JPH07500584A - 古細菌（アルキア）の脂質抽出物からの安定リポソームの形成 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 古細菌（アルキア）の脂質抽出物からの安定リポソームの形成発明の分野 本発明は新規のポリエーテル脂質、ポリエーテル脂質を含んで成るリポソーム、 及びかかるリポソームの製造方法に関する。 従来技術の説明 人工的な脂質小胞（リポソーム）は数多くの基礎及び応用研究分野における重要 な手段となっている。それらはトランスメンプラン輸送、脂質二重層透過性、膜 融合及び脂質−タンパク質相互作用のような過程の研究のための生体膜系として かなり利用されている。 それらは免疫アジュバントとして、又は薬品及びスキンケア化合物、殺虫剤、遺 伝子物質及び酵素の担体としても働きうる。 現在、リポソームはエステル−脂質、例えば卵のホスファチジルコリン（ＥＰＣ ）より作られている。かかるリポソームの固有の物理化学的不安定さがその商業 的用途への一つの主たる障害となっている。 従って、安定性を高める、気孔率を下げる及びその融合又は凝集を防ぐために、 リポソーム組成物の中にコレステロールがしばしば含まされている。更に、これ らのリポソームのエステル結合は酵素及び化学加水分解に感受性であり、このこ とはリポソーム構造の崩壊を招く。エステル脂質脂肪アシル鎖はしばしば不飽和 であり、従って大気中で酸化を受け、そしてリポソームの構造保全性は失われる 。 ２年間という実用的に所望される棚寿命は通常達しえず、従って特別なる保管条 件、例えば酸素を除去すること及び／又は温度を下げることが必要とされつる。 古細菌はその原核及び真核対応物に比して非常に異なる膜脂質構造を含んでいる 。通常は不飽和であり、且つ５ｎ−１，２炭素においてグリセロールへとエステ ル化されている脂肪アシル鎖の代りに、古細菌膜脂質は５ｎ−２，３形態を有す るグリセロール炭素に対してエーテル結合にある飽和フタニル鎖より成る。偏在 的なジエーテルＣ２゜、、。−脂質を有する他に、様々なメタン細菌はテトラエ ーテル、ヒドロキシジエーテル及び巨大環状ジエチル脂質となるように修飾され たフタニル鎖を有しうる。極性頭部基のバリエーションは数多くあり、そして各 メタン細菌属の同定のための分子性分類学的フィンガープリントを供しつる。 古細菌脂質からのリポソームの形成のい（つかの報告がある。これらのうち、あ るグループは大型リポソームの形成について報告している。即ち、Ｒｉｎｇ、　 Ｋ、ら（１９８６）　Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ　ａｓ　Ｄｒｕｇ　Ｃａｒｒｉｅｒｓ （Ｓｃｈｍｉｄｔ、　Ｋ、Ｈ，編）、頁１０１−１２３．　Ｇｅｏｒｇ　Ｔｈｉ ｅｍｅ、　Ｖｅｒｌａｇ、　Ｓｔｕｔｔｇａｒｔａｎｄ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋｏ特 に、Ｒｉｎｇらは大型の小胞（約６００ｎｍはど）を、古細菌す−モブラスマ　 アシドフィルム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）由来の 全脂質内容物から精製した単独のテトラエーテル脂質成分の制御型清浄剤透析に よって生成している。しかしながら、古細菌の全極性脂質からのリポソームの製 造にかかわる方法の利用の教示又は示唆はされていない。また、これらのリポソ ーム構造は電子顕微鏡によって調べられていない。全極性及び／又は全脂質抽出 物によるここで採用した方法を利用することにより、我々は精製脂質分子物質の 製造プロセスの費用及び難しさを排除した。 ＭａｃＤｏｎａｌｄ、　Ｒ，Ｃ，ら（１９９１）　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐ ｈｙｓ、　Ａｃｔａ　１０６　：　２９７−３０３による別の報告においては、 エステル脂質リポソームが加圧抽出によって作られている。しかしながら、古細 菌の全極性脂質抽出物からの単層リポソームの製造の教示はない。古細菌脂質構 造における固有な安定性を理由に、広範囲にわたる様々な条件、例えば気相、温 度及びｐＨにわたってリポソームを作ること力呵能である。これらのファクター は、様々な条件に対するこのようなリポソームの安定性と同様に工業用途におけ る有用性の中心である。更に、広範囲にわたる条件においてのリポソーム形成は エステル脂質については当てはまらない。 リポソームはスルホロブス　アシドカルカリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓａｃｉ ｄｏｃａｌｃａｒｉｕｓ）のエーテル脂質のサブ画分からの音波処理により作ら れている（Ｅｌｆｅｒｉｎｃｋら（１９９２）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６ ７　：　１３７５−１３８１）。 発明の概要 本発明の目的は新規なポリエーテル脂質の提供にある。 本発明の別の目的は安定性の高められたリポソームの提供にある。 本発明の更なる目的はかかるリポソームの製造に新規な処理を適用することにあ る。 本発明の一観点に従い、構造式Ｉの新規なポリエーテル脂質を提ＮｔＣ−０−１ ？。 （ここでＲ１はβ−ｇａ１．−であり、そしてＲ１はａ　−ｇｌｃ、　−（１− ２）−β−ｇａｌ、−である）。 更なる新規のポリエーテル脂質は構造式■により定義される。 （ここでＲ３は（ＣＨｓ）２Ｎ　Ｃｓ０４Ｈ＋。−又は（ＣＨ，）ｓ−Ｎ−Ｃ， Ｏ，ＨＩ。−であり、そしてＲ７はα−ｇｌｃ、　（１−２）−β−ｇａｌ＋− 又（まβ−ｇａｌｌ　（１６）−β−ｇａｌ＋−又はβ−ｇａｌ＋−である）。 構造式■の更なる新規のポリエーテル脂質も提供する。 （ここでＸはＯＨ１そしてＹはエタノールアミン又１まグリセロールである）。 本発明の別の観点に従うと、様々な古細菌の全極性脂質抽出物力）ら調製したリ ポソームを提供する。 本発明の更なる別の観点に従うと、様々な古細菌の全極性Ｂ脂質抽出物からの単 層リポソームの製造のための方法力（提供され、この方法は （ａ）古細菌の細胞を溶媒抽出に付して全極性月旨質画分を用意し、（ｂ）適当 な清浄剤を少なくとも１０：ｌから３０＝１に範囲するモル比（清浄剤；脂質） において加え、次いでエバボレーシコンにより溶媒を完全に除去し、 （Ｃ）得られる清浄剤／脂質材料を適当な水性透析用バッファーの中に溶かして 、脂質と清浄剤との複合ミセルを生成し、そして（ｄ）この複合ミセルを制御型 透析に付して清浄剤を除去してリポソームを形成させること、 を含んで成る。好ましくは、工程（ｂ）において、その清浄剤は非イオン性清浄 剤、例えばｎ−才クチル−β−Ｄ−グルコピラノシドであり、そしてそのモル比 （清浄剤：脂質）は約２０：ｌとする。 本方法の別の態様に従うと、古細菌の全極性脂質からのリポソームは、 （ａ）古細菌の細胞を溶媒抽出に付して全極性脂質画分を用意し、（ｂ）適当な 水性抽出用バッファーを加えて多重層リポソームエマルションを３．０〜１Ｏ０ ７のｐＨ範囲において生成し、次いで単層リポソームが必要ならば、 （Ｃ）この多重層リポソームエマルションを４〜８０℃の温度において、特定の 孔径の膜を通じて加圧のもとで押出して単層リポソームを生成すること、 によって供される。 好ましくは、操作のし易さのため、工程（Ｃ）において温度は周囲温度とする。 図面の簡単な説明 図１は本発明に従ってＭ、ヒュンガティ（Ｍ、　ｈｕＢａｔｅｉ）由来の新規の ポリエーテル脂質化合物の様々な構造式の例示である。 図２はＭ、ヒュンガティの全極性脂質抽出物の陰性ＦＡＢ　ＭＳ　（高速原子衝 撃質量分析法）である。 図３Ａ及びＢはＭ、マゼイ（Ｍ、　ａ＋ａｚｅｉ）由来の新規の精製脂質の陰性 ＦＡＢ　ＭＳスペクトルを示す。Ａ＝ホスファチジルグリセロール−ヒドロキシ ジエーテル、そしてＢ＝ホスファチジルエタノールアミン−ヒドロキシジエーテ ル。 図４はＭ、マゼイ由来の全極性脂質の同様のスペクトルである。 図５は様々なメタノサルシナ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）種由来の全極性 脂質抽出物の陰性ＦＡＢ　ＭＳの比較である。詳しくは、Ａ＝Ｍ、サーモフィラ （Ｍ、　ｔｈｅｒａ＋ｏｐｈｉＬａ）（酢酸増殖）、ｂ＝Ｍ、パーケリ株フサロ （Ｍ、　ｂａｒｋｅｒｉ　５ｔｒａｉｎ　ＦｕｓａｒｏＸメタノール増殖）、Ｃ ＝Ｍ、マゼイ（メタノール増殖）及びＤ＝Ｍ、アセチボランス（Ｍ、　ａｃｅｔ ｉｖｏｒａｎｓ）（メタノール増殖）である。 図６Ａ〜６Ｆは一連の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真であり、これらは様々な 古細菌の全極性脂質抽出物由来のリポソームの均質性を示している。０．７１の 寸法系数を考慮して、バーは２５０ｎｍに相当する。 （Ａ）Ｍ、　ボルタ（Ｍ、　ｖｏｌｔａｅ）　；　（Ｂ）　Ｍ、ヤナシイ（Ｍ、 　ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）（６５℃）；　（Ｃ）Ｍ、ｖゼイ；　（Ｄ）　Ｍ、　 コンシリ（Ｍ、　ｃｏｎｃｉｌｉｉ）　；（Ｅ、Ｆ）Ｍ、ヒュンガティ。 図７はＭ、ボルタのリポソームのフリーズフラクチャー調製品の７８Ｍ写真であ る。バー＝１００ｎｍ、矢印はシャドウ方向を示している。 図８は清浄剤オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＯＢＧ）を用いた、様々な 古細菌由来の、全極性脂質抽出物（Ｔ）、複合ミセル（Ｍ）及びリポソーム（Ｉ 、）の薄層クロマトグラフィーの結果を示している。 図９はＭ、ヤナシイ、Ｍ、スミシイ（Ｍ、　５ｍ１ｔｈｉｉ）　、　Ｍ、ヒュン ガティ、Ｍ、マゼイ及びＭ、ボルタ由来の全極性脂質抽出物の孔径１１００ｎの フィルターを通じての加圧押出により獲得したネガティブ染色リポソームの一連 の７８Ｍ写真である。