JPH11511022A

JPH11511022A - アセチル補酵素ａカルボキシラーゼビオチンカルボキシルキャリヤータンパク質をコードしている植物遺伝子

Info

Publication number: JPH11511022A
Application number: JP9509008A
Authority: JP
Inventors: スラバス，アントニ・ライスザード; エルバーロウ，キーラン・マイケル
Original assignee: ゼネカ・リミテッド
Priority date: 1995-08-18
Filing date: 1996-08-06
Publication date: 1999-09-28
Also published as: WO1997007222A1; AU700365B2; DE69633630T2; ES2227602T3; EP0851933A1; US6150586A; DK0851933T3; CA2227414A1; GB9516961D0; EP0851933B1; AU6664196A; DE69633630D1; ATE279522T1

Abstract

(57)【要約】脂肪酸を生産する植物の能力を、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼビオチンカルボキシルキャリヤータンパク質を規定する遺伝子の発現を制御することによって調節する。調節は、該遺伝子の発現を追加のコピーのゲノム中への挿入によって増加させることまたは内因性遺伝子に対して向けられたアンチセンスまたはコサプレッションベクターの挿入によって発現を阻害することを含むことができる。

Description

【発明の詳細な説明】アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼビオチンカルボキシルキャリヤータンパク質をコードしている植物遺伝子本発明は、アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）のサブユニットであるビオチンカルボキシルキャリヤータンパク質（ＢＣＣＰ）を規定する植物遺伝子および該遺伝子で遺伝的に形質転換された植物ゲノムに関する。特に、制限するわけではないが、本発明は、アブラナ属（Brassica）種、特に、セイヨウアブラナ（Brassica napus）（脂肪種子アブラナ）の植物からのＡＣＣアーゼＢＣＣＰ遺伝子および該遺伝子、部分遺伝子またはそのアンチセンス立体配置で遺伝的に形質転換されるアブラナ属植物における該遺伝子の発現の制御に関する。発現の制御には、二つの主な方法が知られている。これらは、当該技術分野において、「アンチセンスダウンレギュレーション」および「センスダウンレギュレーション」または「コサプレッション」と称される。これらの方法は両方とも、標的遺伝子の発現の阻害をもたらす。過発現は、選択された遺伝子の１個または２個以上の余分のコピーの挿入によって達成される。他のあまり用いられない方法は、遺伝子制御要素、プロモーターおよび制御配列の修飾を必要として、挿入された遺伝子のより大きいまたはより少ない発現を達成する。アンチセンスダウンレギュレーションでは、標的遺伝子の全部または一部分に対して相補的であるＤＮＡを、ゲノム中に逆方向におよびその翻訳開始シグナルを含むことなく挿入する。最も単純な理論は、転写可能であるが翻訳可能でないこのようなアンチセンス遺伝子が、内因性遺伝子から転写されたｍＲＮＡ生成物に対して配列が相補的であるｍＲＮＡを生じた後、そのアンチセンスｍＲＮＡが、天然に生じた「センス」ｍＲＮＡと結合して二重らせんを形成し、それが、天然ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を阻害することである。挿入されたアンチセンス遺伝子は、内因性遺伝子配列に対して長さが等しい必要はなく、フラグメントで充分である。フラグメントの寸法は、特に重要であるとは考えられない。４０ヌクレオチドまたはその程度の小さいフラグメントが有効であると報告されている。概して、５０ヌクレオチドの範囲ぐらいが、阻害作用を得るのに充分であると認められる。しかしながら、更に少ないヌクレオチドが極めてよく作用することがありうるといわれているし、完全長さと同等までの更に多数は、確実に作用するであろう。通常は、約５０ヌクレオチドの下流に好都合な制限酵素切断部位が存在するフラグメント長さを用いるのが簡単である。遺伝子のフラグメントのみが必要とされるということは、遺伝子の全てを配列決定する必要はないということを意味する。更に、一般的にはｃＤＮＡで充分であり、完全なゲノム配列を単離する必要がないことを意味する。アンチセンスフラグメントは、標的遺伝子の内因性相補鎖と正確に同じである必要はない。