DE69623595T2

DE69623595T2 - Verfahren zur behandlung hyperproliferativer epithel-läsionen durch topische verabreichung von hydroxylierten aromatischen protein-crosslinking verbindungen

Info

Publication number: DE69623595T2
Application number: DE69623595T
Authority: DE
Inventors: Burke, Jr.; Caroline Stanwell; Stuart H. Yuspa
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1995-02-17
Filing date: 1996-02-14
Publication date: 2003-05-22
Anticipated expiration: 2016-02-15
Also published as: CA2212888A1; AU698414B2; CA2212888C; AU4928696A; PT809493E; ES2183938T3; DK0809493T3; ATE223715T1; EP0809493B1; JPH11503111A; DE69623595D1; EP0809493A1; WO1996025159A1; US5610185A

Description

Bereich der Erfindung

Die vorliegende. Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Behandlung hyperproliferativer Epithel-Erkrankungen. Im. Besonderen wird eine spezifische Klasse von Verbindungen zur topischen Behändlung von Haut-Läsionen verwendet. Diese Verbindungen sind im Allgemeinen hydroxylierte aromatische Protein-vernetzende Mittel und sind für einen großen Bereich von Hauterkrankungen wirkungsvoll.

Hintergrund der Erfindung

Nicht-neoplastische und neoplastische hyperproliferative Hauterkrankungen sind häufig und stellen eine stetig ansteigende Belastung für Krankenversicherer dar. Die zunehmende Exposition von Haut gegenüber UV-Licht hat in den letzten Jahren zu einer bemerkenswerten Zunahme der Häufigkeit prämaligner Läsionen, wie strahlungsbedingte Keratosen, beigetragen. Die Mengen an oberflächlichen Plattenepithel- und Basalzell-Karzinomen übersteigen derzeit in den Vereinigten Staaten 700.000 Fälle pro Jahr (Amerikanische Krebsgesellschaft, 1994). In ähnlicher Weise sind Warzen (im Fußsohlen- und Genitalbereich) und andere lokale hyperproliferative Zustände der Haut extrem häufig.
Für den behandelnden Arzt sind wirksame Behandlungsmöglichkeiten zur Zeit nicht in ausreichender Menge verfügbar. Die Behandlungs-Modalitäten für diese Zustände beinhalten das Entfernen durch Operation oder Gefrieren des Gewebes, um die entarteten Zellen zu vernichten. Diese Verfahren sind nicht immer die am besten geeignete Behandlung, da sie nicht selektiv sind und somit hyperproliferative Zellen zurückbleiben können, die ein erneutes Auftreten verursachen, oder normales Gewebe kann zerstört werden, wobei sich Narbengewebe entwickelt. Diese Verfahren sind häufig schmerzhaft und deshalb für die Patienten nicht akzeptabel. Exfoliative Säure-Verbindungen wie Salicylate werden topisch verwendet, um hyperproliferative Hautläsionen abzuschuppen und, die Zellen direkt zu töten, insbesondere zur Behandlung von Warzen auf der Fußsohle. Diese Behandlung ist jedoch nichtselektiv für hyperproliferative Zellen und ist nicht immer heilend. Die topische Verabreichung cytotoxischer Mittel wie Bleomycin und 5-Fluoruracil (5FU) wird für die Behandlung prämaligner und maligner Läsionen verwendet, und Podophyllotoxin für Genitalwarzen. Es gibt einige Bedenken hinsichtlich der Toxizität dieser Mittel, welche ihre Wirkung über direkte Cytotoxizität vermitteln, wobei sie durch eine Vielfalt von Mechanismen in die DNA-Synthese proliferierender Zellen eingreifen. Diese Mittel müssen außerordentlich vorsichtig verabreicht werden, um den Kontakt mit der normalen Haut zu vermeiden, da die normale Haut nicht wiederherstellbar geschädigt werden kann, und die systemische Absorption dieser Verbindungen kann ebenfalls ein erhebliches Risiko für den Patienten darstellen. Retinoide, welche Vitamin A-Derivate sind, stellen einen neuen Ansatz zur Behandlung neoplastischer Haut-Läsionen dar. Unglücklicherweise sind diese Verbindungen eher hemmend als heilend und der Entzug des Arzneimittels führt zu erneutem Auftreten.
Die Epidermis bildet die äußersten Schichten der Haut. Dieses Organ durchläuft einen Prozess kontinuierlicher Erneuerung, wobei die innere Schicht epidermaler Zellen, die epidermalen Keratinocyten, kontinuierlich proliferieren, dann eine terminale Differenzierung durchlaufen, die zu programmiertem Zelltod durch Vernetzung zellulärer Proteine durch Transglutaminase-Enzyme führt, wobei eine verhornte Hülle gebildet wird, die das Stratum corneum darstellt. Dieser Prozess wird bei hyperproliferativen Hauterkrankungen verändert, insbesondere bei viral-induzierten Warzen, bei durch Strahlung bedingten Keratosen und Neoplasien, aber auch in anderen hyperproliferativen Zuständen (Yuspa S. H., Cancer Res., 54, 1178-1189, 1994, Molecular Biology of the Skin - the keratinocyte, Hrsg. Darmon und Blumenberg, Kapitel 7, 207-243, 1993).
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, eine Verwendung gemäß den Ansprüchen 1 bis 9 zur Behandlung hyperproliferativer epithelialer Erkrankungen durch die topische Verabreichung einer Klasse von Verbindungen bereitzustellen, welche hydroxylierte aromatische Proteinvernetzende Substanzen sind. Behandelbare hyperproliferative epitheliale Erkrankungen beinhalten die meisten Hauterkrankungen, bei denen die Wachstums-Kontrollmechahismen zerstört worden sind. Beispiele solcher Erkrankungen sind mit Papilloma-Viren infizierte Zellen, welche häufig mit Warzen uhd prämalignen und malignen Oberflächen-Neoplasien der Haut assoziiert sind. Zusätzlich können cervikale hyperproliferative Zustände ebenfalls, topisch behandelt werden. Zimtsäure-Derivate und Analoge, welche gesättigte Formen davon beinhalten, und insbesondere Methyl-2,5- dihydroxycinnamat, können für die Behandlung von hyperproliferativen epithelialen Läsionen verwendet werden. Methyl-2,5-dihydroxycinnamat ist ein bevorzugtes Mitglied aus der Klasse der zweckmäßigen Verbindungen und ist als eine topische Forumlierung für die Behandlung von hyperproliferativen epithelialen Läsionen, insbesondere für die Behandlung von Basalzell- und Plattenepithel-Karzinomen hochgradig wirkungsvoll.
Hydrophobe hydroxylierte aromatische Protein-vernetzende Verbindungen sind für die Behandlung von Hauterkrankungen mit mehr verhornenden Läsionen, wie bei Warzen der Fußsohle, verwendbar. Diese Verbindungen zeigen eine gute Gewebe- Durchdringung und können deshalb verwendet werden, um epitheliale Erkrankungen unterhalb des Stratum corneum zu behandeln.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung hyperproliferativer Epithel-Erkrankungen durch topische Verabreichung von hydroxylierten aromatischen Protein-vernetzenden Verbindungen. Diese Klasse von Verbindungen umfasst die Verbindungen der nachfolgenden allgemeinen Formeln:
in denen R¹ und R² ein Wasserstoffatom oder der Rest
ist, wobei Z ein Alkyl-, Aryl-, Aralkyl- oder ein Alkarylrest ist;
Y ein Wasserstoffatom, ein Alkyl-, Aralkyl-, Alkaryl-, Aryl-, Heteroarylrest oder
ein Rest der Formel
ist, wobei Q ein Wasserstoffatom, ein Alkyl-O-Rest, ein Stickstoffatom, ein O-Alkaryl-, O- Aralkyl-, N-Alkaryl- oder N-Aralkylrest ist;
wobei in der Strukturformel I die gestrichelte Linie eine fakultative Doppelbindung und in der Strukturformel II der gestrichelte Kreis alle Grade an Sättigung innerhalb des Ringes darstellt.
Die vorstehenden Formeln werden dadurch näher definiert, dass die Aralkyl- und Alkaryl-Reste vorzugsweise in der Größenordnung von C&sub7; bis C&sub1;&sub3; liegen, der Aryl-Rest vorzugsweise C&sub6; bis C&sub1;&sub2; ist, der Heteroaryl-Rest ein Heteroatom wie N, O und/oder S enthalten kann. In der Formel II kann jeder einzelne Rest V und W ein Kohlenstoff oder ein Heteroatom wie N, O oder S sein.
Hydroxylierte aromatische Protein-vernetzende Verbindungen sind für die Behandlung von neoplastischen und nichtneoplastischen hyperproliferativen Hauterkrankungen zweckmäßig. Insbesondere sind sie für eine topische Behandlung eines großen Spektrums lokaler hyperproliferativer epithelialer Schäden, einschließlich Warzen, cervikaler Tumoren, prämaligner Läsionen, wie strahlungsbedingte Keratosen, und gutartiger und maligner Tumoren zweckmäßig. Methyl-2,5-dihydroxycinnamat (hierin als "MC" bezeichnet) wird für die topische Verabreichung bevorzugt.
