DE69729740T2 - Cytotrienin-verbindungen, verfahren zu ihrer herstellung und antitumor-mittel - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft neue Cytotrienine I, II, III und IV, ein Verfahren zur Herstellung derselben und Antitumor-Mittel, die dieselben als Wirkstoff umfassen.
• Die jüngsten Studien haben gezeigt, dass viele Onkogen-Produkte als Signal-Transduktionsmolekül wirken und dass die Aktivierung eines solchen Produkts die Neoplasie von Zellen auslöst. Eine Anzahl von onkogenen Produkten wurde nachgewiesen, und nun wurde deutlich, dass mehr als die Hälfte der Anzahl von Onkogenen Tyrosinkinase codiert und dass diese Onkogene eng mit der malignen Transformation von Zellen und mit der Retention der Krebsmorphologie zusammenhängen. Somit wird vorgeschlagen, dass eine Verbindung, die die Funktionen dieser onkogenen Produkte hemmt, ein potentielles Antitumormittel wäre und die Entwicklung neuer Antitumor-Mittel mit einer solchen neuen Wirkungsweise ist erforderlich.
• Obwohl viele Antitumor-Verbindungen bereits als Arzneimittel entwickelt wurden, sind immer noch neue Antitumor-Mittel mit einer neuen chemischen Struktur erforderlich.
• Die vorliegende Erfindung soll die obigen Anforderungen erfüllen und neue Verbindungen mit Antitumor-Aktivität, die Cytotrienine I, II, III und IV, Herstellungsverfahren für diese und Antitumor-Mittel, die diese als Wirkstoff umfassen, bereitstellen.
• Bei der Studie zur Lösung der obigen Probleme fanden die Erfinder der vorliegenden Erfindung, dass der Stamm Actinomyces sp. 95–74, der der Spezies Streptomyces angehört, aus einer Bodenprobe, die in der Stadt Shiki, Präfektur Saitama, Japan, gesammelt wurde, isoliert wurde, Material mit Antitumor-Aktivität produziert.
• Die vorliegende Erfindung stellt die Cytotrienine I, II, III und IV, die durch die folgenden Formeln dargestellt sind, bereit.
• 
• Die Cytotrienine I, II, III und IV können durch Kultivieren eines zur Herstellung der Cytotrienine I, II, III und IV fähigen Bakteriums, das der Spezies Streptomyces angehört, in einem Medium zur Herstellung und Akkumulierung der Cytotrienine I, II, III und IV in dem Medium und ihr Ernten hergestellt werden. Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Bakterium umfasst den Stamm Streptomyces sp. 95–74.
• Außerdem stellt die vorliegende Erfindung ein Antitumor-Mittel, das das neue Cytotrienin I, II, III oder IV als Wirkstoff umfasst, bereit.
• Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden ausführlicher beschrieben.
• Die neuen erfindungsgemäßen Verbindungen, die Cytotrienine I, II, III und IV, sind durch die folgenden Formeln dargestellt.
• 
• Die vorliegenden Verbindungen Cytotrienin I, II, III und IV können aus einem Mikroorganismus der Spezies Streptomyces, beispielsweise dem Stamm Streptomyces sp. 95–74, hergestellt werden. Der Stamm Streptomyces sp. 95–74 besitzt die folgenden mykologischen Merkmale. Tabelle 1 Physiologische Merkmale des Stammns Streptomyces sp. 95–14

  

  Tabelle 2 Kulturmerkmale des Stamms Streptomyces sp. 95–74

  

++

gutes Wachstum;

+

Wachstum;

±

geringes Wachstum;

–

kein Wachstum

Tabelle 3 Kohlenstoffquellen-Verwendung durch den Stamm Streptomyces sp. 95–74


++

gute Verwendung;

+

Verwendung;

±

fast keine Verwendung;

