DE69718612T2

DE69718612T2 - Verfahren zur konservierung von infektiösen rekombinierenden viren, virale wässrige suspension und ihre medizinische verwendung

Info

Publication number: DE69718612T2
Application number: DE69718612T
Authority: DE
Inventors: Claude Sene
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 1996-07-16
Filing date: 1997-07-15
Publication date: 2003-11-06
Anticipated expiration: 2017-07-16
Also published as: US6451256B1; JP2000500026A; FR2751343B1; EP0853660B1; DK0853660T3; AU711409B2; FR2751343A1; ATE231549T1; JP3681401B2; DE69718612D1; ES2187798T3; CA2232604A1; CA2232604C; US20030082206A1; WO1998002522A1; AU3698697A; EP0853660A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Konservierung von infektiösen rekombinanten Viren, eine virale wäßrige Suspension und ihre medizinische Verwendung.
Lebende Viren haben zahlreiche Anwendungen, insbesondere als Impfstoffe. Es sind Partikel, die ein Genom in Form von DNA oder RNA besitzen, das die für ihre Replikation nützlichen Informationen enthält, die aber eine Wirtszelle infizieren müssen, um die Synthese der für sie notwendigen Proteine durchzuführen.
Außerdem hat es die Möglichkeit, in ein Virusgenom fremdes genetisches Material einzubringen, erlaubt, sogenannte rekombinante Viren herzustellen, die ein Gen mit therapeutischem Nutzen enthalten und dafür eingesetzt werden, dieses Gen in spezifische Zellen defizienter Patienten zu übertragen. Das ist das Prinzip der Gentherapie.
Die Möglichkeit, die Krankheiten des Menschen durch Gentherapie zu behandeln, ist innerhalb einiger Jahre vom Stadium der theoretischen Überlegungen zu dem der klinischen Anwendungen fortgeschritten. Die große Mehrheit der bis jetzt beschriebenen Protokolle setzt virale Vektoren dafür ein, das therapeutische Gen in die zu behandelnden Zellen zu übertragen und dort zu exprimieren.
Die retroviralen Vektoren sind heute aufgrund der Einfachheit ihres Genoms unter den meist verwendeten, obwohl sie eine recht eingeschränkte Klonierungskapazität aufweisen.
Die Adenoviren bieten ihrerseits mehrere Vorteile, die sie zu Vektoren der Wahl für eine Vielfalt von Anwendungen machen. Sie infizieren nämlich zahlreiche Zelltypen, sind nicht-integrierend, wenig pathogen und können sich in den sich teilenden oder ruhenden Zellen replizieren. Zur Information: ihr Genom besteht aus einem linearen und doppelsträngigen DNA-Molekül von ungefähr 36 kb, das über dreißig Gene enthält, sowohl frühe Gene, die zur Virusreplikation erforderlich sind (E1 bis E4; E für early, bedeutet im Englischen früh), als auch späte Strukturgene (L1 bis L5; L für late, bedeutet im Englischen spät).
Die zum Zweck der Gentherapie eingesetzten adenoviralen rekombinanten Vektoren sind replikationsdefizient, um ihre Ausbreitung in der Umwelt und im Wirtsorganismus zu vermeiden. Im allgemeinen fehlt ihnen ein Großteil der E1-Region und gewisse Informationen, die mit der Expression der verbleibenden viralen Gene verbunden sind.
Sie können nur durch trans-Komplementation der ihnen defizienten adenoviralen Funktionen vermehrt werden. Heute verwendet man hauptsächlich die komplementierende Zellinie 293 (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72) oder davon abstammende Linien (Yeh et al., 1996, J. Virol. 70, 559- 565; Wang et al., 1995, Gene Therapy 2, 775-783; Krougliak und Graham, 1995, Human Gene Therapy 6, 1575-1586).
Die Adenoviren werden insbesondere im Fall der Mukoviszidose-Behandlung durch Gentherapie eingesetzt (Parivani et al., 1996, medecine/sciences 12, 25-33).
Die rekombinanten Viren sind jedoch nur dann einsetzbar, wenn ihre Vermehrungs- und Infektionsfähigkeit während der gesamten Lagerungszeit sachgemäß erhalten wurden.
Herkömmlicherweise werden die gereinigten Adenoviren in einer Salzlösung konserviert, welche 10 bis 30% Glycerin enthält (Graham et al., 1991, Methods in Molecular Biology, Bd. 7, Kap. 11, S. 109- 127; Ed Murrey, The Human Press Inc.; Precious und Russel, Virology, a Practical Approach, 1985, Kap. 9, S. 193-205; Hsg.: BW Mahy, IRL Press, Washington DC; Kanegae et al., Jpn. J. Med. Sci. Biol., 47, 157-166, 1994 und Green et al., Methods in enzymology, Bd. LVIII, S. 425-435). Glycerin weist jedoch den Nachteil auf, daß es für das Lungenepithel reizend ist, was im Rahmen einer intratrachealen und intrapulmonalen Verabreichung (zum Beispiel zur Behandlung von Mukoviszidose oder von Atemwegkrebs) hinderlich sein kann. Hinzu kommt, daß diese Lösung zwar die Konservierung von Adenoviren in gefrorener Form zuläßt, es aber nicht erlaubt, deren Aktivität bei +4ºC länger als eine Woche zu erhalten.