Die vorliegende Erfindung betrifft hydroxylierte aromatische Protein-vernetzende Verbindungen zur Hemmung des Wachstums von menschlichen Tumorzellen und HPV-infizierten Zellen. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Veränderungen in Bezug auf die Zellproteine, ähnlich den Veränderungen, welche während der normalen Hautbildung auftreten, wobei die hyperproliferativen Zellen in einen mehr normalen Typ umgewandelt werden. Die Toxizität der erfindungsgemäßen Verbindungen wurde unter Verwendung von Mäusehaut als ein in vivo-Modellsystem getestet. Aufgrund ihres dualen Wirkungsmechanismus, das sind Wachstumshemmung und eine Protein-vernetzende Wirkung, sind die erfindungsgemäßen Mittel eine zweckmäßige Ergänzung zu der Ausrüstung des Klinikers für diese hyperproliferativen Hautschädigungen.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 MC erhöht den Anteil vernetzender Proteine in epidermalen Zelllinien. Die schwarzen Quadrate repräsentieren HPV 18-menschliche epitheliale Keratinocyten; schwarze Kreise repräsentieren SV 40-infizierte menschliche Keratinocyten; schwarze Dreiecke repräsentieren (SQCC-Y1)-Zellen; weiße Dreiecke repräsentieren (SP-1)-Maus-Keratinocyten von einem gutartigen Tumor; weiße Quadrate repräsentieren (308-Zellen) gutartige Maus-Keratinocyten; und weiße Kreise repräsentieren (I-7)-Zellen von einem Plattenepithelkarzinom der Maus.
Morphologie der Hüllstrukturen aus vernetztem Protein von MC SP-1-Zellen.
Fig. 2 SP-1-Zellen wurden 48 Stunden lang mit Vehikeln (A und C) oder 250 uM MC (B und D) behandelt. In A und B wurden Phasenkontrast-mikrophotographische Aufnahmen erstellt. In C und D wurden die Zellen in eine Lösung aus 2% SDS, 20 mM DTT geschabt und 10 Minuten gekocht, dann wurden Fotografien der resultierenden Proben gemacht, um die Bildung von vernetzten verhornten Hüllen zu zeigen.
Fig. 3 A Zeitverlauf der Verhornung primärer Maus- Keratinocyten als Antwort auf MC. Die Kästchen repräsentieren 1,4 mM Ca²&spplus;, Dreiecke repräsentieren 100 uM MC, 1,4 mM Ca²&spplus; und ausgefüllte Kreise repräsentieren 1 mM MC, 1,4 mM Ca²&spplus;. B: MC hemmt die MTT-Reduktion in primären Maus-Keratinocyten innerhalb von 4 Stunden. Zellen wurden 4 Stunden lang in Medium mit 1,4 mM Ca²&spplus; und MC inkubiert, dann wurden sie für weitere 4 Stunden mit MTT (0,5 mg/ml in Medium) inkubiert, bevor die Formazan-Herstellung bestimmt wurde.
Fig. 4 Herstellung von vernetztem Protein gegenüber Wachstumshemmung in primären Maus-Keratinocyten. Zellwachstum wird durch schwarze Quadrate repräsentiert und die Herstellung von vernetztem Protein durch weiße Quadrate. Die Ergebnisse sind ±SD (n = 3) für ein Experiment, welches repräsentativ für 3 ist.
Fig. 5 Herstellung von vernetztem Protein im Vergleich mit Wachstumshemmung in A431 (menschlichen cervikalen Krebs)- Zellen. Zellwachstum ist durch schwarze Kreise repräsentiert und Herstellung von vernetztem Protein durch weiße Kreise. Die Ergebnisse sind ±SD (SD, standard deviation; Standardabweichung; n = 3) von einem Experiment, welches für 3 repräsentativ ist.
Fig. 6 Transglutaminase-Inhibitoren verhindern die Protein-Vernetzung durch MC nicht. Schraffierte Säulen repräsentieren die Behandlung ohne Transglutaminase-Inhibitor; schwarze Säulen repräsentieren die Behandlung mit LTB 2 in einer Konzentration von 100 uM; und weiße Säulen repräsentieren die Behandlung mit HPB 2 in einer Konzentration von 100 uM. Die Ergebnisse entsprechen einem Experiment, welches in dreifacher Ausführung durchgeführt wurde, ±SD, welches in zwei verschiedenen Bestimmungen wiederholt wurde.
Fig. 7 MC erhöht nicht die Transglutaminase-Aktivität in primären Maus-Keratinocyten. Schwarze Säulen repräsentieren unbehandelte Zellen in Medium mit 1,4 mM Ca²&spplus;; und schraffierte Säulen repräsentieren Zellen, die mit 1 mM MC behandelt wurden. Das Cytosol wird durch "C" repräsentiert und die Membran-Fraktionen werden durch "M" repräsentiert. Die Ergebnisse sind ±SD (n = 2) dargestellt und wurden in einem ähnlichen Experiment wiederholt.
Fig. 8 MC induziert Protein-Vernetzung in primären Maus- Keratinocyten bei 4ºC und 37ºC. "C" repräsentiert Kontrollproben. Die Ergebnisse stammen von einem Experiment ±SD, welches in doppelter Ausführung durchgeführt wurde, und welches in einem getrennten Experiment wiederholt wurde.
Fig. 9 Topische Verabreichung von MC auf athymische Nacktmaus-Haut. Von Paraffin-eingebettetem Gewebe wurden histologische Schnitte angefertigt und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Bild a ist eine Vehikel-Kontrolle; Bild b stellt eine Behändlung mit 100 uM MC dar; Bild c stellt eine mir 1 mM MC dar; Bild d stellt die Behandlung mit 10 mM MC dar; und Bild e stellt die Behandlung mit 100 mM MC dar. Die Vergrößerung ist 200 x.
Fig. 10 MC hemmt die transplantierte SP-1-Zell- Tumorbildung. Die Zahlen oberhalb der Balken kennzeichnen die Anzahl der Tiere mit Tumoren/die Anzahl der Tiere in der Gruppe. In Teil A wurde MC zwei Wochen lang zweimal wöchentlich verabreicht. In Teil B wurde MC drei Wochen lang an fünf Tagen pro Woche verabreicht.
Fig. 11 Herstellung von vernetztem Protein in SQCC-Y1- Zellen durch MC-Derivate.
Fig. 12. Chemische Struktur von hydroxylierten aromatischen Protein-vernetzenden Verbindungen, die in den Beispielen 9 und 10 beschrieben sind, deren Ergebnisse in Fig. 11 gezeigt sind.
Fig. 13. MC verursacht keine akute Entzündung oder Nekrose, wenn es topisch an Nacktmaus-Haut verabreicht wird. Die Fotografien wurden nach dem Töten der Tiere, nach Beendigung der Experimente gemacht.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die hydroxylierten aromatischen Protein-vernetzenden Verbindungen, die an der vorliegenden Erfindung beteiligt sind, sind eine spezifische Gruppe von Verbindungen mit chemischer Protein-Vernetzungsaktivität bei hohen Konzentrationen. Diese hierin beschriebene Vernetzungswirkung ist neu und für hyperproliferative Schädigungen des Epithels von einzigartiger Signifikanz, wobei die topische Verabreichung den Wirkstoff zielgerichtet an seinen spezifischen Wirkort bringt und die Zellen durch ein Verfahren getötet werden, welches die epidermale Zelldifferenzierung imitiert.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet hydroxylierte aromatische Verbindungen, welche als wirksame Proteinvernetzende Mittel dienen, und welche Proteinhüllen produzieren, die ähnlich denjenigen sind, die durch das endogene Verfähren der terminalen Differenzierung in von Keratinocyten abstammenden Zellen gebildet werden. Alle Zelltypen, die getestet wurden, antworteten auf die erfindungsgemäßen hydroxylierten aromatischen Proteinvernetzenden Verbindungen durch Vernetzung, so dass diese das potentielle Mittel für die topische Behandlung eines großen Bereiches lokaler hypoproliferativer epithelialer Schädigungen, umfassend Warzen, prämaligne Läsionen, wie strahlungsbedingte Keratosen, und gutartige und maligne Tumoren sind. Der Begriff "Läsion", wie er hierin verwendet wird, ist als eine begrenzte pathologische Gewebeveränderung, oder ein Punkt oder eine Stelle einer Hauterkrankung definiert.
Die vernetzende Wirkung der erfindungsgemäßen hydroxylierten aromatischen Verbindungen ist schnell und führt zum Zelltod und zur Ausrottung anormaler Zellen. In niedrigen Konzentrationen hemmen hydroxylierte aromatische Protein vernetzende Mittel Zellwachstum und Tyrosinkinasen (Umezawa et al. FEBS Lett., 314, 3, 289-292, 1992, Hori et al., J. Antibiot., 45, 280-282, 1992, Umezawa et al., FEBS Lett. 260, 198-200, 1990). Diese Wirkungen sind auch günstig für die Behandlung von hyperproliferativen Schädigungen. Der Unterschied zwischen den Konzentrationen, die für diese Wirkungen und für die Vernetzung erforderlich sind, legt nahe, dass das Vernetzen unabhängig ist von den Tyrosinkinaseinhibitorischen Eigenschaften von MC. Darüber hinaus sind andere bewährte Tyrosinkinase-Inhibitoren, einschließlich Tyrphostine, Herbimycin A und Lavendustin A, nicht in der Lage eine Vernetzung zu induzieren (siehe Tabelle II). Bei 4ºC sind zelluläre Prozesse und enzymatische Aktivität gehemmt. Hydroxylierte aromatische Protein-vernetzende Verbindungen, insbesondere MC, sind jedoch in der Lage, bei 4ºC oder 37ºC wirkungsvoll Protein-Vernetzung zu induzieren, was eindeutig belegt, dass chemische anstelle von biologischen Prozessen beteiligt sind.
In vivo-Studien, welche MC verwenden, belegen das Fehlen einer Toxizität von MC für normale Epidermis, was darauf hinweist, dass während der topischen Verabreichung an die spezifische Läsion, das Meiden der normalen Haut weniger kritisch zu sein scheint als bei Verwendung der cytotoxischen Mittel, die gegenwärtig im Gebrauch sind. Das kann eine Widerspiegelung der Unfähigkeit von MC sein, das Stratum corneum zu durchdringen. Diese Wirkung kann bei gering differenzierten hyperproliferativen Schäden, wie Basalzellkarzinomen, in welchen MC spezifisch auf die Zellen der erkrankten Region gerichtet ist, günstig sein.
In mehr verhornenden hyperproliferativen Schädigungen, wie Warzen der Fußsohlen, könnte eine größere Gewebe-Durchdringung erforderlich sein und es können mehr fettlösliche hydroxylierte aromatische. Protein-vernetzende Verbindungen verwendet werden. Beispiele für hydroxylierte aromatische Protein-vernetzende Verbindungen, die in größerem Maße fettlöslich sind, sind 67H-69A, 67H-98A, 67H-124A, 67G-146A. Diese Verbindungen werden aufgrund ihrer erhöhten Hydrophobizität die Haut leichter durchdringen und deshalb bei der Behandlung von mehr verhornenden Schädigungen der Haut, wie bei Warzen der Fußsohlen, wirkungsvoller sein. Zusätzlich besitzen diese Verbindungen eine erhöhte Stabilität.
Man geht davon aus, dass die Klasse von Verbindungen, die für das erfindungsgemäße Verfahren zweckmäßig ist, über einen spezifischen Mechanismus wirkt. Es ist bekannt, dass ortho- oder para-hydroxylierte Aromaten leicht zu den entsprechenden Chinonen oxidiert werden können. Die resultierenden Chinone sind dann empfänglich für nucleophile Angriffe. Deshalb scheint es, dass die Vernetzung der hydroxylierten aromatischen Verbindungen durch die anfängliche Oxidation zu reaktiven Chinon-Zwischenverbindungen auftreten kann, welche dann eine bis-Addition von Nucleophilen durchlaufen (zum Beispiel SH- oder NH&sub2;-Seitenkettenreste von Proteinen), wobei die Vernetzung erfolgt.
Eine erfindungsgemäße hydroxylierte aromatische Proteinvernetzende Verbindung, MC, hat eine kurze Halbwertszeit in Serum (Hori et al., 11. Antibiot., 45, 280-282, 1992). Das kann vorteilhaft sein insofern, dass die Verbindung ihre lokale vernetzende Wirkung kurzfristig ausüben kann (Fig. 3), dann im Blutkreislauf verdünnt und abgebaut wird, was sie wieder in einen inaktiven Zustand überführt und systemische Nebenwirkungen verhindert.
Ein besonderer Schwerpunkt liegt auf Verbindungen, welche an dem aromatischen Ring Substituenten in ortho- oder para- Stellung besitzen. In der Arzneimittel-Vorstufenform können die Hydroxylgruppen zum Schutz vor Abbau, um eine verstärkte Durchdringung der Zellen zu erreichen, geschützt sein. Ein Beispiel einer solchen Arzneimittel-Vorstufen-Derivatisierung ist die Veresterung. Sobald sie innerhalb der Zelle sind, würden Esterasen die aktiven freien Hydroxy-Verbindungen freisetzen. Man geht davon aus, dass die Art des Y- Substituenten in der allgemeinen Formel ebenfalls eine Wirkung auf die zeluläre Durchdringung besitzt. So würde man zum Beispiel erwarten, dass lipophile Ester-Reste das Durchqueren von Zellmembranen verstärken.
Die Wirksamkeit hydroxylierter aromatischer Proteinvernetzender Mittel, Protein-Vernetzung zu induzieren ist Zelltyp-spezifisch, was nahe legt, dass die Verbindung eine gewisse Spezifität für bestimmte hyperproliferative Zustände aufweisen kann. Die erhöhte Sensitivität von primären Maus- Keratinocyten für die vernetzende Wirkung steht nicht in Bezug zu dem normalen Phänotyp. Primäre Kulturen von normalen menschlichen epidermalen Keratinocyten aus der Vorhaut reagierten bei einer Konzentration von niedrgier als 250 uM MC nicht auf MC hinsichtlich seiner vernetzenden Wirkung. Studien, welche ein Transplantations-Modell verwendeten, zeigten die Fähigkeit von MC, bei Konzentrationen von 1 und 100 mM die Tumorbildung zu hemmen. Hydroxylierte aromatische Protein-vernetzende Mittel induzieren die Vernetzung von Zellproteinen in verhornte hüllenartige Strukturen, wobei sie durch einen nicht-biologischen Mechanismus, welcher das normale Differenzierungsprogramm epidermaler Keratinocyten nachahmt, Zelltod verursachen. Zusätzlich zu ihren Wachstumshemmenden Eigenschaften bietet die einzigartige Proteinvernetzende Fähigkeit der Klasse von Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben ist, einen neuen Mechanismus zur topischen Behandlung von hyperproliferativen Erkrankungen der Haut an.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet ein Erbstatin-Analoges, Methyl-2,5-dihydroxycinnamat, welches in normalen und neoplastischen epithelialen. Zellen anhand eines Mechanismus, der unabhängig von der Hemmung der Tyrosinkinase stattfindet, Vernetzte Proteinhüllen ausbildet. Methyl-2,5-dihydroxycinnamat (MC) ist ein Tyrosinkinase-Inhibitor. Um seine Fähigkeit zu bestimmen, epitheliale Zelldifferenzierung zu induzieren, wurden vernetzte Protein- Hüllen nach einer 48-stündigen Inkubation mit dem Mittel gemessen. In allen getesteten Zellen (primäre Keratinocyten, Maus-SP-1, 308 (Papillome), I-7 (Karzinom)-Zellen und menschliche Linien SQCC-Y1 (Plattenepithelkarzinome), A431 (epidermoldes Karzinom) und HPV 18 oder SV 40-infizierte Keratinocyten), erhöhte MC Dosis-abhängig (0,1-1 mM) die Vernetzung von Protein. Um den Prozess der Differenzierung zu bestätigen, wurden MC-behandelte primäre Maus-Keratinocyten auf Transglutaminase (TGase)-Aktivität, Hemmung der Protein- Vernetzung durch die TGase-Inhibitoren LTB-2 und HPB-2 und den Einbau des fluoreszierenden TGase-Substrats Dansylcadaverin in die Hüllen, getestet. Die Ergebnisse widerlegten die Beteiligung von TGase an der Wirkungsweise dieses Mittels. MC induzierte auch Proteinhüllen in NIH 3T3-Fibroblasten, sogar wenn diese bei 4ºC in Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung inkubiert wurden, was ein nicht-physiologisches Verfahren nahe legt. Die simultane Verabreichung von Dithiothreit (DTT, 20 mM) an 3T3-Zellen verhinderte die Vernetzung durch MC bei 37º und 4ºC. Western Blot-Analysen eines in vitro-Tests mit dem EGF-Rezeptor zeigten, dass DTT die Tyrosinkinase-Hemmung durch MC nicht verhinderte, jedoch die MC-induzierte Mobilitätsverringerung des EGF-Rezeptors hemmte, was nahe legt, dass die Oxidation des Mittels oder einer Akzeptor-Gruppe die Vernetzung ermöglicht. Die vorliegende Erfindung zeigt, dass MC in epithelialen Zellen keine Differenzierung induziert, sondern in hoher Dosis chemische Protein-Vernetzung verursacht. Diese Wirkung, gemeinsam mit den wachstumshemmenden Eigenschaften, kann klinisch für die topische Behandlung von Warzen oder oberflächlichen Neoplasien der Haut zweckmäßig sein.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Verhinderung des Wachstums gutartiger, prämaligner und maligner Zellen durch prophylaktische Verabreichung der Zusammensetzung, welche hydroxylierte aromatische Protein-vernetzende Verbindungen, wie MC, umfasst, an eine bestimmte Körperstelle, welche unnormalerweise einem Krebsinduzierenden Reiz ausgesetzt war.
Es zeigte sich auch, dass die vorliegende Erfindung nicht nur für die Eliminierung oder die Verbesserung des Zustands von Tumoren, sondern auch zur Verhinderung von deren Auftreten wirksam ist, wenn sie prophylaktisch verabreicht wird. Um die Etablierung von Krebs zu verhindern, können die erfindungsgemäßen hydroxylierten aromatischen Etoteinvernetzenden Mittel in Cremes und Salben oder in kosmetischen Basen zur täglichen Verwendung, vorzugsweise topisch, formuliert werden.
Die wirksame Menge des hydroxylierten aromatischen Protein-vernetzenden Mittels, welches in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann über einen breiten Bereich variiert werden. Der typische. Bereich für die Menge eines hydroxylierten aromatischen Protein-vernetzenden Mittels für die vorliegenden Verfahren liegt zwischen etwa 0,0001 Gew.% und 5 Gew.%, und vorzugsweise liegt die Menge der hydroxylierten aromatischen Verbindungen, welche gemäß der vorliegenden Erfindung verabreicht werden, zwischen etwa 0,0001 Gew.% und 2 Gew.%. Wie hierin verwendet, bezieht sich das Gew.% in den Formulierungen auf die Konzentrationen der Materialien, welche wirkungsvoll an die Behandlungsstelle verabreicht wurden.
Im Allgemeinen sind die wirkungsvollen Mengen und Konzentrationen der zu verabreichenden Verbindung diejenigen, die in der Zusammensetzung resultieren, welche die Eigenschaft oder die Eigenschaften zeigt, die für die Behandlung erforderlich ist/sind, für die die Zusammensetzung verwendet werden soll, namentlich, Anti-Tumor-Aktivität. Im Besonderen verursachen die erfindungsgemäßen Verbindungen Protein- Vernetzung und Zelltod. Dieses Phänomen ist für die Behandlung von hyperproliferativen epithelialen Läsionen vorteilhaft, dadurch dass es normale Zelleigenschaften verstärkt. Die bevorzugten Mengen hängen ab von den einzelnen zu behandelnden Zuständen, der Verabreichungsrate der aktiven Bestandteile an die zu behandelnde Stelle und der Anzahl der Verabreichungen der Formulierung, die verwendet werden soll. Bevorzugte Mengen für eine spezifische Anwendung können anhand von normalen pharmakologischen Durchmusterungsverfahren bestimmt werden, die im Fachgebiet eingesetzt werden. Falls gewünscht, kann ein Überschuss der Verbindung als angemessen für den spezifischen zu behandelnden Zustand verwendet werden. Es zeigte sich, dass es notwendig ist, die Tumorzellen mit mindestens einer Schwellenmenge der erfindungsgemäßen Verbindungen in Kontakt zu bringen, um eine Hemmung des Wachstums der Haut-Neoplasie zu beobachten. Diese minimale Menge wurde auf größer als etwa 10 nanomol der Verbindung pro ml Tumorzellen bestimmt.
Trägermaterialien sind im Stand der Technik für pharmazeutische Formulierungen gut bekannt und beinhalten diejenigen Materialien, die als Verdünnungsmittel oder Vehikel bezeichnet werden. Der Träger kann anorganische oder organische Materialien beinhalten und sollte ausreichend Viskosität besitzen, um das Ausbreiten der Zusammensetzung zu erlauben und eine gute Anheftung an das Gewebe bereitstellen, an welches er topisch Verabreicht wurde. Beispiele für solche Träger beinhalten, ohne Einschränkung, Polyole wie. Glycerin, Propylenglycol, Polyethylenglycol, vorzugsweise mit einem Molekulargewicht zwischen etwa 400 und etwa 8.000, geeignete Mischungen davon, Pflanzenöle und andere Materialien, die dem Fachmann gut bekannt sind. Die Viskosität der Formulierung kann durch Verfahren angepasst werden, die im Fachgebiet gut bekannt sind, zum Beispiel durch die Verwendung eines Polyethylenglycols von höherem Molekulargewicht.
Zusätzlich zu der hydroxylierten atomatischen Proteinvernetzenden Verbindung und dem Träger kann die Formulierung pharmakologisch akzeptable Zusätze oder Hilfsstoffe, wie antimikrobielle Mittel, z. B. Methyl-, Ethyl-, Propyl-, und Butylester von para-Hydroxybenzoesäure, sowie Chlorbutanol, Phenol, Ascorbinsäure etc. enthalten. Die Formulierung kann in Übereinstimmung mit der Praxis auf dem Fachgebiet auch Verdickungs- oder Geliermittel, Emulgatoren, Netzmittel, Färbemittel, Puffer, Stabilisatoren und Konservierungsmittel, einschließlich Antioxidantien wie Butylhydroxyanisol, enthalten. Die Formulierung kann auch Durchdringungs- Verstärker, wie Dimethylsulfoxid, langkettige Alkohole, wie Nonoxynol, langkettige Carbonsäuren, Propylenglycol, N-(2- Hydroxyethyl)-pyrrolidon, 1-Dodecyl-azacycloheptan-2-on und ähnliche, enthalten. In Abhängigkeit vom Verabreichungsverfahren und der zu behandelnden Erkrankung kann es wünschenswert sein, Absorptions-verzögernde Mittel wie Aluminiummonostearat und Gelatine zu verwenden.
Die Zusammensetzung der Formulierung kann unter Verwendung von Bestandteilen angepasst werden, die auf dem Fachgebiet für Formulierungen gut bekannt sind, um eine pharmazeutische Formulierung bereitzustellen, welche ein Gel, eine Creme, eine Salbe, ein Feststoff, eine Flüssigkeit, ein halbfestes Material etc. ist. Die physikalische Form der Formulierung hängt im Einzelnen von dem gewünschten Behandlungsverfahren und dem zu behandelnden Patienten ab.
Typische Formulierungen der pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung sind in Tabelle I dargestellt.
In den beschriebenen Ausführungsformen liegt die bevorzugte Konzentration im Bereich von 1 mg/100 ml bis 2 g/100 ml oder 0,0001% bis 5% Gew./Gew. Für Derivate, die in wässriger Umgebung instabil sind, werden die folgenden Formulierungen zur topischen Verabreichung bereitgestellt. Eine bevorzugte Salbe kann durch Mischen der hydroxylierten aromatischen Verbindung in 1 ml 100% Ethanol, dann Mischen in Vaselinum album oder Lanolin, hergestellt werden. Eine einfache Formulierung für eine Lotion kann hergestellt werden, indem die erfindungsgemäße hydroxylierte aromatische Verbindung einfach in 100% Ethanol gemischt wird. Alternativ kann ein hydrophiles Petrolatum durch Mischen aller Bestandteile mit Ausnahme des Cholesterins (siehe Tabelle I) miteinander und Erhitzen bis zum Schmelzen, hergestellt werden. Nachdem das Ganze geschmolzen ist, wird das Cholesterin hinzugegeben. Dieses Gemisch wird solange gerührt, bis alle Komponenten aufgelöst sind. Nach dem Abkühlen wird die hydroxylierte aromatische Verbindung zerrieben, welche zuvor in 1 ml 100% Ethanol aufgelöst wurde. Für Derivate, die in einer wässrigen Umgebung stabil sind, wird zusätzlich die nachfolgende Formulierung bevorzugt: Wasser (bis zu 20%) kann zu dem vorstehend beschriebenen hydrophilen Petrolatum zugegeben werden, um eine Wasser-in-Öl-Emulsion herzustellen.
Für Coldcreams werden alle Bestandteile (siehe Tabelle I) mit Ausnähme des Natriumborats und Wasser bei 70ºC geschmolzen. Das Natriumborat wird in Wasser aufgelöst und dann zu den nicht-wässrigen Bestandteilen zugegeben und bis zum Erkalten gerührt.
Die Konzentrationen an aktiven Bestandteilen in einer bestimmten Formulierung, die erforderlich sind, um eine bestimmte wirksame Dosis bereitzustellen, können auf der Grundlage der Eigenschaften eines Trägers und den jeweiligen Zusätzen, die in die Formulierung zugegeben wurden, von einem Fachmann für pharmazeutische Formulierungen bestimmt werden. Es ist vorgesehen, dass in Abhängigkeit von dem Träger und den Zusätzen, welche verwendet werden, Formulierungen hergestellt werden können, die signifikant höhere Konzentrationen der erfindungsgemäßen Verbindung enthalten. Falls der Träger im Wesentlichen die Verbindung zurückhält oder sie in einer langsamen Rate freisetzt, können die Konzentrationen der Verbindung in der Formulierung wesentlich erhöht werden und müssen sogar wesentlich erhöht werden, um eine wirkungsvolle Behandlung bereitzustellen. In der Praxis wird es bevorzugt, dass eine Formulierung die niedrigsten Konzentrationen an wirksamen Bestandteilen enthält, welche mit der gewünschte Anzahl von Verabreichungen den Zustand wirkungsvoll behandeln, d. h. eine niedrige wirkungsvolle Dosis kann toleriert werden, wenn zahlreiche Verabreichungen verwendet werden. Diese niedrige Konzentrationsgrenze ist abhängig von der Bereitstellungs-Wirksamkeit des Träger-Vehikels. Vorzugsweise machen die erfindungsgemäßen Verbindungen zwischen etwa 0,0001 und etwa 5 Gew.% der Formulierung aus. Tabelle I
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst Zusammensetzungen, welche MC enthalten, d. h., Methyldihydroxycinnamat. Es zeigte sich, dass diese Zusammensetzung für die Behändlung von tumorösen Hautläsionen in Tierversuchen besonders wirkungsvoll ist. Obwohl die wirkungsvolle Konzentration von MC, welches an die zu behandelnde Stelle verabreicht wird, unter anderem von dem Träger und anderen Zusätzen, die in der Formulierung enthalten sind, abhängt, liegt die Konzentration von MC in der Formulierung gewöhnlich in einem Bereich von etwa 010001 - etwa 5 Gew.%. Diese Bereiche werden in Form von Beschreibung und nicht in Form von Einschränkung bereitgestellt, da es anerkannt ist, dass die Konzentration in Abhängigkeit von dem Trägermaterial, der Anzahl der verwendeten Verabreichungen etc., wie hierin vorstehend beschrieben, über einen weiten Bereich angepasst werden kann.
Bei topischen Verabreichungen werden die dargestellten Zusammensetzungen an den betroffenen Bereich oder den betroffenen Situs des Patienten verabreicht. Der Begriff "topisch" bezieht sich hierin auf die Oberfläche des epidermalen Gewebes, insbesondere der Haut, die Oberfläche von Tumoren auf der Haut, welche zerstört oder andersartig modifiziert ist, sowie Stellen, von welchen solide Tumoren aus der Haut entfernt wurden. In einer Ausführungsform kann topisch sich auf die Verabreichung einer Formulierung an eine cervikale Läsion beziehen.
Bei der Herstellung einer Formulierung, die zur topischen Verabreichung geeignet ist, werden die dargestellten Zusammensetzungen normalerweise mit einem geeigneten Lösungsmittel vermischt. Beispiele für Lösungsmittel, die für diesen Zweck wirkungsvoll sind, beinhalten Ethanol, Aceton, Essigsäure, wässrige alkalische Lösungen, Dimethylsulfoxid, Glycerin, Glycerol, Propylenglycol, Nonoxynol, Ethylether, Polyethylenglycol, etc.
Zusätzlich können Antioxidantien wie Ascorbinsäure (vorzugsweise in einer Menge von 0,1%), Hydroxychinon, Natriumbisulfit, Metabisulfit etc. zu der Formulierung zugegeben werden.
Die nachfolgenden Beispiele verwendeten bestimmte Verfahren bei der Durchführung der Experimente, welche die vorliegende Erfindung veranschaulichen sollen. Diese Experimente repräsentieren nicht-einschränkende Beispiele der vorliegenden Erfindung. Andere Ausführungsformen sind für den Fachmann leicht ersichtlich und es ist beabsichtigt, dass diese innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung liegen.

