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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft allgemein Hyaluronidase-Zubereitungen
zur therapeutischen Verabreichung an den Augen von Menschen oder
anderen Säugern
und insbesondere a) die Verwendung davon zur Beschleunigung der
Rate, mit der hämorrhagisches
Blut aus dem Glaskörper
eines Säugerauges
beseitigt wird, und b) eine verbesserte Hyaluronidase-Zubereitung
zur ophthalmischen Verabreichung.
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Hintergrund der Erfindung
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i. Anatomie des menschlichen
Auges
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Beim
Menschen weist die Anatomie des Auges einen "Glaskörper" auf, der ungefähr vier fünftel der Augenhöhle hinter
der Linse einnimmt. Der Glaskörper
ist aus gallertigem Material geformt, das als Humor vitreus bekannt
ist. Typischerweise enthält
der Humor vitreus eines normalen menschlichen Auges ungefähr 99 %
Wasser zusammen mit 1 % Makromolekülen, die aufweisen: Kollagen,
Hyaluronsäure,
lösliche
Glykoproteine, Zucker und andere Metaboliten von geringer Molekülmasse.
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Die
Retina bzw. Netzhaut ist im wesentlichen eine Schicht von Nervengewebe,
die an der inneren hinteren Oberfläche des Augapfels gebildet
ist. Die Retina ist von einer Zellschicht umgeben, die als Choroidea bzw.
Aderhaut bekannt ist. Die Retina kann unterteilt werden in a) einen
optischen Bereich, der an dem visuellen Mechanismus teilnimmt, und
b) einem nichtoptischen Bereich, der nicht an dem visuellen Mechanismus teilnimmt.
Der optische Bereich der Retina enthält die Stäbchen und Zapfen, welche die
wirksamen Sehorgane sind. Eine Reihe von Arterien und Venen treten
in die Retina an ihrer Mitte ein und breiten sich nach außen aus,
um für
die Durchblutung der Retina zu sorgen.
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Der
hintere Bereich des Glaskörpers
ist in direktem Kontakt mit der Retina. Fibrillennetze gehen von der
Retina aus und treten in den Glaskörper ein oder sind in diesen
eingeführt,
um so den Glaskörper
an der Retina zu befestigen.
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ii. Ursachen, Behandlungen
und Folgeerscheinungen einer intravitrealen Einblutung
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Diabetische
Retinopathie, Trauma und andere ophthalmologische Störungen resultieren
manchmal in einem Reißen
oder Undichtwerden von Netzhautblutgefäßen mit daraus resultierender
Einblutung in den Humor vitreus des Auges (d. h. "intravitreale Einblutung"). Eine solche intravitreale
Einblutung manifestiert sich typischerweise als Trübung oder
Opakifikation des Humor vitreus.
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Eine
intravitreale Einblutung ist manchmal, jedoch nicht immer, begleitet
von einem Reißen
oder Ablösen
der Netzhaut. In Fällen,
in denen die intravitreale Einblutung von einem Netzhautriß oder einer
Netzhautablösung
begleitet ist, ist es wichtig, daß eine solche Netzhautablösung oder
ein solcher Netzhautriß prompt diagnostiziert
und durch einen Eingriff repariert wird. Wenn der Netzhautriß oder die
-ablösung
nicht prompt diagnostiziert und repariert wird, können Fotorezeptorzellen
der Netzhaut im Bereich des Risses oder der Ablösung absterben. Ein solches
Absterben der Fotorezeptorzellen der Retina kann zu einem Sehverlust
führen. Außerdem kann
dadurch, daß die
Netzhautablösung über einen
längeren
Zeitraum unrepariert bleibt, eine weitere intravitreale Einblutung
und/oder die Bildung von fibrösem
Bindegewebe an der Einblutungsstelle resultieren. Diese Bildung
von fibrösem
Bindegewebe kann zur Bildung einer unerwünschten fibrösen Festlegung zwischen
dem Glaskörper
und der Netzhaut führen.
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Das
typische chirurgische Vorgehen, das zur Reparatur von Netzhautrissen
oder einer Netzhautablösung
angewandt wird, macht es notwendig, daß der Chirurg fähig ist,
durch den Humor vitreus hindurchzusehen, um den geschädigten Bereich
der Netzhaut zu betrachten (d. h. "Betrachtung durch den Glaskörper hindurch"). Wenn eine intravitreale
Einblutung stattgefunden hat, kann die Anwesenheit des hämorrhagischen Bluts
in dem Glaskörper
dazu führen,
daß der
Glaskörper
so trüb
wird, daß der
Chirurg die Netzhaut nicht durch den Glaskörper betrachten kann. Diese
hämorrhagische
Trübung
des Glaskörpers
kann 6 bis 12 Monate oder länger
dauern, bis sie so weit aufgehoben ist, daß eine Betrachtung der Netzhaut
durch den Glaskörper
hindurch möglich
ist. Angesichts der potentiellen Komplikationen, die aus einer verzögerten Diagnose
oder Behandlung eines Netzhautrisses oder einer Netzhautablösung resultieren
können,
ist es im allgemeinen nicht wünschenswert,
auf das Eintreten dieses natürlichen
Verschwindens des hämorrhagischen
Blutes zu warten.
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Auch
wenn die intravitreale Einblutung nicht von einem Riß oder einer
Ablösung
der Retina begleitet ist, ist es häufig schwierig festzustellen,
daß ein
Riß oder
eine Ablösung
der Retina nicht aufgetreten ist, weil die hämorrhagische Trübung des
Glaskörpers
den Arzt daran hindert, die routinemäßige Untersuchung der Retina
mit dem Ophthalmoskop auszuführen.
Ferner kann die Anwesenheit von hämorrhagischem Blut in dem Glaskörper das
Sehvermögen
des Patienten durch das betroffene Auge erheblich beeinträchtigen,
und zwar so lange, bis das hämorrhagische
Blut im wesentlichen oder vollständig
verschwunden ist.
