DE69628912T2

DE69628912T2 - Herstellungb und verwendung eines spezifischen gaba-aalpha5 rezeptorligands zur behandlung der erkrankung von alzheimer

Info

Publication number: DE69628912T2
Application number: DE69628912T
Authority: DE
Inventors: Raphael Gerard DAWSON
Original assignee: Merck Sharp and Dohme Ltd
Current assignee: Organon Pharma UK Ltd
Priority date: 1995-02-23
Filing date: 1996-02-20
Publication date: 2004-06-03
Anticipated expiration: 2016-02-21
Also published as: EP0810879A1; ES2201169T3; AU4725796A; EP0810879B1; JPH11501302A; US6426343B1; CA2212058A1; CA2212058C; AU706515B2; WO1996025948A1; US6323198B1; GB9503601D0; ATE244018T1; DE69628912D1

Description

Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung einer Verbindung zur Herstellung von Medikamenten zur Verbesserung der Kognition (beispielsweise bei der Behandlung von Demenzerkrankungen wie Alzheimer-Krankheit) und für ein solches Verfahren geeignete Zusammensetzungen bereit.
Eine Reihe von Demenzerkrankungen wie Alzheimer-Krankheit ist durch eine progressive Verschlechterung der Kognition bei dem Betroffenen gekennzeichnet. Es wäre eindeutig wünschenswert, die Kognition bei Personen, die einer solchen Behandlung bedürfen, zu verbessern, beispielsweise für Personen, die unter einer Demenzerkrankung leiden.
Es wurde von McNamara und Skelton in Psychobiology, 21: 101–108, berichtet, daß der inverse Benzodiazepin-Rezeptor-Agonist βCCM das räumliche Lernen in dem Morris-Wasserlabyrinth verbesserte. Jedoch sind β-CCM und andere herkömmliche inverse Benzodiazepin-Rezeptor-Agonisten krampffördernd, was es klar macht, daß sie nicht als kognitionsverbessernde Mittel bei Menschen eingesetzt werden können.
Wir haben jedoch nunmehr festgestellt, daß es möglich ist, Medikamente zu erhalten, welche kognitionsverbessernde Wirkungen aufweisen, jedoch keine krampffördernden Wirkungen besitzen, die zuvor mit inversen Benzodiazepin-Rezeptor-Agonisten beschrieben wurden.
Die Benzodiazepin-Rezeptorstelle befindet sich in dem GABA_A-Rezeptor, einer Struktur, die allgemein als pentamer angesehen wird, mit einem integralen Chloridionenkanal, der durch die zweite Transmembrandomäne einer jeder der fünf Untereinheiten gebildet wird. Mit Hilfe moderner molekularer Klonierungstechniken wurde im Säugergehirn eine Familie von 14 GABA_A-Rezeptor-Untereinheiten identifiziert, nämlich die α₁-, α₂-, α₃-, α₄-, α₅-, α₆-, β₁-, β₂-, β₃-, γ₁-, γ₂-, γ₃-, δ- und φ-Untereinheiten. Die Auswahl von fünf Untereinheiten von einem möglichen Repertoire von 14 erlaubt eine Vielfalt möglicher Kombinationen, jedoch bleibt die Anzahl der auftretenden Subtypen und das Ausmaß der GABA_A-Rezeptor-Heterogenität unbekannt. Wenn hier im folgenden Bezug auf einen α₁-, α₂-, α₃-, α₅- oder α₆-Rezeptor genommen wird, bezieht sich dies natürlich auf den GAB_Aα₁, GABA_Aα₂, GABA_Aα₃, GABA_Aα₅ und GABA_Aα₆.
Es wurde nun festgestellt, daß die Verwendung eines inversen α₅-Rezeptor-Agonisten, welcher relativ frei von einer bestimmten Aktivität an α₁- und/oder α₂- und/oder α₃-Rezeptor-Bindungsstellen ist, eingesetzt werden kann, um ein Medikament bereitzustellen, welches sich zur Kognitionsverbesserung eignet, jedoch nicht krampffördernd ist.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung die Verbindung einer Verbindung zur Herstellung eines Medikaments für die Verbesserung der Kognition bei einem Individuum, ohne Krämpfe zu verursachen, bereit, wobei die Verbindung ein inverser α₅-Rezeptor-Agonist ist, der kein Rezeptor-Agonist oder inverser Rezeptor-Agonist bei α₁- und/oder α₂- und/oder α₃-Rezeptoren ist.
Das Individuum wird ein Säuger, am geeignetsten ein Mensch, sein und vorzugsweise ein Mensch, der unter einer Demenzerkrankung wie Alzheimer-Krankheit leidet.
Somit wird die eingesetzte Verbindung als inverser Agonist an α₅-Rezeptoren in Konzentrationen binden, bei denen keine signifikante Bindung eines Agonisten oder inversen Agonisten an α₁-Rezeptoren stattfindet. Geeigneter wird die Verbindung als inverser Agonist an α₅-Rezeptoren in Konzentrationen binden, bei denen keine signifikante Bindung eines Agonisten oder inversen Agonisten an α₁- und α₂-Rezeptoren stattfindet. Am geeignetsten wird die Verbindung als inverser Agonist an α₅-Rezeptoren in Konzentrationen binden, bei denen keine signifikante Bindung eines Agonisten oder inversen Agonisten an α₁-, α₂- und α₃-Rezeptoren stattfindet.
Die Bindung des inversen Agonisten an α₅ kann partiell sein (d. h., die Verbindung kann ein partieller Agonist sein), jedoch ist ein vollständig inverser Agonist bei α₅ bevorzugt. Gleichermaßen sollte die Verbindung kein vollständiger oder partieller Agonist oder inverser Agonist bei den anderen Rezeptoren sein.
Die eingesetzten Verbindungen können gewünschtenfalls eine Antagonisten-Bindung bei α₁, α₂, α₃ und α₆ aufweisen, nachdem eine solche Bindung die Durchführung des Verfahrens dieser Erfindung nicht beeinträchtigen wird. Bezüglich der relativen Bindung an die verschiedenen Rezeptoren ist es nur die Bindung als inverser Agonist oder Agonist, die betrachtet wird.
Im allgemeinen werden solche Verbindungen mindestens 10fach besser an α₅-Rezeptoren als an α₁-Rezeptoren binden, d. h., die Verbindung wird mindestens 10fach selektiv für α₅-enthaltende Rezeptoren gegenüber α₁-enthaltenden Rezeptoren sein.
Geeigneterweise ist die Verbindung zur Verwendung in der Erfindung mindestens 10fach selektiv für α₅-enthaltende Rezeptoren gegenüber α₁- und α₂-enthaltenden Rezeptoren, geeigneter mindestens 10fach selektiv für α₅-enthaltende Rezeptoren gegenüber α₁-, α₂- und α₃-enthaltenden Rezeptoren und am geeignetsten mindestens 10fach selektiv für α₅-enthaltende Rezeptoren gegenüber α₁-, α₂-, α₃- und α₆-enthaltenden Rezeptoren.
Vorteilhafterweise ist die Verbindung zur Verwendung in der Erfindung mindestens 25fach selektiv für α₅-enthaltende Rezeptoren gegenüber α₁-enthaltenden Rezeptoren, z. B. 25fach selektiv für α₅-enthaltende Rezeptoren gegenüber α₁- und α₂-enthaltenden Rezeptoren, geeigneter mindestens 25fach selektiv für α₅-enthaltende Rezeptoren gegenüber α₁-, α₂- und α₃-enthaltenden Rezeptoren und am geeignetsten mindestens 25fach selektiv für α₅-enthaltende Rezeptoren gegenüber α₁-, α₂-, α₃- und α₆-enthaltenden Rezeptoren.