Beispiel 1

Reagenzien

Methyl-2,5-dihydroxycinnamat (MC) und die Tyrosinkinase-Inhibitoren, welche in Tabelle II aufgelistet sind, wurden von LC Laboratories, Woburn, Mass, erhalten. Verbindungen, welche sich auf MC beziehen (Fig. 10), wurden im Labor von Dr. T. R. Burke, NCI, Bethesda synthetisiert. 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium-bromid (MTT) wurde von Sigma erhalten.

Zellkultur

Primäre Maus-Keratinocyten wurden von der Haut neugeborener BALB/c-Mäuse isoliert. Primäre Keratinocyten, die gutartigen neoplastischen Keratinocyten-Zelllinien 308 und SP- 1 (Strickland et al., Cancer Res., 48, 165-169, 1988) und die Maus-Plattenepithelkarzinom-Zelllinie 1-7 (Greenhalgh et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87, 643-647, 1990) wurden in Eagle's minimalem essentiellem Medium mit 8% fötalem Kälberserum (FCS)("chelexed") und Penicillin (20 IU/ml, Streptomycin 20 ug/ml (P/S), gezüchtet. Falls nicht anders angegeben, wurde die Ca²&spplus;-Konzentration im Medium auf 0,05 mM eingestellt (Hennings et al., Cells, 19, 245-254, 1980). A431 menschliche epidermoide Karzinomzellen wurden von ATCC, Rockville, MD erhalten und wurden routinemäßig in DMEM mit 10% FCS, P/S, Glutamin (2 mM) und Pyruvat (1 mM) passagiert. SQCC-Y1 menschliche Plattenepithelkarzinom-Zellen und nicht-tumorigene HPV 18- und SV 40-infizierte menschliche Keratinocyten wurden freundlicherweise von Dr. James Rheinwald von der Harvard University, Boston, MA bzw. Dr. Richard Schlegel von der Georgetown University, Washington, DC zur Verfügung gestellt.
Menschliche Zellen wurden in DMEM/Ham's F12 1 : 1, 10% FCS, P/S und epidermalem Wachstumsfaktor, 10 ng/ml, gezüchtet.
MC erhöht die Menge an vernetztem Protein in epidermalen Zelllinien. Die Zellen wurden 48 Stunden lang mit MC inkubiert, dann wurde vernetztes Protein isoliert und gemessen, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Ergebnisse stammen von einem Experiment ±SD (n = 3) und sind repräsentativ für 2-3 getrennte Bestimmungen, wie in Fig. 1 gezeigt. MC induzierte die Herstellung einer vernetzten Hülle in menschlichen und Maus-Zelllinien, die von Keratinocyten abstammen, welche den normalen Phänotyp repräsentieren (primäre Maus-Keratinocyten), hyperproliferative (SV 40- infizierte), Warzen-ähnliche (HPV 18-infizierte), straltlungsbedingte Keratosen-ähnliche (SP-1, 308) und Karzinomzellen (A431, SQCC-Y1, I-7) (Fig. 1-5).

Beispiel 2

Zeitverlauf der Verhornung primärer Maus-Keratinocyten als Antwort auf MC

Primäre Maus-Keratinocyten wurden 0, 0,5, 1,4 und 48 Stunden lang mit MC inkubiert und wie folgt verarbeitet.

Verhornte Hülle-Test

Der Test mißt unlösliche Hüllen aus vernetztem Protein, wie beschrieben (Hough-Monroe et al. Analytical Biochem., 199, 25-28, 1991), mit Modifikationen wie folgt. Verhornte Hüllen wurden hergestellt, indem Monolayer in eine Lösung aus 2% Natriumdodecylsulfat (SDS), 20 mM Dithiothreit (DTT) in Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (phosphate buffered sahne; PBS) geschabt wurden. Nicht anheftende Zellen aus dem Medium wurden pelletiert und in SDS/DTT resuspendiert und mit anheftenden Zellen vereint. Die Proben wurden für 10 Minuten gekocht. Proben von verhornten Hüllen wurden unter Verwendung einer Phasenkontrast-Optik unter dem Mikroskop getestet, oder wurden mit einer RC 60-Membran (Schleicher und Schüll, Keene, NH) in einer Dot-Blot-Apparatur mit 96 Vertiefungen, an die ein Vakuum angelegt wurde, verwendet. Die Proben wurden dreimal mit SDS/DTT gewaschen und die resultierenden Protein-Flecken auf der RC 60-Membran wurden wie beschrieben fixiert und gefärbt. Die Flecken wurden ausgeschnitten und mit 1% konzentrierter NH&sub3;OH-Lösung, 66% Methanol (200 ul) über Nacht eluiert. Die Absorption des Eluats wurde in einem Titertek- Plattenleser bei 600 nm gemessen.
Die Verhornung trat bei einer Konzentration von 1 mM innerhalb von 4 Stunden der Behandlung der Zellen auf. Nach 48 Stunden waren sowohl die 1 mM- als auch die 100 uM-Dosis wirkungsvoll bezüglich der Verhornung der primären Keratinocyten (Fig. 3 A).

MTT-Cytotoxizitäts-Test

MTT ist ein Farbstoff, der durch mitochondriale Dehydrogenase-Enzyme zu einem blauen Formazan- Produkt reduziert wird. Die Fähigkeit von Zellen, MTT zu reduzieren kann verwendet werden, um die Lebensfähigkeit von Zellen zu messen (Mosmann T., J. Immunol. Methods, 65, 55-63, 1983). Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen mit oder ohne MC für die angegebenen Zeiten inkubiert, dann für weitere 4 Stunden mit 0,5 mg/ml MTT inkubiert. Das Medium wurde entfernt und 88,9% DMSO, 11, 11% Glycin-Puffer (100 mM Glycin, 100 mM NaCl, pH 10,5) wurden in jede Vertiefung zugegeben. Die Platten wurden 20 Minuten lang geschüttelt, um die Auflösung von Formazan zu erlauben, dann wurde die Absorption mit einem Plattenleser bei 570 nm gemessen.

Beispiel 3

Produktion von vernetztem Protein versus Wachstumshemmung in primären Maus-Keratinocyten

Die Zellen wurden in niedriger Dichte ausgesät und wurden 3 Tage lang mit MC behandelt. Dann wurden die Zellen gezählt und die Zunahme der Zellzahl wurde mit unbehandelten Kontrollen verglichen, oder die Zellen wurden auf vernetztes Protein untersucht (Fig. 4). Die Protein-Vernetzung erfolgte schnell, beginnend innerhalb von 4 Stunden bei einer Konzentration von 1 mM in primären Maus- Keratinocyten (Fig. 3 A) und wurde von Zelltod begleitet, was durch den MTT-Test gemessen wurde (Fig. 3 B).

Produktion von vernetztem Protein versus Wachstumshemmung in A431-Karzinomzellen des menschlichen Epidermoid

Die Zellen wurden in niedriger Dichte ausgesät und wurden 3 Tage lang mit MC behandelt. Dann wurden die Zellen gezählt und die Zunahme der Zellzahl wurde mit unbehandelten Kontrollen verglichen, oder die Zellen wurden auf vernetztes Protein untersucht (Fig. 5).
Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Konzentration von MC, die erforderlich ist, um Zellwachstum zu bewirken, niedriger ist als diejenige, die erforderlich ist, um Protein- Vernetzung zu ermöglichen. In primären Maus-Keratinocyten zum Beispiel behielten nur 20% der Zellen die Fähigkeit, bei 25 uM MC zu wachsen, während mehr als 50 uM MC erforderlich war, um Protein-Vernetzung zu produzieren. In A431-Zellen hemmten 75 uM MC Zellwachstum signifikant, wohingegen die Proteinvernetzende Wirkung bei Konzentrationen von weniger als 250 uM nicht offensichtlich war. Deshalb ist es klar, dass die Vernetzung von Proteinen bei höheren Konzentrationen auftritt, als denjenigen, die erforderlich sind, um Zellwachstum zu hemmen (Fig. 4 und 5).

Beispiel 4

Transglutaminase-Inhibitoren verhindern nicht die Protein- Vernetzung durch MC

Primäre Maus-Keratinocyten wurden entweder mit 75 uM oder 1.000 uM MC oder Staurosporin (stsp) bei einer Konzentration von 10 nM 48 Stunden lang inkubiert, mit oder ohne den/die Transglutaminase (TGase)-Inhibitoren LTB 2 und HPB 2, wobei beide in einer Konzentration von 100 uM verwendet wurden. Die Inhibitoren wurden 30 Minuten vor MC oder stsp zugegeben (Fig. 6). Vernetztes Protein wurde mit dem Test auf verhornte Hülle gemessen, der in Beispiel 2 beschrieben ist. Die Ergebnisse, die in Fig. 6 gezeigt sind, beweisen, dass die vernetzende Aktivität von MC durch Transglutaminase-Inhibitoren nicht beeinflusst wird, wie es der Fall ist für die Aktivität von Staurosporin.
MC erhöht nicht die Transglutaninase-Aktivität in primären Maus-Keratinocyten. Primäre Maus-Keratinocyten wurden in Medium mit 1,4 mM Ca²&spplus; für die angegebenen Zeiten inkubiert. MC-induzierte Vernetzung beginnt innerhalb von 4 Stunden (siehe Fig. 3). Die Zellen wurden in Cytosol (C)- und Triton- X 100 lösliche Membran (M)-Fraktionen aufgetrennt (Fig. 7). Jede Fraktion wurde auf die Proteinmenge standardisiert undauf Transglutaminase-Aktivität getestet, wobei das Verfahren von Lichti et al., J. Biol. Chem., 260, 1422-1426 (1985) verwendet wurde. Die Ergebnisse des Experiments beweisen, dass Transglutaminase durch die Behandlung von Zellen mit MC während dem Zeitraum, in welchem seine vernetzende Aktivität nachgewiesen wird (4 Stunden), im Vergleich mit unbehandelten Zellen, nicht stimuliert wird. Protein-Vernetzung wurde nicht durch Transglutaminase (TGase)-Inhibitoren gehemmt, im Gegensatz zu derjenigen, die durch den Kinase-Inhibitor Staurosporin induziert wird, welcher TGase-Aktivität erhöht (Dlugosz and Yuspa, Cancer Res., 51, 4677-4684, 1991) (Fig. 6), und die zelluläre TGase-Aktivität verzögert nicht den Beginn der Vernetzung durch MC (Fig. 7), was nahe legt, dass die endogenen vernetzenden Enzyme bei dieser Wirkung nicht beteiligt sind.