単に、標的遺伝子の阻害を達成するのに充分な配列類似性が存在する必要があるだけである。これは、一つの植物種に由来した配列の使用を別の種でも有効にさせるし且つ目的の個々の種それぞれにアンチセンスベクターを構築する必要をなくするので、アンチセンス技術の重要な特徴である。一つの種から単離された配列は別の種でも有効でありうるが、一つの種と他の種との間の配列類似性の度合いが、得ようとする作用に不充分である例外は、しばしば見られる。このような場合、種特異的同族体を単離することが不可欠でありうる。アンチセンスダウンレギュレーション技術は、当該技術分野において充分に確立されている。それは、いくつかの教本および何百もの定期刊行物の論題である。主な特許参考文献は、カルジーン・インコーポレーテッド（Calgene Inc.）の名義の欧州特許第240,208号である。アンチセンス技術の使用可能性を疑う理由は何もない。その技術は充分に確立され、世界中の実験室で日常的に用いられ、そしてそれが用いられている製品が市販されている。過発現およびダウンレギュレーションは、両方とも「センス」技術で行われる。標的遺伝子の完全長さコピーをゲノム中に挿入した場合、ある範囲の表現型が得られ、いくつかは標的遺伝子を過発現し、いくつかは不足発現する（underexp ressing）。次に、この方法によって生じる植物集団をスクリーニングし、そして個々の表現型を単離することができる。アンチセンスの場合と同様、挿入された配列は翻訳開始シグナルが欠けている。アンチセンスとのもう一つの類似性は、挿入された配列が完全長さコピーである必要がないことである。実際に、過および不足発現性表現型の分布は、不足発現に有利に傾いていて、そしてこれは、遺伝子阻害が所望の作用である場合に好都合であるということが判っている。過発現に対しては、挿入されたコピー遺伝子がその翻訳開始コドンを保持していることが好ましい。コサプレッションについての主な特許参考文献は、ＤＮＡプラント・テクノロジー・インコーポレーテッド（Plant Technology Inc.）の名義の欧州特許第465,572号である。センス／コサプレッション技術の使用可能性を疑う理由は何もない。それは充分に確立され、世界中の実験室で日常的に用いられ、そしてそれが用いられている製品が市販されている。センスおよびアンチセンス遺伝子調節は、バード（Bird）およびレイ（Ray）によって Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 9:207-227(1991)で論評されている。トマトにおいて選択された遺伝子を制御するこれら技術の使用は、グレイ（Gray）ら，Plant Molecular Biology,19:69-87(1992)で記載された。記載された方法のいずれによる遺伝子制御も、センスまたはアンチセンス配列を、適当なプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含有する終結配列と一緒に形質転換によって標的植物種のゲノム中に挿入した後、その形質転換細胞を植物全体で再生することを必要とする。形質転換法は大部分の植物種に存在するしまたは利用可能な方法の適応によって得ることができるということは言ってもよいと思われる。双子葉植物に最も広く用いられる方法は、アグロバクテリア菌（Agrobacteriu m）媒介形質転換である。これは、全ての形質転換法の内で最もよく知られ、最も広く研究され、したがって、最もよく理解された方法である。根粒細菌アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）または近縁のアグロバクテリウム・リゾジェネス（Agrobacterium rhizogenes）は、それらの細菌に感染している植物において、現実に、疾患症状、クラウンゴールまたは毛根腫瘍の形成を引き起こす若干のプラスミドを有する。アグロバクテリア菌によって発病において用いられる機序の一部分は、左右境界部分によって結合しているプラスミドＤＮＡの部分が、感染した植物のゲノム中に安定して転移することである。したがって、異種ＤＮＡを、いわゆる「転移」部分（Ｔ−部分）中に、通常そこに存在している遺伝子の置換で挿入する場合、その異種遺伝子は、植物ゲノム中に転移するであろう。定期刊行物、教本および特許には何百もの参考文献があり、その方法は充分に確立されている。アグロバクテリア菌の有効性は、微生物の宿主範囲に制限され、したがって、双子葉植物種に多少なりとも制限される。概して、重要な穀物を含む単子葉植物種は、アグロバクテリア菌法による形質転換に従わない。単子葉植物細胞の核中へのＤＮＡの直接挿入には様々な方法が知られている。射出法（ballistic method）では、稠密材料、通常、金またはタングステンの微粒子を標的細胞のところで高速で燃焼させ、そこでそれらがその細胞を貫通し、細胞壁に口を開け、それを通ってＤＮＡが入ることができる。そのＤＮＡは、微粒子に対してコーティングされていてよいしまたは培地に対して加えられていてよい。マイクロインジェクションの場合、ＤＮＡを注射によって個々の細胞中に超微細中空針を介して挿入する。単子葉植物および双子葉植物両方に適応しうるもう一つの方法は、標的細胞の液体中懸濁液を生成し、炭化ケイ素または窒化ケイ素などの微視的針状材料「ホイスカー」を加え、そして細胞およびホイスカーが衝突し且つ液体中に存在するＤＮＡが細胞に入るように撹拌することを行う。次に、要約すると、センスおよびアンチセンス技術両方の必要条件は知られているし、そして必要な配列を導入しうる方法は知られている。次に、残っていることは、その調節が所望の作用を有すると考えられる遺伝子を識別し、それらを単離しまたは充分に有効な長さのフラグメントを単離し、有効なフラグメントがプロモーターと終結シグナルとの間に挿入されているキメラ遺伝子を構築し、そして該構築物を標的植物種の細胞中に形質転換によって挿入することである。次に、植物全体を形質転換細胞から再生することができる。本発明の目的は、植物中においてＡＣＣアーゼＢＣＣＰサブユニットの発現を調節する方法および材料を提供することである。本発明により、植物の脂肪酸生産能力を調節する方法であって、アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼビオチンカルボキシルキャリヤータンパク質をコードしている遺伝子の発現を調節することを含む上記方法を提供する。調節は、前記タンパク質をコードする発現可能な遺伝子構築物の１個または２個以上のコピーの植物のゲノム中への安定した挿入によって達成されうる前記遺伝子の過発現を含むことができる。もう一方において、調節は、前記遺伝子の内因性ＤＮＡ配列の全部または一部分に対して相補的なＤＮＡを含む転写可能なＤＮＡ配列を含有するアンチセンス遺伝子構築物の植物のゲノム中への安定した挿入によって達成されうる前記遺伝子の発現のダウンレギュレーションを含むことができる。或いは、過発現は、前記遺伝子をコードしている内因性ＤＮＡ配列のフラグメントを含む転写可能なＤＮＡを含有するセンス遺伝子構築物の植物のゲノム中への安定した挿入によって達成されうる。本発明は、更に、ＩＤ−１、ＩＤ−２、ＩＤ−３、ＩＤ−４、ＩＤ−５またはＩＤ−６および遺伝コードの縮重によって可能になるその変異型から選択されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡを提供する。更に、本発明は、植物中で操作可能な遺伝子プロモーター、請求項７に記載のＤＮＡを含む転写可能な部分およびポリアデニル化シグナルを含むベクターを提供する。本発明は、更に、前記ＤＮＡを１個またはそれ以上含む組換え植物ゲノムを提供する。アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼは、脂肪種子アブラナなどの油脂製造用作物の油脂成分である脂肪酸の合成の経路における鍵酵素である。その経路を開始して、前駆物質アセチルＣｏＡをカルボキシル化反応によってマロニルＣｏＡに変換することによりそれを脂肪酸合成経路に引き渡すのがこの酵素である。大腸菌（E.coli）からのアセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）は、ビオチンカルボキシラーゼおよびビオチンカルボキシルキャリヤータンパク質（ＢＣＣＰ）サブユニット並びにカルボキシルトランスフェラーゼαおよびβ サブユニットから成る解離性マルチサブユニット酵素である。しかしながら、哺乳動物でのＡＣＣアーゼ酵素は、３種類の機能性ドメイン全部を含有するたった一つのポリペプチドから成る。植物では、両方の形のＡＣＣアーゼが存在する。３種類の機能性ドメイン全部を含有する２２０ｋＤａのＡＣＣアーゼポリペプチドは植物組織から精製されており、そして対応する遺伝子は、アブラナ、コムギおよびシロイヌナズナ（Arab idopsis）などの源からクローン化されている。更に、大腸菌トランスカルボキシラーゼのβサブユニットに対して有意の配列相同性を有する遺伝子は、エンドウからクローン化されている（ササキ（Sasaki）ら，1993）。この遺伝子は、葉緑体ＤＮＡから単離された。したがって、解離性マルチサブユニットＡＣＣアーゼは、植物色素体中に存在する。トランスカルボキシラーゼβサブユニット遺伝子は葉緑体でコードされているが、トランスカルボキシラーゼαサブユニット、ビオチンカルボキシラーゼサブユニットおよびＢＣＣＰサブユニットは、全て核でコードされている。したがって、後者の遺伝子からの転写物は細胞質ゾル中で翻訳され、そして色素体に集中した一過性（transit）ペプチド配列の存在のために、ポリペプチドは色素体中に吸収される。