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Somit
verursacht die Anwesenheit von hämorrhagischem
Blut im Glaskörper
eine Vielzahl von klinischen Problemen wie a) die Unfähigkeit,
die Einblutungsstelle und/oder einen begleitenden Riß oder eine
Ablösung
der Retina durch Sicht zu untersuchen und zu diagnostizieren, b)
vollständige
oder teilweise Beeinträchtigung
des Sehvermögens
in dem betroffenen Auge und c) Beeinträchtigung oder Verhinderung
der Durchführung
von transvitrealen chirurgischen Eingriffen der Art, die typischerweise
vorgenommen werden, um die Einblutungsstelle zu reparieren und/oder
einen begleitenden Riß oder
eine Ablösung
der Retina zu reparieren.
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In
Fällen,
in denen die intravitreale Einblutung zu einer erheblichen Trübung oder
Opakifikation des Glaskörpers
geführt
hat, kann der behandelnde Arzt die Option haben, einen als Vitrektomie
bekannten Eingriff durchzuführen,
bei dem der gesamte Glaskörper
(oder ein Teil desselben) aus dem Augeninneren entfernt und durch
eine klare Flüssigkeit
ersetzt wird. Die Durchführung
einer solchen Glaskörperresektion
soll es dem Chirurgen ermöglichen,
die Netzhaut hinreichend sehen zu können, um die erforderliche
Netzhautuntersuchung und/oder chirurgische Reparatur der Einblutung
und einer etwaigen Netzhautablösung
oder eines Netzhautrisses durchzuführen. Solche Glaskörperresektionen
erfordern jedoch außerordentliches
Können
und sind von mehreren signifikanten Nachteilen, Risiken und Komplikationen
begleitet. Unter diesen Nachteilen, Risiken und Komplikationen ist
die Gefahr, daß der
Vorgang des Entfernens des Glaskörpers
eine weitere Ablösung oder
einen weiteren Riß der
Retina verursacht und/oder daß eine
solche Glaskörperresektion
zu einer weiteren Einblutung aus den bereits geschwächten Blutgefäßen der
Retina führt.
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iii. Bekannte opthalmische
Anwendungen von Hyaluronidase und anderen Enzymen
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Bei
dem Versuch, die Gefahr einer weiteren Ablösung oder eines weiteren Reißens der
Retina während
der Glaskörperresektion
zu minimieren, ist bereits in der US-PS 5 292 509 (Hageman) vorgeschlagen worden,
bestimmte proteasefreie Glycosaminoglycanase-Enzyme in den Glaskörper zu
injizieren, um den Glaskörper
zu veranlassen, von der Retina abgekoppelt zu werden oder nicht
mehr in sie eingesetzt zu sein, und zwar vor dem Entfernen des Glaskörpers. Ein
solches Entfernen oder Abkoppeln des Glaskörpers soll die Gefahr minimieren,
daß während der
Resektion des Glaskörpers
weiteres Reißen
oder Ablösen
der Retina eintritt. Beispiele von spezifischen proteasefreien Glycosaminoglycanase-Enzymen,
die verwendet werden können,
um diese Glaskörperablösung zu
bewirken, sollen die folgenden umfassen: Chondroitinase ABC, Chondroitinase
AC, Chondroitinase B, Chondroitin-4-Sulfatase, Chondroitin-6-Sulfatase,
Hyaluronidase und β-Glucuronidase.
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Es
ist zwar bekannt, daß das
Hyaluronidase-Enzym für
verschiedene ophthalmische Anwendungen einsetzbar ist, u. a. die
die Vitrektomie begleitende Anwendung, die in der US-PS 5 292 509
(Hageman) beschrieben wird, veröffentlichte
Studien haben aber gezeigt, daß das
Hyaluronidase-Enzym
selbst für
die Retina und/oder andere anatomische Strukturen des Auges toxisch
sein kann. Siehe hierzu The Safety of Intravitreal Hyaluronidase;
Gottleib, J.L.; Antoszyk, A.N., Hatchell, D.L. und Soloupis, P.,
Invest Ophthalmol Vis Sci 31:11, 2345-52 (1990).
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Die
opthalmische Toxizität
von einigen Hyaluronidase-Zubereitungen ist von anderen Forschern
bestätigt
worden, die vorgeschlagen haben, daß solche Hyaluronidase-Zubereitungen
als toxisches Reizmittel eingesetzt werden, um experimentell induzierte
Revaskularisierung des Auges in tierischen Toxizitätsmodellen zu
verursachen. Siehe hierzu An Experimental Model of Preretinal Neovascularization
in the Rabbit; Antoszyk, A.N., Gottleib, J.L., Casey, R.C., Hatchell,
D.L., und Machemer, R., Invest Ophthalmol Vis Sci 32:1, 46-51 (1991).
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Leider
war früher
nicht bekannt, ob die berichteten therapeutischen Wirksamkeiten
und Toxizitäten
von Hyaluronidase universell für
alle Hyaluronidase-Zubereitungen gelten oder ob solche Wirksamkeiten
und/oder Toxizitäten
nur für
Hyaluronidase-Zubereitungen gelten, die bestimmte Trägersubstanzen
enthalten, oder für Hyaluronidase-Enzyme,
die von spezifischen Quellen abgeleitet sind. Das ist eine wichtige Überlegung
angesichts der Tatsache, daß die
Reinheit und Charakterisierung (z. B. Verteilung des Molekülgewichts)
der verschiedenen im Stand der Technik eingesetzten Hyaluronidase-Zubereitungen
unterschiedlich sein kann, und zwar in Abhängigkeit von der Quelle der
Hyaluronidase und der Lösungsmittel
und/oder von anderen Formulierungskomponenten, mit denen die Hyaluronidase
kombiniert wird.
