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Diese
Erfindung betrifft ein Pflanzengen, das das Biotincarboxyl-Trägerprotein
(BCCP) spezifiziert, eine Untereinheit von Acetyl-Coenzym A-Carboxylase (ACCase),
und mit dem Gen genetisch transformierte Pflanzengenome. Insbesondere,
aber nicht ausschließlich,
betrifft die Erfindung ACCase – BCCP-Gene
aus Pflanzen der Brassica-Arten, speziell Brassica napus (Ölraps),
und die Steuerung der Expression des Gens in Brassica-Pflanzen, die genetisch
mit dem Gen, einem Teilgen oder seiner antisense-Konfiguration transformiert sind.
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Zwei
prinzipielle Methoden zur Steuerung der Expression sind bekannt.
Diese werden fachlich als "antisense-Abregulation" und "sense-Abregulation" oder "Kosuppression" bezeichnet. Beide
Methoden führen
zu einer Inhibierung der Expression des Zielgens. Überexpression
wird durch Insertion einer oder mehr als einer zusätzlichen
Kopie des ausgewählten
Gens erreicht. Andere, weniger häufig
verwendete Methoden beinhalten die Modifikation der genetischen
Kontrollelemente, der Promotor- und Kontrollsequenzen, um eine größere oder
geringere Expression eines inserierten Gens zu erreichen.
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Bei
der antisense-Abregulation wird eine DNA, die komplementär zum gesamten
oder einem Teil des Zielgens ist, in das Genom in umgekehrter Orientierung
und ohne sein Translationsstartsignal inseriert. Die einfachste
Theorie besagt, dass ein solches antisense-Gen, das transkribierbar,
aber nicht translatierbar ist, mRNA erzeugt, die in der Sequenz
komplementär
mit dem mRNA-Produkt ist, das aus dem endogenen Gen transkribiert
wird: diese antisense-mRNA bindet dann mit der natürlich erzeugten "sense"-mRNA unter Bildung eines
Duplex, der die Translation der natürlichen mRNA zu Protein inhibiert.
Es ist nicht notwendig, dass das inserierte antisense-Gen die gleiche
Länge wie
die endogene Gensequenz hat: ein Fragment ist ausreichend. Die Größe des Fragments
scheint nicht besonders wichtig zu sein. Fragmente von nur etwa
40 Nucleotiden wurden als effektiv angegeben. Allgemein sind um
die 50 Nucleotide als ausreichend akzeptiert, um die inhibitorische
Wirkung zu erhalten. Jedoch muss gesagt werden, dass weniger Nucleotide
sehr wohl funktionieren können:
eine größere Anzahl,
bis zum Äquivalent
der vollen Länge,
wird sicherlich funktionieren. Man muss gewöhnlich einfach eine Fragmentlänge verwenden,
für die
es einen zweckmäßigen Restriktionsenzym-Spaltort
irgendwo stromabwärts
der 50 Nucleotide gibt. Die Tatsache, dass nur ein Fragment des
Gens erforderlich ist, bedeutet, dass nicht das gesamte Gen sequenziert
werden muss. Sie bedeutet ebenfalls, dass üblicherweise eine cDNA ausreichen
wird, wodurch die Notwendigkeit zur Isolierung der vollen Genomsequenz
vermieden wird.
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Das
antisense-Fragment braucht nicht genau das gleiche wie der endogene
komplementäre
Strang des Zielgens sein. Es muss einfach ausreichend Sequenzähnlichkeit
bestehen, um die Inhibierung des Zielgens zu erreichen. Dies ist
ein wichtiges Merkmal der antisense-Technologie, da es die Verwendung
einer Sequenz erlaubt, die aus einer Pflanzenart stammt, um in einer
anderen wirksam zu sein, und die Notwendigkeit vermeidet, antisense-Vektoren für jede individuelle
interessierende Art zu konstruieren. Obwohl aus einer Art isolierte
Sequenzen wirksam in einer anderen sein können, findet man nicht selten
Ausnahmen, in denen der Grad der Sequenzähnlichkeit zwischen einer Art
und der anderen unzureichend für
den Erhalt der Wirkung ist. In solchen Fällen kann es notwendig sein,
das artspezifische Homologe zu isolieren.
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Die
antisense-Abregulationstechnologie ist fachlich gut etabliert. Sie
ist Gegenstand verschiedener Lehrbücher und vieler hunderter wissenschaftlicher
Veröffentlichungen.
Die hauptsächliche
Patentstelle ist
EP 0 240 208 im
Namen von Calgene Inc. Es gibt keinen Grund, an der Funktionsfähigkeit
der antisense-Technologie zu zweifeln. Sie ist allgemein etabliert,
wird routinemäßig in Laboratorien
weltweit verwendet, und Produkte befinden sich auf dem Markt, in
denen sie verwendet wird.
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Sowohl
die Überexpression
als auch Abregulation werden durch die "sense"-Technologie erreicht. Falls eine Kopie
voller Länge
des Zielgens in das Genom inseriert wird, dann werden eine Reihe
von Phänotypen
erhalten, von denen einige das Zielgen überexprimieren und einige das
Zielgen unterexprimieren. Eine durch diese Methode erzeugte Population
von Pflanzen kann dann durchmustert und individuelle Phänotypen isoliert
werden. Wie mit antisense fehlt der inserierten Sequenz ein Translationsstartsignal.