Vorzugsweise ist die Verbindung zur Verwendung in der Erfindung mindestens 50fach selektiv für α₅-enthaltende Rezeptoren gegenüber α₁-enthaltenden Rezeptoren, z. B. α₁- und α₂-enthaltenden Rezeptoren, geeigneter mindestens 50fach selektiv für α₅-enthaltende Rezeptoren gegenüber α₁-, α₂- und α₃-enthaltenden Rezeptoren und am geeignetsten mindestens 50fach selektiv für α₅-enthaltende Rezeptoren gegenüber α₁-, α₂-, α₃- und α₆-enthaltenden Rezeptoren.
Vorteilhafterweise wird die Verbindung zur Verwendung in der Erfindung mindestens 100fach selektiv für α₅-enthaltende Rezeptoren gegenüber α₁-enthaltenden Rezeptoren sein.
Die bevorzugte Verwendung dieser Erfindung hat den zusätzlichen Vorteil, die Kognition verbessern zu können, ohne unerwünschte anxiogene Wirkungen zu induzieren.
Ein bevorzugter Rezeptor zur Bestimmung der α₅-Bindung ist der α₅β₃γ₂-Rezeptor. Ein bevorzugter Rezeptor zur Bestimmung der α₁-Bindung ist der α₁β₃γ₂-Rezeptor. Ein bevorzugter Rezeptor zur Bestimmung der α₂-Bindung ist der α₂β₃γ₂-Rezeptor. Ein bevorzugter Rezeptor zur Bestimmung der α₃-Bindung ist der α₃β₃γ₂-Rezeptor. Ein bevorzugter Rezeptor zur Bestimmung der α₆-Bindung ist der α₆β₃γ₂-Rezeptor.
Rezeptoren werden in der internationalen Patentanmeldung Nr. WO 92/22652 und WO 94/13799 beschrieben.
Die Verbindungen zur Verwendung in dieser Erfindung können durch Screenen gegen die oben identifizierten Rezeptoren unter Anwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren identifiziert werden. Bevorzugte Techniken umfassen die in Goeders et al. beschriebenen (siehe hier im folgenden).
Die Feststellung, ob die Verbindungen Rezeptor-Agonisten, partielle Rezeptor-Agonisten oder inverse Rezeptor-Agonisten sind, kann gleichermaßen unter Anwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren erfolgen. Bevorzugte Techniken umfassen die in Wafford et al. beschriebenen (siehe hier im folgenden).
Besonders geeignete Verbindungen zur Verwendung in dieser Erfindung werden einen Ki-Wert (nM) gegenüber dem α₅β₃γ₂-Rezeptor von weniger als 5, geeigneter weniger als 2 und am geeignetsten weniger als 1, beispielsweise etwa 0,5, aufweisen.
Besonders geeignete Verbindungen zur Verwendung in dieser Erfindung werden einen Ki-Wert (nM) gegenüber dem α₁β₃γ₂-Rezeptor von mehr als 10, geeigneter mehr als 20, am geeignetsten mehr als 40, beispielsweise etwa 50, aufweisen.
Besonders geeignete Verbindungen zur Verwendung in dieser Erfindung werden einen Ki-Wert (nM) gegenüber dem α₂β₃γ₂-Rezeptor von mehr als 5, geeigneter mehr als 10, am geeignetsten mehr als 20, beispielsweise etwa 25, aufweisen.
Besonders geeignete Verbindungen zur Verwendung in dieser Erfindung werden einen Ki-Wert (nM) gegenüber dem α₃β₃γ₂-Rezeptor von mehr als 5, geeigneter mehr als 10, am geeignetsten mehr als 20, beispielsweise etwa 25, aufweisen.
Besonders geeignete Verbindungen zur Verwendung in dieser Erfindung werden einen Ki-Wert (nM) gegenüber dem α₆β₃γ₂-Rezeptor von mehr als 10, geeigneter mehr als 20, am geeignetsten mehr als 40, beispielsweise etwa 80, aufweisen.
Um ihre Aktivität zu entfalten, ohne daß die Verbindungen intravenös verabreicht werden müssen, sind die Verbindungen zur Verwendung in dieser Erfindung am meisten bevorzugt in der Lage, die Blut-Gehirn-Schranke nach oraler Verabreichung zu passieren.
Eine Verbindung, welche die oben ausgeführten wünschenswerten Eigenschaften besitzt, welche die Nützlichkeit des Besitzes dieser Eigenschaften zeigt, ist FG 8094.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung bei der Verbesserung der Kognition, ohne Krämpfe zu verursachen, bereit, die eine Verbindung, welche ein inverser α₅-Rezeptor-Agonist ist, der kein Rezeptor-Agonist oder inverser Rezeptor-Agonist bei α₁- und/oder α₂- und/oder α₃-Rezeptoren ist, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger dafür umfaßt.
Die Zusammensetzungen sind am geeignetsten für die orale Verabreichung an Menschen angepaßt, obwohl parenterale Verabreichungswege ebenfalls in Betracht gezogen werden, beispielsweise durch intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Verabreichung oder topisch oder rektal.
Für die orale Anwendung des kognitionsverbessernden Mittels kann die ausgewählte Verbindung beispielsweise in Form einer Tablette oder pharmazeutisch annehmbarer Träger oder Verdünnungsmittel, gegebenenfalls mit bekannten Adjuvanzien, wie z. B. Alaun, in einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach pharmazeutischer Standardpraxis verabreicht werden. Die Verbindungen können oral, parenteral, einschließlich durch intravenöse, intramuskuläre, intraperitoneale oder subkutane Verabreichung, oder topisch verabreicht werden.
Für die orale Anwendung kann das kognitionsverbessernde Mittel beispielsweise in Form von Tabletten oder Kapseln oder als wässerige Lösung oder Suspension verabreicht werden. Im Falle von Tabletten zur oralen Anwendung umfassen gewöhnlich verwendete Träger Lactose und Maisstärke und Gleitmittel, wie z. B. Magnesiumstearat, werden gewöhnlich zugesetzt. Für die orale Verabreichung in Kapselform umfassen geeignete Verdünnungsmittel Lactose und getrocknete Maisstärke. Wenn wässerige Suspensionen für die orale Anwendung erforderlich sind, wird der aktive Bestandteil mit Emulgier- und Suspendier-mitteln kombiniert. Gewünschtenfalls können bestimmte Süß- und/oder Geschmacksstoffe zugegeben werden.
Für die intramuskuläre, intraperitoneale, subkutane und intravenöse Anwendung werden gewöhnlich sterile Lösungen des aktiven Bestandteils hergestellt und der pH-Wert der Lösungen sollte in geeigneter Weise eingestellt und gepuffert werden. Für die intravenöse Anwendung sollte die Gesamtkonzentration der gelösten Stoffe eingestellt werden, um die Präparation isotonisch zu machen.
Für die topische Verabreichung kann das kognitionsverbessernde Mittel beispielsweise als Suspension, Lotion, Creme oder Salbe unter Verwendung eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers, wie z. B. Wasser, Mischungen von Wasser und mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln wie niedrigeren Alkanolen, Pflanzenöle und Polyalkylenglycole, formuliert werden.
Die pharmazeutische Präparation kann auch nicht-toxische Hilfssubstanzen, z. B. Emulgier-, Konservierungs-, Netzmittel, Verdickungsmittel und dgl., wie z. B. die Polyethylenglycole 200, 300, 400 und 600, die Carbowachse 1.000, 1.500, 4.000, 6.000 und 10.000, antibakterielle Komponenten wie quaternäre Ammoniumverbindungen, Phenylquecksilbersalze, von denen bekannt ist, daß sie kalt-sterilisierende Eigenschaften aufweisen und welche bei der Anwendung nicht schädlich sind, Thimerosal, Methyl- und Propylparaben, Benzylalkohol, Phenylethanol, puffernde Bestandteile wie Natriumchlorid, Natriumborat, Natriumacetate, Gluconat-Puffer und andere herkömmliche Bestandteile wie Sorbitanmonolaurat, Triethanolamin, Oleat, Polyoxyethylensorbitanmonopalmitylat, Dioctylnatriumsulfosuccinat, Monothioglycerin, Thiosorbit und Ethylendiamintetraessigsäure enthalten.
