CN1078583C - 酰化化合物脱酰用的选择性方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了从发酵液生产抑制素时使4-酰化的抑制素脱酰的简便的选择性方法，更确切地说，通过提高发酵液的pH值而减少该方法中的杂质。
Description
本发明提出对从发酵液中回收洛伐他汀、康派定(compactin)或普伐地汀的改进。
洛伐他汀是作为各类微生物如土曲霉(Aspergillus terreus)(US4231938)或红色红曲(Monascus ruber)(US4323648)的次生代谢物而产生的。在发酵过程中还生成与洛伐他汀有关的副产物如4-乙酰基洛伐他汀。
可用不同方法从发酵液中分离通常是酸的形式的洛伐他汀。第一步是通过纯化而得粗结晶物，这些粗结晶物中仍含有如4-乙酰基洛伐他汀的相关化合物。由于洛伐他汀属于必须符合高的纯度要求的药物化合物，所以有必要进一步纯化以除去洛伐他汀的相关杂质。该类与洛伐他汀相关的杂质一般是通过多次重结晶、通过如US专利4231938中所述的柱色谱法或制备HPLC法(WO92/16276)而得以除去的，其产率会显著降低。
采用本发明的方法可除去发酵液滤液中存在的杂质，这样就避免通过额外的重结晶来除杂质，因而导致产率的提高。
在将本发明的方法应用于由微生物如土曲霉生产抑制素的发酵液滤液时，令人惊奇的是4-乙酰基洛伐他汀被选择性地转化为洛伐他汀而不象纯的4-乙酰基洛伐他汀那样通过脱水作用而转变为脱氢洛伐他汀(参见图1)。另一个惊人的现象是在实施本发明时那个2-甲基丁酸酯基未被除去。
现有技术中既未述及亦未暗示本发明的方法。
附图简述
图1是4-乙酰基洛伐他汀酸的脱酰化而变成洛伐他汀酸(a)及4-乙酰基洛伐他汀酸的脱水而变成脱氢洛伐他汀酸(b)的反应图解。
图2显示应用本发明的方法后使粗的洛伐他汀结晶物中杂质降低的薄层色谱(TLC)。洗脱液：氯仿/甲醇＝9/1；检测：碘染色；一批产品：2μl的溶液，是粗的洛伐他汀结晶物的甲苯溶液，浓度为50g/l。
右边：得自未处理的发酵液滤液的粗结晶物；
左边：得自已在50℃及pH12.5下搅拌2小时后的发酵液滤液的粗结晶物。
本发明涉及改进从发酵液滤液中回收洛伐他汀、普伐他汀或康派定的方法，该方法包括：
-在培养液中生长微生物，该微生物能产生洛伐他汀、康派定或普伐他汀这类物质，得到一种产物培养液，
-从产物培养液中除去生物量而得到澄清的发酵液滤液，
-分别分离纯化了的洛伐他汀、康派定或普伐他汀，
其特点在于将澄清的发酵液滤液的pH值调节至高于约pH10。所述方法最好还包括将澄清的发酵液滤液加热到高于约50℃。
本发明的方法提出了在发酵液滤液中使4-酰化的抑制素脱酰的简便的、选择性方法，导致结晶物的产率及纯度的改善。在高pH值下的处理中，4-酰化的抑制素被转变成相应的抑制素。转化速率、例如在发酵液滤液中4-乙酰基洛伐他汀转化为洛伐他汀的转化速率依赖于pH值及反应温度。在本发明的一个优选的实施方案中，该处理过程是在pH值高于pH＝10、最好是在pH＝10及pH＝13之间、最优选是在pH＝11及pH＝12.5之间实施。而60℃-95℃之间的温度是优选的。采用更高的pH值及/或更高的温度，则完成脱酰的反应时间缩短了。
提高pH值的方法应用于可生产洛伐他汀、普伐他汀或康派定的任何微生物的发酵液滤液都会有益。可生产抑制素的微生物可以是下列菌种之一：
青霉属(Penicillium)、菌寄生属(Hypomyces)、拟青霉属(Paecilomyces)、正青霉属(Eupenicillium)、木霉菌属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、红曲霉(Monascus)、茎点霉属(Phoma)、Doratomyces、裸囊菌属(Gymnoascus)或北风菌(Pleurotus)。
