JP2002521028A

JP2002521028A - 植物からのコリスミ酸合成酵素

Info

Publication number: JP2002521028A
Application number: JP2000561299A
Authority: JP
Inventors: カフーン，レベツカ・イー; フアルコ，サベリオ・カール; ペンバー，スチーブン・オー
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Priority date: 1998-07-21
Filing date: 1999-07-20
Publication date: 2002-07-16
Also published as: WO2000005386A3; EP1098984A2; WO2000005353A3; EP1098963A2; WO2000005386A2; AU5113899A; AU5113999A; US20040064848A1; JP2002522024A; WO2000005353A2; WO2000005387A1; AU5218799A

Abstract

(57)【要約】本発明はコリスミ酸合成酵素をコードする単離された核酸フラグメントに関する。本発明はまた、センスもしくはアンチセンスの向きでコリスミ酸合成酵素の全部もしくは一部分をコードするキメラ遺伝子の構築にも関し、ここで、該キメラ遺伝子の発現は、形質転換された宿主細胞中でのコリスミ酸合成酵素の変えられたレベルの産生をもたらす。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本出願は、１９９８年７月２１日に出願された米国仮出願第６０／０９３，６
１１号の利益を主張する。

【０００２】（発明の分野）本発明は植物分子生物学の分野にある。より具体的には、本発明は、植物およ
び種子中でコリスミ酸生合成に関与する酵素をコードする核酸フラグメントに関
する。

【０００３】（発明の背景）コリスミ酸の生合成は、芳香族アミノ酸フェニルアラニン、チロシンおよびト
リプトファンの産生に共通の経路の最後の数段階を必要とする。シキミ酸経路を
介して産生される芳香族アミノ酸の生合成の最後の共通段階は、５−エノールピ
ルビルシキミ酸３−リン酸からコリスミ酸を産生するコリスミ酸合成酵素により
触媒される。該酵素は補助因子として還元型ＦＭＮを必要とする。トマトでは２
形態の酵素が記述されている。トマトのコリスミ酸合成酵素１および２はアミノ
酸レベルで８８％の同一性を有し、かつ、花、根および茎中で特異に発現される
（ゴルラッハ（Ｇｏｒｌａｃｈ，Ｊ．）とシュミット（Ｓｃｈｍｉｄ，Ｊ．）（
１９９３）ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ２３：７０７−７１６）。

【０００４】この酵素の量もしくは活性のいずれかの操作は、トウモロコシ、コメ、ダイズ
およびコムギを包含する植物中の非芳香族アミノ酸に対する芳香族アミノ酸の比
の操作を与えるとみられる。本酵素はまた、除草剤としての使用に適する化合物
の高スループットスクリーニングにも有用であるはずである。

【０００５】（発明の要約）本発明はコリスミ酸合成酵素をコードする単離された核酸フラグメントに関す
る。とりわけ、本発明は、コリスミ酸合成酵素をコードする単離された核酸フラ
グメント、およびコリスミ酸合成酵素をコードする単離された核酸フラグメント
に本質的に類似である単離された核酸フラグメントに関する。加えて、本発明は
、コリスミ酸合成酵素をコードする核酸フラグメントに相補的である核酸フラグ
メントに関する。

【０００６】本発明のさらなる一態様は、コリスミ酸合成酵素の全部もしくは本質的な部分
をコードするポリペプチドに関する。

【０００７】別の態様において、本発明は、適する調節配列に操作可能に連結された、コリ
スミ酸合成酵素をコードするキメラ遺伝子、もしくはコリスミ酸合成酵素をコー
ドする核酸フラグメントに相補的である核酸フラグメントを含んで成るキメラ遺
伝子に関し、ここで、該キメラ遺伝子の発現は、形質転換された宿主細胞中での
コードされたタンパク質の、形質転換されない宿主細胞で産生されるレベルから
変えられている（すなわち増大もしくは減少されている）レベルの産生をもたら
す。

【０００８】さらなる一態様において、本発明は、適する調節配列に操作可能に連結された
、コリスミ酸合成酵素をコードするキメラ遺伝子をそのゲノム中に含んで成る形
質転換された宿主細胞に関する。該キメラ遺伝子の発現は、該形質転換された宿
主細胞中でのコードされたタンパク質の変えられたレベルの産生をもたらす。形
質転換された宿主細胞は真核生物もしくは原核生物起源のものであることができ
、また、高等植物および微生物由来の細胞を包含する。本発明はまた、高等植物
の形質転換された宿主細胞から生じる形質転換された植物、およびこうした形質
転換された植物由来の種子も包含する。

【０００９】本発明のさらなる一態様は、ａ）コリスミ酸合成酵素をコードする核酸フラグ
メントを含んで成るキメラ遺伝子で宿主細胞を形質転換すること；およびｂ）該
形質転換された宿主細胞を、該キメラ遺伝子の発現に適する条件下で成長させる
ことを含んで成る、形質転換された宿主細胞中でのコリスミ酸合成酵素の発現の
レベルを変える方法に関し、ここで、該キメラ遺伝子の発現が、形質転換された
宿主細胞中でのコリスミ酸合成酵素の変えられたレベルの産生をもたらす。

【００１０】本発明のさらなる一態様は、コリスミ酸合成酵素をコードするアミノ酸配列の
全部もしくは本質的な部分をコードする核酸フラグメントを得る方法に関する。

【００１１】本発明のさらなる一態様は、コリスミ酸合成酵素の活性を阻害するその能力に
ついての最低１種の化合物の評価方法であり、該方法は、（ａ）適する調節配列
に操作可能に連結された、コリスミ酸合成酵素をコードする核酸フラグメントを
含んで成るキメラ遺伝子で宿主細胞を形質転換すること；（ｂ）該キメラ遺伝子
の発現に適する条件下で形質転換された宿主細胞を成長させることであって、こ
こで、該キメラ遺伝子の発現が、形質転換された宿主細胞中でのコリスミ酸合成
酵素の産生をもたらす；（ｃ）場合によっては、形質転換された宿主細胞により
発現されたコリスミ酸合成酵素を精製すること；（ｄ）コリスミ酸合成酵素を試
験されるべき化合物で処理すること；および（ｅ）試験化合物で処理されたコリ
スミ酸合成酵素の活性を、未処理のコリスミ酸合成酵素の活性と比較して、それ
により阻害活性の潜在能力をもつ化合物を選択すること、の段階を含んで成る。
配列の簡単な説明本発明は、以下の詳細な記述、および本出願の一部を形成する付随する配列表
からより十分に理解することができる。

【００１２】表１は、本明細書で記述されるポリペプチド、これらのポリペプチドの全部も
しくは本質的な部分を表すポリペプチドをコードする核酸フラグメントを含んで
成るｃＤＮＡクローンの呼称、および付属された配列表で使用されるような対応
する識別名(identifier)（配列番号）を列挙する。配列の記述およびそれに付属
された配列表は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１−１．８２５に示されるよう
な、特許出願におけるヌクレオチドおよび／もしくはアミノ酸配列の開示に適用
される規則に従う。

【００１３】

【表１】

【００１４】配列表は、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１３：３０２１
−３０３０（１９８５）およびＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ２１
９（Ｎｏ．２）：３４５−３７３（１９８４）［引用により本明細書に組込まれ
る］に記述されるＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＭＢ標準に従って特定されるとおり、ヌク
レオチド配列文字の１文字記号およびアミノ酸の３文字記号を含有する。ヌクレ
オチドおよびアミノ酸の配列データに使用される記号および形式は、３７Ｃ．
Ｆ．Ｒ．§１．８２２に示される規則に従う。

【００１５】

【発明の詳細な記述】

本開示の情況においては多数の用語を利用する。本明細書で使用されるところ
の「核酸フラグメント」は、合成の、非天然のもしくは変えられたヌクレオチド
塩基を場合によっては含有する、一本鎖もしくは二本鎖であるＲＮＡもしくはＤ
ＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形態の核酸フラグメントは、ｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡもしくは合成ＤＮＡの１個もしくはそれ以上のセグメントより
構成されてよい。

【００１６】本明細書で使用されるところの「本質的に類似の」は、１個もしくはそれ以上
のヌクレオチド塩基の変化が１個もしくはそれ以上のアミノ酸の置換をもたらす
がしかし該ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの機能的特性に影
響を及ぼさない核酸フラグメントを指す。「本質的に類似の」はまた、１個もし
くはそれ以上のヌクレオチド塩基の変化が、例えばアンチセンスもしくは共抑制
(cosuppression)技術により遺伝子を沈黙させること(gene silencing)による遺
伝子発現の変化を媒介する該核酸フラグメントの能力に影響を及ぼさない核酸フ
ラグメントも指す。「本質的に類似の」はまた、遺伝子の沈黙(gene silencing)
もしくは生じるタンパク質分子の機能的特性の変化を媒介する能力に関して、生
じる転写物の機能的特性に本質的に影響を及ぼさない、１個もしくはそれ以上の
ヌクレオチドの欠失もしくは挿入のような本発明の核酸フラグメントの改変も指
す。従って、本発明が特定の例示的なヌクレオチドもしくはアミノ酸の配列以上
を包含しかつそれらの機能的同等物を包含することが理解される。

【００１７】例えば、遺伝子発現のアンチセンス抑制および共抑制は、ある遺伝子のコーデ
ィング領域全体未満を表す核酸フラグメントを使用して、および抑制されるべき
遺伝子と１００％の配列の同一性を共有しない核酸フラグメントにより達成する
ことができることが、当該技術分野で公知である。さらに、所定の一部位で化学
的に同等なアミノ酸の産生をもたらすがしかしコードされたポリペプチドの機能
的特性に影響を与えない核酸フラグメント中の変化は、当該技術分野で公知であ
る。従って、疎水性アミノ酸であるアミノ酸アラニンのコドンを、グリシンのよ
うな別の疎水性のより小さい残基、またはバリン、ロイシンもしくはイソロイシ
ンのようなより疎水性の残基をコードするコドンにより置換してよい。同様に、
グルタミン酸の代わりにアスパラギン酸のような１個の負に荷電した残基の別の
もの、もしくはアルギニンの代わりにリシンのような１個の正に荷電した残基の
別のものへの置換をもたらす変化もまた、機能的に同等な産物を生じさせること
を期待することが可能である。ポリペプチド分子のＮ末端およびＣ末端部分の変
化をもたらすヌクレオチド変化もまた、該ポリペプチドの活性を変えることが期
待されないとみられる。提案された改変のそれぞれは、コードされた産物の生物
学的活性の保持の測定でそうであるように、当該技術分野の慣例の熟練内に十分
にある。