Der Zusatz von Saccharose in geringer Konzentration (1 bis 5%) zu einer Salzlösung wurde ebenfalls beschrieben (Precious et al., siehe oben; Huyghe et al., Human Gene Therapy 6: 1403-1416, November 1995, und Hehir, Process Developement and Production Issues for Viral Vectors & Vaccines, The Williamsburg Bio Processing Conference, 2nd annual meeting, 6-9 November 1995) und läßt eine langfristige Stabilität der Adenoviren in gefrorener Form, aber nur eine kurzfristige bei + 4ºC zu (Hehir, siehe oben).
Da die Konservierung der Viren in gefrorener Form Lagerungs- und Transportprobleme bereitet, wurde ebenfalls in Betracht gezogen, die Viren und viralen Impfstoffe in lyophilisierter Form zu erhalten. Diese Technik weist jedoch den Nachteil auf, daß sie oft einen Verlust der viralen Aktivität zur Folge hat. Um dem abzuhelfen, erlaubt es der Zusatz von Trägersubstanzen wie Zuckern (Saccharose, Glucose, Trehalose), die virale Aktivität in lyophilisierter Form aufrecht zu erhalten (WO 95/10601 - Viagene und EP-0 357 709 - Quadrant). Der Gebrauch von Lactose oder Saccharose in geringer Konzentration (2,5- 5%) zur Erhaltung des lebenden, abgeschwächten Virus in lyophilisierter Form wurde ebenfalls empfohlen (JP-88 555465 - Kitasako Inst.).
Keine der bisher vorgeschlagenen Lösungen hat es erlaubt, die Aktivität der Adenoviren über mehr als sechs Monate auf einem befriedigenden Niveau zu halten und gleichzeitig die sekundären Probleme, wie Reizungen, zu vermeiden.
Die vorliegende Erfindung hilft den Nachteilen des Standes der Technik ab. Sie hat ein Verfahren zur langfristigen Konservierung infektiöser rekombinanter Viren sowohl in flüssiger als auch in gefrorener Form zum Gegenstand, in welchem die rekombinanten Viren in einer wäßrigen Lösung konserviert werden, die Saccharose in hoher Konzentration umfaßt.
Wenn auch der Gebrauch von Saccharose in hoher Konzentration für die Konservierung von Proteinen oder anderen biologischen Materialien (Timasheef et al., in Protein Structure, a Practical Approach, 1989, Hsg. Creighton, Kap. 14, S. 331-345, IRL Press, Oxford, und Doebbler, Cryobiology, Bd. 3, Nr. 1, 1966) oder für die Kryokonservierung lebender Zellen in flüssigem Stickstoff (Grout et al., Tibtech, Oktober 1990, Bd. 8, S. 293-297) seit langem bekannt ist, so wurde er noch nie für die Konservierung von Viren vorgeschlagen.
Die durch die Ausführung des Verfahrens gemäß der Erfindung erhaltenen Ergebnisse haben nun eine Kryoschutz-Wirkung von Saccharose bei unterschiedlichen Lagerungstemperaturen (-80ºC, -40ºC, - 20ºC und +4ºC) gezeigt, und dies um so mehr, je höher die Konzentration an Saccharose ist.
Vorteilhaft sind die von der vorliegenden Erfindung betroffenen infektiösen rekombinanten Viren Poxviridae, Adenoviren, Adenovirus-assoziierte Viren und Retroviren.
Im Rahmen der Erfindung werden die Viren in einer wäßrigen Lösung konserviert, die Saccharose in hoher Konzentration umfaßt, das heißt in einer Konzentration über 0,75 M, vorzugsweise von 0,75 M bis 1,5 M, bevorzugter noch in einer Konzentration gleich 1 M.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens gewinnen die infektiösen rekombinanten Viren an Stabilität, wenn die verwendete wäßrige Lösung einen basischen pH- Wert zwischen 8 und 9 und vorzugsweise gleich 8,5 aufweist.
So kann die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendete wäßrige Lösung eine aus Tris- Puffer, Triethanolamin-, Diethanolamin-, Borat/HCl-, Glycin/NaOH-, EPPS- [N-(2-Hydroxyethyl)piperazin- N'-(3-propansulfonsäure)], Bicin-, TAPS- [N-Tris (hydroxymethyl)methyl-3-aminopropansulfonsäure] und Tricin-Lösungen ausgewählte Pufferlösung sein.
Vorteilhafterweise ist es möglich, das Capsid oder die virale Hülle der gemäß der Erfindung konservierten Viren zusätzlich zu stabilisieren, indem man der verwendeten wäßrigen Lösung zumindest ein aus MgCl&sub2;, CaCl&sub2; und MnCl&sub2; ausgewähltes Salz eines zweiwertigen Kations zusetzt, wobei MgCl&sub2; bevorzugt wird.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird das Salz des zweiwertigen Kations in einer Konzentration von 0,1 bis 5 mM, vorzugsweise von 0,5 bis 2 mM und noch bevorzugter in der Größenordnung von 1 mM verwendet.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Viren in einer Pufferlösung konserviert, die 10 mM Tris/HCl-Puffer, 1 mM MgCl&sub2;, 1 M Saccharose, pH 8,5 umfaßt.