Eine andere Ähnlichkeit
gegenüber
antisense besteht darin, dass die inserierte Sequenz keine Kopie
voller Länge
sein muss. Tatsächlich
wurde festgestellt, dass die Verteilung von über- und unterexprimierenden
Phänotypen
zu Gunsten der Unterexpression verzerrt ist und dies vorteilhaft
ist, wenn die Geninhibierung der gewünschte Effekt ist. Zur Überexpression
ist es bevorzugt, dass die inserierte Kopie des Gens ihr Translationsstartcodon
behält.
Die Hauptpatentstelle zur Kosuppression ist
EP 0 465 572 (DNA Plant Technology
Inc.). Es gibt keinen Grund, an der Funktionsfähigkeit der sense/Kosuppressionstechnologie
zu zweifeln. Sie ist allgemein etabliert, wird routinemäßig in Laboratorien
weltweit verwendet, und Produkte sind auf dem Markt, in denen sie
verwendet wird.
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Die
sense- und antisense-Genregulation wird von Bird und Ray in Biotechnology
and Genetic Engineering Reviews 9:207-227 (1991) rezensiert. Die
Verwendung dieser Techniken zur Kontrolle ausgewählter Gene in der Tomate wurde
von Gray et al. beschrieben, Plant Molecular Biology, 19:69-87 (1992).
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Die
Genkontrolle durch jede der beschriebenen Methoden erfordert die
Insertion der sense- oder antisense-Sequenz, mit geeigneten Promotoren
und Terminationssequenzen, die Polyadenylierungssignale enthalten,
in das Genom der Zielpflanzenart durch Transformation, gefolgt von
Regeneration der Transformanten zu ganzen Pflanzen. Es ist wahrscheinlich
akzeptabel zu sagen, dass Transformationsmethoden für die meisten
Pflanzenarten existieren oder durch Anpassung verfügbarer Methoden
erhalten werden können.
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Für zweikeimblättrige Pflanzen
ist die am meisten verwendete Methode die Agrobacterium-vermittelte Transformation.
Diese ist die am besten bekannte, am weitestgehenden untersuchte
und deshalb am besten verstandene aller Transformationsmethoden.
Das Rhizobacterium Agrobacterium tumefaciens oder das verwandte
Agrobacterium rhizogenes enthält
bestimmte Plasmide, die in der Natur die Bildung von Krankheitssymptomen,
Wurzelhalsgallen oder Haarwurzeltumoren in Pflanzen verursachen,
die mit dem Bakterium infiziert sind. Ein Teil des durch Agrobacterium
in der Pathogenese eingesetzten Mechanismus besteht darin, dass
ein Abschnitt von Plasmid-DNA, der durch rechte und linke Grenzregionen
gebunden ist, stabil in das Genom der infizierten Pflanze überführt wird.
Falls deshalb Fremd-DNA in die sogenannte "Transfer"-Region (T-Region) als Substitution
für die
normalerweise darin vorhandenen Gene inseriert wird, dann wird das
Fremdgen in das Pflanzengenom übertragen
werden. Es gibt viele hunderte Literaturstellen in der wissenschaftlichen Literatur,
in Lehrbüchern
und in Patenten, und die Methodik ist allgemein etabliert.
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Die
Wirksamkeit von Agrobacterium ist auf den Wirtebereich des Mikroorganismus
beschränkt
und ist somit mehr oder weniger auf zweikeimblättrige Pflanzenarten beschränkt. Allgemein
sind einkeimblättige
Arten, die die wichtigen Getreidearten einschließen, nicht zugänglich für die Transformation
durch die Agrobacterium-Methode. Verschiedene Methoden zur direkten
Insertion von DNA in den Kern von einkeimblättrigen Zellen sind bekannt.
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In
der ballistischen Methode werden Mikropartikel aus dichtem Material,
gewöhnlich
Gold oder Wolfram, mit hoher Geschwindigkeit auf die Zielzellen
geschossen, wo sie die Zellen durchdringen, wodurch eine Öffnung in
der Zellwand geschaffen wird, durch die DNA eintreten kann. Die
DNA kann auf die Mikropartikel aufgetragen werden oder kann zum
Kulturmedium gegeben werden.
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Bei
der Mikroinjektion wird die DNA durch Injektion in individuelle
Zellen über
eine ultrafeine Hohlnadel eingeführt.
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Eine
andere Methode, die sowohl auf Einkeimblättrige als auch Zweikeimblättrige anwendbar
ist, beinhaltet die Schaffung einer Suspension der Zielzellen in
einer Flüssigkeit,
das Zugeben von mikroskopischem nadelartigem Material, wie Siliciumcarbid-
oder Siliciumnitrid-"Whiskern", und das Rühren, so
dass die Zellen und Whisker kollidieren und in der Flüssigkeit
vorhandene DNA in die Zelle eintritt.
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Zusammenfassend
sind dann die Anforderungen sowohl für die sense- als auch für die antisense-Technologie
bekannt, und die Methoden, durch die die erforderlichen Sequenzen
eingeführt
werden können,
sind bekannt. Was übrig
bleibt, ist dann die Identifizierung von Genen, von deren Regulation
man eine gewünschte
Wirkung erwartet, ihre Isolation oder die Isolation eines Fragments
mit ausreichend wirksamer Länge,
die Konstruktion eines chimären
Gens, in das das effektive Fragment zwischen Promotor- und Terminationssignalen
inseriert wird, und die Insertion des Konstrukts in Zellen der Zielpflanzenart
durch Transformation. Ganze Pflanzen können dann aus den transformierten
Zellen regeneriert werden.