【００１８】さらに、本質的に類似の核酸フラグメントは、ハイブリダイズするそれらの能
力によってもまた特徴づけてよい。こうした相同性の推定は、当業者により十分
理解されているように、ストリンジェンシーの条件下でのＤＮＡ−ＤＮＡもしく
はＤＮＡ−ＲＮＡのいずれかのハイブリダイゼーションにより提供される（ヘイ
ムズ（Ｈａｍｅｓ）とヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）編、（１９８５）Ｎｕｃｌｅ
ｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ、ＩＲＬプレス（ＩＲＬＰｒｅ
ｓｓ）、英国オックスフォード）。遠く関連する生物体からの相同な配列のよう
な適度に類似のフラグメント、ないし緊密に関連する生物体からの機能的酵素を
再現する遺伝子のような高度に類似のフラグメントについてスクリーニングする
ために、ストリンジェンシーの条件を調節することが可能である。ハイブリダイ
ゼーション後の洗浄がストリンジェンシーの条件を決定する。一組の好ましい条
件は、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、室温で１５分間で開始し、その後２×ＳＳ
Ｃ、０．５％ＳＤＳ、４５℃で３０分間で反復され、そしてその後０．２×ＳＳ
Ｃ、０．５％ＳＤＳ、５０℃で３０分間で２回反復される一連の洗浄を使用する
。より好ましい一組のストリンジェントな条件はより高温を使用し、ここでの洗
浄は、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中での最後の２回の３０分洗浄の温度を
６０℃に上昇させたことを除いて上のものに同一である。別の好ましい組の高度
にストリンジェントな条件は、６５℃で０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの２
回の最終洗浄を使用する。

【００１９】本発明の本質的に類似の核酸フラグメントはまた、当業者により普遍的に使用
されるアルゴリズムにより決定されるように、本明細書で開示されるアミノ酸配
列に対するそれらがコードするアミノ酸配列の同一性のパーセントも特徴として
よい。そのヌクレオチド配列が、本明細書で報告されるアミノ酸配列に８０％同
一であるアミノ酸配列をコードする核酸フラグメントが好ましい。本明細書で報
告されるアミノ酸配列に９０％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸フラグ
メントがより好ましい。本明細書で報告されるアミノ酸配列に９５％同一である
アミノ酸配列をコードする核酸フラグメントが最も好ましい。配列の整列および
同一性パーセントの計算は、レーザージーン［ＬＡＳＡＲＧＥＮＥ］生物情報科
学コンピュータ計算ソフトウェアパッケージ（ＤＮＡスターインク（ＤＮＡＳ
ＴＡＲＩｎｃ．）、ウィスコンシン州マディソン）のメガライン（Ｍｅｇａｌ
ｉｇｎ）プログラムを使用して実施した。配列の複数の整列は、デフォルトのパ
ラメータ（ギャップペナルティ(GAP PENALTY)＝１０、ギャップ長ペナルティ(GA
P LENGTH PENALTY)＝１０）を用い、整列のクラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法（
ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）とシャープ（Ｓｈａｒｐ）（１９８９）ＣＡＢＩＯ
Ｓ５：１５１−１５３）を使用して実施した。クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）
法を使用する対にした整列のためのデフォルトのパラメータは、Ｋタプル(KTUPL
E)１、ギャップペナルティ＝３、ウィンドウ(WINDOW)＝５およびダイアゴナルズ
セイブド(DIAGONALS SAVED)＝５であった。

【００２０】アミノ酸もしくはヌクレオチド配列の「本質的な部分」は、該アミノ酸もしく
はヌクレオチド配列が含んで成るタンパク質もしくは遺伝子の推定の同定を与え
るのに十分であるアミノ酸もしくはヌクレオチド配列を含んで成る。アミノ酸お
よびヌクレオチド配列は、当業者により人的に、もしくはＢＬＡＳＴ（基本的局
所整列検索ツール（ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃ
ｈＴｏｏｌ）；アルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏ
ｖ／ＢＬＡＳＴ／もまた参照されたい）のようなアルゴリズムを使用するコンピ
ュータに基づく配列比較および同定のツールを使用することによるかのいずれか
で評価することが可能である。一般に、あるポリペプチドもしくは核酸配列を、
既知のタンパク質もしくは遺伝子に対して相同として推定で同定するためには、
１０もしくはそれ以上の連続するアミノ酸または３０もしくはそれ以上の連続す
るヌクレオチドの配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関しては、遺
伝子の同定（例えばサザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば、細菌
コロニーもしくはバクテリオファージのプラークのインシトゥハイブリダイゼー
ション）の配列に依存する方法では、３０もしくはそれ以上の連続するヌクレオ
チドを含んで成る遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用することがで
きる。加えて、プライマーを含んで成る特定の核酸フラグメントを得るために、
１２もしくはそれ以上のヌクレオチドの短いオリゴヌクレオチドをＰＣＲでの増
幅プライマーとして使用することができる。従って、ヌクレオチド配列の「本質
的な部分」は、該配列を含んで成る核酸フラグメントの特異的な同定および／も
しくは単離を与えることができるヌクレオチド配列を含んで成る。本明細は、１
種もしくはそれ以上の特定の植物タンパク質を含んで成るポリペプチドをコード
するアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。本明細書に報告されるような
配列の恩恵を有する当業者は、今や、当業者に既知の目的上、開示される配列の
全部もしくは本質的な部分を使用してよい。従って、本発明は、付随する配列表
で報告されるような完全な配列、ならびに上で特定されたようなそれらの配列の
本質的部分を含んで成る。

【００２１】「コドンの縮重」は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響を与え
ることなくヌクレオチド配列の変動を可能にする遺伝暗号中の逸脱を指す。従っ
て、本発明は、本明細書に示されるアミノ酸配列の全部もしくは本質的な部分を
コードするヌクレオチド配列を含んで成るいかなる核酸フラグメントにも関する
。当業者は、ある所定のアミノ酸を特定するヌクレオチドコドンの使用頻度にお
ける特定の宿主細胞により表される「コドンの偏り」を十分認識している。従っ
て、ある宿主細胞中での改良された発現のための核酸フラグメントを合成する場
合、コドン使用頻度のその頻度が該宿主細胞の好ましいコドン使用頻度の頻度に
近づくような核酸フラグメントを設計することが望ましい。

【００２２】「合成核酸フラグメント」は、当業者に既知の手順を使用して化学的に合成さ
れるオリゴヌクレオチド基礎単位から集成することが可能である。これらの基礎
単位は連結およびアニーリングされて、その後に所望の核酸フラグメント全体を
構築するように酵素的に集成することができるより大きな核酸フラグメントを形
成する。核酸フラグメントに関するところの「化学的に合成される」は、該成分
ヌクレオチドがインビトロで集成されたことを意味する。核酸フラグメントの人
的な化学合成は、十分に確立された手順を使用して達成することができるか、も
しくは、多数の商業的に入手可能な機械の１つを使用して自動化学合成を実施す
ることが可能である。従って、該核酸フラグメントは、宿主細胞のコドンの偏り
を反映するヌクレオチド配列の至適化に基づいた最適な遺伝子発現を適応させる
ことが可能である。当業者は、コドンの使用頻度を宿主により好まれるコドンに
偏らせる場合に、成功裏の遺伝子発現の見込みを認識する。好ましいコドンの決
定は、配列情報が入手可能である宿主細胞由来の遺伝子の調査に基づくことが可
能である。

【００２３】「遺伝子」は特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントを指し、コーディ
ング配列に先行する（５’非コーディング配列）およびその後に続く（３’非コ
ーディング配列）調節配列を包含する。「本来の遺伝子」はそれ自身の調節配列
とともに天然に見出されるような遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然に一
緒に見出されない調節配列およびコーディング配列を含んで成る、本来の遺伝子
でないいかなる遺伝子も指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる供給源由来であ
る調節配列およびコーディング配列、もしくは同一の供給源由来のしかし天然に
見出されるものと異なる様式で配置される調節配列およびコーディング配列を含
むことができる。「内在性遺伝子」は、生物体のゲノム中にその天然の位置にあ
る本来の遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、宿主生物体中で通常は見出されない
がしかし遺伝子導入により宿主生物体中に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子
は、非天然の生物体中に挿入された本来の遺伝子、もしくはキメラ遺伝子を含む
可能性がある。「導入遺伝子(transgene)」は、形質転換処置によりゲノム中に
導入されている遺伝子である。

【００２４】「コーディング配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
を指す。「調節配列」は、コーディング配列の上流（５’非コーディング配列）
、その内もしくは下流（３’非コーディング配列）に配置され、そして関連する
コーディング配列の転写、ＲＮＡのプロセシングもしくは安定性、または翻訳に
影響するヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配
列、イントロンおよびポリアデニル酸化認識配列を包含することができる。

【００２５】「プロモーター」は、コーディング配列もしくは機能的ＲＮＡの発現を制御す
ることが可能なヌクレオチド配列を指す。一般に、コーディング配列はプロモー
ター配列に対し３’に配置される。プロモーター配列は、近接およびより遠位の
上流要素より成り、後者の要素はしばしばエンハンサーと称される。従って、「
エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することが可能でありかつプロモー
ターのレベルもしくは組織特異性を高めるように挿入されたプロモーターの内在
的要素もしくは異種要素であることができるヌクレオチド配列である。プロモー
ターはそっくりそのまま本来の遺伝子に由来してよいか、もしくは、天然に見出
される多様なプロモーター由来の多様な要素から構成されてよいか、もしくは合
成ヌクレオチドセグメントさえ含むことができる。多様なプロモーターは、多様
な組織もしくは細胞型において、または発生の多様な段階で、または多様な環境
条件に応答して、遺伝子の発現を指図することができることが、当業者により理
解される。大部分の時間で大部分の細胞型で核酸フラグメントを発現させるプロ
モーターは普遍的に「構成プロモーター」と称される。植物細胞中で有用な多様
な型の新規プロモーターが常に発見されており；多数の例をオカムロ（Ｏｋａｍ
ｕｒｏ）とゴールドバーグ（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ）による編集物、（１９８９）Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆＰｌａｎｔｓ１５：１−８２中で見出すこと
ができる。大部分の場合で調節配列の正確な境界が完全に特定されていないため
、多様な長さの核酸フラグメントが同一のプロモーター活性を有することができ
ることがさらに認識される。