葉緑体でコードされたトランスカルボキシラーゼ遺伝子の発現のダウンレギュレーションの技術はまだ利用できないが、核でコードされたサブユニットの発現を下記のアンチセンスまたは部分センス技術によってダウンレギュレートすることは可能である。本発明は、主として、解離性植物ＡＣＣアーゼのビオチンカルボキシルキャリヤータンパク質（ＢＣＣＰ）サブユニットをコードしている遺伝子に関する。本発明の目的は、植物中のＡＣＣアーゼＢＣＣＰサブユニットを規定する遺伝子を提供することである。アンチセンスまたは部分センス技術によるこの遺伝子の発現のダウンレギュレーションは、植物色素体中に存在する全ＡＣＣアーゼ酵素活性のダウンレギュレーションを引き起こすであろう。本発明は、更に、本発明のＤＮＡまたはそのフラグメントをセンス配向で、またはその完全若しくは部分センスまたはアンチセンス変異型を含有する遺伝的に形質転換された植物、植物細胞および植物部分を提供する。その植物は、デンプブンよりもむしろ実質的な量の油脂を生産する種であるのが好ましい。このような植物種は周知であり、単純に「脂肪種子」作物と称され、そして特に、脂肪種子アブラナ、カノーラ（canola）、ダイズ、ヒマワリ、トウモロコシおよびヤシがある（油脂は種子および果実両方の組織中に貯蔵されている）。多数の油脂作物の遺伝的形質転換の方法が知られており、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス法による形質転換は大部分のものに適している。このような方法は、参考文献で充分に記載され且つ周知であり、そして当該技術分野において広範に実施されている。本発明者は、１９９２年１１月１２日公開の国際特許出願第ＷＯ92/19747号において、基質アセチルＣｏＡからのポリヒドロキシブチレートの生合成を記載している。この活性は、３種類の酵素触媒段階を必要とする。関与する３種類の酵素は、β−ケトチオラーゼ、ＮＡＤＰ結合アセトアセチルＣｏＡレダクターゼおよびポリヒドロキシ酪酸シンターゼであり、これらの遺伝子は、アルカリゲネス・ユートロフス（Alcaligenes eutrophus）からクローン化されている（シューベルト（Schubert）ら，1988，J.Bacteriol,170）。本発明者は、国際出願において、これら３種類の遺伝子の油脂合成植物中へのクローニングを記載している。しかしながら、植物油脂のビルディングブロックである脂肪酸の合成は、ポリヒドロキシアルカノエート遺伝子によって必要とされる同様の基質である基質アセチル補酵素Ａを用いる。本発明によって、本発明者は、ＡＣＣアーゼの発現を減少させることによってポリヒドロキシアルカノエートへの変換に利用可能なアセチルＣｏＡを残すことにより、脂肪酸合成のダウンレギュレーションの手段を提供する。遺伝子発現の調節の方法は、当該技術分野において周知である。二つの主要な方法が一般的に用いられ、これらは大まかに、「センス」および「アンチセンス」調節と称される。アンチセンス調節では、遺伝子構築物を組立てるが、これは、植物細胞中に挿入された場合に、標的遺伝子によって生じるメッセンジャーＲＮＡに対して相補的配列を有するメッセンジャーＲＮＡの発現を引き起こす。その理論は、相補的ＲＮＡ配列が、二重鎖を形成することによってタンパク質への翻訳を阻害することである。その相補的配列は、標的遺伝子の配列全体と長さが等しくてよいが、通常は、フラグメントで充分であり、しかも取扱いにより好都合である。センス調節では、標的遺伝子のコピーを植物ゲノム中に挿入する。これもまた、完全長さであってよいしまたは部分配列であってよい。ある範囲の表現型が得られ、それから、標的遺伝子によってコードされたタンパク質の発現が阻害されている個体を、遺伝子産物の発現が増加している個体でできるようにに識別し且つ単離することができる。部分配列を用いるセンス調節は、阻害に有利な傾向がある。その機序は、充分に理解されていない。共にアンチセンス調節に関する欧州特許出願第140,308号および米国特許第5,107,065号並びにセンス調節に関する国際特許出願第ＷＯ90/12084号を参照する。本発明は、次の遺伝子修飾を行うことを可能にする。１．本発明のクローンを用いて植物ＤＮＡ（ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリー）をプローブして、相同配列を得ることができる。これらは、例えば、コムギまたはアブラナ、カノーラ、ダイズ、ヒマワリ、トウモロコシ、アブラヤシおよびココナツなどの油脂作物からのＡＣＣアーゼＢＣＣＰサブユニット遺伝子の切断された若しくは完全長さのｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡであってよい。２．アブラナ種子ＡＣＣアーゼＢＣＣＰサブユニットのｃＤＮＡを植物で認識されたプロモーターと一緒に用いて、該ＡＣＣアーゼＢＣＣＰサブユニットの生産をダウンレギュレートするようにアブラナ植物を形質転換する場合に用いるための発現カセット（部分センスまたはアンチセンス）を生成することができる。これは、より低いＡＣＣアーゼ活性を植物に与えるであろう。このような植物は、より少ない油脂含有量または変更された品質の油脂を有するであろう。同様のカセットを用いて、アブラナ属種の他の植物でのＡＣＣアーゼＢＣＣＰサブユニットの生産をダウンレギュレートすることができる。他の作物から単離されたＢＣＣＰｃＤＮＡは、油脂含有量を改善するためのこれら作物の形質転換で用いるための発現カセット（部分、センスまたはアンチセンス）を生成するのに用いることができる。油脂合成（アブラナまたは他の油脂作物での）のダウンレギュレーションを用いて、その基質アセチル補酵素Ａを、デンプン、タンパク質または遺伝子修飾によって導入される新規ポリマー、例えば、ポリヒドロキシアルカノエートなどの別の貯蔵物質の合成に向けることができる。３．アブラナＡＣＣアーゼＢＣＣＰサブユニットの完全長さｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡまたは他の油脂作物からのＡＣＣアーゼＢＣＣＰ遺伝子の完全長さｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡを、それらの内因性プロモーターと一緒にまたは別の植物で認識されたプロモーターと一緒に用いて、新規発現カセットを生成することができる。アブラナ植物または他の油脂作物の植物中に形質転換された場合、これらカセットは、ＢＣＣＰの全発現レベルを増加させるかまたは発育した種子（または果実）中でのＢＣＣＰの発現期間を延長させると考えられる。このような計画は、前記種子または果実によって貯蔵される油脂の量を増加させると考えられる。４．アブラナＡＣＣアーゼＢＣＣＰサブユニットのゲノムＤＮＡを用いて、そのＡＣＣアーゼＢＣＣＰ遺伝子のプロモーターを回復させることができる。このプロモーターは、組織特異的なおよび開発によって調節された様式でＲＮＡを生成するのに用いることができる。そのように生成されたプロモーターは、ＡＣＣアーゼの発現を促進しうるし、またはその後に配置された遺伝子構築物（例えば、別の酵素の構造遺伝子）の発現を制御しうるので、発育した種子中でそれを特異的に発現させるであろう。５．アブラナＡＣＣアーゼＢＣＣＰサブユニットの完全長さｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡは、「一過性ペプチド」配列として知られる、成熟タンパク質の翻訳開始部位とＮ末端配列との間の配列を有する。これは、遺伝子産物を色素体へ向かわせ且つタンパク質の色素体中への移入の際に切断除去される。この一過性ペプチド配列を遺伝子融合において用いて、種々の遺伝子産物を色素体へ向かわせることができる。本発明者は、発育したアブラナ胚からのポリＡ＋尾部ｍＲＮＡに由来するポリｄＴ開始ｃＤＮＡライブラリーを製造した。ジェンバンク（GenBank）データベースの走査は、大腸菌からのａｃｃＢ遺伝子（ＢＣＣＰサブユニット）との相同性を示したシロイヌナズナｃＤＮＡを示した。そのｃＤＮＡを入手し、そして６００ｂｐインサートを単離した。これを用いて、アブラナ胚ｃＤＮＡライブラリーをプローブした。それによって、アブラナ種子ＡＣＣアーゼＢＣＣＰサブユニットを規定する不完全長さｃＤＮＡクローンｐＢＰ１、ｐＢＰ２、ｐＢＰ３およびｐＢＰ７を選択した。完全長さＢＣＣＰｃＤＮＡクローンｐＢＰ４およびｐＢＰ６もまた識別した。それらクローンが確かにＡＣＣアーゼサブユニットであるということは、それらヌクレオチド配列および誘導アミノ酸配列が、大腸菌およびアナベナ属（Anabaena）ａｃｃＢ（ＢＣＣＰサブユニット）遺伝子との実質的な相同性を示したということによって確認された。クローンｐＢＰ１、ｐＢＰ２、ｐＢＰ３およびｐＢＰ７は、１９９５年２月１日にナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア（the National Collection of Industrial and Marine Bacteria），マカー・ドライブ（Machar Drive）２３地区，アバディーン，ＡＢ２１ＲＹで寄託されており、寄託番号はそれぞれ、ＮＣＩＭＢ 40707、40708、40706 および40705 である。本発明をここで、次の配列に関して記載する。配列番号１は、ｃＤＮＡインサートｐＢＰ１のＤＮＡ配列を示す。この配列は、塩基４７８〜４９３の推定上のビオチン結合部位を有する。