DE69221496T2 - Formierung von stabilen Liposomen aus Lipidextrakten von Archaeobakterien. - Google Patents
Formierung von stabilen Liposomen aus Lipidextrakten von Archaeobakterien.Info
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Description
- Diese Erfindung betrifft neue Polyether-Lipide, Liposomen, welche Polyether- Lipide umfassen, und Verfahren zur Herstellung solcher Liposomen.
- Künstliche Lipid-Vesikel (Liposomen) sind zu einem wichtigen Werkzeug auf zahlreichen Gebieten der Grundlagenforschung und der angewandten Forschung geworden. Sie wurden in großem Umfang als biologische Membran-Systeme für die Untersuchung solcher Prozesse wie Transmembran-Transport, Lipid-Doppelschicht-Permeabilität, Membranfusion und Lipid-Protein-Wechselwirkung eingesetzt. Sie können auch als immunologische Adjuvantien oder als Träger für Arzneimittel und Hautpflege-Verbindungen, Insektizide, genetisches Material und Enzyme dienen.
- Gegenwartig werden Liposomen aus Ester-Lipiden wie z.B. Ei-Phosphatidylcholin (EPC) hergestellt. Die inhärente physikalisch-chemische Instabilität solcher Liposomen ist eines der Haupthindernisse für deren kommerzielle Anwendung. Dementsprechend ist in der Liposomzusammensetzung oft Cholesterin eingeschlossen, um die Stabilität zu erhöhen, die Porosität zu verringern und deren Fusion oder Aggregation zu verhindern. Darüber hinaus sind die Esterbindungen dieser Liposomen einer enzymatischen und chemischen Hydrolyse zugänglich, welche eine Zerstörung der Liposomstruktur verursacht. Ester-Lipid-Fettsäureketten sind oft ungesättigt und deshalb der Oxidation in Luft und einem Verlust der strukturellen Integrität der Liposomen ausgesetzt. Eine in der Praxis wünschenswerte Lagerungszeit von 2 Jahren wird normalerweise nicht erreicht und es können spezielle Lagerungsbedingungen erforderlich sein, wie die Entfernung von Sauerstoff und/oder herabgesetzte Temperaturen.
- Archaebakterien enthalten gegenüber ihren prokaryotischen und eukaryotischen Gegenstücken sehr unterschiedliche Membranlipidstrukturen. Statt Fettsäureketten, die oft ungesatttgt sind und mit Glycerin an den Kohlenstoffen sn-1,2 verestert smd, sind die Membranlipide von Archaebakterien aus gesattigten Phytanylketten in Etherverknüpfung mit Glycerin-Kohlenstoffatomen in sn-2,3-Konfiguration aufgebaut. Verschiedene Methanogene können neben dem ubiquitären Diether-C20,20-Lipid auch Phytanylketten aufweisen, die modifiziert wurden, um Tetraether-, Hydroxydiether- und makrocyclische Diether-Lipide zu ergeben. Variationen in den polaren Kopfgruppen sind zahlreich und können einen molekularen taxonomischen Fingerabdruck zur Identifizierung jeder Methanogen-Gattung bieten.
- Es gibt wenige Berichte über Liposomenbildung aus archaebakteriellen Lipiden. Hiervon berichtete eine Gruppe über die Bildung großer Liposomen, nämlich Ring, K. et al. (1986) In Liposomes as Drug Carriers (Schmidt, K.H., Hrsg.), S. 101-123, Georg Thieme Verlag, Stuttgart und New York. Konkret erzeugten Ring et al. große Vesikel (von etwa 600 nm) durch kontrollierte Detergens-Dialyse einer einzelnen Tetraether- Lipid-Komponente, die aus dem Gesamtlipidgehalt des Archaebakteriums Thermoplasma acidophilum gereinigt worden war. Es gibt jedoch keinerlei Lehre oder Hinweis auf die Anwendung dieses Verfahrens zur Herstellung von Liposomen aus den gesamten polaren Lipiden von Archaebakterien. Diese Liposomstrukturen wurden auch nicht durch Elektronenkkkroskopie charakterisiert. Mit der Anwendung der hier eingesetzten Verfahren mit Gesamtextrakten polarer Lipide und/oder den Gesamtlipidextrakten vermeiden wir das kostenaufwendige und schwierige Verfahren der Herstellung gereinigter Lipidmolekülspezies.
- In einem weiteren Bericht von MacDonald, R.C. et al. (1991), Biochim. Biophys. Acta 1061: 297-303, werden Ester-Lipid-Liposomen durch Druckextrusion gebildet. Es findet sich jedoch keine Lehre hinsichtlich der Herstellung unilamellarer Liposomen aus den Gesamtextrakten polarer Lipide von Archaebakterien. Aufgrund der inhärenten Stabilität der archaebakteriellen Lipidstrukturen ist es möglich, Liposomen über ein großes Spektrum von Bedingungen, einschließlich Gasphase, Temperatur und pH, hinweg herzustellen. Diese Faktoren sind für deren Brauchbarkeit bei industriellen Anwendungen ebenso zentral wie die Stabilität dieser Liposomen gegenüber einer Vielzahl von Bedingungen. Darüber hinaus trifft die Bildung von Liposomen innerhalb eines breiten Bedingungsspektrums für Ester-Lipide nicht zu.
- Liposomen wurden mittels Ultrabeschallbehandlung aus einer Subfraktion der Ether-Lipide von Sulfolobus acidocalcarius {Elferinck et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 1375-1381] hergestellt.
- Gemäß einem Aspekt der Erfindung weisen neue Polyether-Lipide die Strukturformel I auf
- worin R β-galf- bedeutet, und R α-glcp-(1-2)-β-galf- darstellt.
- Weitere neue Polyether-Lipide sind definiert durch die Strukturformel II
- worin R (CH&sub3;)-N-C&sub5;O&sub3;H&sub0;- oder (CH&sub3;)&sub3;-N-CO&sub3;H&sub0;- bedeutet, und R α-glcp-(1-2)-β-galf, β-galf-(1-6)-β-galf- oder β-galf- darstellt.
- Weitere neue Polyether-Lipide weisen die Strukturformel III auf
- worin X -OH bedeutet, und Y Ethanolamin oder Glycerin darstellt.
- Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Liposomen bereitgestellt, die aus dem Gesamtextrakt polarer Lipide von verschiedenen Archaebakterien hergestellt wurden.
- Gemäß einem noch weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung unilamellarer Liposomen aus den Gesamtextrakten polarer Lipide von verschiedenen Archaebakterien bereitgestellt, welches umfaßt:
- (a) Unterwerfen von Zellen eines Archaebakteriums einer Lösungsmittelextraktion, um eine Gesamtfraktion der polaren Lipide zu ergeben,
- (b) Zugeben eines geeigneten Detergens in einem Molverhältnis (Detergens:Lipid) im Bereich von mindestens 10:1 bis 30:1 und vollständiges Entfernen des Lösungsmittels durch Verdampfung,
- (c) Lösen des resultierenden Detergens/Lipid-Materials in einem geeigneten wäßrigen Dialysepuffer, um gemischte Mizellen von Lipid und Detergens zu bilden, und
- (d) Unterwerfen der gemischten Mizellen einer kontrollierten Dialyse zur Entfernung des Detergens und Bildung der Liposomen. Vorzugsweise ist das Detergens in Schritt (b) ein nicht-ionisches Detergens, z.B. n-Octyl-β-D-glucopyranosid und das Molverhältnis (Detergens: Lipid) beträgt etwa 20:1.
- Gemäß einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens werden Liposomen aus den gesamten polaren Lipiden von Archaebakterien bereitgestellt durch
- (a) Unterwerfen von Zellen eines Archaebakteriums einer Lösungsmittelextraktion, um eine Gesamtfraktion der polaren Lipide zu ergeben,
- (b) Zugeben eines geeigneten wäßrigen Extrusionspuffers, um eine Emulsion multilamellarer Liposomen bei einem pH-Bereich von 3,0 bis 10,7 zu bilden, und
- (c) Extrudieren der Emulsion multilamellarer Liposomen bei einer Temperatur von 4 bis 80ºC unter Druck durch eine Membran ausgewählter Porengröße, um die unilamellaren Liposomen zu bilden.
- Vorzugsweise ist zur leichteren Durchführung die Temperatur in Schritt (c) die Umgebungstemperatur.
- Figur 1 ist eine Darstellung der verschiedenen Strukturformeln der erfindungsgemäßen neuen Polyether-Lipid-Verbindungen aus M. hungatei.
- Figur 2 stellt eine negative FAB-MS (fast atom bombardinent mass spectrometry) der Gesamtextrakte polarer Lipide von M. hungatei dar.
- Die Figuren 3A und B repräsentieren die negativen FAB-MS-Spektren neuer gereüiigter Lipide aus M. mazei. A Phosphatidylglycerinhydroxydiether und B = Phosphatidylethanolaminhydroxydiether.
- Figur 4 zeigt ein ähnliches Spektrum für die gesamten polaren Lipide aus M. mazei.
- Figur 5 ist ein Vergleich der negativen FAB-MS der Gesamtextrakte polarer Lipide aus verschiedenen Methanosarcina spp. Konkret, A = M. thermophila (auf Acetat gezüchtet), b = M. barkeri-Stamm Fusaro (auf Methanol gezüchtet), C = M. mazei (auf Methanol gezüchtet) und D = M. acetivorans (auf Methanol gezüchtet).
- Die Figuren 6A bis 6F zeigen eine Reihe von transmissionselektronenmikroskopischen (TEM) Photographien, welche die Homogenität von Liposomen aus den Gesamtextrakten polarer Lipide von verschiedenen Archaebakterien illustrieren. Unter Berücksichtigung des Größenfaktors von 0,71 entsprechen die Balken 250 nm. (A) M. voltae; (B) M. jannaschii (65ºC); (C) M. mazei; (D) M. concilii; (E,F) M. hungatei -.
- Figur 7 zeigt eine TEM-Photographie eines Gefrieraufbruch-Präparats von M. voltae-Liposomen. Balken = 100 nm. Der Pfeil gibt die Schattenrichtung an.
- Figur 8 erläutert die Ergebnisse einer Dünnschichtchromatographie von Gesamtextrakten polarer Lipide (T), gemischten Mizellen (M) und Liposomen (L) aus verschiedenen Archaebakterien unter Verwendung des Detergens Octyl-β-D-glucopyranosid (OBG).