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iv. Reinheit und Charakterisierung
von Hyaluronidase-Zubereitungen,
die früher
für die
ophthalmische Verabreichung verwendet wurden
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Der
Ausdruck "Hyaluronidase" wird allgemein verwendet,
um eine Gruppe von Endo-β-glucuronidase-Enzymen
zu beschreiben, die bestimmte Mucopolysaccharide wie etwa Hyaluronsäure depolymerisieren. Myer,
K. et al., The Enzymes; Vol. 4, 2nd Ed., S. 447, Academic Press,
Inc., New York (1960).
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Hyaluronidase
verursacht die Hydrolyse der Endo-N-acetylhexosaminsäurebindungen
von Hyaluronsäure
und der Chondroitinsulfatsäuren
A und C primär
zu Tetrasaccharidresten.
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Signifikante
Anhaltspunkte weisen darauf hin, daß Hyaluronidase-Enzyme, die
von verschiedenen Quellen stammen, in bezug auf die Molekülgewichtsverteilung
der Enzyme und spezifische enzymatische Witksamkeiten unterschiedlich
sind. Eine solche Variabilität
der Molekülgewichtsverteilung
und der spezifischen enzymatischen Wirksamkeit sind beachtenswerte Überlegungen
angesichts der Tatsache, daß Hyaluronidase-Enzyme
aus einer Vielzahl von Quellen isoliert werden können, was Rindertestikel, Schaftestikel,
bestimmte Bakterien wie Streptomyces und bestimmte Invertebraten
wie Blutegel umfaßt.
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Von
der Wydase®-Hyaluronidase-Zubereitung
wird berichtet, daß sie
für verschiedene
klinische und experimentelle Anwendungen bereits auf die Augen von
Säugern
aufgebracht wurde, was die Behandlung von Glaukom und die Unterstützung der
Verflüssigung
des Glaskörpers
bei Vitrektomievorgängen
umfaßt,
bei denen der Glaskörper
aus dem Auge entfernt wird.
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Von
einigen Hyaluronidase-Zubereitungen ist zwar berichtet worden, daß sie erwünschte therapeutische
Wirkungen zeigen, wenn sie in das Auge injiziert oder topisch auf
das Auge aufgebracht werden, die potentielle Toxizität von Hyaluronidase
und/oder des Konservierungsmittels Thiomersal geben jedoch Anlaß zu Sorge
in bezug auf die Sicherheit einer routinemäßigen klinischen Verabreichung
solcher Zubereitungen durch intraokulare Injektion.
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Es
besteht also auf diesem Gebiet ein Bedarf für die Formulierung und Entwicklung
einer neuen Hyaluronidase-Zubereitung, die dem Auge in Dosismengen
verabreicht werden kann, die ausreichen, um optimale therapeutische
Wirkungen hervorzubringen, jedoch keine okulare Toxizität verursachen.
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Außerdem besteht
angesichts der oben erörterten
Probleme im Zusammenhang mit der Langsamkeit der natürlichen
Beseitigung von hämorrhagischem
Blut aus dem Glaskörper
ein Bedarf für
Erforschung und Entwicklung neuer Methoden und Verfahren zur Beschleunigen
der Beseitigung von hämorrhagischem
Blut aus dem Glaskörper
des Auges, um so eine transvitreale Betrachtung des Augenhintergrunds
einschließlich der
Retina zu ermöglichen,
ohne daß es
notwendig ist, den Glaskörper
zu entfernen (d. h. ohne Total- oder Teilvitrektomie).
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung gibt die Verwendung einer Hyaluronidase-Lösung bei
der Herstellung eines Medikaments zum Beschleunigen der Beseitigung
von hämorrhagischem
Blut aus dem Glaskörper
des Auges eines Säugers
an, wobei beim Kontakt mit dem Glaskörper eine Menge an Hyaluronidase
wirksam ist, um die Beseitigung von hämorrhagischem Blut aus dem
Glaskörper
zu beschleunigen.
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Ferner
ist gemäß der vorliegenden
Erfindung die Zubereitung eine verbesserte, Thiomersal-freie Hyaluronidase-Zubereitung,
die zur Verabreichung auf das oder in dem Auge als therapeutisches
Mittel zur Behandlung verschiedener krankhafter Störungen geeignet
ist, was, ohne darauf beschränkt
zu sein, die Beschleunigung der Beseitigung von hämorrhagischem
Blut aus dem Glaskörper
in Übereinstimmung
mit der Einblutungs-Beseitigungsmethodik der vorliegenden Erfindung
umfaßt.
Diese Hyaluronidase-Zubereitung der vorliegenden Erfindung weist
ein Hyaluronidase-Enzym auf, das im wesentlichen keine Hyaluronidase-Moleküle hat,
die Molekulargewichte von mehr als 100.000, zwischen 60.000 und
70.000 und unter 40.000 haben. Die bevorzugte Hyaluronidase der
vorliegenden Erfindung kann aus Rindertestikeln gewonnen werden
und in wäßriger Lösung mit
Mengen an Laktose und Phosphat kombiniert sein, um eine Thiomersal-freie
wäßrige Hyaluronidase-Lösung für die intraokulare
Injektion zu ergeben.
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Weitere
Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich für den Fachmann
aus dem Studium und Verständnis
der nachstehenden genauen Beschreibung, der beigefügten Zeichnungen
und der angegebenen Beispiele.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
ein Elektrophoresegel mit Bahnen 1-6, wobei die Bahnen bezeichnen:
1) Molekulargewicht-Standards von 31.000 bis 200.000, 2) Schaf-Hyaluronidase
(ACS), 3) Rinder-Hyaluronidase
Typ VI-S, 4) Schaf-Hyaluronidase Typ V, 5) Rinder-Hyaluronidase
Typ IV-S und 6) Rinder-Hyaluronidase Typ I-S.
