DE69631970T2

DE69631970T2 - Archaeoliposome, Koenzym Q10 enthaltende Archaeoliposome und Koenzym Q10 enthaltende Liposome als Adjuvans und Wirkstoffabgabevehikel

Info

Publication number: DE69631970T2
Application number: DE69631970T
Authority: DE
Inventors: Dennis G. Sprott; B. Girishchandra PATEL; Boby Makabi-Panzu; L. Douglas TOLSON
Original assignee: National Research Council of Canada
Current assignee: National Research Council of Canada
Priority date: 1995-12-15
Filing date: 1996-12-13
Publication date: 2005-04-14
Anticipated expiration: 2016-12-14
Also published as: CA2241247A1; DE69631970D1; JP2000502087A; CA2241247C; EP0869773B1; WO1997022333A1; US6132789A; EP0869773A1; US6403117B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft Liposomen (geschlossene Lipidvesikel), die aus archäobakteriellen Lipiden, aus nicht-archäobakteriellen Lipiden und deren Mischungen hergestellt sind, und die Verwendung derartiger Liposomen für die erhöhte Zufuhr pharmazeutischer und anderer Verbindungen an spezifische Zelltypen, wie Makrophagen/Phagozyten/Antigen-verarbeitende Zellen, und an spezifische Gewebe in Lebensformen, wie Menschen, und für die Verstärkung der Immunantwort auf Antigen(e), die in einer Lebensform, wie dem Menschen, anwesend sind. Die Vesikel dieser Erfindung können nach Einkapselung von oder in Verbindung mit einem oder mehreren Immunogenen mit oder ohne Vermittlung durch die Anwesenheit weiterer Adjuvantien oder Verbindungen in Impfstoff-Formulierungen verwendet werden. Die Erfindung kann auch für die Zufuhr von Arzneistoffen, Antibiotika, pharmazeutischen, biologischen Verbindungen, wie Enzymen oder DNA oder Hormonen, Therapeutika, bildgebenden Mitteln usw. zu spezifischen Zelltypen oder spezifischen Geweben in einem Lebewesen, wie einem Menschen oder anderen Lebensformen, verwendet werden. Eine weitere Anwendung kann darin bestehen, Antibiotika/antivirale Mittel, die in Archäosomen eingekapselt sind, zur Behandlung von Krankheiten zu verwenden, wenn sich die infektiösen Organismen als intrazelluläre Reservoirs (wie in Makrophagen) für eine Reinfektion aufhalten können.
BESCHREIBUNG DES STANDES DER TECHNIK
Liposomen sind geschlossene Lipid-Vesikel, die ein eingeschlossenes wässriges Volumen enthalten. Die hydrophilen Kopfgruppen der Lipide, welche die Liposomen bilden, sind in Richtung auf die wässrigen Umgebungen gerichtet, die innerhalb und außerhalb der Liposomen vorliegen, wohingegen die hydrophoben Regionen der Lipide zwischen den polaren Kopfgruppen und weg von den wässrigen Umgebungen eingeschlossen sind. Liposomen können unilamellar, wobei sie eine einzige Lipid-Doppelschicht enthalten, oder multilamellar sein, wobei sie mehrere Doppelschichten (Zwiebel-artige Struktur) mit einem wässrigen Raum enthalten, der jede Doppelschicht von der anderen trennt. Es sind vielfältige Techniken zur Bildung von Liposomen in der Literatur beschrieben worden, einschließlich Druck-Extrusion, Detergensdialyse, Dehydratisierung-Rehydratisierung, Umkehrphasenverdampfung, "remote loading", Beschallung und anderer Verfahren (13). Liposomen, die aus herkömmlichen Esterphosphorlipiden, wie Phosphatidylcholin, hergestellt sind, werden hierin als herkömmliche Liposomen bezeichnet, selbst wenn sie Sterole oder andere Verbindungen in ihrer Doppelschicht enthalten.
Liposomen, die aus einer Lipid-Doppelschicht, einer Monoschicht oder einer Kombination derselben bestehen, die aus irgendeinem oder irgendwelchen Lipid(en) hergestellt sind und in ihrer Zusammensetzung Etherlipide einschließen, die aus Archaeobacteria extrahiert sind oder darin gefunden werden oder die synthetisiert wurden, um Lipide nachzuahmen, die in Archäobakterien gefunden werden, werden hierin als Archäosomen bezeichnet.
Archaea (Archaeobacteria) werden als unterschiedlich von Eubakterien und Eukaryonten angesehen, und sie schließen aerobe, anaerobe, thermophile, extrem thermophile, thermoazidophile und halophile Mikroorganismen ein. Gesamt-Lipidextrakte aus einzelnen Spezies von Archaea bestehen aus polaren Etherlipiden und aus 5 bis 20% neutralen Lipiden. Die polaren Etherlipide von Archaea bestehen aus verzweigten Phytanyl-Ketten, die gewöhnlich gesättigt sind und über Etherbindungen an die Glycerin-Kohlenstoffe an den sn-2,3-Positionen angebracht sind (8). Im Gegensatz dazu sind in herkömmlichen Phospholipiden, die in Eubacterien und Eukaryonten gefunden werden, die Fettacyl-Ketten, die ungesättigt sein können, über Esterbindungen an die sn-1,2-Kohlenstoffe der Glycerin-Hauptkette angebracht. Die Kernstrukturen der archäobakteriellen Etherlipide (wobei die polaren Kopfgruppen durch Hydrolyse entfernt sind) bestehen aus dem Standard-Dietherlipid (2,3-Di-O-phytanyl-sn-glycerin oder Archaeol) und dem Standard-Tetraetherlipid (2,2',3,3'-Tetra-O-dibiphytanyl-sn- diglycerin oder Caldarchaeol) und deren Modifikationen (8). Dietherlipide sind monopolar wie die herkömmlichen Phospholipide, wohingegen die Tetraetherlipide bipolar sind. Die polaren Kopfgruppen, die an dem sn-1-Glycerin-Kohlenstoff in den Diethern und and den sn-1- und sn-1'-Glycerin-Kohlenstoffen in den Tetraethern angebracht sind, können variieren und können Phospho-Gruppen, Glyco-Gruppen, Phosphoglyco-Gruppen, Polyol-Gruppen oder Hydroxyl-Gruppen einschließen (18). Im Gegensatz zu dem herkömmlichen Phosphatidylcholinlipid, das üblicherweise in Liposomen-Formulierungen verwendet wird, wird die Phosphocholin-Kopfgruppe sehr selten in polaren archäobakteriellen Lipiden gefunden. Archaea stellen eine große Auswahl von Lipiden zur Durchmusterung für die Herstellung von Vesikeln bereit, die Eigenschaften aufweisen, welche für spezielle Anwendungen nützlich sind, und die Schwierigkeiten überwinden, die mit herkömmlichen Lipiden verbunden sind, wie niedrige Adjuvans-Wirkung und Instabilität.
Es besteht ein großes Interesse an der Verwendung von Liposomen für medizinische, pharmazeutische und andere kommerzielle Anwendungen. Der größte Teil der Forschung, die bis heute bezüglich Liposomen mitgeteilt wurde, wurde unter Verwendung herkömmlicher Phospholipide, die manchmal mit Sterolen (z. B. Cholesterol) oder anderen Verbindungen gemischt wurden, um die Stabilität zu verbessern, durchgeführt und nicht unter Verwendung von entweder archäobakteriellen oder nicht-archäobakteriellen Etherlipiden.
In einer vergleichenden Untersuchung der Aufnahme von Liposomen, die mit 1,2-Diacyl-sn-glycero-3-phosphocholin und dessen Ether-Analogon hergestellt wurden, durch kultivierte Rattenleber-Hepatozyten wurde gefunden, dass die zelluläre Aufnahme von beiden Liposomen-Arten ähnlich war (21). In einer anderen Studie wurden Liposomen, die entweder mit Dipalmitoylphosphatidylcholin oder dessen Ether-Analogon 1-O-Octadecyl-2-O-methyl-rac-glycerin-3-phosphocholin hergestellt worden waren, mit etwa derselben Rate durch J774.E1-Makrophagen-Zellen phagozytiert (6). Deshalb würde man aus diesen Offenbarungen erwarten, dass Liposomen, die aus Etherlipiden hergestellt sind, einschließlich durch Extrapolation derjenigen aus Etherlipiden, die entweder aus Archaea extrahiert wurden, oder aus Etherlipiden, die chemisch synthetisiert wurden, um die einzigartigen Lipidstrukturen von Archaea nachzuahmen, durch gewisse Zellen, wie Makrophagen, in einem ähnlichen Ausmaß wie herkömmliche Liposomen aufgenommen würden. Jedoch beweist die vorliegende Erfindung das Gegenteil, indem sie eine erhöhte Phagozytose von Vesikeln (Archäosomen) zeigt, die mit archäobakteriellen Etherlipiden hergestellt sind.
Obwohl der Stand der Technik z. B. in den Literaturstellen (20) und (25) bis (29) eine Liposomenbildung aus gewissen archäobakteriellen Lipiden und -Lipidfraktionen offenbart, gibt es keine Offenbarung der Bildung von Liposomen aus den Liposomen-Zusammensetzungen, die in dieser Anmeldung beansprucht werden.
Die intrazelluläre Zufuhr von Antibiotika und anderen Arzneistoffen zur Kontrolle von Pathogenen, die sich in gewissen Zelltypen, wie Makrophagen, aufhalten, ist ein gegenwärtiges Problem, z. B. das Bakterium Mycobacterium tuberculosis, das Tuberkulose verursacht, Viren, wie das Human-Immunodeficiency-Virus (HIV), welches das erworbene Immundefizienz-Syndrom (AIDS) verursacht, und Parasiten, die Malaria verursachen. Eine überlegene Aufnahme von Archäosomen, die mit Etherlipiden von Archaea hergestellt sind, hätte eine kommerzielle Nützlichkeit bei der Erhöhung der Zufuhr von Arzneistoffen, Antigenen und anderen Verbindungen, die auf die Zufuhr an phagozytische Zellen einer Lebensform, wie eines Menschen, abzielen sollen.
Es gibt ein beträchtliches Interesse an der potentiellen Verwendung von Liposomen auf dem Gebiet der Impfstoff-Anwendungen. Liposomen, die aus herkömmlichen Phospholipiden hergestellt sind, die manchmal mit Cholesterol oder anderen Verbindungen gemischt sind (herkömmliche Liposomen}, sind als potentielle Antigen-Träger/Vehikel getestet worden. Allison und Gregoriadis (1) teilten mit, dass Liposomen, die aus Ei-Phosphatidylcholin hergestellt worden waren, etwas Adjuvans-Aktivität aufwiesen, vorausgesetzt, dass ein negativ geladenes Lipid in die Liposomen-Zusammensetzung eingeschlossen wurde. Da herkömmliche Liposomen häufig nur geringe Adjuvans-Wirkungen demonstrieren, verglichen mit der Verabreichung des freien Antigens, sind verschiedene immunstimulierende Substanzen, wie Lipid A, den Liposomen zusammen mit dem Antigen mit einverleibt worden (4). Jedoch können, wie im Fall von Lipid A und Freund-Adjuvans, immunstimulierende Substanzen mit Toxizität verbundene Probleme bereiten, was sie für Impfstoff-Anwendungen ungeeignet macht.
