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GEBIET DER
ERFINDUNG
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In
einem Aspekt betrifft diese Erfindung Reagentien, die verwendet
werden können,
um Biomaterialoberflächen
zu modifizieren oder neue Biomaterialien herzustellen. In einem
weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Biomaterialien mit Oberflächen, die
hergestellt oder modifiziert worden sind, um gewünschte bioaktive Funktionen
bereitzustellen.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Biomaterialien
sind seit langem verwendet worden, um biomedizinische Vorrichtungen
zur Verwendung in sowohl in-vitro- als auch in-vivo-Anwendungen
herzustellen. Eine Vielzahl von Biomaterialien kann für die Herstellung
solcher Vorrichtungen verwendet werden, einschließlich Keramikwerkstoffen,
Metallen, Polymeren und Kombinationen derselben. Historisch gesehen
wurden solche Biomaterialien als geeignet zur Verwendung bei der
Herstellung biomedizinischer Vorrichtungen angesehen, wenn sie eine
geeignete Kombination solcher grundlegenden Eigenschaften bereitstellten
wie Inertheit, geringe Toxizität
und die Fähigkeit,
zu gewünschten
Vorrichtungen hergestellt zu werden. (Hanker, J. S. und B. L. Giammara,
Science 242: 885–892, 1988).
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Als
das Ergebnis jüngerer
Fortschritte können
Vorrichtungen nunmehr mit Oberflächen
bereitgestellt werden, die verschiedene wünschenswerte Eigenschaften
haben, z.B. um bessere Grenzflächen
mit umgebendem Gewebe oder Lösungen
zu bilden. Zum Beispiel sind Ansätze
entwickelt worden, um die Bindung spezifischer Zellen oder Moleküle an Vorrichtungsoberflächen zu
fördern.
Eine Vorrichtungsoberfläche
kann zum Beispiel mit einer bioaktiven Gruppe versehen sein, die
in der Lage ist, verschiedene Moleküle oder Zellen anzuziehen und/oder
zu binden. Beispiele für
solche bioaktiven Gruppen schließen Antigene zur Bindung an
Antikörper,
Liganden zur Bindung an Zelloberflächenrezeptoren und Enzymsubstrate
zur Bindung an Enzyme ein.
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Solche
bioaktiven Gruppen sind auf den Oberflächen von Biomaterialien in
einer Vielzahl von Weisen bereitgestellt worden. In einem Ansatz
können
Biomaterialien aus Molekülen
hergestellt werden, die nach der Herstellung selbst die gewünschten
bioaktiven Gruppen auf den Oberflächen von Vorrichtungen präsentieren. Wünschenswerte
bioaktive Gruppen sind jedoch typischerweise hydrophil und können in
die meisten Metalle oder hydrophoben polymeren Biomaterialien nicht
in wirksamen Konzentrationen eingebaut werden, ohne die Strukturintegrität solcher
Biomaterialien zu stören.
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Ein
alternativer Ansatz umfaßt
die Zugabe von bioaktiven Gruppen zu den Oberflächen von Biomaterialien, z.B.
nachdem sie zu medizinischen Vorrichtungen hergestellt worden sind.
Solche bioaktiven Gruppen können
gelegentlich durch Adsorption hinzugefügt werden. Gruppen, die durch
Adsorption hinzugefügt
worden sind, können
jedoch typischerweise auf den Oberflächen nicht mit hohen Gehalten
oder für
längere
Zeiträume zurückgehalten
werden.
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Die
Retention solcher bioaktiven Gruppen auf einer Oberfläche kann
durch kovalente Bindung dieser Gruppen an die Oberfläche verbessert
werden. U.S.-Patente Nrn. 4,722,906, 4,979,959, 4,973,493 und 5,263,992
betreffen zum Beispiel Vorrichtungen, bei denen biokompatible Agentien über eine
photoreaktive Gruppe und eine chemische Verknüpfungseinheit kovalent an die
Biomaterialoberfläche
gebunden sind. U.S.-Patente Nrn. 5,258,041 und 5,217,492 betreffen
die Bindung von Biomolekülen
an eine Oberfläche
durch die Verwendung langkettiger chemischer Spacer. U.S.-Patente
Nrn. 5,002,582 und 5,263,992 betreffen die Herstellung und Verwendung
polymerer Oberflächen,
bei denen polymere Agentien, die wünschenswerte Eigenschaften
bereitstellen, über
eine photoreaktive Einheit kovalent an die Oberfläche gebunden
sind. Insbesondere zeigen die Polymere selbst die gewünschten
Eigenschaften und sind, in der bevorzugten Ausführungsform, frei von anderen
(z.B. bioaktiven) Gruppen.
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Andere
haben Photochemie verwendet, um die Oberflächen biomedizinischer Vorrichtungen
zu modifizieren, z.B. um Gefäßtransplantate
zu beschichten. (Siehe z.B. Kito, H. et al., ASAIO Journal 39: M506–M511, 1993.
Siehe auch Clapper, D. L., et al., Trans. Soc. Biomat. 16: 42, 1993).
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Cholakis
und Sefton synthetisierten ein Polymer mit einer Polyvinylalkohol(PVA)-Hauptkette
und bioaktiven Heparingruppen. Das Polymer wurde an Polyethylen-Schlauch über nicht-latente reaktive
Chemie gekoppelt, und die resultierende Oberfläche wurde in einer Reihe von
in-vitro- und in-vivo-Tests auf Thromboresistenz bewertet. Aus welchen
Gründen
auch immer lieferte das Heparin im Polymer, das von Cholakis und Sefton
hergestellt worden war, keine wirksame Aktivität. (Cholakis, C. H. und M.
V. Sefton, J. Biomed. Mater. Res. 23: 399–415, 1989. Siehe auch Cholakis,
C. H., et al., J. Biomed. Mater. Res. 23: 417–441, 1989).
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Schließlich offenbaren
Kinoshita et al. die Verwendung reaktiver Chemie, um Polyacrylsäure-Hauptketten auf porösem Polyethylen
zu erzeugen, wobei anschließend
Collagen-Moleküle
an Carboxyl-Einheiten auf den Polyacrylsäure-Hauptketten gekoppelt werden
(siehe Kinoshita, Y., et al., Biomaterials 14: 209–215, 1993).
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Im
allgemeinen wird die resultierende Beschichtung in den obengenannten
Situationen in Form bioaktiver Gruppen bereitgestellt, die mittels
kurzer linearer Spacer kovalent an Biomaterialoberflächen gekoppelt sind.
Dieser Ansatz funktioniert mit bioaktiven Gruppen mit großem Molekulargewicht,
wie etwa Collagen und Fibronectin, gut, wo die Verwendung von kurzen
Spacern gewünscht
ist und die Größe der bioaktiven
Gruppe, verglichen mit derjenigen des Spacers selbst, recht groß ist.
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Die
oben beschriebenen Ansätze,
mit der möglichen
Ausnahme von Kinoshita et al., sind jedoch nicht optimal zum Aufbringen
bioaktiver Gruppen mit kleinem Molekulargewicht. Kinoshita scheint
Moleküle
mit kleinem Molekulargewicht aufzubringen, obgleich er ein arbeitsaufwendiges
mehrstufiges Verfahren beschreibt, das sowohl Ausbeute als auch
Reproduzierbarkeit nachteilig beeinflussen kann.
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Bioaktive
Gruppen mit kleinem Molekulargewicht werden typischerweise in Form
von entweder kleinen Bereichen bereitgestellt, die von viel größeren Molekülen abgeleitet
sind (z.B. von Fibronectin abgeleitete Zellbindungspeptide), oder
als kleine Moleküle,
die normalerweise frei diffundieren, um ihre Wirkungen zu erzeugen
(z.B. Antibiotika oder Wachstumsfaktoren). Es scheint, daß kurze
Spacer die Bewegungsfreiheit solcher kleinen bioaktiven Gruppen
unzuträglich
begrenzen können
und ihrerseits ihre Aktivität
beeinträchtigen,
wenn sie immobilisiert sind. Was klar benötigt wird, sind Verfahren und
Zusammensetzungen zur Bereitstellung verbesserter Konzentrationen
von bioaktiven Gruppen, und insbesondere Gruppen mit kleinem Molekulargewicht, auf
einer Biomaterialoberfläche
in einer Weise, die verbesserte Bewegungsfreiheit der bioaktiven
Gruppen erlaubt.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung wendet sich den oben beschriebenen Bedürfnissen
zu durch Bereitstellung eines polybifunktionellen Reagens, das eine
Mehrzahl von Molekülen
umfaßt,
wobei jedes eine Polymer-Hauptkette umfaßt, die (a) eine Mehrzahl von
photoreaktiven Seiteneinheiten, die durch Einwirkung einer geeigneten
Energiequelle aktiviert werden können,
und (b) zwei oder mehr bioaktive Seitengruppen, die zu spezifischen,
nicht-kovalenten
Wechselwirkungen mit komplementären
Gruppen in der Lage sind, trägt,
wobei das Reagens bei Aktivierung der photoreaktiven Einheiten ein
vernetztes Material oder eine vernetzte Oberflächenbeschichtung bilden kann,
um die Anziehung solcher komplementären Gruppen zu fördern, wobei
die Polymer-Hauptkette ein synthetisches Polymer oder Copolymer
umfaßt,
das ausgewählt
ist aus der Gruppe, die aus Acrylkunststoffen, Vinylkunststoffen,
Nylons, Polyurethanen, Polyethern und biologisch abbaubaren Polymeren
besteht, die ausgewählt
sind aus der Gruppe, die aus Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Polydioxanonen,
Polyanhydriden und Polyorthoestern besteht, und wobei das Reagens
durch Copolymerisation eines Basismonomers mit Monomeren, die photoreaktive
Seiteneinheiten enthalten, und mit Monomeren, die die gewünschte bioaktive
Gruppe enthalten, hergestellt wird, um ein Reagens mit einem gewünschten
Verhältnis
von Polymer-Hauptkette, photoreaktiven Einheiten und bioaktiven
Gruppen zu liefern. Das Reagens schließt vorzugsweise eine Polymer-Hauptkette
mit hohem Molekulargewicht, vorzugsweise linear, ein, an die eine
optimale Dichte von sowohl bioaktiven Gruppen als auch photoreaktiven
Einheiten gebunden ist. Das Reagens erlaubt, daß nützliche Dichten von bioaktiven
Gruppen an eine Biomaterialoberfläche über eine oder mehrere photoreaktive
Gruppen gebunden werden können.
Die Hauptkette ihrerseits stellt eine Spacerfunktion von ausreichender
Länge bereit,
um die bioaktiven Gruppen mit größerer Bewegungsfreiheit
zu versehen als derjenigen, die ansonsten erreicht werden könnte, z.B.
durch die Verwendung individueller Spacer (wie oben beschrieben).
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Als
ein zusätzlicher
Vorteil erlaubt das vorliegende Reagens die Bildung inter- und intramolekularer
kovalenter Bindungen innerhalb und/oder zwischen Polymer-Hauptketten
und der Biomaterialoberfläche,
wodurch eine optimale und kontrollierbare Kombination solcher Eigenschaften
wie Beschichtungsdichte, Bewegungsfreiheit, Haftfestigkeit und Stabilität bereitgestellt
wird.
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Zusätzlich zu
seiner Verwendung bei der Modifizierung einer Biomaterialoberfläche stellt
ein Reagens der Erfindung ebenso andere Vorteile bereit. Die photoreaktiven
Einheiten erlauben, daß individuelle
Polymermoleküle
wirksam mit benachbarten Polymermolekülen gekoppelt (z.B. vernetzt)
werden können.
Diese Vernetzungseigenschaft erlaubt, daß die Polymere dicke Beschichtungen
auf Biomaterialoberflächen
erzeugen und/oder unabhängige
Filme und Schüttgüter, entweder
in vitro oder in vivo, erzeugen.
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Die
vorliegende Erfindung offenbart auch ein Verfahren zum Synthetisieren
eines polybifunktionellen Reagens und zur Bereitstellung einer beschichteten
Oberfläche,
wie etwa der Oberfläche
eines Biomaterials oder einer biomedizinischen Vorrichtung, die
aus solch einem Biomaterial hergestellt ist. Die beschichtete Oberfläche, die
Moleküle
des polybifunktionellen Reagens daran gebunden aufweist, um die
Vorrichtung mit wünschenswerten
Eigenschaften oder Attributen zu versehen.
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Die
photoreaktiven Einheiten können
aktiviert werden, um das polybifunktionelle Reagens an eine Oberfläche zu binden,
indem abstrahierbare Wasserstoffatome in solcher Weise bereitgestellt
werden, daß die bioaktiven
Seitengruppen ihre gewünschte
bioaktive Funktion beibehalten. Vorzugsweise wird das Reagens an
die Oberfläche
in einem „einstufigen" Verfahren gebunden,
d.h. durch Aufbringen eines Reagens auf die Oberfläche und
dort Aktivieren einer oder mehrerer seiner photoreaktiven Gruppen,
um eine Beschichtung zu bilden. Im Gegensatz dazu würde ein „zweistufiges" Verfahren einen
ersten Schritt der Immobilisierung einer polymeren Hauptkette über photochemische
Mittel und einen zweiten Schritt der Bindung (z.B. thermochemisch)
von zwei oder mehr bioaktiven Gruppen an die immobilisierte Hauptkette
umfassen.
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Bevorzugte
polybifunktionelle Reagentien der Erfindung können verwendet werden, um die
Oberflächen
existierender Biomaterialien zu beschichten und/oder neue Biomaterialien
zu erzeugen, z.B. durch die Herstellung von Schüttgüter. In jedem Fall können sie
die Oberflächeneigenschaften
einer biomedizinischen Vorrichtung verbessern, indem sie kovalent
an die Vorrichtungsoberfläche
gebundene Gruppen bereitstellen. Bevorzugte bioaktive Gruppen ihrerseits
wirken, indem sie entweder nicht-kovalent an spezifische komplementäre Abschnitte
von Molekülen
oder Zellen binden, die mit solchen Gruppen in Kontakt kommen, oder
auf diese wirken.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird ein polybifunktionelles Reagens der Erfindung mit einer polymeren
Hauptkette, einer Mehrzahl von photoreaktiven Einheiten und zwei
oder mehr bioaktiven Gruppen synthetisiert. Das polymere Molekül der Erfindung
wird in Kontakt gebracht mit der Oberfläche eines zuvor ausgebildeten
Biomaterials oder in Kontakt mit einem weiteren polymeren Molekül der Erfindung.
Die photoreaktiven Einheiten werden über eine äußere Stimulation aktiviert,
um, mittels der Erzeugung aktiver Spezies, eine kovalente Bindung
zwischen dem Reagensmolekül
und entweder der Biomaterialoberfläche oder einem weiteren Reagensmolekül zu bilden.
Ein Biomaterial kann zum Beispiel in einer Lösung befeuchtet werden, die ein
geeignetes Reagens enthält
(typischerweise für
0,1–5
Minuten), und dann Licht ausgesetzt werden (typischerweise für 0,1–2 Minuten),
um kovalente Kopplung zu erreichen.
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Bevorzugte
bioaktive Gruppen funktionieren, indem sie die Bindung spezifischer
Moleküle
oder Zellen an die Oberfläche
fördern.
Bevorzugte bioaktive Gruppen schließen Proteine, Peptide, Kohlehydrate,
Nukleinsäuren
und andere Moleküle,
die in der Lage sind, nicht-kovalent
an spezifische oder komplementäre
Abschnitte von Molekülen
oder Zellen zu binden, ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Beispiele
für solche
spezifische Bindung schließen
Zelloberflächenrezeptoren,
die an Liganden binden, Antigene, die an Antikörper binden, und Enzymsubstrate,
die an Enzyme binden, ein. Vorzugsweise umfaßt die polymere Hauptkette
eine synthetische polymere Hauptkette, die ausgewählt ist
aus der Gruppe, die aus Additionspolymeren, wie etwa den Vinylpolymeren,
besteht. Bevorzugter umfassen die Photogruppen jeweils ein reversibles
photoaktivierbares Keton.
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BESCHREIBUNG
DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Wie
hierin verwendet, werden die folgenden Begriffe und Wörter die
folgenden zugeschriebenen Bedeutungen haben:
„Biomaterial" wird sich auf ein
Material beziehen, das in wäßrigen Systemen
im wesentlichen unlöslich
ist und das eine oder mehrere Oberflächen für Kontakt mit Fluiden, die
biologische Moleküle
enthalten, bereitstellt, z.B, wäßrige in-vivo-
oder in-vitro-Systeme, die Gewebe, Zellen oder Biomoleküle enthalten;
„Vorrichtung" wird sich auf ein
funktionelles Objekt beziehen, das aus einem Biomaterial hergestellt
ist;
„Beschichtung" wird sich auf eine
oder mehrere Polymerschichten auf einer Biomaterialoberfläche beziehen und
insbesondere auf eine oder mehrere Schichten, die auf einer Biomaterialoberfläche durch
Aktivierung eines polybifunktionellen Reagens der vorliegenden Erfindung
immobilisiert worden sind;
„polybifunktionelles Reagens", wenn verwendet
im Zusammenhang mit dem vorliegend beanspruchten Reagens, wird sich
auf ein Molekül
beziehen, das eine Polymer-Hauptkette umfaßt, an die eine oder mehrere
photoreaktive Einheiten und zwei oder mehr bioaktive Gruppen kovalent
gebunden sind;
„eine
photoreaktive Einheit" wird
sich auf eine chemische Gruppe beziehen, die auf eine spezifische
angewendete äußere Energiequelle
reagiert, um die Erzeugung aktiver Spezies zu durchlaufen, was zu
kovalenter Bindung an ein benachbartes Molekül oder eine Biomaterialoberfläche führt;
„bioaktive
Gruppe" wird sich
auf ein Molekül
mit einer gewünschten
spezifischen biologischen Aktivität beziehen, wie etwa eine Bindung
oder enzymatische (katalytische) Aktivität;
„Polymer-Hauptkette" wird sich auf ein
natürliches
Polymer oder ein synthetisches Polymer beziehen, das z.B. aus Additions-
oder Kondensationspolymerisation stammt.
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Bevorzugte
Reagentien der Erfindung umfassen ein synthetisches Polymer, das
als eine Hauptkette dient, eine Mehrzahl von photoreaktiven Seiteneinheiten,
die aktiviert werden können,
um kovalente Bindung an Oberflächen
oder benachbarte Polymermoleküle
bereitzustellen, und zwei oder mehr biologisch aktive Seiteneinheiten
mit niedrigem Molelculargewicht (bioaktive Gruppen).
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Hauptkette.
Die Polymer-Hauptkette kann entweder synthetisch oder natürlich vorkommend
sein und ist vorzugsweise ein synthetisches Polymer, das ausgewählt ist
aus der Gruppe, die aus Oligomeren, Homopolymeren und Copolymeren
besteht, die aus Additions- oder Kondensationspolymerisation stammen.
