ES2227602T3 - Gen de una planta que codifica la proteina portadora de biotin carboxilasa de acetil coenzima a carboxilasa. - Google Patents
Gen de una planta que codifica la proteina portadora de biotin carboxilasa de acetil coenzima a carboxilasa.Info
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Abstract
LA CAPACIDAD DE UNA PLANTA PARA PRODUCIR ACIDOS GRASOS ESTA MODULADA POR EL CONTROL DE LA EXPRESION DE UN GEN QUE ESPECIFICA LA PROTEINA PORTADORA DE ACETIL COA CARBOXILASA DE BIOTINCARBOXILO. LA MODULACION PUEDE INCLUIR EL AUMENTO DE LA EXPRESION DEL GEN POR INSERCION DE COPIAS ADICIONALES EN EL GENOMA O INHIBIENDO SU EXPRESION POR LA INSERCION DE UN VECTOR ANTISENTIDO O DE COSUPRESION DIRIGIDO CONTRA EL GEN ENDOGENO.
Description
Gen de una planta que codifica la proteína
portadora de biotin carboxilasa de acetil Coenzima A
carboxilasa.
Esta invención se refiere a un gen de una planta
que especifica la proteína portadora de carboxilo biotina (BCCP, del
inglés "biotin carboxil carrier protein"), una subunidad de la
acetil Coenzima A carboxilasa (ACCasa) y a genomas de planta
genéticamente transformados con dicho gen. Particularmente, pero no
exclusivamente, la invención se refiere a genes BCCP ACCasa
procedentes de plantas de la especie Brassica, especialmente
Brassica napus (colza para aceite) y al control de la
expresión del gen en plantas de la familia Brassica que son
transformadas genéticamente con el gen, con un gen parcial o con su
configuración antisentido.
Se conocen dos métodos principales para el
control de la expresión. Son conocidos en la técnica como
"regulación a la baja antisentido" (antisense downregulation) y
"regulación a la baja sentido" (sense downregulation) o
"cosupresión". Ambos métodos conducen a una inhibición de la
expresión del gen objetivo. Se alcanza la sobreexpresión mediante
la inserción de una o más copias extra del gen seleccionado. Otros
métodos menos utilizados incluyen la modificación de elementos de
control genético, del promotor y de las secuencias de control, para
alcanzar una mayor o una menor expresión de un gen insertado.
En la regulación a la baja antisentido, se
inserta un ADN, que es complementario a todo o a una parte del gen
objetivo, en el genoma con orientación invertida y sin su señal de
iniciación de la traducción. La teoría más sencilla es que dicho
gen antisentido, que es transcribible pero no traducible, produce
mARN que es complementario en secuencia al producto de mARN
tránscrito a partir del gen endógeno: a continuación ese mARN
antisentido se une con el mARN "sentido" producido de forma
natural para formar un dúplex que inhibe la traducción del mARN
natural a la proteína. No es necesario que el gen antisentido
insertado sea de la misma longitud que la secuencia de gen
endógena: un fragmento es suficiente. El tamaño del fragmento no
parece ser especialmente relevante. Se sabe que fragmentos tan
pequeños como de más o menos 40 nucleótidos son eficaces.
Generalmente, cualquier valor en la zona de 50 nucleótidos es
aceptado como suficiente para obtener el efecto inhibidor. Sin
embargo, debe decirse que un número de nucleótidos puede funcionar
muy bien: un número mayor, hasta el equivalente a la longitud
completa, funcionará con total seguridad. Normalmente, se usa
sencillamente una longitud de fragmento para la que existe una
posición de ruptura de enzima de restricción conveniente en
cualquier posición por debajo de los 50 nucleótidos. El hecho de
que sólo se requiere un fragmento del gen significa que no se
necesita secuenciar todo el gen. También significa que, comúnmente,
un cADN será suficiente, evitando la necesidad de aislar la
secuencia genómica completa.
El fragmento antisentido no tiene por qué ser
precisamente el mismo que la cadena complementaria endógena del gen
objetivo. Simplemente tiene que haber suficiente similitud de
secuencia como para alcanzar la inhibición del gen objetivo. Esta
es una característica importante de la tecnología antisentido,
puesto que permite que el uso de una secuencia que ha sido derivada
a partir de una especie vegetal sea eficaz en otra, y evita la
necesidad de construir vectores antisentido para cada especie
individual de interés. Aunque las secuencias aisladas a partir de
una especie pueden ser eficaces en otra, no es extraño encontrar
excepciones en las que el grado de similitud de secuencia ente una
especie y la otra no es suficiente para obtener el efecto. En
dichos casos, puede ser necesario aislar el homólogo específico
para dicha especie.
La tecnología de regulación a la baja antisentido
está bien definida en la técnica. Es el tema principal de varios
libros de textos y de muchos cientos de publicaciones en revistas.
La principal referencia de patentes es la Patente Europea Nº
240.208 a nombre de Calgene Inc. No existe razón alguna para dudar
de la operabilidad de la tecnología antisentido. Está bien
establecida, es usada de forma rutinaria en laboratorios de todo el
mundo y en el mercado existen productos en los que es usada.
Tanto la sobreexpresión como la regulación a la
baja se alcanzan mediante tecnología "sentido". Si se inserta
una copia de longitud completa del gen objetivo en el genoma,
entonces se obtiene una variedad de fenotipos, algunos
sobreexpresando el gen objetivo, algunos subexpresándolo. A
continuación, se puuede monitorizar una población de plantas
producidas mediante este método y se pueden aislar fenotipos
individuales. Como con el antisentido, la secuencia insertada carece
de señal de iniciación de la traducción. Otra similitud con el
antisentido es que la secuencia insertada no tiene por qué ser una
copia de longitud completa. De hecho, se ha descubierto que la
distribución de fenotipos que sobreexpresan y que subexpresan se
decanta a favor de la subexpresión y esto es ventajoso cuando el
efecto deseado es la inhibición del gen. Para la sobreexpresión, es
preferible que el gen copia insertado retenga su codón de
iniciación de la traducción. La principal referencia de patentes
sobre la cosupresión es la Patente Europea 465.572 a nombre de DNA
Plant Technology Inc. No existe ninguna razón para dudar de la
operabilidad de la tecnología de cosupresión/sentido. Está bien
establecida, se usa de forma rutinaria en laboratorios de todo el
mundo y en el mercado existen productos en los que es usada.
La regulación de genes sentido y antisentido es
revisada por Bird y Ray en Biotechnology and Genetic Engineering
Reviews 9: 207-227 (1991). El uso de estas técnicas
para controlar genes seleccionados en el tomate ha sido descrito por
Gray y col., Plant Molecular Biology, 19: 69-87
(1992).
El control de genes mediante cualquiera de los
métodos descritos requiere la inserción de la secuencia sentido o
antisentido, con promotores apropiados y con secuencias de
terminación que contienen señales de poliadenilación, en el genoma
de la especie vegetal objetivo mediante transformación, seguida de
la regeneración de los transformantes en plantas completas.
Probablemente es justo mencionar que existen métodos de
transformación para la mayoría de las especiess de plantas, o que
pueden se obtenidos por adaptación de otros métodos disponibles.
Para las plantas dicotiledóneas, el método más
ampliamente usado es la transformación mediada por Agrobacterium.
Este el mejor conocido, más ampliamente estudiado y, por tanto,
mejor comprendido de todos los métodos de transformación. La
rizobacteria Agrobacterium tumefaciens, o los rizogenes de
Agrobacterium relacionados, contienen ciertos plásmidos que, en la
naturaleza, provocan la formación de síntomas de enfermedad,
enfermedad de crown gall o tumores de raíz vellosos, en plantas que
son infectadas por la bacteria. Parte del mecanismo empleado por la
Agrobacterium en la patogénesis es que una sección de plásmido de
ADN que está unida por regiones frontera a derecha y a izquierda es
transferida establemente al genoma de la planta infectada. Por lo
tanto, si se inserta un ADN extraño en la así denominada región de
"transferencia" (región T) en sustitución de los genes
normalmente presentes allí, ese gen extraño será transferido al
genoma de la planta. Existen muchos cientos de referencias en la
bibliografía de revistas científicas, en libros de texto y en
patentes, y la metodología está bien establecida.
La eficacia de la Agrobacterium está limitada al
rango de hospedantes de los microorganismos y, por tanto, está
limitada más o menos a especies vegetales dicotiledóneas. En general
las especies monocotiledóneas, que incluyen los importantes
cultivos de cereales, no pueden ser sometidas a transformación
mediante el método de la Agrobacterium. Son bien conocidos varios
métodos para la inserción directa de ADN en el núcleo de células
monocot.
En el método balístico, se disparan a elevada
velocidad micropartículas de material denso, normalmente oro o
wolframio, contra las células objetivo en las que penetran,
abriendo una abertura en la pared celular a través de la cual el
ADN puede entrar. El ADN puede ser colocado como recubrimiento sobre
las micropartículas o puede ser añadido al medio de cultivo.
En la microinyección, el ADN es insertado
mediante inyección en células individuales a través de una aguja
hueca ultrafina.
Otro método, aplicable tanto a monocots como a
dicots, incluye crear una suspensión de las células objetivo en un
líquido, añadir material microscópico con forma de agujas, tal como
"pelos" de carburo de silicio o de nitruro de silicio, y
agitar de tal modo que las células y los pelos colisionen y el ADN
presente en el líquido penetre en la célula.
En resumen, entonces, los requerimientos tanto
para tecnología sentido como para tecnología antisentido son
conocidos, y los métodos mediante los cuales las secuencias
requeridas pueden ser introducidas son conocidos. Lo que falta,
entonces, es identificar los genes cuya regulación es de esperar que
tenga un efecto deseado, aislarlos o aislar un fragmento de
longitud suficientemente efectiva, construir un gen quimérico en el
que el fragmento efectivo es insertado entre el promotor y las
señales de terminación, e insertar el constructo dentro de las
células de la especie vegetal objetivo mediante transformación. A
continuación, se pueden generar plantas completas a partir de las
células transformadas.
Un objetivo de la invención es proporcionar un
método y material para modular la expresión de la subunidad BCCP
ACCasa en plantas.
De acuerdo con la presente invención, se
proporciona un método para modificar la capacidad de producción de
ácidos grasos de una planta, que comprende modular la expresión del
gen que codifica la acetil Coenzima A carboxilasa de proteína
portadora de carboxilo biotina.
La modulación puede comprender sobreexpresar
dicho gen lo cual se puede alcanzar mediante la inserción estable en
el genoma de la planta de una o más de una copia de un constructo
de gen expresable que codifica dicha proteína.
Por otro lado, la modulación puede comprender la
regulación a la baja de la expresión de dicho gen, que puede ser
lograda mediante la inserción estable en el genoma de la planta de
un constructo de gen antisentido que contiene una secuencia de ADN
transcribible que comprende un ADN complementario a toda o a parte
de la secuencia de ADN endógeno de dicho gen. Alternativamente, se
puede alcanzar la sobreexpresión mediante la inserción estable en el
genoma de la planta de un constructo de gen sentido que contiene un
ADN transcribible que comprende un fragmento de la secuencia de ADN
endógena que codifica dicho gen.
La invención también proporciona un ADN que tiene
la secuencia de nucleótidos seleccionada entre ID-1,
ID-2, ID-3, ID-4,
ID-5 ó ID-6 y las variantes de ellas
que permiten la degeneración del código genético.
Además, la invención proporciona un vector que
comprende un promotor de gen operable en plantas, una región
transcribible que comprende un ADN como el reivindicado en la
reivindicación 7 y una señal de poliadenilación.
La presente invención también proporciona un
genoma vegetal recombinante que comprende uno o más de dichos
ADNs.
La acetil Coenzima A carboxilasa es una enzima
clave en el mecanismo de síntesis de ácidos grasos, que son los
componentes del aceite de los cultivos productores de aceite tales
como la colza para aceite. Es esta encima la que inicia el
mecanismo, obligando al precursor -acetil CoA- a seguir la ruta
sintética del ácido graso convirtiéndolo en malonil CoA mediante una
reacción de carboxilación.
La acetil Coenzima A carboxilasa (ACCasa)
procedente de E. coli es una enzima de multisubunidad
disociable compuesta por subunidades de carboxilasa de biotina y de
proteína portadora de carboxilo biotina (BCCP) y por subunidades de
transferasa de carboxilo \alpha y \beta. Sin embargo, en los
mamíferos, la enzima ACCasa está compuesta por sólo un polipéptido
que contiene los tres dominios funcionales.
En las plantas, ambas formas de ACCasa están
presentes. Se ha purificado un polipéptido de ACCasa de 220 kDa que
contiene los tres dominios funcionales a partir de tejidos
vegetales y de los correspondientes genes clonados procedentes de
fuentes tales como la colza, el trigo y Arabidopsis.
Adicionalmente, se ha clonado un gen con una significativa
homología de secuencia con la subunidad de la transcarboxilasa
\beta de E. coli a partir de guisantes (Sasaki y col.,
1993). Este gen fue aislado a partir de ADN de cloroplasto. Por
tanto, en los plástidos vegetales hay presente una
multi-subunidad disociable de ACCasa. Mientras que
el gen de subunidad de la transcarboxilasa \beta está codificado
en los cloroplastos, la subunidad de transcarboxilasa \alpha, la
subunidad de carboxilasa de biotina y la subunidad BCCP están todas
codificadas por el núcleo. Por lo tanto, los transcritos de estos
últimos genes son traducidos en el citosol, y los polipéptidos son
llevados a los plástidos debido a la presencia de secuencias de
péptido de tránsito objetivo. Mientras que aún no se dispone de
técnicas para la regulación a la baja de la expresión del gen de
transcarboxilasa codificado por cloroplasto, es posible regular a
la baja la expresión de las subunidades codificadas por el núcleo
mediante las tecnologías antisentido o parcialmente sentido
descritas más adelante.
Esta invención está dedicada principalmente a
genes que codifican la subunidad de proteína portadora de carboxilo
biotina (BCCP) de la ACCasa disociable vegetal. Un objetivo de la
invención es proporcionar un gen que especifica la subunidad BCCP
de ACCasa en plantas. La regulación a la baja de la expresión de
este gen, mediante tecnologías antisentido o parcialmente sentido,
provocará una regulación a la baja de la actividad total de la
enzima ACCasa presente en plástidos vegetales.
La presente invención también proporciona plantas
transformadas genéticamente, células vegetales y partes de plantas,
que contienen un ADN de la invención o fragmentos suyos en
orientación sentido o una variante suya completa o parcialmente
sentido o antisentido.
Se prefiere que la planta sea de una especie que
produce cantidades sustanciales de aceite, en lugar de almidón.
Dicha especies vegetales son bien conocidas y se las denomina
simplemente como cultivos de "semilla de aceite" e incluyen
entre otros, la colza de semilla de aceite, la semilla de colza, la
soja, el girasol, el maíz y la palma (en la que el aceite es
almacenado tanto en la semilla como en los tejidos de los frutos).
Se conocen métodos para la transformación genética de muchos
cultivos de aceite; por ejemplo, la transformación mediante métodos
de Agrobacterium tumefaciens es adecuada para la mayoría.
Dichos métodos están bien descritos en la bibliografía y son bien
conocidos y extensamente practicados en la técnica.
En nuestra Solicitud de Patente Internacional
Número WO 92/19747, publicada el 12 de noviembre de 1992,
describimos la biosíntesis de polihidroxibutirato a partir del
sustrato, acetil-CoA. Esta actividad incluye tres
etapas catalizadas por enzimas. Las tres enzimas involucradas son
la \beta-cetotiolasa, la reductasa de
acetoacetil-CoA unida a NADP, y la sintasa de
polihidroxibutirato, siendo los genes para los que han sido
clonadas de Alcaligenes eutrophus (Schubert y col., 1988, J.
Bacterial., 170). En nuestra solicitud internacional describimos la
clonación de estos tres genes en plantas sintetizadoras de
aceite.
Sin embargo, la síntesis de ácidos grasos, que
son las unidades de construcción de los aceites vegetales, utiliza
el sustrato acetil Coenzima A que es el mismo sustrato requerido
por los genes de polihidroxialcanoato. En virtud de la presente
invención, proporcionamos los medios para regular a la baja la
síntesis de ácidos grasos reduciendo la expresión de ACCasa,
dejando con ello la acetil CoA disponible para la conversión a
polihidroxialcanoatos.
Los métodos para la regulación de la expresión de
genes son bien conocidos en la técnica. Normalmente se emplean dos
métodos principales, denominadas de forma general regulación
"sentido" y "antisentido". En la regulación antisentido,
se monta un constructo de gen que, cuando es insertado en una
célula vegetal, da como resultado la expresión de un ARN mensajero
que es de secuencia complementaria al mensajero producido por el gen
objetivo. La teoría es que las secuencias de ARN complementario
forman un dúplex, inhibiendo con ello la traducción a proteína. La
secuencia complementaria puede ser equivalente en longitud a la
secuencia completa del gen objetivo, pero normalmente un fragmento
es suficiente, y más cómodo de manejar. En la regulación sentido,
se inserta una copia del gen objetivo en el genoma de la planta.
Nuevamente, ésta puede ser de longitud completa o una secuencia
parcial. Se obtiene una variedad de fenotipos, a partir de los
cuales se pueden identificar y aislar individuos en los que la
expresión de la proteína codificada por el gen objetivo es
inhibida, así como individuos en los que la expresión del producto
génico es incrementada. La regulación sentido usando secuencias
parciales tiende a favorecer la inhibición. El mecanismo no se
comprende muy bien. Se hace referencia a la Solicitud de Patente
Europea Nº 140.308 y a la Patente de Estados Unidos 5.107.065, ambas
dedicadas a la regulación antisentido, y la Solicitud de Patente
Internacional Nº WO 90/12084 que describe la regulación sentido. La
invención permite efectuar las siguientes modificaciones
genéticas:
1. Los clones de la invención pueden ser usados
para probar ADN de plantas (librerías de cADN o genómicas) para
obtener secuencias homólogas. Estos pueden ser cADNs o ADNs
genómicos truncados o de longitud completa de genes de subunidad
ACCasa BCCP procedentes, por ejemplo, del trigo, o de cultivos de
aceite tales como la colza, la semilla de colza, el girasol, el
maíz, el aceite de palma y el coco.
2. Se pueden usar cADNs de la subunidad ACCasa
BCCP de semilla de colza junto con un promotor reconocido por
plantas para crear una casete de expresión (sentido parcial o
antisentido) para el uso en la transformación de plantas de colza
para regular a la baja la producción de la subunidad BCCP ACCasa.
Esto proporcionará a las plantas una menor actividad de ACCasa.
Dichas plantas tendrán un menor contenido en aceite o un aceite de
calidad alterada. Se puede usar la misma casete para regular a la
baja la producción de subunidad BCCP ACCasa en otras plantas de la
especie Brassica. Se pueden usar cADNs de BCCP aislados a partir de
otros cultivos para crear casetes de expresión (parcial, sentido o
antisentido) para el uso en la transformación de estos cultivos con
el fin de modificar el contenido de aceite.
La regulación a la baja de la síntesis de aceite
(en la colza o en otros cultivos de aceite) puede ser usada para
desviar el sustrato, la acetil Coenzima A, en la síntesis de
materiales de almacenamiento alternativos tales como el almidón,
proteínas, o nuevos polímeros introducidos mediante modificación
genética, por ejemplo polihidroxialcanoatos.
3. cADNs o ADNs genómicos de longitud completa de
subunidades BCCP ACCasa de colza, o cADNs o ADNs genómicos de
longitud completa de genes de BCCP ACCasa procedentes de otros
cultivos de aceite, pueden ser usados en combinación con sus
promotores endógenos, o con promotores alternativos reconocidos por
plantas para crear nuevas casetes de expresión. Cuando se
transforman en plantas de colza, o en plantas de otros cultivos de
aceite, estas casetes podrían elevar el nivel de expresión total de
BCCP, o extender el periodo de expresión de BCCP en la semilla (o
fruto) en desarrollo. Dichas estrategias podrían dar como resultado
un incremento en el nivel de aceite almacenado por dicha semilla o
fruto.
4. Se pueden usar ADNs genómicos de subunidad
BCCP ACCasa de colza para recuperar el promotor del gen de BCCP
ACCasa. Este promotor puede ser usado para generar ARN de un modo
específico respecto al tejido y regulado desde el punto de vista
del desarrollo. El promotor así generado puede promover la expresión
de ACCasa, o puede controlar la expresión de un constructo de genes
colocado detrás de él (por ejemplo el gen estructural de una enzima
diferente) que a continuación será expresado específicamente en la
semilla en desarrollo.
5. El cADN y el ADN genómico de longitud completa
de la subunidad BCCP ACCasa contiene una secuencia entre la
posición de inicio de la traducción y la secuencia
N-terminal de la proteína madura, conocida como
secuencia "péptido en tránsito". Esto dirige el producto
génico a los plástidos y es separado durante la importación de la
proteína en los plástidos. Esta secuencia de péptido en tránsito
puede ser usada en fusiones de genes para dirigir los diferentes
productos génicos a los plástidos.
Hemos preparado una librería de cADN poli dT
primada derivada de mARN de cola poliA+ procedente de embrión de
colza en desarrollo. El escrutinio de una base de datos GenBank
reveló un cADN de Arabidopsis que muestra homología con el
gen accB (subunidad BCCP) de E. coli. Se obtuvo el cADN y se
aisló un injerto de 600 pb. Esto fue usado para probar la librería
de cADN del embrión de colza. Mediante ello se seleccionaron clones
de cADN de longitud parcial, pBP1, pBP2, pBP3 y pBP7, que
especifican la subunidad BCCP ACCasa de semilla de colza. También
se identificó los clones de cADN de BCCP de longitud completa pBP4 y
pBP6. El hecho de que los clones pertenecían a la subunidad ACCasa
fue confirmado por el hecho de que las secuencias de nucleótidos y
las secuencias de aminoácidos derivadas mostraron una homología
sustancial con los genes accB (subunidad BCCP) de E. coli y
Anabaena.
Los clones pBP1, pBP2, pBP3 y pBP7 han sido
depositados en la Nacional Collection of Industrial and Marine
Bacteria, 23 St Machar Drive, Aberdeen, AB2 1RY el 1 de febrero de
1995: los números de acceso son NCIMB 40707, 40708, 40706 y 40705,
respectivamente.
La invención será descrita ahora en referencia a
las siguientes secuencias en las que:
SEQ-ID-NO-1
muestra la secuencia de ADN del injerto de cADN pBP1. La secuencia
contiene una posición de unión putativa de Biotina desde la base 478
a la 493.
SEQ-ID-NO-2
es la secuencia de ADN del injerto de cADN pBP2. La secuencia
contiene una posición de unión putativa de Biotina desde la base 91
a la 106.
SEQ-ID-NO-3
es la secuencia de ADN del injerto de cADN pBP3.
SEQ-ID-NO-4
es la secuencia de ADN del injerto de cADN pBP4.
SEQ-ID-NO-5
es la secuencia de ADN del injerto de cADN pBP6.
SEQ-ID-NO-6
es la secuencia de ADN del injerto de cADN pBP7.
Con el fin de aislar el cADN que codifica la
subunidad BCCP de colza, a partir de la forma multisubunidad de
ACCasa fue necesaria una sonda de hibridación. Se disponía de una
base de datos que contenía las secuencias de cADNs de Arabidopsis
EST. Después de realizar el escrutinio de la base de datos GenBank,
se identificó una secuencia que mostraba homología con el gen accB
(subunidad BCCP) de E. coli. Usando el clon de cADN VCVDE 11
3' (GenBank ID Z25714) obtenido en el Arabidopsis Biological
Resource Center en la Universidad del Estado de Ohio, aislamos el
injerto de 600 pb. Con el objetivo de comprobar si el gen estaba
realmente presente en la colza y de determinar el tamaño del
tránscrito de longitud completa, se usó la sonda para hibridar a un
Northern blot de mARN de cola poli A+ de colza. La banda de
hibridación dominante demostró ser de un tamaño de 1,3 kb. Durante
la embriogénesis, el nivel de tránscrito fue inicialmente elevado,
aumentando posteriormente hasta dar un pico en la etapa intermedia,
seguido de un gran corte en la expresión en las etapas posteriores.
Se encontró un nivel de tránscrito mucho mayor en embriones y raíces
que en las hojas (aproximadamente 20:1).
Con el fin de estudiar la expresión de mARN de
los genes BCCP, los cuales se cree están involucrados en la síntesis
de lípidos de almacenamiento de novo, se realizó un
escrutinio de Northern blot en desarrollo. Cada línea del blot
tenía la misma cantidad de mARN poli(A)+ de raíz, hoja o
embrión procedentes de diferentes etapas de la embriogénesis de
B. napus. Los resultados indicaron que durante la
embriogénesis, la expresión de mARN de BCCP subió bruscamente,
llegando a un máximo en la parte intermedia de la embriogénesis.
Aunque había una cantidad notable de mARN de BCCP presente en la
raíz, en las hojas había un nivel comparativamente bajo.
Los datos del ensayo Northern blot sugerían que
una librería de cADN de embrión de colza derivada de mARN de cola
poli A+ de colza era la más adecuada para realizar el escrutinio de
un clon de BCCP. Se escrutaron aproximadamente 150.000 placas
recombinantes. Las placas de hibridación fueron tomadas a lo largo
de 3 rondas de escrutinio, momento en el cual eran placas
puras.
Puesto que se tomó aproximadamente 20 clones a lo
largo de 3 rondas de escrutinio, se necesitaba una primera
indicación de la identidad de los clones. La librería que se usó
para el escrutinio fue construida usando el vector de expresión
\lambdaZAP II. Previamente se ha demostrado que los clones
\lambdaZAP II inducidos para expresar la proteína codificada
pueden ser biotinilados por un hospedante E. coli, siempre
que la posición de biotinilación esté presente en la proteína
expresada. Siempre que al menos uno de los injertos esté en el
marco y en la orientación correcta, entonces el clon podría ser
identificado mediante este método de biotinilación para un
secuenciamiento preferencial. Los clones positivos en los
escrutinios de la librería fueron inducidos para expresar su
proteína mediante tratamiento IPTG y fueron escrutados usando un
sistema de detección de estreptavidina/ECL unida a peroxidasa.
El tamaño del tránscrito a partir del análisis de
Northern mostró que el mARN de longitud completa que codifica la
proteína BCCP era de 1,3 kb. Éste codificaría un polipéptido de
aproximadamente 25 kDa. Además, se demostró que la expresión en
embrión era aproximadamente 20 veces la de la hoja. Usando extractos
frescos de proteína completa procedentes de semilla y de hoja de
colza se llevó a cabo un análisis Western blot usando
Estreptavidina marcada con yodo 125 (I^{125}) para identificar
las proteínas que contienen biotina. Se observó que había una
proteína que contiene biotina de aproximadamente 35 kDa en los
extractos de embrión de colza pero no en los extractos de hoja de
colza. Puesto que estos datos concuerdan con los datos del análisis
Northern, la proteína puede representar el producto del gen de BCCP
de colza.
Se secuenció los clones positivos en los
escrutinios de la librería. Se identificaron seis clones y fueron
nombrados pBP1, pBP2, pBP3, pBP4, pBP6 y pBP7.
La secuencia del pBP1 se muestra como
SEQ-ID-NO-1. La
secuencia contiene una posición putativa de unión a biotina entre
las bases 478 y 493. pBP1 muestra una considerable homología de
secuencia de aminoácidos con el gen de BCCP de Anabaena y de E.
coli. La secuencia de pBP2 se muestra como
SEQ-ID-NO-2. La
posición putativa de unión a biotina está entre las bases 91 a 106.
pBP2 muestra una considerable homología de aminoácidos con pBP1. La
secuencia de pBP3 se muestra como
SEQ-ID-NO-3. Las
secuencias pBP4 y 6 se muestran como
SEQ-ID-NO-4 y
SEQ-ID-NO-5
respectivamente. La secuencia de pBP7 se muestra como
SEQ-ID-NO-6. pBP7
muestra una considerable homología de secuencia de aminoácidos con
el gen BCCP de E. coli.
i) la librería de cADN usada fue generada usando
mARN poli (A)+ aislado de acuerdo con el método de Logemann y col. a
partir de embriones de colza Jet neuf en la etapa intermedia de
desarrollo (cosechados a aproximadamente 35 días después de la
antesis). La síntesis de la primera cadena fue llevada a cabo
usando oligoprímeros poli dT de acuerdo con las instrucciones del
fabricante (Amersham International). Los cADNs resultantes
generados fueron clonados directamente en posiciones EcoRI/Xhol de
\lambda-ZAP II, como recomendaron los fabricantes
(Stratagene). La bacteria hospedante usada fue XL-1
Blue (Stratagene).
Las sondas de cADN para el escrutinio de
librerías de colza fueron generadas mediante digestiones del
plásmido de ADN con la endonucleasa de restricción apropiada. El
fragmento de ADN requerido fue separado del ADN vector mediante
electroforesis TAE de agarosa y fue aislado usando el kit GeneClean
II (Bio 101) o mediante congelación y ultrafiltración.
Las sondas (200-300 ng) fueron
radiomarcadas con [\alpha^{32}P] cCTP usando el kit Megaprime
tal como recomiendan los fabricantes (Amersham International) hasta
un nivel de 5 x 10^{9} cmp/\mug. Los marcadores no incorporados
fueron eliminados usando columnas de cromatografía Biospin
(Biorad).
150.000 unidades formadoras de placa fueron
escrutadas como se ha descrito previamente. Los filtros fueron
hibridados a 65ºC. La recuperación de los clones de cADN del
plásmido fue llevada a cabo como se describe en el protocolo de
Stratagene para "escisión in vivo de pSK de
\lambda-ZAP II".
El secuenciamiento se llevó a cabo usando un
secuenciador de ADN 373A de Applied Biosystems Inc. (servicio de
secuenciamiento de la Universidad de Dirham, Ms J Bartley). Se
usaron los prímeros hacia delante e inverso (-21m13 y M13RPI)
inicialmente para todos los clones. Se generaron eliminaciones
anidadas tal como recomienda Pharmacia (d.s. Nested Deletion Kit) y
fueron secuenciadas usando una combinación de prímeros hacia
delante e inverso y de prímeros de oligonucleótidos sintetizados.
Los prímeros fueron fabricados usando un sintetizador de ADN 381A
(Applied Biosystems Inc.). El análisis por ordenador de la
secuencia de ADN será llevado a cabo usando un paquete SEQNET del
centro SERC en Daresbury y DNA Strider.
Se preparó mARN poli A+ a partir bien de 5 g de
hojas jóvenes o bien de 5 g de embriones cosechados a 15, 22, 29,
36, 42 y 49 días después de la antesis, usando el procedimiento
recomendado (kit de purificación de mARN de Pharmacia). Se cargaron
de 1 a 5 \mug en un gel de agarosa con un 1% de
formamida/formaldehído para electroforesis. El procedimiento Northen
blot fue llevado a cabo como se ha descrito anteriormente.
Aproximadamente 2 x 105 p.f.u. fueron colocadas
sobre cada una de 3 grandesplacas NZYM usando KW251 de E.
coli como cepa hospedante, tras cultivo a 42ºC hasta que
aparecen placas de tamaño de agujero de aguja (aproximadamente
3-4 horas), las placas son recubiertas con filtros
de nitrocelulosa (20 x 20 cm) preempacados en IPTG 10 mM y se dejan
secar. Entonces se continúa con el cultivo de las placas a lo largo
de la noche a 37ºC.
Después de incubar a lo largo de la noche, los
filtros fueron retirados y lavados brevemente en TBS (Tris 50 mM a
pH 7,5, NaCl 0,2 M, CaCl_{2} 0,5 M, MgCl_{2} 50 mM). Las
membranas fueron bloqueadas durante 2 horas en TBS/ 1% (p/v)
hemoglobina a 30ºC, seguido de otras 2 horas más estreptavidina en
bloque unida a disolución tampón/peroxidasa (Sirotech). Las
membranas fueron aclaradas a continuación intensamente en Tween 20
con TBS/0,05% a temperatura ambiente.
Para identificar los clones positivos se usó el
sistema de visualización ECL, tal como describen los fabricantes
(Amersham).
Se congeló material vegetal fresco en nitrógeno
líquido y fue molido congelado con un mortero y una mano de mortero.
El polvo fino resultante fue colocado en un eppendorf y se
añadieron 4 volúmenes de tampón de carga de muestra XI. La mezcla
líquido-sólido fue llevada a ebullición
inmediatamente durante 5 minutos y centrifugada durante 10 minutos
en una centrífuga micrófuga de poyata. Se retiró el sobrenadante y
se almacenó en alícuotas a -80ºC. Las muestras de proteína fueron
usadas hasta 2 meses después de la preparación.
Después de SDS PAGE, las proteínas fueron
transferidas a ProBlot (ABI) mediante un "blotting" semiseco.
Se colocó proteínas marcadoras mediante tinción de Ponceau de
acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Las membranas
fueron bloqueadas con hemoglobina al 1%, Tris 20 mM a pH 7,2, NaCl
170mM durante 1 hora con mezcla constante. Se añadió estreptavidina
125 ligada en una relación 1:200 y fue incubado a temperatura
ambiente a lo largo de la noche. La mancha fue lavada intensamente
con Nonidet P40 al 0,2%, bloqueando la disolución con varios
cambios de disolución de lavado a lo largo de 1 hora. Se expuso la
mancha a una película de rayos X durante de 1 a 7 días.
Los análisis Western blot proporcionaron
resultados que indicaban los niveles de BCCP. En ausencia de
anticuerpos específicos de BCCP, y debido a que la BCCP es
biotinilada in vivo, se usó antisuero específico de biotina
para generar anticuerpos específicos de biotina. Se recubrió
hemocianina de lapa con biotina y fue usada como antígeno en
conejos. Para minimizar las señales de fondo falsas en el análisis
Western blot, todos los anticuerpos generados fueron purificados en
afinidad. Esto se realizó mediante cromatografía en columna sobre
una matriz de biotina-agarosa. Los tamaños teóricos
de las bandas de la proteína BCCP fueron estimados en 22,7 kDa y
21,9 kDa a partir de los dos clones más largos que son
SEQ-ID-NO-4 y
SEQ-ID-NO-5. Sin
embargo, el trabajo previo que describe los estudios de BCCP en
procariontes, mostró que la región rica en prolina/alanina de la
BCCP de E. coli confiere una anomalía de gel SDS. La
proteína se mueve con un 35% menos de movilidad de lo previsto a
partir de la secuencia. Puesto que la secuencia de la BCCP de B.
napus también contiene una región rica en prolina/alanina
similar, el peso molecular exacto no pudo ser estimado a partir de
la movilidad en gel SDS. Los experimentos realizados usando los
anticuerpos han demostrado que la única proteína biotinilada en los
cloroplastos de guisante fue la subunidad de BCCP de 35 kDa de
ACCasa. De forma similar, los análisis Western blot de proteína de
cloroplastos de B. napus mostraron que sólo una proteína
biotinilada reside dentro del cloroplasto. Por lo tanto, es
altamente probable que las bandas de 35 kDa mostradas en los
análisis de Western blot de extractos de raíz, hoja y embrión de
B. napus, sean de BCCP. La purificación de plástidos
procedentes de embriones de semilla de colza también reveló que el
polipéptido biotinilado está localizado dentro del plástido.
Además, aunque inicialmente se cargaron los mismos niveles de
proteína en los geles, los niveles de BCCP fueron bajos tanto en
las raíces como en las hojas en comparación con los de los
embriones.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: ZENECA LIMITED
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: GEN VEGETAL QUE ESPECIFICA PROTEINA PORTADORA DE CARBOXILO BIOTINA DE ACETIL CoA CARBOXILASA Y PLANTAS TRANSFORMADAS QUE CONTIENEN LA MISMA.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: ZENECA AGROCHEMICALS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: JEALOTTS HILL RESEARCH STATION
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: BRACKNELL
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: BERKSHIRE
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: GB
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: RG42 6ET
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- COMPUTADORA: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- SOLICITUD ACTUAL DE LOS DATOS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: WO
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DE AGENTE/ABOGADO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: HUSKISSON, FRANK M.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: GA31435
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/ETIQUETA: VER 45001/WO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 0134441822
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 01344481112
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 842 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Brassica napus
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: pBP1
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 421 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Brassica napus
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: pBP2
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 924 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Brassica napus
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: pBP3
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1001 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Brassica napus
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: pBP4
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1133 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Brassica napus
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: pBP6
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 719 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Brassica napus
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: pBP7
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (6)
1. Un método para modificar la capacidad de
producción de ácidos grasos de una planta modulando la expresión
del gen que codifica la proteína portadora de carboxilo biotina de
acetil Coenzima A carboxilasa, que comprende insertar de forma
estable en el genoma de las células de dicha planta un vector que
comprende un promotor génico operable en plantas, una señal de
poliadenilación y una región transcribible, que comprende un ADN
que tiene la secuencia de nucleótidos seleccionada entre
SEQ-ID NO: 1, SEQ-ID NO: 2,
SEQ-ID NO: 3, y SEQ-ID NO: 6, y sus
secuencias complementarias.
2. Un método como el reivindicado en la
reivindicación 1, en el que la modulación comprende sobreexpresar
dicho gen de proteína portadora de carboxilo biotina de acetil
Coenzima A carboxilasa.
3. Un método como el reivindicado en la
reivindicación 2, en el que la sobreexpresión de dicho gen se logra
mediante la inserción estable en el genoma de la planta de una o
más de una copias de un constructo génico expresable que codifica
dicha proteína portadora de carboxilo biotina de acetil Coenzima A
carboxilasa.
4. Un método como el reivindicado en la
reivindicación 1, en el que la modulación comprende la regulación a
la baja de la expresión de dicho gen de proteína portadora de
carboxilo biotina de acetil Coenzima A carboxilasa.
5. Un método como el reivindicado en la
reivindicación 4, en el que la regulación a la baja de dicho gen se
logra mediante la inserción estable en el genoma de la planta de un
constructo génico antisentido que contiene una secuencia de ADN
transcribible que comprende un ADN complementario a toda o a parte
de la secuencia de ADN endógeno de dicho gen de proteína portadora
de carboxilo biotina de acetil Coenzima A carboxilasa.
6. Un método como el reivindicado en la
reivindicación 4, en el que la regulación a la baja de dicho gen se
logra mediante la inserción estable en el genoma de la planta de un
constructo génico sentido que contiene un ADN transcribible que
comprende un fragmento de la secuencia de ADN endógeno que codifica
el mencionado gen de proteína portadora de carboxilo biotina de
acetil Coenzima A carboxilasa.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9516961.1A GB9516961D0 (en) | 1995-08-18 | 1995-08-18 | Plant gene specifying acetyl coenzyme a carboxylase biotin carboxyl carrier protein and transformed plants containing same |
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Publications (1)
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ID=10779443
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES96926474T Expired - Lifetime ES2227602T3 (es) | 1995-08-18 | 1996-08-06 | Gen de una planta que codifica la proteina portadora de biotin carboxilasa de acetil coenzima a carboxilasa. |
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1996
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