由这些微生物发酵生产抑制素象生产其它发酵产品那样在水介质中实施。这种介质中含可被微生物同化的碳源、氮源及无机盐。
一般地，如糖类的碳水化合物例如葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、木糖、甘露醇等等以及如谷类的淀粉例如燕麦、黑麦、玉米淀粉、玉米粉等等可单独地或者结合地用作营养培养基中可同化的碳源。这些碳源可以单独用，也可将数种上述碳源结合用于培养基中。
通常地，许多蛋白质类原料可用作发酵工艺中的氮源。合适的氮源例如包括：酵母水解物、初生酵母、酵母膏、大豆粉、棉籽饼粉、酪蛋白的水解物、玉米浆、酒糟废液或蕃茄酱等等。这些氮源可单独用，也可结合用。
可掺入培养基的营养无机盐是能产生钠、钾、铵、钙、磷酸根、硫酸根、氯离子、碳酸根等离子的常用盐。还包括痕量金属如钴、锰、铁及镁。
应注意的是：实施例中所述的培养基仅仅是举例说明可运用的品种繁多的培养基，而不是限制性的。确切地说，应用于生产洛伐他汀的培养基中的碳源包括：右旋糖、糊精、葡萄糖、蔗糖、燕麦粉、燕麦片、废糖蜜、柠檬酸盐、醋酸盐、大豆油、甘油、麦芽浸出汁、鳕血肝油、淀粉、乙醇、无花果、抗坏血酸盐、及猪脂油。氮源包括：胨化乳、自溶酵母、酵母膏、酵母RNA、蕃茄酱、酪蛋白、初生酵母、花生饼粉、酒糟废液、玉米浆、大豆粉、玉米粉、NZ胺、牛肉浸膏、天门冬酰胺、棉籽饼粉、氨及硫酸铵。还可加入较多的离子组分：CaCO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O和NaCl，少量的CoCl2·6H2O以及痕量的Fe、Mn、Mo、B和Cu。营养物可以加入分批的培养基中，也可在发酵期间(部分地)投入。
本发明的方法可被直接运用于除去生物量之后、而进一步纯化之前的发酵液。例如，碱土金属氢氧化物或氢氧化铵的水溶液适合用于这样的反应。在高的pH值及最好是高温下处理发酵液滤液。而且，在高pH值下的处理时，发酵液滤液中存在的蛋白质都被变性，有利于在后续的反应步骤中将其从产物中除去。进一步的纯化步骤包括提取、吸附到疏水性树脂上、离子交换、柱色谱等等。
下述实施例将以举例的方式而不是以限制的方式阐述本发明。实施例II-IV是在氮气气氛中实施的。
实施例
实施例I：利用土曲霉菌株AD43的发酵生产洛伐他汀
土曲霉菌株AD43，the Centrael Bureau voor Schimmelcultures(CBS，Delft，The Netherlands)的保藏号为28373，并获得CBS编号CBS456.95。
在无菌条件下开启贮存于-80℃的甘油中的、装有土曲霉菌株AD43的孢子悬浮液的1ml小瓶，使其中的物质悬浮于含500ml下列培养基的2升摇瓶中(在121℃的高压灭菌器中加热20分钟)：
成分 每kg的用量
一水合葡萄糖 10g
燕麦片 10g
蕃茄酱 40g
玉米浸泡液的固形物 5g
痕量元素 1g
痕量元素溶液的组成(每100ml的蒸馏水中)：FeSO4·7H2O1g；MnSO4·1H2O 1g；CuCl2·2H2O 0.025g；CaCl2·2H2O0.1g；H3BO4 0.056g；(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.019g；ZnSO4·7H2O 0.2g。
将摇瓶置于转速为280rpm(摆幅为3.5cm)的旋转式摇床中于28℃下保温24小时。然后从摇瓶中取出20ml发酵液(用100ml生理盐水稀释)接种于装有10kg发酵液的发酵罐中，该发酵液的组成如下：