Natürlich
vorkommende Polymere, wie etwa Polysaccharide und Polypeptide, können ebenso
verwendet werden. Bevorzugte Hauptketten sind biologisch inert,
indem sie keine biologische Funktion bereitstellen, die mit ihrer Verwendung
in der beschriebenen Art und Weise inkonsistent oder dafür schädlich ist.
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Solche
Polymer-Hauptketten können
Acrylkunststoffe, wie etwa diejenigen, die aus Hydroxyethylacrylat,
Hydroxyethylmethacrylat, Glycerylacrylat, Glycerylmethacrylat, Acrylsäure, Methacrylsäure, Acrylamid oder
Methacrylamid polymerisiert sind; Vinylkunststoffe, wie etwa Polyvinylpyrrolidon
und Polyvinylalkohol; Nylons, wie etwa Polycaprolactam; Derivate
von Polylauryllactam, Polyhexamethylenadipamid und Polyhexamethylendodecandiamid
und Polyurethane; Polyether, wie etwa Polyethylenoxid, Polypropylenoxid
und Polybutylenoxid; und biologisch abbaubare Polymere, wie etwa
Polymilchsäure,
Polyglykolsäure,
Polydioxanon, Polyanhydride und Polyorthoester, einschließen.
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Die
polymere Hauptkette wird ausgewählt,
um eine Hauptkette bereitzustellen, die in der Lage ist, eine Mehrzahl
von photoreaktiven Einheiten und zwei oder mehr bioaktive Gruppen
zu tragen. Die polymere Hauptkette ist auch ausgewählt, um
zwischen der Oberfläche
und den verschiedenen photoreaktiven Einheiten und bioaktiven Gruppen
einen Spacer bereitzustellen. Auf diese Weise kann das Reagens an
eine Oberfläche
oder an ein benachbartes Reagensmolelcül gebunden werden, um die bioaktiven
Gruppen mit ausreichend Bewegungsfreiheit zu versehen, um optimale
Aktivität
zu zeigen. Die Polymer-Hauptketten sind vorzugsweise wasserlöslich, wobei
Polyacrylamid und Polyvinylpyrrolidon besonders bevorzugte Polymere
sind.
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Photoreaktive
Einheiten. Polybifunktionelle Reagentien der Erfindung tragen eine
Mehrzahl von latenten reaktiven (vorzugsweise photoreaktiven) Seiteneinheiten,
die kovalent an die Polymer-Hauptkette gebunden sind. Photoreaktive
Einheiten sind hierin definiert, und bevorzugte Einheiten sind ausreichend
stabil, um unter Bedingungen gelagert zu werden, bei denen sie solche
Eigenschaften beibehalten. Siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 5,002,582,
dessen Offenbarung hierin durch Bezugnahme miteinbezogen ist. Latente
reaktive Einheiten können
ausgewählt
werden, die auf verschiedene Abschnitte des elektromagnetischen
Spektrums ansprechen, wobei diejenigen, die auf ultraviolette und
sichtbare Abschnitte des Spektrums ansprechen (hierin als „photoreaktiv" bezeichnet), besonders
bevorzugt sind.
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Photoreaktive
Einheiten sprechen auf spezifische angewendete äußere Stimuli an, um die Erzeugung aktiver
Spezies zu durchlaufen, mit resultierender kovalenter Bindung an
eine benachbarte chemische Struktur, z.B. wie bereitgestellt durch
dasselbe oder ein unterschiedliches Molekül. Photoreaktive Einheiten
sind diejenigen Gruppen von Atomen in einem Molekül, die ihre
kovalenten Bindungen unter Lagerbedingungen unverändert beibehalten,
die aber, bei Aktivierung durch eine äußere Energiequelle, kovalente
Bindungen mit anderen Molekülen
bilden.
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Die
photoreaktiven Einheiten erzeugen aktive Spezies, wie etwa freie
Radikale und insbesondere Nitrene, Carbene und angeregte Zustände von
Ketonen, bei Absorption äußerer elektrischer,
elektromagnetischer oder kinetischer (thermischer) Energie. Photoreaktive
Einheiten können
ausgewählt
werden, um auf verschiedene Abschnitte des elektromagnetischen Spektrums
anzusprechen, und photoreaktive Einheiten, die auf z.B. ultraviolette
und sichtbare Abschnitte des Spektrums ansprechen, sind bevorzugt
und werden hierin gelegentlich als „photochemische" Einheit bezeichnet.
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Photoreaktive
Arylketone sind besonders bevorzugt, wie etwa Acetophenon, Benzophenon,
Anthrachinon, Anthron und Anthron-ähnliche Heterocyclen (d.h.
heterocyclische Analoga von Anthron, wie etwa diejenigen mit N,
O oder S in der 10-Position) oder ihre substituierten (z.B. ringsubstituierten)
Derivate. Die funktionellen Gruppen solcher Ketone sind bevorzugt,
da sie ohne weiteres in der Lage sind, den hierin beschriebenen
Aktivierungs/Inaktivierungs/Reaktivierungs-Zyklus zu durchlaufen.
Benzophenon ist eine besonders bevorzugte photoreaktive Einheit,
da es zu photochemischer Anregung mit der anfänglichen Bildung eines angeregten
Singulettzustandes in der Lage ist, der Intersystem-Crossing zum Triplett-Zustand
durchläuft.
Der angeregte Triplett-Zustand kann sich in Kohlenstoff-Wasserstoff-Bindungen
durch Abstraktion eines Wasserstoffatoms (zum Beispiel von einer
Trägeroberfläche) einschieben,
wodurch ein Radikalenpaar geschaffen wird. Anschließender Kollaps
des Radikalenpaares führt
zur Bildung einer neuen Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung. Wenn eine reaktive
Bindung (z.B. Kohlenstoff-Wasserstoff) für Bindung nicht zur Verfügung steht,
ist die durch ultraviolettes Licht induzierte Anregung der Benzophenon-Gruppe
reversibel und das Molekül
kehrt bei Entfernung der Energiequelle zum Grundzustands-Energieniveau
zurück.
Photoaktivierbare Arylketone, wie etwa Benzophenon oder Acetophenon,
sind insofern von besonderer Wichtigkeit, als diese Gruppen mehrfacher Reaktivierung
in Wasser unterliegen und daher erhöhte Beschichtungseffizienz
liefern. Daher sind photoreaktive Arylketone besonders bevorzugt.
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Die
Azide stellen eine bevorzugte Klasse latenter reaktiver Einheiten
dar und schließen
Arylazide (C6R5N3), wie etwa Phenylazid und insbesondere
4-Fluor-3-nitrophenylazid, Acylazide (-CO-N3),
wie etwa Benzoylazid und p-Methylbenzoylazid, Azidoformiate (-O-CO-N3),
wie etwa Ethylazidoformiat, Phenylazidoformiat, Sulfonylazide (-SO2-N3), wie etwa Benzosulfonylazid,
und Phosphorylazide (RO)2PON3,
wie etwa Diphenylphosphorylazid und Diethylphosphorylazid, ein.
Diazoverbindungen stellen eine weitere Klasse photoreaktiver Einheiten
dar und schließen
Diazoalkane (-CHN2), wie etwa Diazomethan
und Diphenyldiazomethan, Diazoketone (-CO-CHN2),
wie etwa Diazoacetophenon und 1-Trifluormethyl-1-diazo-2-pentanon,
Diazoacetate (-O-CO-CHN2), wie etwa t-Butyldiazoacetat
und Phenyldiazoacetat, und beta-Keto-alpha-diazoacetate (-CO-CN2-CO-O-),
wie etwa t-Butyl-alpha-diazoacetoacetat, ein. Weitere photoreaktive
Einheiten schließen die
aliphatischen Azoverbindungen, wie etwa Azobisisobutyronitril, die
Diamine (-CHN2), wie etwa 3-Trifluormethyl-3-phenyldiazirin,
die Ketene (-CH=C=O), wie etwa Keten und Diphenylketen, ein.
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Bei
Aktivierung der photoreaktiven Einheiten werden die Beschichtungs-Adhäsionsmoleküle durch
kovalente Bindungen durch Reste der photoreaktiven Gruppen kovalent
aneinander und/oder die Materialoberfläche gebunden. Beispielhafte
photoreaktive Gruppen und deren Reste bei Aktivierung sind wie folgt
dargestellt.
Photoreaktive
Gruppe | Restfunktionalität |
Arylazide | Amin
R-NH-R' |
Acrylazide | Amid
R-CO-NH-R' |
Azidoformiate | Carbamat
R-O-CO-NH-R' |
Sulfonylazide | Sulfonamid
R-SO2-NH-R' |
Phosphorylazide | Phosphoramid
(RO)2PO-NH-R' |
Diazoalkane | Neue
C-C-Bindung |
Diazoketone | Neue
C-C-Bindung und Keton |
Diazoacetate | Neue
C-C-Bindung und Ester |
beta-Keto-alpha-diazoacetate | Neue
C-C-Bindung und beta-Ketoester |
Aliphtisches
Azo | Neue
C-C-Bindung |
Diamine | Neue
C-C-Bindung |
Ketene | Neue
C-C-Bindung |
Photoaktivierte
Ketone | Neue
C-C-Bindung und Alkohol |
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Bioaktive
Gruppen. Bioaktive Gruppen mit niedrigem Molekulargewicht der vorliegenden
Erfindung sind typischerweise diejenigen, die dazu gedacht sind,
die Funktion oder Leistung einer bestimmten biomedizinischen Vorrichtung
in einer physiologischen Umgebung zu verbessern oder zu verändern. In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
ist die bioaktive Gruppe ausgewählt
aus der Gruppe, die aus Zellanheftungsfaktoren, Wachstumsfaktoren,
Antithrombosefaktoren, Bindungsrezeptoren, Liganden, Enzymen, Antibiotika
und Nulcleinsäuren
besteht. Ein Reagensmolekül
dieser Erfindung schließt
wenigstens zwei bioaktive Seitengruppen ein. Die Verwendung von
zwei oder mehr bioaktiven Seitengruppen ist jedoch gegenwärtig bevorzugt,
da das Vorhandensein mehrerer solcher Gruppen pro Reagensmolekül dazu neigt,
die Verwendung solcher Reagentien zu erleichtern.
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Wünschenswerte
Zellanheftungsfaktoren schließen
Anheftungspeptide (unten definiert) sowie große Proteine oder Glykoproteine
(typischerweise 100–1.000
Kilodaltons Größe) ein,
die in ihrem nativen Zustand fest an ein Substrat oder eine benachbarte
Zelle gebunden sein können,
sich an einen spezifischen Zelloberflächenrezeptor binden können und
mechanisch eine Zelle an das Substrat oder eine benachbarte Zelle
anheften können.
Natürlich
vorkommende Anheftungsfaktoren sind primär Proteine mit großem Molekulargewicht,
mit Molekulargewichten über
100.000 Daltons.
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Anheftungsfaktoren
binden sich an spezifische Zelloberflächenrezeptoren und heften mechanisch
Zellen an das Substrat (hierin als „Substrat-Adhäsionsmoleküle" bezeichnet) oder
an benachbarte Zellen (hierin als „Zell-Zell-Adhäsionsmoleküle" bezeichnet) an [Alberts,
B. et al., Molecular Biology of the Cell, 2nd ed., Garland Publ.,
Inc., New York (1989)]. Zusätzlich
zur Förderung
der Zellanheftung kann jeder Typ von Anheftungsfaktor andere Zellreaktionen
fördern,
einschließlich
Zellmigration und -differentiation. Geeignete Anheftungsfaktoren
für die
vorliegende Erfindung schließen
Substrat-Adhäsionsmoleküle, wie
etwa die Proteine Laminin, Fibronectin, Collagene, Vitronectin,
Tenascin, Fibrinogen, Thrombospondin, Osteopontin, von-Willibrand-Faktor
und Knochen-Sialoprotein, ein.
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Weitere
geeignete Anheftungsfaktoren schließen Zell-Zell-Adhäsionsmoleküle („Cadherine") ein, wie etwa N-Cadherin
und P-Cadherin.
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Anheftungsfaktoren,
die in dieser Erfindung nützlich
sind, umfassen typischerweise Aminosäuresequenzen oder funktionelle
Analoga derselben, die die biologische Aktivität einer spezifischen Domäne eines nativen
Anheftungsfaktors besitzen, wobei das Anheftungspeptid typischerweise
etwa 3 bis etwa 20 Aminosäuren
lang ist. Native Zellanheftungsfaktoren haben typischerweise eine
oder mehrere Domänen,
die sich an Zelloberflächenrezeptoren
binden und die Zellanheftungs-, Migrations- und Differentiationsaktivitäten der Stammmoleküle erzeugen.
Diese Domänen
bestehen aus spezifischen Aminosäuresequenzen,
von denen mehrere synthetisiert worden sind und über die berichtet worden ist,
daß sie
die Anheftung, Ausbreitung und/oder Proliferation von Zellen fördern. Diese
Domänen
und funktionellen Analoga dieser Domänen werden „Anheftungspeptide" genannt.
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Beispiele
für Anheftungspeptide
aus Fibronectin schließen
RGD (arg-gly-asp) [Kleinman, H. K. et al., Vitamins and Hormones
47: 161–186,
1993], REDV (arg-glu-asp-val) [Hubbell, J. A., et al., Ann. N. Y.
Acad. Sci. 665: 253–258,
1992] und C/H-V (WQPPRARI oder trp-gln-pro-pro-arg-ala-arg-ile) [Mooradian,
D. L., et al., Invest. Ophth. & Vis.
Sci. 34: 153–164,
1993] ein, sind aber nicht hierauf beschränkt.
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Beispiele
für Anheftungspeptide
aus Laminin schließen
YIGSR (tyr-ile-gly-ser-arg) und SIKVAV (ser-ile-lys-val-ala-val)
[Kleinman, H. K. et al., Vitamins and Hormones 47: 161–186, 1993]
und F-9 (RYVVLPRPVCFEKGMNYTVR oder arg-tyr-val-val-leu-pro-arg-pro-val-cys-phe-glu-lys-gly-met-asn-tyr-thr-val-arg) [Charonis,
A. S., et al., J. Cell Biol. 107: 1253–1260, 1988] ein, sind aber
nicht hierauf beschränkt.
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Beispiele
für Anheftungspeptide
aus Collagen Typ IV schließen
HEP-III (GEFYFDLRLKGDK oder gly-glu-phe-tyr-phe-asp-leu-arg-leu-lys-gly-asp-lys)
[Koliakos, G. G., et al., J. Biol. Chem. 264: 2313–2323, 1989]
ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Wünschenswerterweise haben Anheftungspeptide,
die in dieser Erfindung verwendet werden, zwischen etwa 3 und etwa
30 Aminosäurereste
in ihren Aminosäuresequenzen. Vorzugsweise
haben Anheftungspeptide nicht mehr als etwa 15 Aminosäurereste
in ihren Aminosäuresequenzen.
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Weitere
wünschenswerte
bioaktive Gruppen, die in der Erfindung vorliegen, schließen Wachstumsfaktoren,
wie etwa Fibroblasten-Wachstumsfaktor, epidermalen Wachstumsfaktor,
Plättchen-entstammende Wachstumsfaktoren,
transformierende Wachstumsfaktoren, Gefäßendothel-Wachstumsfaktoren,
knochenmorphogenetische Proteine und andere Knochenwachstumsfaktoren,
neuralen Wachstumsfaktoren und dergleichen ein.
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Noch
weitere wünschenswerte
bioaktive Gruppen, die in der Erfindung vorliegen, schließen Antithrombosemittel
ein, die Thrombusbildung oder Akkumulation an mit Blut in Kontakt
kommenden Vorrichtungen hemmen. Wünschenswerte Antithrombosemittel
schließen
Heparin und Hirudin (die das Gerinnen von Kaskadenproteinen, wie
etwa Thrombin, hemmen) sowie Lysin ein. Weitere wünschenswerte
Antithrombosemittel schließen
Prostaglandine, wie etwa PGI2, PGE1 und PGD2 ein, die
Plättchenadhäsion und
-aktivierung hemmen. Noch weitere wünschenswerte Thrombosemittel
schließen
fibrinolytische Enzyme, wie etwa Streptokinase, Urokinase und Plasminogenaktivator,
ein, die Fibringerinnsel zersetzen. Eine weitere wünschenswerte
bioaktive Gruppe besteht aus Lysin, das sich spezifisch an Plasminogen
bindet, das seinerseits Fibringerinnsel zersetzt.
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Weitere
wünschenswerte
bioaktive Gruppen, die in der Erfindung vorliegen, schließen Bindungsrezeptoren,
wie etwa Antikörper
und Antigene ein. Antikörper,
die auf einer Biomaterialoberfläche
vorliegen, können an
spezifische Antigene aus wäßrigen Medien,
die mit den immobilisierten Antikörpern in Kontakt kommen, binden
und diese daraus entfernen. In ähnlicher
Weise können
Antigene, die auf einer Biomaterialoberfläche vorliegen, sich an spezifische
Antikörper
aus wäßrigen Medien,
die mit den immobilisierten Antigenen in Kontakt kommen, binden
und diese daraus entfernen.
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Weitere
wünschenswerte
bioaktive Gruppen bestehen aus Rezeptoren und ihren entsprechenden
Liganden. Zum Beispiel binden sich Avidin und Streptavidin spezifisch
an Biotin, wobei Avidin und Streptavidin Rezeptoren sind und Biotin
ein Ligand ist. In ähnlicher
Weise binden sich Fibroblasten-Wachstumsfaktoren und Gefäßendothel-Wachstumsfaktor
mit hoher Affinität
an Heparin und transformierender Wachstumsfaktor beta und bestimmte
knochenmorphogenetische Proteine binden sich an Collagen Typ IV.
Auch eingeschlossen sind Immunoglobulin-spezifische Bindungsproteine,
die aus bakteriellen Quellen stammen, wie etwa Protein A und Protein
G, und synthetische Analoga derselben.
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Noch
weitere wünschenswerte
bioaktive Gruppen, die in der Erfindung vorliegen, schließen Enzyme ein,
die sich an Substratmoleküle,
die in wäßrigen Medien
vorliegen, die mit den immobilisierten Enzymen in Kontakt kommen,
binden und spezifische Veränderungen
in diesen katalysieren können.
Weitere wünschenswerte
bioaktive Gruppen bestehen aus Nukleinsäuresequenzen (z.B. DNA, RNA
und cDNA), die selektiv komplementäre Nukleinsäuresequenzen binden. Oberflächen, die
mit spezifischen Nukleinsäuresequenzen
beschichtet sind, werden in Diagnosetests verwendet, um das Vorhandensein
komplementärer
Nukleinsäuresequenzen
in Testproben zu identifizieren.
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Noch
weitere wünschenswerte
bioaktive Gruppen, die in der Erfindung vorliegen, schließen Antibiotika ein,
die mikrobielles Wachstum auf Biomaterialoberflächen hemmen. Bestimmte wünschenswerte
Antibiotika können
mikrobielles Wachstum durch Bindung an spezifischen Komponenten
auf Bakterien hemmen. Eine besonders wünschenswerte Klasse von Antibiotika
sind die antibiotischen Peptide, die mikrobielles Wachstum zu hemmen
scheinen, indem sie die Permeabilität der Plasmamembran über Mechanismen
verändern,
die zumindest teilweise keine spezifische komplementäre Liganden-Rezeptor-Bindung
involvieren könnten
[Zazloff, M., Curr. Opinion Immunol. 4: 3–7, 1992].