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2 ist
eine Tabelle, in der die zymografisch bestimmten, Hyaluronsäure lysierenden,
gelatinolytischen und caseinolytischen Wirksamkeiten der Hyaluronidase
ACS der vorliegenden Erfindung im Vergleich mit Rinder-Hyaluronidasen
der Typen VI-S, IV-S und I-S und Schaf-Hyaluronidase vom Typ V zusammengefaßt sind;
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3 ist
eine Tabelle, in der die toxischen Wirkungen von intravitrealen
Einzeldosis-Injektionen von BSS, BSS + Thiomersal, Hyaluronidase
(ACS) und Hyaluronidase Wydase® in Kaninchen entsprechend
dem folgenden Beispiel I zusammengefaßt sind;
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4 ist
eine Tabelle, in der die Wirksamkeit der intravitrealen Einzeldosis-Hyaluronidase
(ACS) in Kaninchen entsprechend dem folgenden Beispiel II zusammengefaßt ist;
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5 ist
eine Tabelle, in der die Sicherheit und Wirksamkeit von Vielfachdosen
von intravitrealer Hyaluronidase (ACS) in Kaninchen entsprechend
dem folgenden Beispiel III zusammengefaßt sind; und
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6 ist
eine Tabelle, in der die Wirksamkeit von Einzeldosis-Hyaluronidase
ACS bei der Beseitigung von Einblutungen bei Human-Patienten mit
diabetischer Retinopathie entsprechend dem folgenden Beispiel IV zusammengefaßt ist.
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GENAUE BESCHREIBUNG DER
BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Die
folgende genaue Beschreibung und die begleitenden Beispiele dienen
nur der Beschreibung und Erläuterung
bestimmter bevorzugter Ausführungsformen
der Erfindung und sollen den Umfang der Erfindung in keiner Weise
einschränken.
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i. Enzymatische Methode
zur Beschleunigung der Beseitigung von hämorrhagischem Blut aus dem
Glaskörper des
Auges
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Gemäß der Erfindung
hat die Anmelderin festgestellt, daß Hyaluronidase, wenn sie mit
dem Glaskörper
nach einer Einblutung in diesen in Kontakt gebracht wird, die Rate
beschleunigt, mit der das hämorrhagische
Blut aus dem Glaskörper
beseitigt wird.
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In
dieser Hinsicht hat die Anmelderin eine Methode zum Beschleunigen
der Beseitigung von hämorrhagischem
Blut aus dem Glaskörper
des Auges entwickelt, wobei diese Methode allgemein den Schritt
aufweist, daß Hyaluronidase
mit dem Glaskörper
in einer Menge in Kontakt gebracht wird, die wirksam ist, um die Beseitigung
von hämorrhagischem
Blut aus dem Glaskörper
zu beschleunigen. Diese Methode der Beseitigung der Einblutung kann
ohne jegliche Vitrektomie oder andere chirurgische Maßnahmen
oder Entfernen des Glaskörpers
durchgeführt
werden, wodurch die potentiellen Risiken und Komplikationen vermieden
werden, die mit solchen Vitrektomie-Verfahren einhergehen.
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Die
bevorzugte Verabreichungsroute dieses eine Einblutung beseitigenden
Enzyms ist die intraokulare Injektion, wobei eine injizierbare Lösung, die
das die Einblutung beseitigende Enzym enthält, durch eine Nadel direkt
in den Glaskörper
zu injizieren ist, der sich in der hinteren Augenkammer befindet.
Alternativ kann das die Einblutung beseitigende Enzym der vorliegenden
Erfindung auch auf jeder anderen geeigneten Verabreichungsroute
(z. B. topisch) verabreicht werden, die in einer hinreichenden Verteilung
des Enzyms zu dem Glaskörper
resultiert, so daß die
gewünschte
Wirkung der Beseitigung der Einblutung verursacht wird.
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Die
bevorzugte injizierbare Lösung
des die Einblutung beseitigenden Enzyms kann zusätzlich zu dem die Einblutung
beseitigenden Enzym bestimmte inaktive Bestandteile enthalten, die
bewirken, daß die
Lösung im
wesentlichen isotonisch ist und einen pH-Wert hat, der zur Injektion
in das Auge geeignet ist. Eine solche Injektionslösung kann
ursprünglich
zu einem Trockenzustand lyophilisiert und anschließend vor
dem Gebrauch rekonstituiert werden.
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ii. Eine bevorzugte Hyaluronidase-Zubereitung
zur ophthalmischen Verabreichung
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Eine
allgemeine Formulierung für
eine injizierbare Thiomersal-freie Hyaluronidase-Zubereitung der vorliegenden
Erfindung ist in der Tabelle I wie folgt gezeigt:
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Tabelle
I Allgemeine
Formulierung
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Diese
Formulierungsbestandteile werden zuerst in keimfreiem Wasser gelöst, sterilfiltriert
und anschließend
zu einer Trockenzusammensetzung lyophilisiert. Die lyophilisierte
Zusammensetzung wird für
die spätere
Rekonstitution vor dem Gebrauch in ausbalancierter Salzlösung verpackt.
Eine solche ausbalancierte Salzlösung
enthält
typischerweise: 0,64 % Natriumchlorid, 0,075 % Kaliumchlorid, 0,048
% Calciumchloriddihydrat, 0,03 Magnesiumchloridhexahydrat, 0,39
% Natriumacetattrihydrat, 0,17 % Natriumcitratdihydrat, Natriumhydrid/Salzsäure zur
pH-Einstellung und
Wasser für
die Injektion qs 100 %.
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Der
Ausdruck "Hyaluronidase
ACS" beschreibt
im vorliegenden Zusammenhang eine bevorzugte Hyaluronidase, die
frei von Hyaluronidase-Molekulargewichtsfraktionen über 100.000,
zwischen 60.000 und 70.000 und unter 40.000 ist. Eine solche Hyaluronidase
kann von Schaftestikeln gewonnen werden und ist im Handel erhältlich von
Calbiochem Biochemicals, P.O. Box 12087, La Jolla, Ca 92039-2087.
Die Anmelderin hat festgestellt, daß diese spezifische Molekulargewichtsverteilung
der Hyaluronidase ACS in einer geringeren ophthalmischen Toxizität als andere
Hyaluronidase-Zubereitungen resultiert, während sie gleichzeitig eine
erwünschte
therapeutische Wirksamkeit in einer Reihe von opthalmischen Anwendungen
zeigt.