Man kann die Konservierung der Viren noch verbessern, indem man zumindest eine stabilisierende Verbindung verwendet, die gewählt wird aus: vorzugsweise einwertigen Salzen wie etwa NaCl oder KCl, die der Lösung eine Ionenstärke verleihen, Aminosäuren, wie etwa Gly, Leu, Lys, Arg, Asp, Val, Glu, und Verbindungen, die auf die Oberflächenspannung wirken, wie Tween 80 oder Triton X- 100, wobei letztere alleine oder in Gegenwart von Salzen verwendet werden können.
Vorteilhaft wird NaCl als stabilisierende Verbindung in einer Konzentration von 0,05 bis 1 M, vorzugsweise von 0,1 bis 0,5 M, noch bevorzugter von 0,1 bis 0,3 M verwendet, wobei die als optimal geltende Konzentration 0,15 M beträgt, und Tween 80 wird in einer Konzentration von 0,001 bis 0,5 Gew.- % im Verhältnis zur Gesamtlösung (entsprechend 10 mg/l bis 5 g/l), vorzugsweise von 0,002 bis 0,2 Gew.-% und noch bevorzugter in der Größenordnung von 0,005 Gew.-% verwendet.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform verwendet das erfindungsgemäße Verfahren eine wäßrige Lösung mit einem pH-Werte von etwa 8,5, die 10 mM Tris/HCl, 1 mM MgCl&sub2;, 0,9%iges NaCl (oder 150 mM), 50 mg/l (0,005%iges) Tween 80 und 1 M Saccharose umfaßt.
Die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren konservierten infektiösen rekombinanten Viren können zudem einer Lyophilisierung unterzogen werden.
Die Erfindung hat auch eine wäßrige Suspension infektiöser rekombinanter Viren in einer wäßrigen Lösung aus Saccharose in hoher Konzentration, wie zuvor beschrieben, zum Gegenstand.
Vorteilhaft umfaßt die erfindungsgemäße wäßrige Suspension 10&sup6; bis 10¹³ pfu/ml infektiöser rekombinanter Viren.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine wäßrige Suspension infektiöser rekombinanter Viren, wie oben beschrieben, oder mittels Durchführung des erfindungsgemäßen Konservierungsverfahrens erhalten, in Verbindung mit einem aus pharmazeutischer Sicht annehmbaren Träger. Sie kann auf systemischem Weg, insbesondere auf subkutanem, intravenösem, intrakardialem, intramuskulärem, intraperitonealem, intragastrischem, intratumoralem, intrapulmonalem, intranasalem oder intratrachealem Weg verabreicht werden. Die Verabreichung kann in einmaliger oder in bestimmten Zeitabständen ein- oder mehrmals wiederholter Dosierung erfolgen. Die Formulierung kann auch andere Verbindungen einschließen, wie etwa ein Adjuvans oder eine aus pharmazeutischer Sicht annehmbare Hilfssubstanz. Eine der Erfindung entsprechende Zusammensetzung ist insbesondere für die vorbeugende oder heilende Behandlung von Krankheiten wie genetischen Krankheiten (Hämophilie, Mukoviszidose, Diabetes, Duchenne- und Becker- Myopathie, ...), Krebskrankheiten, viralen Erkrankungen (Hepatitis, AIDS, ...) und Rückfallerkrankungen (durch das Herpesvirus, das humane Papilloma-Virus, ... ausgelöste Infektionen) bestimmt.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung den therapeutischen oder prophylaktischen Gebrauch einer wäßrigen Suspension infektiöser rekombinanter Viren, wie oben beschrieben oder mittels Durchführung des erfindungsgemäßen Konservierungsverfahrens erhalten, zur Herstellung eines für die Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Gentherapie bestimmten Medikamentes. Die wäßrige Lösung kann unmittelbar in vivo verabreicht werden (zum Beispiel durch intravenöse, intramuskuläre Injektion, Injektion in einen zugänglichen Tumor, per Aerosol in die Lunge, ...). Man kann ebenso die ex vivo-Vorgehensweise anwenden, die darin besteht, dem Patienten Zellen (Knochenmarkstammzellen, Lymphozyten der peripheren Blutbahn, Muskelzellen, ...) zu entnehmen, sie mit der wäßrigen Lösung der Erfindung fachgemäß zu infizieren und sie dem Patienten wieder zu verabreichen.
Fig. 1 veranschaulicht den Einfluß des pH-Wertes der Saccharose-Lösung auf die virale Stabilität.
Fig. 2 veranschaulicht den Einfluß des Zusetzens von Tween 80 und NaCl zur Saccharose- Lösung. Die Einheit der Ordinate ist in pfu/ml angegeben.
Andere Merkmale der Erfindung werden anhand der folgenden Beispiele erläutert.