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Biomaterialien.
Bevorzugte Biomaterialien schließen diejenigen ein, die aus
synthetischen Polymeren hergestellt sind, einschließlich Oligomeren,
Homopolymeren und Copolymeren, die aus entweder Additions- oder
Kondensationspolymerisationen stammen. Beispiele für geeignete
Additionspolymere schließen
Acrylkunststoffe, wie etwa diejenigen, die aus Methylacrylat, Methylmethacrylat,
Hydroxyethylmethacrylat, Hydroxyethylacrylat, Acrylsäure, Methacrylsäure, Glycerylacrylat,
Glycerylmethacrylat, Methacrylamid und Acrylamid polymierisiert
sind; Vinylkunststoffe, wie etwa Ethylen, Propylen, Styrol, Vinylchlorid,
Vinylacetat, Vinylpyrrolidon und Vinylidendifluorid, ein, sind aber
nicht hierauf beschränkt.
Beispiele für
Kondensationspolymere schließen
Nylons, wie etwa Polycaprolactam, Polylauryllactam, Polyhexamethylenadipamid
und Polyhexamethylendodecandiamid, und auch Polyurethane, Polycarbonate,
Polyamide, Polysulfone, Poly(ethylenterephtalat), Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Polydimethylsiloxane
und Polyetheretherketone ein, sind aber nicht hierauf beschränkt.
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Bestimmte
natürliche
Materialien sind ebenfalls geeignete Biomaterialien, einschließlich menschlichem
Gewebe, wie etwa Knochen, Knorpel, Haut und Zähne; und andere organische
Materialien, wie etwa Holz, Cellulose, komprimierter Kohlenstoff
und Gummi.
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Weitere
geeignete Biomaterialien bestehen aus Substanzen, die keine abstrahierbaren
Wasserstoffe besitzen, mit denen die Photogruppen kovalente Bindungen
bilden können.
Eine solche Klasse von Biomaterialien kann zur Beschichtung über Photochemie
geeignet gemacht werden, indem eine geeignete Primerbeschichtung
aufgebracht wird, die sich an die Biomaterialoberfläche bindet
und ein geeignetes Substrat zur Bindung durch die Photogruppen liefert.
Ein Untersatz dieser Gruppe schließt Metalle und Keramikwerkstoffe
ein, die Oxidgruppen auf ihren Oberflächen haben und zur Kopplung über Photochemie
geeignet gemacht sind, indem eine Primerbeschichtung zugegeben ist,
die sich an die Oxidgruppen bindet und abstrahierbare Wasserstoffe
liefert. Die Metalle schließen
Titan, rostfreien Stahl und Cobalt-Chrom ein, sind aber nicht hierauf
beschränkt.
Die Keramikwerkstoffe schließen
Siliciumnitrid, Siliciumcarbid, Zirconiumdioxid und Aluminiumoxid sowie
Glas, Siliciumdioxid und Saphir ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Eine
geeignete Klasse von Primern für
Metalle und Keramikwerkstoffe besteht aus Organosilan-Reagentien,
die sich an die Oxidoberfläche binden
und Kohlenwasserstoffgruppen liefern (Brzoska, J. B., et al., Langmuir
10: 4367–4373,
1994). Die Forscher haben auch entdeckt, daß -SiH-Gruppen geeignete Alternativen
zur Bindung von Photogruppen sind.
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Eine
zweite Klasse von Biomaterialien, die einen organischen Primer erfordern,
sind die Edelmetalle, die Gold, Silber, Kupfer und Platin einschließen. Funktionelle
Gruppen mit hoher Affinität
zu Edelmetallen schließen
-CN, -SH und -NH2 ein, und organische Reagentien
mit diesen funktionellen Gruppen werden verwendet, um organische
Monoschichten auf solche Metalle aufzubringen (Grabar, K. C., et
al., Anal. Chem. 67: 735–743,
1995).
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Eine
weitere Klasse von Biomaterialien, die keine abstrahierbaren Wasserstoffe
besitzt, sind faserartig oder porös. Die Erfindungspolymere bilden
kovalent vernetzte Polymer-Netzwerke, die die Poren füllen oder Filme
um einzelne Fasern herum bilden und daher physikalisch eingeschlossen
sind. Expandiertes Polytetrafluorethylen ist solch ein Biomaterial.
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Biomaterialien
können
verwendet werden, um eine Reihe von Vorrichtungen herzustellen,
die mit bioaktiven Gruppen unter Verwendung eines polybiofunktionellen
Reagens der vorliegenden Erfindung beschichtet werden können. Implantatvorrichtungen
sind eine allgemeine Klasse von geeigneten Vorrichtungen und schließen Gefäßvorrichtungen,
wie etwa Transplantate, Stents, Katheter, Ventile, künstliche
Herzen und Herzunterstützungsvorrichtungen;
orthopädische
Vorrichtungen, wie etwa Gelenkimplantate, Frakturreparaturvorrichtungen
und künstliche
Sehnen; dentale Vorrichtungen, wie etwa Dentalimplantate und Frakturreparaturvorrichtungen;
ophthalmische Vorrichtungen, wie etwa Linsen und Glaucom-Drainageshunts;
und andere Katheter, synthetische Prothesen und künstliche
Organe ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Weitere geeignete biomedizinische
Vorrichtungen schließen
Dialyseschläuche
und -membranen, Blutoxygenatorschläuche und -membranen, Blutbeutel,
Nahtmaterialien, Membranen, Zellkulturvorrichtungen, chromatographische
Trägermaterialien,
Biosensoren und dergleichen ein.
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Herstellung
von Reagentien. Die Fachleute, denen man die vorliegende Lehre gibt,
werden die Art und Weise erkennen, auf die Reagentien der vorliegenden
Erfindung unter Verwendung herkömmlicher
Techniken und Materialien hergestellt werden können. In einem bevorzugten
Verfahren wird eine Polymer-Hauptkette durch die Copolymerisation
eines Basis-Monomers, wie etwa Acrylamid oder N-Vinylpyrrolidon,
mit Monomeren mit photoreaktiven und/oder thermochemisch reaktiven
Seitengruppen hergestellt. Die durch diese Copolymerisation hergestellten
Polymere werden dann mit dem bioaktiven Molekül durch Reaktion durch die
thermochemisch reaktiven Gruppen derivatisiert. Ein Beispiel für eine solche
Kopplung ist die Reaktion zwischen einem N-Oxysuccinimid(NOS)-Ester
auf der polymeren Hauptkette mit einer Amingruppe auf dem bioaktiven Molekül.
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Ein
alternatives bevorzugtes Verfahren umfaßt die Herstellung von Monomeren,
die die gewünschte bioaktive
Gruppe sowie eine polymerisierbare Funktion, wie etwa eine Vinylgruppe,
enthalten. Solche Monomere können
dann mit Monomeren, die photoreaktive Gruppen enthalten, und mit
einem Basis-Monomer, wie etwa Acrylamid oder N-Vinylpyrrolidon, copolymerisiert werden.
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Ein
bevorzugtes Verfahren, das verwendet wird, um latente reaktive Peptidpolymere
zu synthetisieren, umfaßt
die Synthese von N-substituierten Methacrylamid-Monomeren, die jeweils
Peptid (Peptid-Monomer) und ein Methacrylamid-Monomer enthalten,
das ein substituiertes Benzophenon enthält (4-Benzoylbenzoeäsure, BBA).
Die Peptid-Monomere wurden durch Umsetzen der Sulfhydryl-Einheit
jeden Peptids mit der Maleiimid-Einheit von N-[3-(6-Maleimidylhexanamido)propyl]methacrylamid
(Mal MAm) hergestellt. Dann wurde jedes Peptid-Monomer mit Acrylamid
und dem Monomer, das BBA enthält
(BBA-APMA), copolymerisiert, um das endgültige latente reaktive Peptidpolymer
herzustellen.
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Verschiedene
Parameter können
eingestellt werden, um Reagentien mit einem gewünschten Verhältnis (entweder
auf Mol- oder Gewichtsbasis) von polymerer Hauptkette, photoreaktiven
Einheiten und bioaktiven Gruppen bereitzustellen. Die Hauptkette
selbst wird zum Beispiel typischerweise zwischen etwa 40 und etwa
400 Kohlenstoffatome pro reaktive Gruppe und vorzugsweise zwischen
etwa 60 und etwa 300 Kohlenstoffatome bereitstellen.
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Im
Hinblick auf die bioaktive Gruppe kann die Länge der Hauptkette in Abhängigkeit
von solchen Faktoren variieren wie der Größe der bioaktiven Gruppe und
der gewünschten
Beschichtungsdichte. Für
relativ kleine bioaktive Gruppen (MG weniger als 3.000) wird die
polymere Hauptkette zum Beispiel typischerweise im Bereich von etwa
5 bis etwa 200 Kohlenstoffatome pro bioaktive Gruppe liegen und
vorzugsweise zwischen etwa 10 und etwa 100. Für größere bioaktive Gruppen, wie
diejenigen mit einem Molekulargewicht zwischen etwa 3.000 und etwa
50.000, stellt die bevorzugte Hauptkette im Durchschnitt zwischen
etwa 10 und etwa 5.000 Kohlenstoffatome pro bioaktive Gruppe und
vorzugsweise zwischen etwa 50 und 1.000 Kohlenstoffatome bereit.
In jedem Fall werden die Fachleute, denen man die vorliegende Beschreibung
gibt, in der Lage sein, die geeigneten Bedingungen zu bestimmen,
um eine optimale Kombination von Dichte und Bewegungsfreiheit der
bioaktiven Gruppen bereitzustellen.
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Beschichtungsverfahren.
Reagentien der vorliegenden Erfindung können auf Biomaterialoberflächen unter
Verwendung von Techniken (z.B. Tauchen, Sprühen, Bürsten) innerhalb der Fähigkeiten
der Fachleute auf diesem Gebiet aufgebracht werden. In einer bevorzugten
Ausführungsform
wird zunächst
das polybifunktionelle Reagens synthetisiert und dann mit einem
zuvor gebildeten Biomaterial in Kontakt (d.h. ausreichende Nähe, um Bindung
zu erlauben) gebracht. Die photoreaktive Gruppe wird über eine äußere Stimulation
(z.B. Einwirkung einer geeigneten Lichtquelle) aktiviert, um, über Erzeugung
freier aktiver Spezies, eine kovalente Bindung zwischen dem Reagens
und entweder einem weiteren polybifunktionellen Reagensmolekül oder der Biomaterialoberfläche zu bilden.
Dieses Beschichtungsverfahren wird hierin als das „einstufige
Beschichtungsverfahren" bezeichnet,
da photoreaktive Kopplungschemie ein Erfindungs-Polymer an eine
Biomaterialoberfläche bindet
und keine anschließenden
Schritte erforderlich sind, um die bioaktive Gruppe hinzuzufügen. Die äußere Stimulation,
die wünschenswerterweise
eingesetzt wird, ist elektromagnetische Strahlung und ist vorzugsweise
Strahlung in den ultravioletten, sichtbaren oder infraroten Bereichen
des elektromagnetischen Spektrums.
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Photoaktivierbare
Polymer der Erfindung können
auch verwendet werden, um Bioeinheiten in Mustern auf den Oberflächen von
Biomaterialien zu immobilisieren, zum Beispiel durch Verwendung
von Techniken, die zuvor für
die Erzeugung von Beschichtungsmustern mit Merkmalen von 50–350 mm
Größe beschrieben
sind. (Siehe Matsuda, T. und T. Sugawara, J. Biomed. Mater. Res.
29: 749–756
(1995)). Hydrophile Muster, die die Anheftung und das Wachstum von
Endothelzellen hemmen, können
zum Beispiel erzeugt werden durch: 1) Synthetisieren latenter reaktiver
hydrophiler Polymere, 2) Hinzugeben der latenten reaktiven Polymere
zu Gewebekultur-Polystyrolplatten, 3) Bestrahlen der Polymere durch
eine Musterphotomaske und 4) Entfernen nicht-immobilisierter Polymere
durch Waschen mit einem geeigneten Lösemittel.
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Solch
ein Ansatz kann mit Polymeren der vorliegenden Erfindung eingesetzt
werden, um Muster spezifischer Bioeinheiten zu immobilisieren. Mikroarrays
spezifischer Bindungsmoleküle
(z.B. Antikörper,
Antigene/Haptene, Nukleinsäuresonden,
etc.) können
zum Beispiel auf optischen, elektrochemischen oder Halbleiter-Sensoroberflächen immobilisiert
werden, um simultane Multianalyt-Testfähigkeiten oder Mehrfachempfindlichkeitsbereichtests
für einzelne
Analyten bereitzustellen. Gemusterte Immobilisation liefert auch
ein nützliches
Werkzeug zur Entwicklung eines „Labors auf einem Chip", bei dem aufeinanderfolgende
Verarbeitungs-/Reaktionsschritte entlang eines Fluidbewegungsweges
in einem mehrstufigen Mikrovolumentestsystem eintreten. Musterbildung
von Zellanheftungsfaktoren, zum Beispiel denjenigen, die die Anheftung
von neuralen Zellen an Elektroden fördern, werden die Entwicklung
von: 1) neuen Generationen ultrasensitiver Biosensoren und 2) künstlichen
Gliedmaßen,
die direkt vom Nervensystem des Patienten gesteuert werden, erlauben.
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Reagentien
der Erfindung können
kovalent an zuvor gebildete Biomaterialien gekoppelt werden, um als
Oberflächenbeschichtungen
zu dienen. Die vorliegenden Reagensmoleküle können auch kovalent an benachbarte
Moleküle
gekoppelt werden, um Filme oder biologische Schüttgüter herzustellen. Die Oberflächenbeschichtungen,
Filme und biologische Schüttgüter, die
aus der Kopplung über
photoreaktive Einheiten resultieren, liefern nützliche Dichten von bioaktiven
Gruppen auf der Oberfläche
der resultierenden Biomaterialien.
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Verwendung
von Vorrichtungen. Bioaktive Polymere der vorliegenden Erfindung
werden verwendet, um die Oberflächen
existierender Biomaterialien zu modifizieren oder neue Biomaterialien
zu erzeugen. Biomedizinische Vorrichtungen, die resultierende Biomaterialien
enthalten, werden für
eine Vielzahl von in-vitro- und in-vivo-Anwendungen verwendet. Biomedizinische
Vorrichtungen, die Zellanheftungsgruppen oder Wachstumsfaktoren
als Bioeinheiten besitzen, fördern
zum Beispiel die Anheftung und/oder das Wachstum von Zellen auf
in-vitro-Zellkulturvorrichtungen und verbessern die Gewebeintegration
bei Implantatvorrichtungen, wie etwa Gefäßtransplantaten, orthopädischen
Implantaten, dentalen Implantaten, Hornhautlinsen und Brustimplantaten.
Biomedizinische Vorrichtungen, die Antithrombosefaktoren als Bioeinheiten
besitzen, verhindern Thrombose auf den Oberflächen von mit Blut in Kontakt
kommenden Vorrichtungen, wie etwa Kathetern, Herzklappen, Gefäßstents,
Gefäßtransplantaten,
Stenttransplantaten, künstlichen
Herzen und Blutoxygenatoren.
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Biomedizinische
Vorrichtungen, wie etwa Harze oder Membranen, die Rezeptoren oder
Liganden als Bioeinheiten besitzen, können für Affinitätsreinigung eines breiten Bereiches
von Biomolekülen
verwendet werden. Heparin (das auch eine antithrombotische Einheit
ist) wird zum Beispiel verwendet, um mehrere Gerinnungsfaktoren,
Proteaseinhibitoren, Lipoproteine, Wachstumsfaktoren, lipolytische
Enzyme, extrazelluläre Matrixproteine
und virale Hüllproteine
zu binden und zu reinigen. Staphylococcales Protein A bindet spezifisch Immunoglobuline
und hat sich als sehr nützlich
zur Reinigung von Antikörpern
erwiesen. Streptavidin ist ein Protein, das sich mit extrem hoher
Affinität
spezifisch an Biotin bindet. Streptavidin und Biotin sind ein sehr nützliches
Paar von Reagentien als ein sekundäres Bindungspaar in Diagnosetests.
Oftmals können
Signalamplifikation, erhöhte
Empfindlichkeit und schnellere Testleistung durch Verwendung immobilisierten
Streptavidins erreicht werden.
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Biomedizinische
Vorrichtungen mit oberflächenbeschichteten
Antikörpern
oder Antigenen können
in Diagnosetests verwendet werden, die von der Spezifität der Bindung
für den
empfindlichen Nachweis des komplementären Antigens oder Antikörpers abhängen. Die
Antikörper
oder Antigene können
auf Membranen, Plastikröhren,
Mikroplattenvertiefungen oder Festkörper-Biosensorvorrichtungen
immobilisiert werden. Immobilisierte Antikörper sind auch wichtig zur
Reinigung einer Vielzahl biopharmazeutischer Mittel. Proteine, die
in Bakterien oder Pilzen durch Gentechnologie erzeugt werden, können durch
Affinitätsreinigung
mit immobilisierten Antikörpern
gereinigt werden. Blutfraktionen, wie etwa Gerinnungsfaktor VIII
(antihämophiler
Faktor), werden ebenfalls durch immobilisierte Antikörper gereinigt.
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Biomedizinische
Vorrichtungen mit Oberflächen,
die mit Nukleinsäuresequenzen
beschichtet sind, können
verwendet werden, um komplementäre
Nukleinsäuresequenzen
selektiv zu binden. Solche Vorrichtungen werden in Diagnosetests
verwendet, um das Vorhandensein komplementärer Nukleinsäuresequenzen
in Testproben zu identifizieren. Vorrichtungen mit oberflächenbeschichteten
Enzymen als Bioeinheiten können für einen
bereiten Bereich von Enzymreaktoren verwendet werden, um entweder
Syntheseverfahren (z.B. die chirale Pharmazeutika herstellen) oder
Abbau-/Umwandlungsverfahren (z.B. die Stärke abbauen und Glucose in
Fructose umwandeln, zur Herstellung von Maissirup mit hohem Fructosegehalt)
zu katalysieren.
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Beschichtete
antimikrobielle Mittel können
verwendet werden, um bakterielles Wachstum auf den Oberflächen von
Vorrichtungen zu hemmen. Solche antimikrobiellen Oberflächen können die
Rate von Infektionen verringern, die mit Implantatvorrichtungen
zusammenhängen,
einschließlich
mehrerer Typen von Kathetern (intravaskulär, peritoneal, Hämodialyse,
Hydrocephalus und urologisch), arteriovenösen Shunts, Herzklappen, Gefäßtransplantaten,
Tracheotomieschläuchen,
orthopädischen
Implantaten und Penisimplantaten. Mehrere in-vitro-Vorrichtungen
können
ebenfalls von solchen Oberflächen
profitieren, z.B. durch Hemmen der Biofilmbildung. Diese schließen Kontaktlinsenkästchen,
Wasserleitungen in Dentaleinheiten, Leitungen, die in der Lebensmittel-
und pharmazeutischen Industrie verwendet werden, Lebensmittelverpackung,
Tischoberflächen
und andere Oberflächen,
die für
die Lebensmittelhandhabung verwendet werden, und Luftfilter ein.
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BEISPIELE
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Die
Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden nicht-beschränkenden
Beispiele weiter beschrieben werden. Es wird für die Fachleute deutlich sein,
daß viele
Veränderungen
in den beschriebenen Ausführungsformen
vorgenommen werden können,
ohne vom Schutzumfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Sofern
nicht anders angegeben, sind alle Prozentanteile gewichtsbezogen.
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Beispiel 1
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Peptidpolymere
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A. Synthese von 4-Benzoylbenzoylchlorid
(BBA-Cl)
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4-Benzoylbenzoesäure (BBA),
200,0 g (0,884 mol), wurde zu einem trockenen 2 Liter-Rundkolben zugegeben,
gefolgt von der Zugabe von 273 ml Thionylchlorid. Dimethylformamid
(DMF), 684 μl,
wurde dann zugegeben und die Mischung wurde für 3–4 Stunden unter Rückfluß gekocht.
Nach Abkühlung
wurde das überschüssige Thionylchlorid
auf einem Rotationsverdampfer bei Wassersaugdruck abgezogen. Jegliches
verbliebenes Thionylchlorid wurde durch wiederholte Verdampfung
mit 3 × 100
ml Toluol entfernt. Das Endprodukt wurde dann aus 5:1 Hexan:Toluol
umkristallisiert mit typischen Ausbeuten an BBA-Cl bei > 90% und einem Schmelzpunkt
von 92–94°C.
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B. Synthese von N-[3-(4-Benzoylbenzamido)propyl]methacrylamid
(BBA-APMA)
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N-[3-Aminopropyl)methacrylamid-Hydrochlorid
(APMA-HCl, 120 g, 0,672 mol, von Eastman Kodak Co., Rochester, N.
Y.) wurde zu einem trockenen 2 Liter-Dreihalsrundkolben, der mit
einem Überkopfrührer ausgestattet
war, zugegeben. Phenothiazin, 23–25 mg, wurde als ein Inhibitor
zugegeben, gefolgt von 800 ml Chloroform. Die Suspension wurde auf
einem Eisbad unter 10°C
abgekühlt
und 172,5 g (0,705 mol) BBA-Cl wurden als ein Feststoff zugegeben.
Triethylamin, 207 ml (1,485 mol), in 50 ml Chloroform wurde dann
tropfenweise über
einen Zeitraum von 1–1,5
Stunden zugegeben. Das Eisbad wurde entfernt und das Rühren bei Umgebungstemperatur
wurde für
2,5 Stunden fortgesetzt. Das Produkt wurde dann mit 600 ml 0,3 N
HCl und 2 × 300
ml 0,07 N HCl gewaschen. Nach Trocknen über Natriumsulfat wurde das
Chloroform unter verringertem Druck abgezogen und das Produkt wurde
zweimal aus 4:1 Toluol:Chloroform unter Verwendung von 23–25 mg Phenothiazin
bei jeder Umkristallisation, um Polymerisation zu verhindern, umkristallisiert.
Typische Ausbeuten an BBA-APMA waren 90% mit einem Schmelzpunkt
von 147–151°C.
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C. Synthese von N-[3-(6-Maleimidohexanamido)propyl]methacrylamid
(Mal-MAm)
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6-Maleimidohexansäure wurde
durch Auflösen
von 6-Aminohexansäure
(100,0 g, 0,762 mol) in 300 ml Essigsäure in einem 3 Liter-Dreihalskolben,
der mit einem Überkopfrührer und
einem Trockenrührer
ausgestattet war, hergestellt. Maleinsäureanhydrid, 78,5 g (0,801
mol), wurde in 200 ml Essigsäure
gelöst
und zur 6-Aminohexansäure-Lösung zugegeben.
Die Mischung wurde eine Stunde gerührt, während sie auf einem siedenden
Wasserbad erhitzt wurde, was zur Bildung eines weißen Feststoffes
führte.
Nach Abkühlen über Nacht bei
Raumtemperatur wurde der Feststoff durch Filtration gesammelt und
mit 2 × 50
ml Hexan gespült.
Typische Ausbeute der (Z)-4-Oxo-S-aza-2-undecendisäure betrug
90–95%
mit einem Schmelzpunkt von 160–165°C.
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(Z)-4-Oxo-S-aza-2-undecendisäure, 150,0
g (0,654 mol), Essigsäureanhydrid,
68 ml (73,5 g, 0,721 mol), und Phenothiazin, 500 mg, wurden zu einem
2 Liter-Dreihalsrundkolben, der mit einem Überkopfrührer ausgestattet war, zugegeben.
Triethylamin (TEA), 91 ml (0,653 mol), und 600 ml Tetrahydrofuran
(THF) wurden zugegeben und die Mischung wurde unter Rühren auf
Rückfluß erhitzt.
Nach insgesamt 4 Stunden Rückfluß wurde
die dunkle Mischung auf < 60°C abgekühlt und
in eine Lösung
von 250 ml 12 N HCl in 3 Litern Wasser gegossen. Die Mischung wurde
3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt
und wurde dann durch ein Filtrationskissen (Celite 545, J. T. Baker,
Jackson, TN) filtriert, um Feststoffe zu entfernen. Das Filtrat
wurde mit 4 × 500
ml Chloroform extrahiert und die vereinigten Extrakte wurden über Natriumsulfat
getrocknet. Nach Zugabe von 15 mg Phenothiazin, um Polymerisation
zu verhindern, wurde das Lösungsmittel
unter verringertem Druck abgezogen. Die 6-Maleimidohexansäure wurde aus 2:1 Hexan:Chloroform
umkristallisiert, um typische Ausbeuten von 55–60% mit einem Schmelzpunkt
von 81–85°C zu ergeben.
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Der
N-Oxysuccinimidester (NOS) von 6-Maleimidohexansäure wurde durch Auflösen von
1,0 g (4,73 mmol) 6-Maleimidohexansäure und 0,572 g (4,97 mmol)
N-Hydroxysuccinimid (NHS) in 10 ml trockenem Dioxan, gefolgt von
der Zugabe von 1,074 g (5,21 mmol) 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), hergestellt.
Die Reaktionsmischung ließ man über Nacht
bei Raumtemperatur rühren.
Das 1,3-Dicyclohexylharnstoff-Nebenprodukt wurde durch Filtration
entfernt und der Filterkuchen wurde mit 3 × 10 ml Dioxan gespült. Phenothiazin
(0,2 mg) wurde zugegeben und die Lösung wurde unter verringertem
Druck eingedampft. Der resultierende Feststoff wurde mit Hexan extrahiert,
um jegliches überschüssige DCC
zu entfernen, und dieses Produkt wurde ohne irgendeine zusätzliche
Reinigung verwendet.
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Das
N-Succinimidyl-6-maleimidohexanoat, 414 mg (1,34 mmol), und N-(3-Aminopropyl)methacrylamid-Hydrochlorid,
200 mg (1,12 mmol), wurden mit 10 ml Chloroform verdünnt, gefolgt
von der Zugabe von 153 μl
(1,10 mmol) TEA über
eine Zeitraum von 1 Stunde bei Raumtemperatur. Die Mischung ließ man über Nacht
bei Raumtemperatur rühren.
Das Produkt wurde durch Eindampfen isoliert und durch Silicagelflashchromatographie
unter Verwendung eines 99:1, gefolgt von einem 97:3 Chloroform:Methanol-Gradienten
gereinigt. Das Poolen der Fraktionen, Zugabe von 10 mg p-Methoxyphenol und
Verdampfen des Lösemittels
ergaben 261 mg Produkt. Massenspektrumanalyse einer Probe ergab
M+ = 335 (10,7%) und NMR zeigte Protonenpeaks
von Maleimid (6,6 ppm) und allylischem Methyl (2,0 ppm).
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D. Synthese von Peptidmonomeren
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Fünf Peptide
wurden als Bioeinheiten verwendet. Jede Peptideinheit wurde durch
Standard-Festphasensyntheseverfahren
synthetisiert und ist unten durch seinen üblichen Namen, ein repräsentatives
Literaturzitat, das Stammprotein, aus dem es identifiziert wurde,
und die spezifische verwendete Sequenz (angegeben durch Standard-Einzelbuchstabennotation
zur Identifizierung von Aminosäuren)
identifiziert.
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Für jede Peptidsequenz
repräsentiert
der Abschnitt der Sequenz, der nicht unterstrichen ist, die native Sequenz,
die im Stammprotein vorhanden ist. Der Abschnitt der Sequenz, der
unterstrichen ist, repräsentiert Aminosäuren, die
hinzugefügt
wurden, um spezifische funktionelle Gruppen bereitzustellen. Die
Lysin-Reste (K) wurden hinzugefügt,
um primäre
Amine bereitzustellen (epsilon-Aminogruppen), die zur radioaktiven
Markierung über
reduktive Methylierung verwendet wurden. Cystein-Reste (C) wurden
hinzugefügt,
um Sulfhydrylgruppen bereitzustellen, die zur Kopplung jedes Peptids
an Maleimidgruppen verwendet wurden, die auf Monomeren vorlagen,
die anschließend
dimerisiert wurden, um die Peptidpolymere herzustellen. C/H-II enthielt ausreichend
Lysin-Reste in seiner nativen Sequenz und benötigte das Hinzufügen zusätzlicher
Lysinreste nicht; in ähnlicher
Weise enthielt F-9 einen Cystein-Rest als Teil seiner nativen Sequenz
und benötigte
das Hinzufügen
eines zusätzlichen
Cystein-Restes nicht.
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Eine
geeignete Menge Mal-MAm wurde aus einer Vorratslösung von Mal-MAm im Chloroform
entnommen und wurde in einer Reaktionsphiole gegeben, unter Stickstoffstrom
getrocknet und erneut in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst. Eine
gleiche molare Menge von jedem Peptid wurde in entgastem 50 mM Acetatpuffer (pH
5) gelöst,
zur Reaktionsphiole zugegeben und die Mischung wurde für 60–90 Minuten
bei Raumtemperatur gerührt.
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E. Synthese photoreaktiver
Polyacrylamide unter Verwendung von Peptid-Monomeren (Peptid-Polymere)
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BBA-APMA
wurde in einer Konzentration von 10 mg/ml in DMSO gelöst und Acrylamid
wurde in einer Konzentration von 100 mg/ml in Wasser gelöst. Die
Peptid-Monomere wurden nicht gereinigt, nachdem sie synthetisiert
worden waren, und blieben in Lösungen
von Acetatpuffer gelöst,
die DMSO enthielten, wie oben beschrieben. Die geeigneten molaren
Mengen BBA-APMA-Monomer und Acrylamid wurden dann zu jeder Reaktionsphiole
zugegeben. Jede Mischung wurde durch Wasserabsaugung für 15 Minuten
entgast. Ammoniumpersulfat (10% Vorratslösung in Wasser) und N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED) wurden
(in den unten angegebenen Mengen) zugegeben, um die Polymerisation
zu katalysieren. Jede Mischung wurde erneut entgast und über Nacht
bei Raumtemparatur in einem verschlossenen Exsikkator inkubiert.
Jedes resultierende Peptid-Copolymer wurde gegen Wasser (unter Verwendung
von Spectra/Por 50.000 MWCO-Dialyseschlauch von Spectrum Medical
Industries, Houston, TX) bei 4°C
dialysiert, um nicht-eingebaute Reaktanten zu entfernen, und dann
lyophilisiert.
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Die
folgende Tabelle gibt die Menge von jedem Reaktanten an, die für jede Copolymerisation
zugegeben wurde.
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Die
gewonnenen Mengen von jedem Peptid-Polymer nach Lyophilisation betrugen
72 mg RGD, 135 mg F-9, 100 mg C/H-II, 15,2 mg C/H-V und 17,8 mg
HEP-III.
-
F. Kopplung von Peptid-Polymeren
an Biomaterialien
-
Drei
Biomaterialien wurden verwendet: Polystyrol (PS), Polyurethan (PU)
und Silikongummi (SR). Abbrech-Polystyrolstreifen in der Größe einer
96-Well-Platte (Immulon I Removawell Strips von Dynatech Laboratories,
Inc., Chantilly, VA) wurden verwendet, um die immobilisierten Gehalte
von jedem Peptid-Polymer in Radiomarkierungsexperimenten zu bestimmen.
Sowohl 24- als auch 48-Well-PS-Kulturplatten (die nicht-steril und
nicht-plasmabehandelt
waren) wurden von Corning Costar Corp. (Cambridge, MA) erhalten
und zur Durchführung
der Zellwachstums-Bioaktivitätstests
verwendet. Flache PU-Blätter
(Pellethane 55-D) und flache SR-Blätter wurden jeweils von Specialty
Silicone Fabricators, Inc. (Paso Robles, CA) erhalten und gestanzt, um
Scheiben mit Durchmessern von 6, 10 und 15 mm Durchmesser herzustellen,
die entsprechend in die Vertiefungen von 96-, 48- und 24-Well-Kulturplatten
paßten.
Die Scheiben wurden in sowohl den Radiomarkierungstests als auch
den Bioaktivitätstests
verwendet.
-
Zwei
unterschiedliche Protokolle wurden verwendet, um die Peptide (Peptid-Polymere
oder Peptid-Reagenskontrollen) auf Biomaterialien aufzubringen,
wobei der Hauptunterschied darin lag, ob die Peptide auf den Biomaterialien
getrocknet wurden oder nicht, bevor sie bestrahlt wurden, um die
latenten reaktiven Gruppen zu aktivieren. Bei dem trockenen Immobilisierungsprotokoll
wurden die Peptide in 50% (v/v) Isopropanol (IPA) in Wasser verdünnt, zu
Biomaterialien, wie unten angegeben, zugegeben und vor der Bestrahlung getrocknet.
Beim nassen Immobilisierungsprotokoll wurden die Peptide in Wasser
verdünnt,
zu Biomaterialien, wie unten angegeben, zugegeben und vor der Bestrahlung
nicht trocknen gelassen.
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Bei
jedem Immobilisierungsprotokoll betrug die endgültige zugegebene Konzentration
an Peptid-Einheiten 50 μg/ml
und die folgenden Volumina wurden pro Vertiefung jeden Typs von
Kulturplatte zugegeben: 50 μl/Vertiefung
bei 96-Well-Platten, 100 μ/Vertiefung
bei 48-Well-Platten,
20 μl/Vertiefung
bei 24-Well-Platten. Wie oben angegeben, wurden Scheiben aus PU
und SR in die Böden
der Platten für
die Beschichtungs- und Bewertungsverfahren gegeben.
-
Die
Proben wurden mit einer Dymax-Lampe (Modell Nr. PC-2, Dymax Corporation,
Torrington, CT) bestrahlt, die einen Heraeus-Kolben (W. C. Heraeus
GmbH, Hanau, Bundesrepublik Deutschland) enthielt, um die in jedem
Polymer vorhandenen Photogruppen zu aktivieren und kovalente Bindung
an das Biomaterial zu erzeugen. Die Bestrahlungsdauer betrug 1–2 Minuten
bei einer Intensität
von 1–2
mW/cm2 im Wellenlängenbereich von 330–340 nm.
Adsorptionskontrollen wurden ebenfalls mit Peptid-Polymeren und
Peptid-Reagenskontrollen,
die nicht bestrahlt wurden, erzeugt.
-
Im
Anschluß an
entweder Photoimmobilisierung oder Adsorption wurden die Peptid-Polymere bzw. Peptid-Reagenskontrollen
umfassend auf einem Orbitalrüttler
(~ 150–200
UPM) gewaschen, um Peptide zu entfernen, die nicht fest an das Substrat
gebunden waren. Die Waschschritte schlossen ein: 1) eine Waschung über Nacht
mit drei Wechseln der Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung (PBS),
pH 7,3, die 1% Tensid Tween 20 enthielt, 2) ein 30-minütiger Wasch-/Sterilisierungsschritt
in 70% (v/v) Ethanol in Wasser und 3) vier Waschungen in steriler
PBS.
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G. Quantifizierung immobilisierter
Gehalte von Peptiden auf Biomaterialien
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Zwei
Peptid-Polymere (RGD-Polymer und F-9-Polymer) und ihre entsprechenden
Peptid-Reagenskontrollen
wurden mit Tritium durch reduktive Methylierung radioaktiv markiert
und verwendet, um den Gehalt von jedem Peptid zu bestimmen, der
auf jedem Biomaterial immobilisiert war. Peptid-Reagenskontrollen
wurden nicht in Polymere eingebaut und bestanden aus RGD (Sequenz
GRGDSPKKC) und F-9. Die vier mit Tritium markierten Peptide wurden
entsprechend [3H]-RGD-Polymer, [3H]-F-9-Polymer, [3H]-RGD-Reagenskontrolle
und [3H]-F-9-Reagenskontrolle genannt. Jedes
mit Tritium markierte Peptid wurde auf jedes Biomaterial (PS-Abbrechstreifen,
6 mm-Scheiben aus PU und 6 mm-Scheiben
aus SR) unter Verwendung des trockenen Immobilisierungsprotokolls
und des hierin beschriebenen Waschverfahrens aufgebracht.
-
Nach
dem Waschverfahren wurden die PS-Abbrechstreifen in einzelne Vertiefungen
gebrochen, in Szintillationsphiolen (1 Vertiefung/Phiole) gegeben,
in TMF gelöst
und in Aquasol-2 Fluor (DuPont NEN®, Boston,
MA) gezählt,
um die dpms/Probe zu bestimmen. Die PU-Scheiben wurden in THF gequollen
und in Aquasol-2 gezählt.
Die SR-Schreiben wurden in Soluene-350 Tissue Solubilizer gelöst und in
Hionic Fluor (jeweils von Packard Instrument Co., Meriden, CT) gezählt. Nachdem
die Biomaterialien durch Flüssigszintillationsspektrometrie
gezählt
waren, wurden die endgültigen
Beladungsdichten jedes Peptids (ng/cm2)
aus den bekannten spezifischen Aktivitäten (dpm/ng) jedes tritiierten
Reagens berechnet. Eine Zusammenfassung der Beladungsdichteergebnisse
ist in der Tabelle unten angegeben. Jeder Wert ist der Mittelwert
von drei oder mehr Bestimmungen. Immobilisiert bezieht sich auf
bestrahlte Proben. Adsorbiert bezieht sich auf nicht-bestrahlte
Proben. ND = nicht bestimmt.
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In
allen Fällen
zeigten die immobilisierten Peptid-Polymere (d.h. die Polymerbeschichtungen,
die bestrahlt worden waren) die größten Beladungsdichten. Die
Beladungsdichten der Peptid-Polymere
waren auch abhängig
vom Biomaterial, wobei die größten zurückbehaltenen
Gehalte an Peptid-Polymeren auf PS und SR vorlagen und die niedrigsten
zurückbehaltenen
Gehalte auf PU vorlagen. In jedem Fall waren die zurückbehaltenen
Gehalte an photoimmobilisierten Peptid-Polymeren in der Größenordnung
von 1,5- bis 9-mal größer als die
adsorbierten Peptid-Polymere und in der Größenordnung von 4,5- bis 39-mal
größer als
die adsorbierten Peptid-Reagenskontrollen.
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H. Zellanheftungsaktivität von immobilisierten
Peptiden
-
Kalbslungenarterienendothel(CPAE)-Zellen
wurden von der ATCC (American Type Culture Collection, Rockwell,
MD) bezogen und kultiviert, wie von der ATCC angegeben. Die Anheftungstests
wurden in 48-Well-PS-Kulturplatten durchgeführt. Wenn PU und SR bewertet
wurden, wurden Scheiben von jedem Material (mit oder ohne Beschichtungen)
in die Böden
der Kulturplattenvertiefungen gegeben. Wenn PS bewertet wurde, wurden
die Böden
der Vertiefungen beschichtet. Für
jeden Test wurden nicht-beschichtete und Peptid-beschichtete Biomaterialien (PS, PU
und SR) mit 50.000 Zellen pro Vertiefung in serumfreiem Medium,
das 2 mg/ml Rinderserumalbumin enthielt (BSA-Fraktion V von Sigma
Chemical Company, St. Louis, MO) beimpft. Die Zellen ließ man für zwei Stunden
an jedes Biomaterial anheften. Dann wurden die nicht-angehefteten
Zellen durch Absaugung entfernt und die Vertiefungen wurden zweimal
mit Hank's Balanced
Salt Solution (Celox Corp., Hopkins, MN) gespült. Schließlich wurden die angehefteten
Zellen quantifiziert durch die Zugabe von Kulturmedium, das einen
Stoffwechselfarbstoff enthielt, MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid],
der von einem gelben Tetrazoliumsalz in Gegenwart von lebensfähigen Zellen
in ein unlösliches, purpurnes
Formazan umgewandelt wird. Nach einer zweistündigen Inkubation im Kulturmedium,
das MTT enthielt, wurde das Medium entfernt und der Formazan-Farbstoff,
der innerhalb der lebensfähigen
Zellen abgeschieden worden war, wurde (mit saurem Isopropanol) löslich gemacht
und auf einem Spektrophotometer bei 570 nm abgelesen. Die Extinktion
des Formazans ist direkt proportional zur Anzahl angehefteter, lebensfähiger Zellen,
die pro Vertiefung vorhanden sind.
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Die
folgende Tabelle faßt
die Ergebnisse von Zellanheftungstests zusammen, die immobilisierte
Peptid-Polymere und adsorbierte Peptid-Reagenskontrollen vergleichen.
In jedem Fall wurde die relative Anzahl von Zellen, die sich an
die Peptid-beschichteten Biomaterialien anhefteten (wie bestimmt
mit MTT-Farbstoff), durch die Anzahl Zellen geteilt, die sich an
die nicht-beschichteten (UC) Biomaterialien anhefteten, um eine relative
Zellanheftungsbewertung zu erhalten. Jeder Wert repräsentiert
den Mittelwert von 1 bis 4 unterschiedlichen Experimenten, wobei
jedes Experiment mit 3 oder 4 Replikaten durchgeführt wurde.
Die Peptide wurden unter Verwendung des hierin beschriebenen nassen
Immobilisierungsprotokolls auf PS immobilisiert und die Peptide
wurden über
das trockene Immobilisierungsprotokoll auf SR und PU immobilisiert.
Immobil. Peptid-Polymer bezieht sich auf bestrahltes Peptid-Polymer.
Adsorbiertes Peptid-Reagens bezieht sich auf nicht-bestrahltes Peptid-Reagens.
ND = nicht bestimmt.
-
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Diese
Ergebnisse zeigen, daß die
photoimmobilisierten Peptid-Polymere die Zellanheftung an alle drei Biomaterialien
verstärkten.
Die größten Verbesserungen
wurden mit RGD-Polymer, das auf allen drei Biomaterialien photoimmobilisiert
war, und F-9-Polymer, das auf PS photoimmobilisiert war, beobachtet
(4,3- bis 10-fache Verbesserungen), wobei geringere Verbesserungen
mit F-9-Polymer auf PU und C/H-V-Polymer auf SR und PU beobachtet
wurden (1,3- bis 1,9-fache Verbesserungen). In jedem Falle, in dem
adsorbierte Peptid- Reagenskontrollen
mit photoimmobilisierten Peptid-Polymeren verglichen wurden, war
die Zellanheftung auf den Peptid-Polymeren größer.
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I. Zellwachstumsaktivität immobilisierter
Peptide
-
Die
Wachstumstests wurden in 24-Well-PS-Kulturplatten durchgeführt. Wenn
PU und SR bewertet wurden, wurden Scheiben aus jedem Material (mit
oder ohne Beschichtungen) in die Böden der Kulturplattenvertiefungen
gegeben. Wenn PS bewertet wurde, wurden die Böden der Vertiefungen beschichtet.
Für jeden Test
wurden nicht-beschichtete und Peptid-beschichtete Biomaterialien (PS, PU
und SR) mit CPAE-Zellen mit 1.500 Zellen pro Vertiefung beimpft
und in vitro für
4 bis 7 Tage proliferieren gelassen. Dann wurde das Medium abgesaugt
und das Zellwachstum wurde unter Verwendung von MTT-Farbstoff quantifiziert.
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Die
folgende Tabelle faßt
die Ergebnisse zusammen, die Zellwachstum auf nicht-beschichteten Substraten,
adsorbierten Peptiden und Peptid-Polymeren verglichen. Wie bei den
Anheftungstests wurde die relative Anzahl von Zellen, die auf jedem
Peptid-beschichteten
Biomaterialien wuchsen, durch die Anzahl Zellen geteilt, die auf
den nicht-beschichteten
(UC) Biomaterial wuchsen, um eine relative Zellwachstumsbewertung zu
erhalten. Jeder Wert repräsentiert
den Mittelwert von 1 bis 4 unterschiedlichen Experimenten, wobei
jedes Experiment mit 3 oder 4 Replikaten durchgeführt wurde.
Das hierin beschriebene trockene Immobilisierungsprotokoll wurde
verwendet, um alle bewerteten Peptide zu immobilisieren. Immobil.
Peptid-Polymer bezieht sich auf bestrahltes Peptid-Polymer. Adsorbiertes
Peptid-Reagens bezieht sich auf nicht-bestrahltes Peptid-Reagens.
ND = nicht bestimmt.
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-
Zusätzlich zu
den in der Tabelle oben angegebenen Peptiden wurden C/H-II und HEP-III
ebenfalls auf Wachstum auf PS bewertet. Bei diesen zwei Peptiden
betrug das Wachstum auf adsorbierten Peptiden das 1,0- bis 1,1-fache
desjenigen, das auf nicht-beschichtetem PS beobachtet wurde, und
das Wachstum auf Peptid-Polymeren betrug das 10,5- und 13-fache
desjenigen, das auf nicht-beschichtetem PS beobachtet wurde. Diese
zwei Peptide (Polymere und Reagenskontrollen) wurden über das
nasse Immobilisierungsprotokoll immobilisiert. Die Ergebnisse mit
C/H-II und HEP-III sind die Mittelwerte von 1 bzw. 2 Experimenten,
wobei jedes Experiment mit 4 Replikaten durchgeführt wurde.
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Diese
Wachstumstests zeigen, daß alle
fünf Peptid-Polymere,
die auf PS photoimmobilisiert waren, Wachstum förderten, das 1,5- bis 17,5-mal
größer war
als Wachstum auf nicht-beschichtetem
PS. Auch verstärkten
die drei Peptid-Polymere das Zellwachstum auf PU um das 3,9- bis
9,4-fache. Nur leichte Verbesserungen im Zellwachstum wurden auf
SR beobachtet.
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Beispiel 2
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Hirudin-Polymer
-
A. Synthese von N-Succinimidyl-6-(4-benzoylbenzamido)hexanoat
(BBA-EAC-NOS)
-
BBA-Cl
(30,00 g, 0,123 mol), hergestellt wie beschrieben in Beispiel 1,
wurde in 450 ml Toluol gelöst. Eine
Menge (16,1 g, 0,123 mol) 6-Aminohexansäure (die hierin alternativ
als ε-Aminocapronsäure bezeichnet werden
wird oder als ihre abgekürzte
Form EAC) wurde in 375 ml 1 N NaOH gelöst und diese Lösung wurde zur
Lösung
des Säurechlorids
zugegeben. Die Mischung wurde für
45 Minuten bei Raumtemperatur kräftig
gerührt,
um eine Emulsion zu erzeugen. Das Produkt wurde dann mit 1 N HCl
angesäuert
und mit 3 × 450
ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden über Magnesiumsulfat
getrocknet, filtriert und unter verringertem Druck eingedampft.
Die 6-(4-Benzoylbenzamido)hexansäure
wurde aus Toluol:Ethylacetat umkristallisiert, um 36,65 g Produkt,
m. p. 106–109°C, zu ergeben.
-
Die
6-(4-Benzoylbenzamido)hexansäure
(25 g, 73,7 mmol) wurde zu einem trockenen Kolben zugegeben und
in 500 ml trockenem 1,4-Dioxan gelöst. NHS (15,5 g, 0,135 mol)
wurde zugegeben und der Kolben wurde auf einem Eisbad unter einer
trockenen N2-Atmosphäre abgekühlt. DCC (27,81 g, 0,135 mol)
in 15 ml 1,4-Dioxan wurde dann zugegeben und die Mischung wurde über Nacht
gerührt.
Nach Filtration, um den 1,3-Cyclohexylharnstoff zu entfernen, wurde
das Lösemittel
unter verringertem Druck abgezogen und das Produkt wurde zweimal
aus Ethanol umkristallisiert, um 23,65 g eines weißen Feststoffes,
m. p. 121–123°C, zu ergeben.
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B. Synthese eines photoreaktiven
Polyacrylamids, das Hirudin-Liganden enthält (Hirudin-Polymer)
-
Methacryloyl-EAC-BBA
wurde hergestellt, indem 112 mg (0,629 mmol) APMA-HCl, 358 mg (0,818 mmol)
BBA-EAC-NOS und 80 mg (104 μl,
0,692 mmol) TEMED in 22 ml DMSO umgesetzt wurden. Die Mischung wurde
für 4,5
Stunden gerührt.
Dann wurde das NOS-Polymer hergestellt, indem zu dieser Mischung 4,20
g (59,1 mmol) Acrylamid, 532 mg (3,15 mmol) N-Acryloxysuccinimid
(Eastman Kodak, Rochester, N. Y.) und 64 mg (0,39 mmol) 2,2'-Azobisisobutyronitril
(AIBN) zugegeben wurden. Die Mischung wurde mit Helium gespült und bei
50°C über Nacht
inkubiert. Ein Teil der resultierenden Polymerlösung (10 ml) wurde mit 10 ml DMSO
verdünnt
und langsam zu kräftig
gerührtem
Aceton (200 ml) zugegeben, um das Polymer auszufällen. Das Polymer wurde gesammelt,
mit Aceton gewaschen, um Verunreinigungen zu entfernen, und unter
Vakuum getrocknet. Insgesamt 1,47 g wurden gewonnen.
-
Rekombinantes
Hirudin mit einer Reinheit von mehr als 90% und einer Aktivität von 16.500 ± 2.000 ATU/mg
wurde von Transgene Laboratories (Strasbourg, Frankreich) erhalten.
(Siehe unten für
Definition von ATU.) Hirudin ist ein Antithrombosemittel, das wirkt,
indem es sich an Thrombin bindet und die proteolytische Aktivität von Thrombin
hemmt. Hirudin (10,5 mg, 1,52 μmol)
wurde in 1 ml 0,1 M Carbonatpuffer gelöst. Das NOS-Polymer (hergestellt
wie oben beschrieben) wurde in DMSO mit 4 mg/ml gelöst. Dann
wurden 2 mg des NOS-Polymers zur Hirudin-Lösung zugegeben und über Nacht
gemischt. Die Hälfte
der Reaktionsmischung wurde in einem Spectra/Por 50.000 MWCO-Schlauch
gegen Wasser dialysiert, gefolgt von Lyophilisation. Insgesamt 5,9
mg Hirudin-Polymer wurden gewonnen, das 5,0 mg Hirudin und 0,2 mol
BBA pro Mol Hirudin enthielt. Das Hirudin wurde mit einem BCA-Protein-Testkit
(von Pierce Chemical Company, Rockford, IL) quantifiziert und der
BBA-Gehalt wurde spektrophotometrisch bestimmt.
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Ein
Kontrollpolymer („Ethanolamin-Polymer") wurde hergestellt,
indem anstelle von Hirudin Ethanolamin zum NOS-Polymer zugegeben
wurde. Das resultierende Ethanolamin-Polymer ist ungeladen und wurde als
eine Kontrolle in Experimenten verwendet, die die Bindung von Thrombin
an ein ähnliches
Polymer, das Ethanolamin anstelle von Hirudin enthielt, verglichen.
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C. Test auf Aktivitäten von
Hirudin und Hirudin-Polymer in Lösung
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Die
spezifischen Aktivitäten
von Hirudin und Hirudin-Polymer wurden durch Standardprotokolle
bestimmt, die von Transgene bereitgestellt wurden, und sind ausgedrückt als
Antithrombin-Einheiten (ATUs) pro mg Hirudin. Eine ATU ist die Menge
Hirudin, die erforderlich ist, um die proteolytische Aktivität einer
NIH-Einheit Thrombin zu hemmen. Für diese Tests wurde eine bekannte
Menge Rinderthrombin (175–350
NIH-Einheiten/mg, von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) mit einer
Reihe von Verdünnungen
von Hirudin oder Hirudin-Polymer vorinkubiert, und die zurückbleibende
Thrombinaktivität
wurde mit einem homogenen Substrat, Chromozym TH (von Boehringer
Mannheim Corp., Indianapolis, IN), bestimmt. Die spezifischen Aktivitäten von
getestetem Hirudin vor und nach Einarbeitung in das Hirudin-Polymer
betrugen 11.710 bzw. 10.204 ATU/mg. Daher erzeugte die Einarbeitung
von Hirudin in das Polymer nur eine 13%-ige Abnahme seiner Aktivität.
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D. Kopplung von Hirudin-Polymer
und Ethanolamin-Polymer an Biomaterialien.
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Flache
Blätter
aus drei Biomaterialien wurden verwendet: 1) Polyethylen (PE, primäres Referenzmaterial
von den National Institutes of Health, Bethesda, MD), 2) SR (medizinische
Qualität
SILASTIC® von
Dow Corning Corporation, Midland, MI) und 3) PU (Tecoflex® von
ThermoCardiosystems, Woburn, MA). Proben jeden Biomaterials wurden
in entweder Scheiben mit einem Durchmesser von 6 mm oder Quadrate
mit 1 × 1
cm geschnitten. Um Oberflächenverunreinigungen
vor den Beschichtungen zu entfernen, wurden die PU- und PE-Proben durch kurzes
Eintauchen in IPA gewaschen und SR wurde 1 Stunde mit Hexan extrahiert
und über Nacht
getrocknet. Zusätzlich
wurden die SR-Proben unmittelbar vor dem Aufbringen des Hirudin-Polymers oder
Ethanolamin-Polymers mit einem Argonplasma behandelt (3 min, 250
Watt, 250 mTorr).
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Das
Hirudin-Polymer wurde auf 1–25 μg/ml in 75:25
(v/v) Wasser:IPA verdünnt
und zu einer Seite jeder Biomaterialprobe zugegeben, die wie oben
beschrieben gewaschen oder extrahiert war. Die zugegebenen Hirudin-Polymerlösungen wurden
trocknen gelassen und wurden dann mit einer Dymax-Lampe bestrahlt.
Um locker anhaftendes Hirudin-Polymer zu entfernen, das nach dem
Beschichtungsverfahren zurückblieb,
wurde jede Probe 3-mal für
15 Minuten und dann über
Nacht in einer 1%-Lösung
von Tween 20 in PBS gewaschen. Dann wurde das Tween 20 durch Spülen der
Proben in entionisiertem Wasser entfernt.
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Drei
Typen Kontrollproben wurden ebenfalls hergestellt: 1) nicht-beschichtete
Kontrollen, zu denen Hirudin-Polymer nicht zugegeben wurde, 2) Proben,
zu denen das Hirudin-Polymer zugegeben, aber nicht bestrahlt wurde,
und 3) SR-Proben, die mit dem Ethanolamin-Polymer beschichtet wurden.
Für die
letztere Kontrolle wurde das Ethanolamin-Polymer (hergestellt wie
hierin beschrieben) in entionisiertem Wasser auf 1 oder 5 μg/200 μl verdünnt. Dann
wurden 200 μl-Aliquote
jeder Vorratslösung
zu einer Seite von 1 cm2-Proben aus SR zugegeben,
trocknen gelassen, photoaktiviert und in Tween 20/PBS und entionisiertem
Wasser gewaschen, wie hierin für
das Hirudin-Polymer beschrieben.
-
E. Quantifizierung der
Hirudin-Beladung auf Biomaterialien
-
Hirudin
wurde über
reduktive Methylierung radioaktiv markiert, in ein Hirudin-Polymer
eingearbeitet, wie hierin beschrieben, und verwendet, um die Menge
an Hirudin-Polymer zu quantifizieren, die auf jedem von drei Biomaterialien
immobilisiert war, wie hierin beschrieben. Um das zurückbehaltene
Tritium zu zählen,
wurden die Proben in THF gelöst,
in Aquasol verdünnt
und in einem Flüssigszintillationszähler Packard
1900CA gezählt.
Die in der Tabelle unten angegebenen Ergebnisse zeigen, daß die Menge
an zurückbehaltenem Hirudin-Polymer
proportional zur zugegebenen Menge war, und die zurückbehaltene
Menge nach Photoaktivierung ist das 2,3- bis 66-fache derjenigen,
die ohne Photoaktivierung zurückbehalten
wird. Jedes Ergebnis ist der Mittelwert von 4 Bestimmungen. N. A.
= nicht getestet.
-
-
F. Test auf Aktivität von Hirudin-Polymerbeschichtungen
auf Biomaterialien
-
Hirudin-Polymer,
das nicht mit Tritium markiert worden war, wurde auf jedes Biomaterial
aufgebracht, wie hierin beschrieben. Die Aktivität des immobilisierten Hirudin-Polymers
wurde dann durch Quantifizierung der Bindung von zugesetztem, mit
Tritium markiertem Thrombin (3H-Thr) getestet.