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1 zeigt
ein Elektrophoresegel (10 % SDS-PAGE), das die Molekulargewichtsverteilung
der bevorzugten Hyaluronidase ACS im Vergleich mit der Molekulargewichtsverteilung
von Hyaluronidasen vom Rindertyp VI-S, IV-S und I-S und vom Schaftyp
V demonstriert, die von Sigma Chemical Company, P.O. Box 14508, St.
Louis, Missouri 63178, erhalten waren. Standardisierte Mengen (d.
h. äquivalente
Einheiten von Hyaluronidase-Wirksamkeit) jedes Enzyms wurden in
jede Bahn (Bahnen 2-6) des in
1 gezeigten
Elektrophoresegels geladen. Bahn 1 des in
1 gezeigten
Elektrophoresegels enthält
Molekulargewichtsmarker bei 200.000, 116.000, 97.400, 66.000, 45.000
bzw. 31.000. Die in
1 gezeigten Bahnen 2 bis 6 des
Elektrophoresegels enthalten die jeweiligen getesteten Hyaluronidase-Zubereitungen
wie folgt:
BAHN | WAS
SICH IN DER BAHN BEFINDET |
2 | Hyaluronidase
ACS |
3 | Rinder-Hyaluronidase
Typ VI-S |
4 | Schaf-Hyaluronidase
Typ V |
5 | Rinder-Hyaluronidase
Typ IV-S |
6 | Rinder-Hyaluronidase
Typ IS |
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Bahn
2 zeigt, daß die
Molekulargewichtsverteilung der Hyaluronidase ACS Molekulargewichtsfraktionen
von 97.400, 50.000 (ungefähr)
und 45.000 (ungefähr)
aufweist, aber offensichtlich keine Molekulargewichtsfraktionen über 100.000,
zwischen 60.000 und 70.000 und unter 40.000 hat.
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Die
Bahnen 3, 4, 5 und 6 des Elektrophoresegels von 1 zeigen,
daß alle
getesteten Rindertestikel-Hyaluronidasen der Typen VI-S, IV-S und
I-S und die Schaftestikel-Hyaluronidase vom Typ V von der Hyaluronidase
ACS der vorliegenden Erfindung dahingehend verschieden sind, daß sie Molekulargewichtsfraktionen
zwischen 60.000 und 70.000 und unter 40.000 aufweisen. Ferner wiesen
drei (3) der vier (4) getesteten Rindertestikel-Hyaluronidasen (d.
h. die Typen VI-S, IV-S und I-S) Hyaluronidase-Molekulargewichtsfraktionen über 100.000
auf.
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Zusätzlich wurden
Zymogramme erstellt, um die relativen lysierenden Wirksamkeiten
von standardisierten Mengen (d. h. äquivalenten Einheiten der Hyaluronidase-Wirksamkeit)
der oben beschriebenen Hyaluronidase ACS, der Typen VI-S, V, IV-S
und I-S Rinder-Hyaluronidasen auf Hyaluronsäure, Gelatine und Casein zu
vergleichen. Unter Bezugnahme auf 2 sind die
spezifischen Methoden, nach denen jedes dieser Zymogramme erstellt
wurde, die folgenden:
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Zymogramm für gelatinolytische
Wirksamkeit
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- GELATINE – 1
mg/ml Gelatine; 10 % Polyacrylamid; über Nacht Puffer = 50 mM Tris
HCl, 5 mM CaCl2, 0,05 % Triton X-100 pH
7,5; Anfärbung
Coomassie-Blau; Entfärben
10 % Essigsäure/50
% Methanol.
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Zymogramm für Caseinolytische
Wirksamkeit
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- CASEIN – 4
mg/ml; 15 % Polyacrylamid; über
Nacht Puffer = 50 mM Tris/HCL, 5 mM CaCl2 und
0,05 % Triton X-100 pH 7,5; Anfärbung
Coomassie-Blau; Entfärben
10 % Essigsäure/50
% Methanol.
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Zymogramm für Hyaluronsäure-Lysierungswirksamkeit
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- HYALURONSÄURE – 2 mg/ml,
10 % Polyacrylamid; über
Nacht Puffer=phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4; Anfärbung 0,5
% Alzianblau in 3 % Essigsäure;
Entfärben
10 % Essigsäure/50
% Methanol.
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Die
Ergebnisse dieser Hyaluronsäure-,
Gelatine- und Casein-Zymogramme sind in der Tabelle von 2 zusammengefaßt. Dabei
ist zu beachten, daß die
bevorzugte Hyaluronidase ACS der vorliegenden Erfindung keine Hyaluronsäure lysierenden
Molekulargewichtsfraktionen über
ungefähr
100.000 hat, wogegen jede der getesteten Rindertestikel-Hyaluronidasen
(d. h. Typen VI-S, IV-S und I-S) Hyaluronsäure lysierende Molekulargewichtsfraktionen über 100.000
enthielt.
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Ebenso
hatte die Hyaluronidase ACS der vorliegenden Erfindung keine gelatinolytischen
Molekulargewichtsfraktionen zwischen ungefähr 60.000 und 100.000, wogegen
jede der getesteten Rindertestikel-Hyaluronidasen gelatinolytische
Molekulargewichtsfraktionen zwischen ungefähr 60.000 und 100.000 aufwies.
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Außerdem hatte
die Hyaluronidase ACS der vorliegenden Erfindung keine caseinolytischen
Molekulargewichtsfraktionen über
ungefähr
45.000, wogegen jede der getesteten Rindertestikel-Hyaluronidasen
(d. h. Typen VI-S, IV-S und I-S) und Schaftestikel-Hyaluronidase (Typ
V) tatsächlich
caseinolytische Molekulargewichtsfraktionen über ungefähr 45.000 enthielt.