右側パネルにおけるＭ。 ヤナシイ由来のリポソームは２００ｎｍのフィルターを通じる押出により得られ た。 好適な態様の詳細な説明 前述した通り、古細菌はリポソームの製造にとって有用な数多くの様々なポリエ ーテル脂質構造体を生産する。有用な古細菌のうちでメタノコツカス（Ｍｅｊｈ ａｎｏｃｏｃｃｕｓ）ボルタ、メタノコツカス　ヤナシイ、メタノセタ（Ｍｅｔ ｈａｎｏｓａ、ｅｔａ）コンシリ、メタノブレビバクター（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒ ｃｖｉｂａｃｔｅｒ）スミシイ、メタノスフエラ　スクツドマナ（Ｍｅｔｈａｎ ｏｓｐｈａｅｒａ　ｓｔａｄｔｍａｎａｅ）　、サーモブラスマ　アシドフィル ム、ナトロノバクテリウム　マガジイ（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍ ａｇａｄｉｉ）及びハロバクテリウム　ギュティルブルム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅ ｒｉｕｍ　ｃｕｔｉｒｕｂｒｕｍ）が選ばれ、なぜならそれらの極性脂質組成物 は互いから非常に異なるから、及びそれらが古細菌において見い出せる独立な核 脂質構造の既知のスペクトルを包括するからである（表１及び図１を参照のこと ）。また、我々は広範囲にわたる古細菌全極性脂質抽出物からのリポソームの形 成を実証する。古細菌は、低ｐ１１、高ｐＨ１高温、高塩濃度及びそれらの組合 せの様々な苛酷な条件の中で成長するものを包括することと、これらの起源から 生成されたリポソームが固有の安定性を示すであろうことを包括するように選ん だ。更に、ヒトの結腸において通常見い出せる古細菌（Ｍ、スミシイ及びＭ、ス タッドマナ）を試験し、なぜならこれらのリポソームは薬剤デリノくター系の開 発に特にかかわりつるからである。 Ｍ、ヒュンガティ及びＭ、マゼイから新規な脂質化合物が単離及び特性化された 。この新規化合物の構造は式Ｔ、ＩＦ及び■、並びに図１において示している。 材料と方法 細菌の起源及び増殖 細菌培養物はメタノスピリルム　ヒュンガティＧＰＩ　（ＮＲＣ２２１４＝ＤＳ Ｍ　１１０１）　、メタノセタ　コンシリＧＰ６　（ＮＲＣ２９８９＝ＤＳＭ　 ３６７１）、メタノコツカス　ヤナシイＪＡＬ−１（ＮＲＣ５９５２＝ＤＳＭ　 ２６６１）　、メタノコツカス　ボルタＰＳ　（ＮＰＣ２８５４）　、メタノサ ルシナ　マゼイＳ−６（ＮＲＣ６０５２＝ＤＳＭ　２０５３）　、メタノブレビ バクター　スミシイＡＬＩ（ＮＲＣ６５３９＝ＤＳＭ　２３７５）　、メタノス フエラ　スタットマナＭＣＢ−３（ＮＲＣ６５４０＝ＤＳＭ　３０９１）　、メ タノバクテリウム　エスパノラＧＰ９（ＮＲＣ５９１２＝ＤＳＭ　５９８２）　 、ナトロバクテリウム　マガジイ（ＮＲＣ６５６１＝ＡＴＣＣ４３０９９）　、 へロバクテリウム　キュティルブルム（ＮＲＣ３４００１＝ＤＳＭ　６６９）及 びサーモブラスマ　アシドフィルム１２２−ＩＢ３（ＮＲＣ６５６６＝ＡＴＣＣ ２７６５８）とした。 メタン細菌を下記の通りに嫌気的に培養した。Ｍ、ヒュンガティを、５μＭのＮ ｉＣ１ｔの添加されたＳＡ培地（Ｂｒｅｕｉｌ、　Ｃ，とＰａｔｅｌ、　Ｇ、Ｂ 。 （１９８０）　Ｃａｎ、　Ｊ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　２６　：　５７７−５８ ２　）中でＨｔ　／Ｃ０ｔ（８０：　２０、Ｖ　／　Ｖ　）の雰囲気において３ ５°Ｃで増殖させた。Ｍ、スタッドマナはメタノール（０，１％、ｖ　／　ｖ　 ）及びＨｔ　／Ｃｏｔ（８ｏ　：　２０、ｖ　／　ｖ　）に基づいて、Ｍｉｌｌ ｅｒとＷｏｌｉｎ　（Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｔ、Ｌ、とＷｏｌｉｎ、　Ｍ、Ｊ、　（ １９８５）　Ａｒｃｈ。 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１４１　：　１１６−１２２　）によりオリジナルが記 載されている培地であるが、しかしビタミン−フリーカゼイン加水分解物を１　 ｍＭｅづつのＬ−ロイシン及びＬ−イソロイシンに置き換え、且つニトリロ三酢 酸の濃度を３０ｍｇ／　ＩそしてＣａ５Ｏａ　’　５ＨｚＯ，ＨｓＢＯｘ及びＮ ａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２０の濃度を２００Ｍｇ／ｌに上げることによって改良した 培地の中で３５℃で増殖させた。Ｍ、スミシイは３５℃でＨ，／Ｃ０２（８０： 　２０、ｖ　／　ｖ　）下で、０．１％（ｗ／ｖ）のＮｌ（、ＣＩ、及びＨ３Ｃ ｏＭ、並びにＭ。 スタッドマナ培地中のように脂肪酸を含むように改良したＢａ１ｃｈ培地−１（ Ｂａｌｃｈ、　Ｗ、Ｅ、ら（１９７９）　Ｍｉｃｒｂｉｏｌ、Ｒｅｖ、　４３　 ：　２６０−２９６　）の中で増殖させた。Ｍ、コンシリは３５°ＣでＮ、下で 、酢酸培地（Ｆｅｒｒａｎｔｅ、　Ｇ、ら（１９８９）　Ｊ、ＬｉＰｉｄ　Ｒｅ ｓ、　３０　：　１６０１−１６０９　）中で増殖させた。Ｍ、ヤナシイの増殖 は５０又は６５℃のいづれかで、Ｈｔ／ＣＯ＊（８０：　２０、ｖ　／　ｖ　） 下で、　限定培地（Ｆｅｒｒａｎｔｅ、　Ｇ、ら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ、 　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　６８　：　２７４−２８３　）中で増殖させた。Ｍ、 ボルタはＨｔ　／Ｃｏ、雰囲気中で、Ｂａ１ｃｈ培地−３（Ｂａｔｃｈ、　Ｗ、 Ｂ、ら（１９７９）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｒｅｖ、　４３　：　２６０−２９６ 　）中で３５℃で増殖させた。改良Ｂａｔｃｈ−３培地（酵母抽出物及びトリプ トンは０．１ｇ／ｌのＬ−イソロイシン及び０．０５ｇ／ＩのＬ−ロイシンに置 き換えられ、ＮＨ，ＣＩ濃度は０．５４ｇ／ｌに上げ、そしてＮａＣ０＊をＮａ ）Ｉｃｅｓに置き換えである）を、メタノールのもとでＮ、下でＭ、マゼイを増 殖させるために用いた。 Ｍ、　エスパノラはＨ＊／Ｃｏｔのもとで、ｐＨ５，０で、ＳＡ培地（Ｐａｔｅ ｌ。 Ｇ、　Ｂ、ら（１９９０）　Ｉｎｔ、Ｊ、５ｙｓｔ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　４ ０　：　１２−１８　）中で増殖させた。 Ｈ，キュティルブルムは３５℃で限定培地（ＧｒｅｙとＦｉｔｔ、　１９７６） 中で好気的に増殖させた。Ｎ、マガディは３７℃でｐＨ９，０で培地＃１５９０ （ＡＴＣＣカタログ１９８９）中で好気的に増殖させた。Ｔ、アシドフィルムは ｐＨ２，０及び５５℃で、１９８９　ＤＳＭの培地＃１５８（微生物及び細胞培 養物のドイツ国寄託機関）（ただし酵母抽出物の濃度は０．２％（Ｗ／Ｖ）まで 高めである）の中で好気的に増殖させた。 脂質回収のための大量培養は７５ＬのＣｈｅｍａｐ　ＡＧ発酵槽の中で、５５Ｌ の新鮮培地中で行った。メタン細菌培地をシスティン−硫化ナトリウム（Ｈｕｎ ｇａｔｅ、　Ｒ，Ｅ、　（１９５０）　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、Ｒｅｖ、　１４　 ：　１−４９）で還元した。溶解スルフィドは水性ＮａｔＳの添加により０．１ ｍＭに維持した。 極好塩菌に２６Ｌ／ｍｉｎの空気を供給し、そして増殖中を、１５０ｒｐｍで撹 拌した。中から後対数増殖期にかけて細胞を集め、そして脂質抽出までペースト として一２０°Ｃで保存しておいた。 脂質抽出及び精製 全極性脂質抽出物。細胞を融解し、次いでクロロホルム／メタノール／水（２５ ０ｍｌ　：　５００ｍ１　：　２００ｍ１）中で２３℃で一夜混合した。細胞塊 を遠心により除去し、そして更に上記の通りに２回抽出を行った。 抽出物をプールし、次いで脂質をクロロホルム相から記載の通り（Ｂｌｉｇｈ、 　Ｅ、Ｇ、とＤｙｅｒ、　Ｗ、Ｊ、（１９５９）　Ｃａｎ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ 、Ｐｈｙｓｉｏｌ、　３７：９１１−９１７）に回収した。このクロロホルム相 をロータリーエバポレーションにより約５０ｍ１に濃縮し、そして抽出を繰り返 した。 極性脂質は、全脂質画分をクロロホルム／メタノール（２：ｌ、Ｖ　／　Ｖ　） の中に溶かし、次いで２０容量の冷アセトンで沈殿させることによって回収した （Ｆｅｒｒａｎｔｅ、　Ｇ、ら（１９９０）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｃｅ１１．Ｂｉ ｏｌ。 ６８　：　２７４−２８３　）。リポソーム調製において利用するための脂質サ ンプルを更に２回沈殿させ、そしてその脂質をクロロホルム／メタノール（２： 　１．ｖ／ｖ）の中に再溶解させ、更にシリカＧカラム（２ｘ　５　ｃｍ）で精 製した。２　：　１　（ｖ／ｖ）のクロロホルム／メタノール１２５ｍ１、それ に続＜　１　：　２　（ｖ／ｖ）のクロロホルム／メタノール１２５ｍ１により 溶離させた脂質をロータリーエバポレーションにより濃縮した。 脂質の精製。構造の特性化のため、エーテル脂質をＭ、ヒュンガティ及びＭ、マ ゼイ極性脂質抽出物から、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）　（Ｆｅｒｒａｎ ｔｅ、　Ｇ、ら（１９８７）　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ 　９２１　：　２８１−２９１〕を用いて精製した。純度は薄層クロマトグラフ ィー、質量スペクトル及び”ＣＮＭＲスペクトルより確認した。 ＴＬＣプレート上の脂質をｖｉｃ−グリコール、ホスファチド、炭水化物及びア ミン基について染色した（Ｆｅｒｒａｎｔｅ、　Ｇ、ら１９８７）。 