MATERIAL UND METHODEN

Die folgenden Beispiele beruhen auf der Verwendung eines rekombinanten adenoviralen Vektors, der entweder das für die β-Galactosidase aus E.coli codierende Markergen LacZ oder das therapeutische Gen CF exprimiert, welches für das bei Mukoviszidose-Erkrankten defiziente Protein CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) codiert. Zur Ergänzung: der Vektor wird ausgehend vom Genom des Adenovirus Typ 5 (Ad5) erhalten, dessen E1- und E3-Regionen deletiert sind, und umfaßt, eingefügt anstelle der E1-Region, eine Kassette zur Expression des Marker- oder therapeutischen Gens (Stratford-Perricaudet et al., 1992, J. Clin. Invest. 90, 626-630; Rosenfeld et al., 1992, Cell. 68, 143- 155). Er kann in der Zellinie 293 vermehrt werden (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72), welche die für die virale Replikation essentielle Funktion E1 komplementiert. Zur Information: die Zellinie 293 stammt von der embryonalen menschlichen Niere ab und ergibt sich aus der Insertion des 5'-Endes des Ad5-Genoms in ihre Chromosomen (11%). Die 293-Zellen sind erhältlich bei ATCC (CRL1573) und werden unter den vom Händler oder den in der Literatur empfohlenen Bedingungen kultiviert.
Ein primärer Virusbestand wird auf konventionelle Art in den 293-Zellen angelegt, die mit dem oben beschriebenen adenoviralen Vektor transfiziert wurden. Man überprüft die Produktion infektiöser viraler Partikel, die nach Zelllyse durch aufeinanderfolgende Gefrier-Auftau-Zyklen gesammelt werden, den Titer des viralen Präparates mit der Agar-Methode (Grahain und Prevec, 1991, Methods in Molecular Biology, Bd. 7, S. 109-128; Hsg.: E. J. Murey, The Human Press Inc.) und die Expression des Markergens durch XGal-Färbung (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-galactosid) nach der Methode von Sanes et al. (1986, EMBO J. 5, 3133-3142) oder des Gens CF durch Western Blot mit Hilfe spezifischer Antikörper (Dalemans et al., 1992, Experimental Cell Research 201, 235-240). Das virale Präparat kann vor Gebrauch per Dichtegradient gereinigt und konzentriert werden.

BEISPIEL 1:

Einfluß des pH-Wertes auf die Stabilität des Virus

Eine virale Suspension wird auf folgende Weise hergestellt.
Die 293-Zellen werden in CellCube (Costar) in einem mit 7% fetalem Kälberserum (FCS) angereicherten GMEM-Medium kultiviert. Nach Erreichen der Konfluenz werden sie mit einer Aliquote des primären Bestandes des adenoviralen, das Gen CF exprimierenden Vektors mit einer MOI (Multiplizität der Infektion) von 2 infiziert. Dreißig Stunden nach der Infektion werden die geschwächten Zellen durch mechanisches Schütteln oder mit Hilfe eines chemischen Reagenzes gelöst und durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit (8 Minuten bei 3 500 Upm (Umdrehungen pro Minute)) gesammelt. Sie werden lysiert, und die viralen Partikel werden durch 3 Gefrier-Auftau-Zyklen freigesetzt, und die Zellrückstände werden durch Zentrifugation (8 Minuten bei 3 500 Upm) abgetrennt. Das Virus wird ausgehend vom Überstand durch zwei Cäsiumchlorid (CsCl)-Ultrazentrifugationen gereinigt, die erste auf CsCl-Kissen der Dichte d = 1,25 beziehungsweise d = 1,40 (2 Stunden bei 141 000 g) und die zweite auf einem sich aus einer CsCl-Lösung der Dichte d = 1,34 einstellenden Gradienten (18 Stunden bei 231 000 g).
Die Virusbande wird zurückgewonnen, ihr Titer wird bestimmt (2 · 10¹¹ pfu) und das Präparat wird in vier Aliquoten aufgeteilt, die einer Dialyse bei 4ºC gegen 4 mal 250 ml 10 mM Tris-Puffer, 1 mM MgCl&sub2;, 10% Glycerin, mit steigendem pH-Wert: pH 7,4, pH 8, pH 8,5 beziehungsweise pH 9, unterzogen werden. Die virale Stabilität in den unterschiedlich formulierten Pufferlösungen wird gegenüberstellend untersucht (beschleunigte Stabilitätsuntersuchung). Dazu wird jede Aliquote in 1 ml-Kryoröhrchen konditioniert, die jeweils 100 ul Suspension enthalten. Die Proben werden bei 37ºC inkubiert und zum Zeitpunkt to und nach 4, 24 und 72 Std. Inkubation entnommen. Sie werden bis zur Titrierung bei -20ºC aufbewahrt. Der Virustiter wird nach der Agar-Methode durch Neuinfektion von 293-Zellen mit unterschiedlichen Verdünnungen der zu testenden Probe bestimmt. Die Ergebnisse sind in pfu (plaque forming units)/ml angegeben.
Die in der Fig. 1 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß die Formulierung mit basischem pH-Wert die Infektionsfähigkeit der Adenoviren erhält. Der Titer der in den Puffern mit pH 8,5 und 9 formulierten Präparate ist nämlich bei 37ºC während 24 Stunden stabil und fällt dann mit der Zeit schrittweise ab. Dagegen verlieren die Viren, die in einen Puffer mit pH 7,4 und 8 gegeben wurden, ihre Infektionsfähigkeit von Beginn der Inkubation bei 37ºC an. Nach 24 Stunden sind die Titer bereits sehr niedrig (103 bis 104 pfu/ml im Vergleich zu anfänglich in der Größenordnung von 1010) und nach 72 Stunden sind die Viren praktisch nicht mehr infektiös.