Wenn ein kognitionsverbesserndes Mittel bei einem menschlichen Individuum eingesetzt wird, wird die Tagesdosis normalerweise von dem verschreibenden Arzt festgelegt werden, wobei die Dosis im allgemeinen je nach Alter, Gewicht und Reaktion des individuellen Patienten sowie der Schwere der Symptome des Patienten variieren wird. Jedoch wird in den meisten Fällen eine wirksame Tagesdosis im Bereich von etwa 0,005 mg/kg bis etwa 100 mg/kg Körpergewicht und vorzugsweise von 0,05 mg/kg bis etwa 50 mg/kg, z. B. von etwa 0,5 mg/kg bis etwa 20 mg/kg Körpergewicht, in Einzeldosen oder verteilten Dosen verabreicht, liegen. In einigen Fällen kann jedoch eine Dosis außerhalb dieser Grenzen eingesetzt werden.
Im allgemeinen werden Dosierungseinheitsformen für die orale Verabreichung 1 bis 800 mg, gewöhnlicher 2,5 bis 250 mg, vorzugsweise 5 bis 100 mg, beispielsweise 10, 20 oder 50 mg, enthalten.
Ein bevorzugtes kognitionsverbesserndes Mittel zur Verwendung in dieser Erfindung ist 9H-Imidazo[1,5-a]pyrrolo[2,1-C][1,4]benzodiazepin-1-carbonsäure-11,12,13,13a-tetrahydro-7- methoxy-9-oxo-ethylester, (S)-(9Cl). Die Herstellung dieser Verbindung wird in der kanadischen Anmeldung CA 1266671 A2 900313 (Teilanmeldung der kanadischen Patentanmeldung Nr. 503 329) beschrieben. Diese Verbindung ist manchmal als FG 8094 bekannt.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können in irgendeiner geeigneten Weise, beispielsweise durch herkömmliche Tablettier- oder Kapselfülltechniken, hergestellt werden.
Diese Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit zur Identifizierung einer Verbindung, welche zur Kognitionsverbesserung in der Lage ist, ohne Krämpfe zu verursachen, welches Verfahren den Einsatz von α₅- und α₁- und/oder α₂- und/oder α₃- und/oder α₆-Rezeptoren umfaßt, um festzustellen, ob die Verbindung ein Ligand bei α₅-, nicht jedoch bei α₁- und/oder α₂- und/oder α₃- und/oder α₆-Rezeptoren ist, und um festzustellen, ob die Bindung an α₅-Rezeptoren die eines inversen Agonisten ist, und um festzustellen, ob die Bindung an die α₁- und/oder α₂- und/oder α₃- und/oder α₆-Rezeptoren die Bindung eines Agonisten oder inversen Agonisten ist.
Diese Erfindung stellt ein Verfahren bereit zum Auffinden einer Verbindung, die zur Verbesserung der Kognition in der Lage ist, ohne Krämpfe zu verursachen, welches Verfahren den Einsatz eines GABA_A-bindenden Rezeptors zur Feststellung, daß die Verbindung ein inverser α₅-Agonist und kein Agonist oder inverser Agonist bei α₁ und/oder α₂ und/oder α₃ ist, umfaßt.
Diese Erfindung stellt auch einen Liganden bereit, von dem bisher unbekannt war, daß er in der Lage ist, die Kognition zu verbessern, ohne Krämpfe zu verursachen, welcher durch ein Nachweisverfahren dieser Erfindung identifiziert wurde.
Diese Erfindung stellt ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, welche eine nach dem Verfahren dieser Erfindung identifizierte Verbindung umfaßt.
Die folgenden Referenzen bieten nützliche Hintergrundinformationen:
Goeders, N. E., und Kuhar, M. J. (1985), Benzodiazepine binding in vivo with [³H]Ro, 15–1788, Life Sci. 37: 345–355.
McKernan, R. M., Quirk, K., Prince, R., Cox, P. A., Gillard, N. P., Ragan, C. I., und Whiting, P. J. (1991), GABA_A receptors immunopurified from rat brain with α-subunit specific antibodies have unique pharmacological properties, Neurone 7: 667–676.
Quirk, K., Gillard, N. P., Ragan, C. I., Whiting, P. J., und McKernan, R. M. (1994), Y-Aminobutyric acid Type A receptors in the rat brain can contain both Y2 and Y3 subunits but Y1 does not exist in combination with another Y-subunit, Mol. Pharmacol. 45: 1061–1070.
Wafford, K. A., Whiting, P. J., und Kemp, J. A. (1993), Differences in affinity and efficacy of benzodiazepine receptor ligands on recombinant GABA_A receptor subtypes, Mol. Pharmacol. 43: 240–244.
Whiting, P. W., Wafford, K., und McKernan, R. M. (1996), GABA_A receptors in the central nervous system, International Reviews in Neurobiology.
Wisden, W., Herb, A., Wieland, H., Keinanen, K., Luddens, H., und Seeberg, P. H. (1991), Febs Lett. 289, 227–230.
BEISPIEL 1
FG 8094 wurde in 0,5%iger Carboxymethylcellulose-Lösung suspendiert, um eine injizierbare Lösung bereitzustellen.
BEISPIEL 2
Die folgenden Beispiele illustrieren pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß der Erfindung.
Tabletten, die 1–25 mg FG 8094 enthalten
Tabletten, die 26–100 mq FG 8094 enthalten
FG 8094, Cellulose, Lactose und ein Teil der Maisstärke werden gemischt und mit 10%iger Maisstärkepaste granuliert. Das resultierende Granulat wird gesiebt, getrocknet und mit dem Rest der Maisstärke und dem Magnesiumstearat gemischt. Das resultierende Granulat wird dann zu Tabletten gepreßt, die 1,0 mg, 2,0 mg, 25,0 mg, 26,0 mg, 50,0 mg und 100 mg der aktiven Verbindung pro Tablette enthalten.
BEISPIEL 3
Das beispielhafte FG 8094 (1,5 mg) wurde mit Hydroxypropylmethylcellulose (58,5 mg) kombiniert, um ein kleines Pellet zu bilden. Die Pellets wurden subkutan Ratten implantiert. Die resultierenden Blutspiegel von FG 8094 waren für mehr als 6 Stunden höher als 100 ng/ml.
Allgemeine Verfahren
1. Radioliganden-Bindungsstudien
Die Radioliganden-Bindungsstudien wurden durchgeführt unter Verwendung von Membranen, welche aus Zellen präpariert wurden, die stabil mit den folgenden Untereinheitskombinationen transfiziert worden waren: α₁β₃γ₂, α₂β₃γ₂, α₃β₃γ₂, α₅β₃γ₂, α₆β₃γ₂. Die Inkubationen erfolgten unter Verwendung von 20–100 mg Membranprotein in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml in 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, für eine Stunde bei Raumtemperatur vor der Beendigung durch Whatman GF/C-Filter, gefolgt von 3 × 3 ml-Waschschritten mit 5 mM Tris-HCl, pH 7,5, und Szintillationszählung. [³H]Ro 15–1788 wurde als Radioligand eingesetzt, um GABA_A-Rezeptoren zu markieren, mit der Ausnahme von Zellen, die α₆β₃γ₂ exprimierten, bei denen [³H]Ro 15–4513 verwendet wurde, da dieser Rezeptortyp [³H]Ro 15–1788 nicht mit hoher Affinität bindet. Die unspezifische Bindung wurde mit 10 μM Ro 15–4513 bestimmt und die Radioliganden wurden in Konzentrationen eingesetzt, die dem doppelten ihrer Kd-Werte für jeden Subtyp entsprachen. Die Ki-Werte wurden mit der Cheng-Prussof-Gleichung berechnet.