Beispiel 5

MC induziert vernetztes Protein in primären Maus- Keratinocyten bei 4ºC und 37ºC. Die Zellen wurden in Medium mit MC oder Staurosporin (stsp) bei 4ºC oder 37ºC 48 Stunden lang inkubiert, dann wurde vernetzendes Protein isoliert und mit dem Test auf verhornte Hülle gemessen, wie in Beispiel 2 beschrieben. Vernetzung durch MC fand bei 4ºC und 37ºC statt, was einen biologischen Prozess nicht nahe legt (sondern eher einen chemischen Prozess), anders als bei der Wirkung von Staurosporin, welche Temperatur-abhängig war.

Beispiel 6

Eine Reihe von Tyrosinkinase-Inhibitoren wurde auf die Fähigkeit hin getestet, in 308- und SQCC-Y1-Zellen Hüllen aus vernetztem Protein zu produzieren. Alle Inhibitoren wurden kommerziell von LC Laboratories, Woburn, Mass erhalten. Die verwendeten Konzentrationen lagen innerhalb des Bereichs zur Hemmung von Tyrosinkinasen. Die Konzentration der Tyrphostine wurde durch deren Löslichkeit in Medium bei 37ºC begrenzt. Tabelle II
Tabelle II. Tyrosinkinase-Inhibitoren induzieren keine Protein-Vernetzung.
Keiner der Tyrosinkinase-Inhibitoren zeigte die Proteinvernetzende Aktivität, die mit den erfindungsgemäßen hydroxylierten aromatischen Protein-vernetzenden Verbindungen gesehen wurde. Dieses Ergebnis zeigt, dass die erfindungsgemäßen hydroxylierten aromatischen Verbindungen nicht aufgrund ihrer Tyrosinkinase-Inhibitor-Aktivität funktionieren. In der Tat scheint es, dass es zwischen diesen beiden Aktivitäten keine Korrelation gibt.

Beispiel 7

Topische Verabreichung von MC auf die Haut von athymischen Nacktmäusen

Die akute topische Toxizität von MC wurde durch dessen Verabreichung auf die Haut athymischer Mäuse und Beobachtung hinsichtlich Entzündung, Geschwürbildung oder anderen Zeichen von Toxizität nach fünfmaliger wöchentlicher Verabreichung für 2 Wochen und durch mikroskopische Analyse Paraffineingebetteter Gewebeschnitte von Haut athymischer Mäuse nach MC-Verabreichung, beurteilt. Männliche nu/nu-Mäuse, 8 Wochen alt, wurden in 5 Behandlungsgruppen unterteilt und MC wurde in 10% DMSO in einem Aceton-Vehikel topisch verabreicht. Die Mäuse wurden mit einem Kontroll-Vehikel, 100 uM MC, 1 MC, 10 mM MC oder 100 mM MC behandelt. Die Behandlung erfolgte 5 Mal pro Woche für 2 Wochen, wonach die Tiere getötet wurden und die dorsale Haut in Carnoy's Lösung bei 4ºC 24 Stunden lang fixiert wurde, gefolgt von einer 100% Ethanolbehandlung. Von Paraffin-eingebettetem Gewebe wurden histologische Schnitte angefertigt und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Fig. 13 Veranschaulicht die Wirkung von MC auf die Haut von Nacktmäusen.
MC verursacht keine akute Entzündung oder Nekrose, wenn es topisch auf die Haut von Nacktmäusen verabreicht wird. Männliche nu/nu-Mäuse, 8 Wochen alt, wurden in Behandlungsgruppen unterteilt und MC wurde auf die dorsale Haut in 10% DMSO in einem Aceton-Vehikel (25 ul) topisch verabreicht. Die Behandlung erfolgte 5 Mal pro Woche für 2 Wochen. Während einer zweiwöchigen topischen Behandlungsperiode mit MC auf die dorsale Haut von Nacktmäusen, wurden die Tiere bezüglich Anzeichen systemischer Toxizität oder Veränderungen der Haut an der Verabreichungsstelle beobachtet. Es wurden keine Veränderungen beobachtet (Fig. 13), mit Ausnahme einer ungleichmäßigen braunen Verfärbung bei einer Konzentration von 100 mM. MC selbst ist gelbbraun, sodass man aufgrund der Arzneimittel- Absetzung und -Anreicherung bei dieser hohen Konzentration eine gewisse Verfärbung erwarten konnte. Durch Mikroskopiewurde festgestellt, daß MC bis zu einer Konzentration von 10 mM nicht akut toxisch oder entzündlich für die Haut einer normalen athymischen Maus war. Die höchste getestete Konzentration, 100 mM, verursachte etwas Vakuolenbildung bei epidermalen Zellen und fokale inflammatorische Infiltrate waren sichtbar, jedoch ohne ersichtliche Nekrose (Fig. 9).

Beispiel 8

Haut-Transplantation und in vivo-Behandlungen

Eine Haut-Transplantation wurde mit athymischen Nacktmäusen durchgeführt, wobei 0,5 · 10&sup6; SP-1-Zellen mit 8 · 10&sup6; dermalen Fibroblasten einer neugeborenen SENCAR-Maus, wie beschrieben, verwendet wurden (Strickland et al., Carcinogenesis, 14, 205, 1993). Hauben (Plastik-Abdeckungen, welche über die Stelle der Haut-Transplantation platziert wurden) wurden 1 Woche nach der Transplantation entfernt und nach einer weiteren Woche wurde mit der topischen Verabreichung von MC begonnen. Das Mittel wurde in 25 ul 90% Aceton, 10% DMSO-Vehikel verabreicht. Die Tumorgröße wurde wöchentlich bis 5 Wochen nach der Transplantation aufgezeichnet.
MC hemmt die transplantierte SP-1-Zell-Tumorbildung. Die Transplantation wurde wie vorstehend beschrieben durchgeführt. In einer Gruppe von Mäusen wurde MC zweimal wöchentlich für 2 Wochen verabreicht (gezeigt in Fig. 10 A). In einer zweiten Gruppe von Mäusen wurde MC an 5 Tagen pro Woche für 3 Wochen verabreicht (gezeigt in Fig. 10 B). Die Tumoren wurden unter Verwendung von Greifzirkeln am Ende des Experiments gemessen und die Tumoren wurden fixiert und Schnitte wurden angefertigt, um den Tumor-Phänotyp durch Mikroskopie zu bestimmen. MC hemmte das Wachstum von Tumoren, die von der neoplastischen Zelllinine SP-1 abstammten, welche auf den Rücken von Nacktmäusen transplantiert wurden, in Konzentrationen von 1 mM und 100 mM.

Beispiel 9

Synthese einiger hydroxylierter aromatischer Proteinvernetzender Reagenzien

Petroleumether hat einen Siedebereich von 35-60ºC und die Entfernung von Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfung bei reduziertem Druck durchgeführt. Die Kieselgel-Filtration wurde unter Verwendung von TLC-Grad. Kieselgel (5-25 u Aldrich) durchgeführt. Die Schmelzpunkte wurden mit einem Mel Temp II Schmelzpunkt-Apparat bestimmt und sind nicht korrigiert. Elementaranalysen wurden von Atlantic Microlab Inc., Norcross, GA erhalten und liegen innerhalb einer Abweichung von 0,4% bezüglich der theoretischen Werte, falls nicht arders angegeben. Atom-Massenspektren auf der Grundlage von schnellem Beschuss (fast atom bombardment mass spectra; FABMS) wurden mit einem VG Analytical 7070E- Massenspektrometer unter der Kontrolle eines VG 2035- Datensystems erhalten. ¹H-NMR-Daten wurden mit einem Bruker AC 250 (250 MHz)-Instrument erhalten.

Synthese von Zimtsäure-Analogen

Die Synthese von Zimtsäure-Analogen wurde durch direkte-Anwendung von Literatur-Verfahren erreicht. Zwei allgemeine Ansätze, als "Verfahren A" und "Verfahren B" wurden verwendet:

Verfahren A

Synthese von Kaffeesäure-β-phenyl-ethylester (CAPE, 67H-42-A)

Eine Lösung von 1,80 g (10,0 mmol) Kaffeesäure, 17,9 ml (150 mmol) β-Phenylethylalkohol und 100 mg p-Toluolsulfonsäure in Benzol (100 ml) wurde über Nacht bei Rückfluss mit einem Dean-Stark-Abscheider gerührt. Lösungsmittel und überschüssiger Alkohol wurden durch Destillation entfernt und der Rückstand wurde durch Kieselgel- Chromatographie (Petrolether/CHCl&sub3;) gereinigt. Das Produkt wurde kristallisiert (Ether/Petroleumether), wobei 67H-42-A in Form von schneeweißen Kristallen, 1,0 g (35%) erhalten wurde: Schmelzpunkt 128,0ºC 126-128ºC) (Grunberger, D. et. al., Experimentia, (1988) 44: 230-2)

3,4-Difluor-zimtsäure-β-phenylethylester (67 J-17-A)

Die Umsetzung von 3,4-Difluor-zimtsäure und β-Phenyl-ethylalkohol, wie im Verfahren A beschrieben, stellte 67J-17-A in Form von schneeweißen Kristallen (38% Ausbeute) bereit: Smp. 53-57ºC, ¹H-NMR (CDCl3) δ: 7,49 (d, 1H, J = 16 Hz), 7,30-7,05 (m, 8H) 6,27 (d, 1H, J = 16 Hz), 4,36 (t, 2H, J 7,0 Hz), 3,82 (s, 3H), 2,95 (t, 2H, J = 7,0 Hz); FABMS (NBA, +VE m/z 289 (M + H). Anal. (C&sub1;&sub7;H&sub1;&sub4;O&sub2;F&sub2;) C, H.

Verfahren B

Synthese von 2,5-Dihydrosy-zimtsäure-β- phenylethylester (67H-124-A)

Ein Gemisch aus 2,5-Dihydroxybenzaldehyd (138 mg 1,0 mmol), 430 mg (0,93 mmol) (Carboxymethyl)-triphenylphosphoniumchlorid, β-Phenylethylester [Smp. 162-165ºC (zers.); 148-151ºC] (Bankova, V., et al., J. Nat. Prod. (1990) 53: 821-4) und pulverförmiges wasserfreies K&sub2;CO&sub3; (586 mg, 4,24 mmol) in wasserfreiem DMF (2 ml) wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das rohe Reaktionsgemisch würde dann zwischen 0,5 normaler HCl in. Salzlösung (50 ml)/Ethylacetat (3 · 50 ml), mit 0,5 normaler HCl in Salzlösung (50 ml), Salzlösung (2 · 50 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;) und das Lösungsmittel wurde entfernt, wobei ein dunkles Sirup erhalten wurde (577 mg). Das Rohprodukt wurde durch ein Kieselgel-Kissen geschickt, wobei zuerst CHCl&sub3;, dann 5% Ethylacetat in CHCl&sub3; verwendet wurde. Die resultierenden hellgelben Kristalle wurden aus Ether Petrolether umkristallisiert, wobei reines 67H-124-A in Form von beigen Kristallen (115 mg; 43% Ausbeute) bereitgestellt wurde; Smp. 123-125ºC; 1H-NMR (CDCl&sub3;) δ: 7,86 (d, 1K, J = 16 Hz), 7,30-7-17 (m, 5H), 6,88 (d, 1H, J = 2,7 Hz), 6,70 (dd, 1H, J = 2,7 Hz & 8,6 Hz), 6,64 (d, 1H; J = 8,6 Hz), 6,44 (d, 1H, J = 16 Hz), 4,36 (t, 2H, J = 7,1 Hz), 2,96 (t, 2H, J = 7,1 Hz); ABMS (NBA, -VE) m/z 283 (M - H). Anal. (C&sub1;&sub7;H&sub1;&sub6;O&sub4;) C, H.

2,3,4-Trihydroxy-zimtsäure-β-phenylethylester (67H-80-C)

Die Umsetzung von 2,3,4-Trihydroxybenzaldehyd mit (Carboxymethyl)-triphenylphosphoniumchlorid-β-phenylethylester, wie in Verfahren B vorstehend beschrieben, stellte ein unverarbeitetes Produkt bereit, welches durch zahlreiche Durchläufe über ein Kieselgel-Kissen mit abschließender Kristallisation aus Ether. Petrolether gereinigt wurde, wobei reines 67H-80-C in Form von beigen Kristallen mit einer Ausbeute von 19% bereitgestellt wurde: Smp. 144ºC aufweichend, 147-150ºC; ¹H NMR (DMSO-d6) δ: 9,77 (s, 1H), 8,60 (s, 1H), 7,78 (d, 1H, J = 16 Hz), 7,36-7,18 (m, 5H), 6,95 (d, 1H, J = 8,5 Hz), 6,37 (d, 1H, J = 16 Hz), 6,36 (d, 1H, J = 8,5 Hz), 4,31 (t, 2H, J = 6,9 Hz), 2,95 (t, 2H, J = 6,9 Hz); FABMS (NBA, -VE m/z 299 (M - H). Anal. (C&sub1;&sub7;H&sub1;&sub6;O&sub5;·l/4H&sub2;O). C, H.

2,4,5-Trihydroxy-zimtsäure-β-phenyl-ethylester (67H-98-A)

Die Umsetzung von 3,4,5-Trihydroxybenzaldehyd mit (Carboxymethyl)-triphenylphosphoniumchlorid, β-Phenylethylester, wie vorstehend im Verfahren B beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Reaktion zwei Stunden lang bei Raumtemperatur durchgeführt wurde. Reinigung durch mehrfache Kieselgel-Chromatögräphien resultierte in einem hellgelben Schaum. Die Zerreibung mit Petrolether: Ether stellte 67H-98- A in Form eines hellgelben Feststoffs mit einer Ausbeute von 21% bereit: Smp. 146-149ºC; 1H-NMR 9,62 (s, 1K), 9,52 (s, 1HO), 8,45 (s, 1H), 7,75 (d, 1H, J = 16 Hz), 7,37-7,18 (m, 5H); 6,87 (s, 1H), 6,38 (s, 1H), 6,16 (d, 1H, J = 16 Hz), 4,30 (t, 2H, J = 6,8 Hz), 2,95 (t, 2H, J = 6,8 Hz); FABMS (NBA, - VE) m/z 299 (M - H). Anal. (C&sub1;&sub7;H&sub1;&sub6;O&sub5;·l/4H&sub2;O) C, H.

Kaffeesäure-2-(2-naphtyl)-ethylester (67H-72-B)

Die Umsetzung von Kaffeesäure und 2-(2-Naphtyl)-ethanol, wie im Verfahren A beschrieben; mit der Ausnahme, dass die Reaktionszeit auf drei Tage erhöht wurde, stellte im Anschluß an eine Chromatographie das Produkt als einen weißen Feststoff bereit. Die Zerreibung mit Ether ergab reines 67H- 72-B in Form eines schneeweißen Feststoffes in einer Gesamtausbeute von 3%: Smp. 174,5-176,5ºC; ¹H-NMR (DMSO-d6) δ: 9,61 (brs, 1H), 9,14 (brs, 1H), 7,93-7,78 (m, 5H), 7,52-7,42 (m, 3H), 7,04 (s, 1H), 6,99 (d, 1H, J = 8,1 Hz), 6,76 (d, 1H, J = 8,1 Hz), 6,24 (d, 1H, J = 15,9 Hz), 4,43 (t, 2H, J = 6,7 Hz), 3,14 (t, 2H, J = 6,7 Hz); FABMS (NBA, -VE) m/z 333 (M - H). Anal. (C&sub2;&sub1;H&sub1;&sub8;O&sub4;·l/H&sub2;O) C, H.

Kaffeesäure-2-(1-naphthyl)-ethylester (67H-148-A)

Die Umsetzung von Kaffeesäure und 2-(1-Naphthyl)-ethanol, wie im Verfahren A beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Reaktionszeit auf 6 Tage erhöht wurde, stellte das Produkt 67H-148-A in Form eines schneeweißen Feststoffs mit einer Gesamtausbeute von 21% bereit: Smp. 165-168ºC; 1H-NMR (DMSOd6) δ: 8,21 (d, 1H, J = 8,1 Hz), 7,97-7,94 (m, 1H), 7,84 (t, 1H, J = 5 Hz), 7,64-7,39 (m, 5H), 7,03 (d, 1H, J = 1,8 Hz), 6,99 (dd, 1H, J = 1,8 Hz & 8,1 Hz), 6,23 (d, 1H, J = 15,9 Hz), 4,44 (t, 2H, J = 7,0 Hz), 3, 45 (t, 2H, J = 7,0 Hz); FABMS (NBA, - VE) m/z 333 (M - H). Anal. (C&sub2;&sub1;H&sub1;&sub8;O&sub4;·l/4H&sub2;O) C, H.

3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-propionsäure-β-phenylethylester (67H-69-A)

Eine Lösung von 2 (284 mg, 1,0 mmol) in Ethanol (25 ml) wurde über 10%igem Pd-C (100 mg) unter einem Druck von 40 psi H&sub2; in einem Parr-Apparat (2,5 Stunden) hydriert. Das Reaktionsgemisch wurde durch Celite filtriert und aus Ether. Petrolether kristallisiert, wobei das Produkt 67H-69-A in Form von cremefarbigen Kristallen (175 mg, 61% Ausbeute) bereitgestellt wurde: Smp. 72,5-73,5ºC, ¹H-NMR (DMSO-d6) δ: 8,75 (s, 1H), 8,67 (s, 1H), 7,36-7,18 (m, 5H), 6,61 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 6,57 (d, 1H, J 1,9 Hz), 6,40 (dd, 1H, J = 1,9 Hz & 8,0 Hz), 4,21 (t, 2H, J = 6,9 Hz), 2,86 (t, 2H, J = 6,8 Hz), 2,64 (t, 2H, J = 6,9 Hz), 2,49 (t, 2H, J = 6,8 Hz); FABMS (NBA, -VE) m/z 285 (M - H). Anal. (C&sub2;&sub1;H&sub1;&sub8;O&sub4;) C, H.

6,7-Dihydroxy-2-naphthalinsäure-β-phenylethylester (67H- 46-A)

Eine Gesamtmenge von 346 mg (1,5 mmol) 6,7-Dimethoxy-2- naphthoylamid (Burke, T. R., et al., J. Med. Chem. (1993) 36, 425-432) in 6 N HCl (20 ml) wurde unter Rückfluss (24 Stunden) gerührt, dann abgekühlt und 6,7-Dihydroxy-2-naphthalinsäure wurde als ein violettfarbener Feststoff (260 mg) gesammelt. Eine Portion von 225 mg (1,10 mmol) wurde mit Phenylethylalkohol verestert, wie im Verfahren A beschrieben (Reaktionszeit 2 Tage). Die chromatographische Aufreinigung (CHCl&sub3; gefolgt von Ethylacetat) ergab einen Feststoff, der in CHCl&sub3; suspendiert wurde und durch Filtration gesammelt wurde, wobei 67H-46-A in Form von schneeweißen Nadeln (100 mg, 25% Gesamtausbeute) erhalten wurde: Smp. 175-176ºC; ¹H NMR (DMSP- d6) δ: 8,33 (s, 1H), 8,24 (s, 1H), 7,66 (s, 2H), 7,38-7,17 (m, 6H), 4,50 (t, 2H, J = 6,8 Hz), 3,07 (t, 2H, J = 6,8 Hz); FABMS (NBA, -VE) mz 307 (M - H), Anal. (C&sub1;&sub9;H&sub1;&sub6;O&sub4;·l/4H&sub2;O) C, H.

