DE69608122T2 - Mikroverkapselte dna zur impfung und gentherapie - Google Patents

Mikroverkapselte dna zur impfung und gentherapie

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft mikroverkapselte DNS, Vakzine, umfassend mikroverkapselte DNS, Verfahren zur Vakzinierung oder Impfung und Verfahren zur Gentherapie, umfassend die Verabreichung von DNS in Mikroteilchen, Verfahren zur Herstellung DNS enthaltender Mikroteilchen und getrocknete Zubereitungen, umfassend DNS enthaltende Teilchen.
  • Das biologisch abbaubare Polymer Poly-(DL-lactid-co-glycolid) (PLG) ist für viele Jahre von der pharmazeutischen Industrie eingesetzt worden, um Wirkstoffe und biologische Materialien in Form von Mikroteilchen in-vivo zu verabreichen. Die Federal Drug Authority der Vereinigten Staaten (FDA) hat in jüngerer Zeit ein 30-Tage-Übermittlungssystem mit PLG-Mikrokugeln für Leuprolidacetat (Lupran Depot (eingetragenes Warenzeichen)) zur Verwendung in der Behandlung von Prostatakrebs zugelassen. Ein nützlicher Review der Möglichkeiten der Polymer-Mikroverkapselungstechnologie für Vakzinanwendungen findet sich in Vakzine, 1994, Band 12, Nr. 1, Seiten 5-11, von William Morris et al.
  • Als eine Alternative zur Verkapselung ist es ebenso bekannt, Antigene in Liposome genannten Phospholipidvesikeln zu übermitteln, wie beispielsweise von D. A. Eppstein et al. in Crit. Rev. Ther. Drug Carrier System. 1988, 5(2), Seiten 99-139, beschrieben. Es wird berichtet, dass eine Anzahl von Antigenen intraperitoneal unter Verwendung von Liposomen übermittelt worden sind, eingeschlossen das Choleratoxin, das Malaria-Sporozoid-Protein und das Tetanustoxoid, und dass das Influenzaantigen intranasal übermittelt worden ist.
  • Es ist außerdem bekannt, dass in bestimmten Umständen die Injektion von nackter DNS in Gewebe zur Expression eines von der DNS kodierten Genprodukts führen kann. Beispielsweise berichtete eine Arbeit am US-NHI 1984, dass die intrahepatische Injektion von nackter, clonierter Plasmid- DNS der Eichhörnchen-Hepatitis sowohl eine virale Infektion als auch die Bildung von antiviralen Antikörpern in den Eichhörnchen erzeugte.
  • Die WO-A-95/05853 beschreibt Verfahren, Zusammensetzungen und Vorrichtungen für die Verabreichung von nackten Polynucleotiden, die biologisch aktive Peptide kodieren. Diese veröffentlichte Anmeldung beschreibt unter anderem die Injektion von nackter DNS, die für ein immunogenes Antigen kodiert, mit dem Ziel, Antikörper im Empfänger der nackten DNS zu erzeugen.
  • Die liposomale Übermittlung von DNS ist ebenfalls bekannt und ist beispielsweise in der EP-A-0475178 beschrieben.
  • Ein alternatives Verfahren zum Erhalten der Expression eines gewünschten Genprodukts ist in der EP-A-0161640 beschrieben, in der ein bovines Wachstumshormon exprimierende Mäusezellen verkapselt und in eine Kuh implantiert werden, um in dieser die Milchproduktion zu erhöhen.
  • Die EP-A-0248531 beschreibt die Verkapselung von linearem Poly-(I:C) in Mikrokapseln und die Verwendung derselben zur Induktion der Produktion von Interferon.
  • WO-A-94/23738 soll ein DNS enthaltendes Mikroteilchen in Kombination mit einem Konjugat beschreiben, das die Aufnahme der DNS erleichtert und zellulär zielrichtet. In den Ausführungsbeispielen ist die Bombardierung von Zellen mit Wolfram enthaltenden Mikroteilchen beschrieben. Diese Beispiele scheinen sich wenig von der herkömmlichen Bombardierung von Zellen mit mit DNS beschichteten Metallteilchen zu unterscheiden. Weiterhin wird die Ultraschallbeschallung bei der Herstellung der Mikroteilchen vorgeschlagen, ein Schritt, von dem bekannt ist, dass er das Risiko der Beschädigung der DNS birgt; die vorliegenden Daten sind jedoch nicht angemessen und ungeeignet, um die Integrität der verkapselten DNS zu ermitteln.
  • In der vorliegenden Erfindung ist es erwünscht, DNS in-vivo zu übermitteln, die für Proteine mit immunogener, enzymatischer oder anders nützlicher biologischer Aktivität kodiert, üblicherweise unter der Kontrolle eines aktiven eukaryotischen Promotors. Die Aufgaben der Erfindung umfassen die Verbesserung von im Stand der Technik bekannten Impftherapien und die Verbesserung von Gentherapieverfahren des Standes der Technik.
  • Die Verbesserung von oder Alternativen zu vorhandenen Zubereitungen und Verfahren sind erwünscht, da diese vorhandenen Verfahren bekanntermaßen eine Anzahl von Nachteilen umfassen.
  • Die WO-A-95/05853 beschreibt die Verabreichung von nackten Polynucleotiden, die für die gewünschten Genprodukte kodieren. Die Zusammensetzungen und Verfahren in dieser Veröffentlichung sind jedoch nur für die Injektion geeignet, was sterile Vorgehensweisen erfordert und selbst eine unangenehme und schwierige Administrationsroute darstellt.
  • Die WO-A-94/23738 gibt vor, ein Verfahren bereitzustellen, in dem verkapselte DNS aus den Teilchen im Körper des Empfängers freigesetzt und anschließend von den Zellen aufgenommen wird, obwohl keine durchgeführten in-vivo Beispiele präsentiert werden.
  • Die Erfindung strebt danach, neue Zusammensetzungen und Verfahren der Administration derselben bereitzustellen, die vorhandene Impf- und Gentherapie-Techniken verbessern und in-vivo wirksam sind oder mindestens einige der Probleme oder Nachteile, die für die bekannten Zusammensetzungen und Verfahren identifiziert wurden, überwinden.
  • Es ist bekannt, dass DNS leicht beschädigt wird, so dass sie die Expression eines Genprodukts nicht länger induzieren kann. Überraschenderweise haben die Erfinder erfolgreich ein Verfahren oder eine Technik zum Verkapseln von DNS in Polymerteilchen entwickelt, so dass die DNS ausreichend Integrität beibehält, um die Expression eines von ihr kodierten Genprodukts zu induzieren. Die Erfinder waren außerdem erfolgreich bei der Entwicklung eines DNS enthaltenden Mikroteilchens oder Mikropartikels, geeignet für die Impfung von Säugern oder für die Gentherapie.
  • Dementsprechend stellt ein erster Aspekt der Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung dar, umfassend eine in einem Polymer verkapselte DNS, wobei die DNS eine für ein Po lypeptid kodierende Sequenz umfasst und wobei die Zusammensetzung an die Induktion der Expression der kodierenden Sequenz in einem Empfänger angepasst ist. Vorzugsweise ist die kodierende Sequenz von einem die Expression der Sequenz fördernden Promotor begleitet. Wenn die pharmazeutische Zubereitung für die Anwendung in Säugern bestimmt ist, ist es angemessen, einen eukaryotischen Promotor und insbesondere einen Promotor zu verwenden, der in einer breiten Vielzahl von Gewebetypen arbeitet. In speziellen Ausführungsformen der Erfindung wird ein gewebe- oder zelltyp-spezifischer Promotor eingesetzt.
  • Bei der Anwendung wird die pharmazeutische Zubereitung oral verabreicht und die kodierende Sequenz wird exprimiert, was zu den gewünschten therapeutischen Effekten führt.
  • Eine Zusammensetzung der Erfindung, die für die Impfung geeignet ist, enthält eine für ein Immunogen kodierende Sequenz. Nach der Verabreichung der Zusammensetzung regt das exprimierte Immunogen die Erzeugung von Antikörpern im Empfänger an und trägt dadurch zur Impfung des Empfängers bei.
  • Eine spezifische Ausführungsform der Erfindung, die in einem Beispiel unten beschrieben ist, enthält eine für ein Protein kodierende DNS-Sequenz. Sie wurde in-vivo verabreicht und es wurde gefunden, dass sie die Expression dieses Proteins in einem Säuger induziert. Die Expression wurde durch Messen der Produktion von für dieses Protein spezifischen Antikörpern detektiert. Die Zusammensetzung der spezifischen Ausführungsform umfasst Mikroteilchen oder Mikropartikel im Größenbereich von bis zu etwa 10 um.
