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Vitiligo
oder ,Swetakustha',
wie in alten medizinischen Texten beschrieben, ist ein die Haut
entstellendes Phänomen,
das etwa 1 % der Weltbevölkerung
gegenüber
3 % Indern betrifft. Obwohl der Natur nach nicht schmerzhaft oder
letal, sind die Patienten aufgrund des sozialen Stigmas mit psychischen
Qualen und Depression belastet und eine völlig zufriedenstellende Therapie
wird deshalb für
diese Krankheit benötigt.
Leider sprach Vitiligo in vielen Fällen nicht auf die Therapien
an, die gegenwärtig
in Gebrauch sind, und die Entwicklung einer Therapie, die die gewünschten
Parameter erfüllt,
bleibt eine Herausforderung an die moderne Medizin.
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Neben
den Therapien, meistens krankheitsbezogen, soll ein Extrakt aus
menschlicher Plazenta ohne exaktere Begründung durch wissenschaftliche
Untersuchung – nämlich eine
Angabe der Wirkstoffe – wirksam gegen
Vitiligo sein. Das Verfahren zur Herstellung des Extrakts wird geheim
gehalten.
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Das
bisher bekannte Verfahren zur Herstellung eines hydroalkoholischen
Extrakts aus frischer menschlicher Plazenta, bestimmt zur Vitiligobehandlung,
ist in
US 4,507,277 beschrieben.
Das offenbarte Verfahren besteht aus Zerreiben der menschlichen
Plazentalappen nach einigen Tagen Tiefkühlen in einem Kühlschrank
bei etwa 2 bis 8°C
und Mazerieren mit absolutem oder wässrigem Ethanol von etwa 60
bis 100 Gew.-%, z. B. 95 Gew.-%, und Aufrechterhalten der Extraktion
von Lipoproteinen, als verantwortlich für die Farbentwicklung bei Brustwarzen
von Meerschweinchen nach 20 bis 50 Tagen Anwendung angegeben. Der
Wirkstoff wurde aus dem Überstand
durch Zusatz von etwa 5 bis etwa 20 Volumina einer gesättigten
ethanolischen Lösung
von Benzeosäure
ausgefällt.
Dann wurde der Niederschlag mit einer wässrigen Lösung von Benzoesäure gewaschen,
gefolgt von wässrigem
oder wasserfreiem Aceton. Zentrifugieren wurde anschließend während etwa
10 bis 30 Minuten mit etwa 1000 bis 3000 min
–1 durchgeführt. Der
Rückstand
wurde dann mit Aceton gewaschen und im Vakuum bei Umgebungstemperatur
getrocknet. Der getrocknete Rückstand
wurde anschließend
in Ethyl wieder gelöst
und über
eine Sephadex
TM-Säule filtriert. Die Rate betrug
10 bis 30 Tropfen pro Minute und die bei 5 bis 10 ml C/u eluierenden
Fraktionen wurden in zwei Peaks aufgetrennt und es wurde angegeben,
dass der zweite Peak Wirkstoff(e) enthielt. Der alkoholische Extrakt
wurde jedoch auch als nützliches
Mittel zur Behandlung von Patienten mit Vitiligo erwähnt.
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In
Bezug auf die Wirksamkeit des erhältlichen Plazentaextrakts,
der zur Behandlung von Vitiligo verwendet wird, wurde aus verschiedenen
wissenschaftlichen Kreisen (Nordlund et al., Dermatologica 1990,
181: 1-4; Goldstein et al., Int. J. Dermatol. 1992, 31: 314-319)
viel Kritik hauptsächlich
mangels wissenschaftlichen Beweises hinsichtlich der darin vorliegenden
Wirkstoffe erhoben. Aber alle Kritiker betonten, anstatt ihn als Therapie
zu verwerfen, den Bedarf an einer gründlichen und gezielten wissenschaftlichen
Untersuchung zur Suche nach den Wirkstoffen der Extrakte. Einige
neue Berichte (Kojina et al., J. Biol. Chem. 1991, 266: 17552-17558;
Imokawa et al., J. Biol. Chem. 1992, 267: 24675-24680) legen diesbezüglich nahe,
dass Glycosphingolipide und ein 21-Aminosäuren-Vasokonstriktorpeptid
und Endothelin die wirksamen Modulatoren von Melanozytenmigration
sowie – motilität und -wachstumsförderung
sind. Diese sind die Schlüsselvorgänge bei
der Wiederherstellung der Hautpigmentierung.
