) und 0,17 μmol homogenes Thrombinsubstrat S-2238 (Kabi Pharmacia, Franklin, OH) enthielt. Zu dieser Testlösung wurde entweder nicht-beschichtete oder Heparin-beschichtete Membranen (um Heparinaktivität auf den Membranen zu bewerten) oder Standardkonzentrationen an Heparin (um Standardkurven des Heparingehaltes gegen Extinktion zu erzeugen) zugegeben. Die Mengen Heparin, die zugegeben wurden, reichten von 2,5 bis 25 mU. Die durch das Thrombin vermittelte Spaltung des S-2238 erzeugte Farbe, gemessen als Extinktion bei 405 nm, wurde unter Verwendung eines Spektrophotometers nach 2 Stunden Inkubation bei 37°C abgelesen. Die Extinktion stand in direktem Verhältnis zur Aktivität des Thrombins und somit in umgekehrtem Verhältnis zum Umfang der Aktivierung von ATIII, induziert durch das Heparin in Lösung oder immobilisiert auf der Oberfläche des Substrats. Die Aktivität von oberflächengebundenem Heparin wurde berechnet, indem die Extinktionswerte, die mit den Membranen erzeugt wurden, mit den Extinktionswerten, die mit bekannten Mengen an zugegebenem Heparin erzeugt wurden, verglichen wurden.
Dieser Test wurde dann verwendet, um Heparinaktivität zu bewerten, die auf den beschichteten und nicht-beschichteten RC-Membranen vorlag. Die beschichtete Membran hatte eine Heparinaktivität von 255 mU/cm², wohingegen die nicht-beschichtete < 0,1 mU/cm² hatte.
Beispiel 4
Lysin-Polymere
A. Synthese von N-α-[6-(Maleimido)hexanoyl]lysin.
6-Maleimidohexansäure, 2,24 g (10,6 mmol) (hergestellt wie beschrieben in Beispiel 1), wurde in 10,76 g (84,8 mmol) Oxalylchlorid gelöst und als eine reine Lösung für 4 Stunden bei Raumtemperatur gelöst. Das überschüssige Oxalylchlorid wurde dann unter verringertem Druck abgezogen und das resultierende Säurechlorid wurde in 25 ml Methylenchlorid gelöst. Diese Lösung wurde unter Rühren zu einer Lösung von 3,60 g (10,6 mmol) N-ε-t-BOC-Lysin-t-butylester-Hydrochlorid (Bachem California) in 25 ml Methylenchlorid und 3,21 g (31,7 mmol) TEA zugegeben. Die resultierende Mischung wurde über Nacht unter Stickstoff gerührt. Danach wurde die Mischung mit Wasser behandelt und die organische Schicht wurde abgetrennt und über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde entfernt und das Produkt wurde auf einer Silicagel-Flashchromatographiesäule unter Verwendung eines Lösemittelgradienten 0–5% Methanol in Chloroform gereinigt. Das Pooling der gewünschten Fraktionen und Verdampfen von Lösemittel ergab 5,20 g Produkt (98% Ausbeute). Analyse auf einem NMR-Spektrometer war konsistent mit dem gewünschten Produkt.
Das geschützte Aminosäurederivat, 0,566 g (1,14 mmol), wurde in 5 ml Trifluoressigsäure unter Rühren gelöst. Nach Rühren für 4 Stunden bei Raumtemperatur wurde das Lösemittel unter verringertem Druck abgezogen. Das resultierende Öl wurde mit Ether trituriert, um restliche Trifluoressigsäure zu entfernen, um 3,73 mg Produkt für eine 98% Ausbeute zu ergeben. Analyse auf einem NMR-Spektrometer war konsistent mit dem gewünschten Produkt.
B. Synthese eines photoreaktiven Polyacrylamids, das ε-Aminolysin-Liganden enthält (Lysin-Polymer).
Acrylamid (0,22 g, 3,10 mmol), BBA-APMA (0,014 g, 0,039 mmol) und N-α-[6-(Maleimido)hexanoyl]lysin (0,266 g, 0,784 mmol; hergestellt wie hierin beschrieben) wurden in 7,3 ml trockenem DMSO gelöst. Um die Polymerisation zu initiieren, wurden 8 mg (0,047 mmol) AIBN und 4,0 μl TEMED zugegeben, gefolgt von Spülen mit Stickstoff, um allen Sauerstoff zu entfernen. Die Mischung wurde dann bei 55°C für 16 Stunden erhitzt, gefolgt vom Abziehen des DMSO unter verringertem Druck. Das Produkt wurde in entionisiertem Wasser gelöst und 3 Tage lang unter Verwendung eines Schlauches mit einem Molelculargewichtsschnitt (MWCO) von 6–8 K gegen entionisiertes Wasser dialysiert. Die resultierende Lösung wurde lyophilisiert, um 160 mg Produkt zu ergeben.
C. Erzeugung von Lysin-Polymerbeschichtungen auf Polyurethan (PU).
PU-Blätter wurden in 1 × 1 cm-Stücke geschnitten, mit IPA gewaschen und luftgetrocknet. Um die Benetzung der Lysin-Polymerlösung auf PU zu verbessern, wurden die PU-Stücke mit Argonplasma bei 250 Watt, 0,25 torr für 1 Minute behandelt. Die PU-Stücke wurden dann in eine wäßrige Lösung von Lysin-Polymer (hergestellt wie hierin beschrieben, 1 mg/ml) für 5 Minuten eingetaucht, luftgetrocknet und für 30 Sekunden bestrahlt. Die Proben wurden dann über Nacht gewaschen (mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4, die 1% Tween 20 enthielt), um nicht-gebundenes Lysin-Polymer zu entfernen. Die beschichteten PU-Stücke wurden bis zur Bewertung in PBS aufbewahrt, das 0,02% Natriumazid enthielt.
D. Quantifizierung von Lysin-Polymerbeschichtungen.
Lysin-Polymer (hergestellt wie oben beschrieben) wurde über reduktive Methylierung radioaktiv markiert und verwendet, um die auf Polyurethan immobilisierten Gehalte zu quantifizieren. Das tritiierte Lysin-Polymer wurde auf PU-Stücke aufgebracht, mit oder ohne Bestrahlung, um die Dichte von Lysin-Polymer zu bestimmen, das immobilisiert war. Nach dem Waschvorgang wurden Proben in Soluene-350 gelöst und in Hionic Fluor (jeweils von Packard Instrument Co., Meriden, CT) gezählt. Die Tabelle unten zeigt die immobilisierten Gehalte (±SEM), ausgedrückt in μg/cm² und nmol/cm² Lysin-Einheit. Jeder Gehalt ist der Durchschnittswert von 4 Replikaten. Die Ergebnisse zeigen, daß 1,51 μg/em² nach Bestrahlung immobilisiert sind, was mehr als ausreichend ist, um eine einschichtige Beschichtung herzustellen, und 3,8-mal soviel Polymer ist, wie mit der adsorbierten Kontrolle zurückbehalten wurde.
E. Bewertung der Plasminogenbindung durch Lysin-beschichtetes Polyurethan.
Andere haben die kovalente Kopplung von Lysin an mit Silan derivatisiertes Glas beschrieben und es wurde berichtet, daß das resultierende mit Lysin derivatisierte Glas Plasminogenbindung fördert, wobei das gebundene Lysin signifikante proteolytische Aktivität zeigte. Man erwartet, daß eine solche Oberfläche verbesserte Beständigkeit gegen Thrombusbildung zeigt, wenn sie mit Blut in Kontakt gebracht wird. Die in früheren Studien verwendete Beschichtungschemie setzte einen kurzen Spacer ein und war auf Glas als eine Oberfläche beschränkt, wohingegen das photoreaktive Lysin-Polymer mit hohen Dichten auf einen breiten Bereich von Biomaterialien aufgebracht werden kann.