2. In vivo-[³H]Ro 15–1788-Bindung im Mausgehirn
Die in vivo-Bindung von [³H]Ro 15–1788 an Mausgehirn erfolgte im wesentlichen wie von Goeders und Kuhar (1985) beschrieben. Männliche Schweizer-Webster-Mäuse erhielten eine 0,9%ige NaCl-Lösung, enthaltend 50 mCi/kg [³H]Ro 15–1788 (0,05 ml/10 g Körpergewicht) über die Schwanzvene. Die Tiere wurden durch Enthauptung drei Minuten später getötet, zu welchem Zeitpunkt Gipfelmengen an [³H]Ro 15–1788 im Gehirn meßbar waren (Daten nicht gezeigt). 30 Minuten vor der Tötung wurde FG 8094 (0,3, 1,0, 3,0 und 10,0 m/kg) oder Diazepam (30,0 mg/kg, um die unspezifische Bindung zu definieren) intraperitoneal in 0,5%iger Carboxymethylcellulose (CMC) gegeben. Jedes Mausgehirn wurde dann schnell entnommen, in 5,0 ml 50 mM Tris-HCl, 5,0 mM EDTA, pH 7,4, bei 4°C unter Verwendung eines Ultra-Turrax-Homogenisators für 10 s bei Einstellung 5 homogenisiert. In einer separaten Reihe von Experimenten wurden auch verschiedene Gehirnbereiche, hinsichtlich ihrer bevorzugten Expression bestimmter GABA-Subtypen ausgewählt, untersucht. Die Bindung von [³H]Ro 15–1788 an das Cerebellum ist fast ausschließlich α₁-artig (Quirk et al., 1994), während die Bindung an das Rückenmark eine Bindung an Rezeptoren anzeigt, welche α₂- oder α₃-Subtypen enthalten, α₁, α₄ und α₅ sind in dieser Region selten oder abwesend (Wisden et al., 1992). Die Gehirne wurden schnell in Vorderhirn und Cerebellum aufgetrennt und das Rückenmark wurde ebenfalls entfernt. Jedes Vorderhirn wurde in 4,0 ml Puffer (etwa 14 ml/g Naßgewicht an Gewebe) homogenisiert, jedes Cerebellum wurde in 1,0 ml Puffer (etwa 14 ml/g Naßgewicht an Gewebe) homogenisiert und jedes Rückenmark in 1,0 ml Puffer (etwa 20,0 mg/g Naßgewicht an Gewebe). Homogenatvolumina (3 × 200 ml) wurden schnell durch GF/B-Filter filtriert, mit 2 × 5,0 ml Volumina eiskaltem Puffer gewaschen und die restliche Radioaktivität mittels Flüssigszintillations-Spektroskopie gezählt.
3. Elektrophysiologische Studien – funktionelle Wirkungen von FG 8094
Bindungsstudien mit transfizierten Zellen, die α₁β₃γ₂S, α₂β₃γ₂S und α₅β₃γ₂S enthielten, haben Verbindungen mit α₅-Selektivität identifiziert. Diese Verbindungen wurden mit Hilfe elektrophysiologischer Techniken (Wafford et al., 1993) studiert, um deren funktionelle Wirkungen auf α₁β₂γ₂S-, α₂β₂γ₂S-, α₃β₂γ₂S-, α₅β₂γ₂S- und α₆β₂γ₂S-GABA_A-Rezeptoren, die in Xenopus-Oozyten exprimiert worden waren, zu bestimmen. Oozytenkerne erhielten eine direkte Injektion mit 10,0–20,0 nl der relevanten cDNAs (6,0 ng/μl), die gentechnisch in den Expressionsvektor pCDM8 eingebracht worden waren. Nach einer Inkubation für 24 h wurden die Oozyten in ein 50-ml-Bad eingebracht und mit Salzlösung gespült. Durch Anwendung des Zweielektroden-Spannungsklammer-Aufzeichnungsverfahrens konnten die GABA-aktivierten Ströme durch Baden der Zelle in einer GABA-enthaltenden Lösung gemessen werden.
Zuerst wurde eine reproduzierbare Stromreaktion unter Einsatz einer GABA-Konzentration etabliert, welche etwa 20% der maximalen GABA-Reaktion ergab, welche hervorgerufen werden konnte, (EC₂₀). Eine gemeinsame Verabreichung der Testverbindung mit dieser EC₂₀-Konzentration an GABA führte zu einer Modulierung der Reaktion über eine Wirkung an der BZ-Bindungsstelle. Die Reaktion konnte durch einen BZ-Rezeptor-Agonisten potenziert oder durch einen inversen BZ-Rezeptor-Agonisten inhibiert werden.
4. Krampfanfall- und Kognitionssstudien
Arzneiwirkstoffe
FG 8094 wurde von der Gruppe der medizinischen Chemie des Merck, Sharp und Dohme Neuroscience Research Centre's synthetisiert und in 0,5% CMC suspendiert. Vehikel oder FG 8094 wurde i.p. 30 Minuten vor Beginn des ersten Trainingsversuchs verabreicht.
Krampfförderungstest
(i) akute Behandlung
60 native männliche Sprague Dawley-Ratten (225–265 g), die in Gruppen von vier mit frei zugänglichem Futter und Wasser untergebracht waren, dienten als Versuchssubjekte. Die Ratten wurden einer von sechs Gruppen zugeordnet und erhielten: Vehikel oder 0,5, 1,0, 2,0, 4,0 mg/kg FG 8904 oder 10,0 mg/kg des nicht-selektiven inversen Rezeptor-Agonisten CGS 8216, eines bekannten krampffördernden Mittels. Vehikel, FG 8094 oder CGS 8216 wurde i.p. 30 Minuten vor einer Inrusion des krampfauslösenden Mittels Pentylentetrazol (PTZ, 40 mg/ml) verabreicht. PTZ wurde in die Schwanzvene der Ratte mit einer Rate von 1,0 ml/Min. infundiert. Die Neigung für klonische und tonische Krampfanfälle wurde aufgezeichnet und der jeweilige Schwellenwert wurde mit Hilfe der Gleichung: Schwellenwertdosis = Infusionsrate (ml/s) × PTZ (mg/ml) × (1000/Rattengewicht) × Latenzzeit (s) berechnet.
(ii) chronische Behandlung
Die bei dieser Studie eingesetzten Ratten erhielten eine chronische Behandlung mit FG 8094 während eines MWM-Experiments. Die Ratten erhielten eine intraperitoneale Dosis einmal pro Tag (Montag bis Freitag) und erhielten insgesamt 24 Dosen. Nach jeder Arzneiwirkstoffverabreichung wurden die Ratten in einem MWM getestet und erhielten die letzte Dosis an Arzneiwirkstoff 48 Stunden vor dem Krampfförderungstest. Die Versuchssubjekte wurden einer von vier Behandlungsgruppen (n = 8) zugeordnet und erhielten entweder Vehikel, 0,1, 0,3 oder 1,0 mg/kg FG 8094.
Am Tag des Krampfförderungstests wurden die Ratten festgehalten und Pentylentetrazol (PTZ, 40,0 mg/ml) wurde wie oben beschrieben infundiert. Die Latenzzeit (s) bis zu sowohl klonischen als auch tonischen (volles Ausmaß) Krämpfen wurde aufgezeichnet. Die Latenzzeitdaten wurden transformiert, um die Dosis an PTZ zu ergeben, welche erforderlich war, um den Schwellenwert von sowohl klonischen als auch tonischen Krampfanfällen zu erreichen.
Kognitionsstudien
Tiere
Männliche PVG-Haubenratten (Bantin & Kingman, Hull, V. K.) mit einem Gewicht von etwa 300 g wurden in Gruppen von vier mit freiem Zugang zu Futter und Wasser untergebracht. Die Tiere wurden bei einem 12/12 h Licht-Dunkelheit-Zyklus gehalten, wobei die Beleuchtung um 07:00 h eingeschaltet wurde.