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Eine
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren und Material zur Modulation
der Expression der ACCase-BCCP-Untereinheit in Pflanzen bereitzustellen.
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Erfindungsgemäß wird ein
Verfahren zur Modizifierung der Kapazität der Fettsäureerzeugung einer Pflanze
bereitgestellt, das das Modulieren der Expression des Gens umfasst,
das das Acetyl-Coenyzm A-Carboxylase-Biotincarboxyl-Trägerprotein codiert.
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Die
Modulation kann die Überexpression
des Gens umfassen, was durch stabile Insertion, in das Genom der
Pflanze, einer oder mehr als einer Kopie eines exprimierbaren Genkonstrukts,
das für
das Protein codiert, erreicht werden kann.
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Andererseits
kann die Modulation die Abregulation der Expression des Gens umfassen,
was durch stabile Insertion, in das Genom der Pflanze, eines antisense-Genkonstrukts
erreicht werden kann, das eine transkribierbare DNA-Sequenz enthält, die
eine DNA umfasst, die komplementär
zur gesamten oder einem Teil der endogenen DNA-Sequenz des Gens
ist. Alternativ kann die Überexpression
durch stabile Insertion, in das Genom der Pflanze, eines sense-Genkonstrukts
erreicht werden, das eine transkribierbare DNA enthält, die ein
Fragment der endogenen DNA-Sequenz umfasst, die das Gen codiert.
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Die
Erfindung stellt ebenfalls eine DNA mit der Nucleotidsequenz bereit,
die aus ID-1, ID-2, ID-3, ID-4, ID-5 oder ID-6 und Varianten davon
ausgewählt
ist, die durch die Entartung des genetischen Codes zugelassen werden.
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Ferner
stellt die Erfindung einen Vektor bereit, der einen Genpromotor,
der in Pflanzen funktionsfähig ist,
eine transkribierbare Region, die eine DNA wie in Anspruch 7 beansprucht
umfasst, und ein Polyadenylierungssignal umfasst.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein rekombinantes Pflanzengenom
bereit, das eine oder mehrere der DNAs umfasst.
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Acetyl-Coenzym
A-Carboxylase ist ein Schlüsselenzym
im Stoffwechsel zur Synthese von Fettsäuren, die die Komponenten des Öls von ölerzeugenden
Kulturpflanzen wie Ölraps
sind. Es ist dieses Enzym, das den Stoffwechselweg einleitet, wobei
der Vorläufer – Acetyl-CoA – der Fettsäure-Biosynthese übergeben
wird, indem er zu Malonyl-CoA durch eine Carboxylierungsreaktion
umgewandelt wird.
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Acetyl-Coenzym
A-Carboxylase (ACCase) aus E. coli ist ein dissoziierbares Enzym
mit mehreren Untereinheiten, das aus Biotincarboxylase- und Biotincarboxyl-Trägerprotein-(BCCP)-Untereinheiten
und Carboxyltransferase-α- und -β-Untereinheiten
zusammengesetzt ist. In Säugetieren
ist das ACCase-Enzym jedoch nur aus einem Polypeptid zusammengesetzt,
das alle drei funktionellen Domänen
enthält.
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In
Pflanzen sind beide Formen von ACCase vorhanden. Ein 220kDa ACCase-Polypeptid,
das alle drei funktionellen Domänen
enthält,
wurde aus Pflanzengeweben gereinigt und die entsprechenden Gene
aus Quellen wie Raps, Weizen und Arabidopsis kloniert. Zusätzlich wurde
ein Gen mit signifikanter Sequenzhomologie mit der β-Untereinheit
von E. coli-Transcarboxylase aus der Erbse kloniert (Sasaki et al.,
1993). Dieses Gen wurde aus Chloroplasten-DNA isoliert. Eine dissoziierbare
ACCase mit mehrfachen Untereinheiten ist daher in Pflanzenplastiden
vorhanden. Während
das Gen der Transcarboxylase-β-Untereinheit
durch Chloroplasten codiert wird, werden die Transcarboxylase-α-Untereinheit,
die Biotincarboxylase-Untereinheit und die BCCP-Untereinheit alle
im Kern codiert. Transkripte aus den letzteren Genen werden daher
im Cytosol translatiert und die Polypeptide in die Plastide aufgrund
der Gegenwart von Plastid-gerichteten Transitpeptidsequenzen aufgenommen.
Während
Techniken zur Abregulation der Expression des Chloroplasten-codierten Transcarboxylasegens
noch nicht verfügbar
sind, ist es möglich,
die Expression der Kern-codierten Untereinheiten durch die nachfolgend
beschriebene antisense- oder partielle sense-Technologie abzuregulieren.