- Figur 9 zeigt eine Reihe von TEM-Photographien von Negativkontrast-gefärbten Liposomen, welche durch Druckextrusion der Gesamtextrakte polarer Lipide aus M. jannaschii, M. smithii, M. hungatei, M. mazei und M. voltae durch Filter mit 100 nm Porengröße erhalten wurden. Liposomen aus M. jannaschii im rechten Feld werden mittels Extrusion durch ein 200 nm-Filter erhalten.
- Wie oben erwähnt, bilden die Archaebakterien zahlreiche verschiedene Polyether- Lipidstrukturen, die zur Herstellung von Liposomen geeignet sind. Von den zur Verfügung stehenden Archaebakterien wurden Methanococcus voltae, Methanococcus jannaschii, Methanosarcina mazei, Methanospirillum hungatei, Methanosaeta concilii, Methanobrevibacter smithii, Methanosphaera stadtmanae, Thermoplasma acidophilum, Natronobacterium magadii und Halobacterium cutirubrum gewählt, da sich die Zusammensetzungen ihrer polaren Lipide sehr voneinander unterscheiden und da sie das bekannte Spektrum ungewöhnlicher Kernlipid-Strukturen umfassen, die bei Archaebakterien gefinden werden (siehe Tabelle 1 und Fig. 1). Wir demonstrieren auch die Bildung von Liposomen aus einem breiten Spektrum von Gesamtextrakten polarer Lipide von Archaebakterien. Die Archaebakterien wurden so ausgewählt, daß sie diejenigen umfaßten, welche in verschiedenen rauhen Milieus mit niedrigem pH, hohem pH, hoher Temperatur, hohem Salzgehalt und Kombinationen davon gedeihen, in der Erwartung, daß aus diesen Quellen gebildete Liposomen ungewöhnliche Stabilitäten aufweisen wurden. Ferner wurden die Lipide von Archaebakterien getestet, die normalerweise im menschlichen Dickdarm gefinden werden (M. smithii und M. stadtmanae), da diese Liposomen besonders relevant für die Entwicklung von Arzneimittel-Abgabesystemen sein könnten.
- Es wurden neue Lipid-Verbindungen aus M. hungatei und M. mazei isoliert und charakterisiert. Die Strukturen der neuen Verbindungen sind in den Formeln I, II und III und der Figur 1 dargestellt. TABELLE I Bekannte Verteilung der verschiedenen Ether-Kernlipide, welche in den in dieser Studie eingesetzten archaebakterien vorhanden sind.
- Abkürzungen: D&sub3;, Standard-Diether; DOH, Hydroxydiether; T, Tetraether; DM, makrocyclischer Diether; +, anwesend, aber Menge noch nicht bestimmt
- Die Bakterienkulturen waren Methanospirillum hungatei GP1 (NRC 2214 DSM 1101), Methanosaeta concilii GP6 (NRC 2989 = DSM 3671), Methanococcus jannaschii JAL-1 (NRC 5952 = DSM 2661), Methanococcus voltae PS (NRC 2854), Methanosarcina mazei S-6 (NRC 6052 = DSM 2053), Methanobrevibacter smithii ALI (NRC 6539 = DSM 2375), Methanosphaera stadtmanae MCB-3 (NRC 6540 = DSM 3091), Methanobacterium espanolae GP9 (NRC 5912 = DSM 5982), Natronobacterium magadii (NRC 6561 = ATCC 43099), Halobacterium cutirubrum (NRC 34001 = DSM 669) und "Thermoplasma acidophilum 122-1B3 (NRC 6566 = ATCC 27658).
- Die Methanogene wurden anaerob wie folgt in Kultur gezüchtet. M. hungatei wurde in einer Atmosphäre von H/CO (80:20, v/v) in SA-Medium [Breuil, C. und Patel, G.B. (1980) Can. J. Microbiol. 26: 577-582] gezüchtet, das mit 5 µM NiCl ergänzt war. M. stadtmanae wurde auf Methanol (0,1 %, v/v) und H/CO (80:20, v/v) bei 35ºC in einem Medium gezüchtet, das ursprünglich von Miller und Wolin [Miller, T.L. und Wolin, M.J. (1985) Arch. Microbiol. 141:116-122] beschrieben wurde, jedoch durch Ersatz des vitanünfteien Kasein-Hydrolysats durch jeweils 1 mM L-Leucin und L- Isoleucin und durch Erhöhung der Nitrilotriessigsäurekonzentration auf 30 mg/l und der CaSO&sub4;-5HO-, H&sub3;BO&sub3;- und NaMoO&sub4;-2HO-Konzentrationen auf 200 µg/l modifiziert war. M. smithii wurde bei 35ºC unter H/CO (80:20, v/v) in Balch-Medium-1 [Balch, W.E. et al., (1979) Microbiol. Rev. 43:260-296] gezüchtet, welches modifiziert war, um 0,1 % (w/v) NH&sub4;Cl und HSCoM und Fettsäuren wie im M. stadtmanae-Medium einzuschließen. M. concilii wurde bei 35ºC unter N2 in Acetat-Medium [Ferrante, G., et al., (1989) J. Lipid Res. 30:1601-1609] gezüchtet. Die Züchtung von M. jannsschii wurde entweder bei 50 oder 65ºC unter H/CO (80:20, v/v) in definiertem Medium [Ferrante, G. et al., (1990) Biochem. Cell Biol. 68: 274-283] durchgeführt. M. voltae wurde in einer H/CO-Atmosphäre in Balch-Medium-3 [Balch, W.E. et al. (1979) Microbiol. Rev. 43:260-296] bei 35ºC gezüchtet. Modifiziertes Balch-3-Medium (worin Hefeextrakt und Trypton durch 0,1 g L-Isoleucin pro Liter und 0,05 g L-Leucin pro Liter ersetzt waren, die NH&sub4;Cl-Konzentration auf 0,54 g pro Liter erhöht und NaCO&sub3; durch NaHCO&sub3; ersetzt war) wurde eingesetzt, um M. mazei auf Methanol unter N zu züchten. M. espanolae wurde auf H/CO bei pH 5,0 in SA-Medium [Patel, G.B. et al., (1990) Int. J. Syst. Bacteriol. 40:12-18] gezüchtet.
- H. cutirubrum wurde aerob bei 35ºC in definiertem Medium (Grey und Fitt, 1976) gezüchtet. N. magadii wurde aerob bei 37ºC und pH 9,0 im Medium # 1590 (ATCC-Katalog 1989) gezüchtet. T. acidophilum wurde aerob bei pH 2,0 und 55ºC im Medium #158 des DSM (German Collection of Microoganisms and Cell Cultures)-Katalogs von 1989 gezüchtet, wobei die Konzentration des Hefeextrakts jedoch auf 0,2% (w/v) erhöht war.
- Die Massenkultivierung für die Lipid-Gewinnung erfolgte in einem 75 l Chemap AG-Fermentor in 55 l frischem Medium. Die Methanogen-Medien wurden mit Cystein- Natriumsulfid reduziert [Hungate, R.E. (1950) Bacteriol. Rev. 14:1-49]. Das gelöste Sulfid wurde durch die Zugabe von wäßrigen NaS bei 0,1 mM gehalten. Extreme Halophile wurden mit 26 l Luft/Min. versorgt und mit 150 UpM während des Wachstums bewegt. Die Zellen wurden im mittleren bis späten exponentiellen Wachstumsstadium geerntet und als Paste bei -20ºC vor der Lipid-Extraktion gelagert.
- Gesamtextrakte polarer Lipide. Zellen (100 g Naßgewicht) wurden aufgetaut und über Nacht bei 23ºC in Chloroform/Methanol/Wasser (250 ml:500 ml:200 ml) gemischt. Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation entfernt und zwei weitere Male wie oben extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt und die Lipide aus der Chloroformphase wie beschrieben gewonnen [Bligh, E.G. und Dyer, W.J. (1959) Can. J. Biochem. Physiol. 37: 911-917]. Die Chloroformphase wurde durch Rotationsverdampfung auf etwa 50 ml konzentriert und die Extraktion wiederholt.
- Die polaren Lipide wurden durch Lösen der Gesamtlipid-Fraktion in Chloroform/Methanol (2:1, v/v) gewonnen und mit 20 Volumina kaltem Aceton gefällt [Feraante, G. et al. (1990) Biochem. Cell. Biol. 68: 274-283]. Lipid-Proben zur Verwendung bei Liposom-Präparationen wurden zwei weitere Male gefällt und die Lipide, nach erneuter Lösung in Chloroform/Methanol (2:1, v/v), weiter auf einer Silica-G-Säule (2 x 5 cm) gereinigt. Die Lipide, mit 125 ml 2:1 (v/v) Chloroform/Methanol, gefolgt von 125 ml 1:2 (v/v) Chloroform/Methanol, eluiert, wurden durch Rotationsverdampfung konzentriert.
- Reinigung von Lipiden. Zur strukturellen Charakterisierung wurden Ether-Lipide aus Extrakten polarer Lipide von M. hungatei und M. mazei mit Hilfe von Dünnschichtchromatographie (DC) gereinigt [Ferrante, 0., et al. (1987) Biochim. Biophys. Acta 921: 281-291]. Die Reinheit wurde durch Dünnschichtchromatographie, Massenspektroskopie und ³C-NMR-Spektroskopie bestätigt.
- Die Lipide auf den DC-Platten wurden liinsichtlich vic-Glycole, Phosphatide, Kohlenhydrat und Aminogruppen angefärbt (Ferrante, G., et al., 1987).
- Die polaren Kopfgruppen wurden durch 0,18% methanolische HCl-Hydrolyse entfernt und die freigesetzten Kernlipide durch DC [Sprott, G.D., et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:13725-13740] gereinigt.
- Phosphat wurde gemäß Allen [Allen, R.L.J. (1940) Biochem. J. 34: 858-865] gemessen und die %C/H/N durch Elementaranalyse bestimmt.
- Physikalische Methoden. Chemische Ionisierungs- (CI) und FAB-Massenspektroskopie erfolgten mit einem JEOL (JMS-AX505H)-Instrument. Die Messungen der optischen Rotation von Lipiden, die in Chloroform gelöst waren, wurden mit einem Perkin Elmer 243 Polarimeter bei Raumtemperatur erhalten. Die ³C-NMR-Spektren wurden bei 125 MHz, Raumtemperatur, unter Verwendung eines AM500 Spektrometers erstellt und die Lipide in CDCl&sub3;-Lösung für Kernlipide oder Benzol-d6-Methanol-d4 (7:1, v/v) für polare Lipide gelöst.