Die humorale Immunantwort bei Mäusen auf Rinder-Serumalbumin, das in Liposomen eingekapselt ist, die mit Dialkylether-sn-3-phosphatidylcholin hergestellt worden waren, war niedriger als diejenige, die mit ähnlichen Liposomen erhalten wurde, welche mit Diacylester-sn-3-phosphatidylcholin hergestellt worden waren (17). Es gibt keine Lehre im Stand der Technik, die vorschlägt, dass im Vergleich zu Liposomen, die unter Verwendung herkömmlicher Phospholipide hergestellt sind, diejenigen, die unter Verwendung von archäobakteriellen Etherlipiden hergestellt sind, eine überlegene Adjuvans-Wirkung bei der Stimulierung der Immunantwort auf ein Antigen aufweisen würden, welches einem Tier auf verschiedenen Wegen (einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, intramuskulär (i. m.), intravenös (i. v.), intraperitoneal (i. p.), subkutan (s. c.) und peroral (p. o.)) verabreicht wurde.
Coenzym Q₁₀ (auch als CoQ₁₀, Ubichinon-10 oder Ubidecarenon-10 bekannt) ist in Säugerzellen mit Mitochondrien anwesend, wo es eine Redox-Komponente in der Atmungskette ist. Da verringerte Konzentrationen an CoQ₁₀ an gewissen pathologischen Zuständen, wie Myokard-Insuffizienz, Herzinfarkt, Muskeldystrophie, Arterienhochdruck und bei den Symptomen der Alterung eine Rolle spielen, wurde es für therapeutische Anwendungen in derartigen Fällen in Betracht gezogen. Ein Mangel an CoQ₁₀ ist auch bei AIDS-Patienten mitgeteilt worden (5). CoQ₁₀ ist von äußerst hydrophober Natur, und wenn seine chemische Struktur nicht künstlich modifiziert wird, ist es nicht in wässrigen Puffern oder Wasser löslich. Es werden Ähnlichkeiten zwischen CoQ₁₀ und Vitamin E bezüglich einer Eignung als Immunstimulator und Antioxidans bemerkt. Es wurde gezeigt, dass CoQ₁₀ als Emulsion mit Detergenzien die In-vivo-Phagozyten-Aktivität in Tiermodellen erhöht (3). Markiertes CoQ₁₀ ist in herkömmlichen Liposomen als Markierung für eine Myokard-Bildgebung und für die Untersuchung der Gewebeverteilung von herkömmlichen Liposomen verwendet worden, die mit Polysacchariden beschichtet sind (7, 22). In Liposomen ist CoQ₁₀ mit der Lipidschicht der Vesikel assoziiert. Jedoch lehrt keine von diesen oder anderen Veröffentlichungen des Standes der Technik, dass die Kombination von CoQ₁₀ in Archäosomen die Phagozytose des resultierenden Vesikels durch Makrophagenzellen verstärken würde (verglichen mit derjenigen der Archäosomen ohne CoQ₁₀) oder dass eine derartige Kombination die Änderung von Abzielungsprofilen an spezielle Gewebe ermöglichen würde, wenn die Vesikel einem Lebewesen auf verschiedenen Wegen verabreicht werden, oder dass derartige Kombinationen weiter die Immunantwort auf mit verabreichtes) Immunogen(e) verstärken würden (vorliegende beanspruchte Erfindung). Ähnlich lehrt der Stand der Technik nicht, dass die Kombination von CoQ₁₀ mit herkömmlichen Liposomen die Phagozytose der resultierenden Liposomen durch Makrophagen erhöhen würde oder die Änderung von Abzielungsprofilen an Gewebe ermöglichen würde, wenn die Liposomen auf verschiedenen Wegen einem Lebewesen verabreicht werden, oder dass eine liposomale CoQ₁₀-Kombination die Immunantwort auf mit verabreichtes) Immunogen(e) verstärken würde, verglichen mit dem liposomalen Immunogen in Abwesenheit von CoQ₁₀.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist ein Ziel dieser Erfindung, Archäosomen als vorteilhafte Träger von Antigenen, immunogenen Verbindungen, DNA, Arzneistoffen, therapeutischen Verbindungen, pharmazeutischen Verbindungen, bildgebenden Mitteln oder Tracern zu verwenden und diese spezifischen Zellen, wie den Makrophagen, oder spezifischen Geweben in Lebensformen, wie dem Menschen, zuzuführen.
Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, Archäosomen bereitzustellen, die eine erhöhte Adjuvans-Wirkung für die Erzeugung einer Immunantwort auf ein Immunogen aufweisen, und Impfstoff-Anwendungen in einem Lebewesen, wie einem Menschen, bereitzustellen, bei denen das oder die Antigene) zum Zeitpunkt der Verabreichung auf verschiedenen Wegen in Archäosomen eingekapselt, damit assoziiert oder nicht assoziiert werden kann. In einigen Fällen ist die Immunantwort (der Grad der Antwort und ihre Dauer) auf ein Immunogen, das über ein Archäosom zugeführt wurde, vergleichbar mit derjenigen, die mit Freund-Adjuvans als Immunstimulator erhalten wurde.
Noch ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, Archäosomen zu verwenden, die mit Lipiden hergestellt sind, welche einen hohen Anteil an bipolarem oder bipolaren Tetraetherlipid(en) enthalten, die in Mitgliedern von Archäobakterien gefunden werden oder diejenigen nachahmen, die darin gefunden werden, um die Immunantwort auf ein Immunogen zu verstärken und zu verlängern, welches einem Lebewesen entweder als Teil des Archäosoms mit verabreicht wird oder gleichzeitig wie das Archäosom verabreicht wird.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, Archäosomen oder Liposomen, die ausschließlich aus Lipiden außer archäobakteriell-artigen Etherlipiden hergestellt sind, Coenzym Q₁₀ einzuverleiben, um die Phagozytose der betreffenden Archäosomen/Liposomen zu verstärken und/oder um die Zufuhr von CoQ₁₀ sowie einem oder mehreren assoziierten Arzneistoffen) zu erhöhen, um die Immunantwort auf ein Antigen zu verstärken, das mit den betreffenden Archäosomen/Liposomen assoziiert ist.
Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, Archäosomen und herkömmlichen Liposomen, manchmal in Kombination mit Polyethylenglycol-Lipid-Konjugaten, CoQ₁₀ einzuverleiben, um die Zufuhr verschiedener assoziierter Verbindungen an spezifische Organgewebe zu erhöhen, wenn die betreffenden Vesikel über verschiedene Wege, wie p. o., i. m., i. v., s. c. und i. p., einem Lebewesen verabreicht werden. Die Kombination von CoQ₁₀ mit archäosomalen oder herkömmlichen liposomalen Vesikeln, einschließlich Vesikeln, die möglicherweise sterisch durch Assoziation mit Polyethylenglycol-Konjugaten stabilisiert worden sind, würde demgemäß weiter die Nützlichkeit von Archäosomen und von herkömmlichen Liposomen für die Zufuhr von Verbindungen, einschließlich Immunogenen und CoQ₁₀ selbst, an phagozytische Zellen und an spezifische Gewebe erhöhen.
Es ist noch ein weiteres Ziel der Erfindung, Mischungen mit herkömmlichen Lipiden optimale Mengen an Archäobakterien-Etherlipid(en) einzuverleiben, um Vesikel herzustellen, welche die obigen verbesserten Eigenschaften aufweisen.
Alle obigen Aspekte der vorliegenden Erfindung bilden ein verwandtes Konzept.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1. Fluoreszenzmikrographien von Zellen, die mit Methanosarcina mazei-Archäosomen oder mit herkömmlichen Liposomen inkubiert wurden, welche aus DMPC : DMPG : CHOL hergestellt waren, wobei jede Vesikelart CF enthält. Schaubilder A₁, B₁, C₁ – Maus-Peritonealmakrophagen; Schaubilder A₂, B₂; C₂ – J774A.1-Makrophagen; Schaubilder A₃, B₃, C₃ – HEp-2-Zellen; Schaubilder A_1-3 – Archäosomen; Schaubilder B_1-3 – herkömmliche Liposomen; und Schaubilder C_1-3 – Zellen ohne zugesetzte Vesikel. Die Anwesenheit von gelb fluoreszierenden Liposomen ist in den Schwarz-Weiß-Photos durch helle Bereiche angezeigt. Vergrößerungsbalken = 20 μm.
2. Fluoreszenzmikrographien von Maus-Peritonealmakrophagen, J774A.1- und HEp-Zellen, die mit multilamellaren M. mazei-Archäosomen (A₁, B₁, C₁) oder multilamellaren herkömmlichen Liposomen inkubiert wurden, welche aus DMPC : DMPG : CHOL hergestellt waren (A₂, B₂, C₂), wobei jede Vesikelart CF enthielt. Schaubilder A_1-2 – J774A.1-Zellen; Schaubilder B_1-2 – Maus-Peritonealmakrophagen; Schaubilder C_1-2 – HEp-Zellen. Die gelbe Fluoreszenz von Vesikeln erscheint auf den Schwarz-Weiß-Photos als helle Bereiche. Vergrößerungsbalken = 20 μm.
3. Gewebeverteilung von (A) herkömmlichen Liposomen (DSPC : DCP : CHOL) und (B) herkömmlichen CoQ₁₀-Liposomen (DSPC : DCP : CHOL : Q₁₀) 24 Stunden nach oraler und parenteraler Verabreichung an Mäuse. Die gezeigten Daten sind ±-Standardfehler vom Mittelwert.
4. Gewebeverteilung von (A) herkömmlichen PEG-Liposomen (DSPC : DCP : CHOL : DSPE-PEG) und (B) herkömmlichen PEG-CoQ₁₀-Liposomen (DSPC : DCP : CHOL : DSPE-PEG : Q₁₀) 24 Stunden nach oraler und parenteraler Verabreichung an Mäuse. Die gezeigten Daten sind ±-Proben-Standardfehler vom Mittelwert.
5. Gewebeverteilung von (A) Archäosomen (M. mazei-GPL) und (B) CoQ₁₀-Archäosomen (M. mazei-GPL : Q₁₀) 24 Stunden nach oraler und parenteraler Verabreichung an Mäuse. Die gezeigten Daten sind ±-Proben-Standardfehler vom Mittelwert.
6. Gewebeverteilung von (A) PEG-Archäosomen (M. mazei-GPL : DSPE-PEG) und (B) PEG-CoQ₁₀-Archäosomen (M. mazei-GPL : DSPE-PEG : Q₁₀) 24 Stunden nach oraler und parenteraler Verabreichung an Mäuse. Die gezeigten Daten sind ±-Proben-Standardfehler vom Mittelwert.
7. Humorale Mäuseantworten auf die Cholera B-Untereinheit als Antigen. Die erste und die zweite Injektion (i. p.) bestand aus: B, 1,0 μg Antigen in PBS (kein Adjuvans); FA, 1,0 μg Antigen + Freund-Adjuvans; M. smithii, Archäosomen (1,21 mg Lipid, 1,0 μg eingekapseltes Antigen); und M. smithii + B, bloße Archäosomen (1,21 mg Lipid), gefolgt von 1,0 μg Antigen in PBS 1 Stunde später. Die Immunisierungen fanden an den Tagen 0 und 14 statt.
8. Vergleich von humoralen Mäuseantworten auf Rinder-Serumalbumin (BSA), das einer Reihe von Lipidvesikeln/Adjuvantien einverleibt wurde. Bei jeder Injektion erhielten die Mäuse 25 μg BSA. Die i. p.-Injektionen in die Mäuse fand an den Tagen 0, 10 und 52 statt, und Seren wurden 4 Tage nach der zweiten und dritten Injektion gesammelt. Archäosomen wurden aus den GPL hergestellt, die aus dem angezeigten Archäobakterium extrahiert wurden. Seren 1 : 400 verdünnt. Vesikel/Adjuvans-Zusammensetzung (mg Lipid/Auffrischung): BSA – kein Adjuvans oder Vesikel, BSA verdünnt in PBS; FA – BSA emulgiert in Freund-Adjuvans; T. acidophilum (0,75 mg); M. mazei (0,64 mg); M. smithii (0,57 mg); M. voltae (1,83 mg); M. hungatei (1,09 mg); M. concilii (0,68 mg); M. stadtmanae (0,51 mg); PC : PG (DMPC : DMPG, 2,11 mg); PC : PF : CHOL (DMPC : DMPG : CHOL, 0,12 mg); und PC : DCP : CHOL (DMPC : DCP : CHOL, 0,87 mg). Die Daten sind die Mittelwerte von zwei Mäusen.