  • Im Allgemeinen wird angestrebt, dass die Mikroteilchen der Erfindung in die Zellen des Empfängers mittels Phagocytose eindringen, beispielsweise über Phagocytose durch Makrophagen oder andere Antigen-präsentierende Zellen. Anschließend zerfällt der Körper des Mikroteilchens im intrazellulären Raum und die DNS wird freigesetzt. Es ist bevorzugt, dass die Mikroteilchen der Erfindung in dem Größenbereich von 0,01 um bis 10 um liegen, wobei 1 um bis 10 um ein stärker bevorzugter Bereich ist. Diese Größen haben sich als geeignet erwiesen, um verlässlich die in-vivo Expression der DNS zu erzielen. Es ist außerdem anzumerken, dass Mittel, die die Aufnahme von DNS fördern, in den Mikropartikeln oder Mikroteilchen der Erfindung nicht erforderlich sind, da die Mikroteilchengröße deren Aufnahme determiniert.
  • Eine alternative Zusammensetzung gemäß der Erfindung enthält eine für ein nicht immunogenes Produkt kodierende Sequenz. Eine solche Zusammensetzung ist insbesondere für die Gentherapie geeignet, bei der es erwünscht ist, ein Genprodukt in einem Empfänger zu exprimieren, das nicht exprimiert wird oder in einer Menge oder einem Maß exprimiert wird, das gesteigert werden soll. In diesem Fall umfasst eine Zusammensetzung der Erfindung eine für ein gewünschtes Produkt kodierende DNS-Sequenz und wobei nach der Administration der Zusammensetzung die Expression der kodierenden Sequenz zu einem erhöhten Level des gewünschten Produkts führt, was den Gentherapie-Effekt ergibt.
  • Es ist wiederum ein Merkmal der Erfindung, dass die Mikroteilchen für die Gentherapieanwendungen Größen im Bereich von 0,01 um bis 10 um, vorzugsweise 1 um bis 10 um, aufweisen, um deren Aufnahme über Phagocytose zielzusteuern.
  • Spezifische Ausführungsformen der Erfindung zur Anwendung bei Impfungen umfassen eine DNS-Sequenz, die für ein Protein oder eine immunogene Komponente derselben oder ein immu nogenes Fragment oder eine Variante desselben eines Virus, Bakteriums oder anderen pathogenen Mikroorganismus' kodiert. Bei dem Protein handelt es sich beispielsweise um ein HIV-Protein, ein Influenza-Virus-Protein, ein Masern- Virus-Protein, ein Hepatitis-Virus-Protein (wie das Hepatitis-Oberflächenantigen) oder ein Keuchhusten-(Pertussis)- Protein. Weiterhin kann die Zusammensetzung, wenn sie für die orale Anwendung bestimmt ist, angemessenerweise außerdem ein geschmacksverbesserndes Mittel enthalten. Der Ausdruck "geschmacksverbesserndes Mittel" soll Süßungsmittel, Geschmacksmittel und Mittel umfassen, die jeglichen unangenehmen Geschmack anderer Komponenten in der Zusammensetzung maskieren können. Sie kann angemessenerweise enterisch beschichtet sein oder mit einer geeigneten antaciden Formulierung co-verabreicht werden.
  • In einer spezifischen Ausführungsform, die unten beschrieben ist, enthält die Zubereitung der Mikroteilchen eine DNS-Sequenz, die für ein Masern-Protein kodiert. Die orale Verabreichung der Mikroteilchen löst einen Anstieg an für das Protein spezifischen Antikörpern aus. Gleichermaßen enthält eine andere Mikroteilchenzubereitung eine DNS-Sequenz, die für ein Protein eines Rotavirus kodiert. Die orale Verabreichung dieser Mikroteilchenzubereitung löst Anti-Rotavirus-Protein-Antikörper und eine Schutzwirkung gegen Angriffe dieses Virus aus.
  • Spezifische Ausführungsformen der Erfindung, die für die Gentherapie geeignet sind, umfassen eine für ein Enzym oder ein anderes Protein kodierende DNS-Sequenz, die für die Behandlung einer genetischen Erkrankung erforderlich sind. Beispielsweise ist eine für die Glucocerebrosidase kodierende DNS-Sequenz zur Behandlung der Gaucher-Erkrankung geeignet.
  • Die Erfinder haben somit DNS bereitgestellt, die so in einem Polymer verkapselt ist, dass die Fähigkeit der DNS, für ein gewünschtes Genprodukt zu kodieren, nicht wesentlich durch den Verkapslungsprozess beeinträchtigt ist. Es ist bekannt, dass DNS leicht durch Emulgieren und andere Schritte, die zur Erzeugung von Polymerteilchen notwendig sind, beschädigt werden kann. Die Erfinder haben für die Verkapselung der DNS gesorgt, so dass eine ausreichend funktionsfähige DNS verkapselt wird, damit eine biologische Wirkung bei der Verabreichung der verkapselten DNS erhalten werden kann.
  • Die Erfindung bietet die Vorteile, dass verkapselte DNS für die orale Verabreichung geeignet ist, was die unangenehmen und schwierigen Aspekte vermeidet, die mit der Notwendigkeit, DNS-Zubereitungen zu injizieren, wie im Stand der Technik beschrieben, assoziiert sind. Spezifische Ausführungsformen in den unten beschriebenen Beispielen sind erfolgreich beim Induzieren immunogen-spezifischer Antikörper in Antwort auf die orale Verabreichung einer Zusammensetzung der Erfindung gewesen. Zusätzlich ist die verkapselte DNS-Formulierung für die Trocknung, beispielsweise die Gefriertrocknung, zu einer Form geeignet, die über lange Zeitspannen stabil und für die Lagerung geeignet ist. Weiterhin wäre es für viele Impfanwendungen von Vorteil, wenn ebenso wie eine systemische humorale und zell-vermittelte Immunantwort eine Immunität an den Schleimhautoberflächen hervorgerufen werden könnte. Von unten beschriebenen spezifischen Ausführungsformen der Erfindung wurde gezeigt, dass sie nach der oralen Verabreichung einen signifikanten Anstieg in spezifischen IgA-Antikörpern auslösen. Die Erfindung stellt somit eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, umfassend DNS in einem Polymerteilchen, wobei die DNS ein Polypeptid kodiert und die Zusammensetzung an die Induktion mucosaler polypeptid-spezifischer IgA-Antikörper in einem Empfänger angepasst ist.
  • Das Polymer des Mikroteilchens der Erfindung ist vorzugsweise sowohl biologisch abbaubar als auch nicht toxisch. Geeignete Polymere schließen Lactide enthaltende Polymer und Glycolide enthaltende Polymere und Copolymere von 0-100 : 100-0 Lactid : Glycolid ein. In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung umfasst das Polymer Poly-(DL- Lactid-co-Glycolid), das ansonsten als PLG bezeichnet wird, das ausgewählt wird, da es für die Verwendung im Menschen und die Veterinärverwendung zugelassen worden ist.
  • Die Produkte der Erfindung sind typischerweise für die invivo Verwendung an Tieren, insbesondere Tieren, bestimmt. Das Polymer des Mikroteilchens sollte deshalb in-vivo nicht toxisch und für die pharmazeutische Anwendung geeignet sein. Das Polymer sollte weiterhin biologisch abbaubar sein, entweder durch Bestehen aus oder Umfassen eines biologisch abbaubaren Polymeren, so dass es seine DNS im Empfänger freisetzt. Im Stand der Technik ist umfangreiche Literatur über Polymere vorhanden, die für die oralen Human- und Tieranwendungen geeignet sind, und ein Fachmann wird in der Lage sein, die Polymere des Standes der Technik in die Mikroteilchen der vorliegenden Erfindung ohne Probleme einzupassen. In diesem Zusammenhang werden die Offenbarungen der EP-A-0451390, WO-A-95/31184 und WO-A-95/31187 durch Bezugnahme hierin aufgenommen.
  • Die in dem Teilchen enthaltene DNS wird typischerweise doppelsträngige DNS umfassen. Die Konstruktion einer für die Anwendung in der Erfindung geeigneten DNS-Sequenz ist für den Fachmann erkennbar. Es ist bevorzugt, dass die Sequenz sowohl einen Transkriptionspromotor als auch eine für ein Gen kodierende Sequenz umfasst. Es ist weiterhin bevorzugt, dass die DNS-Sequenz eine Transkriptionsterminationsstelle und eine Polyadenylierungsstelle downstream oder stromab der kodierenden Sequenz bereitstellt.
  • Es ist besonders bevorzugt, dass die DNS doppelsträngig, zirkular und supercoiled ist. Es ist beobachtet worden, dass während der Herstellung der Teilchen die DNS starken Scherkräften ausgesetzt ist. Unter besonders milden Bedingungen der Teilchenherstellung haben es die Erfinder bewerkstelligt, eine funktionale DNS zu erhalten, obwohl sie beobachtet haben, dass die zuvor supercoiled DNS im Verfahren teilweise in die offen zirkuläre Form umgewandelt werden kann.
  • Plasmid-DNS ist besonders geeignet und wird in speziellen, unten beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung eingesetzt. Da es umfänglich Literatur betreffend die Herstellung von Plasmiden gibt, wird der Fachmann leicht in der Lage sein, ein Plasmid, das für die Mikroteilchen der Erfindung geeignet ist, herzustellen. Im Allgemeinen sind Plasmide geeignet, die eine beliebige eukaryotische Promotorsequenz enthalten.
