DE69606696T2

DE69606696T2 - Selektives verfahren zur deacylierung von acylverbindungen

Info

Publication number: DE69606696T2
Application number: DE69606696T
Authority: DE
Inventors: Mattheus De Pater; Mieke Sibeyn
Original assignee: DSM NV
Current assignee: Teva Pharmaceuticals International GmbH
Priority date: 1995-08-03
Filing date: 1996-08-05
Publication date: 2000-08-17
Anticipated expiration: 2016-08-06
Also published as: JPH11501218A; CA2201729A1; DK0784605T3; HUP9702444A1; MX9702403A; DE69606696D1; ATE189804T1; HU221636B1; WO1997006128A1; EP0784605A1; AU6820096A; CN1078583C; SI0784605T1; HUP9702444A3; ES2145479T3; CA2201729C; PT784605E; CN1164851A; EP0784605B1; GR3033402T3

Description

Gebiet und Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt eine Verbesserung zur Gewinnung von Lovastatin, Compactin und Pravastatin aus Fermentationsbrühen zur Verfügung.
Lovastatin wird beispielsweise als sekundärer Metabolit von verschiedenen Mikroorganismen, wie Aspergillus terreus (US 4231938) oder Monascus ruber (US 4323648) gebildet. Während der Fermentation werden auch mit Lovastatin verwandte Nebenprodukte, wie 4-Acetyllovastatin, produziert.
Lowastatin, das normalerweise in der Säureform vorliegt, kann auf verschiedene Weise aus der Fermentationsbrühe isoliert werden. Die erste Stufe besteht in der Reinigung von erhaltenen Rohkristallen. Diese Rohkristalle enthalten noch verwandte Verbindungen, wie 4-Acetyllovastatin. Da Lovastatin eine pharmazeutische Verbindung ist, die hohe Reinheitsanforderungen erfüllen muß, ist eine weitere Reinigung nötig, um die mit Lovastatin verwandten Verunreinigungen zu entfernen. Die mit Lovastatin verwandten Verunreinigungen werden im Allgemeinen durch mehrfache Rekristallisationen, durch Säurenchromatographie, wie sie in dem US-Patent 4231938 beschrieben ist, oder durch preparative HPLC (WO 92/16276), beseitigt, wodurch sich die Ausbeute deutlich erhöht.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden Verunreinigungen, die in dem Brühenfiltrat vorliegen, entfernt. Somit entfällt die Notwendigkeit, sie durch zusätzliche Rekristallisationen zu beseitigen, und es ergibt sich eine erhöhte Ausbeute.
Während der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf ein Brühenfiltrat eines Mikroorganismus, der Statine bildet, z. B. Aspergillus terreus, wird überraschenderweise 4-Acetyllovastatin selektiv in Lovastatin umgewandelt anstelle einer Umwandlung in Dehydrolovastatin über eine Dehydrierung, die bei reinem 4-Acetyllovastatin eintritt (siehe Fig. 1). Eine andere überraschende Tatsache besteht darin, daß die 2- Methylbutanoatgruppe während der Anwendung der Erfindung nicht entfernt wird.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wurde im Stand der Technik weder beschrieben noch durch diesen nahegelegt.

Kurze Beschreibung der Figuren

1. Reaktionsschema der Deacylierung von 4-Acetyllovastatinsäure zu Lovastatinsäure (a) sowie der Dehydrierung von 4- Acetyllovastatinsäure zu Dehydrolovastatinsäure (b);
2. Dünnschichtchromatogramm (TLC), das nach der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Verminderung der Verunreinigungen in rohen Lovastatinkristallen zeigt. Eluiermittel: Chloroform/Methanol = 9/1; Nachweis: Iodfärbung; Durchgelaufenes Produkt: 2 ul einer Lösung, bestehend aus rohen Lovastatinkristallen in Toluol, mit einer Konzentration von 50 g/l.
Rechte Seite: Roher Kristall aus unbehandeltem Brühenfiltrat; linke Seite: Roher Kristall aus dem Brühenfiltrat, das zwei Stunden bei 50ºC und einem pH-Wert von 12,5 gerührt worden ist.

Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Verbesseren der Gewinnung von Lovastatin, Pravastatin oder Compactin aus einem Brühenfiltrat. Dieses Verfahren umfaßt folgende Schritte
Züchten von Mikroorganismen in einem Medium, die ein Glied aus der Gruppe Lovastatin, Compactin oder Pravastatin produzieren, wobei ein Produktmedium erhalten wird,
- Entfernen der Biomasse aus dem Produktmedium, um ein geklärtes Brühenfiltrat zu erhalten, und
- Isolieren des gereinigten Lovastatins, Compactins oder Pravastatins,
und ist gekennzeichnet durch das Einstellen des pH-Werts des geklärten Brühenfiltrats auf einen pH-Wert von über etwa pH 10. Vorzugsweise umfaßt das Verfahren auch das Erhitzen des geklärten Brühenfiltrats über etwa 50ºC.
Das erfindungsgemäße Verfahren bietet eine einfache und selektive Methode der Deacylierung von 4-acylierten Statirien in Brühenfiltraten, woraus sich eine verbesserte Ausbeute und Reinheit der Kristalle ergibt. Während der Behandlung bei einem höheren pH-Wert wird das 4-acylierte Statin in das zugehörige Statin umgewandelt. Die Umwandlungsgeschwindigkeit von beispielsweise von 4-Acetyllovastatin in Lovastatin in dem Brühenfiltrat hängt von dem pH-Wert und der Reaktionstemperatur ab. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Behandlung bei pH- Werten über pH 10, insbesondere bei einem pH-Wert zwischen 10 und 13, ganz besonders bevorzugt zwischen einem pH-Wert von 11 und 12,5. Auch sind Temperaturen zwischen 60 und 95ºC bevorzugt. Durch Anwenden höherer pH-Werte und/oder höherer Temperaturen sinkt die Reaktionszeit für eine vollständige Deacylierung.
Das Verfahren des Erhöhens des pH-Werts kann mit Vorteil auf Filtrate von Fermentationsbrühen irgendwelcher Mikroorganismen angewandt werden, die in der Lage sind, einen der Stoffe Lovastatin, Pravastatin oder Compactin zu produzieren. Mikroorganismen, die in der Lage sind, Statine zu bilden, können Mikroorganismen der folgenden Spezies sein:
Penicillium, Hypomyces, Paecilomyces, Eupenicillium, Trichoderma, Aspergillus, Monascus, Phoma, Doratomyces, Gymnoascus oder Pleurotus.
Um Statine zu produzieren, wird die Fermentation dieser Mikroorganismen in einem wäßrigen Medium durchgeführt, das jenen ähnlich sind, welche für die Herstellung anderer Fermentationsprodukte eingesetzt werden. Solche Medien enthalten Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze, welche durch die Mikroorganismen assimilierbar sind.
Im Allgemeinen können Kohlenhydrate, wie Zucker, z. B. Glucose, Maltose, Rohrzucker, Xylose, Mannit usw., sowie Stärken, wie Getreide, z. B. Hafer, Roggen, Maisstärke, Maismehl usw., entweder allein in Kombination als Quellen für asi-milierbaren Kohlenstoff in dem Nährmedium verwendet werden. Diese Kohlenstoffquellen können einzeln oder es können mehrere solcher Kohlenstoffquellen als Kombination in dem Medium eingesetzt werden.