Die Lysin-Einheit in Lysin-Polymer ist über die α-Aminogruppe an die Polymer-Hauptkette gekoppelt, und die ε-Aminogruppe ist frei, Plasminogen zu binden. Daher wird erwartet, daß PU, das mit dem Lysin-Polymer beschichtet ist, Thrombusbildung durch reversible Bindung von Plasminogen aus Blut hemmt, wobei das gebundene Plasmin proteolytische Aktivität zeigt, die Fibrin spaltet und Fibringerinnselbildung auf der beschichteten Oberfläche verhindert.
Beispiel 5
Prostaglandin-Polymere
A. Synthese eines photoreaktiven Polyacrylamids, das primäre Amin-Liganden enthält (Amin-Polymer)
Eine Lösung von Acrylamid (7,46 g, 105,1 mmol), APMA-HCl (2,14 g, 11,9 mmol) und BBA-APMA (0,837 g, 2,39 mmol) wird in 170 ml DMSO hergestellt. Zu dieser Lösung wird AIBN (0,246 g, 1,50 mmol) und TEMED (0,131 g, 1,13 mmol) zugegeben. Die Lösung wird dann durch Spülen mit Heliumgas für einen Zeitraum von 10 Minuten von Sauerstoff befreit und wird verschlossen und für 18 Stunden in einen Ofen mit 55°C gegeben, um die Polymerisation zu vervollständigen. Die Polymerlösung wird mit Wasser verdünnt und gegen entionisiertes Wasser unter Verwendung eines Dialyseschlauches mit einem MWCO von 12.000–14.000 dialysiert, um Lösemittel, nicht-umgesetzte Monomere und Oligomere mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen. Das Endprodukt wird durch Lyophilisation isoliert und die Photogruppen-Beladung wird durch UV-Extinktion bei 265 nm bestimmt. Der Amin-Gehalt des Polymers wird unter Verwendung einer Trinitrobenzolsulfonat(TNBS)-Methode bestimmt. Die Photogruppen- und Amin-Beladung kann durch Einstellen der Menge an Monomeren, die in der Polymerisation verwendet wird, verändert werden.
B. Synthese eines photoreaktiven Polyacrylamids, das Prostaglandin E₁-Liganden enthält (Prostaglandin E₁-Polymer).
Eine Lösung von Prostaglandin E₁ (Sigma Chemical Co.) (30 mg, 0,0846 mmol) in 5 ml trockenem 1,4-Dioxan wird hergestellt und NHS (10,7 mg, 0,0931 mmol) und DCC (26,2 mg, 0,127 mmol) werden zur Lösung zugegeben. Die Lösung wird über Nacht bei Raumtemperatur unter Bildung des 1,3-Dicyclohexylharnstoff(DCU)-Nebenprodukts gerührt.
Der Feststoff wird durch Filtration entfernt und der Filterkuchen wird mit 1,4-Dioxan gespült. Das Lösemittel wird unter verringertem Druck abgezogen und das resultierende Produkt wird unter trockenen Bedingungen aufbewahrt und ohne weitere Reinigung verwendet.
Das Amin-Polymer (synthetisiert wie oben beschrieben) wird in DMSO mit einer Konzentration von 10 mg/ml gelöst, gefolgt von der Zugabe von 1,5 Äquivalenten des NOS-derivatisierten Prostaglandins E₁, relativ zum Amin-Gehalt der Amin-Polymerlösung. Fünf Äquivalente Triethylamin werden zugegeben, um zu helfen, die Reaktion zu katalysieren. Nach einer Reaktion über Nacht wird die Polymerlösung in die Dialyse gegen entionisiertes Wasser unter Verwendung eines Dialyseschlauches mit einem MWCO von 12.000–14.000 gegeben, um überschüssige Reaktanten mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen. Das Produkt wird durch Lyophilisation isoliert.
C. Synthese eines photoreaktiven Polyacrylamids, das Carbacyclin-Liganden enthält (Carbacyclin-Polymer).
Eine Lösung von Carbacyclin (Sigma Chemical Co.) (5 mg, 0,0143 mmol) in 2 ml trockenem 1,4-Dioxan wird hergestellt und NHS (1,8 mg, 0,0157 mmol) und DCC (4,4 mg, 0,0215 mmol) werden zur Lösung zugegeben. Die Mischung wird über Nacht bei Raumtemperatur unter Bildung des DCU-Nebenproduktes gerührt. Der Feststoff wird durch Filtration entfernt und der Filterkuchen wird mit 1,4-Dioxan gespült. Das Lösemittel wird unter verringertem Druck abgezogen und das resultierende Produkt wird unter trockenen Bedingungen aufbewahrt und ohne weitere Reinigung verwendet.
Das Amin-Polymer (synthetisiert wie oben beschrieben) wird in DMSO mit einer Konzentration von 10 mg/ml gelöst, gefolgt von der Zugabe von 1,5 Äquivalenten des NOS-derivatisierten Carbocyclins, relativ zum Amin-Gehalt der Amin-Polymerlösung. Fünf Äquivalente TEA werden zugegeben, um zu helfen, die Reaktion zu katalysieren. Nach einer Übernachtreaktion wird die Polymerlösung in die Dialyse gegen entionisiertes Wasser unter Verwendung eines Dialyseschlauches mit einem MWCO von 12.000–14.000 gegeben, um überschüssige Reaktanten mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen. Das Produkt wird durch Lyophilisation isoliert.
D. Prostaglandin-Polymerbeschichtungen
Jedes Prostaglandin-Polymer (synthetisiert wie oben beschrieben) wird auf 5 mg/ml in 50% (v/v) IPA in Wasser verdünnt und zu Biomaterialproben (Polyurethan, Silikongummi und Polyethylen) zugegeben. Das Volumen an Prostaglandin enthaltender Polymerlösung, das zu jedem Polymer zugegeben wird, ist gerade ausreichend, um die Oberfläche jedes Biomaterials zu überziehen (etwa 100 ml/cm²). Die Polymerlösung läßt man auf jeder Probe trocknen, woraufhin jede Probe für 1–2 Minuten bestrahlt wird.
Sowohl Prostaglandin E₁ als auch Carbacyclin (das ein stabiles Analog von Prostaglandin I₂ ist; PGI₂) sind dafür bekannt, Plättchenaktivierung und Thrombusbildung zu hemmen. Daher wird erwartet, daß die erzeugten Prostaglandin-Beschichtungen Plättchenaktivierung und Thrombusbildung auf Biomaterialien hemmen.