- Bildung gemischter Lipid/Detergens-Mizellen. Polare Lipide (40 mg) und n-Octyl- β-D-glucopyranosid (OBG) wurden in CHCl&sub3; (2 ml) gelöst. Das Detergens wurde in einem Molverhältnis von 20:1 (OBG:Lipid) unter Annahme eines durchschnittlichen Molekulargewichts von 1000 für die Extrakte polarer Lipide zugegeben [Ferrante, G., et al. (1990) Biochem. Cell. Biol. 68: 274-283]. Die Lipididetergens-Lösung wurde unter N bis zur Trockne eingedathpft und über Nacht unter Vakuum gebracht, um alle Spuren von CHCl&sub3; zu entfernen. Die gemischten Mizellen wurden gebildet durch Auflösen des Lipid-Detergens-Materials in 3 ml Dialysepuffer [10 mM K-Phosphat-Puffer (pH 7,14), der 160 mM NaCl enthielt]. Spurenmengen von ungelöstem Matefial wurden mittels Filtration durch einen 0,22 µm-Nylonfilter entfernt.
- Liposombildung. Die Liposomen wurden gebildet durch kontrollierte Dialyse der gemischten Lipid/ Detergens-Mizellen bei Raumtemperatur mit einem Liposomat (Avestin Inc., Ottawa, Canada), der 4 Stunden lang bei einer Durchflußrate von 0,5 ml/Min. für die gemischten Mizellen und 2,5 ml/Min. für den Dialysepuffer betrieben wurde.
- Bestimmung des Innenvolumens. Das Innenvolumen wurde mit dem Marker [&sup4;C(U)]- Sucrose (NEN Research Products, Mississauga, Ontario, Canada) bestimmt. Die gemischten Mizellen und Liposomen wurden mit Dialysepuffer gebildet, der 11,1 Mbq/l (0,3 mCi/l) [&sup4;C]-Sucrose enthielt. So war die Konzentration der in den Liposomen eingeschlossen [&sup4;C]-Sucrose die gleiche wie außerhalb der Vesikel. Die spezifische Aktivität der [&sup4;C]-Sucrose (155,4 Mbq/mMol; 4,2 mCi/mMol) wurde eingesetzt, um den intravesikulär abgeteilten wäßrigen Raum zu berechnen, und dieser wurde angegeben als µl wäßriges eingeschlossenes Volumen pro mg gesamtes polares Lipid nach der Entfernung freier [&sup4;C]-Sucrose.
- Die Abtrennung der freien Sucrose von eingeschlossener Sucrose wurde auf Sephadex G-50 (Medium)-Säulen mit Hilfe des Mikrosäulen-Zentrifugationsverfahrens durchgeführt, das von New [New, R.C.C. (1990) in Lipsomes. A practical approach, S. 105- 162, IRL, Press, Oxford] beschrieben wurde.
- Dünnschichtchromatographie. Polare Lipide wurden in Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser (85:22,5:10:4, v/v) auf Silicagel G-Platten (0,25 mm) aufgetrennt und durch Besprühen der Platten mit einem Cersulfat/Ammoniummolybdät-Reagenz (1 g H&sub4;(CeSO&sub4;)&sub4;/2,5 g (NH&sub4;)&sub6;Mo&sub7;O&sub4;.4HO/10 ml HSO&sub4;/90 ml HO), gefolgt von Erwärmen auf 100ºC sichtbar gemacht [Ross, N.W. et al. (1991) FEMS Microbiol. Lett. 81: 257- 267].
- Polare Lipid- und Mizellen-Extrakte, beide in CHCl&sub3;/CH&sub3;OH (2:1, v/v) wurden direkt auf die DC-Platten aufgebracht, wohingegen Proben (5 mg) der Liposom-Suspensionen unter N getrocknet und in CHCl&sub3;/CH&sub3;OH (2:1, v/v) gelöst wurden, bevor sie auf die Platten aufgetragen wurden.
- Die Liposomen wurden durch Druckextrusion gemäß MacDonald et al. [Macdonald, R.C. et al. (1991) Biochim. Biophys. Acta 1061: 297-303] mit Hilfe eines Liposo- Fast (Avestin, Inc., Ottawa, Ontario, Canada) gebildet. Soweit nicht anders angegeben, wurden die Lipide in Extrusionspuffer [10 mM K-Phosphat-Puffer (pH 7,14) und 160 mM NaCl] bei einer Endkonzentration von 20 mg/ml homogenisiert [2 ml-Potter-Elvehjem-Gewebemühle (Fisher Scientific)]. Die resultierenden multilamellaren Liposomen wurden 21 Passagen durch zwei (übereinandergelegte) Polycarbonatfilter (19 mm Durchmesser) mit Porendurchmessern von 50, 100, 200 oder 400 nm unterworfen. Mit Ausnahme der DPPC-Vesikel (50ºC) und soweit nicht anders angegeben wurden die Liposomen routinemäßig bei Raumtemperatur gebildet.
- Zur Untersuchung der Wirkung des pHs auf die Liposombildung wurden 25 mM Citrat/Phosphat (pH 3,0)- oder K-Phosphat (pH 7,14)- oder Carbonatlbicarbonat (pH 10,7)-Puffer, die 160 mM NaCl enthielten, eingesetzt. Filter mit einer Porengröße von 100 nm wurden für die Extrusion verwendet.
- Zur Verkapselung von 5(6)-Carboxyfluorescein (CF) und [&sup4;C]-Sucrose wurden diese dem Extrusionspuffer in Konzentrationen von 100 mM bzw. 150 mM (1,22 kbq/mMol; 33 nCi/µMol) zugegeben. In dieser Konzentration ist CF selbstquenchend und fluoresziert nicht, beim Austreten wird es jedoch verdünnt und die Fluoreszenz wird nachweisbar. Die Abtrennung des freien Materials von eingeschlossenem Material wurde auf Sephadex G-50 (Medium)-Säulen durchgeführt unter Anwendung des Mikrosäulen- Zentrifugationsverfahrens, das von New [New, R.C.C. (1990) in Liposomens. A practical approach, S. 105-162, IRL Press, Oxford] beschrieben wurde.
- Größenbestimmung. Der mittlere Durchmesser und die zahlenmäßig gewichtete Grössenverteilung der Vesikelpräparationen wurden durch dynamische Lichtstreuung (DLS) unter Verwendung des NICOMP Submikron-Teilchengrößenmeßgeräts, Modell 370 (Nicomp, Santa Barbara, Kalifornien, USA) und durch direkte Messungen aus elektronenmikroskopischen Aufnahmen von Negativkontrast-gefärbten Präparaten [New, R.C.C. (1990)] bestimmt.
- Die Negtivkontrastfärbungen wurden mit Hilfe von Formvar -Kohlenstoff-beschichteten Kupferrastern (200 Mesh) und einer 1 %-igen Lösung von Natriumphosphorwolframat (pH 7,2) erzeugt. Zur besseren Dispersion der Liposomen wurden die Raster mit Bacitracin (0,1 mg/ml) [Gregory, D.W. und Pine, B.J.S. (1973) J. Microscopy 99: 261- 265] 2 Minuten lang vor der Probenaufbringung behandelt. Ein Tropfen der geeigneten Liposomverdünnung (10&supmin;¹ bis 10&supmin;²) unter Verwendung von Phosphorwolframat als Verdünnungsmittel wurde 5 Minuten lang auf das Raster gebracht und der überschüssige Farbstoff mit Filterpapier abgenommen. Die Raster wurden mit einem Siemens 101 Transmissionselektronermikroskop bei 60 kV beobachtet. Um das Abflachen der Liposomen zu berücksichtigten, wurden die Durchmesser der gemessenen Scheiben mit 0,71 multipliziert, um den Durchmessem der ursprünglichen Liposomen nahezukommen (New, R.C.C. (1990)].
- Lamellarität. Die Lamellarität der Liposomen wurde durch Gefrieraufbruch bestimmt. Die Liposomen wurden 5 Stunden lang bei 200.000 x gmax zentrifugiert und das Pellet in Gold-Gefrierätz-Probenschälchen verteilt. Diese wurden eingefroren durch Eintauchen in Propan, das bei der Temperatur flüssigen Stickstoffs gehalten wurde. Das gefrorene Material wurde aufgebrochen und geätzt (Ätzzeit: 30 Sekunden) in einem Balzers-BA 360 Gefrierätzgerät, das mit Elektronenstrahleinrichtungen als Verdampfungsquellen ausgerüstet war. Die Platin-Kohlenstoff-Replikas wurden durch Behandlung in konzentrierter Schwefelsäure, 5 % (WIV) Natriumhypochlorit und destilliertem Wasser von liposomalen Trümmern gereinigt. Die Replikas wurden auf 400-Mesh-Kupferraster aufgebracht und mit einem Philips EM 300 beobachtet, das bei 60 kV unter Standardbedingungen mit eingesetztem Kühifinger betrieben wurde.
- Stabilitätsuntersuchung: Phospholipasen. Die Aktivität der Phospholipasen A, B und C gegenüber Liposomen wurde durch Fluoreszenzspektroskopie [New, R.C.C. (1990)] überprüft. Die Reaktionsmischungen (1 ml) enthielten mit 5(6)-Carboxyfluorescein (CF) beladene Liposomen und 50 Einheiten Phospholipase A in einem 50 mM Carbonat/Bicarbonat-Puffer (pH 8,9) oder 10 Einheiten Phospholipase B in einem 50 mM Na- Phosphatpuffer (pH 8,2) oder 10 Einheiten Phospholipase C in einem 50 mM Na-Phosphatpuffer (pH 7,14). Die Mischungen wurden bei 37ºC inkubiert und die Freisetzung von CF als Zunahme der Fluoreszenz verfolgt.