Apparatur
Das Morris-Wasserlabyrinth besteht aus einem weißen, kreisförmigen Fiberglaspool mit einem Durchmesser von 2 m, gefüllt mit einer trüben Mischung von Wasser und weißem Farbstoff (E308, Morton International), der bei 26–28° C gehalten wird. Der Pool wurde in der Mitte eines schallberuhigten Raumes untergebracht, an dessen Wänden Bilder mit kontrastreichen schwarzen und weißen Mustern als räumliche "Außerlabyrinth"-Hinweise gezeigt wurden. "Norden" wurde annähernd bestimmt und der Pool in vier gleiche Quadranten "Nordosten", "Südosten", "Südwesten" und "Nordwesten" aufgeteilt. Eine verborgene Plattform (13 × 13 cm), die 2 cm unter die Wasseroberfläche eingetaucht war, wurde in die Mitte des NE-Quadranten plaziert.
Eine Videokamera mit geschlossenem Kreislauf, die mit einem Weitwinkelobjektiv ausgerüstet war, wurde direkt über der Mitte des Pools montiert und mit einem Bildanalysator verbunden, der das Bild digitalisierte. Die digitale Information wurde zu einem Archimedes-Mikrocomputer geleitet, auf dem "Wasserlabyrinth" lief, ein Softwarepaket, das von Paul Fray LTD bezogen wurde (Cambridge, V. K.). Das Softwarepaket lieferte die folgenden Meßwerte: Latenzzeit bis zum Erreichen der Plattform, Länge des genommenen Weges, mittlere Schwimmgeschwindigkeit, verbrauchte Zeit und Gesamtentfernung, die in dem Zielquadranten zurückgelegt wurde.
Training
Die Ratten wurden vier Behandlungsgruppen zugeordnet (n = 8): Vehikel, 0,1, 0,3, 1,0 mg/kg FG 8094. Während der Lernphase des Experiments wurden mit allen Gruppen vier Versuche pro Tag vorgenommen. Während dieser Zeit war die verborgene Plattform in dem NE-Quadranten des Wasserlabyrinths untergetaucht. Die Ratte wurde aus dem Heimatkäfig genommen und in das Wasserlabyrinth an einem von vier quasi willkürlich bestimmten Orten ("Norden", "Osten", "Süden" oder "Westen") gebracht, wobei ihr Kopf zur Poolwandung zeigte und diese fast berührte. Die Versuche begannen, als die Ratte von dem Versuchsleiter freigelassen wurde, und endeten, als die Ratte auf die Plattform kletterte, und die mittlere Fluchtlatenzzeit wurde aufgezeichnet. Die maximale Versuchsdauer betrug 60 s. Falls nach dieser Zeit die Ratte nicht auf die Plattform geklettert war, endete der Versuch automatisch, der Versuchsleiter plazierte die Ratte auf die Plattform und es wurde eine Fluchtlatenzzeit von 60 s aufgezeichnet. Die Ratte blieb 30 s lang auf der Plattform und wurde dann in einen undurchsichtigen Kunststoffbehälter mit hohen Seitenwänden für weitere 30 s verbracht (Intervall zwischen den Versuchen, ITI). Am Ende des ITI wurde die Ratte erneut in den Pool gebracht, aber an einem anderen Ort, und nach dem Freilassen begann der nächste Versuch. Diese Prozedur wurde wiederholt bis vier Versuche abgeschlossen worden waren.
Lern- und Gedächtnistests
Sondierungsversuche
Normalerweise nimmt die Fluchtlatenzzeit im Verlauf von mehreren Trainingstagen von 60 s auf etwa 20 s ab. Ein "Sondierungsversuch" beurteilt das räumliche Gedächtnis der Ratte für die Lage der verborgenen Plattform. Während dieses Versuchs wurde die Plattform aus dem Wasserlabyrinth entfernt und der Ratte erlaubt, den Pool 60 s lang zu durchsuchen, bevor sie aus dem Pool genommen wurde. Falls die Behandlung das Gedächtnis der Ratte für die Lage der Plattform verbessert, wird sie längere Zeit damit verbringen, den Quadranten zu durchsuchen, in dem die Plattform zuvor verborgen war (NE), als eine Ratte, die eine Vehikel-Behandlung erhielt.
Gesfützte Erinnerung
Leistungsdefizite, welche auf arzneiwirkstoff-induzierten Nebenwirkungen (wie z. B. verschwommene Sicht oder motorische Defizite, die zu einem beeinträchtigten Schwimmvermögen führen) beruhen könnten, wurden mittels gestützter Erinnerung festgestellt. Bei dieser Prozedur wurde die Plattform ebenfalls in den NE-Quadranten plaziert, jedoch 3 cm über den Wasserspiegel erhoben und somit für die Ratte sichtbar. Falls die Behandlung keine Auswirkungen auf die mittleren Fluchtlatenzzeiten bis zu der sichtbaren Plattform hat, können etwaige Gruppenunterschiede in den mittleren Fluchtlatenzzeiten bis zu einer unsichtbaren Plattform einer Wirkung auf den kognitiven Prozess zugeschrieben werden. Das Trainingsschema war identisch mit dem Trainingsschema, welches für das Lerntraining angewandt wurde, und wurde fortgesetzt, bis die mittleren Fluchtlatenzzeiten sich nicht signifikant zwischen den Gruppen unterschieden.
Erinnerungsvermögen
Sechs Tage nach dem Sondierungsversuch, während welcher Zeit die Ratten dem Wasserlabyrinth nicht ausgesetzt wurden oder FG 8094 erhielten, wurden die Ratten erneut unter Anwendung des Lernprotokolls mit der in dem NE-Quadranten untergetauchten Plattform getestet.
Umkehrlernen
Das Umkehrtraining war mit der Lernphase des Experiments identisch, mit der Ausnahme, daß die Plattform in der Mitte des SW-Quadranten untergetaucht war.
Ergebnisse
1. Selektivität von FG 8094 für α₅β₃γ₂
Konkurrenzkurven bei jeder der Zelllinien zeigen, daß FG 8094 selektiv für Rezeptoren ist, welche die α₅-Untereinheit enthalten (siehe Tabelle 1). FG 8094 war 107fach selektiv für α₅- enthaltende Rezeptoren gegenüber α₁, 60fach selektiv gegenüber α₂, 53fach selektiv gegenüber α₃ und 184fach selektiv gegenüber α₆. Dies repräsentiert ein neues pharmakologisches Profil, da die meisten selektiven BZs, wie z. B. Zolpidem oder CL 218872, eine größere Affinität für α₁- als für α₅-enthaltende Rezeptoren haben (Pritchett und Seeberg, 1990). FG 8094 hat eine größere Präferenz für α₅-enthaltende Rezeptoren gegenüber α₁-enthaltenden Rezeptoren als jede andere bisher berichtete Verbindung.
2. Besetzung von GABA_A-Subtypen auf Grundlage der Verdrängung der [³H]Ro 15–1788-Bindung aus dem gesamtem Gehirn durch FG 8094 in vivo
Drei Minuten nachdem [³H]Ro 15–1788 intravenös Mäusen verabreicht worden war, waren signifikante Niveaus an Radioaktivität im Gehirn vorhanden. Es wurde geschätzt, daß mehr als 95% von [³H]Ro 15–1788 mit Membranen assoziiert war, da mehr als 95% der Radioaktivität nach Filtration der Homogenate zurückgehalten wurde (Daten nicht gezeigt).