  • Ein weiteres wahlweises Merkmal der Erfindung besteht darin, dass DNS enthaltende Polymerteilchen so hergestellt werden können, dass sie verschiedene Halbwertszeiten oder Halblebensdauern in-vivo aufweisen. Wenn ein Antigen während der Impfung verabreicht wird, kann es vorteilhaft sein, dass das Antigen über einen so langen Zeitraum wie möglich übermittelt wird. Eine spezielle Ausführungsform der Erfindung stellt ein Vakzin zur Verfügung, umfassend eine erste und eine zweite Vakzin-Komponente, die erste Vakzin-Komponente umfassend eine polymer-verkapselte DNS, worin die DNS eine für ein Immunogen kodierende Sequenz umfasst und worin das Polymer eine erste Halblebensdauer invivo aufweist, und eine zweite Vakzin-Komponente, umfassend polymer-verkapselte DNS, worin die DNS eine für ein Immunogen kodierende Sequenz enthält und worin das Polymer eine zweite Halblebensdauer in-vivo aufweist. Die jeweiligen Halblebensdauern können bis zu fünf Tagen und mehr als fünf Tage betragen. In einem Beispiel sind das Immunogen der ersten und der zweiten Vakzin-Komponenten identisch. Alternativ können die jeweiligen Vakzin-Komponenten DNS-Sequenzen enthalten, die für verschiedene Immunogene kodieren.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung sind die Halblebensdauern der jeweiligen ersten und zweiten Vakzin-Komponenten bis zu zwei Tagen und mehr als zwei Wochen. In einer weiteren Ausführungsform unterscheiden sich die erste und die zweite Halblebensdauer um mindestens eine Größenordnung.
  • Bei der Anwendung einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung, die unten in einem Beispiel beschrieben ist, steht ein luciferase-kodierendes Plasmid unter der Kontrolle des human Cytomegalovirus-Unmittelbar-Frühpromotors und ist in PLG in Teilchen mit etwa 2 um Größe verkapselt. Diese verkapselte DNS wurde an Mäuse verabreicht und löste Anti-Luciferase-Antikörper aus, die über eine Zeitspanne von zahlreichen Wochen detektiert wurden. Die Erzeugung von Antikörpern in Antwort auf verkapselte DNS gemäß der Erfindung wurde mit der Antikörpererzeugung in Antwort auf die Verabreichung nackter DNS intraperitoneal und oral verglichen. In beiden Fällen löste die verkapselte DNS gleiche oder signifikant höhere Mengen an IgG und IgM aus und rief außerdem eine signifikante IgA-Response hervor.
  • Der zweite Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zum Verkapseln von DNS in einem Polymer bereit, so dass die biologische Aktivität der DNS in signifikantem Maß erhalten bleibt. In einer Ausführungsform des zweiten Aspekts umfasst ein Verfahren zum Verkapseln von DNS in einem Polymerteilchen, wobei die DNS die Expression einer kodierenden Sequenz in der DNS induzieren kann, die Herstellung einer (Wasser-in-Öl)-in-Wasser-Emulsion zur Bildung von Mikroteilchen und anschließendes Abtrennen der hergestellten, DNS enthaltenden Mikroteilchen mittels Zentrifugation. Die erhaltenen Mikroteilchen haben vorzugsweise Größen im Bereich von 0,01 um bis 10 um, stärker bevorzugt 1 um bis 10 um.
  • Das Verfahren der Erfindung wird unter Bedingungen durchgeführt, die sicherstellen, dass mindestens ein Teil der DNS während der Herstellung der Teilchen nicht beschädigt wird und dadurch seine Fähigkeit erhalten bleibt, die Expression des Gens seiner kodierenden Sequenz zu induzieren.
  • Es ist wesentlich, dass DNS in die Mikroteilchen inkorporiert wird, und die DNS-Inkorporation wird durch Herstellung einer Lösung der DNS mit einem Alkohol, Zufügen des Mikroteilchenpolymeren und Bilden der Mikroteilchen aus demselben erhöht. Der Alkoholgehalt der Lösung variiert geeigneterweise zwischen 1% und 60%, vorzugsweise zwischen 5% und 40%. In spezifischen Ausführungsformen der Erfindung liegt der Alkoholgehalt um 15 bis 35%, spezieller 20 bis 30% für Mikroteilchen aus PLG, was eine DNS-Inkorporation von 25% und darüber bis zu 50 bis 60% erzeugt. Ethanol ist besonders geeignet; Methanol und Propanol sowie andere Alkohole, die DNS nicht denaturieren, sind ebenfalls geeignet, und bei dem Alkohol handelt es sich vorzugsweise um einen geradkettigen oder verzweigten C&sub2;-C&sub1;&sub0;-Alkohol.
  • Es ist ebenso bevorzugt, dass der oder die Emulgationsschritte des Verfahrens unter Bedingungen verringerter Scherbelastung durchgeführt werden und dieses wird wahlweise durch Verwendung einer Emulgationsgeschwindigkeit erzielt, die ausreichend ist, um eine Emulsion zu erhalten und Mikroteilchen im gewünschten Größenbereich zu bilden, jedoch nicht so hoch ist, dass die gesamte DNS durch übermäßige Scherung beschädigt wird. In einer Ausführungsform der Erfindung, die unten beschrieben ist, wird die Geschwindigkeit des Mixers zum Emulgieren so modifiziert, dass mindestens 25% der DNS-Aktivität (getestet über die Transformation von kompetenten Bakterien oder die Transfektion kultivierter Zellen) in den erhaltenen Mikroteilchen, die DNS enthalten, erhalten bleibt. Geeignete Geschwindigkeiten liegen unterhalb von 8000 UpM, vorzugsweise unterhalb 6000 UpM und in einer unten beschriebenen spezifischen Ausführungsform beträgt die Geschwindigkeit etwa 3000 UpM.
  • Das Verfahren kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden, was für Labor- und industrielle Zwecke günstig ist, und kann ebenso unterhalb von Raumtemperatur durchgeführt werden, was die Stabilität der Plasmid-DNS während des Verkapselungsvorganges verbessert. Die Temperatur des Verfahrens kann auf unterhalb von 20ºC, unterhalb von 10ºC oder sogar unterhalb von 5ºC verringert werden. In einer Ausführungsform der Erfindung wird das Verfahren unterhalb von Raumtemperatur durchgeführt, unter Anwendung einer geringeren Menge an Mikroteilchen-Precursor oder Mikroteilchen-Vorläufer, verglichen zu der bei Raumtemperatur verwendeten Menge.
  • Die Parameter des Verfahrens werden somit so gewählt, dass sie die Bildung von Mikroteilchen mit einem Durchmesser von 10 um oder darunter fördern und dass sie die Inkorporation von DNS in die Mikroteilchen fördern und eine solche Beschädigung der DNS vermeiden, dass die DNS im Empfänger nicht mehr exprimiert werden kann.
  • Für jede spezielle Wahl von Polymer und DNS können Variationen im Verfahren notwendig sein, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Die Effizienz eines Verfahrens kann mittels Transformations- oder Transfektionstests überprüft werden. Im Transformationstest, der von den Erfindern verwendet wurde, wird die DNS aus den Mikroteilchen über Lösung mit einem organischen Lösungsmittel zurückgewonnen, quantifiziert und zur Transformation von Bakterien eingesetzt - Ampicillin-Selektion bestimmt erfolgreiche Transformanten. Im Transfektionstest wird die zurückgewonnene DNS verwendet, um eukaryotische Zellen in Kultur zu transfizieren, wobei die Kultur anschließend auf die Anwesenheit des Antigens oder Gentherapieprodukts getestet wird. Diese Tests haben gezeigt, dass die aus den Mikroteilchen zurückgewonnene DNS, die über das Verfahren der Erfindung hergestellt waren, 50 bis 60% und bis zu 80% der Aktivität der ursprünglichen DNS aufrechterhalten kann, was eine hohe Effizienz der Inkorporation von funktionaler DNS in die Mikroteilchen anzeigt.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung bereitgestellt, umfassend die Herstellung eines DNS- Konstrukts zur Expression einer kodierenden Sequenz in dem Konstrukt und Ausbilden eines Polymerteilchens mit einer Größe zwischen 0,01 um und 10 um um das Konstrukt herum, worin das Konstrukt fähig bleibt, die Expression der kodierenden Sequenz zu induzieren. Bei der Verwendung induziert das Konstrukt dann, wenn es von dem Teilchen getrennt wird, die Expression der kodierenden Sequenz. Das Teilchen wird vorzugsweise durch Emulgieren einer Lösung eines Polymeren mit DNS und Alkohol gebildet.
  • Das Verfahren der Erfindung ist daran angepasst, pharmazeutische Zusammensetzungen des ersten Aspekts der Erfindung herzustellen. Die Schritte des Verfahrens sind so adaptiert, dass in einer erhaltenen Zusammensetzung, die viele DNS enthaltende Polymerteilchen enthält, ein geeigneter Anteil der Teilchen aktive DNS enthält, das heißt eine DNS, die nicht durch das Verfahren so beschädigt wurde, dass ihre Fähigkeit zur Induktion der Expression ihrer kodierenden Sequenz verloren geht. Die DNS-Aktivität wird als Prozentanteil der Aktivität vor dem Schritt der Teilchenbildung gemessen.
  • Ein annehmbares Maß bzw. ein annehmbarer Level an biologischer DNS-Aktivität liegt bei mindestens 10% und vorzugsweise mindestens 25%, obwohl für ganz besonders fragile DNS ein niedrigerer Prozentsatz annehmbar sein kann, solange sich bei der Anwendung eine therapeutische Wirkung von der Zusammensetzung zeigt.
  • In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung wird eine Zusammensetzung durch Herstellen einer Lösung eines Plasmids doppelsträngiger, supercoiled DNS, umfassend eine kodierende Sequenz und einen eukaryotischen Promotor, hergestellt. Getrennt hiervon wird eine Polymerlösung hergestellt. Die zwei Lösungen werden zusammengemischt und mit einer Geschwindigkeit zwischen 1000 und 4000 UpM emulgiert. Eine Lösung eines Stabilisierungsmittels wird anschließend zugefügt und die neue Mischung mit einer Geschwindigkeit zwischen 1000 und 4000 UpM emulgiert. Nach Zentrifugation und Resuspension der Teilchen behält die DNS innerhalb 25% ihrer Aktivität bei.
  • Ein dritter Aspekt der Erfindung stellt eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, umfassend polymer-verkapselte DNS mit einem verringerten Wassergehalt wie weniger als 5 Gew.-%. Diese Zusammensetzung ist für die Langzeitlagerung geeignet, während sie die Fähigkeit der DNS, bei Verabreichung an einen Empfänger die Expression einer kodierenden Sequenz in der DNS zu induzieren, aufrecht erhält.
  • Ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung zur Lagerung besteht darin, eine pharmazeutische Zubereitung gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung zu trocknen, wie über Gefriertrocknung. Es ist bevorzugt, dass die getrocknete Zusammensetzung einen Wassergehalt von weniger als 5% aufweist, obwohl der exakte Wassergehalt durch die angewendete Trockendauer bestimmt wird.
  • Ein vierter Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zum Impfen bereit, umfassend die Verabreichung eines Vakzins gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung. Die Impfung kann damit durch Anregen bzw. Auslösen von Antikörpern gegen das von der kodierenden Sequenz des Gens exprimierte Immunogen erhalten werden. Wie ersichtlich ist, kann es sich bei dem Immunogen um eine Komponente eines Virus oder eines Bakteriums oder eines anderen pathogenen Mikroorganismus handeln oder kann dieses ein Analog des Immunogens sein, so dass die Antikörper gegen das Analogon gegen das Pathogen selbst wirksam sind.
  • In einem fünften Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Gentherapie bereitgestellt, umfassend das Identifizieren eines Genprodukts, das in einem Individuum exprimiert werden soll, das Herstellen einer Zusammensetzung gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung zur Expression des gewünschten Genprodukts und Verabreichen der Zusammensetzung. Bei dem Genprodukt, das exprimiert werden soll, handelt es sich typischerweise um ein Genprodukt, das zuvor nicht vollständig oder nicht angemessen oder auch gar nicht im Patienten exprimiert wird, der die Gentherapie erhält.
  • Die Gentherapie kann bequemerweise durch orale Verabreichung oder intranasale Verabreichung oder Injektion erzielt werden.
  • Gemäß eines sechsten Aspekts der Erfindung wird die Verwendung eines Mikroteilchens gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung in der Herstellung eines Medikaments zum Induzieren der Produktion von IgA-Antikörpern bereitgestellt.
  • Gemäß eines siebten Aspekt der Erfindung wird die Anwendung eines Mikroteilchens gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung in der Herstellung eines Medikaments zur Gentherapie bereitgestellt.
  • In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung, die unten in einem Beispiel beschrieben ist, ist das Teilchenmaterial PLG. Die Größe der Teilchen, die über das Verfahren der Erfindung hergestellt werden, liegt im Allgemeinen im Bereich von 0,01 bis 10 um, vorzugsweise 1 bis 10 um. Andere geeignete Polymerformulierungen für DNS enthaltende Teilchen gemäß der vorliegenden Erfindung schließen Polymilchsäure, Polyhydroxybutyrat, Polyhydroxyvalerat, Poly- (hydroxybutyrat/valerat), Ethylcellulose, Dextran, Polysaccharide, Polyalkylcyanoacrylate, Polymethylmethacrylat, Poly(e-caprolacton) und Mischungen all dieser Komponenten ein.
  • In Anwendung einer speziellen Ausführungsform der Erfindung, die unten in einem Beispiel beschrieben ist, umfasst eine Herstellung von Mikroteilchen gemäß der vorliegenden Erfindung für das Protein Luciferase kodierende DNS. Wie für den Fachmann ersichtlich ist, ist ein weiter Bereich von DNS-Sequenzen und -Konstrukten für die Anwendung in der Erfindung geeignet. Insbesondere kann die Erfindung durch Inkorporieren eines weiten Bereichs von im Stand der Technik wohlbekannten und charakterisierten Plasmidvektoren in die Praxis umgesetzt werden. Typischerweise wird ein in dieser Verwendung verwendeter Plasmidvektor eine cDNS umfassen, die für das gewünschte Genprodukt kodiert. Die Wahl weiterer Komponenten für die DNS-Sequenz wie Promotoren, Indikatorgene und Transkriptionsterminationssequenzen können vom Fachmann gemäß allgemeinem Wissen über die Konstruktion bekannter Plasmidvektoren getroffen werden.
  • Der bevorzugte Administrationsweg für Zubereitungen der Erfindung ist der orale Weg, was heißt, dass Zusammensetzungen der Erfindung vorzugsweise so designed werden sollten, um einen signifikanten Abbau während des Durchtritts durch den Magen mit seinen hohen Säuremengen zu vermeiden.
  • Es ist bekannt, dass die Aufnahme von Mikroteilchen mit einer Größe von weniger als 10 um unter anderem in den M-Zellen des Dünndarms auftritt und dass der Einschluss von DNS enthaltenden Teilchen in diesem Größenbereich vorteilhaft zum Fördern der Aufnahme an diesem Dünndarmort sein kann. Andere Modifikationen an der Natur und der Art und den Komponenten Polymeren können im Konzept der Erfindung vorgenommen werden.
  • Es folgt nun eine Beschreibung spezifischer Ausführungsformen der Erfindung, begleitet von Abbildungen, in denen:
  • Fig. 1 eine schematische Darstellung der Komponenten eines protein-exprimierenden Plasmids ist, geeignet für die Inkorporation in DNS enthaltenden Teilchen bzw. Partikeln gemäß der Erfindung;
  • Fig. 2 die Ergebnisse aus Beispiel 3, insbesondere die Induktion der luciferasespezifischen Serumantikörper über PLG verkapselte Plasmid-DNS veranschaulicht, in der die linke Säule den Antikörpertiter nach drei Wochen und die rechte Säule den Antikörper nach sechs Wochen anzeigt (i. m. steht für intramuskulär, i. p. steht für intraperitoneal, der untere Teil jeder Säule repräsentiert IgG-Level, der obere Teil repräsentiert IgM-Level);
  • Fig. 3 zeigt Daten der Dosisantwort für injizierte und orale Dosen verkapselter DNS mit dem Titer von IgG, IgM und IgA in jedem Fall;
  • Fig. 4 zeigt: A - Agarose-Gelelektrophorese von Plasmid- DNS nach Homogenisierung in einem Silverson-Mixer bei 2000 und 8000 UpM für 0 bis 300 Sekunden; und B - Agarose-Gelelektrophorese von DNS vor und nach der Verkapselung;
  • Fig. 5 zeigt die Antiluciferase-IgA-Antwort auf DNS in PLG-Mikroteilchen im Stuhl;
  • Fig. 6 zeigt das Ergebnis der oralen Verabreichung von PLG-verkapselter DNS, die das N-Protein des Masernvirus exprimiert; und
  • Fig. 7 zeigt die Ergebnisse der oralen Verabreichung von PLG-verkapselter DNS, die das VP6-Gen des Rotavirus exprimiert: A - fäkale, rotavirus-spezifische IgA-Antwort, B - Rotavirus-Abstoßung nach Infektion oral immunisierter Mäuse.
    • Beispiel 1
  • Verfahren zur Verkapselung von Plasmid-DNS in PLG- Mikroteilchen
    • Ausstattung:
  • 1) Silverson-Labormixer mit 3/4" Sonde, ausgestattet mit einem Emulgatorschirm.
  • 2) Hochgeschwindigkeitszentrifuge.
  • 3) Übliche Laborglasartikel, Kolben, Messzylinder, Rührer usw.
    • Reagenzien:
  • 1) Poly(Lactid-co-Glycolid)-Lösung (PLG-Lösung) - 500 mg in 3 ml Dichlormethan.
  • 2) Plasmid-DNS (12 mg/ml in Wasser).
  • 3) Polyvinylalkohol-Lösung (PVA-Lösung) (8% Gewicht/Volumen in Wasser).
  • 4) Absoluter Ethanol.
  • 5) TEN-Puffer (10 mM Tris, pH 8,0, + 1 mM EDTA + 50 mM NaCl)
    • Verfahren:
  • 1) Mische 200 ul Plasmid-DNS-Lösung mit 250 ul TEN und füge 150 ul Ethanol unter Rühren hinzu; gut mischen.
  • 2) Gib dieses Gemisch zu 3 ml PLG-Lösung hinzu und emulgiere im Silverson-Mixer bei 3000 UpM für 2 Minuten.
  • 3) Füge diese Emulsion zu 100 ml PVA hinzu und emulgiere bei 3000 UpM für 2 Minuten.
  • 4) Füge die doppelte Emulsion zu 1 l Wasser hinzu und rühre 1 Minute lang heftig.
  • 5) Verteile die Suspension der Mikroteilchen in Zentrifugenbehältern und zentrifugiere 30 Minuten lang mit 10.000 · gav.
  • 6) Resuspendiere den Mikroteilchen-Niederschlag in 25 ml Wasser und homogenisiere mit einem handgetriebenen Homogenisator mit großer Toleranz (0,5 mm) zur Herstellung einer homogenen Suspension. Verdünne mit 200 ml Wasser und zentrifugiere nochmals wie oben.
  • 7) Wiederhole Schritt 6 3-mal.
  • 8) Resuspendiere den Mikroteilchen-Niederschlag in 25 ml Wasser wie oben, überführe in ein für die Gefriertrocknung geeignetes Gefäß, rollschichtgefriere in einem Gemisch aus Isopropanol und Trockeneis und lyophilisiere für 48 Stunden.
  • In diesem Verfahren werden die Schritte 1-3 bei Raumtemperatur durchgeführt. Die DNS wurde in die Mikroteilchen mit einer Effizienz von etwa 25% inkorporiert.
    • Beispiel 2
  • Plasmide für die Expression von Proteinen nach in-vivo- Übermittlung
  • Für die Verwendung in Mikroteilchen gemäß der Erfindung geeignete Plasmide, bestehend aus den folgenden Komponenten (siehe Fig. 1):
  • 1. Plasmid-Rückgrat: Das Plasmid-Rückgrat weist einen Replikationsursprung und ein Antibiotika-Resistenzgen oder anderen selektierbaren Marker auf, um den Aufrechterhalt des Plasmids in dem bakteriellen Wirt zu gestatten. Rückgrate, die eine hohe Kopienzahl bereitstellen, erleichtern die Produktion der Plasmid-DNS. Ein Beispiel würde aus den pUC-Plasmidvektoren stammen.
  • 2. Transkriptionspromotorsequenz: Die Expression des gewünschten Proteins wird von einem typischerweise eukaryotischen Transkriptionspromotor getrieben, der die Synthese von mRNS initiiert. Im Allgemeinen sollen starke Promotoren, die in einem weiten Bereich von Gewebetypen und Tierspezies funktionieren, verwendet werden, beispielsweise der human Cytomegalovirus-Immediate-Early-Promotor (hCMV IE). Vorzugsweise kann jedoch für Gentherapieanwendungen ein gewebe- oder zelltyp-spezifischer Promotor angemessener sein.
  • 3. Kodierende Sequenz: Die kodierende Sequenz enthält die DNS-Sequenz, die für das interessierende Protein kodiert. Sie enthält das Translationsstartcodon ATG in Sequenzkontext, der für die Initiation der Proteinsynthese zu bevorzugen ist. Die zu kodierende Sequenz endet mit einem Translationsterminationscodon. Zu exprimierende Proteine umfassen a) Indikatorenzyme (beispielsweise Luciferase, 13-Galactosidase); b) Komponenten pathogener Mikroorganismen, die eine schützende Immunantwort induzieren können (beispielsweise das NS1-Protein des Tick-Borne-Encephalitisvirus, die N-, H- oder F-Proteine des Masernvirus, das gp120-Protein des HIV1-Virus); c) Enzyme oder andere Proteine, die für die Behandlung genetischer Erkrankungen (beispielsweise Glucocerebrosidase für die Behandlung des Gaucher-Syndroms) intendiert sind.
  • 4. Transkriptionsterminationsseguenz: Verbesserte Expressionslevel werden unter bestimmten Umständen erhalten, wenn die Termination der mRNS-Transkription verursachende Sequenzen downstream oder stromab der kodierenden Sequenz inkorporiert sind. Diese Sequenzen enthalten oft außerdem Signale, welche die Addition bzw. das Anfügen eines Poly-A- Schwanzes (Poly-A-Tail) an das mRNS-Transkript verursachen. Sequenzen, die in dieser Rolle eingesetzt werden können, können von dem hCMV-Major-Immediate-Early-Protein-Gen oder von der SV40-viralen DNS oder von anderen Orten abgeleitet werden.
    • Beispiel 3
  • Wir haben ein Plasmid konstruiert, welches für das Insektenprotein Luciferase kodiert, unter transkriptionaler Kontrolle des human Cytomegalovirus-Immediate-Early-Promotors (hCMV IE) und haben eine Luciferase-Aktivität in den transfizierten Zellen in-vitro gezeigt.
  • Wir haben gereinigte Plasmid-DNS in PLG-Mikroteilchen um 2 um Größe mit mäßiger (etwa 25%) Effizienz unter Verwendung des Protokolls aus Beispiel 1. Die Agarose-Gelelektrophorese zeigt an, dass ein Anteil der ursprünglich geschlossen zirkulären, supercoiled DNS sich einer Umwandlung zu einer langsamer wandernden Form unterzieht, wahrscheinlich entspannten Ringen, als Ergebnis des Scherstresses im Verkapselungsprozess. Die verkapselte DNS wurde aus den Teilchen freigesetzt und zeigte den Erhalt eines signifikanten Anteils ihrer in-vivo biologischen Aktivität in Tests der Bakterientransformation mittels Elektroporation und der Luciferaseexpression nach Transfektion in kultivierte Zellen.
  • Mikroverkapselte DNS (50 ug) wurde Mäusen mittels intraperitonealer (i. p.) Injektion und oral verabreicht. Kontroll tiere bekamen nicht verkapselte DNS über dieselben Wege und als positive Kontrolle über standard-intramuskuläre (i. m.) Injektion. Luciferase-spezifische Serumantikörper wurden über ELISA drei und sechs Wochen nach Verabreichung der DNS analysiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt.
  • Wie in Fig. 2 gezeigt, waren moderate spezifische IgG- und IgM-Antworten nach i.m.-Injektion zu sehen, was erwartet werden konnte. Verkapselte DNS rief starke IgG- und IgM- Antworten nach i.p.-Injektion hervor, während nicht verkapselte DNS wesentlich schwächere Antworten ergab. Gleichermaßen provozierte die oral verabreichte, verkapselte DNS eine gute IgG-Antwort, die von der nichtverkapselten DNS nicht erreicht wurde. Die IgG- und IgM-Antikörperantworten zeigen, dass nach der Verabreichung der in PLG-Mikroteilchen verkapselten Plasmid-DNS die Luciferase-Expression und Präsentation an das Immunsystem auftritt, mit einer Effizienz, die diejenige, die mit dem Standard-i.m.-Weg zu sehen ist, übersteigt und die diejenige übersteigt, die in der Vergleichsgabe von nicht verkapselter DNS zu sehen ist.
    • Beispiel 4
  • In weiteren Experimenten wurde die über das Verfahren des Beispiels 1 hergestellte, mikroverkapselte DNS in einem Dosisbereich (1 bis 50 ug DNS) einer Gruppe an draußen gezüchteten Mäusen über intraperitoneale (i. p.) Injektion oder oral verabreicht. Luciferase-spezifische Serumantikörper der Klassen IgG, IgM und IgA wurden über ELISA 3, 6 und 9 Wochen nach Verabreichung der DNS analysiert.
  • In Fig. 3 ist ersichtlich, dass die i.p.-Injektion von PLG- verkapselter DNS gute IgG- und IgM-Antworten und eine moderate IgA-Antwort hervorrief. Oral verabreichte verkapselte DNS rief gute Antworten in allen drei Antikörperklassen hervor. Es besteht eine Tendenz für den Anstieg der Antikörpertiter mit der Zeit nach der DNS-Verabreichung und die Antworten sind in größerem oder geringerem Umfang auch dosisabhängig. Es ist offensichtlich, dass DNS-Quantitäten bis hinab zu 1 ug in der Lage sind, signifikante Antworten zu provozieren, insbesondere nach längerer Zeit nach Verabreichung. Diese Antikörperantworten bestätigen wiederum, das die Luciferase-Expression nach Verabreichung der in PLG-Mikroteilchen verkapselten Plasmid-DNS auftritt, entweder über i.p.-Injektion oder oral. Sie belegen außerdem, dass das Antigen dem Immunsystem über diese Mittel auf eine solche Weise präsentiert wird, dass IgG-, IgM- und IgA- Klassen von Antikörpern hervorgerufen werden.