–

keine Verwendung

• Der erfindungsgemäße Bakterienstamm wurde auf der Grundlage der mikrobiellen Merkmale in den obigen Tabellen 1, 2 und 3 als Streptomyces-Spezies identifiziert. Dieser Stamm wurde am 11. Oktober 1996 beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technologie, Japan (1–3, Higashi, 1-chome, Tukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan), das eine offizielle internationale Hinterlegungsbehörde ist, mit der Zugangsnummer FERM BP-6185 unter den Maßgaben des Budapester Vertrags hinterlegt; sämtliche Beschränkungen des öffentlichen Zugriffs auf die Hinterlegung erlöschen unwiderruflich bei der Erteilung eines Patents auf diese Anmeldung; und die Hinterlegung wird ausgetauscht, wenn von der Hinterlegung keine überlebensfähige Proben abgegeben werden können.
• Die Isolierung der neuen Cytotrienine I, II, III und IV aus der Fermentationsbrühe des oben beschriebenen Actinomyceten-Stamms Streptomyces sp. 95–74 kann gemäß den Kultivierungsverfahren für ein der Spezies Streptomyces angehöriges Bakterium durchgeführt werden, allerdings werden in den Herstellungsbeispielen nachstehend die Einzelheiten der Vorgehensweisen beschrieben. Nach Inkubation können die Reinigung und Isolierung der Cytotrienine I, II, III und IV aus der Kulturbrühe unter Verwendung der üblichen Mittel zum Sammeln eines biologischen Stoffwechselprodukts durchgeführt werden. Beispielsweise umfasst das Mittel die Verwendung verschiedener Techniken von Ionenaustauscherharz, nicht ionischem Adsorptionsharz, Gelfiltrationschromatographie oder Chromatographie oder Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit adsorptiven Materialien, wie Aktivkohle, Aluminiumoxid, Silicagel, sowie Kristallisation, Vakuumkonzentrierung und Gefriertrocknung. Jedes dieser Mittel kann allein oder in Kombination oder wiederholt verwendet werden.
• Somit zeigen die neuen hergestellten Cytotrienine I, II, III und IV Antitumor-Aktivität, wie in dem Abschnitt "Evaluierungsstudie" gezeigt.
• Das angewandte Verfahren, die Dosierungsform und Dosierungsmenge des erfindungsgemäßen Antitumor-Mittels, das die. Cytotrienine I, II, III und IV als Wirkstoff umfasst, wird je nach Verwendungszweck des Mittels bestimmt. Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Antitumor-Mittel, das die Cytotrienine I, II, III und IV als Wirkstoff umfasst, oral oder parenteral verabreicht werden. Die Dosierungsform umfasst beispielsweise orale Arzneimittel, wie Tabletten, Pulver, Kapseln, Granulatkörner, Extrakte, Sirupe und dergleichen, und parenterale Arzneimittel, wie Injektionen und Suppositorien. Diese Präparationen können durch bekannte Verfahren unter Verwendung pharmatzeutisch verträglicher Zusatzstoffe, wie Hilfsstoffe und Bindemittel, hergestellt werden. Die klinische Dosis des erfindungsgemäßen Antitumor-Mittels, das die Cytotrienine I, II, III und IV umfasst, kann auf der Grundlage von Alter, Gewicht, Empfindlichkeit und Symptom des Patienten bestimmt werden. Im Allgemeinen beträgt eine wirksame Menge für einen erwachsenen Patienten etwa 0,1 mg bis 1 g pro Tag, und diese Menge kann in einer Einzeldosis oder in mehreren Dosen verabreicht werden. Zusätzlich ist, falls notwendig, die Verwendung der Menge außerhalb des oben beschriebenen Bereichs möglich.