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Die
spezifische Molekulargewichtsverteilung und das spezifische Enzymaktivitätsprofil
der bevorzugten Hyaluronidase (ACS) der vorliegenden Erfindung und/oder
der Ausschluß von
Thiomersal aus ihrer Formulierung führt zu einer Hyaluronidase-Zubereitung,
die für
das Auge nichttoxisch ist, wenn sie in Dosismengen verabreicht wird,
bei denen andere Hyaluronidase-Zubereitungen toxische Wirkungen
verursachen würden.
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Zum
Gebrauch in den nachstehend aufgeführten Beispielen wurde die
bevorzugte Hyaluronidase ACS in einer Thiomersal-freien Formulierung
nach der Methode und der allgemeinen hier beschriebenen und in der Tabelle
I gezeigten Formulierung hergestellt. Insbesondere wurde die in
den folgenden Beispielen verwendete Hyaluronidase gemäß der speziellen
Formulierung hergestellt, die in der folgenden Tabelle II angegeben
ist.
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Tabelle
II Spezifische
Formulierung
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Wie
in den folgenden Beispielen beschrieben wird, kann die spezifische
bevorzugte Formulierung als Hyaluronidase ACS, die in der obigen
Tabelle II angegeben ist, direkt in die hintere Kammer des Auges
in Dosismengen injiziert werden, die erwünschte therapeutische Wirkungen
hervorbringen, was die erfindungsgemäße Beseitigung der Einblutung
im Glaskörper
einschließt,
jedoch nicht notwendigerweise darauf beschränkt ist, und zwar ohne eine
signifikante Toxizität
für das
Auge oder damit zusammenhängende
anatomische Strukturen zu verursachen.
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Beispiel I
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Ophthalmische Toxizität von Thiamersal,
Hyaluronidase (ACS) und Hyaluronidase (Wydase®) in
Kaninchen
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Zweiundfünfzig (52)
gesunde Kaninchen des Typs New Zealand Cross (26 männliche,
26 weibliche Tiere) mit einem Gewicht zwischen 1,5 kg und 2,5 kg
wurden zur Identifizierung einzeln markiert und einzeln in Hängekäfigen untergebracht.
Die Tiere erhielten handelsübliches
pelletisiertes Kaninchenfutter auf täglicher Basis, und Leitungswasser
war ad libitum verfügbar.
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Die
Tiere wurden in dreizehn Gruppen von je vier Tieren aufgeteilt (2
männliche,
2 weibliche). Zwei Tiere in jeder Gruppe (1 männliches, 1 weibliches) wurden
für die
vor der Behandlung erfolgende Fotografie des Augenhintergrunds und
die Fluorescein-Angiographie
ausgewählt.
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Die
Aufnahme des Augenhintergrunds erfolgte durch Fixieren der Tiere
und Sichtbarmachung des Sehnervs, der retinalen Arkaden und des
Fundus mit einer KOWA® RC-3 Funduskamera, die
mit Kodak Gold 200 ASA Film bestückt
war.
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Für die Fluorescein-Angiographie
erfolgte eine 1,5-ml-Injektion einer 2 % sterilen Fluoresceinlösung durch
die Randohrvene. Ungefähr
30 Sekunden nach der Injektion war das Fluorescein bei Lokalisierung
des Sehnervs, der Retinalgefäße und des
Fundus sichtbar.
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Am
folgenden Tag wurde jedes Tier durch i.v. Verabreichung einer Kombination
aus 34 mg/kg Ketaminhydrochlorid und 5 mg/ml Xylazin anästhesiert.
Die Augelider wurden mit einem Lidspekulum zurückgezogen, und die Augen wurden
mit einer Iod-Providon-Waschlösung desinfiziert.
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Experimentelle
Behandlungen entweder mit ausbalancierter Salzlösung (BSS), BSS + Thiomersal, Hyaluronidase
(Wydase®)
oder Hyaluronidase (ACS) wurden mittels Injektion verabreicht unter
Verwendung einer 1 cm3 Tuberkulin-Spritze
mit einer daran angebrachten 30 G Nadel von 0,5 inch. Die bei diesem
Beispiel verwendete Hyaluronidase-(ACS)-Lösung war frei von Thiomersal
und bildete die spezifische bevorzugte Hyaluronidase-ACS-Formulierung, die
in der obigen Tabelle I angegeben ist.
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Die
jeder Tiergruppe verabreichten Versuchsbehandlungen waren wie folgt:
Gruppe
# | Behandlung |
1 | BSS |
2 | BSS
+ 0,0075 mg Thiomersal |
3 | BSS
+ 0,025 mg Thiomersal |
4 | Hyaluronidase
(Wydase) 1 IE |
5 | Hyaluronidase
(Wydase) 15 IE |
6 | Hyaluronidase
(Wydase) 30 IE |
7 | Hyaluronidase
(Wydase) 50 IE |
8 | Hyaluronidase
(Wydase 150 IE |
9 | Hyaluronidase
(ACS) 1 IE |
10 | Hyaluronidase
(ACS) 15 IE |
11 | Hyaluronidase
(ACS) 30 IE |
12 | Hyaluronidase
(ACS) 50 IE |
13 | Hyaluronidase
(ACS) 150 IE |
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An
dem auf die Injektionen folgenden Tag (Tag 1) wurden die 26 Tiere,
die der Fundusfotografie und Fluorescein-Angiographie unterzogen
worden waren, unter Anwendung derselben Methoden wie für die Untersuchung
vor der Dosisgabe beobachtet.
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Am
Tag 2 nach den Injektionen wurden die 13 männlichen Kaninchen, welche
die Fundusfotographie und Fluorescein-Angiographie vor der Dosisgabe
und am Tag 1 erhalten hatten, sowie die 13 weiblichen Kaninchen,
die nicht für
die Fotografie ausgewählt
waren, mit einem Medikament auf der Basis von Natriumpentobarbital
getötet.
Die Augen wurden dann chirurgisch entfernt und in eine Fixierlösung aus
2,5 % Glutaraldehyd mit 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit
pH 7,37 verbracht.