Im Allgemeinen können proteinhaltige Stoffe als Stickstoffquellen in dem Fermentationsverfahren verwendet werden. Geeignete Stickstoffquellen sind beispielsweise Hefehydrolysate, Primärhefe, Hefeextrakte, Sojabohnenmehl, Baumwoll- samenmehl, Hydrolysate von Casein, Maisquellwasser, lösliche Destillationsstoffe oder Tomatenpaste und ähnliches. Die Stickstoffquellen können entweder allein oder in Kombination eingesetzt werden.
Unter den als Nährstoffe dienenden anorganischen Salze, welche in die Kulturmedien eingebracht werden können, sind die üblichen Salze, die in der Lage sind, Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid- und Carbonationen sowie ähnliche Ionen zu liefern. Dazu zählen auch Spurenmetalle, wie Cobalt, Mangan, Eisen und Magnesium.
Es ist zu bemerken, daß die in den Beispielen beschriebenen Medien nur zur Illustration der großen Vielfalt von Medien dienen, die eingesetzt werden können, und keine Beschränkung darstellen sollen. Insbesondere zählten zu den in den Kulturmedien zur Herstellung von Lovastatin eingesetzten Kohlenstoffquellen Dextrose, Dextrin, Glucose, Rohrzucker, Hafermehl, Haferflocken, Molassen, Citrat, Acetat, Sojabohnenöl, Glycerin, Malzextrakt, Kabeljauleberöl, Stärke, Ethanol, Feigen, Ascorbat und Lardöl. Zu den Stickstoffquellen zählen peptonisierte Milch, autolysierte Hefe, Hefeextrakt, Hefe- RNA, Tomatenpaste, Casein, Primärhefe, Erdnußmehl, lösliche Destillationsstoffe, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl, Maismehl, NZ-Amin, Rindfleischextrakt, Asparagin, Baumwollkuchenmehl, Ammoniak und Ammoniumsulfat. Die hauptsächlichen ionischen Komponenten, CaCO&sub3;, KH&sub2;PO&sub4;, MgSO&sub4;.7H&sub2;O und NaCl können ebenso wie kleine Mengen von CoCl&sub2;.6H&sub2;O und Spuren von Fe, Mn, Mo, B und Cu zugegeben werden. Die Nährstoffe können entweder in das Batchmedium eindosiert oder (teilweise) während der Fermentation zugegeben werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird direkt auf die Brühe nach dem Entfernen der Biomasse vor weiteren Reinigungsschritten angewandt: Beispielsweise kann für eine solche Reaktion eine wäßrige Lösung eines Erdalkalimetallhydroxids oder Ammoniumhydroxid bequem eingesetzt werden. Das Brühenfiltrat wird bei einem hohen pH-Wert und vorzugsweise bei hohen Temperaturen behandelt. Ferner werden während dieser Behandlung bei einem hohen pH-Wert vorhandene Proteine in dem Filtrat der Fermentationsbrühe denaturiert, was in den nachfolgenden Reaktionsstufen ihr Entfernen aus dem Produkt erleichtert. Weitere Reinigungsschritte können eine Extraktion, eine Adsorption an einem hydrophoben Harz, einen Ionenaustäusch, eine Säulenchromatographie usw. umfassen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung und werden zur Illustration und nicht im Sinne einer Beschränkung angegeben. Die Versuche II bis IV werden in einer Stickstoffatmosphäre durchgeführt.