配列番号２は、ｐＢＰ２のｃＤＮＡインサートのＤＮＡ配列である。この配列は、塩基９１〜１０６の推定上のビオチン結合部位を有する。配列番号３は、ｐＢＰ３のｃＤＮＡインサートのＤＮＡ配列である。配列番号４は、ｐＢＰ４のｃＤＮＡインサートのＤＮＡ配列である。配列番号５は、ｐＢＰ６のｃＤＮＡインサートのＤＮＡ配列である。配列番号６は、ｐＢＰ７のｃＤＮＡインサートのＤＮＡ配列である。結果ノーザンブロット分析アブラナＢＣＣＰサブユニットをコードしているｃＤＮＡをマルチサブユニットの形のＡＣＣアーゼから単離するために、本発明者はハイブリッド形成性プローブを必要とした。データベースは、アラビドプシス（Arabidopsis）ＥＳＴｃＤＮＡからの配列を含むものが利用可能であった。ジェンバンクデータベースを走査した後、大腸菌からのａｃｃＢ遺伝子（ＢＣＣＰサブユニット）に対して相同性を示した配列を識別した。オハイオ州立大学のアラビドプシス・バイオロジカル・リソース・センター（Arabidopsis Biological Resource Center）から入手したｃＤＮＡクローン VCVDE11 3'（ジェンバンクＩＤＺ25714）を用いて、本発明者は６００ｂｐインサートを単離した。遺伝子がアブラナ中に実際に存在していたかどうかを検査し且つ完全長さ転写物寸法を測定するために、プローブを用いて、アブラナポリＡ＋尾部ｍＲＮＡのノーザンブロットに対してハイブリッド形成させた。優勢なハイブリッド形成バンドは、寸法が１．３ｋｂであることが示された。胚形成中に、転写物の量は、最初は高く、中期で更にピークまで増加した後、後期に発現が大きく中断した。はるかに高い量の転写物が、葉よりも胚および根に存在した（約２０：１）。 de novo 貯蔵脂質合成に関与すると考えられるＢＣＣＰ遺伝子のｍＲＮＡ発現を研究するために、展開したノーザンブロットをスクリーニングした。ブロット上の各列は、セイヨウアブラナ胚形成の種々の段階からの等量の根、葉または胚ポリ（Ａ）＋尾部ｍＲＮＡを有した。結果は、胚形成中にＢＣＣＰｍＲＮＡ発現が急上昇し、胚形成の中間部の間にピークに達したことを示した。根には顕著な量のＢＣＣＰｍＲＮＡが存在したが、葉には比較的低量が存在した。ｃＤＮＡクローニングノーザンブロットデータは、アブラナポリＡ＋尾部ｍＲＮＡに由来するアブラナ胚ｃＤＮＡライブラリーが、ＢＣＣＰクローンをスクリーニングするのに最も適していることを示唆した。約１５０，０００の組換え体プラークをスクリーニングした。ハイブリッド形成性プラークは３回のスクリーニングによって得られ、その時点でそれらは純粋なプラークであった。抗ビオチン分析約２０クローンが３回のスクリーニングによって得られたので、クローン同一性の初期指標が必要とされた。スクリーニングに用いられたライブラリーは、発現ベクターλＺＡＰIIを用いて構築された。コードされたタンパク質を発現するように誘導されたλＺＡＰIIクローンは、発現されたタンパク質中にビオチニル化部位が存在するという条件ならば、大腸菌宿主によってビオチニル化されうるということが以前に示されていた。少なくとも一つのインサートがインフレームであり且つ正しい配向であるならば、そのクローンは、優先的配列順序についてこのビオチニル化法によって識別されるであろう。ライブラリースクリーニングからの正のクローンは、ＩＰＴＧ処置によってそれらのタンパク質を発現するように誘導され、そしてペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン／ＥＣＬ検出システムを用いてスクリーニングされた。タンパク質ブロットデータノーザン分析からの転写物寸法は、ＢＣＣＰタンパク質をコードしている完全長さｍＲＮＡが１．３ｋｂであることを示した。これは、約２５ｋＤａのポリペプチドをコードすると考えられる。更に、胚での発現は、葉の場合の約２０倍であることが示された。アブラナ種子および葉からの新鮮な全タンパク質抽出物を用い、ビオチン含有タンパク質を識別するのにヨウ素１２５（Ｉ¹²⁵）標識ストレプトアビジンを用いてウェスタンブロットを行った。約３５ｋＤａのビオチン含有タンパク質はアブラナ胚に存在したが、葉抽出物には存在しなかったことが判った。このデータはノーザン分析データと一致するので、そのタンパク質はアブラナＢＣＣＰ遺伝子の生産物でありうる。配列分析ライブラリースクリーニングからの正のクローンを配列決定した。６クローンを識別し、そしてｐＢＰ１、ｐＢＰ２、ｐＢＰ３、ｐＢＰ４、ｐＢＰ６およびｐＢＰ７と表示した。ｐＢＰ１の配列は、配列番号１として示される。その配列は、塩基４７８〜４９３の推定上のビオチン結合部位を有する。ｐＢＰ１は、アナベナ属および大腸菌のＢＣＣＰ遺伝子とかなりのアミノ酸配列相同性を示す。ｐＢＰ２の配列は、配列番号２として示される。推定上のビオチン結合部位は塩基９１〜１０６である。