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Alternativ
wurde ein zufällig
ausgewähltes
Kaninchen mittels Pentobarbital-Injektion getötet, dann jedoch durch intrakardiale
Injektion der Glutaraldehydlösung
in den linken Ventrikel fixiert, um die Wirkung des Fixiervorgangs
auf die histologischen Ergebnisse in den ausgeschälten Augen
zu bestimmen.
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Am
Tag 7 wurden die 13 weiblichen Kaninchen, die vorher fotografiert
und der Angiographie unterzogen worden waren, den gleichen Beobachtungen
unterzogen, wobei die vorher beschriebenen Methoden angewandt wurden.
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Die
verbliebenen 26 Tiere wurden wie oben beschrieben 7 Tage nach der
Dosisgabe getötet.
Die Augen wurden auf die gleiche Weise fixiert wie die am Tag 2
fixierten Augen. Auch hier wurde ein zufällig ausgewähltes Kaninchen dem gleichen,
oben für
das vorher zufällig
ausgewählte
Tier beschriebenen intrakardialen Fixiervorgang mit Glutaraldehyd
unterworfen.
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Die
Augen der in diesem Beispiel behandelten Tiere wurden makroskopisch
und mikroskopisch auf Anzeichen einer auf die Behandlung zurückgehenden
Toxizität
untersucht. Eine Tabelle, in der eine Zusammenfassung der histologischen
Anzeichen von Toxizität
oder Nichttoxizität
in jeder Behandlungsgruppe angegeben ist, ist in 3 angeführt. Insgesamt
waren die Augen der mit BSS behandelten Kontrollgruppe am Tag 2
und Tag 7 nach Dosisgabe frei von Toxizität.
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Die
Augen der Tiere der Gruppe Nr. 2, die mit BSS + Thiomersal (0,0075
mg) behandelt worden waren, waren am Tag 2 frei von Toxizität, zeigten
jedoch Anzeichen, daß ein
Zusammenbruch der Blut-Netzhaut-Schranke am Tag 7 stattfand.
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Die
Tiere der Gruppe Nr. 3, die mit BSS + Thiomersal (0,025 mg) behandelt
wurden, zeigten am Tag 2 und Tag 7 nach der Dosisgabe starke behandlungsbedingte
toxische Wirkungen.
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Die
Tiere der Gruppe Nr. 4, die mit Wydase® in
der Dosis 1 IE behandelt wurden, waren an den Tagen 2 und 7 frei
von Toxizität,
aber die Augen der Tiere in den Gruppen Nr. 5 bis 8, die mit Wydase® in
Dosismengen zwischen 15 IE und 150 IE behandelt wurden, zeigten
allgemein dosisbezogene toxische Wirkungen an den Tagen 2 und 7
nach Dosisgabe.
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Die
Augen der Tiere in den Gruppen Nr. 9 bis 13, die mit Hyaluronidase
(ACS) in Dosierungen zwischen 1 IE und 150 IE behandelt wurden,
waren an den Tagen 2 und 7 nach Dosisgabe frei von Anzeichen toxischer
Wirkungen.
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Es
wird somit gefolgert, daß Thiomersal
und die Thiomersal enthaltende Wydase®-Formulierung tatsächlich toxische
Wirkungen in den Augen von Kaninchen bei den untersuchten Dosismengen
verursachen, daß jedoch
Hyaluronidase (ACS) bei diesen Tieren in den getesteten Dosismengen
keine toxischen Wirkungen verursachte.
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Die
Ergebnisse der Untersuchungen, die am Tag 7 durchgeführt wurden,
sind in 3 zusammengefaßt. Wie 3 zeigt,
wurden signifikante toxische Wirkungen am Tag 7 in den Augen von
Kaninchen beobachtet, die mit BSS plus Thiomersal (0,0075 mg) und
Hyaluronidase (Wydase) behandelt wurden, und zwar bei allen Dosismengen
zwischen 1 IE und 150 IE. Im Gegensatz dazu wurden in den Augen
von Tieren, deren Behandlung mit Dosismengen von 1 bis 50 IE Hyaluronidase
(ACS) erfolgte, keine toxischen Wirkungen beobachtet.
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BEISPIEL II
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Sicherheit und Wirksamkeit
von Hyaluronidase (ACS), die intravitreal in die Augen von Kaninchen
injiziert wurde
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Bei
diesem Beispiel wurden 12 gesunde Kaninchen des Typs New Zealand
Cross zum Zweck der Identifizierung markiert und einzeln in Hängekäfigen untergebracht.
Die Tiere erhielten handelsübliches
pelletisiertes Kaninchenfutter auf täglicher Basis, und Leitungswasser
war unbegrenzt verfügbar.
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Die
Tiere wurden nach dem Zufallsprinzip in vier (4) Behandlungsgruppen
von je drei (3) Tieren aufgeteilt.
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Zuerst
wurden die Augen jedes Tiers durch Weittropfen mit 1-2 Tropfen von
10 % Tropicanid untersucht, gefolgt von makroskopischer Untersuchung,
indirekter Ophthalmoskopie unter Verwendung einer 20 dpt-Linse und
Spaltlampenuntersuchung der hinteren Anatomie des Auges.
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Nach
der Eingangsuntersuchung der Augen der Tiere wurde in jedes Auge
jedes Tiers 100 μl
oder 10 μl
Blut intravitreal injiziert.
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Am
Tag 2 erhielten die Tiere jeder Behandlungsgruppe eine einzelne
intravitreale Injektion von entweder BSS oder Hyaluronidase (ACS)
in das rechte Auge entsprechend dem nachstehende Behandlungsplan:
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Die
bei diesem Versuch eingesetzte Hyaluronidase(ACS)-Zubereitung war
die bevorzugte Formulierung, die oben beschrieben und in Tabelle
II angegeben ist.