Beispiel 6
Protein A-Polymer
A. Synthese von N-Succinimidyl-6-methacrylamidohexanoat (MAm-EAC-NOS)
Die ε-Aminocapronsäure (EAC), 2,00 g (15,25 mmol), wurde zu einem trockenen Rundkolben zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 2,58 g (16,73 mmol) Methacrylsäureanhydrid. Die resultierende Mischung wurde bei Raumtemperatur für zwei Stunden gerührt, gefolgt von Trituration mit Hexan. Das Hexan wurde dekantiert und das Produkt wurde zwei zusätzliche Male trituriert, um 3,03 g des acylierten Produktes (Ausbeute > 99%) zu ergeben. Ohne weitere Reinigung wurde das Produkt in 50 ml Chloroform gelöst, gefolgt von der Zugabe von 1,922 g (16,7 mmol) NHS und 6,26 g (30,3 mmol) DCC. Die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Schutz vor Feuchtigkeit gerührt. Der resultierende Feststoff wurde durch Filtration entfernt und der Filterkuchen wurde mit Chloroform gespült. Das Lösemittel wurde unter verringertem Druck mit 5 ppm des Monomethylethers von Hydrochinon (MEHQ), um Polymerisation zu verhindern, abgezogen. Der Rückstand, 4,50 g, wurde erneut in 45 ml trockenem THF gelöst und die Lösung wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
B. Synthese eines photoreaktiven Polyacrylamids, das Protein A-Liganden enthält (Protein A-Polymer).
Um das latente reaktive NOS-Polymer herzustellen, wurde Acrylamid (1,0 g, 14,1 mmol) in 15 ml trockenem THF gelöst. Zu dieser Lösung wurden 44 mg (0,149 mmol) MAm-EAC-NOS (synthetisiert wie hierin beschrieben) und 158 mg (0,45 mmol) BBA-APMA (synthetisiert wie beschrieben in Beispiel 1) zugegeben. Für den Initiator wurden 500 mg (3,04 mmol) AIBN zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 50 μl TEMED. Durch die Lösung wurde Stickstoff geleitet und sie wurde bei 45°C für 18 Stunden inkubiert, um Polymerisation zu ermöglichen. Das unlösliche Polymer wurde durch Filtration gesammelt und dann in trockenem DMSO gelöst. Das Polymer wurde ausgefällt, indem es tropfenweise zu gerührtem Ethanol zugegeben wurde, und wurde dann durch Filtration gesammelt und für die Aufbewahrung bis zur Verwendung getrocknet. Die Produktausbeute betrug 0,906 g.
Um Protein A an das latente reaktive NOS-Polymer zu koppeln, wurde rekombinantes Staphylococcen-Protein A (von Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, CA) mit 10 mg/ml in 0,1 M Carbonatpuffer, pH 9, gelöst. Das latente reaktive NOS-Polymer wurde mit 100 mg/ml in 50 mM Phosphatpuffer, pH 6,8, gelöst. Dann wurden 200 μl (20 mg) des NOS- Polymers zu 1 ml (10 mg) der Protein A-Lösung zugegeben und die Mischung wurde über Nacht bei 4°C inkubiert. Bewertung durch Standard-Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) zeigte, daß mehr als 80% des zugegebenen Proteins A in das resultierende Protein A-Polymer eingebaut wurden. Die Protein A-Polymerlösung wurde verwendet, um Biomaterialien ohne weitere Reinigung zu beschichten.
C. Erzeugung von Protein A-Polymerbeschichtungen auf Biomaterialien.
Das Protein A-Polymer wurde dann an zwei Typen von Membranen photogekoppelt, Polysulfon(PSO)-Membranen mit einer Porengröße von 0,2 mm (HT-200-Membranen von Gelman Sciences, Ann Arbor, MI) und Membranen aus regenerierter Cellulose (RC) mit einer Porengröße von 0,45 mm (No. SM18606 von Sartorius, Edgewood, NY). Jede Membran war in der Form einer Scheibe, die 1 Inch im Durchmesser war. Vor der Zugabe des Protein A-Polymers wurde jede Membran zunächst in 1:1 (v/v) Isopropanol:0,1 N HCl und dann in Wasser gewaschen.
Das Protein A-Polymer (geschätzte Konzentration 8,67 mg/ml) wurde dann zu jedem Membran-Typ zugegeben (1 ml Polymer pro 4–6 Scheiben) und über Nacht bei 4°C inkubiert. Dann wurden die Scheiben aus der Polymerlösung entnommen, luftgetrocknet und für 1 Minute auf jeder Seite in einer Kammer mit kontrollierter Temperatur (bei 10°C) bestrahlt. Die Bestrahlung wurde mit einer Dymax-Lampe durchgeführt, wie hierin beschrieben.
Die Membranen wurden dann gewaschen, um nicht-gebundenes Protein A-Polymer zu entfernen. Die Waschung wurde durchgeführt, indem die beschichteten Scheiben in Membranhalter gegeben wurden (MAC-25-Halter von Amicon, Beverly, MA), wobei 2–4 Membranen in jeden Halter gegeben wurden. Die Membranen wurden dann nacheinander mit: 1) 10 ml 0,1 M Glycin in 2% Essigsäure, 2) 10 ml 10 × PBS und 3) 30 ml PBS gewaschen. Die gewaschenen Membranen wurden dann bis zur Verwendung in PBS aufbewahrt, das 0,05% Natriumazid enthielt.
D. Bewertung der Aktivität von Protein A-Polymerbeschichtungen auf Biomaterialien.
Protein A ist ein bakterielles Protein, das sich spezifisch an die F_c-Region von Immunoglobulin G(IgG)-Molekülen bindet. Die Aktivität der Protein A-Beschichtung auf jedem Membran-Typ wurde durch Testen auf Bindung durch zugegebenes IgG bewertet. Nicht-beschichtete Membranen wurden als Kontrollen verwendet. Für diesen Test wurden 2 ml Kaninchenserum 1:5 in PBS verdünnt und durch die beschichteten Membranen mit 2–3 ml/min perfundiert. Die Membranen wurden dann mit PBS gewaschen, um nicht-gebundenes IgG zu entfernen. Das gebundene IgG wurde dann mit 0,1 M Glycin in 2% Essigsäure eluiert. Die Menge an eluiertem IgG wurde bestimmt, indem die Extinktion des Eluanten bei 280 nM gemessen und ein Extinktionskoeffizient (ε₂₈₀) von 1,4 ml/cm-mg verwendet wurde, um die mg eluiertes IgG zu berechnen. Auch wurde das IgG, das aus jedem Membran-Typ eluierte, durch reduzierte SDS-PAGE-Analyse auf Reinheit bewertet. Bei den mit Protein A-Polymer beschichteten Biomaterialien war das eluierte Protein mehr als 90% leichte und schwere Ketten von IgG. Im Gegensatz dazu war das Hauptprotein, das aus nicht-beschichteten Kontrollen eluierte, Albumin.
Drei Scheiben von jedem Typ (PSO oder RC) wurden in einen MAC-25-Halter gegeben und unter Verwendung dieses Verfahrens bewertet. Die Tabelle unten zeigt die durchschnittlichen Mengen IgG, die aus jedem Membran-Typ eluierten; wobei jeder Wert der Mittelwert von 10 Bestimmungen (10 Zyklen) für 3 PSO-Scheiben und der Mittelwert von 3 Bestimmungen (3 Zyklen) für 3 RC-Scheiben war.
Diese Ergebnisse zeigen, daß jeder Typ von beschichteter Membran 34- bis 64-mal mehr IgG bindet als dies ihre nicht-beschichtete Kontrolle tut. Auch hat Protein A im Polymer eine stabile Konformation und ist fest gebunden, da keine Abnahme in der IgG-Elution nach 10 Zyklen von Serumzugabe und IgG-Elution auftritt.
Beispiel 7
IgG-Polymere
A. Synthese eines photoreaktiven Polyacrylamids, das N-Oxysuccinimid-Liganden enthält (NOS-Polymer).
Acrylamid, 3,897 g (0,0548 mol), wurde in 53 ml THF gelöst, gefolgt von 0,115 g (0,70 mmol) AIBN, 0,053 ml TEMED, 0,204 g (0,58 mmol) BBA-APMA (hergestellt wie beschrieben in Beispiel 1) und 0,899 g (2,9 mmol) N-Succinimidyl-6-maleimidohexanoat (hergestellt wie in Beispiel 3). Die Lösung wurde mit einer Heliumspülung für 4 Minuten, gefolgt von einer Argonspülung für 4 Minuten, von Sauerstoff befreit. Das verschlossene Gefäß wurde dann über Nacht bei 55°C erhitzt, um die Polymerisation zu vervollständigen. Das ausgefällte Polymer wurde durch Filtration isoliert und wurde durch Rühren für 30 Minuten mit 100 ml THF gewaschen. Das Endprodukt wurde durch Filtration gewonnen und in einem Vakuumofen getrocknet, um 4,688 g Feststoff, eine 94% Ausbeute, zu liefern.
B. Synthese und Immobilisierung eines photoreaktiven Polyacrylamids, das IgG-Liganden enthält.
IgG-Moleküle sind eine Klasse von Antikörpermolekülen, die sich an spezifische Antigene binden. Tritiiertes Kaninchen-anti-Glucoseoxidase-IgG wurde verwendet, so daß die Tritium-Markierung verwendet werden konnte, um den immobilisierten Gehalt an IgG zu quantifizieren, und Glucoseoxidasebindung bewertet werden konnte, um IgG-Aktivität zu testen. NOS-Polymer (50 mg) (hergestellt, wie hierin beschrieben) wurde zu 100 mg [³H] IgG (in 100 ml 0,1 M Natriumcarbonat bei pH 9) zugegeben und über Nacht bei 4°C reagieren gelassen. Das IgG-Polymer wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
Polyester-Membran (Accuwick von Pall Corporation) wurde in 6 mm-Scheiben geschnitten und 4 μl-Aliquote des IgG-Polymers wurden auf jede von 19 Scheiben getüpfelt. Drei Scheiben wurden als Kontrollen zurückbehalten, die weder bestrahlt noch gewaschen wurden. Acht Scheiben wurden für 1 Minute bestrahlt und 8 Scheiben wurden nicht-bestrahlt zurückbehalten. Die letzteren 8 bestrahlten und 8 nicht-bestrahlten Scheiben wurden mit 25 mM Bis(2-hydroxyethyl)iminotris(hydroxymethyl)methan (BIS-TRIS) bei pH 7,2 gewaschen, das 1% Lactose, 1% BSA und 0,1% Brij 3 5 enthielt.
Um die immobilisierten Gehalte an IgG-Polymer zu quantifizieren, wurden die 3 Kontrollscheiben (nicht-beschichtet, nicht-gewaschen) und jeweils 3 der bestrahlten und nicht-bestrahlten Zustände in Soluene (0,5 ml) gelöst und in 5 ml Hionic Fluor gezählt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle unten angegeben. Ein Vergleich der bestrahlten (gewaschenen) zu den Kontrollen (nicht-beschichtet, nicht-gewaschen) zeigt, daß 75% des zugegebenen IgG-Polymers nach Bestrahlung zurückgehalten wurden. Im Gegensatz dazu wurden, bei den nicht-bestrahlten Proben, nur 12,5% der zugegebenen IgG-Polymere zurückgehalten.
Um die Aktivität des immobilisierten IgGs zu quantifizieren, wurden die übrigen 5 bestrahlten und 5 nicht-bestrahlten Scheiben mit Glucoseoxidase bei 0,1 mg/ml in PBS für 1 Stunde inkubiert und 5-mal mit TNT (0,05 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween-20) gewaschen. Jede Scheibe wurde dann in Vertiefungen einer 96-Well-Mikrotiterplatte überführt und getestet, indem 200 μl 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin(TMB)-Chromogenmischung (100 μl TMB-Reagens von Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., 100 μl 0,2 M Natriumphosphat pH 5,5, 10 mg Glucose und 4 μg Meerrettichperoxidase) zugegeben wurden, und man sich die Farbe für 20 Minuten entwickeln ließ. Aliquote (100 μl) wurden dann auf eine separate Mikrotiterplatte überführt und die Extinktion wurde bei 650 nm abgelesen. Ein Vergleich der bestrahlten mit den nicht-bestrahlten Proben zeigt, daß 61% mehr Aktivität durch die bestrahlten Proben exprimiert wurde.
Beispiel 8
Streptavidin-Polymer
A. Synthese eines photoreaktiven Polyacrylamids, das Streptavidin-Liganden enthält
Streptavidin (von InFerGene Company, Benicia, CA) wurde an das NOS-Polymer (hergestellt wie beschrieben in Beispiel 6) gekoppelt. Streptavidin (15 mg) wurde in 1,5 ml 0,1 M Carbonatpuffer (pH 9,0) gelöst. Das NOS-Polymer wurde hergestellt und in 5 mM Acetatpuffer (pH 5) bis zu einer Endkonzentration von 100 mg/ml gelöst. Die NOS-Polymerlösung (0,3 ml) wurde zur Streptavidin-Lösung (1,5 ml) zugegeben und die Mischung wurde über Nacht bei 4°C gerührt. Das resultierende Streptavidin-Polymer wurde ohne weitere Reinigung oder Charakterisierung verwendet.
B. Erzeugung von Streptavidin-Polymerbeschichtungen auf Oberflächen
Massive Glasstäbe (3 mm Durchmesser × 3 cm Länge) wurden durch Beschallung in 1:1 (v/v) Aceton in 0,1 N HCl für 30 Minuten gewaschen, in Wasser, Aceton gespült, bei 100°C für 1 Std. getrocknet, abgekühlt und bis zur Verwendung getrocknet aufbewahrt. Bis(trimethoxysilylethyl)benzol (von United Chemical Technologies, Inc., Bristol, PA) wurde auf 10% (v/v) in Aceton verdünnt. Die Stäbe wurden in das Silan-Reagens für 30 Sekunden eingetaucht, luftgetrocknet, für 30 Sekunden in Wasser eingetaucht, entnommen und bei 100°C für 15 Minuten ausgehärtet und mit Aceton gespült.
Die mit Organosilan grundierten Glasstäbe wurden für 30 Sekunden in eine Lösung von Streptavidin-Polymer eingetaucht. Die Glasstäbe wurden aus der Lösung entnommen, an Luft trocknen gelassen und für 30 Sekunden mit einer Dymax-Lampe bestrahlt. Adsorptionskontrollen wurden über dasselbe Protokoll hergestellt, mit der Ausnahme, daß sie nicht bestrahlt wurden. Beide Typen von beschichteten Stäben wurden mit PBS gewaschen, das 0,05% Tween 20 enthielt, um nicht-anhaftendes Streptavidin-Polymer zu entfernen.
C. Bewertung von immobilisiertem Streptavidin-Polymer
Streptavidin ist ein Rezeptor, der sich stark an Biotin als seinen Liganden bindet. Die Aktivität von Streptavidin-Polymerbeschichtung wurde durch Quantifizieren der Bindung von zugegebener, mit Biotin derivatisierter Meerrettichperoxidase (Biotin-HRP, erhalten von Pierce Chemical Company, Rockford, IL) bewertet. Die Glasstäbe wurden für eine Stunde in einer 9 μg/ml Lösung von Biotin-HRP inkubiert. Die Bindung nicht-derivatisierter HRP (zugegeben mit 9 μg/ml) wurde als eine Kontrolle für nicht-spezifische Bindung von HRP an die Glasstäbe bewertet. Die Stäbe wurden dann mit PBS gewaschen, das 0,05% Tween 20 enthielt, um nicht-gebundene HRP zu entfernen, und die relative Aktivität von gebundener HRP wurde mit einem TMB-Peroxidase-Substratsystem (Kirkegaard and Perry Laboratory, Inc., Gaithersburg, MD) bewertet. HRP katalysiert die Oxidation von TMB und erzeugt eine Farbe, die spektrophotometrisch bei 405 nm quantifiziert wird. Jedes Ergebnis ist der Mittelwert von 3 Bestimmungen.