- Stabilitätsuntersuchung: Temperatur. Die Freisetzung von eingeschlossenem CF bei verschiedenen Inkubationstemperaturen wurde mittels Fluoreszenzspektroskopie verfolgt. CF-beladene Liposomen, die in 10 mM K-Phosphat/160 mM NaCl-Puffer resuspendiert waren, wurden bei 4, 23, 35, 50 und 65ºC innubiert und die Fluoreszenz in verschiedenen Zeitihtervallen gemessen. Die Menge der in diesen Assays eingesetzten CF-beladenen Liposomen war derart, daß eine 100%-ige Freisetzung von CF nach Lyse mit 0,2% Triton X-100 eine Fluoreszenz ergab, die 20 µM CF äquivalent war. Die Fluoreszenz wurde überwacht mit einem Farrand-Spektrofluorometer MK-1 (Farrand Optical Co., Inc., New York), der auf eine Anregungswellenlänge von 470 nm und eine Emissionswellenlänge von 520 nm eingestellt war.
- Stabilitätsuntersuchung: Austritt von [&sup4;C]-Sucrose. Der Austritt von eingeschlossener [&sup4;C]-Sucrose während der Lagerung wurde überwacht durch Bestimmung der verbleibenden prozentualen Radioaktivität, die mit den Liposomen assoziiert war. Freie [&sup4;C]- Sucrose in Aliquots (50 µl) von Liposom-Suspensionen wurde von eingeschlossener [&sup4;C]- Sucrose wie oben beschrieben abgetrennt und die Radioaktivität der resultierenden Liposomen in einem LKB Wallac (Modell 1217 Rackbeta)-Flüssigszintillationszähler gezählt. Der Einschlußgrad (als 100% betrachtet) wurde innerhalb von Minuten nach der Bildung der Liposomen bestimmt.
- Stabilitätsuntersuchung: Vesikelgröße. Die Stabilität der hergestellten Liposomen, d.h. Fusion und Aggregation, wurde periodisch durch DLS [Frokjaer, S., et al., (1984) in Liposome technology (Gregoriadis, G., Hrsg.) Band 1, S. 235-245, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida] überwacht.
- Lipidstrukturen Methanospirillum hungatei. In früheren Untersuchungen [Kushwaha, S.C., et al. (1981) Biochim. Biophys. Acta 664: 156-173; Ferrante, G., et al. (1987) Biochim. Biophys. Acta 921: 281-291] nicht charakterisierte Ether-Lipide wurden aus M. hungatei gereinigt und als strukturell neu befunden (Fig. 1). Die Rf-Werte und Färbereaktionen sind in Tabelle 2 für die gereinigten Lipide dargestellt, die durch DC mit Hilfe von Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser (85:22,5:10:4, v/v) als Lösungsmittel aufgetrennt wurden. Die Färbereaktionen entsprechen den früheren Daten und den neuen Strukturen PGL-III bis PGL-VII und TGT-I. PGL-III bis PGL-VI waren Phosphoglycolipide, die eine stark positive Dragendorif-Reaktion für PGL-III und W (typisch für eine N,N,N-Trimethylgruppe) aufwiesen und eine schwach positive Dragendorff-Reaktion (typisch für eine N,N-Dimethylgruppe) im Falle von PGL-V und PGL-VI aufwiesen. TABELLE 2. Relative Häufigkeit und Färbeeigenschaften der Ether-Lipide aus M. hungatei
- a repräsentiert das Gewicht als Prozentsatz der nach der Reinigung gewonnenen Gesamtlipide
- b Färbereaktionen, die für isolierte Lipide festgestellt wurden. ±, unsichere Reaktion.
- Die für die Glykolipide I, II und III dargestellten Analysedaten zeigen eine Elementaranalyse, die den vorausgesagten Strukturen vollständig entspricht (Tabelle 3). Die Molekulargewichte der Lipide, welche das N,N,N-Trimethylaminopentantetrol enthalten, werden bei negativer FAB als Dimethylformen nachgewiesen [Ferrante, G., et al., (1987)], werden jedoch sowohl bei positiver FAB-MS als auch bei NMR-Analyse unschwer identifiziert. TABELLE 3. Analytische Daten für die Phosphoglykolipide I, III nnd IV
- a negative FAB-MS
- b Verlust einer Methylgruppe
- Eine negative FAB-MS der gesamten polaren Lipide von M. hungatei zeigte die Phosphatidyldiether (731,7)- und Phosphatidyltetraether (1379,8)-Fragmente (Fig. 2). Lipide, denen eine Phosphatgruppierung fehlt, werden bei diesem Verfahren mit geringer Empfindlichkeit nachgewiesen, nichtsdestoweniger konnten jedoch Signale, die den Strukturen der gereinigten Lipide entsprachen, zugeordnet werden. Die berechneten Werten stimmen mit den Strukturen überein und sind PPDAD (M=892), PPTAD (M- 15=892), DGD-I und DGD-II (M-1 =975), PGL-V (M= 1703), ?GL-I und PGL-II (M= 1778), TGT-I (M-1 = 1786), PGL-III und Iv (M-15 = 1865) und PGL-VI und VII (M= 1865). Das starke Signal bei 804,9 zeigt einen Phosphatidylglycerindiether (theoretisch M=805) mit derselben Struktur an wie PG, das in Halobactenum cutirubrum [Kates, M. (1978) Prog. Chem. Fats other Lipids 15: 301-342] gefunden wurde.
- Alle ³C-NMR-Signale der Phytanylketten entsprechen den C40,40-Tetraether- oder C20,20-Diether-Lipiden {Ekiel, I., et al. (1983) J. Bacteriol. 156: 316-326; Sprott, G.D., et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:13735-13740]. Ferner besaßen die Lipidkerne nach der Entfernung der Kopfgruppen Mobilitäten bei DC, welche mit den C40,40-Tetraether- Standards, hergestellt ausm. hungatei [Kushwaha, S.C., et al., (1981)], und C20,20-Diether aus Halobacterium cutirubrum [Kates, M. (1978)] als Referenzen identisch waren.
- Die Identifizierung der Kopfgruppen-Strukturen erfolgte mit Hilfe zweidimensionaler homo- und heteronuklearer NMR (COSY, RELAY COSY und HMQC = heteronukleare multiple Quanten-Kohärenzexperimente). In den Tabellen 4A und 4B sind die zugeordneten ³C-NMR-Signale für die Strukturen dargestellt, die bei dieser Untersuchung neu waren und für diejenigen, die in frühen Studien nicht vollständig charakterisiert worden waren [Kushwaha, S.C. et al. (1981) Biochim. Biophys. Acta 664:156-173; und Ferrante, G. et al. (1988) Biochim. Biophys. Acta 963:162-172]. ³NMR-Signale zeigen, daß die meisten Lipide ein Disaccharid (entweder α-glcp-(1-2)-β-galf oder β-galf-(1-6)- β-galf) als eine der Kopfgruppen (R) aufweisen. Die zweite Kopfgruppe (R) in Tetraethem sn-1' verknüpft, ist unterschiedlicher, entweder ein Kohlenhydrat (β-galf in IGT-= I, Phosphatidyl-N,N-dimethylaminopentantetrol in PGL-V, PGL-VI, PGL-VII; die N,N,N-Trimethylgruppe in PGL-III und PGL-IV;) oder Glycerin in PGL-I. Einige Tetraether weisen nur eine Kopfgruppe auf, was durch die charakteristischen chemischen ³C- NMR-Verschiebungen eines der sn-1-Kohlenstoffe von Glycerin (Tabellen 4A und 4B). eindeutig gestützt wird. TABELLE 4A. Chemische ³C-NMR-Verschiebungen für Lipide aus M. hungatei, worin R α-glcp-(1,2)-β-galf, ist.
- *,^ Die Zuordnung dieser Signale könnte umgekehrt sein
- DGD, Diglycosyldiether; DGT, Diglycosyltetraether;
- PGL, Phosphoglyeolipid, TGT, Triglycosyltetraether TABELLE 4B. Chemische ³C-NMR-Verschiebungen für Lipide aus M. hungatei, worin R β-galf-(1-6)-β-galf oder β-galf ist.
- *,^ Die Zuordnung dieser Signale könnte umgekehrt sein
- br, breites Signal
- Die Lipide machten 3,8% des Zelltrockengewichts von M. mazei aus und bestanden aus 90,2% polaren Lipiden. Nach Auftrennung auf Dünnschichtplatten waren neun Ether-Lipide deutlich zu sehen, plus 4 in geringeren Mengen bei Rf < 0,23 und mehrere in Spurenmengen, die durch MS-Analyse entdeckt wurden. Die Reinigung wurde für acht der Ether-Lipide durchgeführt, die zusammen 97-98% der polaren Fraktion darstellten. Jedes gereinigte Lipid besaß ein größeres Fragment bei 747 oder 731, was Phosphatidyldiether-Lipide mit oder ohne eine(r) Hydroxylgruppe auf der Phytanylkette anzeigt. Die weitere Charakterisierung der Lipidkerne wurde nach Hydrolyse der gesamten polaren Lipide und Aufreinigung durchgeführt Diese Kerne besaßen Werte der optischen Rotation von +37 und +55 und ³C-NMR-Spektren mit genau den Signalen wie für die sn-2,3-Konfiguration von Hydroxydiether- bzw. Standard-Diether- Lipiden angegeben [Sprott, G.D., et a., (1990) J. Biol. Chem. 265: 13735-13740]. Unter Heranziehung früherer Signalzuordnungen bestätigten die NMR-Spektren ferner eindeutig, daß die Hydroxylgruppe mit C-3 der sn-2-Phytanylkette verknüpft war, wie für M. barkeri [Sprott, G.D. et al., (1990)] gefunden.
- Negative und positive FAB-MS-Analyse wies auf die Strukturen gemäß Formel III hin. Repräsentative Spektren sind für gereinigten Phosphatidylglycerinhydroxydiether und Phosphatidylethanolaminhydroxydiether (Fig. 4) und für die gesamten polaren Lipide von M. mazei (Fig. 5) gezeigt. Die ³C-NMR-Spektren bestätigten, daß die für Inosit-, Serin-, Ethanolamin- und Glycerin-Kopfgruppen charakteristischen Signale vorhanden waren. Ein gereinigtes Lipid besaß ein Molekulargewicht von 804,9, was entweder auf einen Phosphatidylhydroxyglycin- oder Phosphatidylglycerin-Diether hinweist.
- Die negative FAB-MS von Gesamtextrakten polarer Lipide erlaubte die Durchführung eines Vergleichs bezüglich der Lipid-Komponenten anderer Methanosarcina- Spezies (Fig. 5). In allen Fällen waren dieselben Lipid-Molekülionen vorhanden, obwohl die Ether-Lipide in den verschiedenen Spezies in unterschiedlichen relativen Mengen vorhanden waren.
- Stabilität. Reinigung und Lagerung aller Ether-Lipide erfolgte in einer Luftatmosphäre. Bei keinem der Ether-Lipide wurde während der Lagerung an Luft für Zeiträume von mindestens einem Jahr (längste untersuchte Periode) irgendwelche Instabilitäten gefunden.
- Mittlere Größen und Größenverteilungen. Eine kontrollierte Detergens-Dialyse wurde erfolgreich eingesetzt, um Liposomen mit guter Größenhomogenität aus Gesamtextrakten polarer Lipide von 4 der 5 getesteten Methanogene (Fig. 6) zu bilden, wobei die Ausnahme M. hungatei-Liposomen waren (siehe unten). Dynamische Lichtstreuungs-(DLS)- Analyse der verschiedenen Liposompräparationen ergab Variationskoeffizienten der Größenverteilung zwischen 0,2 und 0,5 (Tabelle 5); die engste Größenverteilung wurde mit M. jannaschii-Liposomen erhalten, in abnehmender Reihenfolge gefolgt von denjenigen aus M. voltae, M. mazei und M. concilii. Die DLS-Analyse erfolgte im Vesikel- Teilchen-Modus als zahlenmäßig gewichtete Durchmesserverteilungen, da die Daten gut mit Größen und Standardabweichungen übereinstimmten, die aus einer niikroskopischen Untersuchung berechnet wurden (Tabelle 5). Volumen-gewichtete Verteilungen ergaben immer wesendiche größere Durchmesserschätzungen (20 bis 80%). Die bei der DLS beobachteten Unterschiede in der Homogenität wurden durch Elektronenmikroskopie von Negativkontrast-gefärbten Liposomen bestätigt (Fig. 6 und Tabelle 5). Wesentlich ist, daß die Größenverteilung für verschiedene Liposompräparationen aus demselben Lipidextrakt sehr reproduzierbar war (d.h. innerhalb von 10%). TABELLE 5. Größeneigenschaften von Liposomen, die durch Detergens-Dialyse hergestellt wurden.
- Variationskoeffizient = Standardabweichung/mittlerer Durchmesser der Größenverteilung
- mg an gesamtem polarem Lipid
- ³ Züchtungstemperatur
- &sup4; Standardabweichung
- &sup5; Anzahl der gemessenen Liposomen
- &sup6; die Liposomen wurden durch ein 0,22 µm-Nylonfilter filtriert, um die großen Aggregate zu entfernen.
- Große Teilchen (> 1 µm), mit dem Lichtmikroskop unschwer zu beobachten, waren in der Liposom-Suspension von M. concilii nach der Dialyse vorhanden. Im Elektronenmikroskop erschienen sie als Aggregate von Liposomen unterschiedlicher Größe. Zahlenmäßig gewichtete DLS-Daten offenbarten, daß die Entfernung dieser Teilchen mittels Filtration durch einen 0,22 µm-Nylonfilter den mittleren Durchmesser und die Größenverteilung der Population erwartungsgemäß nicht beeinflußte, da sie nur einen sehr kleinen Bruchteil der Liposomenpopulation ausmachten. In der Tat wurden sie im Vergleich mit den kleineren zahlreicheren Liposomen mittels Elektronenmikroskopie als sehr wenige befunden. Nachdem dieser kleine Anteil großer Vesikel entfernt war, verblieb eine ziemlich homogene Suspension kleiner Liposomen (Fig. 6D).
- Die Liposomenpopulation, die mit gesamten polaren Lipiden von M. hungatei erhalten wurde, war wesentlich heterogener. Eine Größenbestimmung der Liposomen durch Elektronenminroskopie offenbarte die folgende Verteilung (Fig. 6E): 40% der Liposomen besaßen Durchmesser zwischen 20 und 100 nm, 16% zwischen 100 und 200 nm, 16% zwischen 200 und 300 nm, und die verbleibenden 28% zwischen 300 und 1000 nm. Einige der elektronenmikroskopischen Teilbilder zeigten eine gute Größenverteilung (Fig. 6F). Wiederum konnten die großen Liposomen von den gleichmäßigeren kleineren Liposomen durch Filtration abgetrennt werden.
- Die Durchschnittsgröße der Liposomen variierte in Abhängigkeit von der Herkunft der Lipide (Tabelle 5). Unilamellare Liposomen mit kleineren mittleren Durchmessern als 100 nm wurden mit Lipid-Extrakten von M. voltae, M. mazei, M. concilii und M. jannaschii (gezüchtet bei 50ºC) erhalten, wohingegen größere 0 100 nm) unilatnellare Liposomen mit Lipid-Extrakten von M.jannaschii, die bei 65º0 gezüchtet worden waren, erhalten wurden.
- Die beiden Tetraether-Lipide enthaltenden Extrakte, diejenigen von M. jannaschii, die bei 65º0 gezüchtet worden waren, und M. hungatei, ergaben die größeren Liposomen. Zur Feststellung, ob die Anwesenheit von Tetraether-Lipiden in den Extrakten flir diese größeren Vesikel verantwortlich sein könnte, wurden Liposomen aus den Gesamtlipidextrakten von M. janriaschii, die bei bei 50º0 und 65º0 gezüchtet worden waren, hergestellt. Sprott et al. [Sprott, G.D. et al. (1991) J. Bacteriol. 173: 3907-3910] zeigten, daß bei 50ºC gezüchtete M. jannaschii einen höheren Anteil an Diether-Lipiden und weniger Tetraether und makrocyclische Diether enthalten als Zellen, die bei 65ºC gezüchtet wurden (Tabelle 1). Erwartungsgemäß ergaben die Lipide, welche aus den bei 50ºC gezüchteten M. jannaschii erhalten wurden, konsistenterweise kleinere Liposomen als die Liposomen, welche mit Lipiden von bei 65ºC gezüchteten M. jannaschii erhalten wurden (Tabelle 5).
- Intaktheit archaebakterieller Liposomen. Zur Bestätigung, daß die aus den verschiedenen Methanogenen erhaltenen Extrakte polarer Lipide in der Tat geschlossene intakte Vesikel bildeten, wurden Einschlußexperimente mit [&sup4;C]-Sucrose durchgeführt. Aus diesen Experimenten wurden die Innenvolumen der verschiedenen Liposomen erhalten (Tabelle 5). Es gibt keine absolute Beziehung zwischen Größe und Innenvolumen und dies ist wahrscheinlich auf die Unterschiede in den Lipidzusatntnensetzungen der Extrakte zurückzuführen.
- Nach einer 2-wöchigen Inkubationsperiode bei 4ºC war mindestens 92% des Markers immer noch in den Liposomen vorhanden. Die Lysierung der Liposomen mit 0,2% Triton X-100 setzte 100% der Markierung frei, während die Inkubation (4 Stunden) von leeren Liposomen mit [&sup4;C]-Sucrose (0,3 mCi/L) keine Erhöhung der mit den Liposomen assozüerten Radioaktivität zeigte. Diese Ergebnisse bestätigten, daß die [&sup4;C]- Sucrose eingeschlossen wurde und die Liposomen geschlossene Vesikel waren.
- Lamellarität von Liposomen. Gefrieraufbrüche der Liposomen von M. jannaschii, M. voltae, M. mazei und M. concilii (filtriert) zeigten sie als relativ homogene Vesikel, deren hydrophobe Bruchflächen (sowohl konkav als auch konvex) glatt waren (Fig. 7 ist repräsentativ). Mehrfache Bruchebenen wurden niemals beobachtet, was die unilamellare Natur dieser Liposomen bestätigt. Ein Vergleich der Liposomdurchmesser von Gefrieraufbrüchen und Negativkontrastfärbungen zeigte, daß diejenigen der Negativkontrastfärbwigen etwas größer waren und legte nahe, daß sie im Vergleich zu den gefrorenen Präparationen etwas abgeflacht (und künstlich vergrößert) waren. Es wurde deshalb ein Größenkorrekturfaktor von 0,71 bei der Durchmesserberechnung von Negativkontrast-gefärbten Liposomen eingesetzt [New R.C.C. (1990) in R.C.C. New (Hrsg.) Liposomes. A Practical approach. IRL Press, Oxford]. M. hungatei-Liposomen waren eine Mischung von unilamellaren und zahlreichen großen multilamellaren Vesikeln.
- Lipidzusammensetzung von Liposomen. Ein Vergleich mittels Dünnschichtchromatographie von Gesamtextrakten polarer Lipide, gemischten Mizellen und Liposomen offenbarte im wesentlichen identische Lipidprofile (Fig. 8). Dies weist eindeutig darauf hin, daß alle die verschiedenen Ether-Lipid-Spezies in die jeweilige Liposompraparation inkorporiert wurden. Ebenfalls zu beachten sind die unterschiedlichen und charakteristischen Lipidinuster für jedes Methanogen. Es wurde kein restliches Detergens mittels Dünnschichtchromatographie in irgendeiner der Liposom-Suspensionen nachgewiesen (Fig. 8) und deshalb schätzen wir die Detergenskonzentration auf weniger als 1 µg in den endgültigen Liposompopulationen (40 mg Lipid).
- Mittlere Größen und Größenverteilungen. Ether-Liposomen verschiedener Größe wurden mittels Druckextrusion durch Filter mit Poren von 50, 100, 200 und 400 nm und verschiedenen archaebakteriellen Lipid-Extrakten erzeugt (Tabelle 6). Bei den Filtern mit kleineren Poren (50 und 100 nm Porengröße) ergaben die meisten Extrakte Liposomen mit mittleren Durchmessern um 50 und 100 nm. Bei den Filtern mit 200 um Poren besaßen jedoch nur die aus Lipiden von M. smithii und M. hungatei hergestellten Liposomen mittlere Durchmesser nahe 200 nm, während Liposomen, die mit polaren Lipiden von H. cutirubrum in Gegenwart von 4,0 M NaCl erhalten wurden, beträchtlich größer als die Poren des Filters waren; die verbleibenden Extrakte ergaben Liposomen nut mittleren Durchmessern, die wesentlich kleiner als 200 nm waren. Bei Filtern mit 400 um Poren waren nur die aus H. cutirubrum-Lipiden (in 4,0 M NaCl) erzeugten Liposomen größer als die Porengröße des Filters; die anderen waren wesentlich kleiner als die Porosität des Filters.
- Der Korrelationskoeffizient der Größenverteilungen (zwischen 0,20 und 0,40), der durch dynamische Lichtstreuungs-Analyse (DLS) erhalten wurde, zeigt, daß alle Liposom-Suspensionen eine gute Größenhomogenität aufwiesen (Tabelle 6). Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Negativkontrast-gefärbten Liposomen stützen diese Befunde (Fig. 9).
- Der pH des Extrusionspuffers kann den mittleren Durchmesser der resultierenden Liposomen beeinflussen (Tabelle 7). Von den in dieser Studie eingesetzten repräsentativen Extrakten ergaben diejenigen von M. jannaschii (gezüchtet bei 65ºC) und M. mazei mit zunehmend sauren Bedingungen größere Liposomen. Dieser Effekt trat jedoch bei polaren Lipiden von M. jannaschii, die bei 50ºC gezüchtet worden waren, nicht auf. Deshalb muß er von der Lipidzusammensetzung eines jedes Extrakts abhängig sein. TABELLE 6. Größeneigenschaften (mittlerer Durchmesser ± mittlere Standardabweichung) der verschiedenen Liposom-Suspensionen, die durch Druckextension hergestellt worden waren TABELLE 6 (Fortsetzung)
- Variationskoeffizient der Größenverteilung = Standardabweichung/mittlerer Durchmesser
- Daten nicht verfügbar
- ³ in Extrusionspuffer mit 4,0 M NaCl gebildete Lipsomen TABELLE 7 Wirkung des pH-Werts auf den mittleren Durchmesser von unilamellaren Liposomen nach Druckextrusion und Lagerung
- Liposomen wurden mit 100 nm Poren-Filter erzeugt und bei den angegebenen pH-Werten gelagert
- Liposomen wurden mit Raumtemperatur gelagert
- ³ mittlere Standardabweichung
- &sup4; Variationskoeffizient der Größenverteilung
- &sup5; Daten nicht verfügbar
- Lamellarität. Die Negativkontrast-gefärbte Präparation offenbarte auch, daß die mit 50 und 100 nm Poren-Filtern gebildeten Liposomen unilamellar waren (Fig. 9). Es wurden jedoch zahlreiche multilamellare Liposomen in Suspensionen beobachtet, die mit den größeren Filtern von 200 bzw. 400 nm Poren erzeugt wurden.
- Phospholipasen. Mit Ausnahme von Liposomen, die aus Lipiden von H. cutirubrum hergestellt wurden, sind alle Ether-Liposomen in Anwesenheit der Phospholipasen A und B stabil (Tabelle 8). In der Tat hielten Ether-Lipide, die in Gegenwart dieser Enzyme inkubiert wurden, eingeschlossenen Farbstoff in äquivalenter Weise wie die Kontrollen "ohne Phospholipase" zurück. Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu ähnlichen Experimenten, die mit aus den Ester-Lipiden DPPC und EPC hergestellten Liposomen durchgeführt wurden. Nach der Inkubation mit Phospholipase konnte die NICOMP-Analyse infolge der verlorenen strukturellen Integrität keine Ester-Liposomen nachweisen.
- Ether-Lipide waren jedoch einer Hydrolyse mit Phospholipase C zugänglich. Nichtsdestoweniger waren einige resistenter als Ester-Liposomen, insbesondere diejenigen aus M. hungatei, M. smithii und M. jannaschii (gezüchtet bei 65ºC). TABELLE 8. Wirkungen von Phospholipasen auf Ester- und Ether-Liposomen
- Die Ergebnisse sind als % Carboxyfluorescein-Austritt angegeben.
- Inkubationszeit in Gegenwart des Enzyms
- ³ Kontrollen, angegeben als % Carboxyfluorescein-Austritt aus Liposomen in Abwesenheit des Enzyms.
- Temperature Extrakte von Ether-Lipiden ergaben stabilere Liposomen bei den höheren Temperaturen als die Ester-Lipide DPPC und EPC (Tabelle 9); der Austritt von 5(6)- Carboxyfluorescein bei 50 und 65ºC war bei den Ether-Liposomen weniger stark. Bei Temperaturen unterhalb 50ºC wurde der Farbstoff aus Ether-Liposomen und DPPC- Liposomen mit ähnlicher Geschwindigkeit freigesetzt. Im allgemeinen waren EP-Liposomen durchlässiger als diejenigen von DPPC oder Ether-Liposomen, die aus den gesamten polaren Lipiden von M. jannaschii hergestellt worden waren.
- Von den Ether-Liposomen waren die mit Lipiden aus M. hungatei und M. jannaschii hergestellten am stabilsten. Dies ist wahrscheinlich auf die Anwesenheit von Tetraether-Lipiden in diesen Extrakten zurückzuf(iltren; M. mazei besitzt keine Tetraether-Lipide. Sprott et al. (1991) zeigten, daß bei 50ºC ge7iichtete M. jannaschii einen höheren Anteil an Standard-Diether-Lipiden enthalten und weniger Tetraether und makrocyclische Diether als bei 65ºC gezüchtete Zellen. Deshalb wurde die Stabilität von Liposomen, hergestellt aus Lipiden von Zellen, die bei beiden Temperaturen gezüchtet worden waren, bei 35, 50 und 65ºC getestet. Die Liposomen, welche weniger Tetraether enthielten, waren konsistenterweise durchlässiger als diejenigen, welche aus Lipiden von bei 65ºC gezüchten Zellen hergestellt worden waren (Tabelle 10). Dieser Befund wurde weiter gestützt durch Durchlässigkeitsstudien, die an Liposomen mit verschiedenen Mengen an Tetraether-Lipiden durchgeführt wurden, welche mit gesamten polaren Lipiden von M. voltae und M. hungatei (Tabelle 10) hergestellt worden waren, d.h. die Liposomen, welche mehr Tetraether enthielten, waren konsistenterweise weniger durchlässig.
- Die Entfernung mikrobieller und viraler Kontaminationen ohne Verlust an strukttirellen Eigenschaften und/oder der verkapselten Verbindung ist bei pharmazeutischen Anwendungen von Liposomen wünschenswert. Die Filtersterilisierung ist insofern problematisch, als virale Partikel oder Pyrogene nicht entfernt werden und sie für große Liposomen von 500 nm oder mehr ungeeignet ist [Friese, J. (1984) Kapitel 10 in Liposome technology, Vol 1. Preparation of liposomes. G. Gregoriadus (Hrsg.) CRC Press]. Ein bequemes alternatives Verfahren, welches diese Probleme vermeidet, ist die Autoklavierung. Dieses Verfahren ist jedoch bei Liposomen, die von Ester-Lipiden abgeleitet sind, nicht möglich, da die strukturelle Integrität der Liposomen während der Hitzebehandlung verloren geht [Friese, J. (1984)].
- Eine Autoklavierungsbehandlung (20 Min., 121 ºC, 103,4 kPa = 15 psi) wurde bei archaebakteriellen Ether-Liposomen getestet, welche in dem bei ihrer Herstellung verwendeten Puffer-NaCl-System suspendiert waren. Siehe Tabelle 11. Keine der Ether- Liposomen zeigten Anzeichen von Fusion (mittlerer Durchmesser) oder Lyse (Intensität). Der fluoreszierende Farbstoff wurde während der Autoklavierung in den verschiedenen Liposom-Präparationen in. unterschiedlichem Maße zurückgehalten und wies eine direkte Korrelation zwischen Retention und Tetraether-Gehalt auf. Dies ist ein Hauptvorteil der neuen Ether-Liposomen gemäß der vorliegenden Erfindung. TABELLE 9. Wirkung der Temperatur auf das Austrittsverhalten von Carboxyfluorescein aus Liposomen.
- Die Ergebnisse sind als % Carboxyfluorescein-Austritt angegeben
- Bei 65ºC gezüchtet M. jannaschii TABELLE 10. Wfrkungen zunehmender Mengen an Tetraether-Lipiden auf die Temperaturstabilität von Ether-Liposomen
- Die Ergebnisse sind als % 5(6)-Carboxyfluorescein-Austritt nach 6 Tagen Inkubation angegeben.
- Liposomen, die aus gesamten polaren Lipiden (TPL) von M. hungatei und M. voltae, in verschiedenen Anteilen gemischt, um den prozentualen Tetraether-Lipid-Anteil der Liposomen zu variieren, hergestellt wurden. TABELLE 11. Wirkungen der Autoklavierung auf archaebakterielle Liposomen
- gemessen mit einem Nicomp 370 Submikron-Teilchengrößenmeßgerät bei einer Empfindlichkeit von 150 und einer Fensterbreite von 10 µsek.
- 5(6)-Carboxyfluorescein
- ³ Variationskoeffizient der Größenverteilung = Standardabweichung/mittlerer Durchmesser
- &sup4; enthält Tetraether, die Menge wurde jedoch noch nicht bestimmt
- &sup5; Liposomen, die aus TPL von M. hungatei und M. voltae, in verschidenen Anteilen gemischt, um den prozentualen Tetraether-Lipid-Anteil der Liposomen zu variieren, hergestellt wurden.
- Austritt von [&sup4;C]-Sucrose. Der Austritt von [&sup4;C]-Sucrose während der Lagerung bei 4ºC wurde untersucht (Tabelle 12). Bei pH-Werten von 3,0 und 7,1 hielten die Ether- Liposomen den gelösten Stoff genauso wirkungsvoll wie Ester-Liposomen (DPPC und EPC) zurück und bei pH 10,7 waren Ether-Liposomen wesentlich wirkungsvoller als EPC-Liposomen. Der Grund für die Zunahme an eingeschlossener [&sup4;C]-Sucrose, die bei DPPC-Liposomen bei pH 10,7 beobachtet wurde, ist noch unbekannt. TABELLE 12. Verbleibende eingeschlossene [&sup4;C]-Sucrose (%) nach Lagerung von unilamellaren Liposom-Suspensionen bei verschiedenen pH-Werten
- die Liposomen wurden niit 100 nin Poren-Filter erzeugt und bei 4ºC und den angegebenen pH-Werten gelagert. 0,2% Natriumazid wurde zugegeben, uni Bakterienwachstum zu verhindern.
- bei 50ºC gezüchtete M. jannaschii
- ³ bei 65ºC gezüchtete M. jannaschii
- Vesikelgröße. DLS-Analyse wurde eingesetzt, um eine physikalische Instabilität (Fusion oder Aggregation) von unilamellaren Ether-Liposomen während langer Lagerungszeiträume nachzuweisen. Nach 2-5 Monaten der Inktibation bei 4ºC hatte sich der mittlere Durchmesser der meisten Ether-Liposom-Populationen nicht signifikant geändert (Tabellen 6 und 7). In den meisten Fällen waren die Variationskoelfizienten der Größenverteilungen ebenfalls unbeeinflußt, obwohl eine signifikante Erhöhung bei pH 3,0 bei Liposomen beobachtet wurde, die mit Lipiden von M. jannaschii (65ºC) und M. mazei erzeugt wurden. Dies könnte eine Veränderung der Liposom-Population anzeigen.
- Reine methanogene Ether-Lipide sind im Handel nicht erhältlich. Berücksichtigt man, daß die meisten Methanogene mindestens 10 verschiedene polare Lipide synthetisieren (einige wie z.B. M. jannaschii besitzen viel mehr), so ist die Isolierung selbst der am stärksten vertretenden in ausreichender Menge, um eine Liposombildung zu versuchen, eine gewaltige Aufgabe. Die Lipid-Fraktion der meisten Methanogen-Zellen macht auch nur etwa 5% des Zelltrockengewichts aus. Deshalb untersuchten wir hier die Möglichkeit, natürliche Mischungen von gesamten polaren Lipiden aus verschiedenen Methanogenen und anderen Archaebakterien einzusetzen, um Ether-Liposom-Formulierungen herzustellen.
- Wir haben erfolgreich geschlossene unilamellare Vesikel mit guter Größenhomogenität aus Gesamtextrakten polarer Lipide von M. voltae, M. jannaschii, M. mazei und M. concilii hergestellt. Ein Vergleich zeigt, daß Variationskoeffizienten für die Größenverteilung von Liposomen, die mit archaebakteriellen Ether-Lipiden und Ester-Lipid (EPC) unter Verwendung von n-Alkyl-Glucosid als Detergens erhalten wurden, vergleichbar sind [Mimms, L.T., et al. (1981) Biochemistry 20: 833-840; Schwendener, R.A., et al. (1981) Biochim. Biophy. Res. Comm. 100:1055-1062].
- Es besteht keine starke Korrelation zwischen der Natur der verschiedenen Kernlipid-Strukturen in jedem Extrakt und der Größe der gebildeten Liposomen. Die Anwesenheit von Tetraether-Kernlipiden scheint jedoch die Bildung größerer Vesikel zu fördern. Diese Beobachtungen stimmen überein mit den Befünden von Lelkes et al. [Lelkes, P.I., et al. (1983) Biochim. Biophys. Acta 732:714-718], welche zeigten, daß Vesikel von Ei-Phosphatidylcholin mit zunehmenden Mengen an inkorporierten Tetraethern größer wurden. Die Packungsbeschränkungen, denen die steifen Membran-überspannenden Tetraether-Lipide unterworfen sind (Lelkes, P.I., et al. 1983); Ring, K. et al. (1986)], sind wahrscheinlich für die oben erwähnten Beobachtungen verantwortlich. Diese Beschränkungen wurden mit zunehmend größeren Liposomen geringer werden, wenn die Krümtnung der Liposomen abnimmt. Die Größenunterschiede könnten auch teilweise auf die Unterschiede in den Zusammensetzungen der polaren Kopfgruppen eines jeden Lipid-Extrakts zurückzuführen sein. Es ist allgemein anerkannt, daß die Natur der Kopfgruppe teilweise die Molekularstrüktur/form (invertierter Konus, Zylinder oder Konus) der Lipid-Komponente bestimmt, welche wiederum deren Lipid-Packungsgröße bestimmt [Lichtenberg, D., und Barenholz, Y. (1988) Methods Biochem. Anal. 33:337-462]. Auch der intravesikulär abgeteilte wäßrige Raum kann durch die Kopfgruppen-Zusammensetzung aufgrund deren Hydratation und Sperrigkeit beeinflußt werden [Racey, T.J., et al. (1989) Chem. Phys. Lipids 49:271-28].
- Die Druckextrusion besitzt Vorteile gegenüber der Detergens-Dialyse bei der Anwendung zur Herstellung von archaebakteriellen Ether-Liposomen. Die Druckextrusion ist sehr schnell und einfach, erfordert nur manuelle Homogenisierung des getrockneten Lipids, um es in die wäßrige Pufferlösung zu dispergieren, und mehrinalige Extrusion dieser Dispersion durch einen Filter. Die Inkorporation einer Substanz (&sup4;C-Sucrose und ein fluoreszierender Farbstoff zeigten das Prinzip) in die Pufferlösung resultierte in deren wirksamen Einschluß. Dagegen kann die Detergens-Dialyse zu einem geringen Einschluß führen, falls die einzubringende Substanz durch Dialyse verloren wird. Wir verwendeten kleine Volumina von etwa 1 ml für die Druckextrusion, das Prinzip bleibt jedoch gleich und die Ausrüstung, welche ein Arbeiten in größerem Maßstab erlaubt, ist ohne weiteres erhältlich (Avestin, Inc., Ottawa, Canada). Dieses Verfahren vermeidet die Verwendung von Detergens, was für pharmazeutische Anwendungen nicht akzeptabel sein könnte. Ebenso kann die Größe der Liposomen ohne weiteres in definierter Weise geändert werden, indem einfach die Porengröße der Membran geändert wird, wohingegen Versuche zur sorgfältigen Änderung von Bedingungen erforderlich sind, um eine gewunschte Größenänderung durch Detergens-Dialyse zu erhalten [Zumbuehl, O., und Weder, H.G. (1981) Biochim. Biophys. Acta 640:252-262; Schwendener, R.A., et al. (1981) Biochem. Biophys. Res. Com. 100:1055-1062; Aurora, T.S., et al. (1985) Biochim. Biophys. Acta 820: 250-258]. Schließlich ergab eine Detergens-Dialyse von gesamten Ether-Lipiden aus M. hungatei eine gemischte Population von Liposomen, die aus kleinen unilamellaren und großen multilamellaren Typen im Größenbereich von 100 bis 1000 um bestand. Die Druckextrusion derselben Präparationen, welche aus Diether- und Tetraether-Lipiden in einem Verhältnis von etwa 1:1 bestehen, ergab eine hochgradig homogene Population. Die Größe dieser Liposomen stand im Verhältnis zur Porengröße des Filters, wie für andere Lipidquellen.
- Die Ether-Lipide von M. hungatei wurden vorher teilweise charaktefisiert von Kushwaha et al. [Kushwaha, S.C., et al. (1981) Biochim. Biophys. Acta 664:156-173] und Ferrante et al. [Ferrante, G. et al. (1987) Biochim. Biophys. Acta 921: 281-291]. Neue Strukturen werden für die Tetraether-Phosphoglycolipide PGL-III bis VII und ein Tetraether-Glycolipid TGT-I vorgestellt. Auf der Basis des Trockengewichts machen 16 Lipide mehr als 99% der Ether-Lipide aus, die aus diesem Methanogen extrahiert wurden.
- Methanosarcina barkeri und M. mazei synthetisieren sowohl 3-Hydroxydiether- als auch Standard-Diether-Lipide [Sprott, G.D., et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 13735-13740]. Obwohl Hydroxydietherphosphatidylserin und Hydroxydietherphosphatidyl-myoinosit bei M. barkeri gefünden wurden [Nishihara, M. und Koga, Y. (1991) Biochim. Biophys. Acta 1082: 211-217], sind die polaren Lipide der Methanosarcina-Gattungen ansonsten uncharakterisiert. Wir prasentieren hier Nachweise für zwei neue Hydroxydiether-Lipide mit Kopfgruppen von Phosphoethanolamin und Phosphoglycerin. Es werden Strukturdaten für 96 Gew.-% der Ether-Lipide von M. mazei angegeben. Die negative FAB-Massenspektroskopie ergab Vergleichsdaten bezüglich der polaren Lipide verschiedener Methanosarcina-Spezies, die auf verschiedenen Kohlenstoffquellen gezüchtet wurden, welche offenbarten, daß dieselben Lipid-Molekülionen in allen Fällen vorhanden sind.
- Die Ether-Lipidstrukturen für sowohl neutrophile als auch alkalophile Gruppen der extrem Halophilen wurde detailliert bestimmt, wie von M. Kates [in Handbook of lipid research (1990), S. 1-122 (Kates, M., Hrsg.), Plenum Press, New York und London] im Überblick dargestellt. In einem ähnlichen Überblick dargestellt sind unsere Strukturdaten hinsichtlich der Lipide von Methanococcus voltae, Methanococcus jannaschii und Methanosaeta concilii [Sprott, G.D. (1992) J. Bioenergetics and Biomembranes 24: 555-566).
- Phytanylketten von archaebakteriellen Lipiden sind mit den Glycerin-Kohlenstoffen durch Etherbindungen verknüpft. Im Gegensatz zu den Esterbindungen, welche Fettsäureketten mit den Glycerin-Kohlenstoffatomen in eukaryotischen und eubakteriellen Membran-Lipiden verknüpfen, sind diese Bindungen einem enzymatischen Angriff durch die Phospholipasen A und B nicht zugänglich [DeBose, C.D. und Roberts, M.F. (1983) J. Biol. Chem. 258: 6327-6334]. Ferner sind Phosphatesterbindungen von Ether-Phospholipiden im Gegensatz zu ähnlichen Bindungen in Ester-Phospholipiden oft gegenüber einem enzymatischen Angriff durch Phospholipase C resistent [Morii, H., et al., (1988) Agric. Biol. Chem. 52: 3149-3156; Morii, H. et al., (1986) J. Lipid Res. 27: 724-730; Burns, R.A., et al. (1981) Biochemistry 20: 5943-5950]. Wir haben gezeigt, daß archaebakterielle Ether-Lipide Liposomen bilden, welche gegenüber enzymatischem Angriff resistent sind (Tabelle 8). Der Verlust an struktureller Integrität, der bei Ester-Liposomen (DPPC und EPC) während der Inkubiation mit Phospholipasen beobachtet wird, stimmt mit früheren Berichten überein [Davies, D.E., et al. (1991) Biochim. Biophys. Acta 1084: 29-34; Fugman, D.A., et al. (1984) Biochim. Biophys. Acta 795:191-195; Rowland, R.N. und Woodley, J.F. (1980) Biochim. Biophys. Acta 620: 400-409].
- Neben enzymatischer Hydrolyse sind Esterbindungen auch einer chemischen Hydrolyse zugänglich. Im allgemeinen wird dieser Prozess bei extremen pH-Werten und mit zunehmenden Temperaturen verstärkt [Frokjaer, S., et al. (1982) in Optimization of drug delivery (Bundgaard, H., Bagger-Hansen, A. und Kofod, H., Hrsg.) Alfred Benzon Symp. 17, Munsgaard, Kopenhagen, S. 384]. Eine Hydrolyse kanh freie Fettsäuren und Lysophospholipide in Ester-Liposomen einführen, zwei Verbindungen, welche die Membran-Integrität und -Dynamik beeinflussen (Van Echteld et al., (1981)). Etherbindungen sind jedoch relativ resistent gegenüber chemischer Hydrolyse [Kates, M. (1986) in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular biology (Burdon, R.H., und van Knippenberg, P.H., Hrsg.), Band III, Teil II, Elsevier, New York, S. 123-127]. Diese Eigenschaft kann für die erhöhte Stabilität von Ether-Liposomen bei hohen Temperaturen (Tabellen 9, 10, 11) und extremen pH-Werten (Tabelle 12) teilweise verantwortlich sein.
- Die Anwesenheit von Tetraether-Lipiden ist auch ein stabilisierender Faktor von Liposomen, die bei hohen Temperaturen inkubiert werden (Tabelle II). Ring et al. (1986) zeigten auch, daß CF-beladene multilamellare Liposomen, die aus der Haupt-Lipidkomponente von Thermoplasma acidophilum, welche ein Tetraether-Monoglycosyl-Phosphoryl-Glycerin-Lipid ist, erzeugt wurden, bei hohen Temperaturen wesentlich weniger durchlässig als EPC- oder DPPC-Vesikel sind. Deshalb sollten Liposomen (uni- oder multilamellare), die aus archaebakteriellen Extrakten polarer Lipide mit hohen Tetraether-Gehalten hergestellt wurden, bei höheren Temperaturen stabiler sein als diejenigen, welche aus Extrakten ohne Tetraether hergestellt wurden.
- Es ist gut dokumentiert, daß eines der mit Ester-Liposomen verbundenen Hauptprobleme deren oxidativer Abbau ist [Konings, A.W.T. (1984) in Liposome technology (G. Gregoriadis, Hrsg.) Band I, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, S. 139-162]. Aufgrund der Anwesenheit ungesättigter Fettsäureketten, wie bei Ei-Phosphatidylcholin, findet eine Lipid-Peroxidation statt und als Ergebnis dieser Veränderungen können in wäßriger Suspension gehaltene Liposomen aggregieren, fusionieren oder ihren Inhalt durch Austritt verlieren (Lichtenberg, D., und Barenholz, Y. (1988) Methods Biochem. Anal. 33:337-462; Goldstein, I.M. und Weissmann, (1987) Biochem. Biophys. Res. Comm. 75: 604-609]. Deshalb wurde die Verwendung von archaebakteriellen Lipiden auch dieses Problem minimieren, da die Phytanylketten vollständig gesattigt sind.
- Ether-Liposomen fusionierten oder aggregierten während der Lagerung bei 4ºC über einen Zeitraum von 4 Monaten nicht (Tabelle 6). Es ist wichtig festzustellen, daß die verschiedenen Formulierungen polarer Ether-Lipide Liposomen ergaben, die bei allen untersuchten pH-Werten stabil waren. Bei Ester-Liposomen ist oft Cholesterin erforderlich, um die Stabilität zu erhöhen und deren Fusion oder Aggregation zu verhindern [Lichtenberg, D. und Barenholz, Y. (1988) Methods Biochem. Anal. 33:337-462].
- Die neue natürliche Kombination von Lipiden, welche in den aus jedem Archaebakterium extrahierten gesamten polaren Lipiden gefunden wird, stellt, ohne daß eine Reinigung individueller Lipid-Spezies erforderlich ist, eine geeignete Mischung von Ether-Lipiden bereit, um Liposomen für Stabilitätsstudien herzustellen. Die Herkunft dieser Lipid-Mischungen ist wichtig für das erhaltene Liposomen-Endprodukt. Beispielsweise variiert die Größe mit der Lipid-Formulierung ebenso wie mit der Membran-Porengröße (Tabelle 6). Auch nahm die Beständigkeit gegenüber erhöhten Temperaturen mit zunehmenden Anteilen an Tetraether-Lipiden (Tabelle 10) zu, was Anwendungsmöglichkeiten für Liposomen anzeigt, die aus den Lipiden anderer Archaebakterien, einschlieβlich Thennoplasma spp., Sulfolobus spp. und thermophiler Schwefel-abhängiger Archaebakterien [Strukturdaten im Überblick von Sprott, G.D. (1992) J. Bioenergetics and Biomembranes 24: 555-566], hergestellt werden.
- Die relativen Stabilitäten von Ester- und Ether-Liposomen, die durch Druckextrusion hergestellt worden waren, wurden verglichen. Diese Studien zeigten erhöhte Stabilitäten von Ether-Liposomen. Die Stabilität von archaebakteriellen Ether-Liposomen und deren inhärente Unempfindlichkeit gegenüber Oxidation und Esterasen machen sie zu attraktiven Kandidaten für viele Liposom-Anwendungen.
Claims (23)
1. Polyether-Lipid der Strukturformel I
worin R β-galf- bedeutet, und R α-glcp-(1-2)-β-galf- darstellt.
2. Polyether-Lipid der Strukturformel II
worin R (CH&sub3;)-NC&sub5;O&sub3;H&sub0;- oder (CH&sub3;)&sub3;-N-C&sub5;O&sub3;H&sub0;- bedeutet, und
R α-glcp-(1-2)-β-galf-, β-galf-(1-6)-β-galf- oder β-galf- darstellt.
3. Verbindung nach Anspruch 2, worin R (CH&sub3;)&sub3;-N-C&sub3;O&sub3;H&sub0;- bedeutet, und
worin R α-glcf-(1-2)-β-galf- darstellt.
4. Verbindung nach Anspruch 2, worin R (CH&sub3;)&sub3;-N-C&sub5;O&sub3;H&sub0;- bedeutet, und
worin R β-galf-(1-6)-β-galf- darstellt.
5. Verbindung nach Anspruch 2, worin R (CH&sub3;)-N-C&sub5;O&sub3;H&sub0;- bedeutet, und
worin R β-galf- darstellt.
6. Verbindung nach Anspruch 2, worin R (CH&sub3;)-N-C&sub5;O&sub3;H&sub0;- bedeutet, und
worin R α-glcp-(1-2)-β-galf- darstellt.
7. Polyether-Lipid der Strukturformel III
worin X -OH bedeutet, und worin Y Ethanolamin oder Glycerin darstellt.
8. Liposom, umfassend den Gesamtextrakt der polaren Lipide eines
Archaebakteriums.
9. Liposom nach Anspruch 8, worin das Archaebakterium ausgewählt ist aus
der Gruppe aus Methanospirillum hungatei, Methanococcus jannaschii,
Methanococcus voltae, Methanosarcina mazei, Methanobrevibacter smithii,
Methanosphaera stadtmanae, Methanobacterium espanolae, Thermoplasma
acidophilum, Natronobacterium magadii, Halobacterium cutirubrum und
Mischungen davon.
10. Liposom nach Anspruch 8, worin das Archaebakterium Methanospirillum
hungatei ist.
11. Liposom nach Anspruch 8, worin das Archaebakterium Methanosarcina
mazei ist.
12. Verfahren zur Herstellung unilamellarer Liposomen aus dem Gesamtextrakt
polarer Lipide eines Archaebakteriums, umfassend
(a) Unterwerfen von Zellen eines Archaebakteriums einer
Lösungsmittelextraktion, um eine Gesamtfraktion der polaren Lipide zu
ergeben,
(b) Zugeben eines geeigneten Detergens in einem Molverhälnis
(Detergens:Lipid) im Bereich von mindestens 10:1 bis 30:1 und
vollständiges Entfernen des Lösungsmittels durch Verdampfung,
(c) Lösen des resultierenden Detergens/Lipid-Materials in einem
geeigneten wäßrigen Dialysepuffer, um gemischte Mizellen von Lipid
und Detergens zu bilden, und
(d) Unterwerfen der gemischten Mizellen einer kontrollierten Dialyse
zur Entfernung des Detergens und Bildung der Liposomen.
13. Verfahren nach Anspruch 12, worin das Molverhältnis (Detergens:Lipid)
etwa 20:1 beträgt.
14. Verfahren nach Anspruch 13, worin das Detergens ein nicht-ionisches
Detergens ist.
15. Verfahren nach Anspruch 14, worin das Detergens
n-Octyl-β-D-glucopyranosid ist.
16. Verfahren nach Anspruch 12, umfassend den zusätzlichen Schritt der
Hitzesterilisierung der Liposomen.
17. Verfahren zur Herstellung von Liposomen aus dem Gesamtextrakt polarer
Lipide eines Archaebakteriums, umfassend
(a) Unterwerfen von Zellen eines Archaebakteriums einer Lösungs
mittelextraktion, um eine Gesamtfraktion der polaren Lipide zu
ergeben,
(b) Zugeben eines geeigneten wäßrigen Extrusionspuffers, um eine
Emulsion multilamellarer Liposomen bei einem pH-Bereich von
3,0 bis 10,7 zu bilden, und
(c) falls unilamellare Liposome erforderlich sind, Extrudieren der
Emulsion multilamellarer Liposomen bei einer Temperatur von 4 bis
80ºC unter Druck durch eine Membran ausgewählter Porengröße,
um die unilamellaren Liposomen zu bilden.
18. Verfahren nach Anspruch 17, worin die Porengröße der Membran 50 bis
400 nm beträgt.
19. Verfahren nach Anspruch 18, worin in Schritt (c) die Temperatur die
Umgebungstemperatur ist.
20. Verfahren nach Anspruch 19, worin in Schritt (b) der pH etwa 7 beträgt.
21. Verbindung nach Anspruch 2, worin R β-galf-(1-6)-β-galf- darstellt.
22. Verbindung nach Anspruch 7, worin Y Ethanolamin bedeutet.
23. Verbindung nach Anspruch 7, worin Y Glycerin darstellt.
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