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An
den Tagen 3, 5, 7, 14 und 21 wurden die Augen jedes Tiers erneut
mit der Spaltlampe untersucht, um die Hornhaut, die hintere Kammer
und die Iris zu bewerten. Außerdem
wurden die Augen jedes Tiers mit 10 % Tropicamid-Lösung weitgetropft,
und die Retina wurde mittels indirekter Ophthalmoskopie mit einer
20 dpt-Linse untersucht.
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In 4 ist
die beobachtete Wirksamkeit von Hyaluronidase (ACS) bei der Beseitigung
der Einblutung zusammengefaßt.
Im allgemeinen enthielt das linke Auge (unbehandelt) jedes Tiers
in jeder Behandlungsgruppe trüben
Glaskörper
und einige Blutgerinnsel infolge der Blutmenge, die injiziert worden
war. Die rechten Augen der mit BSS behandelten (Kontroll-)Tiere der Gruppe
A enthielten ebenfalls trüben
Glaskörper
und etwas Blutgerinnsel, wogegen die rechten Augen von allen mit
Hyaluronidase behandelten Tieren in den Behandlungsgruppen B bis
D Glaskörper
enthielten, der klar war und durch den hindurch die transvitreale
Visualisierung der Retina möglich
war. Ferner erschienen die Netzhäute
der rechten Augen aller Tiere in den Behandlungsgruppen B bis D
normal und frei von behandlungsbedingter Toxizität.
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Die
Ergebnisse dieses Experiments zeigen, daß intravitreal verabreichte
Hyaluronidase (ACS) in Einzeldosen von 25 bis 75 IE wirksam war,
um die Rate zu beschleunigen, mit der Blut aus den Augen der behandelten
Tiere beseitigt wurde, und ferner, daß solche Einzeldosen von Hyaluronidase
(ACS), die bei diesem Experiment verabreicht wurden, keine sichtbaren
toxischen Wirkungen in den Augen der Kaninchen verursachten, die
bei diesem Experiment behandelt wurden.
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Die
Beobachtungen, die auf jede Dosis folgten, waren gleichbleibend
und sind in 5 zusammengefaßt. Im allgemeinen
enthielt das linke (unbehandelte) Auge jedes Tiers in jeder Behandlungsgruppe
trüben Glaskörper und
einige Blutgerinnsel infolge der Blutmenge, die injiziert worden
war. Die rechten Augen der mit BSS behandelten (Kontroll-)Tiere
der Gruppe A enthielten ebenfalls trüben Glaskörper und etwas Blutgerinnsel,
wogegen die rechten Augen sämtlicher
Tiere in den Behandlungsgruppen B bis E (d. h. der mit Hyaluronidase
(ACS) behandelten Tiere) klaren Glaskörper enthielten, durch den
hindurch die transvitreale Visualisierung der Retina möglich war.
Ferner erschienen die Netzhäute
der rechten Augen aller Tiere in den Behandlungsgruppen B bis D
normal und frei von behandlungsbedingter Toxizität, und zwar auch nach einer
Vielzahl von Dosen der Hyaluronidase ACS.
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Die
Ergebnisse dieses Experiments zeigen, daß intravitreal verabreichte
Hyaluronidase (ACS) in Einzeldosen von 25 bis 75 I.E. x 4 wirksam
war, um die Rate zu beschleunigen, mit der Blut aus den Augen von Kaninchen
beseitigt wurde, und ferner, daß diese
Dosismengen von Hyaluronidase ACS keine erkennbaren toxischen Auswirkungen
in den Augen der behandelten Kaninchen verursachten, und zwar auch
nach vier (4) aufeinanderfolgenden Dosen von Hyaluronidase ACS,
die in Intervallen von 2 Wochen verabreicht wurden.
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BEISPIEL III
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Wirksamkeit von Hyaluronidase
(ACS) bei der Beseitigung von Einblutungen bei Menschen
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Bei
diesem Experiment wurden sechs (6) Human-Patienten (5 Männer, 1
Frau), die sich mit intravitrealer Einblutung zeigten, mit einzelnen
intravitrealen Injektionen von Hyaluronidase (ACS) in Dosismengen
von 50 bis 200 I.E. behandelt.
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Die
bei diesem Experiment verabreichte Hyaluronidase (ACS) wurde nach
der oben beschriebenen und in Tabelle II angegebenen bevorzugten
Formulierung zubereitet.
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Sämtliche
bei diesem Experiment behandelten Patienten hatten eine Vorgeschichte
von diabetischer Retinopathie, und es wurde festgestellt, daß sie intravitreale
Einblutungen unterschiedlicher Dauer hatten. Bei jedem Patienten
war die im Glaskörper
vorhandene Blutmenge ausreichend, um eine Betrachtung der Retina mit
funduskopischen Standardeinrichtungen zu verhindern.
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Jeder
Patient empfing eine einzige intravitreale Injektion von Hyaluronidase
(ACS). Vier (4) Patienten empfinden eine Dosis von 50 I.E., ein
(1) Patient erhielt eine Dosis von 70 I.E., und ein Patient erhielt
eine Dosis von 200 I.E.
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Die
beobachteten Ergebnisse dieses Experiments sind in 6 zusammengefaßt.
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Bei
den sechs (6) in diesem Beispiel behandelten Patienten wurde der
die Einblutung aufweisende Glaskörper
ausreichend klar, um innerhalb von 6 bis 16 Tagen nach der einzigen
intravitrealen Injektion der Hyaluronidase (ACS) eine transvitreale
Betrachtung der Retina zu ermöglichen.
Es wurde subjektiv festgestellt, daß diese Klärung des Glaskörpers deutlich
rascher als diejenige auftrat, die ohne Hyaluronidase-Behandlung
bei diesen Patienten zu erwarten gewesen wäre.
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Die
vorstehende genaue Beschreibung, die Beispiele und die begleitenden
Figuren beschreiben die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf
bestimmte derzeit bevorzugte Ausführungsformen. Für den Fachmann
auf dem Gebiet ist ersichtlich, daß zahlreiche Abweichungen von
den beschriebenen speziellen Ausführungsformen und Formulierungen
vorgenommen werden können,
ohne vom Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen.