DE69736708T2

DE69736708T2 - Produkt zur proteinstabilisierung von weinen

Info

Publication number: DE69736708T2
Application number: DE69736708T
Authority: DE
Inventors: Virginie Moine; Denis Dubourdieu
Original assignee: APPLIC DE RECH S ET DE CONSEIL; D'applications De Recherches Et De Conseils Oenologiques (sarco) Ste
Current assignee: APPLIC DE RECH S ET DE CONSEIL; D'applications De Recherches Et De Conseils Oenologiques (sarco) Ste
Priority date: 1996-06-26
Filing date: 1997-06-25
Publication date: 2007-10-04
Anticipated expiration: 2017-06-26
Also published as: AU3448397A; ATE340249T1; EP0912718A1; US6238880B1; ZA975594B; AU726185B2; ES2273368T3; FR2750434B1; FR2750434A1; WO1997049794A1; EP0912718B1; AR007624A1; DE69736708D1

Description

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Verfahren zur Eiweißstabilisierung in Weinen zu entwickeln.
In dem Patentantrag Nr. 2 726 284 der Faculté d'Oenologie in Bordeaux werden enzymatisch gewonnene Mannoproteine beschrieben, die ausgesprochen wirkungsvoll gegen die Ausscheidung von Weinstein sowie von Eiweißen eingesetzt werden können.
Diese Mannoproteine werden insbesondere durch die enzymatische Auflösung der Zellwände von Hefen unter Wirkung von 1,3-β-Glucanase und 1,6-β-Glucanase gewonnen, wobei es sich bei den genannten Hefen in einer Ausführungsform um die Art Saccharomyces cerevisiae handelt.
Dabei stellte man zudem fest, dass das Mannoprotein mit einem Molekulargewicht von 31800 Dalton, MP 32 genannt, sich bei der Eiweißstabilisierung als besonders wirkungsvoll erwies.
Ferner wurde Versuche durchgeführt, um zu belegen, dass es sich bei MP 32 um ein Invertasefragment handelt.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein enzymatisches Verfahren zur Gewinnung von Mannoproteinen zum Zwecke der Eiweißstabilisierung in Weißweinen zu entwickeln, dass in der Umsetzung einer enzymatischen Auflösung von Saccharomyces cerevisiae mittels Hydrolyse besteht.
Diese enzymatische Auflösung erfolgt unter Wirkung von 1,3-β-Glucanase und 1,6-β-Glucanase sowie in saurer Umgebung aktiven Proteasen.
Das gewonnene Hydrolysat wird physikalisch behandelt, insbesondere durch eine Membrandialyse gegen Wasser mit einer Ausschlussgrenze von 6.000 bis 8.000 Dalton, gefolgt von einer Gefriertrocknung, sowie durch eine Zentrifugation und Filtration vor der Dialyse.
Die Erfindung betrifft ebenfalls die Auswahl von Saccharomyces cerevisiae-Zellwänden, deren Invertaseaktivität die Gewinnung von Mannoproteinen mit einem Molekulargewicht ermöglicht, das für die Stabilisierung von Weißweinen gemäß Anspruch 5 geeignet ist.
Bestandteil des Verfahrens sind Versuche, die weiter unten beschrieben werden und deren Abbildungen Folgendes zeigen:
1 – Vergleichsdiagramm der erzielten Stabilisierungswirkung mit Angabe der für die Stabilisierung des Weins erforderlichen Menge Bentonit und der Trubzahl in NTU zur Bestimmung der Trübung nach dem Wärmetest.
2 – Vergleichsdiagramm des Gehalts an MP 32 der unterschiedlichen Zubereitungen, mittels Kapillarelektrophorese erzielt.
3 – Vergleichsdiagramm der mit den unterschiedlichen Zubereitungen erzielten Stabilisierungswirkung, abhängig von den Invertase-Hydrolysattypen, und
4 – Vergleich des Gehalts an MP 32 der unterschiedlichen Zubereitungen, mit denen die Ergebnisse in 3 erzielt wurden.
Es ist bekannt, dass die Invertase 2 oder 4 von Saccharomyces cerevisiae ein Molekulargewicht von 270.000 Dalton besitzt und daher ein wesentlich größeres Molekulargewicht als MP 32.
Es ist ebenfalls bekannt, dass die Invertase insbesondere folgende Kette von Aminosäuren enthält:
Lysin-Valin-Phenylalanin-Tryptophan-Tyrosin-Glutamin-Prolin-Serin-Glutagin-Lysin.
Der Antragsteller hat darüber hinaus eine Sequenzierung des Mannoproteins MP 32 durchgeführt und dabei überraschenderweise eine 100%-ige Übereinstimmung mit der in der Invertase enthaltenen Sequenz festgestellt.
Für die Überprüfung, ob das Mannoprotein MP 32 tatsächlich aus einem Invertasefragment von Saccharomyces cerevisiae stammt, werden die beiden folgenden Zubereitungen vorgeschlagen:

– Inv1, 30 bis 50 Einheiten/mg handelsüblicher nicht löslicher Invertase von SIGMA^®, hydrolysiert in 5% Glucanex^® von NOVO, sowie
– Inv2, 400 Einheiten/mg handelsüblicher löslicher Invertase von SIGMA^®, hydrolysiert in Glucanex^® von NOVO.

Nach der Auflösung werden die Hydrolysate Inv1g und Inv2g zentrifugiert, filtriert sowie einer Membrandialyse mit einer Ausschlussgrenze von 6.000 bis 8.000 Dalton unterzogen und das auf diese Weise gewonnene Hydrolysat gefriergetrocknet.
Anschließend gibt man 25 g/hl von jeder Zubereitung in einen Wein, um auf diese Weise einen Vergleich der Stabilisierungswirkung dieser Zubereitungen zu ermitteln.
Die Ergebnisse sind in dem Diagramm in 1 zusammengefasst. Jeder Wein erfuhr zur Bewertung der Eiweißstabilität eine Wärmebehandlung, bei der er 30 Minuten auf 80 °C gehalten wurde.
Es lässt sich feststellen, dass das durch enzymatisches Verfahren mit Glucanex^® aus den aufgelösten Hefezellwänden gewonnene Mannoprotein eine stabilisierende Wirkung besitzt, da für das Erreichen einer besseren Trubzahl NTU weniger Bentonit benötigt wird.
Bei geringer Invertasekonzentration ist die Zubereitung Inv1g sogar noch besser als die durch enzymatisches Verfahren aus den Hefezellwänden extrahierte Zubereitung.
Eine höhere Stabilisierung lässt sich feststellen, sobald die Invertasekonzentration zunimmt, selbst bei der nicht hydrolysierten Zubereitung.
Die Stabilität wird sehr stark verbessert, sobald man, bei einer starken Invertase-Startkonzentration, Inv2 mittels Glucanex^® hydrolysiert (Inv2g).
Somit ist das Hydrolysat mit Glucanex^® umso aktiver, je reicher die Zubereitung an Invertase ist.
Die Zugabe von Bentonit ist nicht mehr erforderlich und die Bildung von Trub am Ende des Wärmetests geht gegen Null.
Durch Kapillarelektrophorese lässt sich feststellen, dass der Gehalt an MP 32 parallel mit der Stabilisierungsaktivität ansteigt. Je mehr MP 32 vorhanden ist, desto deutlicher ist die Stabilisierungsaktivität.
Es ist möglich, dass die Freiwerdung des Invertasefragments von Saccharomyces cerevisiae während der Autolyse der Hefen bei Vorhandensein der geeigneten Aminosäurekette von den Proteasen bewirkt wird.
Unter Berücksichtigung der physikalisch-chemischen Parameter der Weine, pH-Wert von 3 bis 3,8, handelt es sich bei den aktiven Proteasen von Saccharomyces cerevisiae um:

– die Protease A, SIGMA^® und
– die Carboxypeptidase Y, SIGMA^®

Folgende Versuche werden durchgeführt:
In einer Citrat-Pufferlösung (10 ml) hydrolysiert man 100 mg gereinigte Invertase Inv2 während 15 Stunden bei 20 °C mit:

– 5 mg Glucanex^®,
– 2,5 mg Carboxypeptidase Y,
– 0,3 mg Protease A.

Parallel dazu nimmt man eine ähnliche Hydrolyse vor, bei der allerdings die gleichen Enzyme durch Hitze inaktiviert werden (1 Min. bei 100 °C).
Daraufhin werden die verschiedenen Zubereitungen einer Membrandialyse gegen Wasser mit einer Ausschlussgrenze von 6.000 bis 8.000 Dalton unterzogen und anschließend gefriergetrocknet.
Auf identische Weise werden Probenweinen jeweils 25 g/hl der Zubereitungen zugesetzt und die Proben anschließend einem Wärmetest zur Bestimmung der Trübung unterzogen.
Die Abkürzungen im Diagramm in 3 stehen für die folgenden Produkte:

– g, Glucanex^®,
– gc, Glucanex^®, jedoch mit vorheriger Inaktivierung bei 100 °C während einer Minute,
– CY, Carboxypeptidase Y,
– Cyc, Carboxypeptidase Y, jedoch mit vorheriger Inaktivierung bei 100 °C während einer Minute,
– PA, Protease A, und
– PAc, Protease A, jedoch mit vorheriger Inaktivierung bei 100 °C während einer Minute.

Es lässt sich feststellen, dass die enzymatische Hydrolyse einer Invertasezubereitung Produkte hervorbringt, die eine stabilisierende Wirkung auf Weißwein besitzen.
Es lässt sich eine besonders erfolgreiche Wirkung von Glucanex^® und der Protease A für die Gewinnung von Mannoproteinen MP 32 beobachten, wobei die Protease A am wirkungsvollsten ist.
Diese Beobachtung wird im Übrigen von den in 4 zusammengefassten Versuchen bestätigt, die den Gehalt an MP 32 der verschiedenen vorherigen Hydrolysate zeigt.
Es lässt sich ebenfalls beobachten, dass sich die teilweise Inaktivierung durch Wärme negativ auf die erhaltenen Ergebnisse auswirkt.
Auf diese Weise wurde gezeigt, dass durch das Verfahren eine Stabilisierung der Eiweiße in Weißweinen erreicht werden kann.

Claims

Verfahren zur Gewinnung eines biologischen Produkts zum Zwecke der Eiweißstabilisierung in Weißweinen, dadurch gekennzeichnet, dass es in der Umsetzung einer enzymatischen Auflösung von Saccharomyces cerevisiae mittels Hydrolyse unter Wirkung von 1,3-β-Glucanase und 1,6-β-Glucanase sowie in saurer Umgebung aktiven Proteasen besteht.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das erhaltene Hydrolysat einer physikalischen Behandlung unterzogen wird.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die physikalische Behandlung eine Membrandialyse gegen Wasser mit einer Ausschlussgrenze von 6000 bis 8000 Dalton, gefolgt von einer Gefriertrocknung, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die physikalische Behandlung ferner eine Zentrifugation und eine Filtration vor der Dialyse umfasst.
Verfahren zur Auswahl von Saccharomyces cerevisiae-Hefen, aus deren Zellwänden Mannoproteine mit einem Molekulargewicht gewonnen werden können, das für die Stabilisierung von Weißweinen geeignet ist, und dadurch gekennzeichnet, dass die Zellwände aus Hefen ausgewählt sind, deren Zellwände eine Invertaseaktivität zeigen.