BEISPIELE

BEISPIEL I: HERSTELLUNG VON LOVASTATIN DURCH FERMENTATION VON ASPERGILLUS TERREUS, STAMM AD43

Aspergillus terreus, Stamm AD43, DS-Nummer 28373, wurde bei Centraal Bureau voor Schimmelcultures (CBS, Delft, Niederlande) hinterlegt und erhielt die CBS-Zugangsnummer CBS 456.95.
Ein 1-ml-Röhrchen mit einer Sporensuspension von Aspergillus terreus, Stamm AD43, die bei -50ºC in Glycerin gelagert worden war, wurde aseptisch geöffnet. Der Inhalt wurde in einem 2-Liter-Schüttelkolben suspendiert, der 500 ml des folgenden Mediums (erhitzt in einem Autoklaven während 20 Minuten bei 121ºC) enthielt:
Bestandteil Menge pro kg
Glucose.1H&sub2;O 10 g
Haferflocken 10 g
Tomatenpaste 40 g
Eingeweichte Maisfeststoffe 5 g
Spurenelemente 1 g
Zusammensetzung der Spurenelementlösung (pro 100 ml destilliertes Wasser): FeSO&sub4;.7H&sub2;O, 1 g; MnSO&sub4;.1H&sub2;O, 1 g; CuCl&sub2;.2H&sub2;O, 0,025 g; CaCl&sub2;.2H&sub2;O, 0,1 g; H&sub3;PO&sub4;, 0,056 g; (NH&sub4;)&sub6;Mo7O&sub2;&sub4;.4H&sub2;O, 0,019 g; ZnSO&sub4;.7H&sub2;O, 0,2 g.
Der Schüttelkolben wurde 24 Stunden bei 28ºC in einem Rotationsschüttler bei 280 UpM (Ausschlag 3,5 cm) inkubiert. 20 ml der Schüttelkvlbenbrühe (verdünnt in 100 ml Salzlösung) wurden dann in einen Fermenter mit 10 kg Brühengewicht inokuliert. Die Zusammensetzung der Fermentationsbrühe war wie folgt:
Bestandteil Menge pro kg
Glucose.1H&sub2;O 20 g
Hefeextraktpaste 33 g
Polypropylenglycol 2000 2,5 ml
Glucose und die Hefeextrakt-Polypropylenglycol-Lösung wurden getrennt sterilisiert (20 Minuten bei 121ºC).
Die Fermentationsbedingungen waren wie folgt:
Der pH-Wert wurde unter Einsatz von H&sub2;SO&sub4; und NaOH konstant bei 6,5 gehalten.
Die Temperatur betrug 28ºC.
Die Luftzufuhr lag bei 1 vvm.
Sobald die gesamte Glucose verbraucht war, wurde mit einer Glucose-Hefeextrakt-Zufuhr mit einer Geschwindigkeit von 1,2 g Glucose pro kg Brühe pro Stunde begonnen. Die Zusammensetzung der Beschickung war:
Bestandteil Menge pro kg
Glucose.1H&sub2;O 500 g
Hefeextraktpaste 17 g
Polypropylenglucol 2000 14 ml
Nach 192 Stunden der Fermentation wurde der pH-Wert der Brühe mit NaOH auf 10 erhöht, und die Brühe wurde mit 4 l Wasser verdünnt.
Diese Fermentation ergab 385 mg Lovastatinsäure pro Liter Fermentationsbrühe vor dem Verdünnen. Nach dem Verdünnen wurde ein Lovastatinsäuregehalt von 411 mg/l gemessen.