Die Ergebnisse zeigen die erwarteten Trends, wobei die größte Peroxidase-Aktivität auf Stäben beobachtet wurde, die mit photoimmobilisiertem Streptavidin-Polymer beschichtet waren (kovalentem Streptavidin-Polymer) und zu denen Biotin-HRP zugegeben worden war. Das adsorbierte (nicht-bestrahlte) Streptavidin-Polymer erzeugte 3,5-mal weniger Peroxidase- Aktivität und die übrigen Varianten, denen Streptavidin und/oder Biotin fehlte, zeigten wenig Peroxidase-Aktivität.
Beispiel 9
Biotin-Polymer
Das photoreaktive Amin-Polymer (80 mg) (synthetisiert wie beschrieben in Beispiel 5) wird in 2 ml DMSO gelöst. Zur Polymerlösung werden 40 mg Biotinamidocapronsäure-3-sulfo-N-hydroxysuccinimidester (Sigma Chemical Co.) und 0,05 ml Triethylamin zugegeben. Die Lösung wird für zwei Stunden bei Raumtemperatur gemischt, dann gegen entionisiertes Wasser dialysiert, um jegliches Biotin zu entfernen, das nicht an das Polymer gekoppelt ist.
Eine Lösung des Biotin-Polymers (1,0 mg/ml in entionisiertem Wasser) wird auf Vertiefungen einer Polystyrol-Mikrotitrationsplatte aufgebracht und für 1 Stunde inkubiert, wonach die Platte für 1–2 Minuten bestrahlt wird. Die Platte wird dann mit entionisiertem Wasser gewaschen, um nicht-gebundenes Biotin-Polymer zu entfernen.
Biotin ist ein Ligand, der sich an Streptavidin als seinen Rezeptor bindet. Polystyrol-Mikrotitrationsplatten werden mit Biotin-Polymer beschichtet und auf Aktivität durch Testen der Bindung von Streptavidin bewertet. Eine Lösung von Streptavidin wird zu den Platten zugegeben, die mit Biotin-Polymer beschichtet sind, und nicht-gebundenes Streptavidin wird durch Waschen mit entionisiertem Wasser entfernt. Das zurückbehaltene Streptavidin wird durch Zugabe von Biotin-HRP und Bewertung der HRP-Aktivätät quantifiziert.
Beispiel 10
Magainin-Polymer
A. Synthese von Magainin-Peptidmonomer
Magainin-2 wurde in diesem Beispiel verwendet und wurde für BSI von Bachem, Inc. (Torrance, CA) auf Auftrag synthetisiert, wobei zum Carboxylterminus des Peptids ein Cystein hinzugefügt wurde. Die resultierende Sequenz von Magainin bestand aus GIGKFLHSAKKFGKAFVGEIMNSC. Wie beschrieben in Beispiel 1, bezeichnet das unterstrichene C (C) eine nicht-native Aminosäure, die hinzugefügt wurde, um Kopplung über die Sulfhydrylgruppe zu ermöglichen.
Magainin (2,36 μmol) wurde in 0,5 ml entgastem Wasser gelöst. Zu dieser Lösung wurden 2,36 μmol Mal-MAm (gelöst in 20 μl Chloroform) und 0,5 ml Ethanol zugegeben. Die Reaktion wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, woraufhin die Lösung unter Stickstoff getrocknet und in 1 ml Wasser erneut suspendiert wurde. Es wurde bestimmt, daß die gewonnene Magainin-Monomerlösung 5,5 mg/ml Magainin-Einheit aufweist, bestimmt mit dem MicroBCA-Test (Kit von Pierce Chemical Company, Rockford, IL).
B. Synthese von photoreaktivem Polyacrylamid, das Maganinin-Ligand enthält (Magainin-Polymere)
BBA-APMA wurde in einer Konzentration von 10 mg/ml in DMSO gelöst, und Acrylamid wurde in einer Konzentration von 100 mg/ml in Wasser gelöst. Das Magainin-Monomer (0,48 μmol in 220 μl Wasser) wurde nicht gereinigt, nachdem es synthetisiert worden war (wie oben beschrieben). Die geeigneten molaren Mengen BBA-APMA (0,25 μmol in 44 μl THF) und Acrylamid (6,9 μmol in 120 μl Wasser) wurden dann zur Reaktionsphiole zugegeben.
Zusätzliche 300 μl THF wurden zugegeben, und die Mischung wurde durch Wasserabsaugung für 15 Minuten entgast. Ammoniumpersulfat (6,8 μl einer 10% Vorratslösung in Wasser) und TEMED (1,5 μl) wurden zugegeben, um die Polymerisation zu katalysieren. Die Mischung wurde erneut entgast und über Nacht bei Raumtemperatur in einem verschlossenen Exsikkator inkubiert. Das resultierende Magainin-Polymer wurde gegen Wasser bei 4°C dialysiert (unter Verwendung von Spectra/Por-Dialyseschlauch mit einem MWCO von 50.000; von Spectrum, Houston, TX), um nicht-eingebaute Reaktanten zu entfernen, und dann lyophilisiert. Von den 1,2 mg Magainin-Peptid, die verwendet wurden, um das Methacryloyl-Magainin zu synthetisieren, lagen 0,35 mg im löslich gemachten Magainin-Polymer vor.
C. Bewertung von immobilisiertem Magainin-Polymer
Magainin ist ein kationisches Peptid-Antibiotikum, das ursprünglich aus der Haut von Xenopus laevis isoliert wurde. Es ist gegen ein breites Spektrum von Pathogenen aktiv und wirkt an der Oberfläche der Pathogene. Die Aktivität des Magainin-Polymers wurde durch einen Standard-Lösungstest bewertet, der die minimale inhibitorische Konzentration (MIC) von Magainin-Polymer bestimmte, die erforderlich war, um das Wachstum von Bakterien zu verhindern. Die MIC von Magainin-Polymer betrug 50 μg/ml für sowohl Escherichia coli (ATCC No. 25922) als auch für Staphylococcus epidermidis (ATCC No. 12228), wohingegen natives monomeres Magainin (weder in ein Magainin-Monomer oder das Magainin-Polymer eingebaut) eine MIC von 6,25–12,5 μg/ml für E. coli und 25 μg/ml für S. epidermidis aufwies.
Das Magainin-Polymer wird auf 250 μg/ml in 50% (v/v) IPA in Wasser verdünnt und zu Biomaterialproben (PU, SR und PE) zugegeben. Das Volumen an Magainin-Polymerlösung, das zu jedem Polymer zugegeben wird, ist gerade ausreichend, um die Oberfläche jedes Biomaterials zu überziehen (etwa 100 μl/cm²). Die Polymerlösung läßt man auf jeder Probe trocknen, woraufhin jede Probe für 1–2 Minuten bestrahlt wird. Die beschichteten Proben werden in 0,1 N HCl, gefolgt von PBS, gewaschen.