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Diese
Erfindung betrifft hauptsächlich
Gene, die die Biotincarboxyl-Trägerprotein-(BCCP)-Untereinheit der
dissoziierbaren Pflanzen-ACCase codieren. Eine Aufgabe der Erfindung
ist es, ein Gen bereitzustellen, das ACCase-BCCP-Untereinheiten
in Pflanzen spezifiziert. Die Abregulation der Expression dieses
Gens durch antisense- oder partielle sense-Technologien wird eine
Abregulation der gesamten, in Pflanzenplastiden vorhandenen ACCase-Enzymaktivität verursachen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ebenfalls genetisch transformierte
Pflanzen, Pflanzenzellen und Pflanzenteile bereit, die eine DNA
der Erfindung oder ein Fragment davon in der sense-Orientierung
oder eine vollständige
oder teilweise sense- oder antisense-Variante davon enthalten.
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Es
ist bevorzugt, dass die Pflanze eine Art ist, die substantielle
Mengen von Öl
anstelle von Stärke erzeugt.
Solche Pflanzenarten sind allgemein bekannt und werden einfach als "Ölsaat-Kulturpflanzen" bezeichnet und schließen u.a. Ölraps, Canola,
Soja, Sonnenblume, Mais und Ölpalme
ein (worin das Öl
sowohl im Samen- als auch im Fruchtgewebe gespeichert wird). Verfahren
zur genetischen Transformation vieler Ölsaaten sind bekannt: z.B.
sind Verfahren der Transformation durch Agrobacterium tumefaciens
für die
meisten geeignet. Solche Verfahren sind in der Literatur gut beschrieben
und sind fachlich gut bekannt und werden umfangreich praktiziert.
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In
unserer Internationalen Patentanmeldung WO 92/19747, veröffentlicht
am 12. November 1992, beschreiben wir die Biosynthese von Polyhydroxybutyrat
aus dem Substrat Acetyl-CoA. Diese Aktivität beinhaltet drei enzymkatalysierte
Schritte. Die drei beteiligten Enzyme sind β-Ketothiolase, NADP-gebundene
Acetoacetyl-CoA-Reduktase und Polyhydroxybutyratsynthase, wobei
die Gene dafür
aus Alcaligenes eutrophus kloniert wurden (Schubert et al., 1988,
J. Bacteriol., 170). In unserer Internationalen Anmeldung beschreiben
wir die Klonierung dieser drei Gene in ölsynthetisierende Pflanzen.
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Jedoch
nutzt die Synthese von Fettsäuren,
die die Bausteine von Pflanzenölen
sind, das Substrat Acetyl-Coenzym A, das das gleiche Substrat ist,
das von den Polyhydroxyalkanoatgenen gefordert wird. Durch die vorliegende
Erfindung stellen wir Mittel zur Abregulation der Fettsäuresynthese
durch Reduzierung der Expression von ACCase bereit, wodurch das
Acetyl-CoA für
die Umwandlung zu Polyhydroxyalkanoaten verfügbar bleibt.
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Verfahren
zur Regulation der Genexpression sind allgemein fachbekannt. Zwei
prinzipielle Verfahren werden üblicherweise
eingesetzt, wobei diese frei als "sense"- und "antisense"-Regulation bezeichnet werden. In der
antisense-Regulation wird ein Genkonstrukt aufgebaut, das bei Insertion
in eine Pflanzenzelle zur Expression einer Boten-RNA führt, die
die komplementäre
Sequenz zum durch ein Zielgen erzeugten Boten hat. Die Theorie besagt,
dass die komplementären
RNA-Sequenzen einen Duplex bilden, wodurch die Translation zu Protein
inhibiert wird. Die komplementäre
Sequenz kann eine äquivalente
Länge zur
vollständigen
Sequenz des Zielgens haben, aber ein Fragment ist gewöhnlich ausreichend
und ist zweckmäßiger zu
handhaben. Bei der sense-Regulation wird eine Kopie des Zielgens
in das Pflanzengenom inseriert. Wieder kann dies eine Sequenz voller
Länge oder
eine Teilsequenz sein. Eine Reihe von Phänotypen wird erhalten, aus
denen Individuen, in denen die Expression des durch das Zielgen
codierten Proteins inhibiert ist, identifiziert und isoliert werden
können,
ebenso wie Individuen, in denen die Expression des Genprodukts erhöht ist.
Die sense-Regulation unter Verwendung von Teilsequenzen neigt die
Inhibierung zu begünstigen.
Der Mechanismus wird nicht gut verstanden. Wir verweisen auf
EP 0 140 308 und US-PS 5
107 065, die beide die antisense-Regulation betreffen, und WO 90/12089,
das die sense-Regulation beschreibt. Die Erfindung erlaubt die Durchführung der
folgenden genetischen Modifikationen:
- 1. Die
Klone der Erfindung können
verwendet werden, um pflanzliche DNA (genomische oder cDNA-Bibliotheken)
zu sondieren, um homologe Sequenzen zu erhalten. Diese können trunkierte
cDNAs oder DNAs voller Länge
oder genomische DNAs für
ACCase-BCCP-Untereinheiten-Gene aus z.B. Weizen oder Ölsaaten,
wie Raps, Canola, Soja, Sonnenblume, Mais, Ölpalme und Kokosnuss, sein.
- 2. cDNAs von Rapssamen-ACCase-BCCP-Untereinheit können in
Verbindung mit einem durch eine Pflanze erkannten Promotor verwendet
werden, um eine Expressionskassette (partiell, sense oder antisense) zur
Verwendung in der Transformation von Rapspflanzen zu schaffen, um
die Erzeugung der ACCase-BCCP-Untereinheit abzuregulieren. Dies
wird Pflanzen mit einer verringerten ACCase-Aktivität ergeben.
Solche Pflanzen werden einen niedrigeren Ölgehalt oder ein Öl veränderter
Qualität
besitzen. Die gleiche Kassette kann verwendet werden, um die Produktion
von ACCase-BCCP-Untereinheit in anderen Pflanzen der Brassica-Arten
abzuregulieren. BCCP-cDNAs, die aus anderen Nutzpflanzen isoliert
werden, können
zur Schaffung von Expressionskassetten (partiell, sense oder antisense)
zur Verwendung in der Transformation dieser Nutzpflanzen verwendet
werden, um den Ölgehalt
zu modifizieren.
Die Abregulation der Ölsynthese (in Raps oder anderen Ölsaaten)
kann verwendet werden, um das Substrat, Acetyl-Coenzym A, in die
Synthese alternativer Speicherstoffe abzuleiten, wie Stärke, Protein
oder neue Polymere, die durch genetische Modifikation eingeführt werden,
z.B. Polyhydroxyalkanoate.
- 3. cDNAs voller Länge
oder genomische DNAs von Raps-ACCase-BCCP-Untereinheiten oder cDNAs voller Länger oder
genomische DNAs von ACCase-BCCP-Genen
aus anderen Ölsaaten
können
in Verbindung mit ihren endogenen Promotoren oder mit alternativen,
von einer Pflanze erkannten Promotoren verwendet werden, um neue
Expressionskassetten zu schaffen. Bei Transformation in Rapspflanzen
oder Pflanzen anderer Ölsaaten
könnten
diese Kassetten den Gesamtexpressionsgrad von BCCP erhöhen oder die
Expressionsperiode von BCCP im sich entwickelnden Samen (oder in
der Frucht) verlängern.
Solche Strategien könnten
zur Erhöhung
des Gehalts von Öl
führen,
das von dem Samen oder der Frucht gespeichert wird.
- 4. Genomische DNAs von Raps-ACCase-BCCP-Untereinheit können zur
Gewinnung des Promotors des ACCase-BCCP-Gens verwendet werden. Dieser
Promotor kann verwendet werden, um RNA in einer gewebespezifischen
und entwicklungsmäßig regulierten
Weise zu erzeugen. Der so erzeugte Promotor kann die Expression
von ACCase fördern
oder kann die Expression eines dahinter plazierten Genkonstrukts steuern
(z.B. das Strukturgen eines unterschiedlichen Enzyms), das dann
spezifisch im sich entwickelnden Samen exprimiert wird.
- 4. Die cDNA voller Länge
und genomische DNA von Raps-ACCase-BCCP-Untereinheit enthält eine Sequenz zwischen dem
Translationsstart und der N-terminalen Sequenz des reifen Proteins,
bekannt als "Transitpeptid"-Sequenz. Diese richtet das Genprodukt
auf die Plastide und wird während
des Imports des Proteins in die Plastide abgespalten. Diese Transitpeptidsequenz
kann in Genfusionen verwendet werden, um unterschiedliche Genprodukte
auf die Plastide auszurichten.
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Wir
haben eine Poly-dT-Primer-unterstütze cDNA-Bibliothek hergestellt,
die aus PolyA+-Schwanz-mRNA aus sich entwickelndem Rapskeimling stammt.
Die Durchmusterung einer Genbank-Datenbank zeigte eine Arabidopsis-cDNA, die eine Homologie
mit dem accB-Gen (BCCP-Untereinheit) aus E. coli zeigte. Die cDNA
wurde erhalten und ein 600bp-Insert isoliert. Dieses wurde verwendet,
um die Rapskeimling-cDNA-Bibliothek zu sondieren. cDNA-Klone pBP1,
pBP2, pBP3 und pBP7 partieller Länge,
die Rapssamen-ACCase-BCCP-Untereinheit
spezifizieren, wurden dadurch selektiert. BCCP-cDNA-Klone pBP4 und pBP6
voller Länge
wurden ebenfalls identifiziert. Dass die Klone tatsächlich aus
der ACCase-Untereinheit waren, wurde durch die Tatsache bestätigt, dass
die Nucleotidsequenzen und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen
eine substantielle Homologie mit den E. coli- und Anabaena accB-(BCCP-Untereinheit)-Genen
zeigten.
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Die
Klone pBP1, pBP2, pBP3 und pBP7 wurden bei der National Collection
of Industrial and Marine Bacteria, 23 St Machar Drive, Aberdeen,
AB2 IRY am 1. Februar 1995 hinterlegt: die Eingangsnummern sind NCIMB
40707, 40748, 40706 bzw. 40705.
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Die
Erfindung wird jetzt unter Bezugnahme auf die folgenden Sequenzen
beschrieben, worin gilt:
- SEQ ID NO:1 zeigt die DNA-Sequenz
des cDNA-Inserts von pBP1. Die Sequenz enthält eine mutmaßliche Biotin-Bindungsstelle
von Basen 478 bis 493.
- SEQ ID NO:2 ist die DNA-Sequenz des cDNA-Inserts von pBP2. Die
Sequenz enthält
eine mutmaßliche
Biotin-Bindungsstelle von Basen 91 bis 106.
- SEQ ID NO:3 ist die DNA-Sequenz des cDNR-Inserts von pBP3.
- SEQ ID NO:4 ist die DNA-Sequenz des cDNA-Inserts von pBP4.
- SEQ ID NO:5 ist die DNA-Sequenz des cDNA-Inserts von pBP6.
- SEQ ID NO:6 ist die DNA-Sequenz des cDNA-Inserts von pBP7.
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Ergebnisse
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Northern-Blot-Analyse
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Zur
Isolierung der cDNA, die die Raps-BCCP-Untereinheit codiert, aus
der Multi-Untereinheitform von ACCase benötigten wir eine Hybridisierungssonde.
Eine Datenbank war erhältlich,
die Sequenzen aus Arabidopsis EST-cDNAs enthielt. Nach Durchmustern der
GenBank-Datenbank wurde eine Sequenz identifiziert, die Homologie
mit dem accB-Gen (BCCP-Untereinheit) aus E. coli zeigte. Unter Verwendung
des cDNA-Klons VCVDE 11 3' (GenBank
ID Z25714), erhalten aus dem Arabidopsis Biological Resource Center
an der Ohio State University, isolierten wir das 600 bp-Insert.
Zur Überprüfung, ob
das Gen tatsächlich
in Raps vorhanden war, und zur Bestimmung der Transkriptgröße voller
Länge wurde
die Sonde zur Hybridisierung mit einem Northern Blot von Raps-PolyA+-Schwanz-mRNR
verwendet. Es wurde gezeigt, dass die dominante hybridisierende
Bande eine Größe von 1,3
kb hatte. Während
der Embryogenese war der Grad des Transkripts ursprünglich hoch,
stieg weiter zu einem Scheitelpunkt im mittleren Stadium, gefolgt
von einem großen
Einschnitt in der Expression in den späteren Stadien. Ein viel höherer Grad
des Transkripts war im Keimling und in der Wurzel als in den Blättern vorhanden
(ca. 20:1).
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Zur
Untersuchung der mRNA-Expression der BCCP-Gene, von denen angenommen
wird, dass sie in der de novo-Speicherlipidsynthese beteiligt sind,
wurde ein Entwicklungs-Northern-Blot durchmustert. Jede Spur des
Blots besaß eine
gleiche Menge von Poly(A)+-mRNA in Wurzel, Blatt oder Embryo aus
unterschiedlichen Stadien der B. napus-Embryogenese. Die Ergebnisse
zeigten, dass während
der Embryogenese die BCCP-mRNA-Expression steil anstieg, wobei im
mittleren Bereich der Embryogenese ein Scheitelwert auftrat. Obwohl
es eine merkliche Menge von BCCP-mRNA in der Wurzel gab, bestand
eine vergleichsweise niedrige Menge im Blatt.
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cDNA-Klonierung
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Die
Northern-Blot-Daten legen nahe, dass eine aus Raps-Poly(A)+-Schwanz-mRNA stammende Raps-Keimling-cDNA-Bibliothek
die geeignetste zur Durchmusterung auf einen BCCP-Klon war. Circa
150.000 rekombinante Plaques wurden durchmustert. Die hybridisierenden
Plaques wurden durch drei Runden der Durchmusterung geführt, worauf
sie Plaque-rein waren.
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Anti-Biotin-Analyse
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Da
ca. 20 Klone durch 3 Runden von Durchmusterung geführt wurden,
bedurfte es einer frühen
Anzeige der Klon-Identität.
Die Bibliothek, die zur Durchmusterung verwendet wurde, wurde unter
Verwendung des Expressionsvektors λZAP II konstruiert. Es wurde
zuvor gezeigt, dass λZAP
II-Klone, die zur Expression des codierten Proteins induziert werden,
durch den E. coli-Wirt
biotinyliert werden können,
vorausgesetzt der Biotinylierungsort ist im exprimierten Protein
vorhanden. Vorausgesetzt wenigstens eines der Inserte ist im Raster
und in der richtigen Orientierung, dann könnte der Klon durch dieses
Biotinylierungsverfahren zur bevorzugten Sequenzierung identifiziert
werden. Positive Klone aus den Bibliotheksdurchmusterungen wurden zur
Expression ihres Proteins durch IPTG-Behandlung induziert und unter
Verwendung eines Peroxidase-gebundenen Streptavidin/ECL-Detektionssystems
durchmustert.
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Protein-Blot-Daten
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Die
Transkriptgröße aus der
Northern-Analyse zeigte, dass die mRNA voller Länge, die das BCCP-Protein codiert,
1,3 kb war. Dies würde
ein Polypeptid von ca. 25 kDa codieren. Zusätzlich wurde gezeigt, dass
die Expression im Embryo das ca. 20-fache derjenigen im Blatt war.
Unter Verwendung frischer Vollproteinextrakte aus Rapssamen und
-blättern
wurde ein Western-Blot unter Verwendung von Iod 125-(I125)-markiertem
Streptavidin durchgeführt,
um biotinhaltige Proteine zu identifizieren. Ein biotinhaltiges
Protein mit ca. 35 kDa wurde beobachtet, das im Rapskeimling vorhanden
war, aber nicht in Blattextrakten. Da diese Daten mit denjenigen
der Northern-Analyse übereinstimmen,
kann das Protein das Produkt des Raps-BCCP-Gens darstellen.
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Sequenzanalyse
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Positive
Klone aus den Bibliotheksdurchmusterungen wurden sequenziert. Sechs
Klone wurden identifiziert und als pBP1, pBP2, pBP3, pBP4, pBP6
und pBP7 bezeichnet.
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Die
Sequenz von pBP1 ist als SEQ ID NO:1 gezeigt. Die Sequenz enthält eine
mutmaßliche
Biotin-Bindungsstelle von Basen 478 bis 493. pBP1 zeigt eine beträchtliche
Aminosäuresequenzhomologie
mit dem BCCP-Gen von Anabaena und E. coli. Die Sequenz von pBP2
ist als SEQ ID NO:2 gezeigt. Die mutmaßliche Biotin-Bindungsstelle
ist von Basen 91 bis 106. pBP2 zeigt eine beträchtliche Aminosäurehomologie
mit pBP1. Die Sequenz von pBP3 ist als SEQ ID NO:3 gezeigt. Die
Sequenzen pBP4 und 6 sind als SEQ ID NO:4 bzw.
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SEQ
ID NO:5 gezeigt. Die Sequenz von pBP7 ist als SEQ ID NO:6 gezeigt.
pBP7 zeigt eine beträchtliche
Aminosäuresequenzhomologie
mit dem BCCP-Gen von E. coli.
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Materialien und Methoden
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Konstruktion der cDNA-Bibliothek
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i)
Die verwendete cDNA-Bibliothek wurde unter Verwendung von Poly(A)+-mRNA
erzeugt, die gemäß dem Verfahren
von Logemann et al. aus dem mittleren Stadium von sich entwickelnden
Jet neuf-Rapskeimlingen isoliert wurden (geerntet ca. 35 Tage nach
der Blüte).
Die Synthese des ersten Strangs wurde unter Verwendung von Poly-dT-Oligonucleotidprimern
gemäß den Herstelleranweisungen
durchgeführt
(Amersham International). Die resultierenden erzeugten cDNAs wurden
direktional in die EcoRI/Xhol-Orte von λ-ZAP II gemäß den Herstellerempfehlungen
(Stratagene) kloniert. Die verwendeten Wirtsbakterien waren XL-1
Blue (Stratagene).
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Sondenvorbereitung und -markierung
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cDNA-Sonden
zur Durchmusterung der Raps-Bibliotheken wurden durch entsprechende
Restriktionsendonucleaseverdauungen von Plasmid-DNA erzeugt.
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Das
erforderliche DNA-Fragment wurde von Vektor-DNA durch TAE-Agaroseelektrophorese
getrennt unter Verwendung des GeneClean II-Kits (Bio 101) oder durch
Einfrieren und Ultrafiltration isoliert.
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Die
Sonden (200–300
ng) wurden mit [α32P]-dCTP unter Verwendung des Megaprime-Kits
gemäß den Herstellerempfehlungen
(Amersham International) auf einen Gehalt von 5 × 109 cmp/μg radiomarkiert. Nicht-aufgenommene
Markierung wurde unter Verwendung von Biospin-Chromatographiesäulen (Biorad)
entfernt.
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Bibliotheksdurchmusterung
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150.000
plaquebildende Einheiten wurden wie zuvor beschrieben durchmustert.
Die Filter wurden bei 65°C
hybridisiert. "Plasmid
rescue" von cDNA-Klonen
wurde wie zuvor im Stratagene-Protokoll für "in vivo excision of pSK from λ-ZAP II" beschrieben durchgeführt.
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Sequenzierung von DNA-Klonen
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Die
Sequenzierung wurde unter Verwendung eines Applied Biosystems Inc.
373A DNA-Sequenzierungsautomaten (Durham University Sequencing Service,
Ms J. Bartley) durchgeführt.
Sowohl Vorwärts-
als auch Rückwärtsprimer
(–21m13
und M13RPI) wurden zunächst
für alle
Klone verwendet. Geschachtelte Deletionen wurden wie von Pharmacia
(d.s. Nested Deletion Kit) empfohlen erzeugt und unter Verwendung
einer Kombination aus Vorwärts-
und Rückwärtsprimern
und synthetisierten Oligonucleotidprimern sequenziert. Die Primer
wurden unter Verwendung eines 381A-DNA-Syntheseautomaten (Applied
Biosystems Inc.) hergestellt. Die Computeranalyse der DNA-Sequenz
wird unter Verwendung des SEQNET-Pakets von der SERC-Einrichtung
in Daresbury und DNA-Strider durchgeführt werden.
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Northern-Blot-Analyse
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Poly(A)+-mRNA
wurde aus entweder 5 g jungen Blättern
oder 5 g Keimlingen, die 15, 22, 29, 36, 42 und 49 Tage nach der
Blüte geerntet
wurden, unter Verwendung des empfohlenen Verfahrens vorbereitet (Pharmacia
mRNA-Reinigungskit).
1–5 μg wurden
auf ein 1% Formamid/Formaldehyd-Agarosegel zur Elektrophorse aufgetragen.
Das Northern-Blot-Verfahren wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt.
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Expression von λ-Klonen und
Biotinylierungsdetektion
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Circa
2 × 105
plaquebildende Einheiten (p.f.u.) wurden auf jeweils drei große NZYM-Platten
unter Verwendung von E. coli KW251 als Wirtsstamm plattiert; nach
Wachstum bei 42°C
bis Plaques von "Nadelstich"-Größe erscheinen
(ca. 3–4
Stunden), wurden die Platten mit Nitrocellulosefiltern (20 × 20 cm) überschichtet,
die in 10 mM IPTG vorgetränkt
worden waren, und trocknen gelassen. Das Wachstum der Plaques wurde
dann über
Nacht bei 37°C
fortgesetzt.
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Nach
Inkubation über
Nacht wurden die Filter entfernt und kurz in TBS (50 mM Tris, pH
7,5, 0,2 M NaCl, 0,5 mM CaCl2, 50 mM MgCl2) gewaschen. Die Membranen wurden für 2 h in
TBS/1 % (G/V) Hämoglobin bei
30°C, gefolgt
von weiteren 2 h in Blockierungspuffer/Peroxidase-gebundenem Streptavidin
(Sirotech) geblockt. Die Membranen wurden dann umfassend in TBS/0,05
% Tween 20 bei Raumtemperatur gespült.
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Das
ECL-Visualisierungssystem wurde zur Identifizierung positiver Klone
wie vom Hersteller (Amersham) beschrieben verwendet.
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Herstellung von Rohextrakten
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Frisches
Pflanzenmaterial wurde in flüssigem
Stickstoff eingefroren und gefroren mit Mörser und Pistill gemahlen.
Das resultierende feine Pulver wurde in Eppendorf-Röhrchen gegeben
und mit 4 Volumina XI-Probenbeladungspuffer versetzt. Die Aufschlämmung wurde
mittelbar für
5 min gekocht und für
10 min in einer Labortisch-Mikrofuge-Zentrifuge zentrifugiert. Der Überstand
wurde entfernt und bei –80°C in Teilmengen
gelagert. Proteinproben wurden bis zu 2 Monate nach der Herstellung
verwendet.
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Western Blotting
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Nach
SDS-PAGE wurden die Proteine auf ProBlot (ABI) durch halbtrockenes
Blotten geblottet. Markerproteine wurden durch Ponceau-Anfärbung gemäß den Herstelleranweisungen
lokalisiert. Die Membranen wurden mit 1 % Hämoglobin, 20 mM Tris, pH 7,2,
170 mM NaCl für
1 h unter konstantem Vermischen blockiert. 125I-gebundenes
Streptavidin wurde mit einem 1:200-Verhältnis hinzugegeben und bei
Raumtemperatur über Nacht
inkubiert. Der Blot wurde umfassend mit 0,2 % Nonidet P40, Blockierungslösung mit
mehreren Wechseln von Waschlösung über 1 h
gewaschen. Mit dem Blot wurde Röntgenfilm
für 1–7 Tage
belichtet.
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Die
Western Blots lieferten Ergebnisse, die die BCCP-Gehalte anzeigen.
In Abwesenheit spezifischer BCCP-Antikörper, und weil BCCP in vivo
biotinyliert wird, wurde Biotin-spezifisches Antiserum verwendet,
um Biotin-spezifische Antikörper
zu erzeugen. Hämcyanin
der Schlüssellochnapfschnecke
wurde mit Biotin beschichtet und als Antigen in Kaninchen verwendet.
Zur Minimierung falscher Hintergrundsignale auf dem Western Blot
wurden alle erzeugten Antikörper
affinitätsgereinigt.
Dies wurde durch Säulenchromatographie
an einer Biotin-Agarose-Matrix erreicht. Die theoretischen Größen der
BCCP-Proteinbanden wurden zu 22,7 kDa und 21,9 kDA aus den längsten Klonen
vorhergesagt, die SEQ ID NO:9 und SEQ ID NO:5 sind. Frühere Arbeiten,
die die prokaryotischen BCCP-Studien beschreiben, zeigten jedoch,
dass die Prolin/Alanin-reiche Region von E. coli-BCCP eine SDS-Gel-Anomalie überträgt. Das
Protein läuft
mit 35 % weniger Mobilität
als aus der Sequenz vorhergesagt. Da die B. napus-BCCP-Sequenz ebenfalls
eine ähnliche
Prolin/Alanin-reiche Region enthält,
konnte das genaue Molekulargewicht nicht aus der SDS-Gelbeweglichkeit
vorhergesagt werden. Experimente unter Verwendung der Antikörper haben
gezeigt, dass das eine biotinylierte Protein in Erbsen-Chlorplasten
die 35 kDa BCCP-Untereinheit von ACCase war. Ähnlich zeigten Western Blots
von B. napus-Chloroplastenproteinen, dass nur ein biotinyliertes
Protein innerhalb des Chloroplasten verbleibt. Es ist daher höchst wahrscheinlich,
dass die auf den Western Blots der B. napus-Wurzel-, -Blatt- und
-Keimlingsextrakte gezeigten 35 kDa-Banden BCCP sind. Die Reinigung
von Plastiden aus Rapssamenkeimlingen zeigten ebenfalls, dass sich
das biotinylierte Polypeptid innerhalb des Plastids befindet. Außerdem waren
die BCCP-Gehalte niedrig sowohl in der Wurzel als auch im Blatt
im Vergleich mit demjenigen im Keimling, obwohl die gleichen Proteinmengen
zunächst
auf die Gele aufgetragen wurden.
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