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Entsprechend
stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines
Extrakts aus menschlicher Plazenta, der Glycosphingolipide und endothelinartige
Peptide enthält,
zur Behandlung von Vitiligo zur Verfügung, das umfasst:
- (a) Zerkleinern der ganzen Plazenta in kleine Stücke;
- (b) Zerreiben des zerkleinerten Materials auf bekannte Weise
mit Hilfe eines wässrigen
alkoholischen Lösungsmittels;
- (c) Extrahieren des gesamten zerriebenen Materials durch stufenweise
Erwärmung,
zunächst
für 20
bis 40 Minuten auf 40°C
bis 50°C
und dann für
5 bis 15 Minuten auf 60°C
bis 70°C,
unter Vermeidung direkter Wärmeeinwirkung;
- (d) Altern des zerriebenen und erwärmten Materials im Dunkeln
bei Raumtemperatur und Minimierung der Luftexposition;
- (e) Filtern zur Beseitigung vergleichsweise größerer Rückstände/Gewebereste;
- (f) Einstellen der Konzentration des vorhandenen Alkohols auf
eine Stärke
von nicht weniger als 40 Gew.-% und nicht mehr als 60 Gew.-% mit
Hilfe von destilliertem Wasser;
- (g) weiteres Altern des Überstands
durch Lagerung des Materials für
3 bis 4 Tage im Dunkeln bei Raumtemperatur, unter Minimierung der
Luftexposition;
- (h) Filtern durch ein feineres Filterhilfsmittel, wie Whatman-Filterpapier
Nr. 1, gepackt mit Schnipseln davon;
- (i) Lagern des so gewonnenen Überstands für das Altern, damit sich die
feineren Teilchen absetzen können;
- (j) Zentrifugieren des so erhaltenen Materials für 20 bis
40 Minuten mit 10.000 bis 14.000 min–1 bei
4°C bis 10°C, bis ein
klarer, strohfarbener Extrakt entsteht.
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Das
Zerreiben in Schritt (b) kann unter Verwendung von absolutem Ethanol,
rektifiziertem Alkohol, Alkanolen mit nicht mehr als zwei Kohlenstoffatomen
und dergleichen in einem von 85-100 Gew.-% reichenden Gehalt durchgeführt werden.
Das Zerkleinern und Zerreiben können
bei einer Temperatur im Bereich von 20-35°C erfolgen. Das Altern von Schritt
(d) wird bevorzugt während
eines Zeitraums von 36-60 Stunden durchgeführt. Das Filtrieren des gealterten
Materials kann unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten
Grobfiltersystemen vorgenommen werden. Diese Schritte können bei
einer Temperatur im Bereich von 20°C bis 35°C ausgeführt werden. Alle Schritte in
dem Verfahren werden unter normalem Atmosphärendruck durchgeführt.
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In
dem erfindungsgemäßen Verfahren
wird die ganze Plazenta verwendet, weil berichtet wurde, dass Endothelin,
ein kleines Vasokonstriktorpeptid, bekannt als wesentlicher mitogener
Faktor für
Melanozytenwachstum und -überleben,
in den Mikrozotten überall
in der Plazentamasse vorkommt. Lipide sind ebenfalls zwischen allen
Gewebekörpern
verteilt. Das Verfahren verwendet Wärmeextraktion, um selbst kleine
Moleküle,
die als nützlich
für Wachstum
und Migration von pigmentbildenden Zellen bekannt sind, Melanozyten,
zu extrahieren. Das Verfahren vermeidet die Verwendung von Fremdstoffen,
wie Benzoesäure
und Aceton. Das Verfahren achtet bei allen Schritten darauf, die
Anwendung übermäßiger Luftexposition
des Extrakts zu vermeiden, so dass verletzbare Lipidmoleküle/konjugierte
Lipidmoleküle
am wenigsten beeinträchtigt
werden.
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Deshalb
ist die Herstellung derartiger Extrakte aus frischer, menschlicher,
ausgereifter Plazenta eine Grundvoraussetzung, um nach dem/den Wirkstoff(en),
wenn überhaupt
vorhanden, zu suchen. Die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung
ist, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung eines Extrakts aus
menschlicher Plazenta, zur Verfügung
zu stellen, bei dem bei chemischer Analyse festgestellt wird, dass
er wichtige Bestandteile enthält,
welche die Wirkstoffe zur Behandlung von Vitiligo sind. Man nimmt
an, dass diese Wirkstoffe Glycosphingolipide und endothelinartige
Vasokonstriktorpeptide sind.
