ES2201169T3 - Preparacion y uso de un ligando especifico del receptor gabaa alfa5 para el tratamiento de la enfermedad de alzheimer. - Google Patents

Preparacion y uso de un ligando especifico del receptor gabaa alfa5 para el tratamiento de la enfermedad de alzheimer.

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ES2201169T3 ES96903108T ES96903108T ES2201169T3 ES 2201169 T3 ES2201169 T3 ES 2201169T3 ES 96903108 T ES96903108 T ES 96903108T ES 96903108 T ES96903108 T ES 96903108T ES 2201169 T3 ES2201169 T3 ES 2201169T3
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Abstract

LA INVENCION PROPORCIONA UN METODO DE TRATAMIENTO O FABRICACION DE UN MEDICAMENTO ESTIMULANTE DE LAS FACULTADES COGNITIVAS, POR EJEMPLO EN EL TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER, CON UN LIGANDO ESPECIFICO DEL RECEPTOR GABA {SUB,A{AL}5}.

Description

Preparación y uso de un ligando específico del receptor GABA_{A} \alpha_{5} para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
La presente invención proporciona el uso de un compuesto para fabricar medicamentos que aumenten la cognición (por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades que producen demencia tales como la enfermedad de Alzheimer) y composiciones útiles en tal procedimiento.
Una serie de enfermedades que producen demencia, tales como la enfermedad de Alzheimer, se caracterizan por producir en el paciente un deterioro progresivo de la cognición. Claramente, sería deseable aumentar la cognición en sujetos que necesiten tal tratamiento, por ejemplo en sujetos con alguna enfermedad que produzca demencia.
McNamara y Skelton han descrito en Psychobiology 21:101-108, que el agonista inverso del receptor de benzodiazepinas \beta-CCM estimulaba el aprendizaje espacial en el laberinto acuático de Morris. Sin embargo, El \beta-CCM y otros agonistas inversos convencionales del receptor de benzodiazepinas tienen una acción proconvulsiva, por lo que claramente no pueden usarse como agentes estimuladores de la cognición en seres humanos.
Sin embargo, en la actualidad se ha descubierto que es posible obtener medicamentos con efectos estimuladores de la cognición pero sin los efectos proconvulsivos descritos anteriormente con los agonistas inversos del receptor de benzodiazepinas.
El sitio del receptor de benzodiazepinas está en el receptor GABA_{A}, una estructura generalmente aceptada como pentamérica, con un canal iónico integral de cloro formado por el segundo dominio transmembrana de cada una de las cinco subunidades. En el cerebro de mamíferos, usando modernas técnicas de clonaje molecular se ha identificado una familia de 14 subunidades del receptor GABA_{A}, concretamente las subunidades \alpha_{1}, \alpha_{2}, \alpha_{3}, \alpha_{4}, \alpha_{5}, \alpha_{6}, \beta_{1}, \beta_{2}, \beta_{3}, \lambda_{1}, \lambda_{2}, \lambda_{3}, \delta y \phi. La selección de cinco subunidades de un posible repertorio de 14 permite una gran variedad de combinaciones posibles, aunque el número de subtipos que se producen y la extensión de la heterogeneidad del receptor GABA_{A} todavía se desconoce. Cuando en lo sucesivo se habla de receptor \alpha_{1}, \alpha_{2}, \alpha_{3}, \alpha_{5} y \alpha_{6}, se hace referencia respectivamente a los receptores GABA_{A}\alpha_{1}, GABA_{A}\alpha_{2}, GABA_{A}\alpha_{3}, GABA_{A}\alpha_{5} y GABA_{A}\alpha_{6}.
En la actualidad se ha descubierto que el uso de un agonista inverso del receptor \alpha_{5} relativamente libre de cierta actividad en los sitios de unión de los receptores \alpha_{1} y/o \alpha_{2} y/o \alpha_{3}, se puede usar para proporcionar un medicamento útil para estimular la cognición sin producir convulsiones.
Por tanto, la presente invención proporciona el uso de un compuesto para fabricar un medicamento que potencie la cognición en un sujeto sin producir convulsiones, en el que el compuesto es un agonista inverso del receptor \alpha_{5} que no es un agonista de receptor o un agonista inverso de receptor en los receptores \alpha_{1} y/o \alpha_{2} y/o \alpha_{3}.
El sujeto será un mamífero, mejor un ser humano y, preferiblemente, un ser humano con una enfermedad que produzca demencia, como por ejemplo la enfermedad de Alzheimer.
Por consiguiente, el compuesto usado se unirá como agonista inverso a los receptores \alpha_{5} a concentraciones a las que no se produce ninguna unión significativa de agonistas o de agonistas inversos a los receptores \alpha_{1}. De manera más adecuada, el compuesto se unirá como agonista inverso a los receptores \alpha_{5} a concentraciones a las que no se produce ninguna unión significativa de agonistas o de agonistas inversos a los receptores \alpha_{1} y \alpha_{2}. Y más adecuadamente, el compuesto se unirá como agonista inverso a los receptores \alpha_{5} a concentraciones a las que no se produce ninguna unión significativa de agonistas o de agonistas inversos a los receptores \alpha_{1} y \alpha_{2} y \alpha_{3}.
La unión del agonista inverso en \alpha_{5} puede ser parcial (es decir, el compuesto puede ser un agonista parcial), aunque se prefiere un agonista inverso total en \alpha_{5}. De igual manera, el compuesto no debe ser un agonista total o parcial, o un agonista inverso en los otros receptores.
Los compuestos usados pueden presentar unión antagonista en los receptores \alpha_{1}, \alpha_{2}, \alpha_{3} y \alpha_{6} si se desea, ya que esta unión no afectará adversamente a la realización del procedimiento de esta invención. Cuando se trata de la unión relativa a los diversos receptores, sólo se considera la unión agonista inversa o agonista.
En general, tales compuestos se unirán al menos 10 veces mejor a los receptores \alpha_{5} que a los receptores \alpha_{1}, es decir, el compuesto será al menos 10 veces más selectivo por los receptores que contienen \alpha_{5} que por los receptores que contienen \alpha_{1}.
Apropiadamente, el compuesto para usar en la invención es al menos 10 veces más selectivo por los receptores que contienen \alpha_{5} que por los receptores que contienen \alpha_{1} y \alpha_{2}, de forma más apropiada al menos 10 veces más selectivo por los receptores que contienen \alpha_{5} que por los receptores que contienen \alpha_{1}, \alpha_{2} y \alpha_{3}, y más apropiadamente al menos 10 veces más selectivo por los receptores que contienen \alpha_{5} que por los receptores que contienen \alpha_{1}, \alpha_{2}, \alpha_{3} y \alpha_{6}.
Favorablemente, el compuesto para usar en la invención es al menos 25 veces más selectivo por los receptores que contienen \alpha_{5} que por los receptores que contienen \alpha_{1}, por ejemplo 25 veces más selectivo por los receptores que contienen \alpha_{5} que por los receptores que contienen \alpha_{1} y \alpha_{2}, más apropiadamente al menos 25 veces más selectivo por los receptores que contienen \alpha_{5} que por los receptores que contienen \alpha_{1}, \alpha_{2} y \alpha_{3} y más apropiadamente al menos 25 veces más selectivo por los receptores que contienen \alpha_{5} que por los receptores que contienen \alpha_{1}, \alpha_{2}, \alpha_{3} y \alpha_{6}.
Preferiblemente, el compuesto para usar en la invención es al menos 50 veces más selectivo por los receptores que contienen \alpha_{5} que por los receptores que contienen \alpha_{1}, por ejemplo los receptores que contienen \alpha_{1} y \alpha_{2}, más apropiadamente al menos 50 veces más selectivo por los receptores que contienen \alpha_{5} que por los receptores que contienen \alpha_{1}, \alpha_{2} y \alpha_{3}, y más apropiadamente al menos 50 veces más selectivo por los receptores que contienen \alpha_{5} que por los receptores que contienen \alpha_{1}, \alpha_{2}, \alpha_{3} y \alpha_{6}.
De forma ventajosa, el compuesto para usar en la invención será al menos 100 veces más selectivo por los receptores que contienen \alpha_{5} que por los receptores que contienen \alpha_{1}.
El uso especialmente ventajoso de esta invención presenta la ventaja adicional de ser capaz de estimular la cognición sin inducir efectos ansiogénicos indeseados.
Un receptor preferido para determinar la unión a \alpha_{5} es el receptor \alpha_{5}\beta_{3}\gamma_{2}. Un receptor preferido para determinar la unión a \alpha_{1} es el receptor \alpha_{1}\beta_{3}\gamma_{2}. Un receptor preferido para determinar la unión a \alpha_{2} es el receptor \alpha_{2}\beta_{3}\gamma_{2}. Un receptor preferido para determinar la unión a \alpha_{3} es el receptor \alpha_{3}\beta_{3}\gamma_{2}. Un receptor preferido para determinar la unión a \alpha_{6} es el receptor \alpha_{6}\beta_{3}\gamma_{2}.
Los receptores se describen en las solicitudes de patente internacional números WO 92/22652 y WO 94/13799.
Los compuestos para usar en esta invención pueden identificarse mediante detección selectiva frente a los receptores identificados anteriormente usando técnicas conocidas en la materia. Las técnicas preferidas incluyen aquéllas descritas en Goeders y cols. (véase más adelante).
La determinación de si los compuestos son agonistas del receptor, agonistas parciales del receptor o agonistas inversos del receptor puede determinarse de la misma forma usando técnicas conocidas en la materia. Entre las técnicas preferidas se incluyen aquéllas descritas en Wafford y cols. (véase más adelante).
Compuestos particularmente adecuados para usar en esta invención tendrán un valor de Ki (nM) frente al receptor \alpha_{5}\beta_{3}\gamma_{2} inferior a 5, más adecuadamente menor que 1, por ejemplo aproximadamente de 0,5.
Compuestos particularmente adecuados para usar en esta invención tendrán un valor de Ki (nM) frente al receptor \alpha_{1}\beta_{3}\gamma_{2} superior a 10, más adecuadamente superior a 20, más adecuadamente superior a 40, por ejemplo de aproximadamente 50.
Compuestos particularmente adecuados para usar en esta invención tendrán un valor Ki (nM) frente al receptor \alpha_{2}\beta_{3}\gamma_{2} superior a 5, más adecuadamente superior a 10, más adecuadamente superior a 20, por ejemplo de aproximadamente 25.
Compuestos particularmente adecuados para usar en esta invención tendrán un valor de Ki (nM) frente al receptor \alpha_{3}\beta_{3}\gamma_{2} superior a 5, más adecuadamente superior a 10, más adecuadamente superior a 20, por ejemplo de aproximadamente 25.
Compuestos particularmente adecuados para usar en esta invención tendrán un valor de Ki (nM) frente al receptor \alpha_{6}\beta_{3}\gamma_{2} superior a 10, más adecuadamente superior a 20, más adecuadamente superior a 40, por ejemplo de aproximadamente 80.
Para mostrar su actividad sin tener que administrar los compuestos por vía intravenosa, los compuestos para usar en esta invención son, más preferiblemente, capaces de atravesar la barrera hematoencefálica después de la administración oral.
Un compuesto con las propiedades deseadas descritas anteriormente que ilustra la utilidad de poseer esas propiedades es el compuesto FG8094.
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica para usar en la estimulación de la cognición sin que produzca convulsiones, que comprende un compuesto que es un agonista inverso del receptor \alpha_{5}, que no es un agonista de receptor o un agonista inverso en los receptores \alpha_{1} y/o \alpha_{2} y/o \alpha_{3}, y, por tanto, un transportador farmacéuticamente aceptable.
De forma más adecuada, las composiciones están adaptadas para la administración oral a seres humanos, aunque también se contemplan las formas de administración parenteral, por ejemplo mediante administración intravenosa, intramuscular o subcutánea o por vía tópica o rectal.
Para el uso oral del estimulador de la cognición, el compuesto seleccionado puede administrarse por ejemplo, en forma de comprimido o de vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables, opcionalmente con adjuvantes conocidos, tales como alumbre, en una composición farmacéutica, según la práctica farmacéutica convencional. Los compuestos pueden administrarse por vía oral, parenteral, incluyendo la administración intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea, o por vía tópica.
Para su uso oral, el estimulador de la cognición puede administrarse, por ejemplo, en forma de comprimidos o cápsulas, o como una solución o suspensión acuosa. En el caso de los comprimidos de uso oral, los vehículos usados más habitualmente incluyen la lactosa y el almidón de maíz, y se suelen añadir agentes lubrificantes, tales como estearato de magnesio. Para la administración oral en forma de cápsulas, entre los diluyentes útiles se incluyen la lactosa y el almidón de maíz deshidratado. Cuando se requieren suspensiones acuosas de uso oral, el principio activo se combina con agentes emulsionantes y de suspensión. Si se desea, se pueden añadir ciertos edulcorantes y/o saborizantes.
Para uso intramuscular, intraperitoneal, subcutáneo e intravenoso, se suelen preparar soluciones estériles del principio activo y el pH de las soluciones debe ajustarse y tamponarse de forma adecuada. Para uso intravenoso, debe controlarse la concentración total de solutos para conseguir una preparación isotónica.
Para administración tópica, el estimulador de la cognición puede formularse como, por ejemplo, una suspensión, una loción, una crema o una pomada usando un transportador farmacéuticamente aceptable como, por ejemplo, agua, mezclas de agua y solventes hidromiscibles tales como alcanoles menores, aceites vegetales y polialquilenglicoles.
La preparación farmacéutica puede también contener sustancias auxiliares no tóxicas, tales como emulsionantes, conservantes, agentes humectantes, agentes espesantes y similares, como por ejemplo, polietilenglicoles 200, 300, 400 y 600, ceras de carbono 1.000, 1.500, 4.000, 6.000 y 10.000, componentes antibacterianos como compuestos de amonio cuaternarios, sales fenilmercúricas de las que se sabe que tienen propiedades de esterilización en frío y cuyo uso no causa daño, tiomersal, metil y propilparebenes, alcohol bencílico, feniletanol, elementos tamponadores como cloruro sódico, borato sódico, acetatos de sodio, tampones de gluconato y otros ingredientes convencionales tales como monolaurato de sorbitano, trietanolamina, oleato, monopalmitilato depolioxoetilensorbitano, dioctilsulfosuccinato sódico, monotioglicerol, tiosorbitol y ácido tetracético de etilendiamina.
Cuando un estimulador de la cognición se usa en un ser humano, el médico que lo prescribe normalmente determina la dosis diaria, que generalmente varía en función de la edad, el peso y la respuesta de cada paciente, así como según la gravedad de los síntomas del paciente. Sin embargo, en la mayoría de los casos, una dosis diaria eficaz se encontrará dentro del intervalo de aproximadamente 0,005 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal y, preferiblemente, de 0,05 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, como por ejemplo de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, administrados en una única toma o en dosis fraccionadas. Sin embargo, en algunos casos se pueden usar dosis que se encuentren fuera de estos límites.
Generalmente, las formas de dosificación unitaria de administración oral contienen de 1 a 800 mg, más habitualmente 2,5 a 250 mg, preferiblemente 5 a 100 mg, por ejemplo 10, 20 ó 50 mg.
Un estimulador de la cognición preferido para usar en esta invención es el ácido 9H-imidazol[1,5-a]pirrolo[2,1-C][1,4]benzodiazepina-1-carboxílico, 11, 12, 13, 13a-tetrahidro-7-metoxi-9-oxo-, éster de etilo, (S)-(9CI). La preparación de dicho compuesto se describe en el documento canadiense CA 1266671 A2 900313 (División de solicitud de patente canadiense nº503 329). En ocasiones este compuesto se conoce como FG 8094.
Las composiciones según esta invención pueden prepararse en cualquier forma adecuada, por ejemplo mediante tabletización convencional o técnicas de llenado de cápsulas.
Esta invención también proporciona un procedimiento para identificar un compuesto capaz de estimular la cognición sin causar convulsiones, que comprende usar los receptores \alpha_{5} y \alpha_{1} y/o \alpha_{2} y/o \alpha_{3} y/o \alpha_{6} para determinar si dicho compuesto es un ligando del receptor \alpha_{5} pero no de los receptores \alpha_{1} y/o \alpha_{2} y/o \alpha_{3} y/o \alpha_{6} y determinar si la unión a los receptores \alpha_{5} es en forma de agonista inverso y determinar si la unión en los receptores \alpha_{1} y/o \alpha_{2} y/o \alpha_{3} y/o \alpha_{6} es en forma de agonista o de agonista inverso.
Esta invención proporciona un procedimiento para detectar un compuesto capaz de aumentar la cognición sin causar convulsiones, que comprende usar el receptor de unión GABA_{A} para determinar que dicho compuesto es un agonista inverso de \alpha_{5} y no es un agonista o un agonista inverso de \alpha_{1} y/o \alpha_{2} y/o \alpha_{3}.
Esta invención también proporciona un ligando del que anteriormente se desconocía que era capaz de aumentar la cognición sin provocar convulsiones, que se ha identificado mediante un procedimiento de detección de esta invención.
Además, esta invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto identificado mediante el procedimiento de esta invención.
Las siguientes citas bibliográficas proporcionan información útil de referencia:
Goeders NE y Kuhar MJ (1985). Benzodiazepine binding in vivo with [^{3}H]Ro 15-1788. Life Sci 37:345-355.
McKernan RM, Quirk K, Prince R, Cox PA, Gillard NP, Ragan CI y Whiting PJ (1991). GABA_{A} receptors immunopurified from rat brain with \alpha-subunit specific antibodies have unique pharmacological properties. Neurone 7:667-676.
Quirk K, Gillard NP, Ragan CI, Whiting PJ y McKernan RM (1994). \gamma- Aminobutiric acid Type A receptors in the rat brain can contain both \gamma_{2} y \gamma_{3} subunits but \gamma_{1} does not exist in combination with another \gamma- subunit. Mol Pharmacol 45:1061-1070.
Wafford KA, Whiting PJ y Kemp JA (1993). Differences in affinity and efficacy of benzodiazepine receptor ligands on recombinant GABA_{A} receptor subtypes. Mol Pharmacol 43:240-244.
Whiting PW, Wafford KA y McKernan RM (1996). GABA_{A} receptors in the central nervous system. International Reviews in Neurobiology.
Wisden W, Herb A., Wieland H., Keinanen K, Luddens H y Seeberg PH (1991). Febs Lett 289, 227-230.
Ejemplo 1
El compuesto FG 8094 se suspendió en una solución de carboximetilcelulosa al 0,5% para proporcionar una solución inyectable.
Ejemplo 2
Los siguientes ejemplos ilustran composiciones farmacéuticas según la invención.
Comprimidos que contienen 1-25 mg de FG 8094
Cantidad en mg
Compuesto de fórmula I 5,0 25,0
Celulosa microcristalina 20,0 20,0
Almidón de maíz alimentario modificado 20,0 20,0
Lactosa 54,5 34,5
Estearato de magnesio 0,5 0,5
Comprimidos que contienen 26-100 mg de FG 8094
Cantidad en mg
Compuesto 50,0 100,0
Celulosa microcristalina 80,0 80,0
Almidón de maíz alimentario modificado 80,0 80,0
Lactosa 189,5 139,5
Estearato de magnesio 0,5 0,5
El compuesto FG 8094, la celulosa, la lactosa y una porción del almidón de maíz se mezclan y granulan con pasta de almidón de maíz al 10%. La granulación resultante se filtra, seca y mezcla con el resto del almidón de maíz y con el estearato de magnesio. A continuación, el granulado resultante se concentra en comprimidos que contienen 1,0 mg, 2,0 mg, 25,0 mg, 26,0 mg, 50,0 mg y 100 mg del compuesto activo por comprimido.
Ejemplo 3
El compuesto FG 8094 del ejemplo (1,5 mg) se combinó con hidroxipropilmetilcelulosa (58,5 mg) para formar una pequeña pastilla. Las pastillas se implantaron de forma subcutánea en ratas. Los niveles sanguíneos de FG 8094 resultantes fueron superiores a 100 ng/ml durante más de 6 horas.
Procedimientos generales 1. Estudios de unión con radioligando
Los estudios de unión con radioligandos se llevaron a cabo usando membranas preparadas a partir de células en las que se ha producido una transfección estable con las siguientes combinaciones de subunidades: \alpha1\beta3\gamma2, \alpha2\beta3\gamma2, \alpha3\beta3\gamma2, \alpha5\beta3\gamma2, \alpha6\beta3\gamma2. Se llevaron a cabo incubaciones usando 20-100 mg de proteína de membrana en un volumen total de 0,5 ml en 10 nM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA, a un pH de 7,4, durante una hora a temperatura ambiente, antes de su terminación a través de filtros Whatman GF/C, seguido todo ello de 3 lavados de 3 ml con 5 mM de Tris-HCl a un pH de 7,5 y recuento de centelleo. Como radioligando se usó el compuesto [^{3}H]Ro15-1788 para marcar los receptores GABA_{A}, a excepción de las células que expresan \alpha6\beta3\gamma2 en las que se usó el compuesto [^{3}H]Ro15- 4513 porque este tipo de receptor no presenta una afinidad elevada por el compuesto [^{3}H]Ro15-1788. La unión inespecífica se determinó usando 10 \muM de Ro15-4513 y los radioligandos se usaron a unas concentraciones equivalentes a dos veces su valor de Kd para cada subtipo. Los valores de Ki se calcularon de acuerdo con la ecuación de Cheng- Prussof.
2. Unión in vivo del compuesto [^{3}H]Ro15-1788 en el cerebro de ratón
La unión in vivo del compuesto [^{3}H]Ro15-1788 en el cerebro de ratón se realizó esencialmente como describen Goeders y Kuhar (1985). Ratones macho Swiss-Webster recibieron una solución de NaCl al 0,9% que contenía 50 mCi/kg de [^{3}H]Ro15-1788 (0,05 ml/10 g de peso corporal) a través de la vena de la cola. Los animales fueron sacrificados mediante decapitación tres minutos después, momento en el que se midieron las cantidades máximas del compuesto [^{3}H]Ro15-1788 en el cerebro (datos no mostrados). Treinta minutos antes del sacrifico, se administró por vía intraperitoneal FG 8094 (0,3, 1,0, 3,0 y 10,0 mg/kg) o diazepam (30,0 mg para definir la unión inespecífica) en carboximetilcelulosa (CMC) al 0,5%. Cada cerebro de ratón se retiró con rapidez, se homogeneizó en 5,9 ml de 50 mM de Tris HCl, 5,0 mM de EDTA, a un pH de 7,4 a 4ºC, usando un homogeneizador ultra-turrax durante 10 segundos al nivel 5. En otra serie de experimentos, también se examinaron diferentes regiones cerebrales seleccionadas por su expresión preferente de determinados subtipos GABA. La unión del compuesto [^{3}H]Ro15-1788 en el cerebelo es casi exclusivamente de tipo \alpha1 (Quirk y cols., 1994), mientras que la unión en la médula espinal es indicativa de la unión a receptores con los subtipos \alpha2 o \alpha3, los subtipos \alpha1, \alpha4 y \alpha5 son raros o no existen en esta región (Wisden y cols., 1992). Los cerebros inmediatamente se dividieron en prosencéfalo y cerebelo, y también se retiró la médula espinal. Cada prosencéfalo se homogeneizó en 4,0 ml de tampón (aproximadamente 14 ml/g de peso húmedo de tejido) y cada médula espinal en 1,0 ml de tampón (aproximadamente 20,0 mg/g de peso húmedo de tejido). Volúmenes del homogeneizado (3 x 200 ml) se filtraron rápidamente a través de filtros GF/B, se lavaron con 2 volúmenes de 5,0 ml de tampón helado y la radioactividad residual se determinó mediante espectroscopia de centelleo líquido.
3. Estudios electrofisiológicos-efectos funcionales del compuesto FG 8094
Mediante los estudios de unión sobre células en las que se había producido una transfección, que contenían \alpha1\beta3\gamma2S, \alpha2\beta3\gamma2S y \alpha5\beta3\gamma2S, se han identificado compuestos con selectividad para \alpha5. Estos compuestos se estudiaron usando técnicas electrofisiológicas (Wafford y cols., 1993) para determinar sus efectos funcionales sobre los receptores GABA_{A} \alpha1\beta2\gamma2S, \alpha2\beta2\gamma2S, \alpha3\beta2\gamma2S, \alpha5\beta2\gamma2S y \alpha6\beta2\gamma2S expresados en oocitos de Xenopus. En los núcleos de los oocitos se inyectaron directamente 10,0-20,0 nl de los ADNc relevantes (6,0 ng/\mul) introducidos mediante ingeniería genética en el vector de expresión pCDM8. Tras una incubación de 24 horas, los oocitos se introdujeron en un baño de 50 ml y se perfundieron con suero salino. Usando el procedimiento de registro de fijación de voltaje con dos electrodos, las corrientes activadas de GABA pudieron medirse bañando la célula en una solución con GABA. En primer lugar, se estableció una corriente de respuesta reproducible usando una concentración de GABA que dio lugar a aproximadamente un 20% de la máxima respuesta GABA que pudo provocarse (EC_{20}). La aplicación simultánea del compuesto de prueba con esta concentración de GABA EC_{20} resultó en una modulación de la respuesta a través de su acción en el sitio de unión BZ. La respuesta podría potenciarse mediante un agonista del receptor BZ o inhibirse mediante un agonista inverso del receptor BZ.
4. Estudios de convulsiones y cognitivos Fármacos
El compuesto FG 8094 fue sintetizado por el grupo del Neuroscience Research Centre's medicinal chemistry de Merck, Sharp and Dohme y fue suspendido en CMC al 0,5%. El vehículo del FG 8094 se administró por vía IP 30 minutos antes del comienzo del primer ensayo de entrenamiento.
Pruebas de los efectos proconvulsivos (i)Tratamiento agudo
Los sujetos fueron sesenta ratas macho Sprague Dawley (225-265 g) no sometidas previamente a experimentación se agruparon de cuatro en cuatro, con acceso libre a agua y alimento. Cada rata se asignó a uno de seis grupos y se les administró: vehículo o 0,5, 1,0, 2,0, 4,0 mg/kg de FG 8094 o 10,0 mg/kg del agonista inverso no selectivo del receptor, CGS 8216, un conocido agente proconvulsivo. 30 minutos antes de una infusión del convulsivo, pentilentetrazol (PTZ, 40 mg/ml), se administró por vía IP vehículo, FG 8094 o CGS 8216. El PTZ se infundió en la vena de la cola a una velocidad de 1,0 ml/min. Se registró la latencia de las convulsiones clónica y tónica, y el umbral de cada una se calculó usando la ecuación: dosis umbral= velocidad de infusión(ml/s) x PTZ (mg/ml)x (1.000/peso de la rata) x latencia (s).
(ii)Tratamiento crónico
Las ratas usadas en este estudio recibieron tratamiento crónico con FG 8094 durante un experimento MWM. Las ratas recibieron una dosis diaria por vía intraperitoneal (de lunes a viernes), en un total de 24 dosis. Tras cada administración del fármaco, se realizaron pruebas en las ratas en un MWM y recibieron la dosis final del fármaco 48 horas antes de las pruebas de las convulsiones. Los sujetos se asignaron a uno de cuatro grupos de tratamiento (n=8) y se les administró vehículo o 0,1, 0,3 ó 1,0 mg/kg de FG 8094.
El día de la prueba del efecto proconvulsivo, las ratas fueron atadas y se les administró mediante infusión pentilentetrazol (PTZ, 40,0 mg/ml) como se ha descrito anteriormente. Se registró la latencia (s) a las convulsiones tanto clónica como tónica (extensión total). Los datos de latencia se transformaron para determinar la dosis de PTZ necesaria para alcanzar el umbral de ambas convulsiones, clónica y tónica.
Estudios cognitivos Animales
Ratas macho PVG encapuchadas (Bantin y Kingman, Hull GB), de un peso aproximado de 300 g, se agruparon de cuatro en cuatro con libre acceso a agua y alimento. Los animales se mantuvieron en un ciclo de 12/12 horas de luz- oscuridad, encendiendo la luz a las 7:00 h.
Dispositivo
El laberinto acuático de Morris consiste en una piscina circular blanca de fibra de vidrio y con un diámetro de 2m, llena de una mezcla opaca de agua y colorante blanco (E308, Morton International) y mantenida a una temperatura de 26ºC-28ºC. La piscina se colocó en el centro de una habitación insonorizada, alrededor de cuyas paredes se mostraron diagramas estructurados realizados en blanco y negro de alto como señales espaciales "adicionales al laberinto". El "norte" se determinó arbitrariamente y la piscina se dividió en cuatro cuadrantes iguales, "noreste", "sureste", "suroeste" y "noroeste". En el centro del cuadrante NE se colocó una plataforma oculta (13 x 13) sumergida a 2 cm por debajo de la superficie del agua.
Directamente encima del centro de la piscina se montó un circuito cerrado de videocámara equipado con una lente de ángulo ancho, que se conectó a un analizador de imagen que digitalizó la imagen. La información digital se suministró a un microordenador Arquímedes con un software "laberinto acuático", un paquete de software suministrado por Paul Fray LTD (Cambridge, GB). El paquete de software proporcionó las siguientes medidas: latencia hasta alcanzar la plataforma, longitud de la ruta tomada, velocidad media de nado, tiempo empleado y distancia total recorrida en el cuadrante en cuestión.
Entrenamiento
Las ratas se asignaron a cuatro grupos de tratamiento (n=8): vehículo, 0,1, 0,3, 1,0 mg/kg de FG 8094. Durante la fase de adquisición del experimento, todos los grupos se sometieron a cuatro ensayos diarios. Durante este tiempo, la plataforma oculta se sumergió en el cuadrante NE del laberinto acuático. La rata se sacó de su jaula y se introdujo en el laberinto acuático en uno de las localizaciones casi determinadas al azar ("norte", "este", "sur" u "oeste") con su cabeza dirigida hacia, y casi tocando, la pared de la piscina. Los ensayos comenzaron cuando el investigador liberó la rata y terminaron cuando la rata subió a la plataforma, y se registró la latencia de escape media. La duración máxima del experimento era de 60 segundos. Si para entonces la rata no había conseguido subir a la plataforma, el experimento terminaba automáticamente, el investigador colocaba a la rata en la plataforma y se registraba una latencia de escape de 60 segundos. La rata permanecía en la plataforma durante 30 segundos y a continuación era liberaba en un recipiente de plástico opaco situado en un lateral elevado durante otros 30 segundos, (intervalo entre experimentos, ITI). Al final del ITI, se procedía a la reintroducción de la rata en la piscina, aunque en un lugar diferente, y el siguiente experimento comenzaba tras la liberación de la rata. Este procedimiento se repetía hasta completar cuatro experimentos.
Pruebas de aprendizaje y memoria Prueba de exploración
Normalmente, la latencia de escape disminuye de 60 s a 20 s tras varios días de entrenamiento. Una "prueba de exploración" valora la memoria espacial de la rata para encontrar la localización de la plataforma oculta. Durante este experimento, la plataforma se sacó del laberinto acuático y se permitió a la rata buscar en la piscina durante 60 segundos antes de sacarla de la piscina. Si el tratamiento mejora la memoria de la rata con respecto de la localización de la plataforma, pasará más tiempo buscando en el cuadrante en el que previamente se había escondido la plataforma (NE) que una rata a la que se le había administrado un tratamiento con vehículo.
Reconocimiento asistido
Las deficiencias en la actuación que pudieran deberse a los efectos secundarios producidos por el fármaco (tales como visión borrosa o déficits motores que dan lugar a un deterioro de la capacidad para nadar) se valoraron usando un reconocimiento asistido. En este procedimiento, la plataforma también se colocó en el cuadrante NE, pero se elevó 3 cm por encima del nivel del agua y, por tanto, era visible para la rata. Si el tratamiento no tiene efectos sobre las latencias de escape medias hasta llegar a la plataforma visible, cualquier diferencia entre los grupos en las latencias de escape medias hasta llegar a una plataforma invisible se pueden atribuir a un efecto sobre el proceso cognitivo. El programa de entrenamiento fue idéntico al programa de entrenamiento usado para el entrenamiento de adquisición y continuó hasta que las latencias de escape medias no diferían significativamente entre cada grupo.
Memoria de reconocimiento
Seis días después de la prueba de exploración, tiempo durante el cual las ratas no fueron expuestas al laberinto acuático ni se les administró FG 8094, de nuevo se hicieron pruebas con las ratas con la plataforma sumergida en el cuadrante NE, usando el protocolo de adquisición.
Aprendizaje inverso
El entrenamiento inverso fue idéntico a la fase de adquisición del experimento, con la excepción de que la plataforma se sumergió en el centro del cuadrante SO).
Resultados 1. Selectividad del compuesto FG 8094 por el receptor \alpha_{5}\beta_{3}\gamma_{2}
Las curvas de competición en cada una de las líneas celulares muestran que el compuesto FG 8094 es selectivo por los receptores que contienen la subunidad \alpha_{5} (véase la tabla 1). El compuesto FG 8094 fue 107 veces más selectivo por los receptores que contienen \alpha_{5} que por los receptores con \alpha_{1}, 60 veces más selectivo que para los que contienen \alpha_{2}, 53 veces más selectivo que para los que contienen \alpha_{3} y 184 veces más selectivo que para los que contienen \alpha_{6}. Esto representa un novedoso perfil farmacológico, ya que la mayoría de las BZ más selectivas, tales como el zolpidem o CL 218.872, presentan más afinidad por los receptores que contienen \alpha_{1} que por los que contienen \alpha_{5} (Pritchett y Seeberg, 1990). El FG 8094 es el que tiene más preferencia por los receptores con \alpha_{5} sobre los receptores que contienen \alpha_{1} que cualquier otro compuesto conocido hasta la fecha.
2. Ocupación de los subtipos de GABA_{A} en función del desplazamiento de la unión del compuesto [^{3}H]Ro 15-1788 en el cerebro entero por el compuesto FG 8094 in vivo
Tres minutos después de la administración intravenosa de [^{3}H]Ro 15- 1788 a ratones, se encontraron niveles significativos de radioactividad en el cerebro. Se estimó que más del 95% de [^{3}H]Ro 15-1788 estaba asociado con las membranas, ya que más del 95% de la radioactividad se retenía después de la filtración de los homogeneizados (datos no mostrados). El diazepam (30,0 mg/kg) desplazó 90% de la unión de [^{3}H]Ro 15-1788 en el cerebro, lo que indica que el ligando presente en las membranas estaba unido a los receptores GABA_{A}. Cuando se administraron por vía intraperitoneal dosis de hasta 3,0 mg/kg, el compuesto FG 8094 no desplazó significativamente la unión específica de [^{3}H]Ro 15-1788] (datos no mostrados). Esto implica que el número de cualquier otro subtipo de receptor GABA_{A} ocupado a estas dosis tiene que ser pequeño e inferior al límite de detección de este ensayo. Dado que el compuesto FG 8094 tiene una elevada afinidad por los receptores que contienen \alpha_{5} (tabla 1) y esto representa menos del 5% de la población total de receptores GABA_{A}, es posible que dosis \leq 3,0 mg/kg de FG 8094 estén ocupando este subtipo. A 10 mg/kg, el FG 8094 desplazó significativamente la unión del compuesto [^{3}H]Ro 15-1788 (p<0,05). Los receptores que contienen las subunidades \alpha_{1}, \alpha_{2} y \alpha_{3} forman los tres subtipos más numerosos en el cerebro y representan aproximadamente el 90% de los receptores GABA_{A} (McKernan y cols., 1991, Whiting y cols., 1994). A esta dosis, es posible que el compuesto FG 8094 esté ocupando predominantemente los receptores que contienen \alpha_{2} y \alpha_{3} (para los que presenta mayor afinidad que por los receptores que contienen \alpha_{1}). Posiblemente, los receptores no desplazados por el compuesto FG 8094 a 10 mg/kg son receptores que contienen una subunidad \alpha_{1} que comprende el 40%-50% de todos los receptores GABA_{A} del cerebro para los cuales el compuesto FG 8094 tiene la menor afinidad.
La ocupación de los receptores que contienen \alpha_{2}, \alpha_{3}, y \alpha_{1} 30 minutos después de la administración del FG 8094 (1,0 mg/kg) se investigó más directamente valorando el desplazamiento de la unión del compuesto [^{3}H]Ro 15-1788 en la región del cerebro rica en estos subtipos. El cerebelo se usó como tejido selectivo de \alpha_{1} y la médula espinal como tejido selectivo por \alpha_{2}/\alpha_{3}. También se incluyó el prosencéfalo, que contiene la mayoría de los subtipos de los receptores GABA_{A}. La inhibición in vivo de la unión del compuesto [^{3}H]Ro 15-1788 30 minutos después de la administración de FG 8094 (1,0 mg/kg) se muestra en la Tabla 2.
Si se asume que el porcentaje de inhibición in vivo de la unión del compuesto [^{3}H]Ro 15-1788 es una medida de la ocupación del receptor, la concentración en el sitio del receptor en el cerebro se puede calcular según la ecuación de Clarke (ocupación =[fármaco]/[fármaco] + Ki). Al sustituir la ocupación determinada en los receptores que contienen \alpha_{1} y \alpha_{2}/\alpha_{3}, la concentración de FG 8094 disponible en los sitios de unión de las Bz en el cerebro de rata es de 7,8 nM y de 13,2 nM, respectivamente. La ocupación en los receptores que contienen \alpha_{5} no puede medirse directamente por la escasa abundancia del receptor, pero se puede calcular usando la concentración del fármaco y la afinidad de unión usando la ecuación de Clarke. Esto predice una ocupación del 95%-97% de los receptores que contienen \alpha_{5}, 30 minutos después de la administración de FG 8094 (1 mg/kg).
3. Estudios electrofisiológicos-efectos funcionales del compuesto FG 8094
El efecto modulador sobre el receptor GABA_{A} EC_{20} se muestra en la figura 1 para FG 8094 a 1\muM, que estaría cerca del máximo para todos los subtipos de receptores estudiados, y para dos compuestos convencionales, flunizatrepam (1 \muM, un agonista total del receptor) y DMCM (1 \muM, un agonista inverso total del receptor) a unas concentraciones que serían máximas en los estudios de unión sobre el receptor \alpha1\beta2\gamma2S, mostrando que el compuesto FG 8094 es un agonista inverso total de receptor para el \alpha5\beta2\gamma2. La figura 2 compara los efectos del FG 8094 sobre otros receptores que contienen la subunidad \alpha, lo que demuestra que tiene mucha menor eficacia en otras combinaciones de subunidades. No tiene un efecto intrínseco sobre \alpha1\beta2\gamma2, lo que sugiere que es un antagonista de baja afinidad y es un agonista inverso parcial de receptor sobre los receptores \alpha2\beta2\gamma2 y \alpha3\beta2\gamma2. Usando una concentración convencional de fármaco sobre \alpha1\beta2\gamma2S se realizó una comparación de la eficacia, que demostró que el compuesto FG 8094 es funcionalmente selectivo por los receptores que contienen \alpha_{5}, ejerciendo sus acciones principalmente a través de este subtipo.
4. Estudios de convulsiones y cognitivos
(I) Tratamiento agudo. Un análisis de la varianza de una vía de las dosis umbral medias para las convulsiones tónica y clónica reveló un efecto principal de las convulsiones tónicas [F(5,49)=3,70; p=0,007], pero no de las clónicas [F(5,48)=2,01; p=0,09]. Los estudios de comparación múltiple revelaron que sólo el compuesto CDS 8216 redujo significativamente las dosis umbral hasta las convulsiones tónicas, mostrando que tenía un efecto proconvulsivo.
(I) Tratamiento crónico. Un análisis de la varianza reveló que el tratamiento con la dosis umbral de PTZ no tenía ningún efecto significativo sobre las convulsiones clónicas [F(3,25)=0,23; p=0,87] o sobre las tónicas [F(3,25)=0,06; p=0,98]. Estos resultados demuestran que el protocolo de tratamiento crónico usado en el estudio no produce un aumento de la sensibilidad al PTZ proconvulsivo.
Ensayos de adquisición
La figura 3a ilustra las latencias de escape medias durante el noveno día del periodo de entrenamiento. Un análisis de la varianza de la velocidad de natación media durante el escape hacia la plataforma oculta reveló que no existía ningún efecto significativo de la dosis [F(3,28)=0,87], ningún efecto significativo del día [F(8,216)=1,44, p<0,1] y ninguna interacción de la dosis por día [F(24,216)=1,04; p>0,4]. Un análisis de la varianza de las latencias de escape medias con factores de tratamiento y día reveló la existencia de un efecto principal del tratamiento [F(3,28)=3,01; p<0,05], un efecto significativo del día [F(8,216)=34,67; p<0,001], pero ninguna interacción de la dosis por día [F(24,216)=0,75; p>0,5]. Aunque las latencias de escape medias de los grupos a los que se les había administrado 0,3 y 1,0 mg/kg de FG 8094 parecían ser más cortas que las del grupo control al que se le había administrado vehículo o que las del grupo que había recibido 0,1 mg/kg, la observación no se confirmó en las pruebas de comparación múltiple de Newman Keuls.
Pruebas de exploración
Un análisis de la varianza del porcentaje de tiempo empleado en nadar en el cuadrante noreste reveló la inexistencia de un efecto significativo de la dosis [F(3,28)=0,18] (véase la figura 3b para obtener más detalles), que implica que entre los grupos no existían diferencias en la fuerza de la memoria o la eficacia de la adquisición.
Reconocimiento asistido
Un análisis de la varianza de la latencia de escape media para alcanzar la plataforma visible no mostró efectos significativos de la dosis [F(3,28)=0,54]. Sin embargo, sí había un efecto significativo de la dosis sobre la longitud media de la ruta [F(3,28)=4,27, p<0,05]. Las pruebas de comparación múltiple de Newman-Keuls mostraron que el grupo que había recibido vehículo recorrió un camino significativamente más largo que el recorrido por todos los grupos a los que se había administrado FG 8094 (figura 3c).
Prueba de reconocimiento
Un análisis de la varianza de la latencia de escape media reveló la existencia de un efecto significativo de la dosis [F(3,28)=3,53, p<0,05]. Las pruebas de comparación múltiple de Newman-Keuls mostraron que la latencia de escape media del grupo que recibió vehículo era mayor que la de cualquiera de los grupos que habían recibido FG 8094 (p<0,05). Estos datos sugieren que los grupos a los que se había administrado FG 8094 retuvieron la información espacial concerniente a la localización de la plataforma oculta mejor que el grupo control que había recibido vehículo (véase la figura 3d).
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Aprendizaje inverso
Durante el aprendizaje inverso, la plataforma se cambió de lugar al centro del cuadrante suroeste. Un análisis de la varianza de las latencias de escape medias reveló un efecto significativo de la dosis [F(3,28)=3,31, p<0,05], un efecto significativo del ensayo [F(3,84)=9,53, p<0,001], pero ninguna interacción significativa [F(9,84)=1,66; p>0,1]. La prueba de comparación múltiple de Newman-Keuls indicó que la latencia de escape media del grupo que había recibido vehículo fue significativamente mayor que la de todos los grupos que habían recibido FG 8094 (p<0,05). En los días siguientes al aprendizaje inverso, la dosis no tenía ningún efecto sobre las latencias de escape medias. Por tanto, estos datos sugieren que el compuesto FG 8094 aumentaba la capacidad de las ratas para aprender una nueva localización espacial de la plataforma oculta.
Discusión
Los agonistas del receptor de las benzodiazepinas tienen efectos ansiolíticos y anticonvulsivos en el ser humano y en los animales, pero también inducen amnesia. En cambio, los agonistas inversos del receptor BZ tienen efectos ansiogénicos y proconvulsivos, sin embargo tienen efectos estimuladores de la cognición en animales. Los antagonistas del receptor BZ no tienen efectos intrínsecos, pero bloquean los efectos tanto de los agonistas del receptor de BZ como de los agonistas inversos del receptor. A diferencia de los agonistas totales del receptor de BZ, los presentes estudios muestran que el agonista inverso del receptor de BZ selectivo de \alpha_{5}, FG 8094, está desprovisto de efectos proconvulsivos, pero, en animales, tiene efectos estimuladores de la cognición.
Los resultados de los experimentos de unión in vivo mostraron que el compuesto FG 8094 ocupa virtualmente todos los receptores que contenían \alpha_{5} a una concentración de 1,0 mg/kg, mientras que menos del 35% y 15% de los receptores \alpha2/3 y \alpha1, respectivamente, están ocupados. Por tanto, a una concentración de 1,0 mg/kg, el compuesto FG 8094 es selectivo por los receptores que contienen \alpha_{5}. A 10,0 mg/kg, el compuesto FG 8094 ocupa de forma significativa los receptores que contienen \alpha_{1}, \alpha_{2} y \alpha_{3} y, como consecuencia, FG 8094 no es selectivo por los receptores que contienen \alpha_{5} a dosis superiores a 1,0 mg/kg.
En experimentos electrofisiológicos se demostró que el compuesto FG 8094 era un agonista inverso total de receptor en el subtipo de receptor \alpha5\beta2\gamma2, un agonista inverso menor parcial de receptor en los subtipos de receptor que contienen \alpha2 o \alpha3, y un antagonista en \alpha1\beta2\gamma2, la principal combinación de subunidades en el cerebro. Estos datos sugieren que los principales efectos in vivo del compuesto FG 8094 se ejercen en el subtipo que contiene \alpha5, que principalmente se localiza en el hipocampo.
En el experimento MWM, las ratas son entrenadas para encontrar una plataforma sumergida en una piscina de agua opaca. Se supone que los animales usan las diversas señales colocadas alrededor de las paredes de la habitación para guiar su estrategia de búsqueda. Tal proceso supone un procesamiento cognitivo flexible, ya que el animal debe, en primer lugar, formar un "mapa" de la habitación (es decir, la relación espacial entre las señales visuales fijas y la plataforma oculta) y a continuación usar el mapa para guiar su camino a la plataforma oculta. Una rata bien entrenada, introducida en la piscina en lugares al azar, nada más o menos directamente hacia la plataforma oculta, lo que sugiere que tiene un conocimiento detallado de la zona local o un "mapa cognitivo", y puede trazar una nueva ruta hacia la plataforma oculta en cada nuevo experimento.
En el presente experimento, la inspección de la figura 3a, que muestra la latencia (s) media hasta encontrar la plataforma oculta en los sucesivos días de entrenamiento, sugiere que las ratas a las que se había administrado 0,3 y 1,0 mg/kg consistentemente encontraron la plataforma en menos tiempo que los grupos que habían recibido vehículo o 0,1 mg/kg, aunque este efecto no tenía significación estadística. Durante la prueba de exploración, no se observó ninguna diferencia en la cantidad de tiempo que los grupos control y los que habían recibido fármaco habían empleado buscando el cuadrante en el que se había colocado la plataforma durante los ensayos de entrenamiento, sugiriendo que no existían diferencias en la capacidad de los diversos grupos para formar y usar un mapa cognitivo. De igual manera, no había diferencias entre los grupos en sus latencias medias hasta encontrar una plataforma visible, lo que indica que el compuesto FG 8094 estaba desprovisto de efectos sobre los sistemas sensorial o motor. Sin embargo, el primer día del entrenamiento normal, seis días después del ensayo final de la plataforma visible, la latencia media hasta encontrar la plataforma oculta fue significativamente más corta en todos los grupos que habían recibido FG 8094. Estos datos implican que la relación espacial entre la localización de la plataforma y las señales visuales fue retenida y/o recuperada mejor por las ratas que habían recibido FG 8094 que por las que habían recibido vehículo. Es más, cuando la plataforma oculta se cambió a una nueva localización en el centro del cuadrante suroeste, las ratas a las que se administró 1,0 mg/kg de FG 8094 aprendieron más rápido la nueva localización que las ratas a las que se administró vehículo.
En conclusión, el compuesto FG 8094 es un agonista inverso del receptor de BZ selectivo de \alpha_{5} que no posee efectos proconvulsivos. En la prueba MWM, una prueba de memoria espacial dependiente del hipocampo, el compuesto FG 8094 aumentó significativamente la capacidad de las ratas para retener la información espacial, lo que sugiere que estimula el procesamiento cognitivo.
TABLA 1 Valores de Ki para los sitios de benzodiazepinas en células transfeccionadas de forma estable.
Fármaco \alpha1\beta3\gamma2 \alpha2\beta3\gamma2 \alpha3\beta3\gamma2 \alpha5\beta3\gamma2 \alpha6\beta3\gamma2
Flunitrazepam 5,2\pm0,2 2,5\pm0,2 4,8\pm1 2,11\pm0,23 >10.000
Ro 15-4513 2,6\pm0,11 2,6\pm0,7 1,28\pm0,06 0,24\pm0,05 6,5\pm0,6
FG 8094 48,5\pm6 27,4\pm2,5 24,5\pm2 0,45\pm0,15 83,2\pm4,52
Las curvas de inhibición se realizaron usando receptores marcados con [^{3}H]Ro15-1788 a una concentración dos veces el valor de Kd. Los valores de Ki se calcularon según la ecuación de Cheng-Prussof. Los datos mostrados son los valores medios \pmETM para 3-6 determinaciones.
TABLA 2 Inhibición de la unión in vivo de [^{3}H]Ro15-1788 en tres regiones del cerebro después de FG 8094
Tejido FG 8094 (mg/kg)
10 1
Prosencéfalo (todas las \alpha) 53,3\pm4,2 8,3\pm3,2
Cerebelo (\alpha_{1}) 55\pm6,9 13,8\pm4,9
Médula espinal (\alpha2/3) 74,2\pm3,8 33,8\pm7,4
Se procedió a inyectar en los ratones por vía intraperitoneal FG 8094, 10 mg/kg ó 1mg/kg, 30 minutos antes del sacrificio y [^{3}H]Ro15-1788 (0,1 mCi/g). Las regiones cerebrales se retiraron, homogeneizaron y filtraron como se describe en los procedimientos. Los datos se expresan como el porcentaje de inhibición de la unión en relación con los animales control (tratados con vehículo) y son la media \pmETM de 5 (10 mg/kg) ó 10 (1 mg/kg) determinaciones.
Leyendas de las figuras Figura 1
Efectos del flunitrazepam (1\muM), DMCM (1\muM) y FG 8094 (1\muM) sobre la respuesta presente de los receptores GABA EC_{20} en los oocitos que expresan \alpha1\beta2\gamma2 y \alpha5\beta2\gamma2. Los datos se expresan como la media \pm error típico de al menos 4 oocitos distintos.
Figura 2
Efectos del compuesto FG 8094 (1\muM) sobre la respuesta presente de los receptores GABA EC_{20} en los oocitos que expresan receptores que contienen diferentes subunidades a junto con \beta2\gamma2. Los datos se expresan como la media \pm error típico de al menos 4 oocitos distintos.
Figura 3
La latencia media (s) para encontrar la plataforma sumergida en el cuadrante noreste del laberinto acuático de Morris en cada día de entrenamiento (a), el tiempo empleado buscando el cuadrante noreste expresado como un porcentaje de la duración total del ensayo (60 s) (b), la latencia media (s) hasta encontrar una plataforma visible en el cuadrante noreste del laberinto acuático en el último día del entrenamiento de la plataforma visible (c), la latencia media (s) hasta alcanzar una plataforma sumergida en el cuadrante noreste seis días después del último día de entrenamiento (d) se muestra para cada grupo de tratamiento tras un tratamiento previo de 30 minutos por vía intraperitoneal con vehículo o FG 8094 (dosis mostradas). El ^{(*)} encima de a indica que la media para ese grupo es significativamente diferente de la media del grupo control tratado con vehículo (pruebas de comparación múltiple de Newman-Keuls, supuesta p<0,05).
\newpage
Administración en pastillas
Posteriormente, un experimento con un laberinto acuático similar al descrito anteriormente, a excepción de que 2 horas antes del experimento se implantó por vía SC una pastilla de FG 8094 y de que todo el entrenamiento se efectuó en un día, mostró de nuevo que el compuesto FG 8094 mejoraba el rendimiento. En un segundo experimento, el vehículo o las pastillas de FG 8094 se implantaron a ratas exactamente de la forma descrita anteriormente. Sin embargo, después de los cuatro primeros ensayos de entrenamiento, los animales recibieron una inyección IV de [^{3}H]FG 8094 y tres minutos después los cerebros de los animales se retiraron rápidamente. La unión in vivo mostró que el compuesto FG 8094 ocupaba aproximadamente el 85% de los receptores GABA-A cerebrales que contienen subtipos \alpha_{5}. Un tercer experimento idéntico al segundo experimento, a excepción de que se inyectó a los animales [^{3}H]RO 15-1788, mostró que el compuesto FG 8094 no ocupó significativamente los receptores GABA-A que contienen subtipos distintos al \alpha_{5}. Esto muestra que (i) FG 8094 mejoró la actuación en la prueba de memoria espacial del laberinto(ii) que el protocolo de dosificación usado aseguraba que los niveles cerebrales de FG 8094 eran suficientes como para ocupar el 85% de los receptores GABA-A que contienen \alpha_{5}, sin ocupar significativamente los receptores que contienen otros subtipos. Estos datos demuestran que el agonista inverso del receptor \alpha_{5} resulta beneficioso en los trastornos neurológicos con una deficiencia cognitiva asociada y no provoca convulsiones o sedación.

Claims (17)

1. Uso de un compuesto que es un agonista inverso del receptor GABA_{A} \alpha_{5} que no es un agonista de receptor o un agonista inverso de receptor en los receptores GABA_{A} \alpha_{1} y/o GABA_{A} \alpha_{2} y/o GABA_{A} \alpha_{3}, para fabricar un medicamento que estimule la cognición en un sujeto sin producir convulsiones.
2. Uso según la reivindicación 1, en el que el compuesto no es un agonista del receptor o un agonista inverso del receptor en los receptores GABA_{A} \alpha_{1} y/o GABA_{A} \alpha_{2} y/o GABA_{A} \alpha_{3}.
3. Uso según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el sujeto es un ser humano con enfermedad de Alzheimer.
4. Uso según las reivindicaciones 1, 2 ó 3, en el que el compuesto estimulador de la cognición es al menos 25 veces más selectivo por los receptores \alpha_{5} que po los receptores \alpha_{1}.
5. Uso según las reivindicaciones 1, 2, 3 ó 4, en el que el compuesto estimulador de la cognición es al menos 50 veces más selectivo por los receptores que contienen \alpha_{5} que por los receptores que contienen \alpha_{1}, \alpha_{2} y \alpha_{3}.
6. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el compuesto estimulador de la cognición tiene un valor de Ki (nM) frente al receptor \alpha_{5}\beta_{3}\gamma_{2} inferior a 2, frente al receptor \alpha_{1}\beta_{3}\gamma_{2} superior a 20.
7. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el compuesto estimulador de la cognición tiene un valor de Ki (nM) frente al receptor \alpha_{2}\beta_{3}\gamma_{2} superior a 20.
8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el compuesto estimulador de la cognición atraviesa la barrera hematoencefálica después de la administración oral.
9. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto y un transportador farmacéuticamente aceptable, siendo por tanto dicho compuesto un agonista inverso del receptor GABA_{A} \alpha_{5} que no es un agonista de receptor o un agonista inverso en los receptores GABA_{A} \alpha_{1} y/o GABA_{A} \alpha_{2} y/o GABA_{A} \alpha_{3}.
10. Una composición farmacéutica según la reivindicación 9, en la que el compuesto no es un agonista de receptor o un agonista inverso de receptor en los receptores GABA_{A} \alpha_{1} y/o GABA_{A} \alpha_{2} y/o GABA_{A} \alpha_{3}.
11. Una composición farmacéutica según las reivindicaciones 9 ó 10, adecuada para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, que comprende una cantidad eficaz de un compuesto que posee las propiedades establecidas en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8.
12. Un procedimiento para detectar un compuesto capaz de estimular la cognición sin causar convulsiones, que comprende usar el receptor de unión GABA_{A} para determinar que dicho compuesto es un agonista inverso de \alpha_{5} y no es un agonista o un agonista inverso en \alpha_{1} y/o \alpha_{2} y/o \alpha_{3}.
13. Un procedimiento según la reivindicación 12, en el que el compuesto no es un agonista de receptor o un agonista inverso de receptor en los receptores GABA_{A} \alpha_{1} y/o GABA_{A} \alpha_{2} y/o GABA_{A} \alpha_{3}.
14. Un procedimiento según las reivindicaciones 12 ó 13, en el que el compuesto posee las propiedades establecidas en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8.
15. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto detectado mediante un procedimiento de las reivindicaciones 12, 13 ó 14 y un transportador farmacéuticamente aceptable.
16. Una composición farmacéutica según las reivindicaciones 9, 10, 11 ó 15 adaptada para la administración oral.
17. Un compuesto detectado según las reivindicaciones 12, 13 ó 14 para usar para estimular la cognición.
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