Das 3H-Thr wurde durch Markierung von menschlichem
Thrombin (4.000 NIH-Einheiten/mg Protein, von Sigma Chemical Co.) über reduktive
Methylierung hergestellt. Jede beschichtete Probe wurde in einer
Lösung
von 2 μg/ml 3H-Thr in einem Tris-Puffer (0,05 M Tris-HCl,
0,1 M NaCl, 0,1% PEG 3350, pH 8,5) für eine Stunde inkubiert und
mit demselben Puffer gespült,
der kein Thrombin enthielt, um nicht-gebundenes Thrombin zu entfernen.
Die Proben wurden dann in THF gelöst, in Aquasol verdünnt und
gezählt.
-
Die
in der Tabelle unten angegebenen Ergebnisse zeigen, daß die Menge
Thrombin, die durch Hirudin-beschichtete Biomaterialien zurückgehalten
wurde, proportional war zur Menge an immobilisiertem Hirudin. Jedes
Ergebnis ist der Mittelwert von 4 Bestimmungen. SR + EP1 und
SR + EP5 geben SR-Proben an, die mit dem
Ethanolamin-Polymer beschichtet waren, zugegeben mit 1,0 bzw. 5 μg/cm2. N. A. bedeutet nicht getestet. Kontrollexperimente
wurden durchgeführt,
indem Thrombin zu nicht-beschichteten Biomaterialien zugegeben wurde,
und die Mengen Thrombin, die sich an nicht-beschichtetes PE, PU
und SR banden, betrugen 0,01, 0,012 bzw. 0,006 μg/cm2.
Vergleiche der Thrombinbindung an nicht-beschichtetes PE und PU
gegenüber denselben
Biomaterialien, die mit 25 μg/cm2 Hirudin-Polymer beschichtet sind, zeigen,
daß die
letzteren 200- bis 23-mal größere Thrombin-Bindung
förderten.
Schließlich
zeigen die Ergebnisse mit SR, das mit dem Ethanolamin-Polymer beschichtet
ist, daß die
Hirudin-Einheit essentiell für
die Bindung von Thrombin ist.
-
-
Beispiel 3
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Heparin-Polymer
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A. Synthese von N-Succinimidyl-6-maleimidohexanoat
-
6-Maleimidohexansäure, 20,0
g (94,7 mmol), wurde in 100 ml Chloroform gelöst, gefolgt von der Zugabe
von 60,1 g (0,473 mol) Oxalylchlorid. Die resultierende Lösung wurde
dann für
2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Das überschüssige Oxalylchlorid
wurde unter verringertem Druck entfernt und das resultierende Säurechlorid
wurde azeotrop mit 4 × 25
ml Chloroform destilliert, um das überschüssige Oxalylchlorid zu entfernen.
Das Säurechloridprodukt
wurde in 100 ml Chloroform gelöst,
gefolgt von der Zugabe von 12,0 g (0,104 mol) NHS und einer langsamen
Zugabe von 11,48 g (0,113 mol) TEA. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht
gerührt.
Nach Waschen der Reaktionsmischung mit 4 × 100 ml Wasser wurde die Chloroformlösung über Natriumsulfat
getrocknet. Entfernen von Lösemittel
ergab 24,0 g Produkt für
eine 82% Ausbeute. Analyse auf einem NMR-Spektrometer war konsistent mit dem
gewünschten
Produkt, und es wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
-
B. Synthese eines photoreaktiven
Polyacrylamids, das Hydrazid-Liganden enthält (Hydrazid-Polymer)
-
Acrylamid,
8,339 g (0,117 mol), wurde in 112 ml THF gelöst, gefolgt von 0,241 g (1,50
mmol) AIBN, 0,112 ml (0,74 mmol) TEMED, 1,284 g (3,70 mmol) BBA-APMA
(hergestellt, wie hierin beschrieben) und 0,377 g (1,2 mmol) N-Succinimidyl-6-maleimidohexanoat
(hergestellt, wie hierin beschrieben). Die Lösung wurde mit einer Heliumspülung für 4 Minuten,
gefolgt von einer Argonspülung
für 4 Minuten,
von Sauerstoff befreit. Das verschlossene Gefäß wurde dann über Nacht
bei 55°C
erhitzt, um die Polymerisation abzuschließen. Das ausgefällte Polymer
wurde durch Filtration isoliert und wurde durch Rühren für 30 Minuten
mit 100 ml THF gewaschen. Das Endprodukt wurde durch Filtration
gewonnen und in einem Vakuumofen getrocknet, um 9,64 g Feststoff,
eine 96% Ausbeute, zu liefern.
-
Das
obige Polymer (1,0 g) wurde in 50 ml 0,05 M Phosphatpuffer bei pH
8 gelöst
und diese Lösung wurde
zu einer zweiten Lösung
zugegeben, die 0,696 g (5,89 mmol) Oxalsäuredihydrazid in 50 ml 0,05
M Phosphatpuffer bei pH 8 enthielt. Die vereinigten Lösungen wurden über Nacht
bei Raumtemperatur gerührt. Das
Produkt wurde in Dialyse gegen entionisiertes Wasser unter Verwendung
eines Dialyseschlauches mit einem Molekulargewichtsschnitt von 6.000
bis 8.000 gegeben. Nach sechsmaligem Wechsel des Wassers über zwei
Tage wurde das Polymer durch Lyophilisation isoliert, um 850 mg
Produkt zu ergeben. Eine Analyse auf Hydrazidgruppen auf diesem
Polymer ergab einen Wert von 0,0656 mol NH2/g
Polymer, 55% der Theorie.
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C. Synthese eines photoreaktiven
Polyacrylamids, das Heparin-Liganden enthält (Heparin-Polymer)
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Es
ist bekannt, daß eine
kontrollierte Periodat-Oxidation der Uronsäure-Reste, die in Heparin vorhanden
sind, funktionelle Aldehydgruppen erzeugen wird, während vernünftige Heparin-Aktivität beibehalten
wird. Nicht-gebleichtes Heparin mit einer Aktivität von 152
Einheiten/mg (von Celsus Laboratories, Cincinnati, OH) wurde mit
250 mg/ml in 0,1 M Acetatpuffer (pH 5,5) gelöst und mit Natriumperiodat
bei 200 mg/ml für
30 Minuten oxidiert, um freie Aldehydgruppen zu erzeugen. Übriges Periodat
wurde durch die Zugabe von überschüssigem Methylenglykol
inaktiviert. Das Ethylenglykol und Reaktionsprodukte mit kleinem
Molekulargewicht wurden dann durch Dialysieren über Nacht bei 4° gegen 0,1
M Acetatpuffer (pH 5,5) unter Verwendung eines Spektra/Por-Dialyseschlauches
mit einem Molekulargewichtsschnitt von 6.000 (von Spectrum Medical
Industries) entfernt. Das oxidierte Heparin behielt 95 Einheiten/mg
Aktivität
zurück.
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Die
Konzentration von oxidiertem Heparin wurde auf 15 mg/ml in 0,1 M
Acetatpuffer (pH 5,5) eingestellt und wurde über Nacht mit einem gleichen
Volumen 20 mg/ml Photopolyhydrazid in Wasser bei Raumtemperatur
umgesetzt. Das Heparin-Polymer wurde verwendet, um Biomaterialien
ohne weitere Reinigung zu beschichten.
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D. Immobilisierung von
Heparin-Polymer auf regenerierter Cellulosemembran
-
Das
Heparin-Polymer wurde synthetisiert wie hierin beschrieben und auf
regenerierten Cellulosemembranen (RC-Membranen) mit einer Porengröße von 0,45
mm immobilisiert. RC-Membranen mit einem Durchmesser von einem Inch
wurden mit Heparin-Polymer für
50 Minuten inkubiert, luftgetrocknet und dann bei 45 Sekunden auf
jeder Seite bestrahlt. Die Scheiben wurden zunächst in 10 × PBS und dann in PBS gewaschen, um
nicht-gebundenes Heparin-Polymer zu entfernen.
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E. Bewertung der Thrombin-Hemmung
durch Heparin-beschichtete Membranen
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Die
Antithromboseaktivität
von Heparin beruht auf seiner Hemmung von Thrombin, das eine Protease ist,
von der bekannt ist, daß sie
an der Gerinnungskaskade teilnimmt. Heparin hemmt die Thrombinaktivität zunächst durch
Bindung an Antithrombin III (ATIII). Dann bindet sich der Heparin/ATIII-Komplex
an Thrombin und inaktiviert dieses, woraufhin das Heparin freigesetzt
wird und sich an ein weiteres ATIII binden kann. Der Test auf Hemmung
von Thrombin durch immobilisiertes Heparin wurde durchgeführt, indem
die Spaltung eines chromogenen Peptidsubstrats durch Thrombin gemessen
wurde, und verwendete zuvor beschriebene Methoden.
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Jeder
Test wurde in 1 ml PBS durchgeführt,
der 0,85 mg BSA (Sigma Chemical Co.), 10 mU menschliches Thrombin
(Sigma Chemical Co.), 100 mU/ml ATIII (Baxter Biotech, Chicago,
IL) und 0,17 μmol
homogenes Thrombinsubstrat S-2238 (Kabi Pharmacia, Franklin, OH) enthielt.
Zu dieser Testlösung
wurde entweder nicht-beschichtete oder Heparin-beschichtete Membranen
(um Heparinaktivität
auf den Membranen zu bewerten) oder Standardkonzentrationen an Heparin
(um Standardkurven des Heparingehaltes gegen Extinktion zu erzeugen)
zugegeben. Die Mengen Heparin, die zugegeben wurden, reichten von
2,5 bis 25 mU. Die durch das Thrombin vermittelte Spaltung des S-2238
erzeugte Farbe, gemessen als Extinktion bei 405 nm, wurde unter
Verwendung eines Spektrophotometers nach 2 Stunden Inkubation bei
37°C abgelesen.
Die Extinktion stand in direktem Verhältnis zur Aktivität des Thrombins
und somit in umgekehrtem Verhältnis
zum Umfang der Aktivierung von ATIII, induziert durch das Heparin
in Lösung
oder immobilisiert auf der Oberfläche des Substrats. Die Aktivität von oberflächengebundenem
Heparin wurde berechnet, indem die Extinktionswerte, die mit den
Membranen erzeugt wurden, mit den Extinktionswerten, die mit bekannten
Mengen an zugegebenem Heparin erzeugt wurden, verglichen wurden.
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Dieser
Test wurde dann verwendet, um Heparinaktivität zu bewerten, die auf den
beschichteten und nicht-beschichteten RC-Membranen vorlag. Die beschichtete
Membran hatte eine Heparinaktivität von 255 mU/cm2,
wohingegen die nicht-beschichtete < 0,1
mU/cm2 hatte.
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Beispiel 4
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Lysin-Polymere
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A. Synthese von N-α-[6-(Maleimido)hexanoyl]lysin.
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6-Maleimidohexansäure, 2,24
g (10,6 mmol) (hergestellt wie beschrieben in Beispiel 1), wurde
in 10,76 g (84,8 mmol) Oxalylchlorid gelöst und als eine reine Lösung für 4 Stunden
bei Raumtemperatur gelöst.
Das überschüssige Oxalylchlorid
wurde dann unter verringertem Druck abgezogen und das resultierende
Säurechlorid
wurde in 25 ml Methylenchlorid gelöst. Diese Lösung wurde unter Rühren zu
einer Lösung
von 3,60 g (10,6 mmol) N-ε-t-BOC-Lysin-t-butylester-Hydrochlorid
(Bachem California) in 25 ml Methylenchlorid und 3,21 g (31,7 mmol)
TEA zugegeben. Die resultierende Mischung wurde über Nacht unter Stickstoff
gerührt.
Danach wurde die Mischung mit Wasser behandelt und die organische
Schicht wurde abgetrennt und über
Natriumsulfat getrocknet. Das Lösemittel
wurde entfernt und das Produkt wurde auf einer Silicagel-Flashchromatographiesäule unter
Verwendung eines Lösemittelgradienten
0–5% Methanol
in Chloroform gereinigt. Das Pooling der gewünschten Fraktionen und Verdampfen
von Lösemittel
ergab 5,20 g Produkt (98% Ausbeute). Analyse auf einem NMR-Spektrometer
war konsistent mit dem gewünschten
Produkt.
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Das
geschützte
Aminosäurederivat,
0,566 g (1,14 mmol), wurde in 5 ml Trifluoressigsäure unter
Rühren
gelöst.
Nach Rühren
für 4 Stunden
bei Raumtemperatur wurde das Lösemittel
unter verringertem Druck abgezogen. Das resultierende Öl wurde
mit Ether trituriert, um restliche Trifluoressigsäure zu entfernen,
um 3,73 mg Produkt für
eine 98% Ausbeute zu ergeben. Analyse auf einem NMR-Spektrometer
war konsistent mit dem gewünschten
Produkt.
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B. Synthese eines photoreaktiven
Polyacrylamids, das ε-Aminolysin-Liganden
enthält
(Lysin-Polymer).
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Acrylamid
(0,22 g, 3,10 mmol), BBA-APMA (0,014 g, 0,039 mmol) und N-α-[6-(Maleimido)hexanoyl]lysin
(0,266 g, 0,784 mmol; hergestellt wie hierin beschrieben) wurden
in 7,3 ml trockenem DMSO gelöst.
Um die Polymerisation zu initiieren, wurden 8 mg (0,047 mmol) AIBN
und 4,0 μl
TEMED zugegeben, gefolgt von Spülen
mit Stickstoff, um allen Sauerstoff zu entfernen. Die Mischung wurde
dann bei 55°C
für 16
Stunden erhitzt, gefolgt vom Abziehen des DMSO unter verringertem
Druck. Das Produkt wurde in entionisiertem Wasser gelöst und 3
Tage lang unter Verwendung eines Schlauches mit einem Molelculargewichtsschnitt
(MWCO) von 6–8
K gegen entionisiertes Wasser dialysiert. Die resultierende Lösung wurde
lyophilisiert, um 160 mg Produkt zu ergeben.
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C. Erzeugung von Lysin-Polymerbeschichtungen
auf Polyurethan (PU).
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PU-Blätter wurden
in 1 × 1
cm-Stücke
geschnitten, mit IPA gewaschen und luftgetrocknet. Um die Benetzung
der Lysin-Polymerlösung
auf PU zu verbessern, wurden die PU-Stücke mit Argonplasma bei 250
Watt, 0,25 torr für
1 Minute behandelt. Die PU-Stücke
wurden dann in eine wäßrige Lösung von
Lysin-Polymer (hergestellt wie hierin beschrieben, 1 mg/ml) für 5 Minuten
eingetaucht, luftgetrocknet und für 30 Sekunden bestrahlt. Die
Proben wurden dann über
Nacht gewaschen (mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH
7,4, die 1% Tween 20 enthielt), um nicht-gebundenes Lysin-Polymer
zu entfernen. Die beschichteten PU-Stücke wurden bis zur Bewertung
in PBS aufbewahrt, das 0,02% Natriumazid enthielt.
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D. Quantifizierung von
Lysin-Polymerbeschichtungen.
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Lysin-Polymer
(hergestellt wie oben beschrieben) wurde über reduktive Methylierung
radioaktiv markiert und verwendet, um die auf Polyurethan immobilisierten
Gehalte zu quantifizieren. Das tritiierte Lysin-Polymer wurde auf
PU-Stücke
aufgebracht, mit oder ohne Bestrahlung, um die Dichte von Lysin-Polymer
zu bestimmen, das immobilisiert war. Nach dem Waschvorgang wurden
Proben in Soluene-350 gelöst
und in Hionic Fluor (jeweils von Packard Instrument Co., Meriden,
CT) gezählt.
Die Tabelle unten zeigt die immobilisierten Gehalte (±SEM),
ausgedrückt
in μg/cm2 und nmol/cm2 Lysin-Einheit.
Jeder Gehalt ist der Durchschnittswert von 4 Replikaten. Die Ergebnisse
zeigen, daß 1,51 μg/em2 nach Bestrahlung immobilisiert sind, was
mehr als ausreichend ist, um eine einschichtige Beschichtung herzustellen,
und 3,8-mal soviel Polymer ist, wie mit der adsorbierten Kontrolle
zurückbehalten
wurde.
-
-
E. Bewertung der Plasminogenbindung
durch Lysin-beschichtetes Polyurethan.
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Andere
haben die kovalente Kopplung von Lysin an mit Silan derivatisiertes
Glas beschrieben und es wurde berichtet, daß das resultierende mit Lysin
derivatisierte Glas Plasminogenbindung fördert, wobei das gebundene
Lysin signifikante proteolytische Aktivität zeigte. Man erwartet, daß eine solche
Oberfläche
verbesserte Beständigkeit
gegen Thrombusbildung zeigt, wenn sie mit Blut in Kontakt gebracht
wird. Die in früheren Studien
verwendete Beschichtungschemie setzte einen kurzen Spacer ein und
war auf Glas als eine Oberfläche
beschränkt,
wohingegen das photoreaktive Lysin-Polymer mit hohen Dichten auf
einen breiten Bereich von Biomaterialien aufgebracht werden kann.
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Die
Lysin-Einheit in Lysin-Polymer ist über die α-Aminogruppe an die Polymer-Hauptkette
gekoppelt, und die ε-Aminogruppe
ist frei, Plasminogen zu binden. Daher wird erwartet, daß PU, das
mit dem Lysin-Polymer beschichtet ist, Thrombusbildung durch reversible
Bindung von Plasminogen aus Blut hemmt, wobei das gebundene Plasmin
proteolytische Aktivität
zeigt, die Fibrin spaltet und Fibringerinnselbildung auf der beschichteten
Oberfläche
verhindert.
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Beispiel 5
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Prostaglandin-Polymere
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A. Synthese eines photoreaktiven
Polyacrylamids, das primäre
Amin-Liganden enthält
(Amin-Polymer)
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Eine
Lösung
von Acrylamid (7,46 g, 105,1 mmol), APMA-HCl (2,14 g, 11,9 mmol)
und BBA-APMA (0,837 g, 2,39 mmol) wird in 170 ml DMSO hergestellt.
Zu dieser Lösung
wird AIBN (0,246 g, 1,50 mmol) und TEMED (0,131 g, 1,13 mmol) zugegeben.
Die Lösung
wird dann durch Spülen
mit Heliumgas für
einen Zeitraum von 10 Minuten von Sauerstoff befreit und wird verschlossen
und für
18 Stunden in einen Ofen mit 55°C gegeben,
um die Polymerisation zu vervollständigen. Die Polymerlösung wird
mit Wasser verdünnt
und gegen entionisiertes Wasser unter Verwendung eines Dialyseschlauches
mit einem MWCO von 12.000–14.000
dialysiert, um Lösemittel,
nicht-umgesetzte Monomere und Oligomere mit niedrigem Molekulargewicht
zu entfernen. Das Endprodukt wird durch Lyophilisation isoliert
und die Photogruppen-Beladung wird durch UV-Extinktion bei 265 nm
bestimmt. Der Amin-Gehalt
des Polymers wird unter Verwendung einer Trinitrobenzolsulfonat(TNBS)-Methode
bestimmt. Die Photogruppen- und Amin-Beladung kann durch Einstellen
der Menge an Monomeren, die in der Polymerisation verwendet wird,
verändert
werden.