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Die
Wärmeextraktion
kann in einem Dreihalskolben unter Verwendung eines mechanischen
Rührers, einer
Wärmekontrolleinheit
(z. B. Thermometer) und eines Wasserkühlers durchgeführt werden.
Der hierbei verwendete Kolben kann entweder einer mit Wassermantel
sein oder er kann in einem Wasserbad mit einer auf dem Fachgebiet
bekannten Temperaturregeleinrichtung untergebracht werden. Durch
Verwendung eines Kühlsystems,
wie eines Wasserkühlers,
wird die Lösungsmittelverdunstung
verhindert, um die Extraktion zu maximieren. Der Extrakt sollte
während
Alterung und Lagerung bevorzugt bei Raumtemperatur und im Dunkeln
gehalten werden.
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Die
Erfindung wird in den folgenden Beispielen, die zum Erläutern der
Erfindung bereitgestellt werden, detailliert beschrieben.
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Beispiel 1
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AIDS-negative,
frische, menschliche, ausgereifte Plazenten wurden von der Entbindungsstation
des Medical College Hospital gesammelt. Im Durchschnitt betrug die
Masse einer Plazenta 300-350 g (nach Herausdrücken des überschüssigen Blutes). Zuerst wurde
sie in große
Stücke
zerkleinert und anschließend
wurde das immer noch zurückgehaltene
Blut abgezogen. Danach wurde das Material für 15 Minuten bei Raumtemperatur
in einem Waring Blender gründlich
zerrieben, wobei 90%iges Ethanol (1,2 l) zu jeder Plazenta gegeben wurde.
Danach wurde das gesamte Material, das aus dem Zerreiben von zwei
Plazenten in einer typischen Menge erhalten wurde, in einen 3-I-Dreihalsrundkolben,
ausgestattet mit einem Wasserkühler,
der ein Schutzrohr mit Calciumchlorid (geschmolzen) am offenen Ende
besaß,
einem Thermometer und einem mechanischen Rührer, überführt. Der Kolben wurde in einem
Wasserbad zur Hälfte
eingetaucht und erwärmt,
bis die mit dem Thermometer im Kolben registrierte Temperatur nahe
50°C ± 1°C lag. Diese
wurde über
30 Minuten gehalten, gefolgt von einem kurzen Erwärmen für weitere
5 Minuten auf 60-65°C. Der gesamte
Inhalt des Kolbens wurde dann für
48 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln gelagert, um den Alterungseffekt
zu verursachen, während
die Hälse
des Kolbens fest zugepfropft waren. Das reduzierte die Luftexposition
des Materials auf ein Mindestmaß.
Die Grobgewebemasse wurde anschließend durch ein Grobfilterhilfsmittel
(Käseleinen
oder dergleichen) filtriert und das so aufgefangene Filtrat wurde
in einem 4-I-Erlenmeyerkolben konserviert. Die Alkoholkonzentration
des Extrakts (wahrscheinlich nahe 85-90 % v/v) wurde dann durch Zusatz von Wasser
(berechnet nach der Messung des Extrakts) auf 60 % (v/v) eingestellt.
Das Volumen des aus zwei Plazenten erhaltenen Extrakts betrug fast
3,5 l. Der Kolben wurde anschließend dicht verschlossen, um
die Luftexposition auf ein Mindestmaß zu verringern, und weitere
48-60 Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur gelagert, um das Material
weiter zu altern. Die feineren Teilchen, wie nach solch einem Altern
aufgetreten, setzten sich auf dem Boden des Behälters ab und wurden durch ein
Whatman-Filterpapier Nr. 1, gepackt mit Schnipseln davon, auf einem
Büchner-Trichter herausfiltriert.