Diazepam (30,0 mg/kg) verdrängte 90% der [³H]Ro 15–1788-Bindung im Gehirn, was anzeigt, daß in den Membranen vorhandener Ligand an GABA_A-Rezeptoren gebunden wurde. Bei intraperitonealer Gabe in Dosen von bis zu 3,0 mg/kg verdrängte FG 8094 nicht signifikant die spezifische [³H]Ro 15–1788-Bindung (Daten nicht gezeigt). Dies impliziert, daß die Anzahl irgendeines anderen GABA_A-Rezeptor-Subtyps, die bei diesen Dosen besetzt war, klein und unterhalb der Nachweisgrenze in diesem Assay sein müßte. Nachdem FG 8094 die höchste Affinität für α₅-enthaltende Rezeptoren aufweist (Tabelle 1) und diese weniger als 5% der gesamten GABA_A-Rezeptorpopulation darstellen, ist es möglich, daß Dosen ≤ 3,0 mg/kg FG 8094 diesen Subtyp besetzen. Bei 10,0 mg/kg verdrängte FG 8094 die [³H]Ro 15–1788-Bindung signifikant (p < 0,05). Rezeptoren, welche α₁-, α₂- und α₃-Untereinheiten enthalten, bilden die drei größten Subtypen im Gehirn und machen etwa 90% der GABA_A-Rezeptoren aus (McKernan et al., 1991, Whiting et al., 1994). Bei dieser Dosis ist es wahrscheinlich, daß FG 8094 überwiegend α₂- und α₃-enthaltende Rezeptoren besetzt (für die es eine höhere Affinität als für α₁-enthaltende Rezeptoren besitzt). Die Rezeptoren, welche durch FG 8094 mit 10,0 mg/kg nicht verdrängt werden, sind am wahrscheinlichsten eine α₁-Untereinheit enthaltende Rezeptoren, die 40–50% aller GABA_A-Rezeptoren im Gehirn umfassen und für die FG 8094 die niedrigste Affinität hat.
Die Besetzung von α₂-, α₃- und α₁-enthaltenden Rezeptoren 30 Minuten nach Verabreichung von FG 8094 (1,0 mg/kg) wurde direkter untersucht durch die Ermittlung der Verdrängung der [³H]Ro 15–1788-Bindung in einer Gehirnregion, die hinsichtlich dieser Subtypen angereichert ist. Das Cerebellum wurde als ein α₁-selektives Gewebe verwendet und das Rückenmark als ein α₂/α₃-selektives Gewebe. Das Vorderhirn, welches die meisten Subtypen von GABA_A-Rezeptoren enthält, war ebenfalls eingeschlossen. Die Inhibierung der in vivo-Bindung von [³H]Ro 15–1788 30 Minuten nach Verabreichung von FG 8094 (1,0 mg/kg) ist in Tabelle 2 gezeigt.
Unter der Annahme, daß die prozentuale Inhibierung der [³H]Ro 15–1788-Bindung in vivo ein Maß der Rezeptorbesetzung ist, kann die Konzentration an der Rezeptorstelle im Gehirn nach Clarke's Gleichung berechnet werden (Besetzung = [Arzneiwirkstoff] / [Arzneiwirkstoff] + Ki). Setzt man die bei α₁- und α_2/ ₃-enthaltenden Rezeptoren bestimmte Besetzung ein, beträgt die Konzentration an FG 8094, die an BZ-Bindungsstellen im Rattengehirn verfügbar ist, 7,8 nM bzw. 13,2 nM. Die Besetzung bei α₅-enthaltenden Rezeptoren kann aufgrund der geringen Häufigkeit des Rezeptors nicht direkt gemessen werden, kann jedoch mit Hilfe der Arzneiwirkstoffkonzentration und Bindungsaffinität mit Clarke's Gleichung berechnet werden.
Diese sagt eine 95–97%ige Besetzung von α₅-enthaltender Rezeptoren 30 Minuten nach Verabreichung von FG 8094 (1 mg/kg) voraus.
3. Elektrophysiologische Studien – Funktionelle Wirkungen von FG 8094
Die modulatorische Wirkung auf den GABA-EC₂₀-Wert ist in 1 gezeigt für FG 8094 bei 1 μM, was für alle untersuchten Rezeptor-Subtypen nahezu maximal sein würde, und für zwei Standardverbindungen, Flunitrazepam (1 μM, ein voller Rezeptor-Agonist) und DMCM (1 μM, ein voller inverser Rezeptor-Agonist), bei Konzentrationen, welche in Bindungsstudien mit α₁β₂γ₂S maximal sein würden, die zeigt, daß FG 8094 ein voller inverser Rezeptor-Agonist bei α₅β₂γ₂ ist. 2 vergleicht die Wirkungen von FG 8094 auf Rezeptoren, die eine andere α-Untereinheit enthalten, und demonstriert, daß es eine wesentlich niedrigere Wirksamkeit auf andere α-Untereinheitskombinationen hat. Es hat keine eigene Wirkung auf α₁β₂γ₂, was nahelegt, daß es ein Antagonist mit niedriger Affinität ist, und es ist ein partieller inverser Rezeptor-Agonist bei α₂β₂γ₂- und α₃β₂γ₂-Rezeptoren. Ein Vergleich der Wirksamkeit bei Verwendung einer Standardkonzentration des Arzneiwirkstoffs bei α₁β₂γ₂S demonstrierte, daß FG 8094 funktionell selektiv für α₅-enthaltende Rezeptoren ist und seine Wirkungen hauptsächlich über diesen Subtyp entfaltet.
4. Krampfanfall- und Kognitionsstudien
(I) Akute Behandlung – Eine Einweg-Varianzanalyse der mittleren Schwellenwertdosen für tonische und klonische Krampfanfälle offenbarte eine Hauptwirkung auf tonische [F(5,49) = 3,70; p = 0,007], jedoch nicht klonische [F(5,48) = 2,01; p = 0,09)] Anfälle. Post hoc-Tests offenbaren, daß nur CGS 8216 signifikant die Schwellenwertdosen für tonische Krampfanfälle verringerte, was zeigt, daß es eine krampffördernde Wirkung besaß.
(I) Chronische Behandlung – Eine Varianzanalyse offenbarte keine signifikante Behandlungswirkung auf die Schwellenwertdosis von PTZ für entweder klonische [F(3,25) = 0,23; p = 0,87] oder tonische [F(3,25) = 0,06; p = 0,98] Anfälle. Diese Ergebnisse demonstrieren, daß das in der Studie verwendete chronische Behandlungsprotokoll nicht zu einer erhöhten Sensitivität für das krampffördernde Mittel PTZ führte.
Lernversuche
3a illustriert die mittleren Fluchtlatenzzeiten während der neuntägigen Trainingsperiode. Eine Varianzanalyse der mittleren Schwimmgeschwindigkeit während der Flucht zu der verborgenen Plattform offenbarte keine signifikante Dosiswirkung [F(3,28) = 0,87], keine signifikante Auswirkung des Tags [F(8,216) = 1,44, p > 0,1] und keine Dosis-Tag-Wechselwirkung [F(24,216) = 1,04, p > 0,4]. Eine Varianzanalyse der mittleren Fluchtlatenzzeiten mit den Faktoren der Behandlung und des Tages offenbarten eine hauptsächliche Behandlungswirkung [F(3,28) = 3,01, p < 0,05], eine signifikante Auswirkung des Tages [F(8,216) = 34,67, p < 0,001], jedoch keine Dosis-Tag-Wechselwirkung [F(24,216) = 0,75, p > 0,5]. Obwohl die mittleren Fluchtlatenzzeiten von Gruppen, die 0,3 und 1,0 mg/kg FG 8094 erhalten hatten, kürzer zu sein scheinen als bei der Vehikel-Kontrollgruppe oder der 0,1-mg/kg-Gruppe, wurde die Beobachtung durch Newman Keul-Tests post hoc nicht bestätigt.
Sondierungsversuche
Eine Varianzanalyse der prozentualen Zeit, die im Nordost-Quadranten schwimmend verbracht wurde, offenbarte keine signifikante Dosiswirkung [F(3,28) = 0,18] (siehe 3b hinsichtlich Details), was impliziert, daß das Erinnerungsvermögen oder die Lerneffizienz sich bei den Gruppen nicht unterschied.
Gestützte Erinnerung
Eine Varianzanalyse der mittleren Fluchtlatenzzeit, um die sichtbare Plattform zu erreichen, zeigte keine signifikante Dosiswirkung [F(3,28) = 0,54]. Es gab jedoch eine signifikante Dosiswirkung auf die mittlere Weglänge [F(3,28) = 4,27, p < 0,05]. Newman-Keuls-Tests post hoc zeigten, daß die Vehikel-Gruppe einen signifikant längeren Weg zurücklegte als alle Gruppen, denen FG 8094 gegeben wurde (3c).