BEISPIEL II: WIRKUNG EINER WÄRMEBEHANDLUNG DES BRÜHENFILTRATS AUF DIE REINHEIT DER LOVASTATINKRISTALLE

1000 ml Brühenfiltrat des Stamms AD43 (Lovastatinsäurekonzentration 0,4 g/l, hergestellt nach Beispiel I) wurden mit 2 n NaOH bei 25ºC auf einem pH-Wert von 12,5 gebracht und nachfolgend zwei Stunden auf 50ºC erwärmt. Nach zwei Stunden war die Reaktion vollständig, und das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt. Dann wurde der pH-Wert unter Einsatz von Schwefelsäure auf 4 gesenkt, und es wurden 3000 ml Toluol zugefügt und es wurde während 30 Minuten gemischt.
Die Toluolschicht wurde von der Wasserschicht abgetrennt und dann durch Verdampfen bei 40ºC unter Vakuum auf 80 ml konzentriert.
Die Lovastatinsäure in dem Extrakt wurde durch dreistündiges Erhitzen auf 90ºC in das Lacton überführt (die Ausbeute der Umwandlung betrug 99,2%). Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Toluol mit 80 ml Wasser gemischt, während der pH-Wert mit NaOH auf 10 eingestellt wurde. Nach dem Trennen der Schichten wurde die Toluolschicht wieder mit 80 ml frischem Wasser gemischt, während der pH-Wert mit Schwefelsäure auf 4 eingestellt wurde. Nach dem Trennen der Schichten wurde die Toluolschicht mit 0,1 g Aktivkohle Norit SX Ultra behandelt. Anschließend wurde die Toluollösung filtriert und durch Verdampfen weiter auf 15 ml konzentriert. Ein Abkühlen auf -10ºC führte zur Kristallisation. Die Kristalle wurden mit 5 ml kaltem Toluol gewaschen und unter Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet. In diesen Kristallen konnte kein 4- Acetyllovastatin nachgewiesen werden, weder durch TLC noch durch Protonen-NMR.
Im Gegensatz dazu enthielten Kristalle, die aus der Fermentationsbrühe über das oben beschriebene Verfahren, jedoch ohne Wärmebehandlung des Brühenfiltrats bei pH 12 erhalten worden sind, 4-Acetyllovastatin, wie durch TLC nachgewiesen wurde (siehe Fig. II). Auch die Protonen-NMR-Analyse zeigte die Anwesenheit von 1,1% 4-Acetyllovastatin in diesen Kristallen.
BEISPIEL III: VERGLEICH VERSCHIEDENER WÄRMEBEHANDLUNGSBEDINGUNGEN BEIM BRÜHENFILTRAT AUF DIE REINHEIT DER LOVASTATINKRISTALLE
Verschiedene Anteile von Brühenfiltrat wurden bei verschiedenen pH-Werten und Temperaturen und während verschiedener Dauer behandelt, wie in Tabelle 1 gezeigt wird. Für jeden Satz der Parameter wurden 1000 ml eines Brühenfiltrats des Stamms AD43 (Lovastatinsäurekonzentration 0,4 g/l) verwendet. Nach der Behandlung wurde das Filtrat unter Einsatz von Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4 eingestellt, und es wurden 1000 ml Toluol mit dem Filtrat während 30 Minuten gemischt. Die Schichten wurden dann getrennt, und die Toluolschicht wurde durch Verdampfen auf ein Volumen von 80 ml konzentriert sowie drei Stunden auf 90ºC gehalten. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Toluol mit 40 ml Wasser gemischt, während der pH-Wert mit NaOH auf 10 eingestellt wurde. Nach dem Trennen der Schichten wurde das Toluol mit weiteren 40 ml Wasser gemischt, während der pH-Wert mit Schwefelsäure auf 4 eingestellt wurde. Nach dem Trennen der Schichten wurden 0,1 g Aktivkohle Norit SX Ultra zu der Toluollösung gegeben. Die Toluollösung wurde filtriert, um die Aktivkohle abzutrennen, und nachfolgend durch Verdampfen auf 15 ml konzentriert. Ein Abkühlen auf -10ºC führte zur Kristallisation. Die Kristalle wurden abfiltriert, mit 5 ml kaltem Toluol gewaschen und dann bei Raumtemperatur unter Vakuum getrocknet. Die Kristalle wurden mittels TLC (Merck Sililcagel 60F, d = 0,25 mm, Art.-Nr. 5715; Mobile Phase Chloroform/Methanol im Verhältnis 30/l), Analyse durch UV bei 254 nm (die Empfindlichkeit beträgt 0,3% bei 0,1 mg durchlaufen- des Produkt) und durch Jodfärbung (Empfindlichkeit 0,1% bei 0,1 mg durchlaufendes Produkt) qualitativ analysiert. Die Ergebnisse dieser Behandlungen werden in der Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1. Wirkung verschiedener Wärmebehandlungsparameter auf die Reinheit der Lovastatinkristalle. Qualitative Analyse durch TLC mittels UV'-Nachweis (Empfindlichkeit 0,3 g für 0,1 mg durchlaufendes Produkt) und Jodfärbung (Empfindlichkeit 0,1% für 0,1 mg durchlaufendes Produkt).
* - nicht nachweisbar
0 schwacher Fleck
+ nachweisbar

BEISPIEL IV: UMSETZUNG DER REINEN VERBINDUNG 4-ACETYL- LOVASTATIN BEI DER WÄRMEBEHANDLUNG IN WÄSSRIGER LÖSUNG BEI EINEM HOHEN pH-WERT