【００２６】「翻訳リーダー配列」は、遺伝子のプロモーター配列とコーディング配列との
間に配置されるヌクレオチド配列を指す。翻訳リーダー配列は、翻訳開始配列の
上流の完全にプロセシングされたｍＲＮＡ中に存在する。翻訳リーダー配列は、
一次転写物のｍＲＮＡへのプロセシング、ｍＲＮＡの安定性もしくは翻訳効率に
影響を及ぼすことができる。翻訳リーダー配列の例は記述されている（ターナー
（Ｔｕｒｎｅｒ）とフォスター（Ｆｏｓｔｅｒ）（１９９５）Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３：２２５）。

【００２７】「３’非コーディング配列」は、コーディング配列の下流に配置されるヌクレ
オチド配列を指し、かつ、ポリアデニル酸化認識配列、およびｍＲＮＡのプロセ
シングもしくは遺伝子発現に影響を及ぼすことが可能な調節シグナルをコードす
る他の配列を包含する。ポリアデニル酸化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の
３’端へのポリアデニル酸領域(tract)の付加に影響を及ぼすことを特徴とする
。多様な３’非コーディング配列の使用がインゲルブレヒト（Ｉｎｇｅｌｂｒｅ
ｃｈｔ）ら（１９８９）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ１：６７１−６８０により例示
される。

【００２８】「ＲＮＡ転写物」は、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼに触媒される転写から
生じる産物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合
、それは一次転写物と称されるか、もしくは、それは一次転写物の転写後プロセ
シング由来のＲＮＡ配列であることができ、そして成熟ＲＮＡと称される。「メ
ッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、イントロンを含まずかつ細胞によりポリ
ペプチドに翻訳される可能性があるＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」はｍＲＮＡに相
補的でありかつこれに由来する二本鎖ＤＮＡを指す。「センス」ＲＮＡは、ｍＲ
ＮＡを包含しそして従って細胞によりポリペプチドに翻訳される可能性があるＲ
ＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的の一次転写物もしくはｍＲ
ＮＡの全部もしくは一部に相補的でありかつ標的遺伝子の発現を封鎖するＲＮＡ
転写物を指す（引用により本明細書に組込まれる米国特許第５，１０７，０６５
号を参照されたい）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特異的なヌクレオチド配
列のいずれかの部分、すなわち、５’非コーディング配列、３’非コーディング
配列、イントロンもしくはコーディング配列とであることができる。「機能的Ｒ
ＮＡ」は、センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡもしくは翻訳
されなくてもよいがしかし細胞の過程に対する影響をなお有する他のＲＮＡを指
す。

【００２９】「操作可能に連結される」という用語は単一の核酸フラグメントに対する２種
もしくはそれ以上の核酸フラグメントの連合を指し、その結果一方の機能が他方
により影響を及ぼされる。例えば、プロモーターは、それがあるコーディング配
列の発現に影響を及ぼすことが可能である場合（すなわち、該コーディング配列
が該プロモーターの転写制御下にある）は、そのコーディング配列と操作可能に
連結されている。コーディング配列は、センスもしくはアンチセンスの向きで調
節配列に操作可能に連結することが可能である。

【００３０】本明細書で使用されるところの「発現」という用語は、本発明の核酸フラグメ
ント由来のセンスＲＮＡ（ｍＲＮＡ）もしくはアンチセンスＲＮＡの転写および
安定な蓄積を指す。発現はｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指してもまたよい
。「アンチセンス阻害」は、標的タンパク質の発現を抑制することが可能なアン
チセンスＲＮＡ転写物の産生を指す。「過剰発現」は、正常のもしくは形質転換
されない生物体での産生のレベルを超える、トランスジェニック生物体での遺伝
子産物の産生を指す。「共抑制」は、同一のもしくは本質的に類似の外来もしく
は内在性遺伝子の発現を抑制することが可能なセンスＲＮＡ転写物の産生を指す
（引用により本明細書に組込まれる米国特許第５，２３１，０２０号）。

【００３１】「変えられたレベル」は、正常なもしくは形質転換されない生物体の量もしく
は比率と異なる量もしくは比率での、トランスジェニック生物体での遺伝子産物
（１種もしくは複数）の産生を指す。

【００３２】「成熟」タンパク質は、転写後にプロセシングされたポリペプチド；すなわち
一次翻訳産物中に存在するいかなるプレペプチドもしくはプロペプチドもそれか
ら除去されているものを指す。「前駆体」タンパク質は、ｍＲＮＡの翻訳の一次
産物；すなわちプレペプチドおよびプロペプチドがなお存在するものを指す。プ
レペプチドおよびプロペプチドは、限定されるものでないが細胞内局在化シグナ
ルであることができる。

【００３３】「葉緑体輸送ペプチド」は、１個のタンパク質とともに翻訳されかつ葉緑体も
しくはタンパク質が産生される細胞中に存在する他のプラスチド型に該タンパク
質を向かわせるアミノ酸配列である。「葉緑体輸送配列」は、葉緑体輸送ペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列を指す。「シグナルペプチド」は、１種のタン
パク質とともに翻訳されかつ該タンパク質を分泌系に向かわせるアミノ酸配列で
ある（クリスピールズ（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ）（１９９１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．
ＰｌａｎｔＰｈｙｓ．ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２：２１−５３）。
タンパク質が液胞に向けられるべきである場合は、液胞ターゲッティングシグナ
ル（上記）がさらに付加される可能性があるか、もしくは、小胞体に向けられる
場合には、小胞体保持シグナル（上記）が付加されることができる。タンパク質
が核に向けられるべきである場合には、存在するいかなるシグナルペプチドも除
去されかつ代わりに核局在化シグナルが包含されるはずである（ライケル（Ｒａ
ｉｋｈｅｌ）（１９９２）ＰｌａｎｔＰｈｙｓ．１００：１６２７−１６３２
）。

【００３４】「形質転換」は、遺伝学的に安定な遺伝をもたらす、宿主生物体のゲノム中へ
の核酸フラグメントの導入を指す。形質転換された核酸フラグメントを含有する
宿主生物体は「トランスジェニック」生物体と称される。植物の形質転換の方法
の例は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性の形質転
換（デブレレ（ＤｅＢｌａｅｒｅ）ら（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ
．１４３：２７７）、および粒子加速型もしくは「ジーンガン(gene gun)」形質
転換技術（クライン（Ｋｌｅｉｎ）ら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ
）３２７：７０−７３；米国特許第４，９４５，０５０号、引用により本明細書
に組込まれる）を包含する。

【００３５】本明細書で使用される標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当
該技術分野で公知であり、かつ、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らＭｏｌ
ｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ；
コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）：コールドスプリン
グハーバー、１９８９（以下で「マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）」）に、よ
り十分に記述される。

【００３６】いくつかのコリスミ酸合成酵素の少なくとも一部分をコードする核酸フラグメ
ントは単離されており、かつ、当業者に公知のＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用し
た、ヌクレオチドおよびタンパク質配列を含有する公的データベースとの無作為
な植物のｃＤＮＡ配列の比較により同定されている。本発明の核酸フラグメント
は、同一もしくは他の植物種からの相同なタンパク質をコードするｃＤＮＡおよ
び遺伝子を単離するのに使用してよい。配列に依存するプロトコルを使用する相
同な遺伝子の単離は当該技術分野で公知である。配列に依存するプロトコルの例
は、限定されるものでないが、核酸ハイブリダイゼーションの方法、ならびに、
核酸増幅技術（例えばポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応）の多様な用途
により例示されるようなＤＮＡおよびＲＮＡ増幅の方法を挙げることができる。

【００３７】例えば、ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして本核酸フラグメントの
全部もしくは一部分を使用して、当業者に公知の方法論を使用していずれかの所
望の植物からのライブラリーをスクリーニングすることにより、他のコリスミ酸
合成酵素をコードする遺伝子を、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡのいずれかとし
て直接単離し得る。当該技術分野で既知の方法（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ））により、本核酸配列に基づく特定のオリゴヌクレオチドプローブを設計か
つ合成することが可能である。さらに、該配列全体を直接使用して、ランダムプ
ライマー法、ニックトランスレーション、もしくは末端標識(end-labeling)技術
のような当業者に既知の方法によりＤＮＡプローブを、または利用可能なインビ
トロ転写系を使用してＲＮＡプローブを合成することが可能である。加えて、特
異的プライマーを設計し、そして本配列の一部もしくは全部を増幅するのに使用
することが可能である。生じる増幅産物は増幅反応の間に直接標識することが可
能であるか、もしくは増幅反応後に標識することが可能であり、そして、適切な
ストリンジェンシーの条件下で完全長のｃＤＮＡもしくはゲノムのフラグメント
を単離するためのプローブとして使用することができる。

【００３８】加えて、本核酸フラグメントの２個の短いセグメントをポリメラーゼ連鎖反応
のプロトコルで使用して、ＤＮＡもしくはＲＮＡからの相同な遺伝子をコードす
るより長い核酸フラグメントを増幅することができる。ポリメラーゼ連鎖反応は
また、クローン化された核酸フラグメントのライブラリーで実施してもよく、こ
こで、一方のプライマーの配列は本核酸フラグメント由来であり、そして他方の
プライマーの配列は、植物遺伝子をコードするｍＲＮＡ前駆体の３’端へのポリ
アデニル酸領域の存在を利用する。あるいは、第二のプライマー配列はクローニ
ングベクター由来の配列に基づいてよい。例えば、当業者は、ＰＣＲを使用して
転写物と３’もしくは５’端の単一点の間の領域のコピーを増幅することにより
ｃＤＮＡを生じさせるＲＡＣＥプロトコル（フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ）ら（
１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：８９９８）
に従うことが可能である。本配列から３’および５’の方向に向けられたプライ
マーを設計することが可能である。商業的に入手可能な３’ＲＡＣＥもしくは５
’ＲＡＣＥ系（ＢＲＬ）を使用して、特異的な３’もしくは５’のｃＤＮＡフラ
グメントを単離することができる（小原（Ｏｈａｒａ）ら（１９８９）Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：５６７３；ロー（Ｌｏｈ）ら（
１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４３：２１７）。３’および５’ＲＡＣＥ処置に
より生じられる産物を組み合わせて完全長のｃＤＮＡを生じさせることが可能で
ある（フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ）とマーティン（Ｍａｒｔｉｎ）（１９８９
）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１：１６５）。

【００３９】本ヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列の利用可能性は、ｃＤＮＡ発現
ライブラリーの免疫学的スクリーニングを助長する。本アミノ酸配列の部分を表
す合成ペプチドを合成することができる。これらのペプチドを使用して、該アミ
ノ酸配列を含んで成るペプチドもしくはタンパク質に対する特異性をもつポリク
ローナルもしくはモノクローナルの抗体を生じさせるため動物を免疫することが
可能である。その後、これらの抗体を使用して、目的の完全長ｃＤＮＡクローン
を単離するためにｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることが可能で
ある（ラーナー（Ｌｅｒｎｅｒ）（１９８４）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：
１；マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））。

【００４０】本発明の核酸フラグメントを、開示されるポリペプチドが正常より高もしくは
低レベルでまたはそれらが通常は見出されない細胞型もしくは発生段階で存在す
る、トランスジェニック植物を創製するのに使用してよい。これは、それらの細
胞における非芳香族アミノ酸に対する芳香族アミノ酸の比を変えるという効果を
有するとみられる。これはまた、除草剤に対して抵抗性である植物も創製するこ
とができる。

【００４１】本発明のタンパク質の過剰発現は、最初に、発生の所望の段階で所望の組織中
である遺伝子の発現を指図することが可能なプロモーターに、コーディング領域
が操作可能に連結されている、キメラ遺伝子を構築することにより達成すること
ができる。便宜的理由上、キメラ遺伝子は、同一の遺伝子由来のプロモーター配
列および翻訳リーダー配列を含んでよい。転写終止シグナルをコードする３’の
非コーディング配列もまた提供することができる。本キメラ遺伝子は、遺伝子発
現を助長するために、１個もしくはそれ以上のイントロンもまた含んでよい。

【００４２】その後、本キメラ遺伝子を含んで成るプラスミドベクターを構築することが可
能である。プラスミドベクターの選択は、宿主植物を形質転換するのに使用する
ことができる方法に依存する。当業者は、キメラ遺伝子を含有する宿主細胞を成
功裏に形質転換、選択かつ増殖させるためにプラスミドベクター上に存在しなけ
ればならない遺伝子要素を十分認識している。当業者は、多様な独立した形質転
換事象が発現の多様なレベルおよびパターンをもたらすことができること（ジョ
ーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら（１９８５）ＥＭＢＯＪ．４：２４１１−２４１８；
デアルメイダ（ＤｅＡｌｍｅｉｄａ）ら（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ２１８：７８−８６）、そして従って、所望の発現のレベルおよび
パターンを表す系統を得るために複数の事象をスクリーニングしなければならな
いこともまた認識するであろう。こうしたスクリーニングは、ＤＮＡのサザン分
析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現のウェスタン分析、もしくは
表現系分析により達成してよい。

【００４３】いくつかの応用については、本ポリペプチドを多様な細胞区画に向かわせるこ
と、もしくは細胞からのその分泌を助長することが有用であることができる。従
って、輸送配列（ケーグストラ（Ｋｅｅｇｓｔｒａ）（１９８９）Ｃｅｌｌ５
６：２４７−２５３）、シグナル配列もしくは小胞体局在化をコードする配列（
クリスピールズ（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ）（１９９１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａ
ｎｔＰｈｙｓ．ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２：２１−５３）または既
に存在するターゲッティング配列が付加および／もしくは除去された核局在化シ
グナル（ライケル（Ｒａｉｋｈｅｌ）（１９９２）ＰｌａｎｔＰｈｙｓ．１０
０：１６２７−１６３２）のような適切な細胞内ターゲッティング配列とともに
本ポリペプチドをコードするようにコーディング配列を変えることにより、上述
されたキメラ遺伝子をさらに補うことができることが予見される。引用された参
考文献はこれらのそれぞれの例を与えるが、該一覧は網羅的でなく、そして、有
用なより多くのターゲッティングシグナルが将来発見されてよい。

【００４４】いくつかの応用について、植物中での本ポリペプチドをコードする遺伝子の発
現を抑制もしくは排除することもまた望ましいことができる。これを達成するた
めには、そのポリペプチドをコードする遺伝子もしくは遺伝子フラグメントを植
物のプロモーター配列に連結することにより、本ポリペプチドの共抑制のため設
計されたキメラ遺伝子を構築することが可能である。あるいは、該遺伝子もしく
は遺伝子フラグメントを逆の向きで植物のプロモーター配列に連結することによ
り、本核酸フラグメントの全部もしくは一部のアンチセンスＲＮＡを発現するよ
う設計されたキメラ遺伝子を構築することができる。共抑制もしくはアンチセン
スキメラ遺伝子のいずれかを形質転換を介して植物に導入することが可能であり
、ここで、対応する内在性遺伝子の発現が抑制もしくは排除される。

【００４５】遺伝子発現が変えられた植物の発生に対する分子遺伝学的解決策は、より伝統
的な植物育種のアプローチを上回る決定的な利点を有する。植物の表現型の変化
は、アンチセンス阻害もしくは共抑制により１種もしくはそれ以上の遺伝子の発
現を特異的に阻害することにより生じさせることが可能である（米国特許第５，
１９０，９３１、５，１０７，０６５および５，２８３，３２３号）。アンチセ
ンスもしくは共抑制の構築物は、遺伝子活性の優勢な負の調節物質として作用す
るとみられる。慣習的な突然変異は遺伝子活性の負の調節を生じる可能性がある
一方で、これらの効果は内向性であることがもっともありそうである。トランス
ジェニックのアプローチで利用可能な優勢の負の調節は育種の見地から有利であ
ることができる。加えて、組織特異的プロモーターの使用により特定の表現型の
発現を植物の生殖組織に限定する能力は、突然変異体の遺伝子が普通に発現され
る全組織中で影響を有するかも知れない慣習的突然変異に関して、作物学的利点
を与えるかも知れない。

【００４６】当業者は、特定の遺伝子の発現を抑制するためには特別の考慮がアンチセンス
もしくは共抑制の技術の使用を伴うことを知るであろう。例えば、センスもしく
はアンチセンス遺伝子の適正な発現レベルは、当業者に既知の多様な調節要素を
利用する多様なキメラ遺伝子の使用を必要とすることができる。上述された方法
の１つによりトランスジェニック植物を得れば、所望の表現型を最も効果的に表
すものについて個々のトランスジェニック植物をスクリーニングすることが必要
になるであろう。従って当業者は多数の形質転換体のスクリーニング方法を開発
するであろう。これらのスクリーニングの性質は一般に実務的立場で選ばれるで
あろうし、そして本発明の固有の部分でない。例えば、抑制されている遺伝子に
よりコードされるタンパク質に特異的な抗体を使用することにより遺伝子発現の
変化を探すことによりスクリーニングすることが可能であるか、もしくは、酵素
活性を特異的に測定するアッセイを確立することが可能である。好ましい一方法
は多数のサンプルを迅速に処理させるものであろう。なぜなら、多数の形質転換
体が所望の表現型について陰性であるであろうことが期待されるであろうからで
ある。

【００４７】本ポリペプチド（もしくはその部分）は、異種宿主細胞、とりわけ微生物宿主
の細胞中で製造することができ、そして、当業者に公知の方法によりこれらのタ
ンパク質に対する抗体を製造するのに使用することが可能である。該抗体は、細
胞中でインシトゥで、もしくは細胞抽出物中でインビトロで本発明のポリペプチ
ドを検出するのに有用である。本ポリペプチドの産生に好ましい異種宿主細胞は
微生物宿主である。微生物の発現系および外来タンパク質の高レベル発現を指図
する調節配列を含有する発現ベクターが当業者に公知である。これらのいずれも
、本ポリペプチドの産生のためのキメラ遺伝子を構築するのに使用することが可
能である。その後、このキメラ遺伝子を、形質転換を介して適切な微生物に導入
してコードされたコリスミ酸合成酵素の高レベル発現を提供することが可能であ
る。細菌宿主中での本ポリペプチドの高レベル発現のためのベクターの一例を提
供する（実施例６）。

【００４８】加えて、除草剤として有用であることができる酵素の阻害剤の設計および／も
しくは同定を助長するための標的として本ポリペプチドを使用することが可能で
ある。これは、本明細書に記述されたポリペプチドが多数の芳香族化合物の生合
成における最後の共通の前駆体の形成を触媒するため、望ましい。従って、本明
細書に記述される酵素の活性の阻害は植物の成長の阻害につながる可能性がある
。従って、本ポリペプチドは、新たな除草剤の発見および設計に適切である可能
性がある。

【００４９】本発明の核酸フラグメントの全部もしくは本質的な部分は、それらが一部であ
る遺伝子を遺伝子的にかつ物理的にマッピングするためのプローブとして、また
、それらの遺伝子に結びつけられる形質のマーカーとしてもまた使用してよい。
こうした情報は、所望の表現型の系統を開発するために植物育種で有用であるこ
とができる。例えば、本核酸フラグメントは制限断片長多形（ＲＦＬＰ）マーカ
ーとして使用してよい。制限消化された植物のゲノムＤＮＡのサザンブロット（
マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））を、本発明の核酸フラグメントでプロービ
ングしてよい。その後、遺伝子地図を構築するために、生じるバンド形成(bandi
ng)パターンを、マップメーカー（ＭａｐＭａｋｅｒ）（ランダー（Ｌａｎｄｅ
ｒ）ら（１９８７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１：１７４−１８１）のようなコンピュ
ータプログラムを使用する遺伝子分析にかけてよい。加えて、本発明の核酸フラ
グメントは、特定された遺伝子交差の親および子孫を代表する一組の個体の制限
エンドヌクレアーゼ処理されたゲノムＤＮＡを含有するサザンブロットをプロー
ビングするのに使用してよい。ＤＮＡ多形の分離が示され、そしてこの集団を使
用して既に得られた遺伝子地図中の本核酸配列の部分を計算するのに使用される
（ボトシュタイン（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ）ら（１９８０）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅ
ｎｅｔ．３２：３１４−３３１）。

【００５０】遺伝子マッピングでの使用のための植物遺伝子由来のプローブの製造および使
用は、ベルナツキ（Ｂｅｒｎａｔｚｋｙ）とタンクスレイ（Ｔａｎｋｓｌｅｙ）
（１９８６）ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ４（１）：３
７−４１に記述されている。多数の刊行物が、上に概説された方法論もしくはそ
の変形物を使用する特定のｃＤＮＡクローンの遺伝子マッピングを記述している
。例えば、Ｆ２交雑雑種集団、戻し交雑集団、無作為交配集団、近同系系統およ
び他の組の個体をマッピングに使用してよい。こうした方法論は当業者に公知で
ある。

【００５１】本核酸配列由来の核酸プローブは物理的マッピングにもまた使用してよい（す
なわち物理的地図上での配列の配置；ホヘイゼル（Ｈｏｈｅｉｓｅｌ）ら、Ｎｏ
ｎｍａｍｍａｌｉａｎＧｅｎｏｍｉｃＡｎａｌｙｓｉｓ：ＡＰｒａｃｔ
ｉｃａｌＧｕｉｄｅ、アカデミックプレス（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ
）１９９６、ｐｐ．３１９−３４６中、およびその中に引用される参考文献を参
照されたい）。

【００５２】別の態様において、本核酸配列由来の核酸プローブは、直接蛍光インシトゥハ
イブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）マッピング（トラスク（Ｔｒａｓｋ）（１９
９１）ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ．７：１４９−１５４）で使用してよい。ＦＩ
ＳＨマッピングの現在の方法は大きなクローン（数ｋｂないし数百ｋｂ；ラーン
（Ｌａａｎ）ら（１９９５）ＧｅｎｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈ５：１３−２０
を参照されたい）の使用に好都合であるが、感度の改良がより短いプローブを使
用するＦＩＳＨマッピングの実施を可能にするかも知れない。

【００５３】本核酸配列を使用して、多様な核酸増幅に基づく遺伝的および物理的マッピン
グの方法を実施してよい。例は、対立遺伝子特異的増幅（カザジアン（Ｋａｚａ
ｚｉａｎ）（１９８９）Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１１４（２）：９５−
９６）、ＰＣＲ増幅されたフラグメントの多形（ＣＡＰＳ；シェフィールド（Ｓ
ｈｅｆｆｉｅｌｄ）ら（１９９３）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１６：３２５−３３２）
、対立遺伝子特異的ライゲーション（ランデグレン（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ）ら（
１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１：１０７７−１０８０）、ヌクレオチド伸長
反応（ソコロフ（Ｓｏｋｏｌｏｖ）（１９９０）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲ
ｅｓ．１８：３６７１）、放射ハイブリッドマッピング（Ｒａｄｉａｔｉｏｎ
ＨｙｂｒｉｄＭａｐｐｉｎｇ）（ウォルター（Ｗａｌｔｅｒ）ら（１９９７）
ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ７：２２−２８）およびハッピーマッピング
（ＨａｐｐｙＭａｐｐｉｎｇ）（ディア（Ｄｅａｒ）とクック（Ｃｏｏｋ）（
１９８９）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．１７：６７９５−６８０７）を
包含する。これらの方法について、核酸フラグメントの配列を使用して、増幅反
応もしくはプライマー伸長反応での使用のためのプライマー対を設計かつ製造す
る。こうしたプライマーの設計は当業者に公知である。ＰＣＲに基づく遺伝子マ
ッピングを使用する方法においては、本核酸配列に対応する領域中のマッピング
交差(mapping cross)の親の間のＤＮＡ配列の差異を同定することが必要である
かも知れない。しかしながら、これは一般にマッピング方法には必要でない。

【００５４】機能突然変異体の表現型の喪失は、ターゲッティングされた遺伝子分裂プロト
コル、もしくは全部の可能な遺伝子中に突然変異を担持するトウモロコシ集団に
含有されるこれらの遺伝子の特定の突然変異体の同定のいずれかにより、本ｃＤ
ＮＡクローンについて同定することができる（ボーリンジャー（Ｂａｌｌｉｎｇ
ｅｒ）とベンザー（Ｂｅｎｚｅｒ）（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．ＳｃｉＵＳＡ８６：９４０２；コーズ（Ｋｏｅｓ）ら（１９９５）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ９２：８１４９；ベンセン（Ｂｅｎ
ｓｅｎ）ら（１９９５）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ７：７５）。後者のアプローチ
は２方法で達成することができる。第一に、突然変異誘発トランスポゾン(Mutat
or transposons)もしくはいくつかの他の突然変異を引き起こすＤＮＡ要素が導
入されている植物の集団から調製されたＤＮＡ上で、本核酸フラグメントの短い
セグメントを、突然変異標識(tag)配列プライマーとともにポリメラーゼ連鎖反
応プロトコルで使用してよい（ベンセン（Ｂｅｎｓｅｎ）、上記を参照されたい
）。これらのプライマーでの特定のＤＮＡフラグメントの増幅は、本ポリペプチ
ドをコードする植物遺伝子中もしくはその近くでの突然変異標識要素の挿入を示
す。あるいは、本核酸フラグメントは、制限酵素部位に固定された合成アダプタ
ーのもののような自由裁量によるゲノム部位プライマーとともに突然変異標識配
列プライマーを使用して突然変異集団から生じられたＰＣＲ増幅産物に対するハ
イブリダイゼーションプローブとして使用してよい。いずれかの方法を用いて、
本ポリペプチドをコードする内在性遺伝子中に突然変異を含有する植物を同定し
かつ得ることができる。その後、この突然変異体植物を使用して、本明細書に開
示される本ポリペプチドの本来の機能を決定もしくは確認することが可能である
。実施例本発明は以下の実施例でさらに特定され、ここでは、別の方法で述べられない
限り、全部の部分およびパーセントは重量であり、また、度は摂氏である。これ
らの実施例は、本発明の好ましい態様を示している一方で、具体的説明のみとし
て示されることが理解されるべきである。当業者は、上の論考およびこれらの実
施例から本発明の不可欠の特徴を確かめることが可能であり、また、その技術思
想および範囲から離れることなく、それを多様な用途および条件に適合させるよ
うに本発明の多様な変更および改変をなすことが可能である。実施例１ｃＤＮＡライブラリーの構成；ｃＤＮＡクローンの単離および配列決定多様なトウモロコシ、コメ、ダイズおよびコムギ組織からのｍＲＮＡを表すｃ
ＤＮＡライブラリーを調製した。ライブラリーの特徴を下述する。

【００５５】

【表２】

【００５６】 *２−［（２，４−ジヒドロ−２，６，９−トリメチル［１］ベンゾチオピラノ
［４，３−ｃ］ピラゾル−８−イル）カルボニル］−１，３−シクロヘキサンジ
オンＳ，Ｓ−ジオキシドの適用；この化合物を使用する合成および方法は、引用
により本明細書に組込まれる第ＷＯ９７／１９０８７号に記述される。 **これらのライブラリーは、引用により本明細書に組込まれる米国特許第５，４
８２，８４５号に本質的に記述されるとおり正規化した。

【００５７】ｃＤＮＡライブラリーは利用可能な多くの方法のいずれか１つにより調製して
よい。例えば、ｃＤＮＡは、最初に、製造元のプロトコル（ストラタジーンク
ローニングシステムズ（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅ
ｍｓ）、カリフォルニア州ラホヤ）に従ってユニザップ［Ｕｎｉ−ＺＡＰ］（商
標）ＸＲベクター中でｃＤＮＡライブラリーを調製することによりプラスミドベ
クター中に導入してよい。ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により提供
されたプロトコルに従って、ユニザップ［Ｕｎｉ−ＺＡＰ］（商標）ＸＲライブ
ラリーをプラスミドライブラリーに転化する。転化に際して、ｃＤＮＡ挿入物は
プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中に含有されることができる。加え
て、ｃＤＮＡは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランドバイオラブス
（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ））を使用して、予め切断されたＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）ベクター（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ））に直接導入することができ、次いで、製造元のプロトコル（ギブ
コＢＲＬプロダクツ（ＧＩＢＣＯＢＲＬＰｒｏｄｕｃｔｓ））に従って
ＤＨ１０Ｂ細胞にトランスフェクションする。ｃＤＮＡ挿入物がプラスミドベク
ター中にあれば、組換えｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドを含有する無作為に
拾われた細菌コロニーからプラスミドＤＮＡを調製するか、もしくは、挿入され
たｃＤＮＡ配列に隣接するベクター配列に特異的なプライマーを使用するポリメ
ラーゼ連鎖反応を介して挿入物ｃＤＮＡ配列を増幅する。増幅された挿入物ＤＮ
ＡもしくはプラスミドＤＮＡを、色素−プライマー配列決定反応で配列決定して
部分的ｃＤＮＡ配列を生じさせる（発現された配列標識(expressed sequence ta
gs)もしくは「ＥＳＴ」；アダムス（Ａｄａｍｓ）ら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ２５２：１６５１を参照されたい）。生じるＥＳＴは、パーキンエルマー
（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）モデル３７７蛍光シークェンサーを使用して分析
する。実施例２ｃＤＮＡクローンの同定ＢＬＡＳＴの「ｎｒ」データベース（全部の非冗長ジェンバンク（ＧｅｎＢａ
ｎｋ）ＣＤＳ翻訳、三次元構造のブルックヘイヴンタンパク質データバンク（Ｂ
ｒｏｏｋｈａｖｅｎＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ）由来の配列、スイ
スプロット（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）タンパク質配列データベースの最近の主要
な発表、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪデータベースを含んで成る）に含有される配列
に対する類似性についてのＢＬＡＳＴ（基本的局所整列検索ツール（Ｂａｓｉｃ
ＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ；アルチュル（Ａ
ｌｔｓｃｈｕｌ）ら（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１
０；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／もまた参照され
たい）検索を実施することにより、コリスミ酸合成酵素をコードするｃＤＮＡク
ローンを同定した。国立生物工学情報センター（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅ
ｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢ
Ｉ）により提供されるＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを使用して、「ｎｒ」データベ
ースに含有される全部の公的に入手可能なＤＮＡ配列に対する類似性について、
実施例１で得られたｃＤＮＡ配列を分析した。ＤＮＡ配列を全部の読み枠で翻訳
し、そしてＮＣＢＩにより提供されるＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（ギッシュ（Ｇ
ｉｓｈ）とステーツ（Ｓｔａｔｅｓ）（１９９３）ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉ
ｃｓ３：２６６−２７２）を使用して、「ｎｒ」データベースに含有される全
部の公的に入手可能なタンパク質配列に対する類似性について比較した。便宜上
、ＢＬＡＳＴにより計算されるような偶然によってのみ、検索されたデータベー
ス中に含有された配列に対するあるｃＤＮＡ配列の一致を観察するＰ値（確率）
を本明細書で「ｐＬｏｇ」値として報告し、これは報告されたＰ値の負の対数を
表す。従って、ｐＬｏｇ値が大きくなるほど、ｃＤＮＡ配列およびＢＬＡＳＴの
「ヒット」が相同なタンパク質を表す見込みがより大きくなる。実施例３コリスミ酸合成酵素をコードするｃＤＮＡクローンの特徴表３に列挙されたクローンからのＥＳＴ配列を使用するＢＬＡＳＴＸ検索は、
トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）（ＮＣＢＩ一般識
別番号２４９２９５２および２４９２９５３）からのコリスミ酸合成酵素に対す
る、該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの類似性を示した。表３に、個
々のＥＳＴ（「ＥＳＴ」）、もしくは示されるｃＤＮＡクローンを含んで成るｃ
ＤＮＡ挿入物全体の配列（「ＦＩＳ」）についてのＢＬＡＳＴの結果を示す。

【００５８】

【表３】

【００５９】配列の整列および同一性パーセントの計算は、レーザージーン（ＬＡＳＥＲＧ
ＥＮＥ）生物情報科学コンピュータ計算ソフトウェアパッケージ（ＤＮＡスター
インク（ＤＮＡＳＴＡＲＩｎｃ．）、ウィスコンシン州マディソン）のメガ
ライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）プログラムを使用して実施した。配列の複数の整列
は、デフォルトのパラメータ（ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルテ
ィ＝１０）を用い、整列のクラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法（ヒギンズ（Ｈｉｇ
ｇｉｎｓ）とシャープ（Ｓｈａｒｐ）（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ５：１５１−
１５３）を使用して実施した。クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法を使用する対に
した整列のためのデフォルトのパラメータは、Ｋタプル１、ギャップペナルティ
＝３、ウィンドウ＝５およびダイアゴナルズセイブド＝５であった。配列の整
列、ならびにＢＬＡＳＴのスコアおよび確率は、本ｃＤＮＡクローンを含んで成
る核酸フラグメントが、２種の既知のトマトのコリスミ酸合成酵素のアイソザイ
ム（ＬｅＣＳ１およびＬｅＳＣ２）に対応する２種のトウモロコシのコリスミ酸
合成酵素全体；２種のダイズのコリスミ酸合成酵素の本質的な部分；コメのコリ
スミ酸合成酵素の２部分（同一もしくは異なる遺伝子であるかも知れない）；な
らびにコムギのコリスミ酸合成酵素の本質的な部分をコードすることを示す。こ
れらの配列は、コリスミ酸合成酵素をコードする最初のトウモロコシ、コメ、ダ
イズおよびコムギの配列を表す。実施例４単子葉植物細胞におけるキメラ遺伝子の発現該ｃＤＮＡフラグメントに対し５’に配置されているトウモロコシの２７ｋＤ
のゼインプロモーター、および該ｃＤＮＡフラグメントに対し３’に配置されて
いる１０ｋＤのゼインの３’端に関してセンスの向きで本ポリペプチドをコード
するｃＤＮＡを含んで成るキメラ遺伝子を構築することが可能である。本遺伝子
のｃＤＮＡフラグメントは、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用する該
ｃＤＮＡクローンのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により生じさせることがで
きる。下述されるような消化されたベクターｐＭＬ１０３中に挿入された場合に
適正な向きのＤＮＡフラグメントを提供するように、該オリゴヌクレオチド中に
クローニング部位（ＮｃｏＩもしくはＳｍａＩ）を組込むことが可能である。そ
の後標準的ＰＣＲで増幅を実施する。その後、増幅されたＤＮＡを制限酵素Ｎｃ
ｏＩおよびＳｍａＩで消化し、そしてアガロースゲル上で分画する。適切なバン
ドをゲルから単離し、そしてプラスミドｐＭＬ１０３の４．９ｋｂのＮｃｏＩ−
ＳｍａＩフラグメントと組み合わせることが可能である。プラスミドｐＭＬ１０
３は、ブダペスト条約（ＢｕｄａｐｅｓｔＴｒｅａｔｙ）の約定のもとにＡＴ
ＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴ
ｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、１０８０１ユニバーシテ
ィブールヴァード（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＢｌｖｄ．）、バージニア州マナ
サス、２０１１０−２２０９）に寄託され、そして受託番号ＡＴＣＣ９７３６
６をもつ。ｐＭＬ１０３からの該ＤＮＡセグメントは、ベクターｐＧｅｍ９Ｚｆ
（＋）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））中に、トウモロコシの２７ｋＤのゼイン
遺伝子の１．０５ｋｂのＳａｌＩ−ＮｃｏＩプロモーターフラグメント、および
トウモロコシの１０ｋＤのゼイン遺伝子の３’端からの０．９６ｋｂのＳｍａＩ
−ＳａｌＩフラグメントを含有する。ベクターおよび挿入物ＤＮＡを、本質的に
記述された（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））とおり、１５℃で一夜連結す
ることが可能である。それから、連結されたＤＮＡを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃ
ｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（エピキュリアンコライＸＬ−１ブルー［Ｅｐ
ｉｃｕｒｉａｎＣｏｌｉＸＬ−１Ｂｌｕｅ］（商標）；ストラタジーン（
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を形質転換してよい。細菌の形質転換体は、プラス
ミドＤＮＡの制限酵素消化およびチェインターミネーター法（シークェナーゼ［
Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ］（商標）ＤＮＡ配列決定キット；Ｕ．Ｓ．バイオケミカル
（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ））を使用する制限されたヌクレオチド配列
分析によりスクリーニングすることが可能である。生じるプラスミド構築物は、
５’から３’の向きで、トウモロコシの２７ｋＤのゼインプロモーター、本ポリ
ペプチドをコードするｃＤＮＡフラグメント、および１０ｋＤのゼインの３’領
域をコードするキメラ遺伝子を含むとみられる。

【００６０】その後、上述されたキメラ遺伝子を、以下の手順によりトウモロコシ細胞に導
入することが可能である。近交系トウモロコシＨ９９およびＬＨ１３２の異種交
配由来の発生中の穎果から未熟なトウモロコシ胚を切断することが可能である。
胚は、受粉後１０ないし１１日に、それらが１．０ないし１．５ｍｍ長である場
合に単離する。その後、軸側を下に向けかつアガロースで固化されたＮ６培地と
接触して胚を置く（チュ（Ｃｈｕ）ら（１９７５）Ｓｃｉ．Ｓｉｎ．Ｐｅｋｉｎ
ｇ１８：６５９−６６８）。胚を暗所で２７℃に保つ。胚柄構造上に担持され
る体細胞の前胚および胚様体をもつ細胞の未分化の塊より成るもろい胚カルスが
、これらの未熟な胚の胚盤から増殖する。一次外植体から単離された胚形成カル
スをＮ６倍地上で培養し、そして２ないし３週ごとにこの培地上で継代培養する
ことが可能である。

【００６１】選択可能なマーカーを提供するために、形質転換実験でプラスミドｐ３５Ｓ／
Ａｃ（ドイツ・フランクルフルトのヘキスト有限会社（ＨｏｅｃｈｓｔＡｇ）
のエッケス（ＰｅｔｅｒＥｃｋｅｓ）博士から得られた）を使用してよい。こ
のプラスミドは、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）を
コードするＰａｔ遺伝子（欧州特許公開第０２４２２３６号を参照されたい
）を含有する。酵素ＰＡＴは、ホスフィノトリシンのような除草性のグルタミン
合成酵素阻害剤に抵抗性を与える。ｐ３５Ｓ／Ａｃ中のｐａｔ遺伝子は、カリフ
ラワーモザイクウイルスからの３５Ｓプロモーター（オデル（Ｏｄｅｌｌ）ら（
１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１３：８１０−８１２）および根頭がんしゅ病菌（
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉプラスミドのＴ
−ＤＮＡからのノパリン合成酵素遺伝子の３’領域の制御下にある。

【００６２】カルス培養細胞に遺伝子を導入するために粒子砲撃法(particle bombardment
method)（クライン（Ｋｌｅｉｎ）ら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ３２７：７０
−７３）を使用してよい。この方法によれば、以下の技術を使用して金粒子（直
径１μｍ）をＤＮＡで被覆する。１０μｇのプラスミドＤＮＡを、金粒子の懸濁
液（１ｍＬあたり６０ｍｇ）５０μＬに添加する。塩化カルシウム（２．５Ｍ溶
液の５０μＬ）およびスペルミジンを含まない塩基（１．０Ｍ溶液の２０μＬ）
を粒子に添加する。これらの溶液の添加のあいだ該懸濁液をボルテックス攪拌す
る。１０分後にチューブを短く遠心分離（１５，０００ｒｐｍで５秒）し、そし
て上清を除去する。粒子を２００μＬの無水エタノールに再懸濁し、再度遠心分
離しそして上清を除去する。エタノールすすぎを再度実施し、そして粒子を最終
体積３０μＬのエタノールに再懸濁する。ＤＮＡ被覆された金粒子のアリコート
（５μＬ）をカプトン［Ｋａｐｔｏｎ］（商標）フライングディスク(flying di
sc)（バイオラッドラブス（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｓ））の中央に置くこと
が可能である。その後、１０００ｐｓｉのヘリウム圧、０．５ｃｍのギャップ距
離および１．０ｃｍの飛行距離を使用して、バイオリスティック［Ｂｉｏｌｉｓ
ｔｉｃ］（商標）ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ（バイオラッドインストゥルメンツ
（Ｂｉｏ−ＲａｄＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、カリフォルニア州ハーキュリー
ズ）を用いて粒子をトウモロコシ組織中に加速する。

【００６３】砲撃のためには、胚形成組織を、アガロース固化されたＮ６培地上の濾紙上に
置く。組織は薄い芝生(lawn)のように配置し、そして直径約５ｃｍの円形領域を
覆う。組織を含有するペトリ皿は、ＰＤＳ−１０００／Ｈｅのチャンバー中で停
止スクリーン(stopping screen)からおよそ８ｃｍに置くことが可能である。そ
の後、チャンバー中の空気をＨｇ２８インチの真空まで排気する。衝撃チューブ
中のＨｅ圧が１０００ｐｓｉに達する場合に爆発する破裂膜(rupture membrane)
を使用して、マクロキャリアー(macrocarrier)をヘリウムショック波で加速する
。

【００６４】砲撃７日後、グルホシネート（１リットルあたり２ｍｇ）を含有しかつカゼイ
ンもしくはプロリンを欠くＮ６培地に組織を移すことが可能である。組織をこの
培地上でゆっくりと成長を続けさせる。追加の２週間後に、グルホシネートを含
有する新鮮なＮ６培地に組織を移すことができる。６週間後に、グルホシネート
を補充された培地を含有するプレートのいくつかで、活発に成長しているカルス
の直径約１ｃｍの領域を同定することが可能である。これらのカルスは、選択培
地上で継代培養される場合に成長を続けることができる。

【００６５】最初に、１リットルあたり０．２ｍｇの２，４−Ｄを補充されたＮ６培地に組
織の集団を移すことにより、植物をトランスジェニックカルスから再生すること
が可能である。２週間後に組織を再生培地に移すことができる（フロム（Ｆｒｏ
ｍｍ）ら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：８３３−８３９）。実施例５双子葉植物細胞におけるキメラ遺伝子の発現形質転換されたダイズでの本ポリペプチドの発現に、マメ、インゲンマメ（Ｐ
ｈａｓｅｏｌｕｓｖｕｌｇａｒｉｓ）からの種子貯蔵タンパク質ファセオリン
のβサブユニットをコードする遺伝子からのプロモーターおよび転写ターミネー
ターより構成される種子特異的発現カセット（ドイル（Ｄｏｙｌｅ）ら（１９８
６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：９２２８−９２３８）を使用することが
可能である。該ファセオリンカセットは、ファセオリンの翻訳開始コドンから約
５００ヌクレオチド上流（５’）および翻訳終止コドンから約１６５０ヌクレオ
チド下流（３’）を包含する。５’領域と３’領域との間は、唯一の制限エンド
ヌクレアーゼ部位ＮｃｏＩ（ＡＴＧ翻訳開始コドンを包含する）、ＳｍａＩ
、ＫｐｎＩおよびＸｂａＩである。カセット全体はＨｉｎｄＩＩＩ部位に
より隣接される。

【００６６】本遺伝子のｃＤＮＡフラグメントは、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを
使用する該ｃＤＮＡクローンのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により生じさせ
てよい。発現ベクター中に挿入される場合に該ＤＮＡフラグメントの適正な向き
を提供するように、クローニング部位をオリゴヌクレオチド中に組込むことが可
能である。その後、上述されたとおり増幅を実施し、そして、単離されるフラグ
メントを、種子発現カセットを担持するｐＵＣ１８ベクター中に挿入する。

【００６７】その後、本ポリペプチドをコードする配列を含んで成る発現ベクターでダイズ
胚を形質転換してよい。体細胞胚を誘導するために、ダイズ栽培変種作物Ａ２８
７２の表面滅菌された未熟な種子から切断された長さ３〜５ｍｍの子葉を、適切
なアガー培地上で明もしくは暗所で２６℃で６〜１０週間培養することが可能で
ある。その後、二次胚を生じさせる体細胞胚を切除し、そして適する液体培地中
に入れる。早期の球形段階の(early, globular staged)胚として増殖した体細胞
胚の集団についての反復された選択後に、懸濁液を下述されるとおり維持する。

【００６８】ダイズ胚形成懸濁培養物は、１５０ｒｐｍの回転振とう器上の３５ｍＬの液体
培地中、２６℃で蛍光灯を用いて１６：８時間の明／暗スケジュールで維持する
ことが可能である。培養物は、３５ｍＬの液体培地中におよそ３５ｍｇの組織を
接種することにより２週間ごとに継代培養する。

【００６９】その後、パーティクル・ガン・ボンバードメント(particle gun bombardment)
の方法（クライン（Ｋｌｅｉｎ）ら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）
３２７：７０、米国特許第４，９４５，０５０号）により、ダイズ胚形成懸濁培
養物を形質転換してよい。これらの形質転換にはデュポン（ＤｕＰｏｎｔ）のバ
イオリスティック［Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ］（商標）ＰＤＳ１０００／ＨＥ機器（
ヘリウム改良(helium retrofit)）を使用することが可能である。

【００７０】ダイズの形質転換を助長するのに使用することが可能である選択可能なマーカ
ー遺伝子は、カリフラワーモザイクウイルスからの３５Ｓプロモーター（オデル
（Ｏｄｅｌｌ）ら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１３：８１０−８１２）、プラ
スミドｐＪＲ２２５からのヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から；グリッツ（Ｇｒｉｔｚ）ら（１９８３）Ｇｅｎｅ
２５：１７９−１８８）および根頭がんしゅ病菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡからのノパリン合成
酵素遺伝子の３’領域より構成されるキメラ遺伝子である。ファセオリンの５’
領域、本ポリペプチドをコードするフラグメントおよびファセオリンの３’領域
を含んで成る種子発現カセットを制限フラグメントとして単離することが可能で
ある。このフラグメントをその後、該マーカー遺伝子を担持するベクターの唯一
の制限部位に挿入することが可能である。

【００７１】６０ｍｇ／ｍＬの１μｍ金粒子懸濁液５０μＬに、（この順で）５μＬのＤＮ
Ａ（１μｇ／μＬ）、２０μｌのスペルミジン（０．１Ｍ）、および５０μＬの
ＣａＣｌ₂（２．５Ｍ）を添加する。その後、粒子調製物を３分間攪拌し、微小
遠心機中で１０秒間回転し、そして上清を除去する。その後、ＤＮＡで被覆され
た粒子を４００μＬの７０％エタノールで１回洗浄し、そして４０μＬの無水エ
タノール中に再懸濁する。ＤＮＡ／粒子懸濁液をそれぞれ１秒間３回超音波処理
することが可能である。５μＬのＤＮＡ被覆された金粒子を、その後、各マクロ
キャリアーディスク上に負荷する。

【００７２】およそ３００〜４００ｍｇの２週齢の懸濁培養物を空の６０×１５ｍｍのペト
リ皿に入れ、そしてピペットを用いて残余の液体を組織から除去する。各形質転
換実験にはおよそ５〜１０枚の組織のプレートを通常砲撃する。膜破裂圧は１１
００ｐｓｉに設定し、そしてチャンバーを２８インチ水銀の真空まで排気する。
組織を保持スクリーンからおよそ３．５インチ離して置き、そして３回砲撃する
。砲撃後に組織を半分に分割しかつ液体中に戻し入れ、そして上述されたとおり
培養することが可能である。

【００７３】砲撃後５ないし７日に液体培地を新鮮培地と、また、砲撃後１１ないし１２日
に５０ｍｇ／ｍＬのヒグロマイシンを含有する新鮮培地と交換してよい。この選
択培地は毎週新しくすることが可能である。砲撃後７ないし８週間で、緑色の形
質転換された組織が、形質転換されない壊死胚形成集団から成長するのを観察す
ることができる。孤立した緑色組織を取り出し、そして別個のフラスコに接種し
て、新しいクローン的に増殖された形質転換された胚形成懸濁培養物を生じさせ
る。各新系統は独立した形質転換事象として取り扱ってよい。これらの懸濁液を
その後継代培養し、そして未熟な胚の集団として維持するかもしくは個々の体細
胞胚の成熟および発芽により植物全体に再生することが可能である。実施例６微生物細胞におけるキメラ遺伝子の発現本ポリペプチドをコードするｃＤＮＡをＴ７大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベク
ターｐＢＴ４３０に挿入することが可能である。本ベクターは、バクテリオファ
ージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ／Ｔ７プロモーター系を使用するｐＥＴ−３ａ（
ローゼンバーク（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）ら（１９８７）Ｇｅｎｅ５６：１２５
−１３５）の一誘導体である。プラスミドｐＢＴ４３０は、最初に、それらの元
の位置のｐＥＴ−３ａ中のＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を破壊する
ことにより構築した。ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有するオリ
ゴヌクレオチドアダプターをｐＥＴ−３ａのＢａｍＨＩ部位に挿入した。これ
は、該発現ベクターへの遺伝子の挿入のための付加的な唯一のクローニング部位
をもつｐＥＴ−３ａＭを創製した。その後、オリゴヌクレオチド特異的突然変異
誘発を使用して、翻訳開始の位置のＮｄｅＩ部位をＮｃｏＩ部位に転化した
。この領域中のｐＥＴ−３ａＭのＤＮＡ配列５’−ＣＡＴＡＴＧＧを、ｐＢＴ４
３０中の５’−ＣＣＣＡＴＧＧに転化した。

【００７４】ｃＤＮＡを含有するプラスミドＤＮＡを適切に消化して、該タンパク質をコー
ドする核酸フラグメントを遊離させることができる。その後、１％ヌシーブＧＴ
Ｇ［ＮｕＳｉｅｖｅＧＴＧ］（商標）低溶融アガロースゲル（ＦＭＣ）上でこ
のフラグメントを精製してよい。緩衝液およびアガロースは、ＤＮＡフラグメン
トの可視化のため１０μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する。その後、製造元
の説明書に従ったジェラース［ＧＥＬａｓｅ］（商標）（エピセンターテクノ
ロジーズ（ＥｐｉｃｅｎｔｒｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））での消化により
、該フラグメントをアガロースゲルから精製し、エタノール沈殿し、乾燥しそし
て２０μＬの水に再懸濁することが可能である。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ニュー
イングランドバイオラブス（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）、
マサチューセッツ州ビバリー）を使用して、適切なオリゴヌクレオチドアダプタ
ーを該フラグメントに連結してよい。連結されたアダプターを含有する該フラグ
メントは、上述されたとおり低溶融アガロースを使用して過剰のアダプターから
精製することが可能である。ベクターｐＢＴ４３０は、上述されたとおり消化し
、アルカリホスファターゼ（ＮＥＢ）で脱ホスホリル化し、そしてフェノール／
クロロホルムでタンパク質を除去する。調製されたベクターｐＢＴ４３０および
フラグメントをその後、１６℃で１５時間連結し、次いでＤＨ５エレクトロコン
ピテント(electrocompetent)細胞（ギブコＢＲＬ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ））に
形質転換することが可能である。形質転換体は、ＬＢ培地および１００μｇ／ｍ
Ｌのアンピシリンを含有するアガープレート上で選択することができる。その後
、本ポリペプチドをコードする遺伝子を含有する形質転換体を、制限酵素分析に
よりＴ７プロモーターに関して正しい向きについてスクリーニングする。

【００７５】高レベル発現のためには、Ｔ７プロモーターに関して正しい向きのｃＤＮＡ挿
入物をもつプラスミドクローンを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１（ＤＥ３）
に形質転換することが可能である（シュトゥディエール（Ｓｔｕｄｉｅｒ）ら（
１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３−１３０）。培養物は、アン
ピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）を含有するＬＢ培地中で２５℃で成長させる。およ
そ１の６００ｎｍの至適密度で、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−ガラクトシ
ド、誘導物質）を０．４ｍＭの最終濃度まで添加することが可能であり、そして
、インキュベーションを２５℃で３時間継続することが可能である。その後、遠
心分離により細胞を収穫し、そして、０．１ｍＭのＤＴＴおよび０．２ｍＭのフ
ッ化フェニルメチルスルホニルを含有する５０μＬのｐＨ８．０の５０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌに再懸濁する。少量の１ｍｍガラスビーズを添加し、そして微小プロ
ーブ超音波処理装置(microprobe sonicator)を用いて混合物を各回約５秒間３回
超音波処理することが可能である。該混合物を遠心分離し、そして上清のタンパ
ク質濃度を測定する。培養物の可溶性画分からの１μｇのタンパク質をＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離することが可能である。ゲルを、期
待される分子量で移動するタンパク質のバンドについて観察することができる。実施例７コリスミ酸合成酵素の活性を阻害するそれらの能力についての化合物の評価本明細書に記述されるポリペプチドは、当業者に既知のいかなる数の方法を使
用して製造してもよい。こうした方法は、限定されるものでないが、実施例６で
記述されたような細菌での発現、または真核生物細胞培養物中での発現、植物中
で(in planta)、および適して感染した生物体もしくは細胞系中でのウイルス発
現系を使用することを挙げることができる。本ポリペプチドは、インビボで観察
されるような成熟形態のタンパク質、または多様な酵素、タンパク質もしくは親
和性標識への共有結合による融合タンパク質のいずれかとして発現させてもよい
。普遍的な融合タンパク質パートナーは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ
（「ＧＳＴ」）、チオレドキシン（「Ｔｒｘ」）、マルトース結合タンパク質な
らびにＣおよび／もしくはＮ末端ヘキサヒスチジンポリペプチド（「（Ｈｉｓ）
₆」）を包含する。融合タンパク質は、融合パートナーがプロテアーゼ消化によ
り分離されて無傷の成熟酵素を生じることができるように、融合点のプロテアー
ゼ認識部位を伴って工作してよい。こうしたプロテアーゼの例は、トロンビン、
エンテロキナーゼおよび第Ｘａ因子を包含する。しかしながら、融合タンパク質
および該酵素を連結するペプチドを特異的に切断するいずれのプロテアーゼも使
用することが可能である。

【００７６】本ポリペプチドの精製は、所望の場合は、タンパク質精製の当業者に馴染みの
あるいかなる数の分離技術も利用してよい。こうした方法の例は、制限されるも
のでないが、ホモジェナイズ、濾過、遠心分離、熱変性、硫酸アンモニウム沈殿
、脱塩、ｐＨ沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグ
ラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーを挙げることができ、ここで
、親和性リガンドは基質、基質類似物もしくは阻害剤を表す。本ポリペプチドが
融合タンパク質として発現される場合の精製プロトコルは、発現された酵素に結
合された融合タンパク質標識に特異的である親和性樹脂、もしくは該酵素に特異
的であるリガンドを含有する親和性樹脂の使用を包含してよい。例えば、本ポリ
ペプチドはチオレドキシンのＣ末端に結合された融合タンパク質として発現して
よい。加えて、親和性精製のための付加的な機会を与えるため、融合されたチオ
レドキシン部分のＮ末端に（Ｈｉｓ）₆ペプチドを工作してよい。他の適する親
和性樹脂は、セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）−４Ｂのようないずれかの適
する樹脂に適切なリガンドを連結することにより合成することが可能である。代
替の一態様において、ジチオスレイトールを使用してチオレドキシン融合タンパ
ク質を溶出してよいが；しかしながら、溶出は、相互作用して樹脂からチオレド
キシンを置き換える他の試薬を使用して達成してよい。これらの試薬はβ−メル
カプトエタノールもしくは他の還元型チオールを包含する。溶出された融合タン
パク質は、所望の場合は上述されたような伝統的手段によるさらなる精製にかけ
てよい。チオレドキシン融合タンパク質および酵素のタンパク質分解性切断は、
融合タンパク質を精製した後、または該タンパク質がチオボンド［ＴｈｉｏＢｏ
ｎｄ］（商標）親和性樹脂もしくは他の樹脂になお結合されている間に達成して
よい。

【００７７】単独もしくは融合タンパクのいずれかとしての、粗酵素、部分的に精製された
酵素もしくは精製された酵素は、本明細書に開示される本ポリペプチドの酵素的
活性化を阻害するそれらの能力についての化合物の評価のためのアッセイで利用
してよい。アッセイは、至適の酵素活性を可能にする公知の実験条件下で実施し
てよい。コリスミ酸合成酵素についてのアッセイは、ギブソン（Ｆ．Ｇｉｂｓｏ
ｎ）（１９７０）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１７：３６２−３６４、ホ
ワイト（Ｗｈｉｔｅ，Ｐ．Ｊ．）、ムースデール（Ｍｏｕｓｄａｌｅ，Ｄ．Ｍ．
）とコギンス（Ｃｏｇｇｉｎｓ，Ｊ．Ｒ．）（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．Ｔｒａｎｓ．１５：１４４−１４５、シャラー（Ｓｃｈａｌｌｅｒ，Ａ．）
、ヴィンドホファー（Ｗｉｎｄｈｏｆｅｒ，Ｖ．）とアムルハイン（Ａｍｒｈｅ
ｉｎ，Ｎ．）（１９９０）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２８２
：４３７−４４２およびブーコック（Ｂｏｏｃｏｃｋ，Ｍ．Ｒ．）とコギンス（
Ｃｏｇｇｉｎｓ，Ｊ．Ｒ．）（１９８３）ＦＥＢＳＬｅｔｔ．１５４：１２７
−１３３により提示されている。

【００７８】

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/527 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 33/50 ＺＧ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＤ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ (72)発明者フアルコ，サベリオ・カールアメリカ合衆国デラウエア州19810アーデン・ミラーロード1902 (72)発明者ペンバー，スチーブン・オーアメリカ合衆国ペンシルベニア州19348ケネツトスクエア・アンドライブ722 Ｆターム(参考） 2G045 AA31 AA35 AA40 CB01 CB20 CB21 DA12 DA13 DA14 DA20 FB01 FB02 4B024 AA07 BA07 CA04 DA01 DA06 EA04 GA11 HA11 4B050 CC03 DD09 LL03 4B063 QA01 QA20 QQ09 QQ38 QQ44 QR08 QR32 QR36 4B065 AA26X AA88X AA88Y AB01 BA01 CA27 CA46 CA47

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）最低５００ヌクレオチドを含んで成る単離された核酸
フラグメントであって、該核酸フラグメントが、配列番号２、配列番号４、配列
番号６、配列番号８，配列番号１０、配列番号１２および配列番号１４より成る
群から選択される１メンバーに示されるアミノ酸配列をコードする単離された核
酸フラグメントにハイブリダイズする；（ｂ）（ａ）に相補的である単離された核酸フラグメント、より成る群から選択される１メンバーを含んで成るコリスミ酸合成酵素をコード
する単離された核酸フラグメント。
【請求項２】核酸フラグメントが機能的ＲＮＡである、請求項１記載の単
離された核酸フラグメント。
【請求項３】該フラグメントのヌクレオチド配列が、配列番号１、配列番
号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３
より成る群から選択される１メンバーに示される配列を含んで成る、請求項１記
載の単離された核酸フラグメント。
【請求項４】適する調節配列に操作可能に連結された、請求項１記載の核
酸フラグメントを含んで成るキメラ遺伝子。
【請求項５】請求項４記載のキメラ遺伝子を含んで成る形質転換された宿
主細胞。
【請求項６】配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番
号１０、配列番号１２および配列番号１４より成る群から選択される１メンバー
に示されるアミノ酸配列の全部もしくは本質的な部分を含んで成るコリスミ酸合
成酵素ポリペプチド。
【請求項７】（ａ）請求項４記載のキメラ遺伝子で宿主細胞を形質転換す
ること；および（ｂ）段階（ａ）で産生された形質転換された宿主細胞を、該キメラ遺伝子の発
現に適する条件下で成長させること、を含んで成り、該キメラ遺伝子の発現が、形質転換された宿主細胞中でのコリスミ酸合成酵素の
変えられたレベルの産生をもたらす、宿主細胞におけるコリスミ酸合成酵素の発
現のレベルを変える方法。
【請求項８】（ａ）請求項１記載の核酸フラグメントでｃＤＮＡもしくは
ゲノムライブラリーをプロービングすること；（ｂ）請求項１記載の核酸フラグメントとハイブリダイズするＤＮＡクローンを
同定すること；（ｃ）段階（ｂ）で同定されたＤＮＡクローンを単離すること；および（ｄ）段階（ｃ）で単離されたクローンを含んで成るｃＤＮＡもしくはゲノムの
フラグメントの配列を決定すること、を含んで成り、配列決定された核酸フラグメントが、コリスミ酸合成酵素をコードするアミノ酸
配列の全部もしくは本質的な部分をコードする、コリスミ酸合成酵素をコードす
るアミノ酸配列の全部もしくは本質的な部分をコードする核酸フラグメントを得
る方法。
【請求項９】（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１もしくは１３のい
ずれかに示される配列の一部分に対応するオリゴヌクレオチドプライマーを合成
すること；ならびに（ｂ）段階（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマー、およびクローニングベクタ
ーの配列を表すプライマーを使用して、クローニングベクター中に存在するｃＤ
ＮＡ挿入物を増幅すること、を含んで成り、増幅された核酸フラグメントが、コリスミ酸合成酵素をコードするアミノ酸配列
の本質的な部分をコードする、コリスミ酸合成酵素をコードするアミノ酸配列の
本質的な部分をコードする核酸フラグメントを得る方法。
【請求項１０】請求項８記載の方法の産物。
【請求項１１】請求項９記載の方法の産物。
【請求項１２】コリスミ酸合成酵素の活性を阻害するその能力についての
最低１種の化合物の評価方法であって、（ａ）適する調節配列に操作可能に連結された、コリスミ酸合成酵素をコードす
る核酸フラグメントを含んで成るキメラ遺伝子で宿主細胞を形質転換すること；
（ｂ）該キメラ遺伝子の発現に適する条件下で、形質転換された宿主細胞を成長
させることであって、該キメラ遺伝子の発現が、形質転換された宿主細胞中で操
作可能に連結された核酸フラグメントによりコードされるコリスミ酸合成酵素の
産生をもたらす；（ｃ）場合によっては、形質転換された宿主細胞により発現されたコリスミ酸合
成酵素を精製すること；（ｄ）コリスミ酸合成酵素を試験されるべき化合物で処理すること；および（ｅ）試験化合物で処理されたコリスミ酸合成酵素の活性を、未処理のコリスミ
酸合成酵素の活性と比較し、それにより阻害活性の潜在能力をもつ化合物を選択すること、の段階を含んで成る方法。