Erinnerungstest
Eine Varianzanalyse der mittleren Fluchtlatenzzeit offenbarte eine signifikante Dosiswirkung [F(3,28) = 3,53, p < 0,05]. Ein Newman-Keuls-Test post hoc zeigte, daß die mittlere Fluchtlatenzzeit der Vehikelgruppe länger war als bei irgendeiner der FG 8094-Gruppen (p < 0,05). Diese Daten legen nahe, daß die Gruppen, die FG 8094 erhielten, die räumliche Information bezüglich der Lage der verborgenen Plattform besser als die Vehikel-Kontrollgruppe behielten (siehe 3d).
Umkehrlernen
Während des Umkehrlernens wurde die Plattform in die Mitte des Südwest-Quadranten verlegt. Eine Varianzanalyse der mittleren Fluchtlatenzzeiten offenbarte eine signifikante Dosiswirkung [F(3,28) = 3,31, p < 0,05], eine signifikante Versuchswirkung [F(3,84) = 9,53, p < 0,001], jedoch keine signifikante Wechselwirkung [F(9,84) = 1,66, p > 0,1]. Ein Newman- Keuls-Test post hoc zeigte an, daß die mittlere Fluchtlatenzzeit der Vehikelgruppe signifikant länger als die aller FG 8094-Gruppen war (p < 0,05). Bei nachfolgenden Tagen des Umkehrlernens hatte die Dosis keine Wirkung auf die mittleren Fluchtlatenzzeiten. Somit legen diese Daten nahe, daß FG 8094 das Vermögen der Ratten verbesserte, eine neue räumliche Lage der verborgenen Plattform zu lernen.
Diskussion
Benzodiazepin-Rezeptor-Agonisten haben angstlösende und krampflösende Wirkungen bei Menschen und Tieren, induzieren jedoch auch Amnesie. Umgekehrt haben inverse BZ-Rezeptor-Agonisten angstfördernde und krampffördernde Wirkungen, haben jedoch kognitionsverbessernde Wirkungen bei Lebewesen. BZ-Rezeptor-Antagonisten sind ohne eigene Wirkung, blockieren jedoch die Wirkungen von sowohl BZ-Rezeptor-Agonisten als auch inversen BZ-Rezeptor-Agonisten. Im Gegensatz zu vollen BZ-Rezeptor-Agonisten zeigen die vorliegenden Studien, daß der selektive inverse α₅-BZ-Rezeptor-Agonist FG 8094 keine krampffördernden Wirkungen hat, jedoch kognitionsverbessernde Wirkungen bei Lebewesen besitzt.
Die Ergebnisse der in vivo-Bindungsexperimente zeigten, daß FG 8094 bei 1,0 mg/kg praktisch alle α₅-enthaltenden Rezeptoren besetzt, wohingegen weniger als 35% und 15% der α_2/ ₃- bzw. α₁-Rezeptoren besetzt sind. Deshalb ist FG 8094 bei 1,0 mg/kg selektiv für α₅-enthaltende Rezeptoren. Bei 10,0 mg/kg besetzt FG 8094 in signifikanter Weise α₁-, α₂- und α₃-enthaltende Rezeptoren und folglich ist FG 8094 bei Dosen oberhalb von 1,0 mg/kg nicht selektiv für α₅-enthaltende Rezeptoren.
Bei elektrophysiologischen Experimenten wurde demonstriert, daß FG 8094 ein voller inverser Rezeptor-Agonist gegenüber dem α₅β₂γ₂-Rezeptor-Subtyp, ein schwacher partieller inverser Rezeptor-Agonist gegenüber Rezeptor-Subtypen, die α₂ oder α₃ enthalten, und ein Antagonist gegenüber α₁β₂γ₂, der hauptsächlichen Untereinheitskombination im Gehirn, ist. Diese Daten legen nahe, daß die hauptsächlichen in vivo-Wirkungen von FG 8094 auf den α₅-enthaltenden Subtyp ausgeübt werden, der sich überwiegend im Hippocampus befindet.
In dem MWM werden Ratten trainiert, um eine untergetauchte Plattform in einem Pool von trübem Wasser aufzufinden. Es wird angenommen, daß die Tiere die verschiedenen visuellen Hinweise nutzen, die an den Wänden des Raums angebracht sind, um ihre Suchstrategie zu leiten. Ein solcher Prozess setzt eine flexible kognitive Verarbeitung voraus, da das Tier zuerst eine "Karte" des Raums erstellen muss (d. h., die räumliche Beziehung zwischen den stationären visuellen Hinweisen und der verborgenen Plattform) und dann die Karte verwenden, um seinen Weg zu der verborgenen Plattform zu leiten. Eine wohltrainierte Ratte, die an willkürlichen Orten in den Pool gebracht wird, schwimmt mehr oder weniger direkt zu der verborgenen Plattform, was nahelegt, daß sie eine detaillierte Kenntnis des lokalen Areals oder eine "kognitive Karte" besitzt und eine neue Route zu der verborgenen Plattform bei jedem neuen Versuch planen kann.
Bei dem vorliegenden Experiment legt die Betrachtung von 3a, welche die mittlere Latenzzeit (s), um die verborgene Plattform an aufeinander folgenden Trainingstagen zu finden, zeigt, nahe, daß die Ratten, die 0,3 und 1,0 mg/kg erhalten haben, durchgehend die Plattform in geringerer Zeit als die Gruppen mit Vehikel oder 0,1 mg/kg fanden, obwohl dieser Effekt keine statistische Signifikanz erreichte. Während des Sondierungsversuchs gab es keinen Unterschied in dem Zeitaufwand, den die Kontroll- und Arzneiwirkstoffgruppen damit verbrachten, den Quadranten zu suchen, in dem die untergetauchte Plattform während der Trainingsversuche plaziert worden war, was nahelegt, daß es keinen Unterschied in dem Vermögen der verschiedenen Gruppen, eine kognitive Karte zu erstellen und zu verwenden, gab. Gleichermaßen gab es keinen Unterschied zwischen den Gruppen in ihren mittleren Latenzzeiten (s), eine sichtbare Plattform zu finden, was anzeigt, daß FG 8094 keine Auswirkungen auf motorische oder sensorische Systeme hatte. Jedoch war am ersten Tag des normalen Trainings, sechs Tage nach dem letzten Versuch mit einer sichtbaren Plattform, die mittlere Latenzzeit zur Auffindung der verborgenen Plattform signifikant kürzer bei allen Gruppen, die FG 8094 erhalten hatten. Diese Daten implizieren, daß die räumliche Beziehung zwischen der Lage der Plattform und den visuellen Hinweisen von den Ratten, die FG 8094 erhalten hatten, besser behalten und/oder wiedergefunden wurde als von denjenigen, denen Vehikel gegeben worden war. Darüber hinaus waren, wenn die verborgene Plattform zu einer neuen Position in der Mitte des Südwest-Quadranten verlegt wurde, Ratten, die 1,0 mg/kg FG 8094 erhalten hatten, schneller beim Lernen dieser neuen Position als Ratten, die Vehikel erhalten hatten.
Zusammenfassend, FG 8094 ist ein selektiver inverser α₅-BZ-Rezeptor-Agonist, der keine krampffördernden Wirkungen aufweist. Im MWM, einem hippocampus-abhängigen Raumgedächtnistest, erhöhte FG 8094 das Vermögen von Ratten, die räumliche Information zu behalten, signifikant, was nahelegt, daß es die kognitive Verarbeitung verbessert.
Tabelle 1
Tabelle 1: Ki-Werte für Benzodiazepin-Stellen auf stabil transfizierten Zellen
Die Inhibierungskurven wurden mit Hilfe von Rezeptoren erstellt, die mit [³H]Ro 15–1788 in einer Konzentration vom Doppelten des Kd-Werts markiert worden waren. Die Ki-Werte wurden nach der Cheng-Prussof-Gleichung berechnet. Die gezeigten Daten sind Mittelwerte ± SEM für 3–6 Bestimmungen.