Das so erhaltene Filtrat wurde in einem anderen 4-I- Erlenmeyerkolben
aufgefangen und zum dritten Mal für 24 Stunden unter den Bedingungen
wie vorstehend beschrieben gealtert. Zum Schluss wurde das Material
während
30 Minuten mit 10.000 min
–1 unter Verwendung einer
(Beckmann-Zentrifuge) Sorvall-Zentrifuge zentrifugiert. Der so als Überstand
erhaltene klare, strohfarbene Extrakt wurde abgetrennt und als Endprodukt
gesammelt und zum Abfüllen
in Flaschen verwendet. Das Endvolumen des Extrakts betrug etwa 3,48
l. Zur besseren Lagerung des Produkts wurde eine bernsteinfarbene
Flasche zum Abfüllen
verwendet und das abgefüllte
Material wurde an einem kühlen
dunklen Ort bei Raumtemperatur gelagert. Verwendete
Materialien und Bedingungen
| Jeweils
verarbeitete Plazentaanzahl: | 2 |
| Durchschnittliche
Masse einer Plazenta: | 325
g |
| Alkoholkonz.
während
des Zerreibens: | 90
% (v/v) |
| Pro
Plazenta verwendetes Alkoholvolumen: | 1,2
l |
| Extraktionstemperatur
und -zeit: | zuerst
30 Minuten bei 50°C ± 1°C und anschließend 5 Minuten
bei 60°C ± 1°C |
| Dauer
und gehaltener Zustand während
erster Alterung: | 48
Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur mit festem Zupfropfen |
| Filterhilfsmittel
zum Entfernen der Grobgewebemasse: | Grobfilterhilfsmittel
(Käseleinen
oder dergleichen) |
| Endkonzentration
an Alkohol nach Einstellung mit Wasser: | ungefähr 60 %
(v/v) |
| Dauer
und gehaltener Zustand während
zweiter Alterung: | 48-60
Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur mit festem Zupfropfen |
| Filterhilfsmittel
zum Entfernen feinerer Teilchen: | Whatman-Filterpapier
Nr. 1, gepackt mit Schnipseln davon |
| Dauer
und gehaltener Zustand während
dritter Alterung (Endalterung): | 24
Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur mit festem Zupfropfen |
| Drehzahl,
Dauer und Temperatur während
des Zentrifugierens: | 10.000
min–1;
30 Minuten; 2-4°C |
| Endvolumen
des erhaltenen Extrakts: | 3,48
l (ungefähr) |
| Lagerung: | in
bernsteinfarbener Flasche und an einem kühlen und dunklen Platz bei
Raumtemperatur |
Analyse
der Bruttozusammensetzung (zur Qualitätskontrolle)
| Bestandteile | Konz.
in dem Alkoholextrakt mg/ml |
| In
Aceton lösliche
Peptide: | 0,002 |
| Mit
Aceton fällbare
Peptide/kleine Proteine: | 0,008 |
| Freie
Sialinsäure: | 0,009
(oder 9 μg/ml) |
| Gebundene
Sialinsäure: | 0,008
(oder 8 μg/ml) |
| Gesamtlipide: | 0,362 |
| Gesamtkohlenhydrate: | 0,141 |
| Gesamtphosphor: | 0,016 |
| Festgestellte
Nebenbestandteile: | Vitamin
B6 und D, Nukleotide, Spuren von Aminosäuren, wie Asparagin, Threonin,
Valin, Tryptophan, Phenylalanin, Progesteron und Östrogene
(in ng bis pg). Glucocorticoide (etwa 100 ng/ml) |
- (Alle Bestimmungen und die Analyse wurden
gemäß den veröffentlichten
Standardverfahren durchgeführt. Beispielsweise
Proteinbestimmung mit der Lowry-Methode, Kohlenhydrate mit der Orcinol-H2SO4-Methode, Sialinsäuren mit
dem TBA-Assay-Verfahren, Phosphor mit dem Ames-Test, Lipide mit
der Phosphovanillin-H2SO4-Methode
usw.)
-
Beispiel 2
-
Die
Details des Verfahrens sind nahezu dieselben wie für Beispiel
1 für die
Herstellung des Plazentaextrakts beschrieben. Unterschiedliche Parameter
wurden nur bei den Materialtypen und Bedingungen des Verfahrens
verwendet. Das schließt
geringe quantitative Unterschiede der Bestandteile des Extrakts
ein. Die Details der Parameter der Verfahrensbedingungen und die
Zusammensetzung des Extrakts werden nachstehend angegeben: Verwendete
Materialien und Bedingungen
| Jeweils
verarbeitete Plazentaanzahl,: | 2 |
| Durchschnittliche
Masse einer Plazenta: | 348
g |
| Alkoholkonz.
während
des Zerreibens: | 95
% (v/v) |
| Pro
Plazenta verwendetes Alkoholvolumen: | 1,25
l |
| Extraktionstemperatur
und -zeit: | zuerst
30 Minuten bei 45°C ± 1°C und anschließend 10
Minuten bei 65°C ± 1°C |
| Dauer
und gehaltener Zustand während
erster Alterung: | 52
Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur (27°C) mit festem Zupfropfen |
| Filterhilfsmittel
zum Entfernen der Grobgewebemasse: | Grobfilterhilfsmittel
(Nylongewebe oder dergleichen) |
| Endkonzentration
an Alkohol nach Einstellung mit Wasser: | ungefähr 58 %
(v/v) |
| Dauer
und gehaltener Zustand während
zweiter Alterung: | 60
Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur (27°C) mit festem Zupfropfen |
| Filterhilfsmittel
zum Entfernen feinerer Teilchen: | Whatman-Filterpapier
Nr. 1, gepackt mit Schnipseln davon |
| Dauer
und gehaltener Zustand während
zweiter Alterung (Endalterung): | 30
Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur mit festem Zupfropfen |
| Drehzahl,
Dauer und Temperatur während
des Zentrifugierens: | 10.000
min–1;
30 Minuten; 2-4°C |
| Endvolumen
des erhaltenen Extrakts: | 4,1
l (ungefähr) |
| Lagerung: | in
bernsteinfarbener Flasche und an einem kühlen und dunklen Platz bei
Raumtemperatur |
Analyse
der Bruttozusammensetzung (zur Qualitätskontrolle)
| Bestandteile | Konz.
in dem Alkoholextrakt (mg/ml) |
| In
Aceton lösliche
Peptide: | 0,0018 |
| Mit
Aceton fällbare
Peptide/kleine Proteine: | 0,009 |
| Freie
Sialinsäure: | 0,011
(oder 11 μg/ml) |
| Gebundene
Sialinsäure: | 0,0005
(oder 0,5 μg/ml) |
| Gesamtlipide: | 0,355 |
| Gesamtkohlenhydrate: | 0,135 |
| Gesamtphosphor: | 0,022 |
| Festgestellte
Nebenbestandteile: | Vitamin
B6 und D, Nukleoside, Spuren von Aminosäuren, wie Asparagin, Threonin,
Valin, Tryptophan, Phenylalanin. Progesterone und Östrogene
(in ng bis pg). Glucocorticoide (etwa 110 ng/ml) |
- (Alle Bestimmungen und die Analyse wurden
gemäß den veröffentlichten
Standardverfahren durchgeführt. Beispielsweise
Proteinbestimmung mit der Lowry-Methode, Kohlenhydrate mit der Orcinol-H2SO4-Methode, Sialinsäuren mit
dem TBA-Assay-Verfahren, Phosphor mit dem Ames-Test, Lipide mit
der Phosphovanillin-H2SO4-Methode
usw.)
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Beispiel 3
-
Die
Details des Verfahrens sind dieselben wie für Beispiel 1 für die Herstellung
des Plazentaextrakts beschrieben. Unterschiedliche Parameter wurden
nur bei den Materialtypen und Bedingungen des Verfahrens verwendet.
Das schließt
geringe quantitative Unterschiede der Bestandteile des Extrakts
ein. Die Details der Parameter und die Zusammensetzung des Extrakts
werden nachstehend angegeben: Verwendete
Materialien und Bedingungen
| Jeweils
verarbeitete Plazentaanzahl,: | 2 |
| Durchschnittliche
Masse einer Plazenta: | 330
g |
| Alkoholkonz.
während
des Zerreibens: | 92
% (v/v) |
| Pro
Plazenta verwendetes Alkoholvolumen: | 1,22
l |
| Extraktionstemperatur
und -zeit: | zuerst
40 Minuten bei 50°C ± 1°C und anschließend 10
Minuten bei 60°C ± 1°C |
| Dauer
und gehaltener Zustand während
erster Alterung: | genau
wie in Beispiel 2 |
| Filterhilfsmittel
zum Entfernen der Grobgewebemasse: | Feinbaumwolleinlage |
| Endkonzentration
an Alkohol nach Einstellung mit Wasser: | ungefähr 60 %
(v/v) |
| Dauer
und gehaltener Zustand während
zweiter Alterung: | genau
wie in Beispiel 2 |
| Filterhilfsmittel
zum Entfernen feinerer Teilchen: | genau
wie in Beispiel 2 |
| Dauer
und gehaltener Zustand während
dritter Alterung (Endalterung): | genau
wie in Beispiel 2 |
| Drehzahl,
Dauer und Temperatur während
des Zentrifugierens: | genau
wie in Beispiel 2 |
| Endvolumen
des erhaltenen Extrakts: Lagerung: | genau
wie in Beispiel 2 |
Analyse
der Bruttozusammensetzung (zur Qualitätskontrolle)
| Bestandteile | Konz.
in dem Alkoholextrakt m/ml |
| In
Aceton lösliche
Peptide: | 0,0015 |
| Mit
Aceton fällbare
Peptide/kleine Proteine: | 0,0025 |
| Freie
Sialinsäure: | 0,004
(oder 4 μg/ml) |
| Gebundene
Sialinsäure: | 0,004
(oder 4 μg/ml) |
| Gesamtlipide: | 0,350 |
| Gesamtkohlenhydrate: | 0,138 |
| Gesamtphosphor: | 0,014 |
| Festgestellte
Nebenbestandteile: | Vitamin
B6 und D, Nukleoside, Spuren von Aminosäuren, wie Asparagin, Threonin,
Valin, Tryptophan, Phenylalanin, Progesterone und Östrogene
(in ng bis pg). Glucocorticoide (etwa 100 ng/ml) |
-
- (Alle Bestimmungen und die Analyse wurden gemäß den veröffentlichten
Standardverfahren durchgeführt. Beispielsweise
Proteinbestimmung mit der Lowry-Methode, Kohlenhydrate mit der Orcinol-H2SO4-Methode, Sialinsäuren mit
dem TBA-Assay-Verfahren, Phosphor mit dem Ames-Test, Lipide mit
der Phosphovanillin-H2SO4-Methode
usw.)
-
Beispiel 4
-
Die
Details des Verfahrens sind dieselben wie unter Beispiel 1 für die Herstellung
des Plazentaextrakts beschrieben. Unterschiedliche Parameter wurden
nur bei den Materialtypen und Bedingungen des Verfahrens verwendet.
Das schließt
geringe quantitative Unterschiede der Bestandteile des Extrakts
ein. Die Details der Parameter und die Zusammensetzung des Extrakts
werden nachstehend angegeben: Verwendete
Materialien und Bedingungen
| Jeweils
verarbeitete Plazentaanzahl,: | 2 |
| Durchschnittliche
Masse einer Plazenta: | 340
g |
| Alkoholkonz.
während
des Zerreibens: | 87
% (v/v) |
| Pro
Plazenta verwendetes Alkoholvolumen: | 1,24
l |
| Extraktionstemperatur
und -zeit: | zuerst
40 Minuten bei 45°C ± 1°C und anschließend 5 Minuten
bei 63°C ± 1°C |
| Dauer
und gehaltener Zustand während
erster Alterung: | genau
wie in Beispiel 2 |
| Filterhilfsmittel
zum Entfernen der Grobgewebemasse: | genau
wie in Beispiel 2 |
| Endkonzentration
an Alkohol nach Einstellung mit Wasser: | ungefähr 56 %
(v/v) |
| Dauer
und gehaltener Zustand während
zweiter Alterung: | genau
wie in Beispiel 2 |
| Filterhilfsmittel
zum Entfernen feinerer Teilchen: | genau
wie in Beispiel 2 |
| Dauer
und gehaltener Zustand während
dritter Alterung (Endalterung): | genau
wie in Beispiel 2 |
| Drehzahl,
Dauer und Temperatur während
des Zentrifugierens: | genau
wie in Beispiel 2 |
| Endvolumen
des erhaltenen Extrakts: Lagerung: | genau
wie in Beispiel 2 |
Analyse
der Bruttozusammensetzung (zur Qualitätskontrolle)
| Bestandteile | Konz.
in dem Alkoholextrakt (mg/ml) |
| In
Aceton lösliche
Peptide: | 0,0017 |
| Mit
Aceton fällbare
Peptide/kleine Proteine: | 0,002 |
| Freie
Sialinsäure: | 0,008
(oder 8 μg/ml) |
| Gebundene
Sialinsäure: | 0,001
(oder 1 μg/ml) |
| Gesamtlipide: | 0,352 |
| Gesamtkohlenhydrate: | 0,132 |
| Gesamtphosphor: | 0,020 |
| Festgestellte
Nebenbestandteile: | Vitamin
B6 und D, Nukleoside, Spuren von Aminosäuren, wie Asparagin, Threonin,
Valin, Tryptophan, Phenylalanin; Progesterone und Östrogene
(in ng bis pg). Glucocorticoide (etwa 120 ng/ml) |
-
Alle
Bestimmungen und die Analyse wurden gemäß den veröffentlichten Standardverfahren
durchgeführt.
Beispielsweise Proteinbestimmung mit der Lowry-Methode, Kohlenhydrate
mit der Orcinol-H2SO4-Methode,
Sialinsäure
mit dem TBA-Assay-Verfahren, Phosphor mit dem Ames-Test, Lipide
mit der Phosphovanillin-H2SO4-Methode
usw.
-
Untersuchungen
auf die Pigmentierungswirksamkeit des Extrakts im Tiermodell
-
(a) Meerschweinchenmodell
-
20
Tropfen des Extrakts wurden auf die Areolaregionen männlicher,
unreifer, weißer
Meerschweinchen (Gewicht 205-250 g) zweimal täglich mit 15 Minuten Dauer
bei jeder Applikation über
mindestens 2 Monate ohne Unterbrechung aufgebracht. Die Applikationsregion
wurde nach jeder Applikation IR (230 V/150 W) aus einer Entfernung
von 45 cm für
15 Minuten ausgesetzt. Das Ergebnis war recht erfolgversprechend
mit Dunkelwerden der Region und Hypertrophie der Brustwarzen, wie
in dem Modellversuch berichtet (J. Invest. Dermatol. 1953, 20: 385-399).
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Das
Gewicht des verwendeten Meerschweinchens ist sehr entscheidend und
jüngere
Meerschweinchen unter 200 g erleiden einen enormen Alkoholschock,
der ihr Überleben
gefährdet,
sogar wenn schon allein 50-60%iger Alkohol topisch verabreicht wird.
-
-
(b) Mausmodell (C57/BL6)
-
Ein
Teil des Mäusefells
mit bräunlichem
Haar (diese Belastung der Maus zeigt ihre Fellfarbe, die bei Älterwerden
von Tiefschwarz zu bräunlichem
Grau ausbleicht, und ausgewachsene Mäuse mit einer braunen Fellfarbe
werden als Tiermodell für
Vitiligo verwendet) wurde durch Rasieren entfernt und die glatt
rasierte Region wurde zum Auftragen des Extrakts ausgewählt. 15
Tropfen des Extrakts wurden auf die glatt rasierten Stellen mit
leichtem Reiben aufgetragen. Nach dem Aufbringen wurden die Mäuse wie
im Fall des Meerschweinchens IR-Einwirkung
ausgesetzt und die Applikation wurde zweimal täglich durchgeführt. Zwischen
5 und 6 Wochen begannen deutlich dunkelschwarze Haare/Hautflecken
wieder zu erscheinen, während
die Haare am Rand weiteres Ausbleichen der Farbe zu hellerem Braun
zeigten.
-
-
Vorteile der
Erfindung
-
Die
Herstellung des hydroalkoholischen Extrakts gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren
ist sehr einfach. Der erhaltene Extrakt ist, falls gewünscht, ganz
leicht auf die Haut der Patienten aufzutragen. Sowohl Alkohol als
auch Plazenta (ein Krankenhausabfall) sind ausreichend verfügbare Ausgangsstoffe.
Keine speziellen Chemikalien oder besondere Einrichtung wird benötigt, um
das Verfahren durchzuführen.
Da das Verfahren sehr ökonomisch
ist, ist es für
die kommerzielle Verwendung sehr ermutigend. Keine besondere Lagereinrichtung
oder speziellen Transportanforderungen sind notwendig. Es ist leicht,
Qualitätskontrollparameter
nach Identifizierung der Wirkstoffe mit Standardverfahren zu entwickeln.
Da es ein topisches Mittel ist, wird es keine entscheidenden klinischen
Erprobungsverfahren, welche für
eine orale oder parenterale Therapie nötig sind, durchlaufen müssen.