Die antimikrobielle Aktivität von immobilisiertem Magainin-Polymer wird mit einem Zentrifugationstest bewertet. Blätter aus Biomaterialien wurden in Scheiben mit einem Durchmesser von 1,5 cm geschnitten, mit Magainin-Polymer beschichtet und in einzelne Vertiefungen von 24-Well-Kulturplatten gegeben. Bakterien (E. coli und S. epidermidis) werden mit 200–400 koloniebildenden Einheiten pro ml (cfu/ml) in PBS suspendiert. Ein-ml-Aliquote von bakteriellen Suspensionen werden in Vertiefungen gegeben, die mit Magainin beschichtete Biomaterialien enthalten, und die Platten werden bei 3.500 × g bei 4°C für 20 Minuten zentrifugiert, um die Bakterien auf den beschichteten Biomaterial-Scheiben zu sedimentieren. Die Scheiben werden dann in Bakterienkulturplatten aus tryptischem Sojaagar (TSA) gegeben und mit einer dünnen Schicht TSA überzogen. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C werden die Bakterienkolonien, die auf den Scheiben wachsen, gezählt. Es wird erwartet, daß die Magainin-Polymerbeschichtungen bakterielles Wachstum hemmen und das Wachstum von weniger Bakterienkolonien unterstützen als nicht-beschichtete Kontrollen.
Beispiel 11
β-Galactosidase-Polymer
A. Synthese eines photoreaktiven Polyacrylamids, das β-Galactosidase enthält (β-Galactosidase-Polymer)
Eine Mischung, die 50 mg/ml des NOS-Polymers (hergestellt wie beschrieben in Beispiel 6) und 6,4 mg/ml β-Galactosidase (von Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) in 0,1 M Natriumcarbonat, pH 9, enthielt, wurde hergestellt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 1 Stunde reagieren gelassen und bei 4°C über Nacht aufbewahrt. Die resultierende β-Galactosidase-Polymerlösung wurde ohne Reinigung für die Erzeugung quervernetzter Filme verwendet.
B. Erzeugung von quervernetzten Filmen.
Filme wurden gegossen, indem 40 ml-Aliquote der β-Galactosidase-Polymerlösung (synthetisiert wie hierin beschrieben) auf einen Teflon-Block gegeben und jedes Aliquot trocknen gelassen wurde. Die resultierenden Filme wurden für 0,5 oder 4 Minuten bestrahlt, wie oben beschrieben.
C. Test auf Integrität der Filme.
Die Integrität der Filme wurde getestet, indem bestimmt wurde, ob sie ihre Form beibehielten, nachdem sie in eine PBS-Lösung gegeben wurden. Filme, die für 0,5 min bestrahlt waren, lösten sich bei Einwirkung von Kochsalzlösung auf; wohingegen Filme, die für 4 Minuten bestrahlt waren, ihre Form beibehielten. Diese Ergebnisse sind konsistent mit der Lichtaktivierung der BBA-Gruppen, die kovalente Quervernetzung von Erfindungs-Polymermolekülen erzeugen.
Das quervernetzte β-Galactosidase-Polymer wurde 3-mal mit 1 ml PBS gewaschen, um nicht-eingebautes Enzym zu entfernen. Die letzte Waschung (0,2 ml) und der gewonnene Film wurden jeweils auf Enzymaktivität unter Verwendung von o-Nitrophenol-β-D-galactopyranosid (o-NPG) (von Pierce, Rockford, IL) bei 1 mg/ml in Wasser unter Verwendung des Protokolls analysiert, das im „Worthington Enzyme Manual" (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ, 1977) beschrieben ist. Die letzte Waschung zeigte keine β-Galactosidaseaktivität, während der Film das gelbe Nitrophenolprodukt ergab. Dieses Ergebnis zeigte, daß die β-Galactosidase-Einheit aktiv war, nachdem das Erfindungspolymer quervernetzt war, um ein unlösliches Biomaterial zu bilden.
Beispiel 12
DNA-Polymer
Eine Modell-Oligodesoxynucleotid(oligoDNA)-Sonde mit einer Sequenz von Exon 1 des H-2K^b-Gens des Haupthistokompatibilitätskomplexes wurde synthetisiert und als eine Einfangsonde verwendet. Die Sequenz der oligoDNA-Einfangsonde war 5'-GTCTGAGTCGGAGCCAGGGCGGCCGCCAACAGCAGGAGCA-3' und wurde mit einem aliphtischen C12-Spacer am 5'-Ende synthetisiert, der mit einem primären Amin abschloß. Die oligoDNA-Einfangsonde (80 μg oder 6 nmol) wurde über die terminale Aminogruppe auf dem C12-Spacer an 160 μg NOS-Polymer, hierin beschrieben, in 50 mM Phosphatpuffer (pH 8,5, 1 mM EDTA, 0,24 ml Endvolumen) bei Raumtemperatur für 2,5 Stunden gekoppelt. Das resultierende DNA-Polymer wurde ohne weitere Reinigung oder Charakterisierung eingesetzt.
Das DNA-Polymer wurde auf Mikroplattenvertiefungen (Polypropylenplatten von Corning Costar Corporation, Cambridge, MA) mit 10 pmol (in 0,1 ml Lösung) pro Vertiefung aufgebracht und für 10–30 Minuten inkubiert. Die Platten, die DNA-Polymerlösungen enthielten, wurden für 1,5 Minuten mit einer Dymax-Lampe bestrahlt, wie hierin beschrieben, mit der Ausnahme, daß ein Filter verwendet wurde, der Licht mit kürzeren Wellenlängen als 300 nm entfernt. Eine Kontrolle bestand aus oligoDNA-Einfangsonde (10 pmol in 0,1 ml 50 mM Phosphatpuffer, pH 8,5, 1 mM EDTA), die zu Vertiefungen zugegeben, für 2,5 Std. adsorbieren gelassen und nicht bestrahlt wurde. Die Platten wurden mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, die 0,05% Tween 20 in PBS enthielt, gewaschen, um nicht-gebundenes DNA-Polymer oder Kontroll-oligoDNA-Einfangsonde zu entfernen.
Eine Nachweissonde mit einer zur Einfangsonde komplementären Sequenz, hierin beschrieben, wurde mit einem Biotin am 5'-Ende synthetisiert und verwendet, um die Aktivität des immobilisierten DNA-Polymers zu bewerten. Die Sequenz der Nachweissonde war 5'-CCGTGCACGCTGCTCCTGCTGTTGGCGGCCGCCCTGGCTCCGACTCAGAC-3'. Eine Kontroll-Nachweissonde, die aus einer nicht-komplementären Sequenz von Exon 2 des H-2K^b-Gens bestand, wurde ebenfalls mit einer Biotin-Einheit am 5'-Ende synthetisiert.
Die Bindung jeder Nachweissonde wurde getestet, indem nacheinander ein Konjugat von Streptavidin und Meerrettichperoxidase (SA-HRP, erhältlich von Pierce, Rockford, IL) zugegeben und die Aktivität des gebundenen HRPs gemessen wurde. Für diesen Test wurden die beschichteten Platten mit Hybridisierungspuffer (0,75 M NaCl, 0,075 M Citrat, pH 7,0, 0,1% Lauroylsarcosin, 1% Casein und 0,02% Natriumdodecylsulfat) bei 55°C für 30 Minuten blockiert. Komplementäre und nicht-komplementäre Nachweissonden wurden mit 50 fmol pro 0,1 ml Hybridisierungspuffer pro Vertiefung zugegeben und für eine Stunde bei 55°C inkubiert. Die Platten wurden dann mit 0,3 M NaCl, 0,03 M Citrat, pH 7,0, das 0,1% SDS enthielt, für 5 Minuten bei 55°C gewaschen. SA-HRP wurde mit 0,5 μg/ml zugegeben und für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden dann mit 0,05% Tween 20 in PBS gewaschen, gefolgt von der Zugabe von Peroxidasesubstrat (TMB Microwell Peroxidase-Substratsystem von Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) und Messung der Extinktion bei 655 nm auf einer Mikroplatten-Lesegerät (Modell 3550, Bio-Rad Labs, Cambridge, MA). Da die Polypropylenplatten undurchsichtig waren, wurden die umgesetzten Substratlösungen auf Polystyrolplatten überführt, um die Extinktion abzulesen.