5,6-Dihydroxy-2-naphthalinsäure-β-phenylethylester (67H- 52-A)

Eine Gesamtmenge von 240 mg (1,0 mmol) 5,6-Dimethoxy-2- naphthalinsäure (Burke, T. R., et al., J. Med. Chem. (1993) 36, 425-432) wurde rein mit Pyridin-HCl (5,0 g) bei 180-200ºC unter Argon (40 Minuten) erhitzt. Überschüssiges Pyridin-HCl wurde unter hohem Vakuum abdestilliert und der Rückstand wurde mit 1 N HCl (20 ml) vermischt, wobei 5,6-Dihydroxy-2- naphthalinsäure als ein hellgelber Feststoff erhalten wurde, der durch Filtration gesammelt wurde (160 mg). Eine Portion von 140 mg (0,7 mmol) wurde mit β-Phenyl-ethylalkohol umgesetzt, wie für die Verbindung 67H-46-A beschrieben, und über Kieselgel-Chromatographie (CHCl&sub3;) gereinigt, wobei das Produkt 67H-52-A in Form eines weißen Feststoffs (1.200 mg, 36% Gesamtausbeute) bereitgestellt wurde: Smp. 164-166ºC; ¹HNMR (DMSO-d6) δ: 8,40 (d, 1H, J = 1,6 Hz), 8,07 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 7,80 (dd, 1H, J = 1,6 Hz & 8,8 Hz), 7,49 (d, 1H, J = 8,6 Hz), 7,38-7,33 (m, 5H), 7,25 (d, 1H, J = 8,6 Hz), 4,51 (t, 2H, J = 6,8 Hz), 3,08/t, 2H. J = 6,8 Hz); FAMS (NBA, -VE) mz 307 (M - H). Anal. (C&sub1;&sub9;H&sub1;&sub6;O&sub4;) C, H.

5,6-Dihydroxy-2-naphthalinsäure-methylester (67G-146-A)

Diese Verbindungen wurden wie zuvor beschrieben hergestellt (Burke, T. R., et al., J. Med. Chem. (1993) 36, 425-432).

6,7-Dihydroxy-isochinolin-3-carbonsäuremethylesterhydrochlorid (67F-65-A)

Diese Verbindung wurde wie zuvor beschrieben hergestellt (Burke, T. R., et al., Heterocycles (1992) 34, 757-764).

7,8-Dihydroxy-isochinolin-3-carbonsäuremethylesterhydrochlorid (67F-36-A)

Diese Verbindung wurde wie zuvor beschrieben hergestellt (Burke, T. R., et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (1992) 2, 1771-1774)

2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-1-phenylacetamidoethan (67J-28-A)

Zu einem energisch gerührten Gemisch aus Tyramin-HCl (948 mg, 5,0 mmol) in wässrigem NaHCO&sub3; (1, 68 g, 20 mmol in 25 ml H&sub2;O) und CHCl&sub3; (25 ml) wurde tropfenweise Phenylacetylchlorid (660 ul 5,0 mmol) zugegeben, dann wurde die Umsetzung bei Raumtemperatur gerührt (1 Stunde). Die organische Schicht wurde gesammelt, mit einem 25-ml-CHCl&sub3;-Extrakt der wässrigen Schicht vereint und die vereinten organischen Phasen wurden mit 1 N HCl (25 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;) und das Lösungsmittel wurde verdampft. Der resultierende Schaum wurde mit Ethylacetat vermischt, dann mit Ether verdünnt und ein weißer Feststoff (225 mg) wurde entfernt und verworfen. Das Filtrat wurde über Kieselgel-Chromatographie gereinigt, wobei zuerst 25% Ethylacetat in CHCl&sub3;, dann 100% Ethylacetat verwendet wurde. Das Produkt 67J-28-A wurde in Form eines hellgelben Sirups (362 mg, 27% Ausbeute) erhalten; ¹H-NMR (DMSO-d6) δ: 7,38-7,24 (m, 5H), 6,37 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 6,62 (d, 1H, J = 2 Hz), 6,40 (dd, 1H, J = 2 Hz & 8,0 Hz), 5,63 (brt, 1H), 3,14 (dt, 2H, J = 6,5 Hz & 13,0 Hz), 2,59 (t, 2H, J = 6,5 Hz); hoch auflösende FABMS berechnet für C&sub1;&sub6;H&sub1;&sub6;NO&sub3; (M - H); 270,1130, gefunden 270,1117, Anal. (C&sub1;&sub6;H&sub1;&sub7;O&sub3;) H, N; C theor. 69, 69, gefunden 70.11.

3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-propionsäure-β-(3,4-dihydroxyphenylethylamid (67J-32-A)

Zu einer Lösung von 348 mg (1,0 mmol) 3-(3, 4-Dihydroxyphenyl)-propionsäure-pentafluorphenylester, welcher hergestellt wurde wie in der vorstehenden Umsetzung beschrieben, wurden in wasserfreiem Dimethylformamid (2 ml) Tyramin-HCl (227 mg, 1,2 mmol) und Triethylamin (209 ug, 1,5 mmol) zugegeben und die Umsetzung wurde gerührt. Nach 2 Stunden wurde das Lösungsmittel durch Destillation unterhohem Vakuum entfernt und der Rückstand über Kieselgel- Chroitatogtraphie gereinigt, wie für die vorherige Umsetzung beschrieben, wobei das Produkt 67 J-32-A in Form eines weißen Schaumes (338 mg, quantitativer Ausbeute), erhalten wurde: 1H- NMR (DMSO-d6) δ: 8,75 (s, 1H), 8,72 (s, 1H), 7,84 (t, 1h < J = 5,6 Hz), 6,65-6,57 (m, 4H), 6,44-6,39 (m, 2H), 3,20-3,11 (m, 2H), 2,52-2,46 (m, 2H), 2,28-2,22 (m, 2H); hoch auflösende FABMS berechnet für C&sub1;&sub7;H&sub1;&sub8;NO&sub5; (M - H); 316, 1185, gefunden 316, 1146. Anal. (C&sub1;&sub7;H&sub1;&sub9;O&sub5; l/2H&sub2;O) H, N; C theor. 62, 14, gefunden 62, 57.

Beispiel 10

Basierend auf den anfänglichen Beobachtungen, dass MC Vernetzung induziert, wurde ein Reihe von 15 aromatischen Verbindungen auf ähnliche Aktivität getestet. Diese Verbindungen besaßen alle Hydroxyl-Substitutionsmuster in entweder ortho- oder para-Stellung, mit Ausnahme von 67-J17A, bei welcher die OH-Gruppen durch Fluor ersetzt wurden. Vorläufige Studien zeigten, dass einige Verbindungen in der Lage waren zu vernetzen, während andere bei den getesteten Konzentrationen schwach aktiv oder inaktiv waren. Vier der am stärksten wirksamen Verbindungen sind in Fig. 12 als "67H- 69A", "67H-98A", "67H-124A" und "67 G-146A" gezeigt. Diese Strukturen zeigen deutlich Protein-vernetzende Aktivität und sind deshalb Mitglieder der erfindungsgemäßen hydroxylierten aromatischen Protein-vernetzenden Verbindungen. Diese bestimmten hydroxylierten aromatischen Protein-vernetzenden Verbindungen sind als topische Mittel zur Behandlung von hyperproliferativen Hauterkrankungen zweckmäßig.
Die Ergebnisse, die in Fig. 11 gezeigt sind, zeigen, dass bei dem Vernetzungsprozess eine gewisse strukturelle Spezifität beteiligt ist. Die aktive Verbindung 67H-69-A zum Beispiel unterscheidet sich von dem inaktiven 67H-42-A nur durch die Abwesenheit einer Seitenketten-Doppelbindung. Darüber hinaus stellt die Addition einer einzelnen Hydroxylgruppe an inaktives 67H-42-A die aktive Verbindung 67H-98-A bereit. Ein anderes Beispiel für strukturelle Spezifität wird durch den Vergleich von aktivem 67G-146-A mit inaktivem 67F-36-A veranschaulicht, welche sich durch den Einschluss eines Stickstoffatoms in den Ring unterscheiden.

Claims

1. Verwendung von mindestens einer Verbindung der Formel:

wobei R¹, R² ein Wasserstoffatom, ein Rest der Formel

ist, wobei Z ein Alkyl-, Aryl-, Aralkyl- oder ein Alkarylrest ist;

Y ein Wasserstoffatom, ein Alkyl-, Aralkyl-, Alkaryl-, Aryl-, Heteroarylrest, ein Rest der Formel

ist, wobei Q ein Wasserstoffatom, ein Alkyl-O-Pest, ein Stickstoffatom, ein O-Alkaryl-, O-Aralkyl-, N-Alkaryl- oder N-Aralkylrest ist;

eine fakultative Doppelbindung darstellt

für die Herstellung eines Arzneimittels zur topischen Behandlung von hyperproliferativen epithelialen Zellläsionen.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die epitheliale Läsion eine Hautläsion ist.

3. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die epitheliale Läsion eine mit menschlichem Papillomavirus infizierte Gewebeläsion ist.

4. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die epitheliale Läsion eine tumoröse Läsion ist.

5. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung Methyl-2,5- dihydroxycinnamat ist.

6. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung

ist.

7. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung

ist.

6. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung

ist.

9. Verwendung nach Ansprüch 1, wobei die Verbindung

ist.