    • Beispiel 5
  • Wir haben die Auswirkung von Homogenisierungsschritten mit hoher Geschwindigkeit, die zum Erzeugen der erforderlichen Wasser-Öl-Wasser-Emulsionen angewandt werden, die Intermediate im Verkapselungsprozess darstellen, auf die physikalische Integrität und biologische Funktion der Plasmid-DNS untersucht.
  • In den anfänglichen Experimenten wurde supercoiled Plasmid- DNS auf Konzentrationen und Volumen eingestellt, die denjenigen vergleichbar sind, die in den Mikroverkapselungsexperimenten eingesetzt werden, und mit einem Silverson-Laborhomogenisator homogenisiert. Proben wurden nach Intervallen von 0 bis 300 Sekunden für die Analyse mittels Agarose-Gelelektrophorese entnommen (Fig. 4A). Ein solches analytisches Verfahren ist in der Lage, zwischen supercoiled (sc) DNS, offen zirkulärer-(oc)-DNS, worin ein einzelner Strang gebrochen ist, und linearer (1) DNS zu unterscheiden, worin beide Stränge an benachbarten Stellen geschnitten wurden (siehe beispielsweise Fig. 2C in Garner und Chrambach 1992, Auflösung zirkulärer, gebrochener und linearer DNS, 4,4 kb in Länge, mittels Elektrophorese in Polyacrylamidlösungen, Electrophoresis 13, 176-178). Es ist klar, dass die Exposition an solche Bedingungen für Zeitspannen bis hinab zu 10 Sekunden zu einer Umwandlung von der sc- zur oc-Form führt. Bei 8000 UpM tritt eine weitere Umwandlung zur linearen Form und gegebenenfalls ein noch stärker Abbau auf. Bei der verringerten Geschwindigkeit von 2000 UpM ist die oc-Form der DNS jedoch relativ stabil über die Zeitspanne, die typischerweise zur Bildung der Emulsionsintermediate erforderlich ist, die in der PLG-Verkapselung involviert sind. Diese Untersuchungen zeigen somit, dass die Plasmid-DNS gegenüber einer Scherkraft induzierten Beschädigung anfällig ist und dass den genauen Bedingungen sorgfältig Beachtung geschenkt werden muss, zum Erhalt der Verkapselung einer minimal geänderten DNS.
  • Auf dieser Basis haben wir Bedingungen für die Verkapselung von gereinigter Plasmid-DNS in PLG-Mikroteilchen um 2 um Größe mit moderater Effizienz (etwa 25%) entwickelt. Die Agarose-Gelelektrophorese (Fig. 4B) zeigt, dass die anfänglich geschlossen zirkuläre supercoiled DNS eine Umwandlung zur oc-Form durchläuft als Ergebnis der Scherbelastung im Verkapselungsprozess. Die biologische Aktivität der aus den Mikroteilchen freigesetzten DNS wurde in Tests der Bakterientransformation über Elektroporation und der Luciferase- Expression nach Transfektion in kultivierte Zellen ermittelt. Die aus den Teilchen freigesetzte DNS behält einen signifikanten Anteil (etwa 25%) ihrer in-vitro-Aktivität in diesen beiden Tests bei.
    • Beispiel 6
  • Für die Luciferase kodierende, in PLG verkapselte DNS, hergestellt über das Verfahren aus Beispiel 3, ist außerdem in der Lage, eine mucosale Immunantwort gegen das exprimierte Protein hervorzurufen. Level von für Luciferase spezifischen IgG-, IgM- und IgA-Antikörpern wurden über ELISA in Kotproben von Mäusen ermittelt, die i. p. oder oral Dosen von 1, 5, 20 oder 50 ug PLG verkapselte DNS erhielten. Keine Signifikante Level für IgG- oder IgM-Antikörper wurden in Kotproben von keiner Gruppe der Mäuse gefunden. Eher beschränkte IgA-Antworten wurden bei den i. p.-injizierten Mäusen gesehen; die orale Verabreichung führte jedoch zu signifikanten Leveln an luciferasespezifischen IgA-Antikörpern in den Kotproben (Fig. 5). Diese erreichten außergewöhnlich hohe Level in denjenigen Mäusen, die 50 ug PLG- verkapselte DNS erhielten. Diese Ergebnisse zeigen, dass die orale Verabreichung einer einzelnen Dosis von PLG-verkapselter Plasmid-DNS in der Lage ist, eine mucosale wie auch eine systemische Antikörperantwort hervorzurufen. Dies kann ein nützliches Attribut eines PLG-verkapselten DNS- Vakzins in Anwendungen sein, in denen Schutz gegen Infektionen an mucosalen oder Schleimhaut-Oberflächen erwünscht ist, wie für Masern oder AIDS.
    • Beispiel 7
  • Wir haben ein Plasmid genutzt, welches das Nucleocapsidprotein (N) des Masernvirus (MV) exprimiert, um unsere Beobachtungen zu erweitern, dass die orale Verabreichung von Luciferase exprimierender verkapselter Plasmid-DNS in der Lage ist, eine systemische Antikörperantwort auszulösen. Das N-exprimierende Konstrukt ist demjenigen identisch, welches die Luciferase exprimiert (beschrieben in Beispiel 3), mit der Ausnahme, dass die kodierende Sequenz durch die N-kodierende Sequenz des Edmonston-Stamms MV ersetzt wurde. Die gereinigte Plasmid-DNS wurde PLG-verkapselt (unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens).
  • Eingekreuzte C3H-Mäuse wurden mit zwei Dosen immunisiert, suspendiert in 0,1 M Natriumbicarbonat, verabreicht über orale künstliche Ernährung, im Abstand von 13 Tagen; jede Dosis enthielt 50 ug DNS. Kontrollgruppen von Mäusen erhielten PBS alleine oder PLG-Teilchen, enthaltend Plasmidvektor-DNS, die keine kodierende Sequenz enthielt. Die Mäuse wurden in Intervallen zur Ader gelassen und Serumlevel von IgG, spezifisch für MV N, über ELISA ermittelt, unter Verwendung eines rekombinanten MV N, exprimiert in Insektenzellen als Antigen. Wie in Fig. 6A gezeigt, führte die Immunisierung mit PLG-verkapselter DNS, exprimierend MV N, zu signifikanten Leveln an N-spezifischem Antikörper. Die gezeigten Ergebnisse sind mittlere Absorptionen in 1 : 100 verdünnten Seren, entnommen 53 Tage nach der zweiten DNS- Verabreichung. Es scheint ein beträchtliches Maß an Variabilität in der Antwort der einzelnen Mäuse gegen die DNS- Immunisierung in diesen Experimenten vorzuliegen (siehe Fig. 6B), in einigen Tieren liegen jedoch sehr hohe Antikörperlevel vor (reziproke Titer übersteigen 104, ermittelt in Nachfolgeexperimenten). Diese Ergebnisse belegen, dass die orale Übermittlung von PLG-verkapselter DNS ein effektives Verfahren zur Induktion einer Immunantwort gegen ein wichtiges Pathogen darstellt.
    • Beispiel 8
  • Ein weiteres Verfahren zur Verkapselung von Plasmid-DNS in PLG-Mikroteilchen
    • Ausstattung:
  • 1) Silverson-Labormixer mit 3/4" Sonde, ausgestattet mit einem Emulgatorschirm.
  • 2) Hochgeschwindigkeitszentrifuge.
  • 3) Normale Laborglasausstattung, Kühler, Messzylinder, Rührer usw.
    • Reagenzien:
  • 1) Poly(Lactid-co-Glycolid)-Lösung (PLG-Lösung) - 500 mg in 3 ml Dichlormethan.
  • 2) Plasmid-DNS (> 10 mg/ml in TE-Puffer).
  • 3) Polyvinylalkohol-Lösung (PVA-Lösung) (8% Gewicht/Volumen in Wasser).
  • 4) Absoluter Ethanol.
  • 5) TE-Puffer (10 mM Tris, pH 8,0, + 1 mM EDTA + 50 mM NaCl).
    • Verfahren:
  • 1) Mische 450 ul Plasmid-DNS-Lösung mit 150 ul Ethanol unter Rühren; gut mischen.
  • 2) Gib dieses Gemisch zu 3 ml PLG-Lösung hinzu und emulgiere im Silverson-Mixer bei 2000 UpM für 2 ¹/&sub2; Minuten.
  • 3) Gib diese Emulsion zu 100 ml PVA hinzu und emulgiere bei 2000 UpM für 2 ¹/&sub2; Minuten.
  • 4) Gib die doppelte Emulsion zu 1 l Wasser hinzu und rühre 1 Minute lang heftig.