Hybridisierungssignale (A₆₅₅) von Polypropylen-Mikrovertiefungen, die mit photoimmobilisiertem DNA-Polymer beschichtet waren, oder adsorbierter oligoDNA-Einfangsonde (n = 3).
Die Ergebnisse in der obigen Tabelle liefern die Hybridisierungssignale von Polypropylen-Mikrovertiefungen, die mit photoimmobilisierten DNA-Polymer oder adsorbierter oligoDNA-Einfangsonde beschichtet waren (n = 3). Diese Ergebnisse zeigen, daß das photoimmobilisierte DNA-Polymer 32-mal mehr komplementäre Nachweissonde bindet, als dies die adsorbierte Kontrolle tut, und keine Beschichtung bindet die nicht-komplementäre Sonde.

Claims

Polybifunktionelles Reagens, das eine Mehrzahl von Molekülen umfasst, wobei jedes eine Polymer-Hauptkette umfasst, die (a) eine Mehrzahl von photoreaktiven Seiteneinheiten, die durch Einwirkung einer geeigneten Energiequelle aktiviert werden können, und (b) zwei oder mehr bioaktive Seitengruppen, die zu spezifischen, nicht-kovalenten Wechselwirkungen mit komplementären Gruppen in der Lage sind, trägt, wobei das Reagens bei Aktivierung der photoreaktiven Einheiten ein vernetztes Material oder eine vernetzte Oberflächenbeschichtung bilden kann, um die Anziehung solcher komplementären Gruppen zu fördern, wobei die Polymer-Hauptkette ein synthetisches Polymer oder Copolymer umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Acrylkunststoffen, Vinylkunststoffen, Nylons, Polyurethanen, Polyethern und biologisch abbaubaren Polymeren besteht, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Polydioxanonen, Polyanhydriden und Polyorthoestern besteht, und wobei das Reagens durch Copolymerisation eines Basismonomers mit Monomeren, die photoreaktive Seiteneinheiten enthalten, und mit Monomeren, die die gewünschte bioaktive Gruppe enthalten, hergestellt wird, um ein Reagens mit einem gewünschten Verhältnis von Polymer-Hauptkette, photoreaktiven Einheiten und bioaktiven Gruppen zu liefern.
Polybifunktionelles Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die photoreaktiven Einheiten aktiviert werden können, um intermolekulare kovalente Bindungen zwischen dem Reagensmolekül und einer Biomaterialoberfläche zu bilden, um eine Beschichtung darauf zu bilden.
Polybifunktionelles Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die photoreaktiven Einheiten aktiviert werden können, um zu ermöglichen, daß einzelne Reagensmoleküle mit benachbarten Reagensmolekülen vernetzen, um unabhängige Filme oder Grundmaterialien aus vernetztem Material zu erzeugen.
Polybifunktionelles Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die bioaktiven Gruppen jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Proteinen, Peptiden, Aminosäuren, Kohlehydraten und Nukleinsäuren besteht, wobei jede nicht-kovalent an spezifische und komplementäre Abschnitte von Molekülen oder Zellen binden kann.
Polybifunktionelles Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die bioaktiven Gruppen jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Antithrombosemitteln, Zellanheftungsfaktoren, Rezeptoren, Liganden, Wachstumsfaktoren, Antibiotika, Enzymen und Nukleinsäuren besteht.
Polybifunktionelles Reagens nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die bioaktiven Gruppen Antithrombosemittel umfassen, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Heparin, Hirudin, Lysin, Prostaglandinen, Streptokinase, Urokinase und Plasminogenaktivator besteht.
Polybifunktionelles Reagens nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die bioaktiven Gruppen Zellanheftungsfaktoren umfassen, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Oberflächen-Adhäsionsmolekülen und Zell-Zell-Adhäsionsmolekülen besteht.
Polybifunktionelles Reagens nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die bioaktiven Gruppen Oberflächen-Adhäsionsmoleküle umfassen, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die Laminin, Fibronectin, Collagen, Vitronectin, Tenascin, Fibrinogen, Thrombospondin, Osteopontin, von-Willibrand-Faktor und Knochen-Sialoprotein und aktiven Domänen davon besteht.
Polybifunktionelles Reagens nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die bioaktiven Gruppen Zell-Zell-Adhäsionsmoleküle umfassen, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus N-Cadherin und P-Cadherin und aktiven Domänen davon besteht.
Polybifunktionelles Reagens nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die bioaktiven Gruppen Wachstumsfaktoren umfassen, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Fibroblasten-Wachstumsfaktor, epidermalem Wachstumsfaktor, Plättchen-entstammenden Wachstumsfaktoren, transformierenden Wachstumsfaktoren, Gefäßendothel-Wachstumsfaktor, knochenmorphogenetischen Proteinen und anderen Knochenwachstumsfaktoren und neuralen Wachstumsfaktoren besteht.
Polybifunktionelles Reagens nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die bioaktiven Gruppen einen Liganden oder Rezeptor umfassen, der ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Antikörpern, Antigenen, Avidin, Streptavidin, Biotin, Heparin, Typ-IV-Collagen, Protein A und Protein G besteht.
Polybifunktionelles Reagens nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die bioaktiven Gruppen ein Antibiotikum umfassen, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus antibiotischen Peptiden besteht.
Polybifunktionelles Reagens nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die bioaktiven Gruppen Enzyme umfassen.
Polybifunktionelles Reagens nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die bioaktiven Gruppen Nukleinsäuresequenzen umfassen, die selektiv komplementäre Nukleinsäuresequenzen binden können.
Polybifunktionelles Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die photoreaktiven Einheiten jeweils ein photoaktivierbares Keton umfassen.
Polybifunktionelles Reagens, das eine synthetische Polymer-Hauptkette umfasst, die (a) eine Mehrzahl von photoreaktiven Seiteneinheiten in der Form photoaktivierbarer Ketone und (b) zwei oder mehr bioaktive Seitengruppen, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Proteinen, Peptiden, Aminosäuren, Kohlehydraten und Nukleinsäure besteht, trägt, wobei die Polymer-Hauptkette ein synthetisches Polymer oder Copolymer umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Acrylkunststoffen, Vinylkunststoffen, Nylons, Polyurethanen, Polyethern und biologisch abbaubaren Polymeren besteht, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Polydioxanonen, Polyanhydriden und Polyorthoestern besteht, und wobei das Reagens durch Copolymerisation eines Basismonomers mit Monomeren, die photoreaktive Seiteneinheiten enthalten, und mit Monomeren, die die gewünschten bioaktive Gruppe enthalten, hergestellt wird, um ein Reagens mit einem gewünschten Verhältnis von Polymer-Hauptkette, photoreaktiven Einheiten und bioaktiven Gruppen zu liefern.