(a) Herstellung von 4-Acetyllovastatin

Acetanhydrid (7 ml; 0,073 mol) wurde bei 0ºC unter Stickstoff in einem Schuß zu reinem Lovastatin (25 g; 0,062 mol) und 4- Dimethylaminopyridin (1,53 g; 0,013 mol; 20%) in trockenem Pyridin (120 ml) gegeben. Das Gemisch wurde sechs Stunden bei 0ºC gerührt. Durch TLC-Analyse (siehe Beispiel III zur Beschreibung der Methode) des Reaktiongsgemisches wurde gezeigt, daß das ganze Lovastatin verschwunden ist, vermutlich durch Umwandlung in 4-Acetyllovastatin.
Nachfolgend wurde das Pyridin durch Verdampfen abgetrennt, und Ethylacetat wurde zugegeben (240 ml). Die Lösung wurde mit 240 ml einer gesättigten Lösung von NaCl gewaschen. Die Lösungen wurden getrennt, und die organische Lösung wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Die organische Schicht wurde filtriert. Dann wurde das Ethylacetat verdampft. Man erhielt ein hellgelbes Öl. Dieses Öl wurde durch Protonen-NMR als Gemisch 1 : 1 aus 4-Acetyllovastatin und Dehydrolovastatin identifiziert.
Es zeigte sich, daß das 4-Acetyllovastatin bei der Lagerung unter Stickstoff instabil war und es erfolgte eine weitere Umwandlung des 4-Acetyllovastatins zu Dehydrolovastatin.

(b) Reinigung von 4-Acetyllovastatin durch Chromatographie

3 g eines Gemisches 1 : 2 aus 4-Acetyllovastatin und Dehydrolovastatin wurden in 2 ml Chloroform/Methanol (40/l) gelöst. Dann wurde die Lösung an 120 g Silicagel (Baker 533) absorbiert, das seinerseits unter Druck (0,3 bar) mit einem Gemisch Chloroform/Methanol (Verhältnis 40/l) entwickelt wurde. Es wurden vier Fraktionen gesammelt, von denen das Lösungsmittel durch Abdampfen entfernt wurde. Die dritte Fraktion enthielt 4-Acetyllovastatin mit einer Spur von Dehydrolovastatin (0,28 g). Die vierte Fraktion enthielt nur 4-Acetyllovastatin (0,3 g).

(c) Umsetzung von 4-Acetyllovastatin in einer wäßrigen Lösung bei einem hohen pH-Wert und bei erhöhter Temperatur

0,3 g 4-Acetyllovastatin (vierte Fraktion des Beispiels IV b) wurde in einem Gemisch aus 2 ml N,N-Dimethylformamid (DMF, Merck) und 98 ml demineralisiertem Wasser gelöst. Der pH-Wert wurde mit NaOH auf 12,5 eingestellt, und die Lösung wurde eine Stunde bei 60ºC gerührt.
Nachfolgend wurde das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abgekühlt, der pH-Wert wurde mit Schwefelsäure auf 4 eingestellt und 60 ml Toluol wurden mit der wäßrigen Lösung während 0,5 Stunden gemischt, um die Reaktionsprodukte zu extrahieren.
Nach dem Trennen der Schichten wurde die Toluollösung sechs Stunden auf 90ºC erhitzt. Das Toluol wurde dann durch Verdampfen abgetrennt und ergab eine kleine Menge eines Produkts. Dieses wurde durch Protonen-NMR als hauptsächlich Dehydrolovastatin identifiziert, das kein Lovastatin enthielt.

Claims

1. Verfahren zum Verbessern der Gewinnung von Lovastatin, Pravastatin oder Compactin aus einem Brühenfiltrat, mit den nachfolgenden Schritten

- Züchten von Mikroorganismen in einem Medium, die ein Glied aus der Gruppe Lovastatin, Compactin oder Pravastatin produzieren, wobei ein Produktmedium erhalten wird,

- Entfernen der Biomasse aus dem Produktmedium, um ein geklärtes Brühenfiltrat zu erhalten, und

- Isolieren des gereinigten Lovastatins, Compactins oder Pravastatins,

gekennzeichnet durch Einstellen des pH-Werts des geklärten Brühenfiltrats auf einen pH-Wert von über etwa pH 10.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der pH-Wert zwischen pH 10 und pH 13 liegt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin der pH-Wert zwischen pH 11 und pH 12,5 liegt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet durch Erhitzen des Brühenfiltrats über etwa 50ºC.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin die Temperatur zwischen 60 und 90ºC liegt.