Tabelle 2: Inhibierung der [³H]Ro 15–1788-Bindung in vivo in drei Gehirnregionen nach FG 8094
Mäusen wurde intraperitoneal FG 8094, 10 mg/kg oder 1 mg/kg, 30 Minuten vor der Tötung und [³H]Ro 15–1788 (0,1 mCi/g) injiziert. Die Gehirnregionen wurden seziert, homogenisiert und filtriert wie bei den Methoden beschrieben. Die Daten sind ausgedrückt als prozentuale Inhibierung der Bindung relativ zu (vehikel-behandelten) Kontrolltieren und sind der Mittelwert ± SEM von 5 (10 mg/kg) oder 10 (1 mg/kg) Bestimmungen.
Legende der Figuren
1
Wirkungen von Flunitrazepam (1 μM), DMCM (1 μM) und FG 8094 (1 μM) auf die GABA-EC₂₀-Stromreaktion in Oozyten, die α₁β₂γ₂ und α₅β₂γ₂ exprimierten. Die Daten sind ausgedrückt als der Mittelwert ± Standardfehler von mindestens 4 separaten Oozyten.
2
Wirkungen von FG 8094 (1 μM) auf die GABA-EC₂₀-Stromreaktion in Oozyten, die verschiedene α-Untereinheits-enthaltende Rezeptoren zusammen mit β₂γ₂ exprimieren. Die Daten sind ausgedrückt als der Mittelwert ± Standardfehler von mindestens 4 separaten Oozyten.
3
Die mittlere Latenzzeit (s), um eine untergetauchte Plattform in dem Nordost-Quadranten des Morris-Wasserlabyrinths an jedem Trainingstag aufzufinden (a), die verbrauchte Zeit zur Durchsuchung des Nordost-Quadranten, ausgedrückt als Prozentsatz der gesamten Versuchslänge (60 s) (b), die mittlere Latenzzeit (s), um eine sichtbare Plattform im Nordost-Quadranten des Wasserlabyrinths am letzten Tag des Trainings mit der sichtbaren Plattform zu finden (c), die mittlere Latenzzeit (s), um eine untergetauchte Plattform in dem Nordost-Quadranten sechs Tage nach dem letzten Trainingstag zu erreichen (d), ist für jede Behandlungsgruppe nach einer 30-minütigen i.p. Vorbehandlung mit Vehikel oder FG 8094 (Dosen wie gezeigt) gezeigt * über a zeigt an, daß der Mittelwert für diese Gruppe sich signifikant von dem Mittelwert der Vehikel-Kontrollgruppe unterscheidet (post hoc-Newman-Keuls-Tests, p < 0,05 angenommen).
Verabreichung als Pellets
Ein anschließendes Wasserlabyrinth-Experiment ähnlich dem oben beschriebenen, mit der Ausnahme, daß ein Pellet von FG 8094 subkutan zwei Stunden vor Beginn des Experiments implantiert wurde und das gesamte Training an einem Tag durchgeführt wurde, zeigte, daß FG 8094 wiederum die Leistung verbesserte. In einem zweiten Experiment wurden die Vehikel- oder FG-Pellets Ratten exakt wie oben beschrieben implantiert. Jedoch wurde nach den ersten vier Schwimmversuchen den Tieren (intravenös) [³H]FG 8094 injiziert und drei Minuten später wurden die Gehirne der Tiere schnell entfernt. Die in vivo-Bindung zeigte, daß FG 8094 etwa 85% der α₅-Subtyp-enthaltenden GABA_A-Rezeptoren im Gehirn besetzte. Ein drittes Experiment, identisch mit dem zweiten Experiment, mit der Ausnahme, daß den Tieren [³H]Ro 15–1788 injiziert wurde, zeigte, daß FG 8094 GABA_A-Rezeptoren, die den α₅-Subtyp nicht enthielten, nicht signifikant besetzte. Dies zeigt, (i) daß FG 8094 die Leistung in dem Wasserlabyrinth-Test der räumlichen Erinnerung verbesserte, (ii), daß das verwendete Dosierungsprotokoll sicherstellte, daß die Gehirnspiegel an FG 8094 ausreichend waren, um 85% der α₅-enthaltenden GABA_A-Rezeptoren zu besetzen, ohne signifikant Rezeptoren zu besetzen, die andere Subtypen enthielten. Diese Daten demonstrieren, daß der inverse α₅-Rezeptor-Agonist bei neurologischen Erkrankungen mit einem assoziierten Kognitionsdefekt von Nutzen ist und keine Krämpfe oder Sedierung verursachte.

Claims

Verwendung einer Verbindung, welche ein inverser GABA_A-α₅-Rezeptor-Agonist ist, der kein Rezeptor-Agonist oder inverser Rezeptor-Agonist bei GABA_A-α₁- und/oder GABA_A-α₂- und/oder GABA_A-α₃-Rezeptoren ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Verbesserung der Kognition bei einer Person, ohne Krämpfe zu verursachen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung kein Rezeptor-Agonist oder inverser Rezeptor-Agonist bei GABA_A-α₁- und GABA_A-α₂- und GABA_A-α₃-Rezeptoren ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Person ein Mensch mit Alzheimer-Krankheit ist.
Verwendung nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die kognitionsverbessernde Verbindung mindestens 25fach selektiv für α₅-Rezeptoren gegenüber α₁-Rezeptoren ist.
Verwendung nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, wobei die kognitionsverbessernde Verbindung mindestens 50fach selektiv für α₅-enthaltende Rezeptoren gegenüber α₁-, α₂- und α₃-enthaltenden Rezeptoren ist.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die kognitionsverbessernde Verbindung einen Ki (nM)-Wert gegenüber dem α₅β₃γ₂-Rezeptor von weniger als 2, gegenüber dem α₁β₃γ₂-Rezeptor von mehr als 20 aufweist.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die kognitionsverbessernde Verbindung einen Ki (nM)-Wert gegenüber dem α₂β₃γ₂-Rezeptor von mehr als 20 aufweist.
Verwendung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die kognitionsverbessernde Verbindung die Blut-Gehirn-Schranke nach oraler Verabreichung passiert.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche eine Verbindung und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger dafür umfaßt, wobei die Verbindung ein inverser GABA_A-α₅-Rezeptor-Agonist ist, der kein Rezeptor-Agonist oder inverser Agonist bei GABA_A-α₁- und/oder GABA_A-α₂- und/oder GABA_A-α₃-Rezeptoren ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei die Verbindung kein Rezeptor-Agonist oder inverser Rezeptor-Agonist bei GABA_A-α₁- und GABA_A-α₂- und GABA_A-α₃-Rezeptoren ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9 oder 10, geeignet zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit und die eine wirksame Menge einer Verbindung mit den in irgendeinem der Ansprüche 2 bis 8 angegebenen Eigenschaften umfaßt.
Verfahren zum Auffinden einer Verbindung, die zur Verbesserung der Kognition in der Lage ist, ohne Krämpfe zu verursachen, welches Verfahren den Einsatz eines GABA_A-bindenden Rezeptors zur Feststellung, daß die Verbindung ein inverser α₅-Agonist und kein Agonist oder inverser Agonist bei a, und/oder α₂ und/oder α₃ ist, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Verbindung kein Rezeptor-Agonist oder inverser Rezeptor-Agonist bei GABA_A-α₁- und GABA_A-α₂- und GABA_A-α₃-Rezeptoren ist.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei die Verbindung die in irgendeinem der Ansprüche 2 bis 8 angegebenen Eigenschaften aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung, die mit einem Verfahren der Ansprüche 12, 13 oder 14 aufgefunden wurde, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger dafür.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9, 10, 11 oder 15, welche an die orale Verabreichung angepaßt ist.
Verbindung, welche gemäß Anspruch 12, 13 oder 14 aufgefunden wurde, zur Verwendung für die Verbesserung der Kognition.