Verfahren zum Beschichten einer Biomaterialoberfläche, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (i) Bereitstellen eines polyfunktionellen Reagens, das eine Polymer-Hauptkette umfasst, die (a) eine Mehrzahl von photoreaktiven Seiteneinheiten, die durch Einwirkung einer geeigneten Energiequelle aktiviert werden können, und (b) zwei oder mehr bioaktiven Seitengruppen, die zu spezifischen, nicht-kovalenten Wechselwirkungen mit komplementären Gruppen in der Lage sind, trägt, (ii) Inkontaktbringen der Oberfläche mit dem Reagens und (iii) Aktivieren der photoreaktiven Einheiten, um die Reagensmoleküle mit sich selbst und/oder der Oberfläche zu vernetzen, wobei die Polymer-Hauptkette ein synthetisches Polymer oder Copolymer umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Acrylkunststoffen, Vinylkunststoffen, Nylons, Polyurethanen, Polyethern und biologisch abbaubaren Polymeren besteht, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Polydioxanonen, Polyanhydriden und Polyorthoestern besteht, und wobei das Reagens durch Copolymerisation eines Basismonomers mit Monomeren, die photoreaktive Seiteneinheiten enthalten, und mit Monomeren, die die gewünschte bioaktive Gruppe enthalten, hergestellt wird, um ein Reagens mit einem gewünschten Verhältnis von Polymer-Hauptkette, photoreaktiven Einheiten und bioaktiven Gruppen zu liefern.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens auf die Oberfläche durch Sprühen, Tauchen oder Bürsten aufgebracht wird.
Beschichtete Biomaterialoberfläche, die die gebundenen Reste eines aktivierten polybifunktionellen Reagens umfasst, das anfänglich eine Polymer-Hauptkette umfasste, die (a) eine Mehrzahl von photoreaktiven Seiteneinheiten, die durch Einwirkung einer geeigneten Energiequelle aktiviert werden können, und (b) zwei oder mehr bioaktiven Seitengruppen, die zu spezifischen, nicht-kovalenten Wechselwirkungen mit komplementären Gruppen in der Lage sind, trägt, wobei die Polymer-Hauptkette ein synthetisches Polymer oder Copolymer umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Acrylkunststoffen, Vinylkunststoffen, Nylons, Polyurethanen, Polyethern und biologisch abbaubaren Polymeren besteht, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Polydioxanonen, Polyanhydriden und Polyorthoestern besteht, und wobei das Reagens durch Copolymerisation eines Basismonomers mit Monomeren, die photoreaktive Seiteneinheiten enthalten, und mit Monomeren, die die gewünschte bioaktive Gruppe enthalten, hergestellt wird, um ein Reagens mit einem gewünschten Verhältnis von Polymer-Hauptkette, photoreaktiven Einheiten und bioaktiven Gruppen zu liefern.
Vernetztes Material, das die gebundenen Reste eines aktivierten polybifunktionellen Reagens umfasst, das anfänglich eine Polymer-Hauptkette umfasste, die (a) eine Mehrzahl von photoreaktiven Seiteneinheiten, die durch Einwirkung einer geeigneten Energiequelle aktiviert werden können, und (b) zwei oder mehr bioaktiven Seitengruppen, die zu spezifischen, nicht-kovalenten Wechselwirkungen mit komplementären Gruppen in der Lage sind, trägt, wobei die Polymer-Hauptkette ein synthetisches Polymer oder Copolymer umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Acrylkunststoffen, Vinylkunststoffen, Nylons, Polyurethanen, Polyethern und biologisch abbaubaren Polymeren besteht, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Polydioxanonen, Polyanhydriden und Polyorthoestern besteht, und wobei das Reagens durch Copolymerisation eines Basismonomers mit Monomeren, die fotoreaktive Seiteneinheiten enthalten, und mit Monomeren, die die gewünschte bioaktive Gruppe enthalten, hergestellt wird, um ein Reagens mit einem gewünschten Verhältnis von Polymer-Hauptkette, photoreaktiven Einheiten und bioaktiven Gruppen zu liefern.
Polybifunktionelles Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Acrylpolymer-Hauptketten ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus denjenigen besteht, die aus Hydroxyethylacrylat, Hydroxyethylmethacrylat, Glycerylacrylat, Glycerylmethacrylat, Acrylsäure, Methacrylsäure, Acrylamid und Methacrylamid polymerisiert sind; die Vinylpolymer-Hauptketten ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Polyvinylpyrrolidon und Polyvinylalkohol besteht; die Nylonpolymer-Hauptketten ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Polycaprolactam, Polylauryllactam, Polyhexamethylenadipamid und Polyhexamethylendodecandiamid besteht, und die Polyetherpolymer-Hauptketten ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Polyethylenoxid, Polypropylenoxid und Polybutylenoxid besteht.
Reagens nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Acrylpolymer-Hauptketten ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus denjenigen besteht, die aus Hydroxyethylacrylat, Hydroxyethylmethacrylat, Glycerylacrylat, Glycerylmethacrylat, Acrylsäure, Methacrylsäure, Acrylamid und Methacrylamid polymerisiert sind; die Vinylpolymer-Hauptketten ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Polyvinylpyrrolidon und Polyvinylalkohol besteht; die Nylonpolymer-Hauptketten ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Polycaprolactam, Polylauryllactam, Polyhexamethylenadipamid und Polyhexamethylendodecandiamid besteht, und die Polyetherpolymer-Hauptketten ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Polyethylenoxid, Polypropylenoxid und Polybutylenoxid besteht.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Acrylpolymer-Hauptketten ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus denjenigen besteht, die aus Hydroxyethylacrylat, Hydroxyethylmethacrylat, Glycerylacrylat, Glycerylmethacrylat, Acrylsäure, Methacrylsäure, Acrylamid und Methacrylamid polymerisiert sind; die Vinylpolymer-Hauptketten ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Polyvinylpyrrolidon und Polyvinylalkohol besteht; die Nylonpolymer-Hauptketten ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Polycaprolactam, Polylauryllactam, Polyhexamethylenadipamid und Polyhexamethylendodecandiamid besteht, und die Polyetherpolymer-Hauptketten ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Polyethylenoxid, Polypropylenoxid und Polybutylenoxid besteht.
Beschichtete Oberfläche nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Acrylpolymer-Hauptketten ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus denjenigen besteht, die aus Hydroxyethylacrylat, Hydroxyethylmethacrylat, Glycerylacrylat, Glycerylmethacrylat, Acrylsäure, Methacrylsäure, Acrylamid und Methacrylamid polymerisiert sind; die Vinylpolymer-Hauptketten ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Polyvinylpyrrolidon und Polyvinylalkohol besteht; die Nylonpolymer-Hauptketten ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Polycaprolactam, Polylauryllactam, Polyhexamethylenadipamid und Polyhexamethylendodecandiamid besteht, und die Polyetherpolymer-Hauptketten ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Polyethylenoxid, Polypropylenoxid und Polybutylenoxid besteht.
Material nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Acrylpolymer-Hauptketten ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus denjenigen besteht, die aus Hydroxyethylacrylat, Hydroxyethylmethacrylat, Glycerylacrylat, Glycerylmethacrylat, Acrylsäure, Methacrylsäure, Acrylamid und Methacrylamid polymerisiert sind; die Vinylpolymer-Hauptketten ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Polyvinylpyrrolidon und Polyvinylalkohol besteht; die Nylonpolymer-Hauptketten ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Polycaprolactam, Polylauryllactam, Polyhexamethylenadipamid und Polyhexamethylendodecandiamid besteht, und die Polyetherpolymer-Hauptketten ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Polyethylenoxid, Polypropylenoxid und Polyeutylenoxid besteht.
Polybifunktionelles Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymer-Hauptkette des Reagens zwischen etwa 40 und etwa 400 Kohlenstoffatome pro photoreaktiver Gruppe und zwischen etwa 5 und etwa 200 Kohlenstoffatome pro bioaktiver Gruppe, wenn die bioaktiven Gruppen ein Molekulargewicht von weniger als 3.000 besitzen, oder zwischen etwa 10 und etwa 5.000 Kohlenstoffatome, wenn die bioaktiven Gruppen ein Molekulargewicht zwischen 3.000 und etwa 50.000 besitzen, bereitstellt.