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B. Synthese eines photoreaktiven
Polyacrylamids, das Prostaglandin E1-Liganden
enthält
(Prostaglandin E1-Polymer).
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Eine
Lösung
von Prostaglandin E1 (Sigma Chemical Co.)
(30 mg, 0,0846 mmol) in 5 ml trockenem 1,4-Dioxan wird hergestellt
und NHS (10,7 mg, 0,0931 mmol) und DCC (26,2 mg, 0,127 mmol) werden
zur Lösung
zugegeben. Die Lösung
wird über
Nacht bei Raumtemperatur unter Bildung des 1,3-Dicyclohexylharnstoff(DCU)-Nebenprodukts
gerührt.
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Der
Feststoff wird durch Filtration entfernt und der Filterkuchen wird
mit 1,4-Dioxan gespült.
Das Lösemittel
wird unter verringertem Druck abgezogen und das resultierende Produkt
wird unter trockenen Bedingungen aufbewahrt und ohne weitere Reinigung
verwendet.
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Das
Amin-Polymer (synthetisiert wie oben beschrieben) wird in DMSO mit
einer Konzentration von 10 mg/ml gelöst, gefolgt von der Zugabe
von 1,5 Äquivalenten
des NOS-derivatisierten
Prostaglandins E1, relativ zum Amin-Gehalt
der Amin-Polymerlösung.
Fünf Äquivalente
Triethylamin werden zugegeben, um zu helfen, die Reaktion zu katalysieren.
Nach einer Reaktion über
Nacht wird die Polymerlösung
in die Dialyse gegen entionisiertes Wasser unter Verwendung eines
Dialyseschlauches mit einem MWCO von 12.000–14.000 gegeben, um überschüssige Reaktanten
mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen. Das Produkt wird durch Lyophilisation
isoliert.
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C. Synthese eines photoreaktiven
Polyacrylamids, das Carbacyclin-Liganden enthält (Carbacyclin-Polymer).
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Eine
Lösung
von Carbacyclin (Sigma Chemical Co.) (5 mg, 0,0143 mmol) in 2 ml
trockenem 1,4-Dioxan wird hergestellt und NHS (1,8 mg, 0,0157 mmol)
und DCC (4,4 mg, 0,0215 mmol) werden zur Lösung zugegeben. Die Mischung
wird über
Nacht bei Raumtemperatur unter Bildung des DCU-Nebenproduktes gerührt. Der
Feststoff wird durch Filtration entfernt und der Filterkuchen wird
mit 1,4-Dioxan gespült.
Das Lösemittel
wird unter verringertem Druck abgezogen und das resultierende Produkt
wird unter trockenen Bedingungen aufbewahrt und ohne weitere Reinigung
verwendet.
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Das
Amin-Polymer (synthetisiert wie oben beschrieben) wird in DMSO mit
einer Konzentration von 10 mg/ml gelöst, gefolgt von der Zugabe
von 1,5 Äquivalenten
des NOS-derivatisierten
Carbocyclins, relativ zum Amin-Gehalt der Amin-Polymerlösung. Fünf Äquivalente
TEA werden zugegeben, um zu helfen, die Reaktion zu katalysieren.
Nach einer Übernachtreaktion
wird die Polymerlösung
in die Dialyse gegen entionisiertes Wasser unter Verwendung eines
Dialyseschlauches mit einem MWCO von 12.000–14.000 gegeben, um überschüssige Reaktanten
mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen. Das Produkt wird durch
Lyophilisation isoliert.
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D. Prostaglandin-Polymerbeschichtungen
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Jedes
Prostaglandin-Polymer (synthetisiert wie oben beschrieben) wird
auf 5 mg/ml in 50% (v/v) IPA in Wasser verdünnt und zu Biomaterialproben
(Polyurethan, Silikongummi und Polyethylen) zugegeben. Das Volumen
an Prostaglandin enthaltender Polymerlösung, das zu jedem Polymer
zugegeben wird, ist gerade ausreichend, um die Oberfläche jedes
Biomaterials zu überziehen
(etwa 100 ml/cm2). Die Polymerlösung läßt man auf
jeder Probe trocknen, woraufhin jede Probe für 1–2 Minuten bestrahlt wird.
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Sowohl
Prostaglandin E1 als auch Carbacyclin (das
ein stabiles Analog von Prostaglandin I2 ist;
PGI2) sind dafür bekannt, Plättchenaktivierung
und Thrombusbildung zu hemmen. Daher wird erwartet, daß die erzeugten
Prostaglandin-Beschichtungen Plättchenaktivierung
und Thrombusbildung auf Biomaterialien hemmen.
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Beispiel 6
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Protein A-Polymer
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A. Synthese von N-Succinimidyl-6-methacrylamidohexanoat
(MAm-EAC-NOS)
-
Die ε-Aminocapronsäure (EAC),
2,00 g (15,25 mmol), wurde zu einem trockenen Rundkolben zugegeben,
gefolgt von der Zugabe von 2,58 g (16,73 mmol) Methacrylsäureanhydrid.
Die resultierende Mischung wurde bei Raumtemperatur für zwei Stunden
gerührt,
gefolgt von Trituration mit Hexan. Das Hexan wurde dekantiert und
das Produkt wurde zwei zusätzliche
Male trituriert, um 3,03 g des acylierten Produktes (Ausbeute > 99%) zu ergeben. Ohne
weitere Reinigung wurde das Produkt in 50 ml Chloroform gelöst, gefolgt
von der Zugabe von 1,922 g (16,7 mmol) NHS und 6,26 g (30,3 mmol)
DCC. Die Mischung wurde über
Nacht bei Raumtemperatur unter Schutz vor Feuchtigkeit gerührt. Der
resultierende Feststoff wurde durch Filtration entfernt und der
Filterkuchen wurde mit Chloroform gespült. Das Lösemittel wurde unter verringertem
Druck mit 5 ppm des Monomethylethers von Hydrochinon (MEHQ), um
Polymerisation zu verhindern, abgezogen. Der Rückstand, 4,50 g, wurde erneut
in 45 ml trockenem THF gelöst
und die Lösung
wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
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B. Synthese eines photoreaktiven
Polyacrylamids, das Protein A-Liganden enthält (Protein A-Polymer).
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Um
das latente reaktive NOS-Polymer herzustellen, wurde Acrylamid (1,0
g, 14,1 mmol) in 15 ml trockenem THF gelöst. Zu dieser Lösung wurden
44 mg (0,149 mmol) MAm-EAC-NOS
(synthetisiert wie hierin beschrieben) und 158 mg (0,45 mmol) BBA-APMA
(synthetisiert wie beschrieben in Beispiel 1) zugegeben. Für den Initiator
wurden 500 mg (3,04 mmol) AIBN zugegeben, gefolgt von der Zugabe
von 50 μl
TEMED. Durch die Lösung
wurde Stickstoff geleitet und sie wurde bei 45°C für 18 Stunden inkubiert, um
Polymerisation zu ermöglichen.
Das unlösliche
Polymer wurde durch Filtration gesammelt und dann in trockenem DMSO
gelöst.
Das Polymer wurde ausgefällt,
indem es tropfenweise zu gerührtem
Ethanol zugegeben wurde, und wurde dann durch Filtration gesammelt
und für
die Aufbewahrung bis zur Verwendung getrocknet. Die Produktausbeute
betrug 0,906 g.
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Um
Protein A an das latente reaktive NOS-Polymer zu koppeln, wurde
rekombinantes Staphylococcen-Protein A (von Calbiochem-Novabiochem
Corp., San Diego, CA) mit 10 mg/ml in 0,1 M Carbonatpuffer, pH 9,
gelöst.
Das latente reaktive NOS-Polymer wurde mit 100 mg/ml in 50 mM Phosphatpuffer,
pH 6,8, gelöst. Dann
wurden 200 μl
(20 mg) des NOS- Polymers
zu 1 ml (10 mg) der Protein A-Lösung
zugegeben und die Mischung wurde über Nacht bei 4°C inkubiert.
Bewertung durch Standard-Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
(SDS-PAGE) zeigte, daß mehr
als 80% des zugegebenen Proteins A in das resultierende Protein
A-Polymer eingebaut wurden. Die Protein A-Polymerlösung wurde
verwendet, um Biomaterialien ohne weitere Reinigung zu beschichten.
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C. Erzeugung von Protein
A-Polymerbeschichtungen auf Biomaterialien.
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Das
Protein A-Polymer wurde dann an zwei Typen von Membranen photogekoppelt,
Polysulfon(PSO)-Membranen mit einer Porengröße von 0,2 mm (HT-200-Membranen
von Gelman Sciences, Ann Arbor, MI) und Membranen aus regenerierter
Cellulose (RC) mit einer Porengröße von 0,45
mm (No. SM18606 von Sartorius, Edgewood, NY). Jede Membran war in
der Form einer Scheibe, die 1 Inch im Durchmesser war. Vor der Zugabe
des Protein A-Polymers
wurde jede Membran zunächst
in 1:1 (v/v) Isopropanol:0,1 N HCl und dann in Wasser gewaschen.
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Das
Protein A-Polymer (geschätzte
Konzentration 8,67 mg/ml) wurde dann zu jedem Membran-Typ zugegeben
(1 ml Polymer pro 4–6
Scheiben) und über
Nacht bei 4°C
inkubiert. Dann wurden die Scheiben aus der Polymerlösung entnommen,
luftgetrocknet und für
1 Minute auf jeder Seite in einer Kammer mit kontrollierter Temperatur
(bei 10°C)
bestrahlt. Die Bestrahlung wurde mit einer Dymax-Lampe durchgeführt, wie
hierin beschrieben.
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Die
Membranen wurden dann gewaschen, um nicht-gebundenes Protein A-Polymer
zu entfernen. Die Waschung wurde durchgeführt, indem die beschichteten
Scheiben in Membranhalter gegeben wurden (MAC-25-Halter von Amicon,
Beverly, MA), wobei 2–4
Membranen in jeden Halter gegeben wurden. Die Membranen wurden dann
nacheinander mit: 1) 10 ml 0,1 M Glycin in 2% Essigsäure, 2)
10 ml 10 × PBS
und 3) 30 ml PBS gewaschen. Die gewaschenen Membranen wurden dann
bis zur Verwendung in PBS aufbewahrt, das 0,05% Natriumazid enthielt.
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D. Bewertung der Aktivität von Protein
A-Polymerbeschichtungen auf Biomaterialien.
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Protein
A ist ein bakterielles Protein, das sich spezifisch an die Fc-Region von Immunoglobulin G(IgG)-Molekülen bindet.
Die Aktivität
der Protein A-Beschichtung auf jedem Membran-Typ wurde durch Testen
auf Bindung durch zugegebenes IgG bewertet. Nicht-beschichtete Membranen
wurden als Kontrollen verwendet. Für diesen Test wurden 2 ml Kaninchenserum
1:5 in PBS verdünnt
und durch die beschichteten Membranen mit 2–3 ml/min perfundiert. Die
Membranen wurden dann mit PBS gewaschen, um nicht-gebundenes IgG
zu entfernen. Das gebundene IgG wurde dann mit 0,1 M Glycin in 2%
Essigsäure
eluiert. Die Menge an eluiertem IgG wurde bestimmt, indem die Extinktion
des Eluanten bei 280 nM gemessen und ein Extinktionskoeffizient
(ε280) von 1,4 ml/cm-mg verwendet wurde, um
die mg eluiertes IgG zu berechnen. Auch wurde das IgG, das aus jedem
Membran-Typ eluierte, durch reduzierte SDS-PAGE-Analyse auf Reinheit
bewertet. Bei den mit Protein A-Polymer beschichteten Biomaterialien
war das eluierte Protein mehr als 90% leichte und schwere Ketten
von IgG. Im Gegensatz dazu war das Hauptprotein, das aus nicht-beschichteten
Kontrollen eluierte, Albumin.
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Drei
Scheiben von jedem Typ (PSO oder RC) wurden in einen MAC-25-Halter
gegeben und unter Verwendung dieses Verfahrens bewertet. Die Tabelle
unten zeigt die durchschnittlichen Mengen IgG, die aus jedem Membran-Typ
eluierten; wobei jeder Wert der Mittelwert von 10 Bestimmungen (10
Zyklen) für
3 PSO-Scheiben und der Mittelwert von 3 Bestimmungen (3 Zyklen)
für 3 RC-Scheiben
war.
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-
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Diese
Ergebnisse zeigen, daß jeder
Typ von beschichteter Membran 34- bis 64-mal mehr IgG bindet als
dies ihre nicht-beschichtete Kontrolle tut. Auch hat Protein A im
Polymer eine stabile Konformation und ist fest gebunden, da keine
Abnahme in der IgG-Elution nach 10 Zyklen von Serumzugabe und IgG-Elution
auftritt.
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Beispiel 7
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IgG-Polymere
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A. Synthese eines photoreaktiven
Polyacrylamids, das N-Oxysuccinimid-Liganden enthält (NOS-Polymer).
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Acrylamid,
3,897 g (0,0548 mol), wurde in 53 ml THF gelöst, gefolgt von 0,115 g (0,70
mmol) AIBN, 0,053 ml TEMED, 0,204 g (0,58 mmol) BBA-APMA (hergestellt
wie beschrieben in Beispiel 1) und 0,899 g (2,9 mmol) N-Succinimidyl-6-maleimidohexanoat
(hergestellt wie in Beispiel 3). Die Lösung wurde mit einer Heliumspülung für 4 Minuten,
gefolgt von einer Argonspülung
für 4 Minuten,
von Sauerstoff befreit. Das verschlossene Gefäß wurde dann über Nacht
bei 55°C
erhitzt, um die Polymerisation zu vervollständigen. Das ausgefällte Polymer
wurde durch Filtration isoliert und wurde durch Rühren für 30 Minuten
mit 100 ml THF gewaschen. Das Endprodukt wurde durch Filtration
gewonnen und in einem Vakuumofen getrocknet, um 4,688 g Feststoff,
eine 94% Ausbeute, zu liefern.
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B. Synthese und Immobilisierung
eines photoreaktiven Polyacrylamids, das IgG-Liganden enthält.
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IgG-Moleküle sind
eine Klasse von Antikörpermolekülen, die
sich an spezifische Antigene binden. Tritiiertes Kaninchen-anti-Glucoseoxidase-IgG
wurde verwendet, so daß die
Tritium-Markierung
verwendet werden konnte, um den immobilisierten Gehalt an IgG zu
quantifizieren, und Glucoseoxidasebindung bewertet werden konnte,
um IgG-Aktivität
zu testen. NOS-Polymer (50 mg) (hergestellt, wie hierin beschrieben)
wurde zu 100 mg [3H] IgG (in 100 ml 0,1
M Natriumcarbonat bei pH 9) zugegeben und über Nacht bei 4°C reagieren gelassen.
Das IgG-Polymer wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
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Polyester-Membran
(Accuwick von Pall Corporation) wurde in 6 mm-Scheiben geschnitten
und 4 μl-Aliquote
des IgG-Polymers wurden auf jede von 19 Scheiben getüpfelt. Drei
Scheiben wurden als Kontrollen zurückbehalten, die weder bestrahlt
noch gewaschen wurden. Acht Scheiben wurden für 1 Minute bestrahlt und 8
Scheiben wurden nicht-bestrahlt zurückbehalten. Die letzteren 8
bestrahlten und 8 nicht-bestrahlten Scheiben wurden mit 25 mM Bis(2-hydroxyethyl)iminotris(hydroxymethyl)methan
(BIS-TRIS) bei pH 7,2 gewaschen, das 1% Lactose, 1% BSA und 0,1%
Brij 3 5 enthielt.
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Um
die immobilisierten Gehalte an IgG-Polymer zu quantifizieren, wurden
die 3 Kontrollscheiben (nicht-beschichtet, nicht-gewaschen) und
jeweils 3 der bestrahlten und nicht-bestrahlten Zustände in Soluene (0,5
ml) gelöst
und in 5 ml Hionic Fluor gezählt.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle unten angegeben. Ein Vergleich
der bestrahlten (gewaschenen) zu den Kontrollen (nicht-beschichtet,
nicht-gewaschen) zeigt, daß 75% des
zugegebenen IgG-Polymers
nach Bestrahlung zurückgehalten
wurden. Im Gegensatz dazu wurden, bei den nicht-bestrahlten Proben,
nur 12,5% der zugegebenen IgG-Polymere zurückgehalten.
-
-
Um
die Aktivität
des immobilisierten IgGs zu quantifizieren, wurden die übrigen 5
bestrahlten und 5 nicht-bestrahlten Scheiben mit Glucoseoxidase
bei 0,1 mg/ml in PBS für
1 Stunde inkubiert und 5-mal mit TNT (0,05 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan,
0,15 M NaCl, 0,05% Tween-20) gewaschen. Jede Scheibe wurde dann
in Vertiefungen einer 96-Well-Mikrotiterplatte überführt und
getestet, indem 200 μl
3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin(TMB)-Chromogenmischung
(100 μl
TMB-Reagens von Kirkegaard & Perry
Laboratories, Inc., 100 μl 0,2
M Natriumphosphat pH 5,5, 10 mg Glucose und 4 μg Meerrettichperoxidase) zugegeben
wurden, und man sich die Farbe für
20 Minuten entwickeln ließ.
Aliquote (100 μl)
wurden dann auf eine separate Mikrotiterplatte überführt und die Extinktion wurde
bei 650 nm abgelesen. Ein Vergleich der bestrahlten mit den nicht-bestrahlten
Proben zeigt, daß 61%
mehr Aktivität
durch die bestrahlten Proben exprimiert wurde.
-
Beispiel 8
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Streptavidin-Polymer
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A. Synthese eines photoreaktiven
Polyacrylamids, das Streptavidin-Liganden enthält
-
Streptavidin
(von InFerGene Company, Benicia, CA) wurde an das NOS-Polymer (hergestellt
wie beschrieben in Beispiel 6) gekoppelt. Streptavidin (15 mg) wurde
in 1,5 ml 0,1 M Carbonatpuffer (pH 9,0) gelöst. Das NOS-Polymer wurde hergestellt
und in 5 mM Acetatpuffer (pH 5) bis zu einer Endkonzentration von
100 mg/ml gelöst.
Die NOS-Polymerlösung (0,3
ml) wurde zur Streptavidin-Lösung
(1,5 ml) zugegeben und die Mischung wurde über Nacht bei 4°C gerührt. Das
resultierende Streptavidin-Polymer wurde ohne weitere Reinigung
oder Charakterisierung verwendet.
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B. Erzeugung von Streptavidin-Polymerbeschichtungen
auf Oberflächen
-
Massive
Glasstäbe
(3 mm Durchmesser × 3
cm Länge)
wurden durch Beschallung in 1:1 (v/v) Aceton in 0,1 N HCl für 30 Minuten
gewaschen, in Wasser, Aceton gespült, bei 100°C für 1 Std. getrocknet, abgekühlt und
bis zur Verwendung getrocknet aufbewahrt. Bis(trimethoxysilylethyl)benzol
(von United Chemical Technologies, Inc., Bristol, PA) wurde auf
10% (v/v) in Aceton verdünnt.