• Zusätzlich zeigt sich, falls die Verbindung als Reagens zum chemischen Testen verwendet wird, durch Verabreichung der in einem organischen oder wässrigen organischen Lösungsmittel gelösten Verbindung direkt an jede Kulturzelllinie ein Zellwachstum. Ein solches organisches Lösungsmittel umfasst beispielsweise Methanol, Dimethylsulfoxid und dergleichen. Die verwendete Formulierung umfasst beispielsweise einen Feststoff, wie Pulver und Granulat, und Flüssigkeit, gelöst in einem organischen Lösungsmittel oder in einem wässrigen organischen Lösungsmittel. Eine wirksame Menge der Mittel, die die Cytotrienine I, II, III und IV als Wirkstoff zur Hemmung des Tumorzellwachstums umfassen, beträgt im allgemeinen 1 × 10^–3 bis 100 μg/ml. Allerdings variiert eine geeignete Menge je nach Art der Kulturzelllinie oder Zweck der zu verwendenden Verbindung. Die Verwendung der Menge außerhalb des oben beschriebenen Bereiches ist, falls notwendig, möglich.
• BEISPIELE
• Die folgenden Beispiele sind zu Erläuterungszwecken der vorliegenden Erfindung bereitgestellt.
• Herstellungsbeispiel 1
• Der Stamm Streptomyces sp. 95–74 wurde auf ein Medium (pH 6,5) übergeimpft, das aus 2% Glucose, 2,5% Sojamehl, 1% löslicher Stärke, 0,4% Hefe, 0,1% Brühe, 2% Salz und 0,005% Dikaliumhydrogenphosphat bestand, und anschließend wurde die Inkubation unter Schütteln 96 h bei 28°C fortgesetzt.
• Die Kulturbrühe (1,8 l) wurde mit 2 l 80%igen Aceton extrahiert. Nach Vakuumfiltration und Vakuumkonzentrieren wurde die wässrige Lösung auf pH 7,0 eingestellt und 3 × mit 2,6 l Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatphasen wurden vereinigt und dann unter vermindertem Druck unter Erhalt von 571 mg braunem Sirup konzentriert.
• Der Sirup (571 mg) wurde in 1 ml Ethylacetat/Methanol (9 : 1) gelöst und auf eine Kieselgelsäule (bestehend aus im Handel erhältlichem Sep-Pak^® CARTRIDGE PLUS SILICA (Durchmesser 10 mm, Länge 30 mm), gekoppelt mit einer gepackten Säule (10 ml Injektionsspritze) (Silicagel: 20 mm Durchmesser, Länge 50 mm)) aufgegeben, die zuvor mit Ethylacetat/Methanol (9 : 1) behandelt worden war. Das Verhältnis von Ethylacetat und Methanol wurde geändert (90 : 10, 50 : 50), und 60 ml jeder Lösung wurden eluiert. Schließlich wurden 60 ml Methanol eluiert. Die wirksame Komponente wurde in der Fraktion von Ethylacetat-Methanol (90 : 10) eluiert. Die Fraktionen wurden unter vermindertem Druck unter Erhalt von 484 mg braunem öligem Material konzentriert.
• Anschließend wurde das Material durch präparative Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer ODS-Säule (20 mm Durchmesser, 250 mm Länge; Kapselpackung Shiseido) und 62,5% wässrigem Methanol als Elutionsmittel unter Bedingungen, dass die Fließgeschwindigkeit 9,0 ml/min und die Nachweiswellenlänge 230 nm betrug, gereinigt. Als Ergebnis wurden 64,4 mg bzw. 9,8 mg der Cytotrienine I bzw. II als hellgelbes Pulver erhalten.
• Obwohl die Cytotrienine III und IV aus den Kulturprodukten durch die gleichen Reinigungsverfahren isoliert werden können, können diese Verbindungen leicht durch Oxidation der Cytotrienine I und II mit Eisen(III)-chlorid erhalten werden (8). Zusätzlich können die Cytotrienine III und IV durch eine Reduktionsreaktion mit Natriumhydrogensulfit in die Cytotrienine I und II übergeführt werden (9).
• Die physiologischen Merkmale der gereinigten authentischen Cytotrienine I, II, III und IV sind in den Tabellen 4 und 5 gezeigt, und die NMR-spektroskopischen Daten der Cytotrienine I und II sind in den Tabellen 6 und 7 gezeigt.
• Tabelle 4 Physiologische Merkmale der Cytotrienine I und II