ｐＢＰ２は、ｐＢＰ１とかなりのアミノ酸相同性を示す。ｐＢＰ３の配列は、配列番号３として示される。配列ｐＢＰ４および６は、それぞれ配列番号４および配列番号５として示される。ｐＢＰ７の配列は、配列番号６として示される。ｐＢＰ７は、大腸菌のＢＣＣＰ遺伝子とかなりのアミノ酸配列相同性を示す。材料および方法ｃＤＮＡライブラリー構築（ｉ）用いられるｃＤＮＡライブラリーを、ロジマン（Logemann）らの方法にしたがって中期発育 Jet neuf アブラナ胚（開花後約３５日目に採取された）から単離されたポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡを用いて作成した。最初の鎖合成は、ポリｄＴオリゴプライマーを用いて製造者の指示（アマーシャム・インターナショナル（Amersham International））にしたがって行われた。作成され得られたｃＤＮＡを、λ−ＺＡＰIIのＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ部位中に製造者（ストラタジーン（Stratagene））によって指示された通りの方向にクローン化した。用いられた宿主細菌は、ＸＬ-1 Blue（ストラタジーン）であった。プローブ製造および標識付けアブラナライブラリーをスクリーニングするためのｃＤＮＡプローブは、プラスミドＤＮＡの適当な制限エンドヌクレアーゼ消化によって作成された。必要なＤＮＡフラグメントを、ＴＡＥアガロース電気泳動によってベクターＤＮＡから分離し、そしてジェネクリーン（GeneClean）II キット（Bio 101）を用いてまたは凍結および限外濾過によって単離した。プローブ（２００〜３００ｎｇ）を、メガプライム（Megaprime）キットを用いて製造者（アマーシャム・インターナショナル）によって指示された通りに［ α³²Ｐ］ｄＣＴＰで５ｘ１０⁹ｃｍｐ／μｇのレベルまで放射性標識した。取り込まれなかった標識は、バイオスピン（Biospin）クロマトグラフィーカラム（バイオラド（Biorad））を用いて除去された。ライブラリースクリーニング１５０，０００プラーク形成単位を、前に記載のようにスクリーニングした。フィルターを６５℃でハイブリッド形成させた。ｃＤＮＡクローンのプラスミド保護は、「λ−ＺＡＰIIからのｐＳＫの in vivo 切断」に関するストラタジーンプロトコールで記載の通り行われた。ＤＮＡクローンの配列決定配列決定は、アプライド・バイオシステムズ・インコーポレーテッド（Applie d Biosystems Inc.）３７３ＡＤＮＡシークエンサー（ダーラム大学配列決定サービス、Ms J バートリー（Bartley））を用いて行われた。前進および逆プライマー（−２１ｍ１３およびＭ１３ＲＰＩ）両方を全てのクローンに最初に用いた。重なり（nested）欠失は、ファーマシア（d.s.Nested Deletion Kit）によって指示された通りに作成され、そして前進および逆プライマー並びに合成オリゴヌクレオチドプライマーの組合せを用いて配列決定された。プライマーは、３８１ＡＤＮＡ合成機（アプライド・バイオシステムズ・インコーポレーテッド）を用いて製造された。ＤＮＡ配列の計算機分析は、ダレスバリーのＳＥＲＣ装置からのＳＥＱＮＥＴパッケージおよびＤＮＡストライダー（Strider）を用いて行われるであろう。ノーザンブロット分析ポリＡ＋ｍＲＮＡは、開花後１５日、２２日、２９日、３６日、４２日および４９日目に採取された若い葉５ｇかまたは胚５ｇから、指示された手順（ファーマシアｍＲＮＡ精製キット）を用いて製造された。１〜５μｇを、電気泳動用の１％ホルムアミド／ホルムアルデヒドアガロースゲル上に充填した。ノーザンブロット法は、前に記載のように行われた。λクローンの発現およびビオチニル化検出約２ｘ１０⁵p.f.u.を、４２℃で「針穴」寸法プラークが現れるまで（約３〜４時間）増殖後、宿主菌株として大腸菌ＫＷ２５１を用いて３個の大型ＮＺＹＭプレートそれぞれにプレーティングし、そしてそれらプレートの上に、１０ｍＭＩＰＴＧ中に予め浸漬されたニトロセルロースフィルター（２０ｘ２０ｃｍ）を載せ且つ乾燥させた。次に、プラークの増殖を３７℃で一晩中続けた。一晩中インキュベーション後、フィルターを取り除き且つＴＢＳ（５０ｍＭトリスｐＨ７．５、０．２ＭＮａＣｌ、０．５ｍＭＣａＣｌ₂、５０ｍＭＭｇＣｌ₂）中で簡単に洗浄した。それら膜を、ＴＢＳ／１％（ｗ／ｖ）ヘモグロビン中において３０℃で２時間、続いてブロック緩衝液／ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（シロテク（Sirotech））中で更に２時間ブロッキングした。次に、膜をＴＢＳ／０．０５％トゥイーン（Tween）２０中において室温で充分に洗浄した。