Beispiel 2:

Einfluß der Saccharosekonzentration auf die Stabilität des Virus

Eine virale Suspension wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit den wenigen nachfolgenden Änderungen hergestellt:
- die Zellen werden mit dem adenoviralen, das LacZ-Gen exprimierenden Vektor infiziert;
- die infizierten Zellen werden auf mechanische Weise (Silverson Homogenisator; Referenz L4R) lysiert;
- die CsCl-Gradienten-Ultrazentrifugationen werden mit Hilfe von Festwinkel-Rotoren (2 Std. bei 235 000 g für die erste und 18 Std, bei 435 000 g für die zweite) durchgeführt;
- die Dialyse wird durch einen Gelfiltrations-Chromatographieschritt mit Hilfe einer Trisacryl GF05 LS- Matrix (Biosepra, Referenz 259161) ersetzt, welcher ein Entsalzen der Lösung durch Eliminierung des CsCl ermöglicht;
- die Viren werden in einer 10 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl&sub2; und 1 M Saccharose-Lösung mit pH 8,5 aufgenommen, bevor sie durch 1 : 20-Verdünnung in den nachfolgenden Pufferlösungen in 5 Aliquoten unterteilt und zuvor über eine Membran der Porengröße 0,22 um gefiltert werden
Aliquote 1) 10 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl&sub2;, 1 M Saccharose, pH 8,5
Aliquote 2) 10 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl&sub2;, 0,75 M Saccharose, pH 8,5
Aliquote 3) 10 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl&sub2;, 0,5 M Saccharose, pH 8,5
Aliquote 4) 10 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl&sub2;, 0,25 M Saccharose, pH 8,5
Aliquote 5) 10 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl&sub2;, 0 M Saccharose, pH 8,5
Jede Aliquote weist zu Beginn einen Titer von ungefähr 10¹&sup0; pfu/ml auf. Die Stabilität der Viren wird unter beschleunigten Bedingungen (37ºC) bei regelmäßig entnommenen Aliquoten bestimmt.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 dargestellt: Tabelle 1 Einfluß der Saccharosekonzentration auf die Stabilität des Virus bei 37ºC
1 10 mM Tris, 1 mM MgCl&sub2;, 1 M Saccharose, pH 8,5
2 10 mM Tris, 1 mM MgCl&sub2;, 0,75 M Saccharose, pH 8,5
3 10 mM Tris, 1 mM MgCl&sub2;, 0,5 M Saccharose, pH 8,5
4 10 mM Tris, 1 mM MgCl&sub2;, 0,25 M Saccharose, pH 8,5
5 10 mM Tris, 1 mM MgCl&sub2;, 0 M Saccharose, pH 8,5
Aus dieser Untersuchung geht hervor, daß die Virusaktivität umso mehr bewahrt wird, je höher die Konzentration an Saccharose ist (Aliquote 1 stabiler als Aliquote 2, die wiederum stabiler als Aliquote 3, usw.). In Abwesenheit von Saccharose (Aliquote 5) fällt die Infektionsfähigkeit sehr schnell ab (Verringerung um den Faktor 5000 bereits nach 8 Stunden Inkubation). In Gegenwart von 0,25 M (Aliquote 4) nimmt der Titer schnell, aber in geringerem Maß ab (Verringerung um den Faktor 10 nach 8 Stunden bei 37ºC). Erhöht man die Saccharosekonzentrationen noch weiter (Aliquoten 1, 2 und 3), so bleibt der Titer über 8 Stunden erhalten und nimmt dann schrittweise im Verlauf der Inkubation ab. Die Abnahme ist jedoch geringfügig, wenn die Saccharosekonzentration 1 M erreicht (Aliquote 1).

Beispiel 3:

Untersuchung der Langzeitstabilität in dem Formulierungspuffer 10 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl&sub2; 1 M Saccharose, pH 8,5

Die Untersuchung wird ausgehend von der in Beispiel 2 erhaltenen viralen Suspension durchgeführt, von der man unter Langzeitbedingungen die Stabilität bei +4ºC und -20ºC bestimmt. Der virale Titer wird im Lauf der Zeit durch Agar-Titrierung verfolgt, und die in der nachfolgenden Tabelle 2 dargestellten Ergebnisse zeigen eine Stabilität der in Gegenwart von 1 M Saccharose und bei pH 8,5 vorliegenden viralen Präparate über mindestens 6 Monate. Tabelle 2 Untersuchung der Stabilität bei 4ºC und -20ºC eines in 1 M Saccharose formulierten viralen Präparates
Der Puffer, dessen Formulierung 1 M Saccharose umfaßte, wurde auch mit dem gewöhnlichen Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl&sub2;, 10% Glycerin, pH 7,4) verglichen. Diese Untersuchung wurde bei +4ºC anhand einer viralen Suspension durchgeführt, die in beiden Puffertypen bis zu einem Endtiter von ungefähr 10¹&sup0; pfu/ml verdünnt wurde. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3 Untersuchung der Stabilität bei 4ºC eines in 1 M Saccharose oder in 10% Glycerin formulierten viralen Präparates
1 10 mM Tris, 1 mM MgCl&sub2;, 1 M Saccharose, pH 8,5
2 10 mM Tris, 1 mM Mg Cl&sub2;, 10% Glycerin, pH 7,4
Der virale Titer ist bei +4ºC über mehr als 6 Monate stabil, wenn der Formulierungspuffer 1 M Saccharose umfaßt und bei leicht basischem pH vorliegt, während er vom ersten Monat an abnimmt, wenn die Viren in einen neutralen pH in Gegenwart von 10% Glycerin gegeben werden.

Beispiel 4:

Optimierung des Formulierungspuffers

Die in Beispiel 2 erhaltene virale Suspension wird in zwei Aliquoten aufgeteilt, die unangereichert oder in Gegenwart von 50 mg/l (0,005%iges) Tween 80 und 150 mM NaCl 1 : 20 in der in der Aliquote 1) verwendeten Pufferlösung verdünnt werden. Die Stabilität wird bei 37ºC und bei 4ºC untersucht.
Die Ergebnisse der beschleunigten Stabilitätsuntersuchung (Fig. 2) zeigen, daß der Zusatz von Konservierungsmitteln wie Tween 80 und des Salzes die Stabilität der in dem 10 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl&sub2;, 1 M Saccharose, pH 8,5 -Puffer formulierten Viren noch verbessert. In ihrer Gegenwart bleibt die Infektionsfähigkeit bei 37ºC 24 Stunden erhalten, im Vergleich zu 8 Stunden in ihrer Abwesenheit. Im übrigen schadet das Vorliegen beider Konservierungsmittel der Stabilität des viralen Präparates bei 4ºC nicht, da der Titer sich über mehr als 6 Monate als stabil erweist.

Beispiel 5

Stabilität in dem Formulierungspuffer 10 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl&sub2;, 0,9% NaCl, 50 mg/l Tween 80 und 1 M Saccharose, pH 8,5.

Eine wie in Beispiel 2 beschriebene, in 10 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl&sub2; und 1 M Saccharose formulierte virale Suspension wird 1 : 20 in dem folgenden Formulierungspuffer verdünnt:
Tris-HCl 10 mM
MgCl&sub2; 1 mM
NaCl 0,9%ig (150 mM)
Tween 80 50 mg/l
Saccharose 1 M
pH 8,5
Die Probe wird in 1 ml-Kryoröhrchen konditioniert, von denen jedes 100 ul virale Suspension enthält. Die Kryoröhrchen werden bei 4ºC konserviert, und die viralen Titer werden zur Zeit t&sub0; und in regelmässigen Abständen über ein Jahr hinweg bestimmt. Die Proben werden bis zur Titrierung bei -20ºC konserviert. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 4 dargestellt und zeigen eine Stabilität der Viren über mindestens 1 Jahr.

Tabelle 4

Konservierungszeit bei 4ºC Titer in pfu/ml
t&sub0; 5,5 · 10&sup9;
2 Wochen 5,6 · 10&sup9;
1 Monat 23 · 10&sup9;
2 Monate 4 · 10&sup9;
3 Monate 5,6 · 10&sup9;
6 Monate 4,5 · 10&sup9;
1 Jahr 2,5 · 10&sup9;

Claims

1. Verfahren zur Konservierung von infektiösen rekombinanten Viren in gefrorener oder flüssiger Form, in dem die Viren in einer wäßrigen Lösung konserviert werden, welche Saccharose bei einer Konzentration über 0,75 M, vorzugsweise von 0,75 M bis 1,5 M, bevorzugter bei einer Konzentration gleich 1 M umfasst, wobei der pH der wäßrigen Lösung 8 bis 9 beträgt und vorzugsweise gleich 8,5 ist.

2. Verfahren zur Konservierung von infektiösen rekombinanten Viren nach Anspruch 1, in dem die Viren Adenoviren oder Retroviren sind.

3. Verfahren zur Konservierung von infektiösen rekombinanten Viren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, in dem die wäßrige Lösung eine Pufferlösung ist.

4. Verfahren zur Konservierung von infektiösen rekombinanten Viren nach Anspruch 3, in dem die Pufferlösung ausgewählt ist aus dem Puffer Tris-HOI, Triethanolamin-, Diethanolamin-, Borat/- HCl-, Glycin/NaOH-, EPPS- [N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-(3-propansulfonsäure)], Bicin-, TAPS- [N- Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropansulfonsäure] und Tricin-Lösungen, wobei der Puffer Tris-HCl bevorzugt ist.

5. Verfahren zur Konservierung von infektiösen rekombinanten Viren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, in dem die wäßrige Lösung darüber hinaus mindestens ein Salz eines zweiwertigen Kations umfaßt, das ausgewählt ist aus MgCl&sub2;, CaCl&sub2; und MnCl&sub2;, wobei MgCl&sub2; bevorzugt ist.

6. Verfahren zur Konservierung von infektiösen rekombinanten Viren nach Anspruch 5, in dem das Salz des zweiwertigen Kations in der wäßrigen Lösung bei einer Konzentration von 0,1 bis 5 mM, vorzugsweise von 0,5 bis 2 mM und noch bevorzugter in der Größenordnung von 1 mM vorliegt.

7. Verfahren zur Konservierung von infektiösen rekombinanten Viren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, in dem die wäßrige Lösung einen Puffer 10 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl&sub2;, 1 M Saccharose, pH 8,5 umfaßt.

8. Verfahren zur Konservierung von infektiösen rekombinanten Viren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, in dem die wäßrige Lösung mindestens eine stabilisierende Verbindung umfaßt, die ausgewählt ist aus Salzen, vorzugsweise einwertigen, Aminosäuren und Tensiden.

9. Verfahren zur Konservierung von infektiösen rekombinanten Viren nach Anspruch 8, in dem das einwertige Salz ausgewählt ist aus NaCl und KCl, wobei NaCl bevorzugt ist.

10. Verfahren zur Konservierung von infektiösen rekombinanten Viren nach Anspruch 9, in dem das einwertige Salz in der wäßrigen Lösung bei einer Konzentration von 0,05 bis 1 M, vorzugsweise 0,1 bis 0,5 M, bevorzugter noch 0,1 bis 0,3 M vorliegt.

11. Verfahren zur Konservierung von infektiösen rekombinanten Viren nach Anspruch 8, in dem das Tensid Tween 80 oder Triton X-100 ist.

12. Verfahren zur Konservierung von infektiösen rekombinanten Viren nach Anspruch 11, in dem das Tween 80 in der wäßrigen Lösung bei einer Konzentration von 0,001 bis 0,5 Gew.-%, vorzugsweise 0,002 bis 0,2 Gew.-% und noch bevorzugter in der Größenordnung von 0,005 Gew.-%, bezogen auf die Gesamt-Lösung, vorliegt.

13. Verfahren zur Konservierung von infektiösen rekombinanten Viren nach Anspruch 12, in dem die wäßrige Lösung einen Puffer 10 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl&sub2;, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 80 und 1 M Saccharose, pH etwa 8,5, umfaßt.

14. Verfahren zur Konservierung von infektiösen rekombinanten Viren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, in dem die Temperatur der Konservierung unter oder gleich +4ºC ist.

15. Verfahren zur Konservierung von infektiösen rekombinanten Viren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, in dem die Viren in Lösung anschließend einer Lyophilisierung unterzogen werden.

16. Wäßrige Suspension von infektiösen rekombinanten Viren, die eine wäßrige Lösung von Saccharose bei einer Konzentration über 0,75 M, vorzugsweise von 0,75 M bis 1,5 M, bevorzugter noch gleich 1 M umfaßt, wobei die wäßrige Lösung einen pH von 8 bis 9 aufweist, vorzugsweise einen pH gleich 8,5.

17. Wäßrige Lösung von infektiösen rekombinanten Viren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Viren Adenoviren oder Retroviren sind.

18. Wäßrige Suspension von infektiösen rekombinanten Viren nach einem der Ansprüche 16 bis 17, in der die wäßrige Lösung eine Pufferlösung ist.

19. Wäßrige Suspension von infektiösen rekombinanten Viren nach Anspruch 18, in der die Pufferlösung ausgewählt ist aus dem Puffer Tris-HCl, Triethanolamin-, Diethanolamin-, Borat/HCl- Glycin/NaOH-, EPPS- [N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-(3-propansulfonsäure)], Bicin-, TAPS- [N-Tris- (hydroxymethyl)methyl-3-aminopropansulfonsäure] und Tricin-Lösungen, wobei der Puffer Tris-HCl bevorzugt ist.

20. Wäßrige Suspension von infektiösen rekombinanten Viren nach einem der Ansprüche 16 bis 19, in der die wäßrige Lösung darüber hinaus mindestens ein Salz eines zweiwertigen Kations umfaßt, das ausgewählt ist aus MgCl&sub2;, CaCl&sub2; und MnCl&sub2;, wobei MgCl&sub2; bevorzugt ist.

21. Wäßrige Suspension von infektiösen rekombinanten Viren nach Anspruch 20, in der das Salz des zweiwertigen Kations in der wäßrigen Lösung bei einer Konzentration von 0,1 bis 5 mM, bevorzugt 0,5 bis 2 mM und noch bevorzugter in der Größenordnung von 1 mM vorliegt.

22. Wäßrige Suspension von infektiösen rekombinanten Viren nach einem der Ansprüche 16 bis 21, in der die wäßrige Lösung einen Puffer 10 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl&sub2;, 1 M Saccharose, pH 8,5, umfaßt.

23. Wäßrige Suspension von infektiösen rekombinanten Viren nach einem der Ansprüche 16 bis 21, in der die wäßrige Lösung mindestens eine stabilisierende Verbindung umfaßt, die ausgewählt ist aus Salzen, vorzugsweise einwertigen, Aminosäuren und Tensiden.

24. Wäßrige Suspension von infektiösen rekombinanten Viren nach Anspruch 23, in der das einwertige Salz ausgewählt ist aus NaCl und KCl, wobei NaCl bevorzugt ist.

25. Wäßrige Suspension von infektiösen rekombinanten Viren nach Anspruch 24, in der das einwertige Salz in der wäßrigen Lösung bei einer Konzentration von 0,05 bis 1 M, vorzugsweise 0,1 bis 0,5 M, noch bevorzugter von 0,1 bis 0,3 M vorliegt.

26. Wäßrige Suspension von infektiösen rekombinanten Viren nach Anspruch 23, in der das Tensid Tween 80 oder Triton X-100 ist.

27. Wäßrige Suspension von infektiösen rekombinanten Viren nach Anspruch 24, in der das Tween 80 in der wäßrigen Lösung bei einer Konzentration von 0,001 bis 0,5 Gew.-%, vorzugsweise 0,002 bis 0,2 Gew.-% und noch bevorzugter in der Größenordnung von 0,005 Gew.-%, bezogen auf die Gesamt-Lösung, vorliegt.

28. Wäßrige Suspension von infektiösen rekombinanten Viren nach einem der Ansprüche 16 bis 27, die 10&sup6; bis 10¹³ pfu/ml an infektiösen rekombinanten Viren umfaßt.

29. Wäßrige Lösung nach Anspruch 27, die einen Puffer 10 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl&sub2;, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 80 und 1 M Saccharose, pH etwa 8,5, umfaßt.

30. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine wäßrige Suspension von infektiösen rekombinanten Viren nach einem der Ansprüche 16 bis 28 oder erhalten durch die Durchführung eines Verfahrens zur Konservierung von infektiösen rekombinanten Viren nach den Ansprüchen 1 bis 15 in Verbindung mit einem Träger, der unter pharmazeutischem Gesichtspunkt annehmbar ist.

31. Verwendung einer wäßrigen Suspension von infektiösen rekombinanten Viren nach einem der Ansprüche 16 bis 28 oder erhalten durch die Durchführung eines Verfahrens zur Konservierung von infektiösen rekombinanten Viren nach den Ansprüchen 1 bis 15 für die Herstellung eines Medikaments, das zur Behandlung oder Prophylaxe von genetischen Krankheiten, Krebsen, viralen Erkrankungen und Rückfallerkrankungen bestimmt ist.

32. Verwendung nach Anspruch 31 für die Herstellung eines Medikaments, das zur Behandlung oder Prophylaxe von Hämophilie, Mukoviszidose, Diabetes, Duchenne- und Becker- Myopathie bestimmt ist.

33. Verwendung nach Anspruch 31 für die Herstellung eines Medikaments, das zur Behandlung oder Prophylaxe von Hepatitiden oder AIDS bestimmt ist.

34. Verwendung nach Anspruch 31 für die Herstellung eines Medikaments, das zur Behandlung oder Prophylaxe von Infektionen bestimmt ist, die durch das Herpes-Virus oder das menschliche Papilloma-Virus hervorgerufen werden.