極性頭部基を０．１８％のメタノール性ＨＣＩ加水分解により除去し、そして遊 離したコア脂質をＴＬＣにより精製したＣ３ｐｒｏｔｔ、　Ｇ、Ｄ、ら（１９９ ０）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６５　：　１３７２５−１３７４０　）。 リン酸はＡ１１ｅｎに従い（Ａｌｉｅｎ、　Ｒ，Ｌ、Ｊ、　（１９４０）　Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、Ｊ、　３４：８５８−８６５）　、そして％Ｃ／Ｈ／Ｎは元素分析 により測定した。 物理的方法。化学電離（Ｃ１）及びＦＡＢ質量スペクトルは、ＪＥＯＬ（ＪＭＳ −ＡＸ５０５Ｈ）装置により行った。クロロホルムの中に溶かした脂質の旋光測 定値はＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　２４３ボラリメーターにより室温で得た。　 ”ＣＮＭＲスペクトルは１２５Ｍ）ｌｚで、室温で、ＡＭ５００スベクトロメー ターヲ用いて、コア脂質についてはＣＤＣ１ｍ溶液の中に、極性脂質については ベンゼン−ｄ６−メタノール−ｄ４　（７：Ｌ　ｖ／ｖ）の中に脂質を溶かして 行った。 清浄剤透析によるリポソーム形成 脂質／清浄剤の複合ミセル形成。極性脂質（４０＋ｎｇ）及びｎ−才クチル−β −Ｄ−グルコピラノシド（ＯＢＧ）をＣＨＣＩｇ　（２ｍｌ）の中に溶かした。 極性脂質抽出物については１０００の平均分子量であると仮定して清浄剤を２０ ：１のモル比（ＯＢＧ　：脂質）において加えた（Ｆｅｒｒａｎｔｅ。 Ｇ、ら（１９９０）　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　６８　：　２７ ４−２８３　）　。この脂質／清浄剤溶液をＮ１のもとで乾くまでエバボレート に付く、次いで真空に一装置いて微量のＣＨＣｌ　１全てを除去した。複合ミセ ルは膠質／清浄剤材料を３ｍｌの透析バッファー（１０ｍＭのに一リン酸ツク・ ノファー（ｐＨ７，１４）　；　１６０ｍＭのＮａＣ１含有〕の中に溶かすこと により形成させた。微量の未溶解材料は０．２２μｍのナイロンフィルターを介 する濾過により除去した。 リポソーム形成。リポソームは室温で、複合ミセルについては０、５ｍｌ／ｍｉ ｎ　、そして透析バッファーについては２．５ｍｌ／ｗｉｎの流速で４ｈ作動さ せたＬｉｐｏｓｏｍａｔ　（Ａｖｅｓｔｉｎ　Ｉｎｃ、　Ｏｔｔａｗａ、　Ｃａ ｎａｄａ）での脂質／清浄剤複合ミセルの制御透析により形成させた。 内部容量の決定。内部容量はマーカー（■ＣＣＵ））スクロース（ＮＥＮ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、　０ｎｔａｒｉ ｏ、　Ｃａｎａｄａ）により決定した。複合ミセル及びリポソームを０．３ａ＋ Ｃｉ／　１の（”Ｃ）スクロースを含む透析バッファーで形成させた。従って、 リポソームの内側に捕捉された［”Ｃ）スクロースの濃度は小胞の外部と同じと なる。（”Ｃ）スクロースの比活性（４゜２ｍＣｉ　／　ｍｍｏ　Ｉ　）を、小 胞内の水性区画を計算するために利用し、そしてこれらは遊離（１４Ｃ）スクロ ースの除去を経た極性脂質のｍｇ当りの水性捕捉容量μｍとして表わす。 捕捉スクロースからの遊離スクロースの分離はＮｅｗにより述べられているマイ クロカラム遠心法（Ｎｅｗ、　Ｒ，Ｃ，Ｃ，（１９９０）　Ｌｉｐｏｓｏｏ＋ｅ ｓ。 Ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ、頁１０５−１６２．　ＩＲＬ　Ｐ ｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ）を利用して５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０（中）カラ ムで行った。 薄層クロマトグラフィー。極性脂質をクロロホルム／メタノール／酢酸／水（８ ５：　２２．５　：　１０　：　４、ｖ　／　ｖ　）において、シリカゲルＧプ レート（０，２５ｍｍ）で分離させ、そしてこのプレートに硫酸セシウム／モリ ブデン酸アンモニウム試薬（ＩｇのＨ＊（ＣｅＳＯａ）４／　２．５ｇの（ＮＨ ４）ｓＭｏｔＯｔｔ　’　４　ＨｔＯ／ｌ０ｍ１のＨ＊ＳＯａ／　９０ｍ１のＨ ２Ｏ）を吹き付け、続いて１００°Ｃで熱することにより識別化させた（Ｒｏｓ ｓ、　Ｎ、Ｗ、ら（１９９１）ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｌｅｔｔ、　 ８１　：　２５７−２６７　）。 共にＣＨＣｌ５／Ｃ１（ＩＯＨ（２：　Ｉ、ｖ　／　ｖ　）中の極性脂質及びミ セル抽出物をＴＣＬプレートに直接付加し、一方、リポソーム懸濁物のサンプル （５ｍｇ）はＮ、下で乾かし、次いでＣＨＣｌ５Ｃ１（ＩＯＨ（２：Ｌ　Ｖ／　 Ｖ　）に溶かしてからプレートに付加した。 加圧押出によるリポソーム形成 リポソームをＭａｃＤｏｎａｌら（Ｍａｃｄｏｎａｌｄ、　Ｒ，Ｃ，ら（１９９ １）　Ｂｉｏｃｈｉｍ。 Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　１０６　：　２９７−３０３　）に従い、Ｌｉｐ ｏｓｏＦａｓｔ　（Ａｖｅｓｔｉｎ、Ｉｎｃ、。 Ｏｔｔａｗａ　０ｎｔａｒｉｏ、　Ｃａｎａｄａ）を利用して加圧押出により形 成させた。 何らかのことわりのない限り、脂質を押出バッファー（１０ｍＭのに一リン酸バ フ　７　ｙ　（ｐＨ７，１４）及び１６０ａ＋Ｍｃ７）ＮａＣ１）　（７）中テ ２０ａ＋ｇ／ａ＋１ｃ７）最終濃度において均質化させた（２ｍｌサイズのＰｏ ｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ組織破砕機（Ｆｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔ由ｃ）　 ）　ｏ得られる多重層リポソームを５０、１００．２００又は４００ｎｍのいづ れかの孔径の２枚（重なった）ポリカーボネート”）　４　ル９−　（径１９ｍ ＋ａ）　１．：２１回通した。ＤＰＰＣ小胞（５０”Ｃ）を除き、そして何らか のことわりのない限り、リポソームの通常室温で形成させた。 リポソーム形成に及ぼすｐＨの影響を調べるため、２５ｍＭのクエン酸／リン酸 （ｐｌ（３，０）又はに−リン酸（１）Ｈ７，１４）又は炭酸／重炭酸（ｐＨ１ ０，７）バッファーであって１６０ｍＭのＮａＣ１を含むものを使用した。 孔径１００止のフィルターを押出のために用いた。 ５（６）−カルボキシフルオロセイン（ＣＦ）及び（”Ｃ）スクロースの封入の ため、これらを押出バッファーにそれぞれ１００ａ＋Ｍ及び１５０ｍＭ　（３３ ｎＣｉ／　μｌｌ１ｏｌｅ）の濃度で加えた。その濃度ではＣＦは自己消失性で あり、従って発光しないが、しかしそれが漏出すると、それは希釈され、そして 蛍光が検出可能となる。捕捉物質からの遊離物質の分離は、Ｎｅｗにより述べら れているマイクロカラム遠心法（Ｎｅｗ、　Ｒ，Ｃ，Ｃ，（１９９０）　Ｌｉｐ ｏｓｏｍｅｓ、　Ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ、頁１０５−１６ ２、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ）を利用して５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ −５０（中）カラムで行った。 リポソームの特性化 サイズの決定。小胞調製品の平均径及び数重量サイズ分布をＮＩＣＯＭＰサブミ クロン粒子サイザー、モデル３７０　（Ｎｉｃｏｍｐ、　５ａｎｔａ　Ｂａｒｂ ａｒａ。 Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、　ＵＳＡ）を用いて動的光散乱（ＤＬＳ）により、及び ネガティブ染色調製品（Ｎｅｗ、　Ｒ，Ｃ，Ｃ，（１９９０））の電子顕微鏡写 真からの直接測定により決定した。 ネガティブ染色は、Ｆｏｒｍｖａｒカーボンコート化銅製グリッド（２００メツ シユ）及び１％のナトリウムホスホタングステート（ｐＨ７，２）の溶液を用い て調製した。リポソームのより良い分散のため、サンプル付加の前にグリッドを バシトラシン（０，１ｍｇ／　ｍｌ）　（Ｇｒｅｇｏｒｙ。 Ｄ、　Ｗ、とＰｉｒｉｅ、　Ｂ、Ｊ、Ｓ、　（１９７３）　Ｊ、Ｍｉｃｒｏｓｃ ｏｐｙ　９９　：　２６１−２６５　〕により２分間処理しておいた。希釈剤と してホスホタングステートを用いての一滴の適当なリポソーム希釈物（１０−’ から１０−”）をグリッドの上に５分載せておき、そして余計な染料を濾紙でぬ ぐい取った。このグリッドをＳｉｅｍｅｎｓ　１０１透過型電子顕微鏡で６０ｋ Ｖにて観察した。 リポソームの平坦化のため、測定されたディスクの径に０．７１を乗して、本来 のリポソームの径に近づけた（Ｎｅｗ、　Ｒ，Ｃ，Ｃ，（１９９０））。 層状性。リポソームの層状性をフリーズフラクチャリングにより調べた。リポソ ームを２００．０００　Ｘ　ｇｍａｘで５時間遠心し、次いでそのベレットを金 フリーズーエツチングブランケットの中で分散させた。 それを液体窒素の温度に保ったプロパンの中に突っ込むことによって凍結させた 。凍結材料を、エバポレーション源としての電子ガンの付いたＢａ１ｚｅｒｓ　 ＢＡ　３６０フリーズエツチヤーの中て割断及びエツチングに付した（３０Ｓの エツチング時間）。プラチナ−カーボンレプリカを濃硫酸、５％（ｗ／ｖ）の次 亜塩素酸ナトリウム及び蒸留水中での処理によりリポソーム片を除去した。その レプリカを４００メツシユの鋼製グリッドの上に載せ、そしてコールドフィンガ ーをその場に置き、標準条件のもとて６０ｋＶて作動しているｐｈｉｌｉｐｓ　 ＥＭ　３００て見た。 安定性試験：ホスホリパーゼ。