  • 5) Verteile die Suspension der Mikroteilchen in Zentrifugenbehältern und zentrifugiere 30 Minuten lang mit 10.000 · gav.
  • 6) Resuspendiere den Mikroteilchen-Niederschlag in 25 ml Wasser und homogenisiere mit einem Hand-Homogenisator mit großem Spiel (0,5 mm) zur Herstellung einer homogenen Suspension. Verdünne mit 200 ml Wasser und rezentrifugiere wie oben.
  • 7) Wiederhole die Schritte 5 und 6 4-mal.
  • 8) Resuspendiere den Mikroteilchen-Niederschlag in 25 ml Wasser wie oben, überführe in ein für die Gefriertrocknung geeignetes Gefäß, rollschichtgefriere in einem Gemisch aus Isopropanol und Trockeneis und lyophilisiere für 48 Stunden.
  • In diesem Verfahren werden die Schritte 1-3 bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Effizienz wurde im Vergleich zu Beispiel 1 auf bis zu 30 bis 40% Effizienz verbessert.
    • Beispiel 9
  • Ein weiteres Verfahren zur Verkapselung von Plasmid-DNS in PLG-Mikroteilchen
    • Ausstattung:
  • 1) Silverson-Labormixer mit 3/4" Sonde, ausgestattet mit einem Emulgatorschirm.
  • 2) Hochgeschwindigkeitszentrifuge.
  • 3) Normale Laborglasausstattung, Kühler, Messzylinder, Rührer usw.
    • Reagenzien:
  • 1) Poly(Lactid-co-Glycolid)-Lösung (PLG-Lösung) - 400 mg in 3 ml Dichlormethan.
  • 2) Plasmid-DNS (> 10 mg/ml in TE-Puffer).
  • 3) Polyvinylalkohol-Lösung (PVA-Lösung) (8% Gewicht/Volumen in Wasser).
  • 4) Absoluter Ethanol.
  • 5) TE-Puffer (10 mM Tris, pH 8,0, + 1 mM EDTA).
    • Verfahren:
  • 1) Mische 450 u1 Plasmid-DNS-Lösung mit 150 ul Ethanol unter Rühren; gut mischen.
  • 2) Gib dieses Gemisch zu 3 ml PLG-Lösung hinzu und emulgiere im Silverson-Mixer bei 2000 UpM für 2 ¹/&sub2; Minuten.
  • 3) Gib diese Emulsion zu 100 ml PVA hinzu und emulgiere bei 2000 UpM für 2 ¹/&sub2; Minuten.
  • 4) Gib die doppelte Emulsion zu 1 l Wasser hinzu und rühre 1 Minute lang heftig.
  • 5) Verteile die Suspension der Mikroteilchen in Zentrifugenbehältern und zentrifugiere 30 Minuten lang mit 10.000 · gav.
  • 6) Resuspendiere den Mikroteilchen-Niederschlag in 25 ml Wasser und homogenisiere mit einem Hand-Homogenisator mit großem Spiel (0,5 mm) zur Herstellung einer homogenen Suspension. Verdünne mit 200 ml Wasser und rezentrifugiere wie oben.
  • 7) Wiederhole die Schritte 5 und 6 4-mal.
  • 8) Resuspendiere den Mikroteilchen-Niederschlag in 25 ml Wasser wie oben, überführe in ein für die Gefriertrocknung geeignetes Gefäß, rollschichtgefriere in einem Gemisch aus Isopropanol und Trockeneis und lyophilisiere für 48 Stunden.
  • In diesem Verfahren werden die Schritte 1-3 bei 4ºC durchgeführt. Die Effizienz der Inkorporation der DNS in die Mikroteilchen betrug 50 bis 60%.
    • Beispiel 10:
  • Eine Plasmid-DNS (pCMVIA/VP6), exprimierend das VP6-Gen des Mäuse-Rotavirus (epizootisches Diarrhoevirus von heranwachsenden Mäusen (epizootic diarrhoea of infant mice virus (EDIM-Virus)) wurde an der University of Massachusetts Medical Center konstruiert. Das VP6-kodierende Gen wurde in einen Vektor (pJW4303) stromab von Sequenzen des Immediate- Early-Transkriptionspromotors und des Introns A des humanen Cytomegalovirus und einer von tPA abgeleiteten Sekretionssignalsequenz invertiert. Dem Gen folgte eine Transkriptionsterminations- und eine Polyadenylierungssequenz, abgeleitet vom Wachstumshormongen des Rindes. Die gereinigte Plasmid-DNS wurde unter Anwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens PLG-verkapselt.
  • Eingekreuzte gezüchtete Balb/c-Mäuse wurden durch orale Verabreichung mit einer Dosis, enthaltend 50 ug VP6-exprimierende DNS, verkapselt in PLG-Mikroteilchen, immunisiert. Eine Kontrollgruppe der Mäuse erhielt eine vergleichbare Dosis verkapselter Vektor-DNS. Die Mäuse wurden auf intestinale rotavirus-spezifische IgA in Intervallen von 14 Tagen mittels ELISA unter Verwendung des EDIM-Virus als Antigen untersucht. Neun Wochen nach der Immunisierung wurden die Tiere mit dem EDIM-Virus herausgefordert bzw. infiziert und auf die Exkretion des Virus im Kot unter Verwendung eines ELISA auf Basis eines monoklonalen Antikörpers überwacht.
  • Wie in Fig. 7A gezeigt, führte die Immunisierung mit PLG- verkapselter DNS, exprimierend VP6, im Vergleich zu den Kontrolltieren zu signifikanten Leveln des rotavirus-spezifischen intestinalen IgA-Antikörpers. Dies ist besonders bemerkenswert, da andere Routen der Verabreichung der VP6- exprimierenden Plasmid-DNS keinen nachweisbaren Level von intestinalen virusspezifischen IgA vor der Infektion mit dem Virus auslösen. Nach dem Infizieren mit dem EDIM-Virus verringerte sich die Rotavirus-Abgabe in den Mäusen, die die PLG verkapselte VP6-exprimierende Plasmid-DNS erhalten hatten, verglichen mit der Kontrollgruppe (Fig. 7B).
  • Diese Ergebnisse belegen, dass oral verabreichte PLG-verkapselte Plasmid-DNS in der Lage ist, (a) eine spezifische intestinale IgA-Antwort und (b) einen Schutz gegen Virusangriffe zu induzieren, wie über die Verringerung der Virusausscheidung belegt.
  • Die Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung finden Anwendung in langsam freisetzenden Systemen für die Übermittlung von DNS-Vakzinen; die verlängerte Expression des Immunogens führt möglicherweise zu einer effizienten Initialreaktion und Auffrischung mit einer einzelnen Dosis mit anschließender effizienter Induktion der Langzeitgedächtnisantwort. Eine andere Anwendung besteht in einem Träger für die orale Übermittlung von Vakzinen; einfache und annehmbare Mittel für die Vakzin-Verabreichung verbessern wahrscheinlich die Vakzin-Aufnahmeraten; zusätzlich ist die gefriergetrocknete, verkapselte Plasmid-DNS sehr wahrscheinlich sehr stabil und unempfindlich gegenüber Umweltbedingungen. Eine weitere Anwendung besteht in einem langsam freisetzenden System für die Gentherapie; die verlängerte Freisetzung der DNS und die anschließende Expression verringert potenziell den Bedarf an wiederholten Behandlungen.

Claims (45)

1. Zusammensetzung, umfassend ein Mikroteilchen und DNS, worin die DNS sich in wässriger Lösung befindet, innerhalb des Mikroteilchens ist und eine Sequenz umfasst, die für ein Polypeptid codiert, wobei die DNS eine aktive DNS in dem Sinne ist, dass sie ihre Fähigkeit zum Induzieren der Expression der codierten Sequenz nach Verabreichung an einen Empfänger aufrecht erhält, und wobei das Mikroteilchen einen Durchmesser von 10 um oder darunter aufweist.
2. Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, umfassend eine zirkuläre DNS.
3. Zusammensetzung gemäss Anspruch 2, umfassend doppelsträngige DNS, ausgewählt unter (i) Plasmid-DNS und (ii) DNS, die aus Plasmid-DNS über eines oder mehrere unter Insertion, Deletion und Substitution abgeleitet ist.
4. Zusammensetzung gemäss einem der vorstehenden Ansprüche, worin die DNS eine Sequenz umfasst, die die Transkription der codierenden Sequenz fördert.
5. Zusammensetzung gemäss einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Mikroteilchen nicht toxisch und pharmazeutisch annehmbar ist und ein biologisch abbaubares Polymer umfasst oder aus diesem besteht.
6. Zusammensetzung gemäss Anspruch 5, worin das Polymer ein Lactid enthaltendes Polymer ist.
7. Zusammensetzung gemäss Anspruch 5 oder 6, worin das Polymer ein Glykolid enthaltendes Polymer ist.
8. Zusammensetzung gemäss Anspruch 6 oder 7, worin das Polymer Poly-(DL- Lactid-Co-Glykolid) umfasst.
9. Zusammensetzung, umfassend Mikroteilchen gemäss einem der Ansprüche 1 bis 8, worin mindestens 50% der Mikroteilchen im Grössenbereich von 1 um bis 10 um liegen.
10. Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 9, umfassend eine DNS- Sequenz, die für ein Immunogen codiert und an die Induktion der Expression dieses Immunogens in einem Empfänger nach oraler oder parenteraler Verabreichung angepasst ist.
11. Zusammensetzung gemäss Anspruch 10, die an die Induktion der Produktion eines für das Immunogen spezifischen Antikörpers im Empfänger angepasst ist.
12. Zusammensetzung gemäss Anspruch 11, angepasst an die Induktion IgA- Antikörper-Produktion.
13. Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 10 bis 12, die an das Impfen eines Säugers angepasst ist, wobei die Impfung durch Produktion von Antikörpern durch den Säuger als Antwort auf das Immunogen erhalten wird, welches selbst durch Expression der codierenden Sequenz der DNS erzeugt wird.
14. Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 13, erhältlich durch
a) Herstellung einer Mischung der DNS und einer Wasser-in-Öl-in-Wasser- Emulsion, die zur Bildung vvn Mikroteilchen geeignet ist, worin die sich die DNS in der ersten Wasserphase befindet,
b) Bildung von Mikroteilchen, die DNS enthalten, und
c) Abtrennen der DNS enthaltenden Mikroteilchen aus der Mischung mittels Zentrifugation.
15. Zusammensetzung gemäss Anspruch 14, erhältlich gemäss dem Verfahren der Schritte (a)-(c), wobei sich die DNS in einer 1 bis 60%-igen Alkohollösung befindet.
16. Zusammensetzung gemäss Anspruch 14, erhältlich gemäss dem Verfahren der Schritte (a)-(c), wobei sich die DNS in einer 20 bis 30%-igen Ethanollösung befindet.
17. Vakzin zum Hervorrufen von Antikörpern gegen ein Immunogen, umfassend eine Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 16 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, worin die DNS-Sequenz für das Immunogen codiert.
18. Vakzin gemäss Anspruch 17, worin das Immunogen eine immunogene Komponente eines Virus oder eines Bakteriums oder eines anderen pathogenen Mikroorganismus' ist oder ein immunogenes Fragment oder Variante derselben darstellt.
19. Vakzin gemäss Anspruch 18, worin die DNS-Sequenz für ein virales Protein codien.
20. Vakzin gemäss einem der Ansprüche 17 bis 19, welches weiterhin ein geschmack- verbesserndes Mittel enthält.
21. Vakzin gemäss einem der Ansprüche 17 bis 20, umfassend erste und zweite Vakzin-Komponenten, wobei die erste Vakzin-Komponente eine DNS innerhalb eines Mikroteilchens, wobei die DNS eine für ein Immunogen codierende Sequenz enthält und das Mikroteilchen eine erste in-vivo-Halblebensdauer aufweist, und eine zweite Vakzin-Komponente eine DNS innerhalb eines Mikroteilchens umfasst, wobei die DNS eine für ein Immunogen codierende Sequenz enthält und das Mikroteilchen eine zweite in-vivo-Halblebensdauer aufweist.
22. Vakzin gemäss Anspruch 21, worin das Immunogen der ersten Vakzin- Komponente und das Immunogen der zweiten Vakzin-Komponente gleich sind.
23. Vakzin gemäss Anspruch 21 oder 22, worin die erste bzw. zweite Halblebensdauer bis zu zwei Wochen bzw. mehr als zwei Wochen betragen.
24. Vakzin gemäss Ansprüchen 21 oder 22, worin das Verhältnis der ersten zur zweiten Halblebensdauer mindestens 2 : 1 beträgt.
25. Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 12, die an die Induktion der Expression eines gewünschten, nicht immunogenen Genprodukts in einem Empfänger angepasst ist.
26. Zusammensetzung gemäss Anspruch 25 zum Induzieren der Expression eines gewünschten, nicht immunogenen Produktes, welches Produkt (i) zuvor im wesentlichen nicht expremiert wird oder (ii) zuvor in einem Umfang exprimiert wird, der gesteigert werden soll.
27. Zusammensetzung gemäss Anspruch 25 oder 26 zur Behandlung oder Vorbeugung einer Erkrankung, die durch Nicht-Expression oder verringerte Expression oder Abwesenheit eines Genprodukts verursacht wird, worin die codierende Sequenz der DNS der Zusammensetzung für das Genprodukt codiert.
28. Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 25 bis 27 für die Gentherapie.
29. Zusammensetzung, die eine Polymer verkapselte DNS umfasst und einen Wassergehalt von weniger als 5% aufweist, erhalten durch Gefriertrocknen einer Zusammensetzung oder eines Vakzins gemäss einem der Ansprüche 1 bis 28.
30. Zusammensetzung, umfassend ein Mikroteilchen und DNS, worin die DNS sich in wässriger Lösung befindet, innerhalb des Mikroteilchen ist und eine für ein Po lypeptid codierende Sequenz aufweist, wobei das Mikroteilchen einen Durchmesser von 10 um oder darunter aufweist und an die Induktion der Expression der codierenden Sequenz nach oraler Verabreichung an einen Empfänger angepasst ist und worin die biologische Aktivität der aus den Mikroteilchen freigesetzten DNS mindestens 25% ihrer Aktivität vor der Inkorporation in die Mikroteilchen beträgt, gemessen über einen Test der Bakterientransformation mittels Elektroporation.
31. Verfahren zur Herstellung eines Mikroteilchens, umfassend die Schritte:
i. Herstellung einer Mischung von DNS und Alkohol und Zusetzen eines Mikroteilchen-Vorläufers zu der Mischung;
ii. Bilden eines Mikroteilchens mit einem Durchmesser von 10 um oder weniger, welches DNS enthält; und
iii. Abtrennen der DNS enthaltenden Mikroteilchen aus der Mischung, wobei die DNS in dem DNS enthaltenden Mikroteilchen eine für ein Polypeptid codierende Sequenz umfasst und wobei das Mikroteilchen an die Induktion der Expression der codierenden Sequenz in einem Empfänger angepasst ist.
32. Verfahren gemäss Anspruch 31, umfassend das Bilden von Mikroteilchen unter Bedingungen von verringerter Scherbelastung, sodass die DNS in den Mikroteilchen mindestens 10% ihrer Fähigkeit zum Induzieren der Expression ihrer codierenden Sequenz aufrecht erhält, gemessen über Tests der Bakterientransformation mittels Elektroporation.
33. Verfahren gemäss Anspruch 32, worin die DNS mindestens 25% ihrer Fähigkeit zur Induktion der Expression der codierenden Sequenz aufrecht erhält.
34. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 31 bis 33, umfassend die Herstellung einer Lösung von DNS und Alkohol mit einem Alkoholgehalt von 10 bis 40%.
35. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 31 bis 34, umfassend die Bildung von Mikroteilchen im Grössenbereich von 0,01 um bis 10 um.
36. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 31 bis 35, worin die DNS zirkuläre Plasmid-DNS ist.
37. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 31 bis 36, welches zusätzlich das Gefriertrocknen des Mikroteilchens umfasst.
38. Verfahren zur Verkapselung von DNS in einem Mikroteilchen, worin die DNS eine für ein Polypeptid codierende Sequenz umfasst und an die Induktion der Expression der codierenden Sequenz angepasst ist, umfassend die Schritte des Herstellens einer Mischung der DNS und einer Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsion, die für die Bildung von Mikroteilchen geeignet ist, das Bilden von Mikroteilchen von 10 um oder geringerem Durchmesser, die DNS enthalten, und Abtrennen der DNS enthaltenden Mikroteilchen aus der Mischung mittels Zentrifugation, dadurch gekennzeichnet, dass die DNS ihre Fähigkeit zur Induktion der Expression ihrer codierenden Sequenz aufrecht erhält.
39. Verfahren gemäss Anspruch 38, umfassend die Herstellung einer Lösung von DNS und Alkohol.
40. Verfahren gemäss Anspruch 38 oder 39, umfassend die Bildung von Mikroteilchen unter Bedingungen verringerter Scherbelastung, sodass die DNS in den Mikroteilchen mindestens 10% ihrer Fähigkeit zur Induktion der Expression ihrer codierenden Sequenz aufrecht erhält, gemessen über Tests der Bakterientransformation mittels Elektroporation.
41. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 31 bis 40, umfassend die Durchführung des Verfahrens bei 10ºC oder darunter.
42. Verwendung einer Zubereitung gemäss einem der Ansprüche 26 bis 28 bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Gentherapie.
43. Verwendung einer Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 16 bei der Herstellung eines Medikaments zur Induktion der Schleimhautimmunität.
44. Verwendung einer Zubereitung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 16 bei der Herstellung eines Medikaments zur Induktion der IgA-Antikörper-Produktion.
45. Verwendung einer Zubereitung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 16 bei der Herstellung eines Medikaments zur Induktion prophylaktischer oder therapeutischer Immunantworten.
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