ＥＣＬ可視化システムを用いて、製造者（アマーシャム）によって記載の通り正のクローンを識別した。粗抽出物の製造新鮮な植物材料を液体窒素中で凍結させ、そして乳鉢および乳棒によって凍結粉砕した。得られた微粉をエッペンドルフ中に入れ、そして４容量のＸＩ試料充填緩衝液を加えた。そのスラリーを直ちに５分間沸騰させ、そして卓上ミクロ遠心機中で１０分間遠心分離した。上澄みを取出し、そして−８０℃で分別して貯蔵した。タンパク質試料は、製造後２か月までに用いられた。ウェスタンブロッティングＳＤＳＰＡＧＥ後、タンパク質をプロブロット（ProBlot）（ＡＢＩ）上に半乾燥ブロッティングによってブロッティングした。マーカータンパク質を、ポンソー（Ponceau）染色によって製造者の指示にしたがって配置した。膜を、１％ヘモグロビン、２０ｍＭトリスｐＨ７．２、１７０ｍＭＮａＣｌで絶えず混合しながら１時間ブロッキングした。１２５結合ストレプトアビジンを１：２００の比率で加え、そして室温で一晩中インキュベートした。ブロットを、０．２％ノニデト（Nonidet）Ｐ４０ブロッキング溶液を用いて１時間の間に洗浄液を数回交換して充分に洗浄した。ブロットをＸ線フィルムに１〜７日間暴露した。ウェスタンブロットは、ＢＣＣＰレベルを示す結果を与えた。特異的ＢＣＣＰ抗体の不存在下において、およびＢＣＣＰが in vivo でビオチニル化されているために、ビオチン特異的抗血清を用いてビオチン特異的抗体を生じさせた。スカシガイのヘモシアニンをビオチンで被覆し、そしてウサギにおいて抗原として用いた。ウェスタンブロットでの偽バックグラウンドシグナルを最小限にするために、生じた抗体全部をアフィニティー精製した。これは、ビオチン−アガロースマトリックス上のカラムクロマトグラフィーによって行われた。ＢＣＣＰタンパク質バンドの理論上の寸法は、配列番号４および配列番号５である二つの最長クローンからの２２．７ｋＤａおよび２１．９ｋＤａで予測された。しかしながら、原核性ＢＣＣＰ実験を記載した以前の研究は、大腸菌ＢＣＣＰのプロリン／アラニンが多い部分が例外的にＳＤＳゲルを与えることを示した。タンパク質は、その配列から推定されるよりも３５％少ない移動度で流れる。セイヨウアブラナＢＣＣＰ配列も、同様のプロリン／アラニンが多い部分を有するので、正確な分子質量をＳＤＳゲル移動度から予測することはできないであろう。抗体を用いる実験は、エントウ葉緑素中の１つのビオチニル化タンパク質がＡＣＣアーゼの３５ｋＤａＢＣＣＰサブユニットであることを示した。同様に、セイヨウアブラナ葉緑体タンパク質のウェスタンブロットは、一つのビオチニル化タンパク質だけが葉緑体中に存在することを示した。したがって、セイヨウアブラナの根、葉および胚抽出物のウェスタンブロットで示された３５ｋＤａバンドはＢＣＣＰである可能性が高い。アブラナ種子胚からの色素体の精製もまた、ビオチニル化ポリペプチドが色素体中に局在していることを示した。更に、同レベルのタンパク質をゲル上に最初に充填したが、ＢＣＣＰレベルは、胚におけるそれと比較して、根および葉において低かった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．植物の脂肪酸生産能力を調節する方法であって、アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼビオチンカルボキシルキャリヤータンパク質をコードしている遺伝子の発現を調節することを含む上記方法。２．調節が、前記遺伝子の過発現を含む請求項１に記載の方法。３．前記遺伝子の過発現が、前記タンパク質をコードする発現可能な遺伝子構築物の１個または２個以上のコピーの植物のゲノム中への安定した挿入によって達成される請求項２に記載の方法。４．調節が、前記遺伝子の発現のダウンレギュレーションを含む請求項１に記載の方法。５．前記遺伝子のダウンレギュレーションが、前記遺伝子の内因性ＤＮＡ配列の全部または一部分に対して相補的なＤＮＡを含む転写可能なＤＮＡ配列を含有するアンチセンス遺伝子構築物の植物のゲノム中への安定した挿入によって達成される請求項４に記載の方法。６．前記遺伝子のダウンレギュレーションが、前記遺伝子をコードしている内因性ＤＮＡ配列のフラグメントを含む転写可能なＤＮＡを含有するセンス遺伝子構築物の植物のゲノム中への安定した挿入によって達成される請求項４に記載の方法。７．ＩＤ−１、ＩＤ−２、ＩＤ−３、ＩＤ−４、ＩＤ−５またはＩＤ−６および遺伝コードの縮重によって可能になるその変異型から選択されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ。８．植物中で操作可能な遺伝子プロモーター、請求項７に記載のＤＮＡを含む転写可能な部分およびポリアデニル化シグナルを含むベクター。９．請求項７に記載のＤＮＡを含む組換え植物ゲノム。