9. Beziehung zwischen der Zahl der Immunisierungen mit in Archäosomen eingekapseltem BSA und den resultierenden Anti-BSA-Antikörpertitern in Mausseren. Jede Maus empfing 25 μg BSA pro i. p.-Injektion entweder als bloßes Antigen, in M. smithii-Archäosomen (0,58 mg Lipid) eingekapselt oder in FA emulgiert. Die Injektionen in die Mäuse fanden an den Tagen 0, 24, 54 und 108 statt. Seren 1 : 400 verdünnt. Injektionsprotokoll: 0/4, bis zu 4-mal mit dem bloßen Antigen immunisiert; 1/3, erste Injektion mit verkapseltem Antigen und verbleibende drei Auffrischungen mit dem bloßen Antigen; 2/2, die ersten 2 Injektionen mit verkapseltem Antigen und die verbleibenden 2 Auffrischungen mit dem bloßen Antigen; 3/1, die ersten 3 Injektionen mit verkapseltem Antigen und die verbleibende Auffrischung mit dem bloßen Antigen; 4/0, 4 Injektionen mit verkapseltem Antigen; und FA, erste Injektion mit KFA, zweite mit IFA, verbleibende 2 Auffrischungen mit bloßem Antigen. Die Daten sind als die Mittelwerte von 2 Mäusen ausgedrückt.
10. Anti-BSA-Antikörper-Isotypen, die nach Immunisierungen mit in Archäosomen verkapseltem BSA in Mausseren gefunden wurden. Die Injektionen wurden den Mäusen i. m. an den Tagen 0 und 14 unter Verwendung von 12,5 μg BSA/Injektion verabreicht. Archäosomen, die 12,5 μg BSA tragen und aus den GPL hergestellt sind, entsprechen Trockengewichte/Injektion von 0,69 mg (M. macei), 0,55 mg (M. hungatei) und 1,5 mg (T. acidophilum). Serumproben wurden am Tag 25 nach der ersten Injektion erhalten. Ebenfalls gezeigt sind die Isotypisierungs-Ergebnisse für Injektionen von bloßem BSA (BSA) und BSA mit Freund-Adjuvans (FA).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG VON BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die Archaea (Archaeobacteria) erzeugen viele verschiedene Polyetherlipid-Strukturen, die für die Herstellung von Vesikeln (Archäosomen) nützlich sind, welche einzigartige Eigenschaften aufweisen. Von den verfügbaren Arten von Archaea als Klasse von Organismen wählten wir mehrere erläuternde Beispiele, so dass ein breites Spektrum von Etherlipid-Strukturen umfasst wurde; nämlich Halobacterium cutirubrum, Methanococcus mazei, Methanospirillum hungatei, Methanococcus jannaschii, Methanosphaera stadtmanae, Methanobrevibacter smithii, Methanococcus voltae, Thermoplasma acidophilum, Methanosaeta concilii und Methanobacterium espanolae. In dieser Erfindung sind Archäosomen Vesikel, die mit Lipiden hergestellt werden, welche in ihrer Zusammensetzung Etherlipide, die aus einem oder mehreren Mitgliedern der Archaea extrahiert wurden, oder (ein) Lipid(e), das bzw. die (eine) Etherlipid-Strukturen) nachahmt bzw. nachahmen, die in Mitgliedern von Archaea gefunden werden, oder ein oder mehrere Etherlipid(e) einschließen, die in biologisch reiner Form aus Archaea gereinigt wurden. Man erkennt auch, dass Lipide (wie diejenigen, die durch chemische Synthese hergestellt sind), welche diejenigen nachahmen, die in Archaea gefunden werden, ebenfalls verwendet werden könnten, um Archäosomen für die Zwecke herzustellen, die in der vorliegenden Erfindung angegeben sind.
Die Erfinder haben entdeckt, dass Archäosomen durch phagozytische Zellen in einem größeren Ausmaß aufgenommen werden als herkömmliche Liposomen. Ein weiterer Aspekt der Erfindung zeigt die verbesserte Aufnahme von sowohl herkömmlichen Liposomen als auch Archäosomen durch phagozytische Zellen durch die Einverleibung von Coenzym Q₁₀ in die jeweiligen Vesikel. Die Einverleibung von CoQ₁₀ in herkömmliche Liposomen und Archäosomen ermöglicht für Vesikel, die auf verschiedenen Wegen verabreicht werden, auch die verbesserte gezielte Zufuhr von Vesikeln an spezifische Gewebe in dem Lebewesen. CoQ₁₀-haltige Archäosomen, die auch Polyethylenglycol enthalten, sind bei der Abzielung von oral verabreichten Vesikeln auf die Zufuhr zu Geweben der Milz und der Leber besonders wirksam. Dies wäre besonders für die orale Zufuhr von Impfstoffen anwendbar. Weiter wird gezeigt, dass Archäosomen allgemein im Vergleich zu herkömmlichen Liposomen als Träger von Antigenen überlegen sind, was eine verbesserte Immunantwort auf das Antigen zur Folge hat, das einem Lebewesen, wie einem Menschen, verabreicht wird. Weiter wird gezeigt, dass Archäosomen als überlegene Adjuvantien wirken, verglichen mit herkömmlichen Liposomen, was eine erhöhte Immunantwort auf ein Antigen zur Folge hat, das einem Lebewesen, wie einem Menschen, verabreicht wird. Auch die Dauer der Immunantwort, wie durch den Antikörpertiter gemessen, kann durch Herstellung von Archäosomen mit Lipiden, die einen hohen Anteil an bipolaren Tetraetherlipiden enthalten, verlängert werden. Schließlich wird gezeigt, dass Coenzym Q₁₀, wenn es bei der Herstellung von Vesikeln verwendet wird, die Immunantwort auf ein Antigen, das entweder in herkömmlichen Liposomen und/oder in Archäosomen mit eingeschlossen ist, verbessert.
Diese Erfindung wird besser aus den Daten verstanden, die unter der Überschrift „ERGEBNISSE UND DISKUSSION" angegeben sind.
Definitionen der verschiedenen Ausdrücke, die in dieser Beschreibung verwendet werden
Antigen, ein Immunogen, auf welches ein Lebewesen, wie ein Mensch, eine Immunantwort erzeugt; herkömmliches Phospholipid, ein Glycerolipid, in dem die Kohlenwasserstoff-Ketten über Esterbindungen an die Glycerin-Hauptkette geknüpft sind; Etherlipid, ein Glycerolipid, in dem die Kohlenwasserstoff-Ketten über Etherbindungen an die Glycerin-Hauptkette geknüpft sind; archaeale(s) oder archäobakterielle(s) Lipid(e), Lipid(e), das bzw. die von (einem) Mitgliedern) der Klasse Archaea (Synonym für Archaeobacteria) abstammt bzw. abstammen; Liposom, geschlossenes Vehikel, das aus Lipid-Doppelschichtmembranen hergestellt ist, welche ein wässriges Volumen einschließen, das Liposom kann unilamellar (eine Doppelschicht) oder multilamellar (mehrere Doppelschichten, die jeweils von der angrenzenden durch wässrige Räume getrennt sind) sein; herkömmliches Liposom, ein Liposom, das mit herkömmlichen Phospholipiden hergestellt ist und in einigen Fällen ein Sterol einschließt und andere Verbindungen einschließen kann, die innerhalb des Vesikels eingeschlossen oder mit der Doppelschichtmembran assoziiert sind; Archäosom, ein Lipid-Vesikel, das mit einem oder mehreren Etherlipiden hergestellt ist, die allein in den Arten in der Klasse Archaea gefunden werden, einschließlich derjenigen Vesikel, die aus jeder Kombination von Lipiden hergestellt sind, die archäobakterielle(s) Etherlipid(e) in ihrer Zusammensetzung einschließen, die Vesikelschicht von Archäosomen kann vollständig in Form einer Doppelschicht (falls ausschließlich mit monopolaren Dietherlipiden oder mit Lipid-Mischungen hergestellt, die Diether und andere monopolare Lipide enthalten) oder einer Monoschicht (falls ausschließlich mit bipolaren Tetraetherlipiden hergestellt) oder einer Kombination aus Mono- und Doppelschichten (falls mit Diether- oder anderen monopolaren Lipiden und Tetraetherlipiden hergestellt) vorliegen; Vesikel, Liposom oder Archäosom; bloßes Antigen, Antigen ohne Adjuvans oder Vesikel; bloßes Liposom/Archäosom, Liposom oder Archäosom ohne ein assoziiertes Antigen; Adjuvans, eine Substanz oder ein Material, die bzw. das, wenn sie mit einem Immunogen verabreicht wird, die Immunreaktion auf das Immunogen erhöht. Der Name des Archäobakteriums, der mit dem Wort Archäosom verbunden ist (z. B. M. espanolae-Archäosom oder Archäosom von/aus M. espanolae), zeigt an, dass das Archäosom mit Lipiden, die aus diesem speziellen Archäobakterium extrahiert wurden, und, falls nicht gegenteilig angegeben, aus den gesamten polaren Lipiden (GPL), die aus diesem Archäobakterium extrahiert wurden, hergestellt ist.
MATERIALIEN UND METHODEN
Materialien
Die Archäobakterien-Kulturen waren Methanospirillum hungatei GP1 (DSM 1101), Methanococcus jannaschii JAL-1 (DSM 2661), Methonococcus voltae PS (DSM 1537), Methanosarcina mazei S-6 (DSM 2053), Methanobrevibacter smithii AL1 (DSM 2375), Methanosphaera stadtmanae MCB-3 (DSM 3091), Methanobacterium espanolae GP9 (DSM 5982), Halobacterium cutirubrum (DSM 669), Methanosaeta concilii GP6 (DSM 3671) und Thermoplasma acidophilum 122-1B3 (ATCC 27658). Die Kulturen wurden gemäß Sprott et al. (20) kultiviert.
L-α-Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC), L-α-Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC), L-α-Dimyristoylphosphatidylglycerin (DMPG), Distearoylphosphatidylcholin (DSPC), Dicetylphosphat (DCP, d. h. Dihexadecylphosphat), Cholesterol (CHOL) (alle diese waren mindestens 99% rein), 5(6)-Carboxyfluorescein (CF), Triton X-100, n-Propylgallat, Peroxidase-Substrat 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzothiazolinsulfonsäure), Meerrettich-Peroxidase (1380 Einheiten/mg), Fettsäurefreies Rinder-Serumalbumin (BSA), Coenzym Q₁₀, Vitamin E, komplettes Freund-Adjuvans (KFA) und inkomplettes Freund-Adjuvans (IFA) wurden von Sigma Chemical Co., Mo, USA, erworben. Distearoylphosphatidylethanolamin-Polyethylenglycol 5000-Konjugat (DSPE-PEG) wurde von Avanti Polar Lipids, Inc., Alabama, erworben. Cholera-Toxin B-Untereinheit aus Vibrio cholerae wurde von Calbiochem (La Jolla, Kalifornien) erworben. Cholesteryl[1-³H]hexadecylether (³H-Chol), 52 μCi/mMol, wurde von Amersham Canada Ltd., Oakville, Ont., erworben. Kieselgel G wurde von Macherey Nagel und Co., Düren, Deutschland, erworben. Das LiposoFast-System und 400 nm-Filter wurden von Avestin, Inc., Ottawa, Kanada, erworben. n-Octyl-β-D-glucopyranosid (OGP) war ein Produkt von Calbiochem. Fetales Rinderserum (FBS) und alle Medienkomponenten, einschließlich DMEM und RPMI-Medium, wurden von Gibco Life Technologies, Inc., Grand Island, NY, erworben. Radioaktivitäts-Zählungs-Bedarf wurde von ICN Biomedicals Inc., Irvine, CA, erhalten. O-Ketten-Polysaccharid, hergestellt aus Escherichia coli 0:157:H7 war ein Geschenk von Dr. M. B. Perry (16). Immunologische Reagenzien für die Antikörper-Isotypisierung waren von Isotec, im Handel durch CedarLane Laboratories (Hornby, Ont.). Serum-Abtrennröhrchen waren von Becton Dickinson (Rutherford, New Jersey), und Meerrettich-Peroxidase (HRP)-konjugiertes Ziegen-Antimaus-IgG + IgM von Caltag (South San Francisco, CA).
Bakterielle Lipide
Die Gesamt-Lipide wurden aus gefrorenen Zellpasten der verschiedenen Arten von Archäobakterien extrahiert, und die gesamten polaren Lipide (GPL) wurden als die in Aceton unlösliche Fraktion gesammelt, wie beschrieben (20). Wenn erforderlich, wurden Lipide in biologisch reiner Form aus der Mischung von extrahierten Lipiden unter Verwendung präparativer Dünnschicht-Chromatographie erhalten, und die Reinheit wurde durch Negativ-Ion-Fast-Atom-Bombardement-Messenspektrometrie bestätigt. PGP-Me (2,3-Diphytanyl-sn-glycerin-1-phospho-3'-sn-glycerin-1'-methylphosphat) wurde aus Halobacterium cutirubrum gereinigt (9); D_OHPI (Hydroxydiether-Analogon von Phosphatidylinosit) und D_OHPG (Hydroxydiether-Analogon von Phosphatidylglycerin) wurden aus M. mazei gereinigt (19); und ein Phosphatidylinositglycotetraetherlipid mit m/z 1703 Dalton wurde aus Lipiden gereinigt, die aus M. smithii extrahiert worden waren. Der Fachmann erkennt, dass die Lipide durch andere Verfahren als die hierin beschriebenen extrahiert und/oder gereinigt werden können, um annehmbare Lipide für die beschriebene Nützlichkeit zu erhalten.
Liposomen- und Archäosomen-Herstellung
Für die Liposomen- und Archäosomen-Herstellung wurden die Lipide, die in Chloroform gelöst waren, unter einem N₂-Strom getrocknet und vor der Hydratisierung 1–2 Stunden in einen Lyophilisierer gegeben. Der Hydratationspuffer bestand aus 0,5 ml 10 mM Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,14, der 160 mM NaCl enthielt (PBS). Falls nicht anders angegeben, wurden die Liposomen und Archäosomen durch Druck-Extrusion der hydratisierten Lipide durch zwei aufeinander gestapelte 400 nm-Filter in einer LiposoFast-Apparatur ähnlich derjenigen, die von MacDonald et al. beschrieben wird (10), hergestellt, wodurch man hauptsächlich unilamellare Vesikel erhält. Archäobakterielle Lipide wurden 1–2 Stunden oder manchmal über Nacht bei 35°C hydratisiert, und die resultierenden multilamellaren Vesikel wurden entweder direkt verwendet (wenn angegeben) oder bei Umgebungstemperatur extrudiert. Herkömmliche Phospholipide wurden hydratisiert (1–2 h) und bei DPPC bei 50°C und bei DMPC : DMPG : Cholesterol (Molverhältnis 1,8 : 0,2 : 1,5) oder DMPC : DMPG (Molverhältnis 1,8 : 0,2) bei 35°C extrudiert, wodurch man unilamellare Vesikel erhielt.
Vesikel mit eingeschlossenem CF oder eingeschlossener Peroxidase wurden für In-vitro-Phagozytose-Studien hergestellt, indem man dem Hydratationspuffer 1,5 mM CF bzw. 100 μg Peroxidase (138 Einheiten) einverleibte. Typisch wurden 10 mg getrocknete GPL, die aus dem angegebenen Archäobakterium extrahiert worden waren, oder eines oder beide der herkömmlichen Lipide DPPC oder DMPC : DMPC : CHOL mit den oben angezeigten Molverhältnissen für die Vesikel-Bildung durch Druck-Extrusion hydratisiert, wie oben beschrieben. Uneingekapseltes CF in CF-Vesikel-Präparaten wurde in Sephadex G-50-Säulen unter Verwendung der Minisäulen-Zentrifugationsmethode entfernt, die von New (14) beschrieben wird. Im Fall von Peroxidase-Vesikeln wurde ungebundenes Enzym durch Zentrifugation (200 000 × g max. 30 min) entfernt, und die Vesikel wurden 4–5 mal mit 7 ml-Aliquoten PBS gewaschen.
Die In-vitro-Aufnahme von Archäosomen, die aus den aus M. mazei extrahierten GPL hergestellt waren, und von herkömmlichen Liposomen, die aus DPPC : CHOL (Molverhältnis 5 : 5), DSPC : CHOL (Molverhältnis 5 : 5) oder DSPC : CHOL : DCP (Molverhältnis 4 : 5 : 1) hergestellt waren, wurden unter Verwendung von Cholesteryl[1-³H]hexadecylether (³H-Chol) als lipidischer Markierung ebenfalls untersucht. ³H-Chol, gelöst in Chloroform, wurde zu 3,7 × 10⁴ Bq/mg Gesamtlipid (1 μCi/mg Gesamtlipid) vor Trocknen der Lipide zu der jeweiligen Lipidmischung gegeben. Falls erforderlich, wurde Coenzym Q₁₀, gelöst in Chloroform, zugesetzt (bei einem Verhältnis von 5 : 20 Gew./Gew. der Gesamtlipide), bevor die Lipide getrocknet wurden. Die Liposomen und Archäosomen wurden durch das Umkehrphasen-Verdampfungs- (REV-) Verfahren (bei 55°C), kombiniert mit Badbeschallung (bei Raumtemperatur) unter Verwendung des von New (13) beschriebenen Verfahrens hergestellt. Die ³H-Chol-Einverleibung in diese Vesikel fand mit einem Wirkungsgrad von mindestens 95% statt, und diese Vesikel wiesen im Wesentlichen die gleichen spezifischen Aktivitäten auf. Material, das nicht mit den Vesikeln assoziiert war, wurde durch Zentrifugation und Waschen mit PBS entfernt, wie oben beschrieben.
Für In-vivo-Gewebeverteilungs-Studien wurden verschiedene Vesikel mit ³H-Chol als lipidischer Markierung hergestellt, wie nachstehend beschrieben. Wenn angezeigt, enthielten diese Vesikel auch Coenzym Q₁₀ und/oder Distearoylphosphatidylethanolamin-Polyethylenglycol 5000-Konjugat (DSPE-PEG), welche dem Rest der Lipide vor Trocknen zugesetzt wurden. Archäosomen (M. mazei-GPL), CoQ₁₀-Archäosomen (M. mazei-GPL : CoQ₁₀ bei einem Molverhältnis von 8 : 2 unter Verwendung des durchschnittlichen Molekulargewichts der GPL als 1000), PEG-Archäosomen (M. mazei-GPL plus DSPE-PEG bei einem 7%-Molverhältnis der Gesamt-Lipide) und PEG-CoQ₁₀-Archäosomen (M. mazei-GPL : CoQ₁₀ bei einem Molverhältnis 8 : 2 plus DSPE-PEG bei einem 7%-Molverhältnis der Gesamt-Lipide) wurden mit ³H-Chol (spezifische Aktivität von 1,924 × 10⁶ Bq/mMol (52 μCi/mMol)) zu 3,7 × 10⁵ Bq (10 μCi) pro mg für die Vesikelherstellung verwendetes Gesamt-Lipid zugesetzt. Die Vesikel wurden durch das oben beschriebene REV-Badbeschallungs-Verfahren zur Herstellung von ³H-Chol-markierten Vesikeln für die In-vitro-Studien hergestellt.
Herkömmliche Liposomen (DSPC : DCP : CHOL bei einem Molverhältnis von 4 : 1 : 5), herkömmliche CoQ₁₀-Liposomen (DSPC : DCP : CHOL : CoQ₁₀ bei einem Molverhältnis von 3 : 1 : 4 : 2), herkömmliche PEG-Liposomen (DSPC : DCP : CHOL bei einem Molverhältnis von 4 : 1 : 5 plus DSPE-PEG bei einem Molverhältnis von 7% der Gesamt-Lipide) und herkömmliche PEG-CoQ₁₀-Liposomen (DSPC : DCP : CHOL : CoQ₁₀ bei einem Molverhältnis von 3 : 1 : 4 : 2 plus DSPE-PEG bei einem Molverhältnis von 7% der Gesamt-Lipide) wurden mit ³H-Chol hergestellt, wie oben für Archäosomen beschrieben.
Für In-vivo-Studien mit Archäosomen (hergestellt aus den GPL oder einem Lipid, das in biologisch reiner Form aus dem angezeigten Archäobakterium erhalten wurde) und herkömmlichen Liposomen (hergestellt aus DMPC : DMPG bei einem Molverhältnis von 1,8 : 0,2 oder DMPC : DMPG : CHOL bei einem Molverhältnis von 1,8 : 0,2 : 1,5 oder DMPC : DCP : CHOL bei einem Molverhältnis von 7 : 1 : 2), die eingeschlossenes Antigen enthielten, wurden die Vesikel durch Druck-Extrusion (bei Raumtemperatur bei den archäobakteriellen Lipiden und bei 35°C bei den DMPC-haltigen Lipiden unter Verwendung von Filtern mit einer Porengröße von 400 nm) hergestellt. Etwa 20 mg Trockengewicht des oder der getrockneten Lipids bzw. Lipide wurden in 1 ml PBS hydratisiert, die entweder BSA (5 mg/ml), Cholera B-Toxin-Untereinheit (0,5 mg/ml) oder O-Ketten-Polysaccharid (18 mg/ml) enthielt. Um BSA in DSPC : DCP : CHOL (Molverhältnis 4 : 1 : 5), in DSPC : DCP : CHOL : CoQ₁₀ (Molverhältnis 3 : 1 : 4 : 2) und in M. mazei-GPL : CoQ₁₀ (Molverhältnis 8 : 2) einzuschließen, wurden die Vesikel durch das oben beschriebene REV- (bei 55°C) Beschallungs-Verfahren hergestellt. Das BSA wurde in diese Vesikel durch das DRV-Verfahren, wie von New (13) beschrieben, eingekapselt. Das Antigen, das nicht in den Vesikeln eingeschlossen/damit assoziiert war, wurde durch Zentrifugation und Waschen, wie für die Peroxidase-Vesikel beschrieben, entfernt.
Vitamin E wurde den Archäosomen einverleibt, indem man 1 mg Vitamin E und 20 mg T. acidophilum-GPL in CHCl₃ löste. Das CHCl₃ wurde entfernt, die getrockneten Lipide und das Vitamin E wurden mit PBS hydratisiert, und Vitamin E-Archäosomen wurden durch Druck-Extrusion hergestellt, wie oben beschrieben.
Vesikel-Charakterisierung
Die mittleren Vesikel-Durchmesser wurden durch Zahlen-gewichtete Größenverteilung unter Verwendung einer Nicomp-Teilchengrößen-Bestimmungsvorrichtung, Modell 370 (Nicomp, Santa Barbara, CA), bestimmt.
Die Peroxidase-Aktivität in 5 bis 35 μg Trockengewicht von Liposomen oder Archäosomen wurde in 1 ml-Reaktionsmischungen bestimmt, die 45 mM Citronensäure, pH 4,0, 2,2 mM H₂O₂, 0,2 mM 2,2'-Azinobis(3-ethylbenothiazolin-6-sulfonsäure) in Anwesenheit von 0,5% (Gew./Vol.) des Detergens OGP enthielten. Die Reaktionsgeschwindigkeiten wurden bei 23°C mit einem Coleman 575- Aufzeichnungs-Spektrophotometer aufgezeichnet.
CF wurde mit einem Spektrofluorometer quantifiziert, das bei einer Anregungs-Wellenlänge von 470 nm und einer Emissions-Wellenlänge von 520 nm eingestellt war.
Die Menge an Protein, die den für die Immunisierungen zu verwendenden Archäosomen und Liposomen einverleibt oder mit diesen assoziiert wurde, wurde durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) quantifiziert, in der sich die Lipide von dem Protein-Antigen trennen. Die Densitometrie von angefärbten Gelen wurde mit einem Geldokumentationssystems von Canberra Packard Canada vorgenommen und aus Standardkurven quantifiziert, die durch Laden von 0,025 bis 2 μg des interessierenden Proteins in jede Bahn hergestellt wurden. Die Menge an Protein, die den Vesikeln einverleibt/damit assoziiert wurde, wurde auf der Grundlage von salzfreien Trockengewichten der Liposomen bzw. Archäosomen verglichen.
Um die Menge an Coenzym Q₁₀ zu bestimmen, das in der Lipidschicht der Vesikel eingeschlossen war, wurden die Vesikel in Chloroform gelöst, und die Extinktion wurde bei 278 nm gemessen. Es wurde eine Standardkurve unter Verwendung von gereinigtem, in Chloroform gelöstem Q₁₀ hergestellt, und eine Konzentration von 10 μg CoQ₁₀/ml ergab eine Extinktion von 0,2.
Maus-Peritonealmakrophagen und Zell-Linien
Maus-Peritonealmakrophagen, die wie zuvor beschrieben (23) aus 12–16 Wochen alten weiblichen Balb/c-Mäusen geerntet worden waren, wurden in RPMI-1640-Medium gehalten, das mit 25 mM HEPES-Puffer, 2 mM L-Glutamin, 40 μg/ml Gentamicin und 10% FBS ergänzt war. HEp-2 (menschliche Kehlkopfepithel-Karzinom-Zell-Linie, ATCC Nr. CCL 23) und HeLa (menschliche Zervix-Epithelioid-Karzinom-Zell-Linie, ATTC Nr. CCL 2) und die Monozyten-Makrophagen-Zell-Linie J774A.1 (ATCC Nr. TIB 67) wurden von der American Type Culture Collection, Rockville, MD, erhalten. Diese drei Zell-Linien wurden in dem gleichen Medium wie die Peritonealmakrophagen gehalten. EJ/28-Zellen (menschliche Uroepithel-Karzinom-Zell-Linie) wurden von Dr. Derek Duke, Imperial Cancer Research Fund, London, England, erhalten. Die EJ/28-Zellen wurden in DMEM gehalten, das mit 2 mM L-Glutamin, 40 μg/ml Gentamicin und 10 FBS ergänzt war. Alle Zellen wurden bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre gehalten, die 5% CO₂ in Luft enthielt.
Peroxidase-Assay für die In-vitro-Vesikelbindung an Zellen
Archäosomen oder Liposomen, die eingekapselte Peroxidase enthielten, wurden mit verschiedenen Zelltypen inkubiert, um die jeweilige Vesikelbindung an Säugerzellen zu quantifizieren. Peritonealmakrophagen wurden, wie zuvor beschrieben, hergestellt, so dass sie konfluente Monoschichten ergaben (23). Die Zell-Linien wurden bei 50% Konfluenz auf Gewebekulturplatten (Nunc Inc., Naperville, IL) ausgesät. Alle Zell-Linien wurden in ihren jeweiligen Medien auf Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen plattiert, um konfluente Monoschichten zu bilden. Am nächsten Tag wurden die Zellen zweimal mit dem jeweiligen Zuchtmedium gewaschen, um nicht-anhaftende Zellen zu entfernen, und dann in frischem Medium, das mit den verschiedenen Vesikel-Präparaten ergänzt war, inkubiert (50 min bei 37°C). Die anhaftenden Zellen wurden dann 5 × mit 200 μl eiskalter PBS gewaschen, die 0,9 mM CaCl₂ enthielt, um ungebundene Vesikel zu entfernen. Die Vesikel und die Zellen wurden anschließend unter Verwendung von 100 μl 0,5%-igem OGP lysiert, und 100 μl 2 × konzentrierte Substratlösung wurden dazugegeben. Nach 30-minütiger Inkubation bei 25°C wurde die Farbreaktion unter Verwendung einer Dynatech MR5000-Mikroplatten-Ablesevorrichtung (Chantillym, VA) bei 405 nm gemessen. Die Messwerte wurden auf der Basis der Menge an Peroxidase, die in den jeweiligen bei dem Bindungsassay verwendeten Vesikeln eingekapselt war, in μg Vesikel, die pro mg Zellprotein gebunden waren, umgerechnet.
Fluoreszenzmikroskopische Abschätzung der In-vitro-Vesikelbindung an Zellen Fluoreszenzmikroskopie wurde verwendet, um die Archäosomen- oder Liposomenbindung an mehrere Zelltypen sichtbar zu machen. Für diese Studien wurde CF bei einer Konzentration von lediglich 1,5 mM in die Vesikel eingeschlossen, um ein Selbst-Quenchen zu vermeiden. Peritonealmakrophagen und die verschiedenen Zell-Linien wurden bei etwa 20% Konfluenz auf Gewebekultur-Platten mit 24 Vertiefungen (Nunc Inc., Naperville, IL) ausgesät. Am nächsten Tag wurden die Zellen zweimal mit eiskalter PBS gewaschen, die 0,9 mM CaCl₂ enthielt, um nicht-anhaftende Zellen zu entfernen, und mit den verschiedenen CF-haltigen Vesikelpräparaten (40 μg/ml) 30 min bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden ausgiebig mit eiskalter PBS gewaschen und dann in PBS konserviert, die 1% Formaldehyd und 0,1% n-Propylgallat (Fluoreszenzverblassungs-Inhibitor) konserviert. Die anhaftenden Zellen und gebundenen CF-Vesikel wurden unter Verwendung eines Olympus IMT-2-Umkehrmikroskops betrachet, welches mit einer IMT2-RFL-Einrichtung für reflektiertes Fluoreszenzlicht und einer 35 mm-Photomikrographie-Kamera ausgerüstet war.
³H-Chol-Assay für die In-vitro-Vesikelaufnahme
Diese Aufnahme-Studien wurden im Wesentlichen wie oben beschrieben durchgeführt, verwendeten aber Liposomen und Archäosomen, die so hergestellt waren, dass sie tritiierten Cholesteryl[1-³H]ether (³H-Chol) als Tracer enthielten. Ein Mikrocurie (1 μCi = 37 kBq) ³H-Chol wurde vor Herstellung der Vesikel pro Milligramm Lipid zugesetzt. Die radioaktive Markierung, die von J774A.1-Makrophagen aufgenommen wurde, wurde gemessen und gemäß Makabi-Panzu et al. (11) auf der Basis der Menge an Makrophagen-Protein berechnet.
Inhibierung von Makrophagen-Funktionen
Anhaftende Makrophagen wurden behandelt, um ihre phagozytischen Funktionen zu inhibieren, und der Einfluss davon auf die Archäosomen-Bindung/Aufnahme wurde überwacht. J774A.1-Makrophagen wurden in Gewebekulturplatten mit 24 Vertiefungen ausgesät, um halbkonfluente Monoschichten zu bilden. Am nächsten Tag wurden die Zellen zweimal mit eiskalter PBS gewaschen. CF-haltige Archäosomen, die aus den GPL von M. hungatei hergestellt worden waren, wurden bei einer Konzentration von 0,04 mg/ml zu den Makrophagen gegeben, und man ließ die Proben 30 Minuten bei 37°C inkubieren. Die Zellen wurden dann ausgiebig mit eiskalter PBS gewaschen, die 0,9 mM CaCl₂ enthielt, um nicht-anhaftende Archäosomen zu entfernen, und die Zellen wurden in frischem Medium allein, in Medium, das Inhibitoren enthielt, oder in Medien, die bei 4°C gekühlt waren, resuspendiert. Die Kulturen wurden dann bis zu 300 min bei 37°C (oder 4°C, wie angezeigt) inkubiert. In erforderlichen Zeitabständen wurden die Makrophagen mittels Fluoreszenzmikroskopie überprüft, um eine Abschätzung des Ausmaßes der CF-Freisetzung aus den Archäosomen zu erhalten.
Für Assays, die Formaldehyd-fixierte Makrophagen verwendeten, wurden die Zellen zuerst mit Archäosomen inkubiert und gewaschen, wie oben beschrieben. Dann wurden 0,5 ml einer 0,5%-igen Formaldehyd-Lösung zu jeder Vertiefung gegeben, und die Zellen wurden 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Das Fixierungsmittel wurde vor Beginn der Inkubation über bis zu 240 min durch ausgiebiges Waschen mit PBS und Medium entfernt.
Um die Wirkungen der Inhibierung der Polymerisation von Zytoskelett-Komponenten der Zellen auf die Archäosomen-Aufnahme zu überprüfen, wurden die Makrophagen in Medium, das jeweils 10 μg/ml Zytochalasine B und D (in einer Endkonzentration von 1% Dimethylsulfoxid) enthielt, beginnend 30 min vor der Zugabe von Archäosomen und fortgesetzt bis zum Ende der Zeitversuchs-Periode inkubiert. Makrophagen wurden unter den gleichen Bedingungen auch in Medium inkubiert, das 1% Dimethylsulfoxid (DMSO) enthielt, um jegliche mögliche Auswirkung von DMSO zu bewerten.
In-vivo-Gewebeverteilung von Vesikeln
Durch Inzucht erzeugte weibliche Balb/c-Mäuse wurden von Charles River Laboratories (St. Constant, Quebec) erworben und in der Tierversorgungseinheit am National Research Council of Canada gehalten.
Verschiedene Arten von Vesikeln, die ³H-Chol enthielten, wurden weiblichen Balb/c-Mäusen (1 mg Gesamt-Lipide pro Maus, ca. 50 mg/kg Körpergewicht) in dreifacher Ausführung über den p. o.-Weg unter Verwendung intragastrischer Intubation, um direkt dem Magen zuzuführen, über den i. m.-Weg, über den s. c.-Weg oder über den i. v.-Weg (in die Schwanzvene injiziert) verabreicht. Die Mäuse waren zum Zeitpunkt der Vesikel-Verabreichung 6–8 Wochen alt. Man gestattete den Mäusen normalen Zugang zu Futter und Wasser. 24 oder 48 Stunden nach der Verabreichung wurden die Mäuse euthanasiert, Plasma und Organe wurden gesammelt, und die Radiotracer-Zählvorgänge, die mit den Organgeweben verbunden waren, wurden in einem LKB 1217 Rackbeta-Flüssigszintillations-Zähler (Pharmacia Canada, Baie d'Urfé, Quebec) unter Verwendung von früher beschriebenen Verfahren (12) bestimmt. Die Verteilung der Radiotracer pro Gramm der verschiedenen Organgewebe (oder pro ml Plasma) wurde berechnet und als Prozentsatz der Gesamt-Radiotracer-Zählrate ausgedrückt, welche den Tieren zum Zeitpunkt 0 verabreicht worden war (% Dosis/g Gewebe).
Immunisierungsprotokolle
Die Immunisierungsstrategien waren bei jedem der verschiedenen Experimente ähnlich. Bei jedem Experiment sind Einzelheiten der Mengen und Arten von injiziertem Antigen/Adjuvans und die Zeitabstände zwischen Injektionen in den entsprechenden Figurenlegenden beschrieben. Freund-Adjuvans (FA) umfasst komplettes Freund-Adjuvans (KFA) und inkomplettes Freund-Adjuvans (IFA), die bei 62,5% Stärke in PBS verwendet wurden. Bei jedem Antigen/Adjuvans-Präparat wurden Antigene, die in Archäosomen oder Liposomen eingekapselt waren (verdünnt in steriler PBS, pH 7,1), Antigene, die in KFA emulgiert waren, oder Antigene, die in PBS allein verdünnt waren (Endvolumen 0,2 ml/Maus) i. p., i. m. oder s. c. drei Mäusen injiziert (falls nicht anders angegeben). Bei der zweiten Immunisierung wurden Antigene, die in Archäosomen oder Liposomen eingekapselt waren oder in IFA emulgiert waren oder in PBS verdünnt waren, Mäusen injiziert. Bei Experimenten, bei denen eine dritte oder vierte Injektion erforderlich war, wurden die Antigene entweder in der jeweiligen Vesikel-Art eingekapselt oder als bloßes, in PBS verdünntes Antigen injiziert. Die Mäuse waren zum Zeitpunkt der ersten Immunisierung 6–8 Wochen alt.
Den Mäusen wurde gewöhnlich 4 Tage nach jeder Injektion Blut aus der Schwanzvene entnommen. Man ließ das Blut koagulieren, und die Zellen wurden durch Zentrifugieren in Serum-Abtrennröhrchen aus dem Serum entfernt.
In-vivo-Verabreichung
Die Verabreichung der Vesikel, welche das Antigen, den Arzneistoff oder andere Bestandteile tragen, erfolgt auf üblichen Wegen und kann mit zusätzlichen Substanzen, wie Carbonat-Puffer, verwendet werden, wenn eine orale Verabreichung erfolgt. Die erforderliche Antigendosis variiert abhängig vom verwendeten Antigen und dem Weg der Verabreichung, beträgt aber etwa 1 bis 50 μg pro Dosis. Einschlüsse von Protein-Antikörpern in den Vesikeln liegen im Bereich von etwa 0,9 bis 208 μg/mg Trockengewicht Vesikel oder bei O-Ketten-Polysaccharid bis zu 500 μg/mg Vesikel. Coenzym Q₁₀ kann von 0 bis etwa 0,23 mg/mg Vesikel und Vitamin E von 0 bis etwa 0,2 mg/mg Vesikel einverleibt werden, wobei 0,05 mg/mg bevorzugt sind. Im Allgemeinen liegt die Dosierung der Vesikel im Bereich von 4 bis 73 mg/kg Körpergewicht, bezogen auf ein Gewicht von 25 g/Maus.
Nichtsdestoweniger kann es unter gewissen Umständen erforderlich sein, von den erwähnten Mengen abzuweichen, und dies insbesondere als Funktion des Körpergewichts oder der Art der Verabreichungsmethode, der Art ihrer Formulierung, der Art von Lebewesen und des Zeitpunkts oder des Intervalls, über welches die Verabreichung stattfindet. So kann es in einigen Fällen ausreichend sein, mit weniger als der oben erwähnten Menge auszukommen, wohingegen in anderen Fällen mehr als die erwähnte obere Grenze erforderlich sein kann.
Enzymimmunosorbent-Assay
Die humorale Antwort wurde durch den indirekten Enzyme-linked-Immunosorbent-Assay (ELISA) unter Verwendung einer Anzahl von Festphasenadsorbierten Antigenen gemessen. BSA, Cholera B-Toxin-Untereinheit oder E. coli 0:157:H7-Lipopolysaccharid wurde in destilliertem Wasser verdünnt (15 μg/ml Endkonzentration), und 100 μl/Vertiefung wurden getrocknet (über Nacht Inkubation bei 37°C), um die ELISA-Mikroplatten-Vertiefungen zu beschichten. Alle indirekten ELISA-Assays wurden unter Verwendung von Standardmethoden durchgeführt. Verdünnungen von Antikörper-haltigen Seren wurden als der erste Antikörper verwendet, und eine 1/1500-Verdünnung von HRP-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG + IgM als der Nachweis-Antikörper.
Die Isotypen von Anti-BSA-Antikörpern, die in Mäuseseren gezüchtet wurden, wurden durch ein ELISA-Verfahren getestet. Vertiefungen wurden mit BSA beschichtet (wie oben). Verdünnungen von jedem Serum wurden mit Peroxidase-gekoppeltem Schaf-Anti-Maus-IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 und IgM titriert. Alle ELISA-Daten sind als Mittelwert ± Proben-Standardabweichungen mitgeteilt.
ERGEBNISSE: UND DISKUSSION
Konstruktion und Charakterisierung von Archäosomen und Liposomen
Peroxidase, die in Vesikel eingekapselt war, wurde verwendet, um die relative Aufnahme der verschiedenen Arten von Archäosomen und von herkömmlichen Liposomen durch eukaryontische Zellen zu quantifizieren. Die Mengen jeder Vesikelart, die von anhaftenden Zellen aufgenommen wurde, welche auf Kulturvertiefungen gesät worden waren, konnte durch Messen der Peroxidase-Aktivität, gefolgt von Lyse/Permeabilisierung von sowohl Zellen als auch assoziierten Vesikeln durch Detergens quantifiziert werden.
Archäosomen wurden aus den GPL hergestellt, die aus mehreren Archäobakterien extrahiert worden waren, und herkömmliche Liposomen wurden aus zwei herkömmlichen Phospholipid-Formulierungen hergestellt, die häufig im Stand der Technik verwendet worden sind (2,17). Der Prozentsatz der Gesamt-Peroxidase, die auf der Vesikel-Oberfläche freilag, konnte durch Vergleich der Geschwindigkeit der Enzymreaktion in ganzen Vesikeln und in OGPpermeabilisierten Vesikeln abgeschätzt werden (Tabelle 1).
Außer bei den Daten in 2 stellten wir Vesikel von einer Zwischengröße mit einem Durchmesser von etwa 200 nm durch Druck-Extrusion von hydratisierten multilamellaren Liposomen durch Filter mit einer Porengröße von 400 nm her. Dies hatte Populationen von Vesikeln mit den Größenbereichs-Verteilungen zum Ergebnis, die in Tabelle 1 definiert sind. Die Verteilungen waren ziemlich eng, außer bei DPPC-Liposomen, die aus Populationen mit zwei unterschiedlichen Größen bestanden.
Bindung von Archäosomen und herkömmlichen Liposomen an Zellen
Die Bindung und die Aufnahme des Immunogens durch Makrophagen oder andere Antigen-verarbeitende/präsentierende Zellen ist die Basis für die Einleitung einer Immunantwort. Peroxidase- und Fluoreszenz-Assays wurden verwendet, um die Bindung von mehreren Arten von Archäosomen und herkömmlichen Liposomen an zwei phagozytische und drei nicht-phagozytische Zell-Linien zu quantifizieren und zu vergleichen. Die Ergebnisse sind in 1 und in den Tabellen 2 und 3 veranschaulicht. Die Aufnahme von Archäosomen durch die zwei Makrophagen-Linien (Maus-Peritoneal- und J774A.1-Makrophagen) war mehrere Male größer als die herkömmlicher Liposomen. Verglichen mit Makrophagen-Zell-Linien war die Aufnahme von Archäosomen und von herkömmlichen Liposomen durch nicht-phagozytische Zell-Linien (HEp-2, HeLa, EJ/28) wesentlich geringer.
Große multilamellare Vesikel (0,5 bis 3 μm), die aus den polaren Lipiden von M. mazei oder aus DMPC : DMPG : Cholesterol hergestellt worden waren, ergaben Trends, die denjenigen ähnlich waren, die mit den kleineren Vesikeln erhalten wurden, d. h. eine größere Aufnahme von Archäosomen als von herkömmlichen Liposomen durch Maus-Peritonealmakrophagen und durch J774A.1-Zellen; weniger Aufnahme von beiden Vesikelarten durch die nicht-phagozytische HEp-2-Zell-Linie (2).
Diese Daten, die eingekapselte Peroxidase oder Fluoreszenz-Farbstoff als Markierungen verwendeten, veranschaulichen die verstärkte Phagozytose von Archäosomen im Vergleich zu herkömmlichen Liposomen. Die potentiellen Vorteile für die Verwendung von Archäosomen für die Zufuhr von Verbindungen an Makrophagen wird an anderer Stelle in dieser Anmeldung erörtert.
Auswirkung der Inhibierung von Makrophagen-Funktionen auf die Archäosomen-Bindung
Um zu bestimmen, ob Archäosomen-Populationen aktiv phagozytiert werden, im Gegensatz zu einer Anhaftung auf der Oberfläche, wurden Makrophagen mit Inhibitoren der Phagozytose behandelt (Tabelle 4). Wie durch die Kontrollpopulation von unbehandelten Makrophagen, die Archäosomen ausgesetzt wurden, demonstriert, wurde beobachtet, dass die Fluoreszenzmenge, die mit diesen Makrophagen verbunden war, deutlich mit der Zeit abnahm. Dies steht mit einer Internalisierung der Archäosomen, gefolgt von der Freisetzung des eingekapselten Farbstoffs aufgrund des Abbaus der Vesikel, in Einklang. Im Gegensatz dazu hatten Behandlungen, von denen typisch bekannt ist, dass sie den Membranfluss und so die Phagozytose inhibieren, wie verringerte Temperatur, die Zugabe von Cytochalasinen oder die Fixierung mit Formalin, wenig oder keine Abnahme der Fluoreszenz (die aufgrund der anfänglichen Bindung der Vesikel vor der Inhibierung der Phagozytose anwesend ist) der Makrophagen über die untersuchten Zeiträume zur Folge. Dies zeigt an, dass die Inhibitoren die Internalisierung der Liposomen in die Makrophagen verhinderten. Zusätzlich demonstrierte die zeitabhängige Abnahme der Fluoreszenz bei Wiedereinstellung der Temperatur des Kulturmediums von 4°C zurück zu 37°C, dass die Makrophagen ihre phagozytischen Fähigkeiten wiedergewannen. Ein geeignetes Modell umfasst eine anfänglich Bindung an die Zelloberfläche, gefolgt von Phagozytose und Abbau der internalisierten Vesikel.
Verwendung von Coenzym Q₁₀, um die Aufnahme von Vesikeln durch Zell-Linien zu erhöhen
Coenzym Q₁₀ wurde in Archäosomen, die aus den GPL von M. mazei, von denen bekannt ist, dass sie anionisch sind (19), hergestellt worden waren, und in anionische herkömmliche Liposomen (DSPC : CHOL : DCP) mit relativ hohen Einschluss-Wirkungsgraden eingeschlossen (Tabelle 5). Jedoch wurden im Vergleich zu anionischen Lipid-Mischungen sogar noch höhere Einschluss-Wirkungsgrade mit Vesikeln erhalten, die mit neutralen Lipid-Mischungen DPPC : CHOL und DSPC : CHOL hergestellt worden waren. Die gezeigten Beladungsverhältnisse sind repräsentativ für diejenigen, die in den folgenden Experimenten verwendet wurden (Tabellen 6–7).
Die Aufnahme von Archäosomen und von herkömmlichen Liposomen, denen Coenzym Q₁₀ fehlte, durch Makrophagen ist unter Verwendung von ³H-Chol als Tracer-Markierung als Funktion der Zeit gezeigt (Tabelle 6A). Bei 37°C kann bei den angegebenen Zeiten gesehen werden, dass M. mazei-Archäosomen wesentlich besser als alle Formulierungen herkömmlicher Liposomen aufgenommen werden, wie es auch in Tabelle 2 gezeigt ist. Die Daten in Tabelle 6A dienen als Kontrollwerte, um die Auswirkung der Einverleibung von Coenzym Q₁₀ in die Vesikel auf die Vesikel-Aufnahme abzuschätzen (Tabelle 6B). Diese Daten zeigen, dass die zelluläre Akkumulation aller Vesikel-Arten durch die Makrophagen deutlich erhöht wurde, wenn die Vesikel Coenzym Q₁₀ enthielten. Diese Verstärkungswirkung von Coenzym Q₁₀ war bei den Archäosomen mehrere Male höher als bei den herkömmlichen Liposomen. Vergleichbare Akkumulationsprofile und die verstärkenden Auswirkungen des Coenzym Q₁₀-Einschlusses auf die Aufnahme von Archäosomen und herkömmlichen Liposomen wurde bei allen getesteten Lipid-Konzentrationen beobachtet (vergleiche Tabellen 7A und 7B).
Diese Ergebnisse zeigen klar das Potenzial beim Einschluss von Coenzym Q₁₀ in Vesikel für eine erhöhte zielgerichtete Zufuhr von Archäosomen und herkömmlichen Liposomen zu verschiedenen Zelltypen. Eine erhöhte Aufnahme von Vesikeln, die Coenzym Q₁₀ enthalten, durch Makrophagen (Antigenverarbeitende Zellen und die Stellen für einige infektiöse Agenzien) zeigt klar die Anwendung bei der Zufuhr von Antigenen und Arnzeistoffen (einschließlich antiviraler und antimikrobieller Mittel) an. Eine weitere Anwendung besteht darin, den in Wasser unlöslichen Arzneistoff (Coenzym Q₁₀) Säugerzellen über Liposomen und Archäosomen zuzuführen.
Beispielsweise konnten Archäosomen hergestellt werden, die aus Vitamin E und den GPL von T. acidophilum hergestellt waren. Die Einverleibung von 1 mg Vitamin E in 20 mg Lipide hatte Archäosomen mit dem erwarteten Größenbereich von 220 ± 88 nm nach Extrusion durch Membranen mit einer Porengröße von 400 nm zum Ergebnis.
In-vivo-Gewebeverteilung von Vesikeln
Die Verteilung der ³H-Chol-Lipid-Radiotracer-Markierung, die der Vesikelschicht einverleibt wurde, in verschiedenen Geweben wurde verwendet, um die Zufuhr der Vesikel und/oder der assoziierten/eingekapselten Verbindungen an spezifische Organgewebe vorauszusagen. Cholesteryl[1-³H]ether ist ein nicht-metabolisierter Radiotracer (Markierung), der für die Untersuchung der Gewebeverteilung von Lipid-Vesikeln in Lebewesen wie Säugern geeignet ist (15).
Die Gewebeverteilungs-Profile der Markierung aus herkömmlichen Liposomen und herkömmlichen CoQ₁₀-Liposomen, die auf verschiedenen Wegen verabreicht wurden, zeigten, dass diese im Allgemeinen ähnlich waren (3A und 3B). Jedoch bestand der Hauptunterschied darin, dass bei oral verabreichten herkömmlichen CoQ₁₀-Liposomen keine Akkumulation der Markierung (bei 24 Stunden) in irgendeinem der überprüften Gewebe außer in der Milz gesehen wurde.
PEG, das an Lipide wie DSPE konjugiert ist, ist in Verbindung mit herkömmlichen Lipiden verwendet worden, um Vesikel mit geänderten Oberflächen-Eigenschaften herzustellen, um den Einfang durch die Zellen des retikuloendothelialen Systems (hauptsächlich in Milz und Leber anwesend) zu vermeiden und dadurch die Zirkulations-Halbwertszeit im Blut zu verlängern. Derartige Liposomen sind als sterisch stabilisierte Liposomen bezeichnet worden (24). Das Gewebeverteilungs-Profil von herkömmlichen PEG-Liposomen (4A) war demjenigen herkömmlicher Liposomen (3A) ungefähr ähnlich. Jedoch war es überraschend zu sehen, dass, wenn CoQ₁₀ den herkömmlichen PEG-Liposomen einverleibt wurde, welche oral verabreicht wurden, eine vermehrte Akkumulation der Markierung (24 Stunden nach Verabreichung) in Milz-, Leber-, Darm-, Nieren- und Lungengeweben stattfand (4B). Die vereinigte Akkumulation in der Milz und der Leber war etwa achtfach größer. Bei dem i. v.-Weg der Verabreichung zeigten die herkömmlichen PEG-CoQ₁₀-Liposomen keine Anwesenheit der Markierung in der Milz (4B).
Außer der Akkumulation im Darm und in den Nieren zeigten die Gewebeverteilungs-Profile von M. mazei-Archäosomen (5A) Unterschiede bezüglich derjenigen von herkömmlichen Liposomen (3A). Wenn M. mazei-Archäosomen auf dem i. m.-, s. c.- oder i. v.-Weg verabreicht wurden, war das Gewebeverteilungs-Profil (bei 24 h) mit und ohne in den Vesikeln eingeschlossenes CoQ₁₀ ähnlich, außer demjenigen im Eingeweide (5A und 5B).
Es war überraschend zu sehen, dass im Fall von oral verabreichten PEG-CoQ₁₀-Archäosomen die Akkumulation der Markierung (24 h nach Verabreichung) in der Milz etwa 80-fach höher war als diejenige, die mit PEG-Archäosomen gesehen wurde (6A und 6B). Diese Akkumulation in der Milz stellte etwa 40 der gesamten verabreichten Markierung dar. Der vereinigte Grad der Einverleibung von oral zugeführten PEG-CoQ₁₀-Archäosomen in der Leber und der Milz war etwa fünffach besser als der höchste Grad, der mit irgendeiner Kombination unter Verwendung herkömmlicher Liposomen erhalten wurde (4B). Bei i. m. und i. v. verabreichten PEG-CoQ₁₀-Archäosomen war die Akkumulation der Markierung in der Milz signifikant niedriger als diejenige, die in Abwesenheit von CoQ₁₀ (d. h. in PEG-Archäosomen) erhalten wurde.
Das 48 Stunden-Gewebeverteilungs-Profil der Markierung aus oral verabreichten herkömmlichen PEG-CoQ₁₀-Liposomen war demjenigen ähnlich, das bei 24 Stunden beobachtet wurde (4B). Jedoch zeigte das 48 Stunden-Gewebeverteilungs-Profil der Markierung aus oral verabreichten CoQ₁₀-Archäosomen, un abhängig davon, ob sie mit PEG assoziiert waren oder nicht, dass die Menge in Milz, Leber und Eingeweide auf jeweils etwa 0,001% der verabreichten Dosis von den betreffenden höheren Konzentrationen (5B und 6B) bei 24 Stunden abgenommen hatte. Bei 24 Stunden nach Verabreichung lag keine nachweisbare Markierung im Serum vor, unabhängig von der Vesikelart oder dem Weg der Vesikelverabreichung (3–6).
Die Daten in diesen Figuren zeigen, dass eine signifikante Erhöhung des Wirkungsgrads der Zufuhr/Akkumulation der oral verabreichten herkömmlichen Liposomen an Milz und Leber (den Hauptstellen für die Antigen-verarbeitenden Zellen des Immunsystems) durch Einverleibung von CoQ₁₀ in diese Vesikel erzielt werden kann. Die Zufuhr zur Milz und zur Leber durch oral verabreichte Vesikel kann weiter dramatisch unter Verwendung von PEG-CoQ₁₀-Archäosomen erhöhte werden. Es ist auch offensichtlich, dass unter Verwendung verschiedener Kombinationen von Vesikelarten mit und ohne eingeschlossenes CoQ₁₀ vielfältige verschiedene Gewebeverteilungs-Profile erhalten werden können. Dies bietet ein Mittel zur Änderung der Zufuhr zu Zielgewebe für verschiedene Anwendungen auf den Gebieten der Medizin.
Immunantworten
Die verstärkte Aufnahme von Archäosomen durch phagozytische Zellen im Vergleich zu herkömmlichen Liposomen legt nahe, dass Archäosomen als Adjuvantien und/oder Träger von Antigenen zur Hervorrufung einer Immunantwort auf ein Immunogen überlegen sein können. Es wurde gefunden, dass dies bei Tiermodell-Studien unter Verwendung von Mäusen der Fall ist.
Verglichen mit Kontrollmäusen, welche das bloße Antigen empfingen, wurde gefunden, dass der Antikörpertiter in Seren von Mäusen, die mit Cholera-Toxin B-Untereinheit immunisiert worden waren, signifikant höher war, wenn das Antigen in Archäosomen von M. smithii eingeschlossen war, und diese Antwort war sogar mit derjenigen vergleichbar, die mit Freund-Adjuvans beobachtet wurde (7).
Ein Vergleich der Adjuvans/Antigen-Trägereigenschaften von Archäosomen und von herkömmlichen Liposomen wurde unter Verwendung von BSA als Antigen vorgenommen (8). Die Immunantwort auf BSA war deutlich verstärkt, wenn es in Archäosomen eingekapselt war, und die Ergebnisse waren in einigen Fällen wieder vergleichbar mit demjenigen, das mit Freund-Adjuvans erzielt wurde. Im Gegensatz dazu lieferten alle drei herkömmlichen Liposomen-Arten wesentlich geringere immunstimulierende Wirkungen.
Die Anzahl von Auffrischungen, die erforderlich war, um einen zirkulierenden Antikörpertiter zu erzielen, der mit demjenigen vergleichbar war, der mit Freund-Adjuvans erzielt wurde, wurde unter Verwendung des BSA-Antigens bestimmt, das in Archäosomen von M. smithii eingeschlossen war (9). Wenn Archäosomen (mit dem eingekapselten Antigen) nur einmal verabreicht wurden, gefolgt von einer Auffrischung mit bloßem Antigen, wurde eine beträchtliche Immunantwort, vergleichbar derjenigen mit Freund-Adjuvans, erzielt.
Es wurde bemerkt, dass die Stimulation der Immunantwort mit gewissen Archäosomen (z. B. M. espanolae), die i. p. verabreicht wurden, erforderte, dass das BSA-Antigen in dem Vesikel eingeschlossen ist, wohingegen mit anderen Archäosomen (z. B. T. acidophilum) ein Einschluss keine Voraussetzung war (Tabelle 8). In einem weiteren Beispiel unter Verwendung von Cholera-Toxin B war die immunstimulierende Wirkung größer, wenn das Antigen in dem Archäosom eingeschlossen war (7). Wenn jedoch das BSA-Antigen über den i. m.-Weg verabreicht wurde, war eine Assoziation mit dem Archäosom für eine gute Immunantwort erforderlich (Tabelle 9). Demgemäß würde die Tatsache, ob das Antigen in dem Vesikel eingeschlossen oder damit assoziiert sein muss, von dem Verabreichungsweg und der Lipid-Zusammensetzung der Vesikel abhängen.
Für die Verwendung bei Menschen, anderen Säugern und anderen Lebensformen, wie Vogel- und Meerestierarten, ist es wichtig, die Immunantwort nach einer Immunisierung über normalerweise annehmbare Wege der Zufuhr zu erhalten. Der Vergleich von s. c.-, i. m.- und i. p.-Immunisierungen belegte, dass die humorale Antwort durch auf verschiedenen Wegen verabreichte Archäosomen erhöht werden konnte (Tabelle 10).
Die geringe Adjuvans-Wirkung, die mit herkömmlichen DMPC : DMPG-Liposomen beobachtet wurde, kann durch den Einschluss zunehmender Mengen an archäobakteriellen Lipiden in die für die Vesikelbildung verwendeten Lipide verbessert werden. Dies ist in Tabelle 11 veranschaulicht, wo Vesikel verwendet werden, die mit DMPS : DMPG : M smithii-GPL hergestellt worden sind, wobei die Menge der GPL von 0 bis 100% in der Mischung variiert wurde, die verwendet wurde, um Vesikel zu bilden und das BSA-Antigen einzukapseln. Eine Verstärkung der humoralen Immunantwort auf das Protein wurde durch Einschluss von so wenig wie 10% archäobakteriellen Lipiden in die Vesikel gesehen, und fortschreitende Verbesserungen wurden bis zu 100% gesehen.
Es wird weiter gezeigt, dass Archäosomen aus Lipiden hergestellt werden können, die in biologisch reiner Form aus Archäobakterien erhalten werden, und dass diese Archäosomen ebenfalls die Fähigkeit aufweisen, die Immunantwort auf ein Antigen zu verstärken (Tabelle 12). Obwohl alle Archäosomen, die aus reinen Lipiden hergestellt worden waren, eine positive Adjuvans-Wirkung erzeugten, war PGP-Me überlegen. Dies könnte durch die Neuheit der doppelt geladenen anionischen Kopfgruppe von PGP-Me erklärt werden.
Die Dauer der Immunantwort auf das eingekapselte Antigen wird länger aufrechterhalten, wenn Tetraetherlipide verwendet werden, verglichen mit Dietherlipiden, um die Archäosomen herzustellen (Tabelle 12). Die Abnahme des Antikörpertiters zwischen und 35 und 55 Tagen betrug 40 bis 46% im Fall von Freund-Adjuvans und der drei Dietherlipid-Archäosomen, wohingegen die Abnahme bei dem Tetraether-Archäosom nur 25% betrug.
Der Vergleich von M. smithii-Archäosomen, die aus dem Gesamt-Lipid-Extrakt hergestellt worden waren (einschließlich neutraler Lipide), mit denjenigen, die aus dem gesamten polaren Lipid-Extrakt (neutrale Lipide entfernt) hergestellt worden waren, belegte, dass die Immunantwort auf BSA (Anti-BSA- Antikörpertiter), das i. p. verabreicht worden war, 63 bzw. 91% derjenigen war, die mit Freund-Adjuvans gefunden wurde. Die Menge an verabreichtem Antigen, die Immunisierungsprotokolle und die Antikörpertiter wurden durchgeführt, wie es in Tabelle 11 in Einzelheit angegeben ist.
Archäosomen mit eingekapseltem/assoziiertem BSA erzeugten Antikörper verschiedener Isotypen (10), als sie Mäusen verabreicht wurden. Die Anwesenheit von IgG-Isotypen der 2a/2b-Klasse ist ein wichtiger Indikator von schützende Immunität und von einer Zell-vermittelten Immunantwort. Demgemäß rufen die Archäosomen nicht nur eine humorale Antwort auf das getragene Antigen hervor, sondern es wird auch eine Zell-vermittelte Antwort erwartet.
Mäuse wurden i. p. mit herkömmlichen Liposomen (DSPC : DCP : CHOL) immunisiert (Tage 0 und 14), die 15 μg BSA pro Dosis mit und ohne einverleibtes Q₁₀ enthielten (siehe Tabelle 5 und 6B für Zusammensetzungen). Seren, die am Tag 18 gesammelt wurden, wiesen, als sie bezüglich Antikörper (IgG + IgM) titriert wurden, deutlich höhere Anti-BSA-Antikörpertiter (bei der 95%-Vertrauensgrenze) auf, wenn die Liposomen CoQ₁₀ enthielten.
Es ist bekannt, dass Kohlehydrate schlechte Immunogene sind, selbst wenn sie mit bekannten Adjuvantien verabreicht werden. Zusätzlich zur Verstärkung der Immunantwort auf Protein-Antigene wird hier gezeigt, dass das O-Ketten-Polysaccharid-Antigen aus E. coli 0:157:N7 immunogen ist, wenn es mit M. smithii-Archäosomen assoziiert ist. Für diese Studien empfingen Balb/c-Mäuse 50 μg/Injektion (i. p.) bloßes O-Ketten-Polysaccharid oder 50 μg/Injektion des gleichen Antigens, das in 0,1 mg M. smithii-Archäosomen (GPL) eingekapselt war. Eine Injektion wurde am Tag 0 verabreicht, und Blut wurde am Tag 18 für die Titration von IgG + IgM-Antikörpern gesammelt. Das bloße Antigen erzeugte einen E_{410 nm}-Messwert von 0,004, verglichen mit 0,231 mit Archäosomen, was eine etwa 58-fache Zunahme darstellt.
Die in dieser Studie beobachtete dramatische Zunahme der Immunantwort auf Antigene, die mit Archäosomen assoziiert sind, war unerwartet und im Gegensatz zu den Erwartungen, die aus den Offenbarungen des Standes der Technik bei Verwendung von Etherlipiden nahegelegt worden waren. In der Tat zeigten Shek et al. (17), dass Vesikel, die mit Dialkyletherphosphatidylcholinen und BSA als dem eingeschlossenen Antigen hergestellt worden waren, bei der Hervorrufung einer Immunantwort bei Mäusen weniger wirksam waren, verglichen mit Liposomen, die mit dem Diacylesterphosphatidylcholin hergestellt worden waren. Zusätzlich zu den verstärkten Adjuvans-Wirkungen sind mit Archäosomen weniger Auffrischungen erforderlich. Darüber hinaus ist die Lagerstabilität (Lagerbeständigkeit) von Archäosomen lang (20).
In-vitro-Zytotoxizitätsstudien mit mehreren phagozytischen und nicht-phagozytischen Zell-Linien, die früher beschrieben wurden, zeigten an, dass weder Archäosomen noch herkömmliche Liposomen irgendwelche signifikanten Nebenwirkungen aufwiesen, wie aus Zell-Lebensfähigkeits-Assays beurteilt, selbst wenn die Vesikel bei Lipid-Konzentrationen gut oberhalb von Sättigung getestet wurden. In Mausmodellen gab es keine Anzeichen starker Toxizität, wie Granulome an den Injektionsstellen, starke Veränderungen in den Schlüssel-Körperorganen oder Todesfälle. Anti-Archäosomlipid-Antikörper werden in den Mausseren, die in 8 erhalten wurden, nicht nachgewiesen. Weiter gibt es Anzeichen, dass Moleküle mit Etherbindungen langsam metabolisiert und aus dem Körper eliminiert werden können (21). Die In-vitro-Phagozytose-Daten, die in unserer Offenbarung präsentiert werden, zeigen auch an, dass Archäosomen zumindest ausreichend in den Makrophagen destabilisiert/abgebaut werden, um eingeschlossene Protein- und Fluoreszenz-Farbstoff-Markierungen freizusetzen. Die In-vivo-Daten bei der Immunantwort unterstützen auch, dass die verkapselte Antigene enthaltenden Archäosomen destabilisiert/abgebaut werden, um eine Präsentation des Antigens an die Antigen-verabeitenden Zellen des Immunsystems zu ermöglichen.
LITERATURVERZEICHNIS

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Tabelle 1. Charakteristika von Peroxidase-Archäosomen und Peroxidase-Liposomen, die in Bindungs-Assays verwendet wurden¹

Claims

Liposomen-Zusammensetzung, umfassend einen Etherlipidextrakt eines Archäobakteriums und eine weitere Komponente, die aus einem Antigen, Coenzym Q₁₀ und Vitamin E ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, in der der Etherlipidextrakt den gesamten polaren Etherlipidextrakt eines Archäobakteriums umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, die zusätzlich den neutralen Lipidextrakt eines Archäobakteriums umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, in der das Archäobakterium bipolare Tetraetherlipide enthält.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, die zusätzlich ein nicht-archäobakterielles Lipid enthält.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, in der das nicht-archäobakterielle Lipid aus Cholesterol, Phosphatidylcholin, Phosphatidylglycerol, Diacetylphosphat und deren Mischungen ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1, 2, 3, 5 und 6, in der das Archäobakterium aus Halobacterium cutirubrum, Methanosarcina mazei, Methanospirillum hungatei, Methanococcus jannaschii, Methanosphaera stadtmanae, Methanobrevibacter smithii, Methanococcus voltae, Methanobacterium espanolae und Thermoplasma acidophilum ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, in der das Archäobakterium aus Methanospirillum hungatei, Methanococcus jannaschii, Methanosphaera stadtmanae, Methanobrevibacter smithii, Methanobacterium espanolae und Thermoplasma acidophilum ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, in der das Archäobakterium Halobacterium cutirubrum ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, in der das Archäobakterium Methanosarcina mazei ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, in der das Archäobakterium Methanospirillum hungatei ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, in der das Archäobakterium Methanococcus jannaschii ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, in der das Archäobakterium Methanosphaera stadtmanae ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, in der das Archäobakterium Methanobrevibacter smithii ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, in der das Archäobakterium Methanococcus voltae ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, in der das Archäobakterium Methanobacterium espanolae ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, in der das Archäobakterium Thermoplasma acidophilum ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, in der der Lipidextrakt ein Lipid umfasst, das ausgewählt ist aus 3-O-(3,7,11,15-Tetramethylhexadecyl)-2-O-(3-hydroxy-3,7,11,15-tetramethylhexadecyl)-sn-glycerol-1-phosphoinosit (D_OHPI), 3-O-(3,7,11,15-Tetramethylhexadecyl)-2-O-(3-hydroxy-3,7,11,15-tetramethylhexadecyl)-sn-glycerol-1-phosphoglycerol (D_OHPG), Phosphatidylinositglycotetraetherlipid mit einem Mol.gew. von 1703 Dalton und 2,3-Diphytanyl-sn-glycerol-1-phospho-3'-sn-glycerol-1'-methylphosphat (PGP-Me).
Zusammensetzung nach Anspruch 18, in der das PGP-Me aus Halobacterium cutirubrum erhältlich ist, das D_OHPI aus Methanosarcina mazei erhältlich ist, das D_OHPG aus Methanosarcina mazei erhältlich ist oder das Phosphatidylinositglycotetraetherlipid mit einem Mol.gew. von 1703 Dalton aus Methanobrevibacter smithii erhältlich ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 18 oder Anspruch 19, in der das Lipid in biologisch reiner Form aus einem Archäobakterium isoliert ist.
Zusammensetzung nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, in der die Liposomen einen Durchmesser von 50 bis 500 nm aufweisen.
Zusammensetzung nach Anspruch 21, in der die Liposomen einen Durchmesser von 100 bis 200 nm aufweisen.
Zusammensetzung nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, in der die Liposomen unilamellar sind.
Zusammensetzung nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, in der die weitere Komponente ein Antigen ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 24, in der das Antigen ein Protein oder ein Polysaccharid ist.
Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 23, in der die weitere Komponente Vitamin E ist.
Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 23, in der die weitere Komponente Coenzym Q₁₀ ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 27, die zusätzlich ein Polyethylenglycol-Lipid-Konjugat umfasst.
Zusammensetzung nach irgendeinem vorangehenden Anspruch zur Verwendung in der Therapie.
Zusammensetzung nach Anspruch 29 in Form eines Medikaments, das so angepasst ist, dass es oral, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan oder intravenös verabreicht wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 29, in der das Medikament so angepasst ist, dass es über den oralen Weg verabreicht wird.
Impfstoff, umfassend eine Zusammensetzung nach Anspruch 24 oder Anspruch 25.
Verwendung eines Antigens für die Herstellung eines Liposomen-haltigen Medikaments, das eine Zusammensetzung nach Anspruch 24 oder Anspruch 25 umfasst, zur Verwendung bei der Verstärkung einer Immunantwort.
Verwendung nach Anspruch 33, bei der das Medikament ein Impfstoff ist.
Verwendung eines pharmazeutischen Mittels für die Herstellung einer Liposomen-haltigen Zusammensetzung nach Anspruch 27 oder Anspruch 28 zur therapeutischen Verwendung, die mit dem Mittel assoziiert ist.