Die Stäbe
wurden in das Silan-Reagens für 30
Sekunden eingetaucht, luftgetrocknet, für 30 Sekunden in Wasser eingetaucht,
entnommen und bei 100°C für 15 Minuten
ausgehärtet
und mit Aceton gespült.
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Die
mit Organosilan grundierten Glasstäbe wurden für 30 Sekunden in eine Lösung von
Streptavidin-Polymer eingetaucht. Die Glasstäbe wurden aus der Lösung entnommen,
an Luft trocknen gelassen und für
30 Sekunden mit einer Dymax-Lampe bestrahlt. Adsorptionskontrollen
wurden über
dasselbe Protokoll hergestellt, mit der Ausnahme, daß sie nicht
bestrahlt wurden. Beide Typen von beschichteten Stäben wurden
mit PBS gewaschen, das 0,05% Tween 20 enthielt, um nicht-anhaftendes
Streptavidin-Polymer zu entfernen.
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C. Bewertung von immobilisiertem
Streptavidin-Polymer
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Streptavidin
ist ein Rezeptor, der sich stark an Biotin als seinen Liganden bindet.
Die Aktivität
von Streptavidin-Polymerbeschichtung wurde durch Quantifizieren
der Bindung von zugegebener, mit Biotin derivatisierter Meerrettichperoxidase
(Biotin-HRP, erhalten von Pierce Chemical Company, Rockford, IL)
bewertet. Die Glasstäbe
wurden für
eine Stunde in einer 9 μg/ml
Lösung
von Biotin-HRP inkubiert. Die Bindung nicht-derivatisierter HRP
(zugegeben mit 9 μg/ml)
wurde als eine Kontrolle für
nicht-spezifische Bindung von HRP an die Glasstäbe bewertet. Die Stäbe wurden
dann mit PBS gewaschen, das 0,05% Tween 20 enthielt, um nicht-gebundene
HRP zu entfernen, und die relative Aktivität von gebundener HRP wurde
mit einem TMB-Peroxidase-Substratsystem (Kirkegaard and Perry Laboratory,
Inc., Gaithersburg, MD) bewertet. HRP katalysiert die Oxidation
von TMB und erzeugt eine Farbe, die spektrophotometrisch bei 405
nm quantifiziert wird. Jedes Ergebnis ist der Mittelwert von 3 Bestimmungen.
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Die
Ergebnisse zeigen die erwarteten Trends, wobei die größte Peroxidase-Aktivität auf Stäben beobachtet
wurde, die mit photoimmobilisiertem Streptavidin-Polymer beschichtet
waren (kovalentem Streptavidin-Polymer) und zu denen Biotin-HRP
zugegeben worden war. Das adsorbierte (nicht-bestrahlte) Streptavidin-Polymer
erzeugte 3,5-mal weniger Peroxidase- Aktivität und die übrigen Varianten, denen Streptavidin und/oder
Biotin fehlte, zeigten wenig Peroxidase-Aktivität.
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Beispiel 9
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Biotin-Polymer
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Das
photoreaktive Amin-Polymer (80 mg) (synthetisiert wie beschrieben
in Beispiel 5) wird in 2 ml DMSO gelöst. Zur Polymerlösung werden
40 mg Biotinamidocapronsäure-3-sulfo-N-hydroxysuccinimidester (Sigma
Chemical Co.) und 0,05 ml Triethylamin zugegeben. Die Lösung wird
für zwei
Stunden bei Raumtemperatur gemischt, dann gegen entionisiertes Wasser
dialysiert, um jegliches Biotin zu entfernen, das nicht an das Polymer
gekoppelt ist.
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Eine
Lösung
des Biotin-Polymers (1,0 mg/ml in entionisiertem Wasser) wird auf
Vertiefungen einer Polystyrol-Mikrotitrationsplatte aufgebracht
und für
1 Stunde inkubiert, wonach die Platte für 1–2 Minuten bestrahlt wird.
Die Platte wird dann mit entionisiertem Wasser gewaschen, um nicht-gebundenes
Biotin-Polymer zu entfernen.
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Biotin
ist ein Ligand, der sich an Streptavidin als seinen Rezeptor bindet.
Polystyrol-Mikrotitrationsplatten
werden mit Biotin-Polymer beschichtet und auf Aktivität durch
Testen der Bindung von Streptavidin bewertet. Eine Lösung von
Streptavidin wird zu den Platten zugegeben, die mit Biotin-Polymer
beschichtet sind, und nicht-gebundenes Streptavidin wird durch Waschen
mit entionisiertem Wasser entfernt. Das zurückbehaltene Streptavidin wird
durch Zugabe von Biotin-HRP und Bewertung der HRP-Aktivätät quantifiziert.
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Beispiel 10
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Magainin-Polymer
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A. Synthese von Magainin-Peptidmonomer
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Magainin-2
wurde in diesem Beispiel verwendet und wurde für BSI von Bachem, Inc. (Torrance,
CA) auf Auftrag synthetisiert, wobei zum Carboxylterminus des Peptids
ein Cystein hinzugefügt
wurde. Die resultierende Sequenz von Magainin bestand aus GIGKFLHSAKKFGKAFVGEIMNSC. Wie beschrieben in Beispiel 1,
bezeichnet das unterstrichene C (C)
eine nicht-native Aminosäure,
die hinzugefügt
wurde, um Kopplung über
die Sulfhydrylgruppe zu ermöglichen.
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Magainin
(2,36 μmol)
wurde in 0,5 ml entgastem Wasser gelöst. Zu dieser Lösung wurden
2,36 μmol Mal-MAm
(gelöst
in 20 μl
Chloroform) und 0,5 ml Ethanol zugegeben. Die Reaktion wurde für 30 Minuten
bei Raumtemperatur gerührt,
woraufhin die Lösung
unter Stickstoff getrocknet und in 1 ml Wasser erneut suspendiert
wurde. Es wurde bestimmt, daß die
gewonnene Magainin-Monomerlösung
5,5 mg/ml Magainin-Einheit aufweist, bestimmt mit dem MicroBCA-Test
(Kit von Pierce Chemical Company, Rockford, IL).
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B. Synthese von photoreaktivem
Polyacrylamid, das Maganinin-Ligand enthält (Magainin-Polymere)
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BBA-APMA
wurde in einer Konzentration von 10 mg/ml in DMSO gelöst, und
Acrylamid wurde in einer Konzentration von 100 mg/ml in Wasser gelöst. Das
Magainin-Monomer (0,48 μmol
in 220 μl
Wasser) wurde nicht gereinigt, nachdem es synthetisiert worden war
(wie oben beschrieben). Die geeigneten molaren Mengen BBA-APMA (0,25 μmol in 44 μl THF) und
Acrylamid (6,9 μmol
in 120 μl
Wasser) wurden dann zur Reaktionsphiole zugegeben.
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Zusätzliche
300 μl THF
wurden zugegeben, und die Mischung wurde durch Wasserabsaugung für 15 Minuten
entgast. Ammoniumpersulfat (6,8 μl
einer 10% Vorratslösung
in Wasser) und TEMED (1,5 μl)
wurden zugegeben, um die Polymerisation zu katalysieren. Die Mischung
wurde erneut entgast und über
Nacht bei Raumtemperatur in einem verschlossenen Exsikkator inkubiert.
Das resultierende Magainin-Polymer wurde gegen Wasser bei 4°C dialysiert
(unter Verwendung von Spectra/Por-Dialyseschlauch mit einem MWCO
von 50.000; von Spectrum, Houston, TX), um nicht-eingebaute Reaktanten
zu entfernen, und dann lyophilisiert. Von den 1,2 mg Magainin-Peptid,
die verwendet wurden, um das Methacryloyl-Magainin zu synthetisieren,
lagen 0,35 mg im löslich
gemachten Magainin-Polymer vor.
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C. Bewertung von immobilisiertem
Magainin-Polymer
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Magainin
ist ein kationisches Peptid-Antibiotikum, das ursprünglich aus
der Haut von Xenopus laevis isoliert wurde. Es ist gegen ein breites
Spektrum von Pathogenen aktiv und wirkt an der Oberfläche der
Pathogene. Die Aktivität
des Magainin-Polymers wurde durch einen Standard-Lösungstest
bewertet, der die minimale inhibitorische Konzentration (MIC) von
Magainin-Polymer bestimmte, die erforderlich war, um das Wachstum von
Bakterien zu verhindern. Die MIC von Magainin-Polymer betrug 50 μg/ml für sowohl
Escherichia coli (ATCC No. 25922) als auch für Staphylococcus epidermidis
(ATCC No. 12228), wohingegen natives monomeres Magainin (weder in
ein Magainin-Monomer oder das Magainin-Polymer eingebaut) eine MIC
von 6,25–12,5 μg/ml für E. coli
und 25 μg/ml
für S.
epidermidis aufwies.
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Das
Magainin-Polymer wird auf 250 μg/ml
in 50% (v/v) IPA in Wasser verdünnt
und zu Biomaterialproben (PU, SR und PE) zugegeben. Das Volumen
an Magainin-Polymerlösung,
das zu jedem Polymer zugegeben wird, ist gerade ausreichend, um
die Oberfläche
jedes Biomaterials zu überziehen
(etwa 100 μl/cm2). Die Polymerlösung läßt man auf jeder Probe trocknen,
woraufhin jede Probe für
1–2 Minuten
bestrahlt wird. Die beschichteten Proben werden in 0,1 N HCl, gefolgt
von PBS, gewaschen.
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Die
antimikrobielle Aktivität
von immobilisiertem Magainin-Polymer wird mit einem Zentrifugationstest bewertet.
Blätter
aus Biomaterialien wurden in Scheiben mit einem Durchmesser von
1,5 cm geschnitten, mit Magainin-Polymer beschichtet und in einzelne
Vertiefungen von 24-Well-Kulturplatten gegeben. Bakterien (E. coli
und S. epidermidis) werden mit 200–400 koloniebildenden Einheiten
pro ml (cfu/ml) in PBS suspendiert. Ein-ml-Aliquote von bakteriellen Suspensionen
werden in Vertiefungen gegeben, die mit Magainin beschichtete Biomaterialien
enthalten, und die Platten werden bei 3.500 × g bei 4°C für 20 Minuten zentrifugiert,
um die Bakterien auf den beschichteten Biomaterial-Scheiben zu sedimentieren.
Die Scheiben werden dann in Bakterienkulturplatten aus tryptischem
Sojaagar (TSA) gegeben und mit einer dünnen Schicht TSA überzogen. Nach
Inkubation über
Nacht bei 37°C
werden die Bakterienkolonien, die auf den Scheiben wachsen, gezählt. Es
wird erwartet, daß die
Magainin-Polymerbeschichtungen bakterielles Wachstum hemmen und
das Wachstum von weniger Bakterienkolonien unterstützen als
nicht-beschichtete Kontrollen.
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Beispiel 11
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β-Galactosidase-Polymer
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A. Synthese eines photoreaktiven
Polyacrylamids, das β-Galactosidase
enthält
(β-Galactosidase-Polymer)
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Eine
Mischung, die 50 mg/ml des NOS-Polymers (hergestellt wie beschrieben
in Beispiel 6) und 6,4 mg/ml β-Galactosidase
(von Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) in 0,1 M Natriumcarbonat,
pH 9, enthielt, wurde hergestellt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur
für 1 Stunde
reagieren gelassen und bei 4°C über Nacht
aufbewahrt. Die resultierende β-Galactosidase-Polymerlösung wurde
ohne Reinigung für
die Erzeugung quervernetzter Filme verwendet.
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B. Erzeugung von quervernetzten
Filmen.
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Filme
wurden gegossen, indem 40 ml-Aliquote der β-Galactosidase-Polymerlösung (synthetisiert
wie hierin beschrieben) auf einen Teflon-Block gegeben und jedes
Aliquot trocknen gelassen wurde. Die resultierenden Filme wurden
für 0,5
oder 4 Minuten bestrahlt, wie oben beschrieben.
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C. Test auf Integrität der Filme.
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Die
Integrität
der Filme wurde getestet, indem bestimmt wurde, ob sie ihre Form
beibehielten, nachdem sie in eine PBS-Lösung gegeben wurden. Filme,
die für
0,5 min bestrahlt waren, lösten
sich bei Einwirkung von Kochsalzlösung auf; wohingegen Filme,
die für
4 Minuten bestrahlt waren, ihre Form beibehielten. Diese Ergebnisse
sind konsistent mit der Lichtaktivierung der BBA-Gruppen, die kovalente
Quervernetzung von Erfindungs-Polymermolekülen erzeugen.
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Das
quervernetzte β-Galactosidase-Polymer
wurde 3-mal mit 1 ml PBS gewaschen, um nicht-eingebautes Enzym zu entfernen. Die
letzte Waschung (0,2 ml) und der gewonnene Film wurden jeweils auf
Enzymaktivität
unter Verwendung von o-Nitrophenol-β-D-galactopyranosid (o-NPG) (von Pierce,
Rockford, IL) bei 1 mg/ml in Wasser unter Verwendung des Protokolls
analysiert, das im „Worthington
Enzyme Manual" (Worthington
Biochemical Corp., Freehold, NJ, 1977) beschrieben ist. Die letzte
Waschung zeigte keine β-Galactosidaseaktivität, während der
Film das gelbe Nitrophenolprodukt ergab. Dieses Ergebnis zeigte,
daß die β-Galactosidase-Einheit
aktiv war, nachdem das Erfindungspolymer quervernetzt war, um ein
unlösliches
Biomaterial zu bilden.
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Beispiel 12
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DNA-Polymer
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Eine
Modell-Oligodesoxynucleotid(oligoDNA)-Sonde mit einer Sequenz von
Exon 1 des H-2Kb-Gens des Haupthistokompatibilitätskomplexes
wurde synthetisiert und als eine Einfangsonde verwendet. Die Sequenz
der oligoDNA-Einfangsonde war 5'-GTCTGAGTCGGAGCCAGGGCGGCCGCCAACAGCAGGAGCA-3' und wurde mit einem
aliphtischen C12-Spacer am 5'-Ende
synthetisiert, der mit einem primären Amin abschloß. Die oligoDNA-Einfangsonde
(80 μg oder
6 nmol) wurde über
die terminale Aminogruppe auf dem C12-Spacer an 160 μg NOS-Polymer,
hierin beschrieben, in 50 mM Phosphatpuffer (pH 8,5, 1 mM EDTA,
0,24 ml Endvolumen) bei Raumtemperatur für 2,5 Stunden gekoppelt. Das
resultierende DNA-Polymer wurde ohne weitere Reinigung oder Charakterisierung
eingesetzt.
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Das
DNA-Polymer wurde auf Mikroplattenvertiefungen (Polypropylenplatten
von Corning Costar Corporation, Cambridge, MA) mit 10 pmol (in 0,1
ml Lösung)
pro Vertiefung aufgebracht und für
10–30
Minuten inkubiert. Die Platten, die DNA-Polymerlösungen enthielten, wurden für 1,5 Minuten
mit einer Dymax-Lampe bestrahlt, wie hierin beschrieben, mit der
Ausnahme, daß ein
Filter verwendet wurde, der Licht mit kürzeren Wellenlängen als
300 nm entfernt. Eine Kontrolle bestand aus oligoDNA-Einfangsonde
(10 pmol in 0,1 ml 50 mM Phosphatpuffer, pH 8,5, 1 mM EDTA), die
zu Vertiefungen zugegeben, für
2,5 Std. adsorbieren gelassen und nicht bestrahlt wurde. Die Platten
wurden mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, die 0,05% Tween 20 in
PBS enthielt, gewaschen, um nicht-gebundenes DNA-Polymer oder Kontroll-oligoDNA-Einfangsonde
zu entfernen.
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Eine
Nachweissonde mit einer zur Einfangsonde komplementären Sequenz,
hierin beschrieben, wurde mit einem Biotin am 5'-Ende synthetisiert und verwendet, um
die Aktivität
des immobilisierten DNA-Polymers zu bewerten. Die Sequenz der Nachweissonde war
5'-CCGTGCACGCTGCTCCTGCTGTTGGCGGCCGCCCTGGCTCCGACTCAGAC-3'. Eine Kontroll-Nachweissonde, die aus
einer nicht-komplementären
Sequenz von Exon 2 des H-2Kb-Gens bestand,
wurde ebenfalls mit einer Biotin-Einheit am 5'-Ende synthetisiert.
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Die
Bindung jeder Nachweissonde wurde getestet, indem nacheinander ein
Konjugat von Streptavidin und Meerrettichperoxidase (SA-HRP, erhältlich von
Pierce, Rockford, IL) zugegeben und die Aktivität des gebundenen HRPs gemessen
wurde. Für
diesen Test wurden die beschichteten Platten mit Hybridisierungspuffer (0,75
M NaCl, 0,075 M Citrat, pH 7,0, 0,1% Lauroylsarcosin, 1% Casein
und 0,02% Natriumdodecylsulfat) bei 55°C für 30 Minuten blockiert. Komplementäre und nicht-komplementäre Nachweissonden
wurden mit 50 fmol pro 0,1 ml Hybridisierungspuffer pro Vertiefung
zugegeben und für
eine Stunde bei 55°C
inkubiert. Die Platten wurden dann mit 0,3 M NaCl, 0,03 M Citrat,
pH 7,0, das 0,1% SDS enthielt, für
5 Minuten bei 55°C
gewaschen. SA-HRP wurde mit 0,5 μg/ml
zugegeben und für
30 Minuten bei 37°C
inkubiert. Die Platten wurden dann mit 0,05% Tween 20 in PBS gewaschen,
gefolgt von der Zugabe von Peroxidasesubstrat (TMB Microwell Peroxidase-Substratsystem von
Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) und Messung
der Extinktion bei 655 nm auf einer Mikroplatten-Lesegerät (Modell
3550, Bio-Rad Labs, Cambridge, MA). Da die Polypropylenplatten undurchsichtig
waren, wurden die umgesetzten Substratlösungen auf Polystyrolplatten überführt, um
die Extinktion abzulesen.
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Hybridisierungssignale
(A655) von Polypropylen-Mikrovertiefungen,
die mit photoimmobilisiertem DNA-Polymer beschichtet waren, oder
adsorbierter oligoDNA-Einfangsonde
(n = 3).
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Die
Ergebnisse in der obigen Tabelle liefern die Hybridisierungssignale
von Polypropylen-Mikrovertiefungen,
die mit photoimmobilisierten DNA-Polymer oder adsorbierter oligoDNA-Einfangsonde beschichtet
waren (n = 3). Diese Ergebnisse zeigen, daß das photoimmobilisierte DNA-Polymer
32-mal mehr komplementäre Nachweissonde
bindet, als dies die adsorbierte Kontrolle tut, und keine Beschichtung
bindet die nicht-komplementäre
Sonde.