リポソームに及ぼすホスホリパーゼＡ、、Ｂ及び Ｃの活性を蛍光スペクトロスコピーによりモニターした（Ｎｅｗ、　Ｒ，Ｃ，Ｃ ，（１９９０））　、その反応混合物は５（６）−カルボキシフルオロセイン（ ＣＦ）−付加リポソームと、５０ｍＭの炭酸／重炭酸バッファー（ｐＨ８，９） 中の５０単位のホスホリパーゼＡ４、又は５０ＩｎＭのＮａ−リン酸バッファー （ｐＨ８，２）中のＩＯ単位のホスホリパーゼＢ、又は５０ｍＭのＮａ−リン酸 バッフｙ　（ＩＩ８７．１９）中のｌθ単位のホスホリパーゼＣとを含む。その 混合物を３７℃でインキュベー＋−Ｌ、そしてＣＦの放出を蛍光の増強として追 った。 安定性試験：温度。様々なインキュベーション温度での捕捉ＣＦの放出を蛍光顕 微鏡で追った。１０ｍＭのに一すン酸／　１６０ｍＭのＮａＣｌバッファー中に 再懸濁されたＣＦ−付加リポソームを４．２３．３５．５０及び６５℃でインキ ュベートし、次いで蛍光を様々な時間間隔で測定した。 これらのアッセイにおいて用いたＣＦ付加リポソームの量は、０．２％のトリト ンＸ−１００により溶解に基づ＜１００％のＣＦ放出が２０μＭのＣＦに相当す る蛍光をもたらすような量とした。蛍光は、　Ｆａｒｒａｎｄスペクトロフルオ ロメーターＭＫ　−１（Ｆａｒｒａｎｄ　０ｐｔｉｅａｌ　Ｃｏ、、　Ｉｎｃ、 。 Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）により、４７０ｎｍの励起波長及び５２０ｎｍの発光波長に 設定してモニターした。 安定性試験：　Ｃ”Ｃ）スクロースの漏出。保存の際の捕捉（”Ｃ）スクロース の漏出を、リポソームに一体化している残留％放射活性を決定することによりモ ニターした。リポソーム懸濁物のアリコー１−　（５０μｌ）中の遊離（”Ｃ） スクロースを前述の通りに捕捉（”Ｃ）スクロースから分け、そして得られたリ ポソームの放射活性をＬＫＢ　Ｗａｌｌａｃ　（モデル１２１７　Ｒａｃｋｂｅ ｔａ）液体シンチレーションカウンターの中で計測した。（１００％と考える） 捕捉の度合いはリポソームの形成後数分以内に決定した。 安定性試験：小胞サイズ。調製したリポソームの安定性、即ち、融合及び凝集性 をＤＬＳにより定期的にモニターした（Ｆｒｏｋｊａｅｒ、　Ｓ。 ら（１９８４）　Ｌｉｐｏｓｏｍｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　（Ｇｒｅｇｏｒｉ ａｄｉｓ、　Ｇ、編）第１巻、頁２３５−２４５．　ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　Ｉｎ ｃ、、　Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ、　Ｆｌｏｒｉｄａ）。 結果 脂質構造 メタノスピリルム　ヒュンガティ。従来研究において特性化されていないエーテ ル脂質Ｗ質（Ｋｕｓｈｗａｈａ、　Ｓ、Ｃ，、ら（１９８１）　Ｂｉｏｃｈｉｍ 、Ｂｉｏｐｈｙｓ。 Ａｃｔａ　６６４　：　１５６−１７３　；　Ｆｅｒｒａｎｔｅ、　Ｇ、ら（１ ９８７）　Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。 Ａｃｔａ　９２１　：　２８１−２９１　）をＭ、ヒュンガティから精製し、そ して構造的に新規であることが見い出された（図１）。溶媒としてクロロホルム ／メタノール／酢酸／水（８５：　２２．５　：　１０　：　４、ｖ　／　ｖ　 ）を用いてＴＬＣで分離した精製脂質についてのＲ，値及び染色反応を表２に示 す。染色反応は従来データーと、並びに新たな構造ＰＧＬ−ＩＩＩからＰＧＬ− ■及びＴＧＴ−１と一致した。ＰＧＬ−ＩＩＩからＰＧＬ−ＶＩはホスホグリコ リピッドであり、ＰＧＬ−ＩＩ及び■（典型的にはＮ、　Ｎ、　Ｎ−トリメチル 基）については強方な陽性ドラゲンドルフ反応が示され、そしてＰＧＬ−Ｖ及び ＰＧＬ−ＶＩの場合（典型的にはＮ、　Ｎ−ジメチル基）は弱い陽性ドラゲンド ルフ反応が示された。 表２０Ｍ、ヒュンガティ由来のエーテル脂質の相対的な潤沢及び成分　ｗｔ　（ ％）’Ｒ，値　リン酸　糖　ｖｉｅ−グリ　ドラゲンコール　ドルフ ＰＧＬ−に２３．７　０．１４　＋＋＋＋　＋十−ＰＧＬ−１［３，９０，１８ ＋十＋十＋十　±ＰＧＬ−ＩＩ［１，４０，０７＋＋＋＋　＋＋　＋＋ＰＧＬ− ＩＶ　Ｏ，５０，０９＋＋＋＋　＋＋　＋＋ＰＧＬ−Ｖ　＜０．５　０．３３　 ＋＋　＋＋＋＋　＋ＰＧＬ−ＶＩ　Ｏ，７０，１４＋＋　＋＋　＋＋　±ＰＧＬ −■　２．４　０．１８　決定せずＴＧＴ　−１＜ｏ、５　、　０．３５　決定 せずＤＧＤ−１３２，２０，５３−＋＋　＋＋　−ＤＧＴ−１１２，５０，６１ −＋＋　＋＋　−ＤＧＤ−ＩＩ　２．０　０．６５−＋＋　＋＋　−ＤＧＴ−Ｉ Ｉ　Ｏ，９０，７０−＋＋　＋＋　−ＰＰＤＡＤ　９．７　０．５１　＋＋−＋ ＋　＋ａ　精製後に回収された全脂質のうちの重量％を示す。 ｂ　単離脂質について決定した染色反応。士、未確定反応。 糖脂質１．　ＩＩ及び■について示している分析データーは推定構造おいて検定 したが（Ｆｅｒｒａｎｔｅ、　Ｇら（１９８７）　）　、Ｌかし陽性ＦＡＢ　Ｍ Ｓ及びＮＭＲ分析の両方において容易に同定される。 表３．ホスホグリコリピッドＩ、　ＩＩＩ及び■についての分析データーＣ６８ ，０３６８，１７６７，５６６７，６６６４，９８６７，６６Ｈ１１，１６１１ ，７０！１．１５　１１．２２　１０．６６　１１．２２Ｐ　１．７９　＋、７ ４　１，６２　１．６５　１，６０　１．６５Ｎ　−−０，７２０，７５０，７ ７０，７５ａ　陰性−ＦＡＢ　ＭＳ ｂ　メチル基の欠失 Ｍ、ヒュンガティの全極性膠質の陰性ＦＡＢ　ＭＳはホスファチジルジエーテル （７３１，７）及びホスファチジルテトラエーテル（１３７９，８）フラグメン トを示した（図２）。リン酸成分を欠く脂質がこの方法により低感度で検出され たが、にもかかわらず精製脂質の構造に対応するシグナルが認められうる。計算 値はその構造と一致し、そしてそれらはＰＰＤＡＰ（Ｍ＝８９２）、ＰＰＴＡＤ （Ｍ−１５＝８９２）、ＤＧＤ−１及びＤＧＤ−Ｉｆ　（Ｍ−１＝９７５）、Ｐ ＧＬ−Ｖ　（Ｍ＝１７０３）、　ＰＧＬ−１及びＰＧＬ−ｎ　（Ｍ＝１７７８） 、　ＴＧＴ−１（Ｍ−１＝１７８６）、　ＰＧＬ−ＩＩＩ及びＩＶ　（Ｍ−１５ ＝１８６５）　、並びにＰＧＬ−ＶＴ及び■（Ｍ＝１８６５）である。８０４． ９での大きなシグナルはハロバクテリウム　キュティルブルム（Ｋａｔｅｓ。 Ｍ、　（１９７８）　Ｐｒｏｇ、Ｃｈｅｍ、Ｆａｔｓ　ａｔｈｅｒ　Ｉ、１ｐｉ ｄｓ　１５　：　３０１−３４２　）において見い出せるＰＧと同じ構造のホス ファチジルグリセロールジエーテル（理論値Ｍ　＝　８０５）を示唆する。 フタニル鎖の全てのＩ″ＣＮＭＲシグナルはＣ１゜４゜−テトラエーテル又はＣ ｔｏ、ｔｏ−ジエーテル脂質（Ｅｋｉｅｌ、　１．ら（１９８３）　Ｊ、Ｂａｃ ｔｅｒｉｏｌ。 １５６　：　３１６−３２６　；　５ｐｒｏｔｔ、　Ｇ、Ｄ、、ら（１９９０） 　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６５：１３７３５−１３７４０）と一致した。 更に、頭部基の除去を経た脂質コアはＭ、ヒュンガティから調製した対照Ｃ４０ ，。−テトラエーテル標準品（Ｋｕｓｈｗａｈａ、　Ｓ、Ｃ，ら（＋９８１）　 ）及びハロバクテリウム　キュティルブルム由来のＣ１゜、、。−ジエーテル（ Ｋａｔｅｓ、　Ｍ、　１９７８）と同一のＴＬＣ上での挙動性を有す。 頭部基構造の同定は二次元ホモ−及びヘテロ−核ＮＭＲ（ＣＯＳＹ。 ＲＥＬＡＹ　Ｃ０５Ｙ及びＩ（ＭＱＣ＝ヘテロ核多重嚢多重量子干渉実験用して 行った。この研究に関する新規構造についての、及び従来の研究（Ｋｕｓｈｗａ ｈａ、　Ｓ、Ｃ，ら（１９８１）　Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｂｙｓ、Ａｃｔａ 　６６４　：　１５６−１７３　；及びＦｅｒｒａｎｔｅ、　Ｇ、ら（１９８８ ）　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　９６３　：　１６２−１７ ２）において完全に特性化されていないものについての認められた１３ＣＮＭＲ シグナルを表４Ａ及び４Ｂに示す。　”ＮＭＲシグナルは、はとんどの脂質が１ 個の頭部基（Ｒ３）として三糖類（α−ｇｌｃ、−（１−２）−β−ｇａｌ、又 はβ−ｇａｌｒ　−（１−６）−β−ｇａｌ＋）を有していることを示した。テ トラエーテルにおける５ｎ−１’に結合した第二頭部基はもっと多彩であり、い づれかが炭水化物となっている（ＴＧＴ−夏においてはβ−ｇａｌ、、ＰＧＬ− Ｖ、ＰＧＬ−Ｖｌ、ＰＧＬ−■においてはホスファチジル−Ｎ、　Ｎ−ジメチル アミノペンタンテトロル、ＰＧＬ−Ｉ［［及びＰＧＬ−ＩＶにおいてはＮ、　Ｎ 、　Ｎ−）ジメチル；又はＰＧＬ−１においてはグリセロール）。一部のテトラ エーテルは一個の頭部基しか有さず、これはグリセロールのｓｎ　−１炭素のう ちの一個の特徴的な”ＣＮＭＲ化学シフトにより明確に裏付けられている（表４ Ａ及び４Ｂ）。 表４Ａ、Ｒ＊がａ　−ｇｌｃ、　−（１−２）−β−ｇａｌｔであるＭ　ヒュン ガティ由来の脂質１についての”ＣＦＪＩＲ＃シフト基　炭素数　■コーＩ　Ｄ ＧＴ−Ｉ　Ｋ先−■　限−■　卯−■　ππ−１宰、△　これらのシグナルの表 示はあべごべでありうる。 Ｉ　ＤＧＤ、ジグリコシルジエーテル；■「、ジグリコシルテトラエーテル；Ｐ Ｌｆｌホスホグリコリピッド　；π丁、トリグリコジルテトラエーテル表４８． Ｒ１がβ−ｇａｉ＋　−（１−６）−β−ｇａｌｔ又はβ−ｇａｌｔであるＭ、 ヒュンガティ由来の脂質についての”ＣＦＭＲ（Ｉｆｆシフト基　炭素数　ＤＧ Ｄ−ＩＦ　ＤＧＴ−［Ｆｕ−ＩＶ　ＰＧＬ−Ｖ　ＰＧＬ−ＶＩＥネ、Δ　これら のシグナルの表示はあべこべでありうる。 ｂｒ、広域シグナル メタノサルシナ種。脂質はＭ、マゼイの細胞乾燥重量の３．８％を占め、そして ９０．２％の極性脂質より成る。薄層プレートでの分離に基づいて９つのエーテ ル脂質が明らかとなり、更にＲ，＜０．２３の若干量の４種が、そしてＭＳ分析 によって微量のいくつかが発見された。 精製は極性画分の９７〜９８％を全体的に占める８種のエーテル脂質について行 った。各精製脂質は７４７又は７３１において主要画分を有しており、フタニル 鎖上にヒドロキシルを有するか有さないホスファチジルジエーテル脂質が示唆さ れる。脂質コアの更なる特性化は全極性脂質の加水分解及び精製を経て行った。 これらのコアは＋３７及び＋５５の旋光度、並びにヒドロキシジエーテル及び標 準ジエーテル脂質それぞれの５ｎ−２，３形態についてまさに報告されているシ グナル（Ｓｐｒｏｔｔ、　Ｇ、Ｄ、ら（１９９０）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 　２６５　：　１３７３５−１３７４０　）を有する”ＣＮＭＲスペクトルを有 していた。先のシグナル表示を参照することにより、ＮＭＲスペクトルは、ヒド ロキシル基がＭ、バーケリについて見い出せる通り（Ｓｐｒｏｔｔ、Ｇ、Ｄら（ １９９０）　）　Ｓｎ−２フタニル鎖のＣ−３に連結していることが包括的に樹 立される。 陰性及び陽性ＦＡＢ　ＭＳ分析は弐■に関する構造を示唆する。代表的なスペク トルを、精製ホスファチジルグリセロール−ヒドロキシジエーテル及びホスファ チジルエタノールアミン−ヒドロキシジエーテルについて（図４）、並びにＭ、 マゼイの全極性脂質について（図５）示す。　”ＣＮＭＲスペクトルは、イソシ トール、セリン、エタノールアミン及びグリセロール頭部基の特徴的なシグナル が存在していることを実証した。ある精製脂質は８０４．９の分子量を有し、ホ スファチジルヒドロキシグリシン−又はホスファチジルグリセロール−ジエーテ ルのいづれかであることを裏付けしている。 全極性脂質抽出物の陰性ＦＡＢ　ＭＳはその他のメタノサルシナ種の脂質成分と 関連する比較を可能にした（図５）。全てのケースにおいて、同一の脂質分子が 存在しているが、しかしながらエーテル脂質はそれぞれの種において異なる相対 量で存在していた。 安定性。全てのエーテル脂質の精製及び保存は大気中で行った。 大気中での少なくとも１年間の保存にわたり（アッセイした最長期間）どのエー テル脂質に関しても不安定さは認められなかった。 清浄剤透析により調製したリポソーム 平均サイズ及びサイズ分布。試験した５種のメタン細菌（図６）のうちの４種の 全極性脂質抽出物において、良好なサイズ均一性のリポソームを形成するのに制 御型清浄剤透析が有効に利用でき、その例外はＭ、ヒュンガティ　リポソームで あった（下記参照のこと）。 種々のリポソーム調製品の動的光散乱（ＤＬＳ）分析は０．２〜０．５のサイズ 分布の変動係数をもたらした（表５）；最も狭い分布はＭ、ヤナシイ　リポソー ムにより得られ、続いて小さい順にＭ、ボルタ、Ｍ、マゼイ、そしてＭ、コンシ リのそれであった。ＤＬＳ分析は数−重量径分布として小胞−粒子モードで行い 、その理由はそれらのデーターは顕微鏡調査より計算したサイズ及び標準偏差と よく一致するからである。容量−重量分布は常に大きめの径予測値をもたらす（ ２０から８０％）。ＤＬＳにより観察された均一性の相違を、ネガティブ染色リ ボ゛バームの電子顕微鏡写真により確認した（図６及び表５）。 重要なことには、サイズ分布は同じ脂質抽出物から作った別のリポソーム調製品 について非常に再現性があることにある（即ち、１０％以内）。 光学顕微鏡で容易に観察される大型粒子（＞１μｍ）が透析後のＭ、コンシリの リポソーム懸濁物の中に存在していた。電子顕微鏡観察により、それらは様々な サイズのリポソームの凝集体であることが明らかにされた。数−重量ＤＬＳデー ターは、予想通り０．２２μｍのナイロンフィルターを介するそれらの粒子の除 去がその集団の平均径及びサイズ分布に影響を及ぼさないことを示し、その理由 はそれらはリポソーム集団のほんの一部しか占めないからである。事実、小型の より多くのリポソームと比較して、それらは電子顕微鏡により少ないことが判明 された。この大型の小胞の少集団を除去すると、かなり均質な小リポソームの懸 濁物が残った（図６Ｄ）。 Ｍ、ヒュンガティの全極性脂質により得られたリポソーム集団ははるかに均質で あった。電子顕微鏡によるリポソームのサイズ分けは、下記の分布を示した（図 ６　Ｅ）　：　２２０−１Ｏ０ｎの径を有するリポソーム４０％、　１００〜２ ００ｎｍのもの１６％、２００〜３００ｎｍのもの１６％、及び３００〜＋００ ００ｍの残りのもの２８％。電子顕微鏡写真領域の一部は良好なサイズ分布を示 した（図６Ｆ）。繰り返すが、大型リポソームは濾過によって、より均一な小さ めのサイズのリポソームから分別できつる。 リポソームの平均サイズは脂質の起源に依存して変わる（表５）。 ！００ｎｍより小さい平均径を有する単層リポソームがＭ、ボルタ、Ｍ。 マゼイ、Ｍ、コンシリ又はＭ、ヤナシイ（５０″Ｃで増殖）の脂質抽出物が得ら れ、一方、大きめの（＞　１１００ｎ＞単層リポソームが６５°Ｃで増殖させた Ｍ、ヤナシイの脂質抽出物が得られた。 ６５°Ｃで増殖させたＭ、ヤナシイ、及びＭ、ヒュンガティに由来するテトラエ ーテル脂質を含む２ｍ類の抽出物が大きめのリポソームをもたらした。抽出物中 のテトラエーテル脂質の存在がこのような大きめの小胞の原因であるかを決定す るため、５０”Ｃ及び６５°Ｃで増殖させたＭ、ヤナシイの全膠質抽出物がらり ボソームを調製した。 ５ｐｒｏｔｔらＣ３ｐｒｏｔｔ、　Ｇ、Ｄ、ら（１９９＋）　、１．Ｂａｃｔｅ ｒｉｏｌ、１７３　：　３９０７−３９１０　）は、５０℃で増殖させたＭ、ヤ ナシイが、６５°Ｃて増殖させた細胞よりも、高めの比率のジエーテル脂質並び に少なめのテトラエーテル及び巨大環状ジエーテルを含むことを示した（表１） 。予測通り、５゜°Ｃて増殖させたＭ、ヤナシイより獲得した脂質は一貫して６ ５°Ｃて増殖させたＭ、ヤナシイの脂質より得られたリポソームよりも小さいリ ポソームをもたらした（表５）。 古細菌リポソームの完全性。様々なメタン細菌より得た極性脂質抽出物か実際に 密閉の完全小胞を形成するかを樹立するため、［１４Ｃ］　スクロースによる捕 捉実験を行った。これらの実験より、種々のリポソームの内部容量が得られた（ 表５）。サイズと内部容量との間には絶対的な関係はな（、そしてこれはおそら く抽出物の脂質組成における相違に基づく。 ４°Ｃて２週間のインキュベーションの後、マーカーの少なくとも９２％かリポ ソームの中に存在していた。リポソームを０．２％のトリ）−ンＸ−１００で溶 解させると１００％のラベルが放出されたが、空のリポソームと［”Ｃ］スクロ ース（０，３ｍＣ１／　Ｌ　）とのインキュベーション（４時間）はリポソーム に一体化した放射活性の上昇を示さなかった。それらの結果は、　［”Ｃ］スク ロースが封入されており、そしてリポソームが密閉小胞であることを確証せしめ た。 リポソームの層状性。Ｍ、ヤナシイ、Ｍ、ボルタ、Ｍ、マゼイ及びＭ、コンシリ 由来のリポソーム（濾過）のフリーズーフラクチャーは、それらが疎水性割断面 （凸及び凹共に）が滑らがである比較的均質な小胞であることを示した（図７が 代表）。多重の割断面は全く認められず、このことはこれらのリポソームの単層 状態を確証せしめる。フリーズーフラクチャーとネガティブ染色とのリポソーム 径の比較は、ネガティブ染色由来のそれが若干大きいことを示し、そしてそれら が凍結調製物に比して若干平坦となっている（且つ人工的に膨張されている）こ とを示唆する。従って、ネガティブ染色リポソームの径を算定するときは０．７ １のサイズ補正係数を利用した［Ｎｅｗ、　Ｒ，Ｃ，Ｃ，（１９９０）　Ｒ，Ｃ ，Ｃ，Ｎｅｗ　（編）　Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ、　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐ ｒｏａｃｈ、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ］。Ｍ、ヒュンガティのリポ ソームは単層と多数の大型多重層小胞との混合物であった。 リポソームの膠質組成。全極性脂質抽出物、複合ミセル及びリポソーム間の薄層 クロマトグラフィーによる比較は、脂質プロフィールか本質的に同一であること を示した（図８）。このことは、様々なエーテル脂質物質の全てが各リポソーム 調製物の中に一体化されていることを明確に示唆する。各メタン細菌の種々の、 且つ特徴的な脂質パターンを注目した。どのリポソーム懸濁物においても薄層ク ロマトグラフィーにより検出される残留清浄剤はなかった（図８）。 従って、清浄剤の濃度は最終リポソーム集団（４０ｍｇの脂質）の中で１ｍｇ以 下であると我々は見積った。 膠質押出により調製したリポソーム 平均サイズ及びサイズ分布。様々なサイズのエーテルリポソームを、５０．１０ ０．２００及び４Ｏ０ｎｍの孔径のフィルター並びに種々の古細菌脂質抽出物に より加圧押出によって作り上げた（表６）。小さめの孔径のフィルターにより（ ５０及び１１００ｎの孔径）、はとんどの抽出物が５０及びＩ００ｎｍ付近の平 均径を有するリポソームをもたらした。 しかしなから、２Ｏ０ｎｍの孔径のフィルターでは、Ｍ、スミシイ及びＭ、ヒュ ンガティの脂質より作ったリポソームのみが２Ｏ０ｎｍに近い平均径を有してお り、一方、４．ＯＭのＮａＣｌの存在下てＨ，キュティルブルムの極性脂質によ り得られたリポソームはそのフィルターの孔よりかなり大きかった。残りの抽出 物は２Ｏ０ｎｍよりはるかに小さい平均径を有するリポソームをもたらした。４ ００ｎｍの孔径フィルターでは、Ｈ，キュティルブルム脂質（４，０ＭのＮａＣ １中）中より作ったリポソームのみがフィルターの孔径よりも大きかった。他の ものはフィルターの孔径よりもはるかに小さかった。 動力光散乱分析（ＤＬＳ）により得られたサイズ分布の補正係数（０，２０と０ ．４０との間）は、全てのリポソーム懸濁物が良好なサイズ均質性を有している ことを示した（表６）。ネガティブ染色リポソームの電子穎微鏡写真はこれらの 発見を裏付けた（図９）。 しつる（表７）。この研究において用いた代表的な抽出物のうちで、Ｍ、ヤナシ イ（６５°Ｃて増殖）及びＭ、マゼイのそれが酸性条件が高まるにつれて大きめ のリポソームをもたらした。しかしながら、この効果は５０°Ｃて増殖させたＭ 、ヤナシイの極性脂質によっては明示されなかった。従って、それは各抽出物の 脂質組成に依存するのであろう。 層状性。ネガティブ染色調製物も、５ｏ及び１００止の孔径フィルターで形成し たリポソームが単層であることを示した（図９）。しかしながら、数多くの多重 層リポソームが、２００及び４００ｎｍの孔径フィルターで作った懸濁物の中に 認められた。 安定性の研究 ホスホリパーゼ。Ｈ，キュティルブルムの脂質より作られたリポソームを除き、 全てのエーテルリポソームがホスホリパーゼＡ、及びＢの存在下で安定であった （表８）。実際、このような酵素の存在下でインキュベートしたエーテルリポソ ームは［ホスホリパーゼ抜きＪのコントロールと同等な捕捉色素を保持した。こ れらの結果は、エステル脂質ＤＰＰＣ及びＥＰＣより作られたリポソームで行っ た同様の実験と相反した。ホスホリパーゼとのインキュベージコン後のＮＩＣＯ ＭＰ分析は、その構造保全性の欠如の理由によりエステルリポソームの検出をす ることができなかった。 ところで、エーテルリポソームはホスホリパーゼＣによる加水分解に感受性であ った。にもかかわらず、一部、即ちＭ、ヒュンガティ、Ｍ、スミシイ及びＭ、ヤ ナシイ（６５°Ｃで増殖）のそれはエステルリポソームよりも耐性であった。 表８．エステル及びエーテルリポソームに及ぼすホスホリパーゼの効果１ ホスホリパーゼＡ、　ホスホリパーゼＢ　ホスホリパーゼＣエステルリポソーム ＥＰＣ１１００（１０リ　４　６０（１８）　５　１００（０）ＤＰＰＣ４７５ （４）　４　９１（６）１５　８Ｂ（２）エーテルリポソーム Ｅキュティルブルム　ｌ　７０（０）　１　８Ｂ（０）　５　１００（８）ｋマ ゼイ　４　１８（１３）　４　６（４）　５　１００（７）ｋボルタ　４　１５ （０）　４　２（０）　１５　８５（２）［スミシイ　４　２３（１０）　４　 ０（０）　６０　７５（３）・ｋヤナシイ ５０”Ｃｒ増殖　４　９（６）　４　５（３）　１５　７５（０）５°Ｃ１殖　 ４　７（７）　４　５（３）　（資）　田（１）Ｍ、ヒュンガＩ／イ４　４（２ ）　４　４（２）６０　６０（０）２結果はカルボキシフルオロセインの％漏出 で表す。 ２酵素の存在下でのインキュベーション時間３酵素の非存在下でのリポソームか らのカルボキシフルオロセインの９６漏出としてのコントロールを表す。 温度。エーテル脂質の抽出物は、エステル脂質ＤＰＰＣ及びＥＰＣよりも高温で より安定なリポソームをもたらした（表９）。５ｏ及び６５℃での５（６）−カ ルボキシフルオロセインの漏出はエーテルリポソームはとてなかった。５ｏ″Ｃ より低い温度では、色素はエーテルリポソーム及びＤＰＰＣリポソームがら同じ ような速度で放出された。一般に、ＥＰリポソームは、ＤＰＰＣ又はＭ、ヤナシ イの全極性脂質がら調製したエーテル脂質ソ・−ム由来のそれよりも漏出性であ った。 エーテルリポソームのうちで、Ｍ、ヒュンガティ及びＭ、ヤナシイの脂質より作 ったものが最も安定であった。このことはそれらの抽出物中のテトラエーテル脂 質の存在にもとづくようである。Ｍ。 マゼイはテトラエーテル脂質を有さない。５ｐｒｏｔｔら（１９９１）は、５゜ °Ｃて増殖させたＭ、ヤナシイが、６５℃て増殖させた細胞よりも、より高めの 比率の標準ジエーテル膠質並びに少なめのテトラエーテル及び巨大環状ジエーテ ルを含むことを示した。従って、両方の温度で増殖させた細胞の脂質より作った リポソームの安定性を３５．５０及び６５°Ｃて試験した。少なめのテトラエー テルを含むリポソームは一貫して、６５°Ｃて増殖させた細胞の脂質より調製し たものよりも漏出性であった（表１０）。この発見はＭ、ボルタ及びＭ、ヒュン ガティの全極性脂質により作った様々な量のテトラエーテル脂質のリポソームで 行った漏出研究により裏付けられ（表１０）　、即ち、より多くのテトラエーテ ルを含むリポソームが一貫して漏出性が低かった。 構造特性及び／又は封入化合物の損失を伴うことなく微生物及びウィルス汚染物 を除去することはリポソームの薬理用途において所望される。濾過除菌はウィル ス粒子又はパイロジエンが除去されない問題に悩まされ、そして５００ｎｍ以上 の大型リポソームにとっては不適切である［Ｐｒ１ｅｓｅ、　Ｊ、　（１９８４ ）第１０章、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。 第１巻、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ、　Ｇ、　Ｇｒｅ ｇｏｒｉａｕｄｕｓ　（編）　ＣＲＣＰｒｅｓｓ］。このような問題を排除する 好適なそれに代る方法はオートクレーブ処理であるが、この方法はエステル脂質 由来のリポソームにとっては可能でなく、その理由は加熱処理の際にリポソーム の構造保全性が失われることにある［Ｆｒ１ｅｓｅ、　Ｊ、　（１９８４月。 オートクレーブ処理を、古細菌エーテルリポソームの構築の際に用いたバッファ ー−ＮａＣＩ原の中に懸濁されたそれに基づいて行った。 表■を参照のこと。どのエーテルリポソームも融合（平均径）又は溶融（強度） の徴候を示さなかった。蛍光色素は種々のリポソーム調製物におけるオートクレ ーブ処理の際に様々な度合いで保持され、保持とテトラエーテル含量との一次相 関が示された。これは本発明にかかわる新規なエーテルリポソームの主たる長所 である。 表１０．エーテルリポソームの温度安定性に及ぼすテトラエーテル脂質の量を増 やすことの効果１ インキュベーション温度 ５０℃で増殖　２１　２７　４０ ６５℃で増殖　４２　１６　３０ Ｍ、ボルタ　Ｏ７５１００ Ｍ　ヒュンガティ　５０　１２　２５ １結果は６日間のインキュベーション後の５（６）−カルポキシフルオロセイン の％漏出として表す。 ２Ｍ、ヒュンガティ及びＭ、ボルタの全極性脂質（ＴＰＬ）より作ったリポソー ムを種々の比率で混合して、リポソームのテトラエーテル脂質の％を変えた。 ［”Ｃ］スクロースの漏出。４°Ｃで保存中の［”ＣＩスクロースの漏出を研究 した（表１２）。ｐＨ３，０及び７．１では、エーテルリボソーリポソーム集団 の平均径が有意に変化しなかった（表６及び７）。 はとんどの場合、サイズ分布の変動係数にも影響がなかったが、Ｍ。 ヤナシイ（６５℃）及びＭ、マゼイの脂質で作りあげたりボフームではｐＨ３， ０において有意な上昇が認められた。これはリポソーム集団におけるシフトの示 唆でありうる。 所　見 純粋なメタン細菌エーテル脂質は商業的に入手できない。はとんどのメタン細菌 が少なくとも１０種類の極性脂質を合成することを考えると（一部、例えばＭ、 ヤナシイはもっと多くを有する）、リポソーム形成を達しめるのに十分な量にお ける最も主要なものの単離でさえも途方もない仕事である。また、はとんどのメ タン細菌細胞の脂質画分は細胞乾燥重量の約５％しか占めない。従って、我々は エーテルリポソーム製剤を調製するための、様々なメタン細菌及びその他の古細 菌に由来する全極性脂質の天然混合物を利用する現実性を開拓した。 我々は、Ｍ、ボルタ、Ｍ、ヤナシイ、Ｍ、マゼイ及びＭ、コンシリの全極性脂質 抽出物由来の良好なサイズ均質性を有する密閉単層小胞を作り上げるのに成功し た。対比において、清浄剤としてｎ−アルキル−グルコシドを利用すると、古細 菌エーテル脂質とエステル脂質（ＥＰＣ）とで得られるリポソームのサイズ分布 についての変動係数は同等であった［Ｍｉｍｍｓ、　Ｌ、　Ｔ、ら（１９８１） 　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２０　：８３３−８４０　；　Ｓｃｈｗｅｎｄｅ ｎｅｒ、　Ｒ，Ａ、ら（１９８１）　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒ ｅｓ。 Ｃｏｍｍ、　１００　：　１０５５−１０６２］。 各抽出物における種々のコア脂質構造体の種類と形成されたリポソームのサイズ との間には強力な相関は認められなかった。しかしながら、テトラニーデルコア 脂質の存在は大きめの小胞の形成を助長するようであった。これらの考察は、卵 のホスファチジルコリンの小胞のサイズか、一体化しているテトラエーテルの量 の増大に伴って大きくなることを示したＬｅｌｋｅｓら［Ｌｅｌｋｅｓ、　Ｐ、 　１．　ら（１９８３）Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　７３ ２　：　７１４−７１８］の発見と一致する。硬質な、膜に広がったテトラエー テル脂質に強いられるバッキング束縛（ｐａｃｋｉｎｇ　ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ ｓ）（Ｌｅｌｋｅｓ、　Ｐ、　１．ら（１９８３）　；　Ｒｉｎｇ、　Ｋ、ら（ １９８６）］はおそらく上記の考察に原因する。このような拘束は、リポソーム か太き（なるほとりボソームの曲率が小さくなるので、減少するであろう。サイ ズの相違は各脂質抽出物の極性頭部基の組成の相違にある程度基づくこともあり うる。頭部基の種類の脂質成分の分子構造／形態（逆円錐、円筒又は円錐）をあ る程度決定する、換言すれば脂質のパツキング状態を決定することがよく確立さ れている　［Ｌｉｃｈｔｅｎｂｅｒｇ、　Ｄ、とＢａｒｅｎｈｏｌｚ、　Ｙ、　 （１９８８）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ。 Ａｎｕｌ、　３３　：　３３７−４６２］。小胞内水性区画は頭部基の組成によ り、その水和性及びかさ高さに基づいて、影響を及ぼされもする［Ｒａｃｅｙ。 Ｔ、　Ｙ、ら（１９８９）　Ｃｈｅｍ、　Ｐｈｙｓ、　Ｌｉｐｉｄｓ　４９　： 　２７１−２８］。 加圧押出は、古細菌エーテルリポソームの調製に適用する際に、清浄剤透析に比 して利点を有する。加圧押出は非常に迅速、且つ簡単であり、乾燥脂質を水性バ ッファー溶液の中に分散せしめるためのそのハンドホモジナイゼーシ３ン、及び フィルターを有するこの分散体の数回の押出のみを必要とする。物質のバッファ ー溶液の中に含ませること（”Ｃ−スクロース及び蛍光色素がその原理を示唆す る）は有効な捕捉をもたらした。他方、清浄剤透析は、もし付加された物質が透 析により失われるなら、劣った捕捉をもたらしうる。 我々は加圧押出のために約１ｍｌの少ない容量を利用したが、その原理は同して あり、従って装置は容易にスケールアップが可能である（Ａｖｅｓｔｉｎ、Ｉｎ ｃ、、　Ｏｔｔａｗａ、　Ｃａｎａｄａ）　ａこの方法は薬理用途にとって許容 されないことかある清浄剤の使用を排除する。また、リポソームのサイズは膜の 孔径を単に変えるだけの限定された手法で簡単に変えることかてき、他方、清浄 剤透析によりサイズの所望の変更を得るには条件を慎重に変える実験が必要とさ れる［Ｚｕｍｂｕｅｈｌ、　０．。 とＷｅｄｅｒ、ｔＬ　Ｇ、（＋９８１）　Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａ ｃｔａ　６４０　：　２５２−２６２　；Ｓｃｈｗｅｎｄｅｎｅｒ、Ｒ，Ａ、ら 　（＋９８１）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍ、１００　 。 １０５５−１０６２　；　Ａｕｒｏｒａ、　Ｔ、　Ｓ、、ら（１９８５）　Ｂｉ ｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ。 ８２０　：　２５０−２５８１゜最後に、Ｍ、ヒュンガティ由来の全エーテル脂 質の清浄剤透析は、　１００から１１０００ｎのサイズに範囲する、小型の単層 と大型の多重層タイプとより成るリポソームの混合集団をもたらした。これと同 一の調製品であり、約ｌ：１の比におけるジエーテルとテトラエーテル脂質とよ り成るものの加圧押出は均質性の高い集団をもたらした。これらのリポソームの サイズは他の膠質起源と同様に、フィルターの孔径に比例していた。 Ｍ、ヒュンガティのエーテル脂質はＫｕｓｈｗａｈａら［Ｋｕｓｈｗａｈａ、　 Ｓ、　Ｃ。 ら（１９８１）　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　６６４　： 　１５６−１７３］及びＦｅｒｒａｎｔｅら［Ｆｅｒｒａｎｔｅ、　Ｇ、ら（１ ９８７）　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　９２１　：　２８ １−２９１１により既に部分的に特性化されている。テトラエーテルホスホグリ コリピッドＰＧＩ、−■から■、及びテトラエーテル糖脂質ＴＧＴ−１について の新たな構造を紹介する。乾燥重量に基づき、１６種の脂質はこのメタン細菌由 来のエーテル脂質の〉９９％を占めている。 メタノサルシナ　バーケリ及びＭ、マゼイはヒドロキシジエーテル及び標準のジ エーテル脂質を合成した［５ｐｒｏｔｔ、　Ｇ、　Ｄ、ら（１９９０）Ｊ、　Ｂ ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６５　：　１３７３５−１３７４０１　、ヒドロキシ ジエーテルホスファチジルセリン及びヒドロキシジエーテルホスファチジル−ｍ ｙ。 −イノシトールがＭ、バーケリにおいて見い出されているが［ＮｉｓｈＮ１５ｈ ｉ、　Ｍ、とＫｏｇａ、　Ｙ、（１９９１）　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙ ｓ　Ａｃｔａ　１０８２　：２１１−２１７］、メタノサルシナ属の極性脂質は 特性化されていない。我々はここで、ホスホエタノールアミン及びホスホグリセ ロールの頭部基を有する２種類の新規なヒドロキシジエーテル脂質についての証 拠を提供する。構造データーはＭ、マゼイのエーテル脂質の９６重量９６を供し た。陰性ＦＡＢ質量スペクトルは、様々な炭素源で増殖させた様々なメタノサル ツナ種の極性脂質と同等のデーターを供し、同じ脂質分子イオンが全てのケース において存在していることを示した。 極好塩菌の好中菌及び好アルカリ性菌群の両方についてのエーテル脂質構造はＭ 、　Ｋａｔｅｓにより詳しく決定されている［Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆｌｉｐｉ ｄ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　（１９９０）頁１−１２２　（Ｋａｔｅｓ、　Ｍ、編） 、　ＰＩｅｎｕａ＋　Ｐｒｅｓｓ。 Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　ａｎｄ　Ｌｏｎｄｏｎｌ。同様にメタノコツカス　ボルタ、 メタノコツカス　ヤナシイ及びメタノコツカス　コンシリの脂質についての我々 の構造データーも参照されたい［５ｐｒｏｔｔ、　Ｇ、　Ｄ、　（１９９２）　 Ｊ。 Ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ　２４　：　 ５５５−５６６１゜古細菌膠質のフタニル鎖はエーテル結合によってグリセロー ル炭素に結合している。脂肪アシル鎖を真核及び真正細菌中のグリセロール炭素 に連結するエステル結合と異なり、これらの結合はホスホリパーゼＡ、及びＢに よる酵素攻撃に感受性でない［ＤｅＢｏｓｅ、　Ｃ，Ｄ。 とＲｏｂｅｒｔｓ、　Ｍ、　Ｆ、　（１９８３）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ 、　２５８　：　６３２７−６３３４］　、更に、エステルリン脂質中の類似の 結合と異なり、エーテルリン脂質のリン酸エステル結合は、しばしばホスホリパ ーゼＣによる酵素攻撃に耐性である［Ｍｏｒｉｉ、　Ｈ，ら（１９８８）　Ａｇ ｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　５２　：３１４９−３１５６　；　Ｍｏｒ ｉｉ、　Ｈ，ら（１９８６）　Ｊ、　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ、　２７　：　７２４ −７３０　；Ｂｕｒｎｓ、　Ｒ，Ａ、ら（１９８１）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ　２０　：　５９４３−５９５０１゜我々は、古細菌エーテル脂質が、酵素攻 撃に耐えるリポソームを形成することを実証した（表８）。ホスホリパーゼのイ ンキュベーションの際のエステルリポソーム（ＤＰＰＣ及びＥＰＣ）により観察 された構造保全性の損失は先行論文と一致する［Ｄａｖｉｅｓ、　Ｄ、　Ｅ、　 ら（１９９１）　Ｂｉｏｅｈｉｍ。 Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　１０８４　：　２９−３４　；　Ｐｕｇｍａｎ、 　Ｄ、　Ａ、ら（１９８４）　Ｂｉｏｃｈｉｍ。 Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　７９５　：　１９１−１９５　；　Ｒｏｗｌａｎ ｄ、Ｒ，Ｎ、とｌ１ｆｏｏｄｌｅｙ、Ｊ、Ｐ。 （１９８０）　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　６２０　：　 ４００−４０９］。 酵素的加水分解の他に、エステル結合は化学的加水分解も受け易い。一般に、こ の過程は極端なｐＨ及び温度の上昇により顕著となる［Ｆｒｏｋｊａｅｒ、　Ｓ 、ら（１９８２）　０ｐｔｉａ＋１ｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｒｕｇ　ｄｅｌｉｖ ｅｒｙ（Ｂｕｎｄｇａａｒｄ、　Ｈ，、Ｂａｇｇｅｒ−１（ａｎｓｅｎ、　Ａ、 とＫｏｆｏｒｄ、　Ｈ，編）　ＡｌｆｒｅｄＢｅｎｚｏｎ　Ｓｙｍｐ、　１７． 　Ｍｕｎｓｇａａｒｄ、　Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、　ｐ３８４］　ｏ加水分解は 遊離脂肪酸及び分解リン脂質をエステルリポソームに導入してしまうことがあり 、その二つの成分は膜の保全性及び力学に影響を及ぼす（Ｖａｎ　Ｅｃｈｔｅｉ ｄら（１９８１））。しかしながら、エーテル結合は化学的加水分解に対して比 較的耐性である［Ｋａｔｅｓ、　Ｍ、　（１９８６）　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴ ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕ ｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ　（Ｂｕｒｄｏｎ、　Ｒ。 Ｈｏとｖａｎ　Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ、　Ｐ、　Ｈ，纏）第■巻、第■部、Ｅ ｌｓｅｖｉｅｒ、　ＮｅｗＹｏｒｋ、頁１２３−１２７１゜この特徴はエーテル リポソームの高温（表９゜１０、１１）及び極端なｐＨ（表１２）での安定性の 高さにある程度原因しうる。 テトラエーテル脂質の存在は高温でインキュベートしたリポソームの安定化因子 でもある（表■）。Ｒｉｎｇら（１９８６）は、テトラエーテルモノグリコシル ーホスホリルグリセロール脂質である。サーモブラスマ　アシドフィルムの主要 脂質成分より作ったＣＦ−付加多重層リポソームが、高温でＥＰＣ又はＤＰＰＣ 小胞よりもかなり漏出性が低いことも示している。従って、大量のテトラエーテ ルを含む古細菌極性脂質抽出物から作られたリポソーム（単−又は多重一層）は 、テトラエーテルを欠く抽出物から作ったものよりも高温でより安定であろう。 エステルリポソームにかかわる主要問題の一つはその酸化分解性にあることがか なり述べられている［にｏｎｉｎｇｓ、　Ａ、　Ｗ、　Ｔ、　（１９８４）Ｌｉ ｐｏｓｏｍｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　（Ｇ、　Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ編）第 １巻、ＣＲＣＰｒｅｓｓ。 Ｉｎｃ、、　Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ、　Ｆｌｏｒｉｄａ、頁１３９−１６２］、 脂質の過酸化は、卵のホスファチジルコリンの中のように不飽和脂肪アシル鎖の 存在の理由により生じ、そしてこれらの変化の結果、水性懸濁物中に維持してお いたリポソームは凝集、融合又はその内容物が漏出することがある　（Ｌｉｃｈ ｔｅｎｂｅｒｇ、　Ｄ、とＢａｒｅｎｈｏｌｚ、　Ｙ、　（１９８８）　Ｍｅｔ ｈｏｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ。 Ａｎａｌ、　３３　：　３３７−４６２　；　Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、１．　Ｍ、 とＷｅｉｓｓｍａｎｎ、１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｎ＋、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒ ｅｓ、　Ｃｏｍｍ、　７５　：　６０４−６０９］、従って、古細菌脂質の利用 はこの問題をなくすことができ、なぜならフタニル鎖は完全に飽和されているか らである。 エステルリポソームは４℃で４ケ月にわたる保存の際に融合又は凝集しなかった （表６）。種々の極性エーテル脂質組成が試験した全てのｐＨで安定であったこ とに注目することが重要である。エステルリポソームにおいては、安定性を高め る及び融合又は凝集を防ぐためにコレステロールがよく必要とされる［Ｌｉｃｈ ｔｅｎｂｅｒｇ、　Ｄ、とＢａｒｅｎｈｏｌｚ、　Ｙ、　（１９８８）　Ｍｅｔ ｈｏｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ａｎａｌ、　３３　：　３３７−４６２］。 各古細菌から抽出した全極性脂質の中に見い出させる新規の天然の組合せは、個 々の脂質物質の精製を必要とすることなく、安定性試験のためにリポソームを調 製するためのエーテル脂質の適切な混合物を供する。これらの脂質混合物の起源 は得られる最終リポソーム生成物にとって重要である。例えば、サイズは脂質組 成及び膜の孔径によって変わる（表６）。また、高温に対する耐性はテトラエー テル脂質の割合の高まりに伴って高まり（表１Ｏ）、その他の古細菌、例えばサ ーモブラスマ種、スルホロブス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）種及び好熱硫黄−依存 性古細菌の脂質より作ったリポソームの用途を示唆する（構造データーは５ｐｒ ｏｔｔ、　Ｇ、　Ｄ、　（１９９２）　Ｊ、　Ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ　ａ ｎｄＢｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ　２４　：　５５５−５６６を参照］。加圧押出 により調製したエステルとエーテルリポソームとの相対安定性を比較した。これ らの研究は、エーテルリポソームの安定性の高さを示した。古細菌エーテルリポ ソームの安定性、並びに酸化及びエステラーゼに対するその固有の非感受性は、 それらを数多くのリポソーム用途にとって魅力的な候補にする。 Ｆｌら　ｌ メ　ＦｔＧ″ｌ ド）Ｃ７３ ＦＩＧＳ ＦＩＧ、６ ＦＩＧ、７ ＦＩＧ、８ ＦＩＧ、９ 国際調査報告 ｍ１ｆｉｌ細ゆ一＾−−７１　ｐｃＴｉｃ＾　９２１００４６４フロントページ の続き （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。 ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ （ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ， ＳＮ、　ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　 ＣＨ，Ｃ３゜ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、 　ＬＵ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＰＬ、　ＲＯ，ＲＵ、　 ＳＤ、　ＳＥ、　ＵＳ（７２）発明者　ペイチル、シリシュチャンドラ　ビー。 カナダ国、オンタリオ　グー２ジー　５ニス２．ネピーン、マーブル　アーチ　 クレセント　１６ （７２）発明者　チョケット、クリスチャン　ジー。 カナダ国、クーペツク　ジェイ８ゼット１ジー５．ハル、ラディソン　ストリー ト１、アパートメント　５ （７２）発明者　エキール、イレナ カナダ国、ケベック　エイチ９ニス　５シー４．ポイント　クレア、ペイビュー 　アベニュ　５６

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. １．構造式Ｉの新規なポリエーテル脂質▲数式、化学式、表等があります▼Ｉ （式中、Ｒ１はβ−ｇａｌｒ−、そしてＲ２はα−ｇｌｃ■−（１−２）−β− ｇａｌｒ−である）。
2. ２．構造式ＩＩの新規なポリエーテル脂質▲数式、化学式、表等があります▼Ｉ Ｉ（式中、Ｒ１は▲数式、化学式、表等があります▼又は▲数式、化学式、表等 があります▼、そしてＲ２は▲数式、化学式、表等があります▼又は▲数式、化 学式、表等があります▼又はβ−ｇａｌｒ−である）。
3. ３．Ｒ１が▲数式、化学式、表等があります▼、そしてＲ２が▲数式、化学式、 表等があります▼である、請求項２に記載の化合物。
4. ４．Ｒ１が▲数式、化学式、表等があります▼、そしてＲ２が▲数式、化学式、 表等があります▼である、請求項２に記載の化合物。
5. ５．Ｒ１が▲数式、化学式、表等があります▼、そしてＲ，がβ−ｇａｌｒ−で ある、請求項２に記載の化合物。
6. ６．Ｒ１が▲数式、化学式、表等があります▼、そしてＲ２が▲数式、化学式、 表等があります▼である、請求項２に記載の化合物。
7. ７．構造式ＩＩＩの新規なポリエーテル脂質▲数式、化学式、表等があります▼ ＩＩＩ式中、Ｘは−ＯＨ、そしてＹはエタノールアミン又はグリセロールである ）。
8. ８．古細菌の全極性脂質抽出物を含んで成るリポソーム。
9. ９．前記古細菌が、メタノスピリルムヒュンガティ、メタノコッカスヤナシイ、 メタノコッカスボルタ、メタノサルシナマゼイ、メタノブレビバクタースミシイ 、メタノスフェラスタッドマナ、メタノバクテサウムエスパノラ、サーモプラス マアシドフィルム、ナトロノバクテリウムマガジイ、ハロバクテリウムキュティ ルブルム及びそれらの混合物より成る群から選ばれる、請求項８に記載のリポソ ーム。
10. １０．前記古細菌がメタノスピリルムヒュンガティである、請求項８に記載のリ ポソーム。
11. １１．前記古細菌がメタノサルシナマゼイである、請求項８に記載のリポソーム 。
12. １２．古細菌の全極性脂質抽出物からの単層リポソームの製造のための方法であ って、 （ａ）古細菌の細胞を溶媒抽出に付して全極性脂質画分を用意し、（ｂ）適当な 清浄剤を、少なくとも１０：１から３０：１に至る範囲におけるモル比（清浄剤 ：脂質）で加え、次いでエバポレーションによりその溶媒を完全に除去し、 （ｃ）得られる清浄剤／脂質材料を適当な水性透性バッファーの中に溶かして脂 質と清浄剤との複合ミセルを形成し、そして（ｄ）この複合ミセルを制御型透析 に付して清浄剤を除去し、且つリポソームを形成すること、を含んで成る方法。
13. １３．前記モル比（清浄剤：脂質）を約２０：１にする、請求項１２に記載の方 法。
14. １４．前記清浄剤が非イオン性清浄剤である、請求項１３に記載の方法。
15. １５．前記清浄剤がｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドである、請求項１ ４に記載の方法。
16. １６．リポソームの加熱滅菌の更なる工程を含む、請求項１２に記載の方法。
17. １７．古細胞の全極性抽出物からのリポソームの製造のための方法であって、 （ａ）古細菌の細胞を溶媒抽出に付して全極性脂質面分を用意し、（ｂ）適切な 水性抽出バッファーを加えて３．０から１０．７に至るｐＨ範囲において多重層 リポソームエマルジョンを形成し、そして単層リポソームが必要な場合、 （ｃ）多重層リポソームエマルジョンを４〜８０℃の温度において加圧のもとで 、特定の孔径の膜を通じて押出して、単層リポソームを形成せしめること、 を含んで成る方法。
18. １８．前記膜の孔径が５０〜４００ｍｍである、請求項１７に記載の方法。
19. １９．前記工程（ｃ）において、温度が周囲温度である、請求項１８に記載の方 法。
20. ２０．前記工程（ｂ）において、ｐＨが約７である、請求項１９に記載の方法。
21. ２１．Ｒ１が▲数式、化学式、表等があります▼又は▲数式、化学式、表等があ ります▼であり、そしてＲ２が▲数式、化学式、表等があります▼である、請求 項２に記載の方法。
22. ２２．ＸがＯＨ、そしてＹがエタノールアミンである、請求項７に記載の方法。
23. ２３．ＸがＯＨ、そしてＹがグリセロールである、請求項７に記載の方法。