  
• Tabelle 5 Physiologische Merkmale der Cytotrienine III und IV

  
• Tabelle 6 400 MHz ¹H-NMR und 100 MHz ¹³C-NMR Chemische Verschiebungsdaten (δppm)¹⁾ für Cytotrienin I

  
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• Tabelle 7 400 MHz ¹H-NMR und 100 MHz ¹³C-NMR Chemische Verschiebungsdaten (δppm)¹⁾ für Cytotrienin II

  
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• Die biologischen Aktivitäten der erfindungsgemäßen Verbindungen wurden wie nachstehend beschrieben bestimmt.
• Evaluierungsstudie 1
• Aktivität der Cytotrienine I, II, III und IV bei der Reversion von v-src-NRK-Zellen (Ratten-Nierenzellen, infiziert mit dem Temperatur empfindlichen Rous-Sarcoma-Virus) zur normalen Morphologie.
• Viele Onkogene codieren Tyrosinkinase. Es wird angenommen, dass von ihnen v-src die Nichtrezeptortyp-Tyrosinkinase codiert, dass die Zelle zu einer transformierten Morphologie veranlasst wird. Die v-src-NRK-Zelle, in der das Temperatur empfindliche v-src-Gen transformiert ist, zeigt bei permissiver Temperatur (32°C) Krebsmorphologie und bei nicht-permissiver Temperatur (39°C) eine normale Morphologie. Dies legt nahe, dass das Mittel, das die normale Morphologie auslöst, die Funktion des src-Proteins und das für das src-Protein zutreffende Signal-Transduktionssystem hemmt und die Prolieferation von Krebszellen selektiv hemmt.
• Die v-src-NRK-Zelle wird typischerweise auf MEM-Eagle-Medium, das 10% Rinderserum einschließt, bei 32°C in einer Kulturkammer kultiviert, die mit 5% Kohlendioxid und Dampf gesättigt ist. Bei der zulässigen Temperatur (32°C) wurde eine Reihe von verdünntem Cytotrienenin I, II, III oder IV zugesetzt. Nach 18 h wurde die Induzierbarkeit der normalen Morphologie analysiert. Das Ergebnis wurde in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 8 Reversionsaktivität der Cytotrienine I, II, III und IV bei der Induktion der normalen Mophologie der v-src^ts-NRK-Zelle

  

+

schwache Induktion der normalen Morphologie;

++

Induktion der normalen Morphologie

+++

hohe Induktion der normalen Morphologie

• Tabelle 8 zeigt, dass die Cytotrienine I, II, III und IV als Antitumor-Mittel wirksam sind.
• Evaluierungsstudie 2
• Inhibitorische Aktivität der Cytotrienine I, II, III und IV auf den Zellzyklus
• Im Allgemeinen teilt sich die Zelle und prolieferiert nach einem Zellzyklus, der eine Serie von Phasen, wie M-Phase, G1-Phase, S-Phase und G2-Phase, umfasst. Wird der Kontrollmechanismus des Zellzyklus gestört, so wird die Homöostase unterbrochen und die Wahrscheinlichkeit eines Krebsleidens oder einer Immunerkrankung würde ansteigen.
• Die v-src^ts-NRK-Zelle, bei der das Temperatur empfindliche SRC-Gen transformiert ist, zeigt bei permissiver Temperatur (32°C) eine Krebsmorphologie, und es werden viele Zellen in der S-Phase festgestellt, während bei nicht-permissiver Temperatur (39°C) die Zelle eine normale Morphologie zeigt und viele Zellen in der G0/G1-Phase festgestellt werden. Es wird nahegelegt, dass ein Mittel, das das Fortschreiten der S-Phase bei permissiver Temperatur unterbricht und die normale Morphologie auslöst, die Funktion des SRC-Proteins und des mit dem SRC-Protein zusammenhängenden Signal-Transduktionssystems sowie die Prolieferation von Krebszellen selektiv hemmt.
• Wird die v-src^ts-NRK-Zelle bei nicht-permissiver Temperatur (39°C) kultiviert, stoppt der Zellzyklus in der G0/G1-Phase, und wenn die Temperatur auf die permissive Temperatur (32°C) herabgesetzt wird, geht die Zelle in die S-Phase über und wiederholt anschließend die Prolieferation. Eine Reihe von verdünntem Cytotrienenin I, II, III oder IV wurde gleichzeitig mit der herabsetzung zugesetzt, und nach 18 h wurde der Fortschritt des Zellzyklus zur S-Phase durch Strömungszytometrie analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt. Tabelle 9 Inhibitorische Wirkung der Cytotrienine I, II, III und IV auf den v-src^ts-NRK-Zellzyklus

  

+

schwache Hemmung des Fortschritts der S-Phase

++

Hemmung des Fortschritts der S-Phase;

+++

starke Hemmung des Fortschritts der S-Phase

• Tabelle 9 zeigt, dass die Cytotrienine I, II, III und IV als Antitumor-Mittel wirksam sind.
• Evaluierungsstudie 3
• Inhibitorische Aktivität bei der Prolieferation von Krebszellen der Cytotrienine I, II, III und IV
• Die menschlichen Leukozytenzellen K562 und HL-60 wurden auf PRM 1640-Medium (umfassend 10% Rinderserum) in einer Kulturkammer, die mit 5% Kohlendioxid und Wasserdampf gesättigt war, inkubiert. Dem Medium wurde eine Reihe von verdünntem Cytotrienin I, II III oder IV zugesetzt. Nach 17 h wurde MTT-Reagens zugesetzt und das Wachstum gemessen. Das Ergebnis wurde in Tabelle 10 gezeigt. Tabelle 10 Inhibitorische Wirkung der Cytotrienine I, II, III und IV auf die Prolieferation von Krebszellen IC50-Wert [gezeigt als Konzentration zur Hemmung von 50% Prolieferation (μg/ml)]

  

K-562

Menschliche chronisch-myelogene Leukämie-Zellen

HL-60

Menschliche akut-promyelogene Leukämie-Zellen

• Tabelle 10 zeigt, dass die Cytotrienine I, II, III und IV als Antitumor-Mittel wirksam sind.
• Evaluierungsstudie 4
• Antimikrobielle Aktivität der Cytotrienine I, II, III und IV
• Die Cytotrienine I, II, III und IV wurden durch das Agar-Verdünnungsverfahren in Bouillon-Medium (getesteter Mikroorganismus: Bakterien, 37°C, 1 Tag) und Sabouraud-Medium (getesteter Mikroorganismus: Fungus, 28°C, 2 Tage) getestet. In Tabelle 11 ist die inhibitorische Minimalkonzentration gezeigt.
• Tabelle 11 Antimikrobielle Aktivität der Cytotrienine I, II, III und IV (gezeigt als inhibitorische Minimalkonzentration (MIC: μg/ml))

  
• Herstellungsbeispiel 1 (für Injektionen und Tropfinjektionen)
• 10 mg Cytotrienin I, II, III oder IV mit 5 g Dextrosepulver wurden abgewogen und in einem Röhrchen aseptisch versiegelt. Das Röhrchen wurde mit Inertgas, wie Stickstoff und Helium, gefüllt und in einem kühlen dunklen Raum gehalten. Bei ihrer Verwendung wurde die Verbindung in dem Röhrchen in Ethanol gelöst, und der Lösung wurde 0,85% physiologische Salzlösung (100 ml) zugesetzt, um eine Präparation zur intravenösen Injektion zu bilden, wovon je nach Symptom der Krankheit 10 bis 100 ml/Tag durch intravenöse Injektion oder Tropfinfusion verabreicht werden.
• Herstellungsbeispiel 2 (Granulatkörner)
• 1 g Cytotrienin I, II, III oder IV, 98 g Lactose und 1 g Hydroxypropylcellulose wurden kombiniert und dann nach dem herkömmlichen Verfahren zu einer Granulat-Formulierung geformt und anschließend unter Erhalt von Granulatkörnern getrocknet, die zum Verpacken in einem Röhrchen oder zum Heißversiegeln geeignet sein können. Die Granulatkörner können oral in der Menge von 100 bis 1000 mg/Tag verabreicht werden.
• 1 zeigt das UV-Spektrum von Cytotrienin I (1a) und II (1b) in Methanol
• 2 zeigt das Infrarotspektrum (KBr) von Cytotrienin I.
• 3 zeigt das Infrarotspektrum (KBr) von Cytotrienin II.
• 4 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum (DMSO-d₆) von Cytrotrienin I.
• 5 zeigt das 1H-NMR-Spektrum (DMSO-d₆) von Cytrotrienin II.
• 6 zeigt das ¹³C-NMR-Spektrum (DMSO-d₆) von Cytrotrienin I.
• 7 zeigt das ¹³C-NMR-Spektrum (DMSO-d₆) von Cytrotrienin II.
• 8 zeigt die Umwandlung der Cytotrienine I bzw. II zu III bzw. IV.
• 9 zeigt die Umwandlung der Cytotrienine III bzw. IV zu I bzw. II.

Claims (16)

1. Verbindung, ausgewählt aus Cytotrieninen I, II, III und IV der nachstehenden Formeln:

   
2. Verbindung gemäß Anspruch 1, welche Cytotrienin I ist.
3. Verbindung gemäß Anspruch 1, welche Cytotrienin II ist.
4. Verbindung gemäß Anspruch 1, welche Cytotrienin III ist.
5. Verbindung gemäß Anspruch 1, welche Cytotrienin IV ist.
6. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung, ausgewählt aus Cytotrieninen I, II, III und IV gemäß Anspruch 1, welches Kultivieren eines Bakteriums, das zur Bildung der Verbindung befähigt ist, das zu Streptomyces gehört, in einem Medium, Akkumulieren der Verbindung in dem Medium und Ernten der Verbindung umfasst.
7. Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das Bakterium, das zur Bildung einer Verbindung, ausgewählt aus Cytotrieninen I, II, III und IV, befähigt ist, ein Streptomyces sp. 95–74 Stamm (FERM BP6185) ist.
8. Verfahren gemäß Anspruch 6 oder 7, wobei die Verbindung Cytotrienin I ist.
9. Verfahren gemäß Anspruch 6 oder 7, wobei die Verbindung Cytotrienin II ist.
10. Verfahren gemäß Anspruch 6 oder 7, wobei die Verbindung Cytotrienin III ist.
11. Verfahren gemäß Anspruch 6 oder 7, wobei die Verbindung Cytotrienin IV ist.
12. Antitumor-Mittel, welches mindestens eine Verbindung, ausgewählt aus Cytotrieninen I, II, III und IV gemäß Anspruch 1, als Wirkstoff umfasst.
13. Antitumor-Mittel gemäß Anspruch 12, wobei die Verbindung Cytotrienin I ist.
14. Antitumor-Mittel gemäß Anspruch 12, wobei die Verbindung Cytotrienin II ist.
15. Antitumor-Mittel gemäß Anspruch 12, wobei die Verbindung Cytotrienin III ist.
16. Antitumor-Mittel gemäß Anspruch 12, wobei die Verbindung Cytotrienin IV ist.