成分 每kg的含量
一水合葡萄糖 20g
酵母膏 33g
聚丙二醇2000 2.5ml
葡萄糖及酵母膏/聚丙二醇溶液已被分别灭菌(在121℃下灭菌20分钟)。
发酵条件如下：
用H2SO4和NaOH将pH值保持恒定于6.5，
温度为28℃
空气进入量为1vvm
一旦葡萄糖消耗完，就开始按每小时每kg发酵液中加入1.2g葡萄糖的进料比率投入葡萄糖/酵母膏的补料，补料的组成如下：
成分 每kg的含量
一水合葡萄糖 500g
酵母膏 17g
聚丙二醇2000 14ml
发酵192小时之后用NaOH将发酵液的pH提高到pH＝10，且用4升水稀释发酵液。
该发酵在稀释前的每升发酵液中产生385mg洛伐他汀酸。稀释后测得洛伐他汀酸含量为411mg/l。
实施例II：发酵液滤液的热处理对洛伐他汀结晶物纯度的影响
在25℃下用2N NaOH将1000ml菌株AD43的发酵液滤液(洛伐他汀酸浓度为0.4g/l，按实施例I的方法生产)的pH值调到12.5，接着将温度升至50℃达2小时。2小时后，结束反应，将反应混合液冷却至室温。然后用硫酸将其pH降至pH＝4，再加入3000ml甲苯，并搅拌30分钟。
将甲苯层与水层分开，然后在40℃及真空下蒸发将甲苯层浓缩至80ml。
将上述提取液加热至90℃达3小时使其中的洛伐他汀酸转化为内酯(转化率为99.2％)。冷却至室温后，将该甲苯溶液与80ml水混合，并用NaOH将其pH调至pH＝10。分层后，再用80ml新鲜水与甲苯层混合，且用硫酸将pH调至pH＝4。分层后，用O.1g活性炭Norit SX ultra处理甲苯层；接着将甲苯溶液过滤，并蒸发而进一步浓缩至15ml。冷却至-10℃使之产生结晶。用5ml冷甲苯洗涤结晶物，再在室温下真空干燥。用TLC及质子NMR均未从这些结晶物中检出4-乙酰基洛伐他汀。
反之，从按上述方法、但未于pH＝12下对发酵液滤液进行热处理制得的发酵液中获得的结晶物，用TLC的确测定出含4-乙酰基洛伐他汀(参见图2)。质子NMR分析表明：这些结晶物中存在1.1％的4-乙酰基洛伐他汀。
实施例III：比较发酵液滤液的不同热处理条件对洛伐他汀结晶物纯度的影响
如表1中所示，在不同的pH值、温度及不同的处理时间下处理各部分发酵液滤液。对于每组参数，各用到1000ml菌株AD43的发酵液滤液(洛伐他汀酸浓度为0.4g/l)。处理后，用硫酸将滤液的pH值调至pH＝4，并使滤液与1000ml甲苯混合，达30分钟。接着使之分层，然后将甲苯层蒸发浓缩至体积为80ml，并在90℃下保持3小时。冷却至室温后，将该甲苯溶液与40ml水混合，并用NaOH将其pH调至pH＝10。分层后，再用40ml水与甲苯层混合，并用硫酸将其pH调至pH＝4。分层后，往甲苯溶液中加入0.1g活性炭Norit SX Ultra。将该甲苯溶液过滤脱除活性炭，接着蒸发浓缩至15ml。冷却至-10℃使之产生结晶。过滤出结晶物并用5ml冷甲苯洗涤，然后在室温下真空干燥。用TCL对结晶物进行定量分析(Merck silicagel 60F，d＝0.25mm，art.nr.5715；流动相是比率为30/1的氯仿/甲醇)，用UV在254nm处测定(对0.1mg产品试样的检测灵敏度为0.3％)，并用碘染色法检测(对0.1mg的产品试样检测灵敏度为0.1％)。将这些处理的测定结果列于表1。
表1.不同的热处理参数对洛伐他汀结晶物纯度的影响。采用TLC进行定性分析并用UV检测(对0.1mg产品试样的检测灵敏度为0.3％)及碘染色法检测(对0.1mg产品试样的检测灵敏度为0.1％)
| pH 温度℃ 时间/分 | 结晶物中的4-乙酰基洛伐他汀 | |||
| UV* | 碘 | |||
| 10 | 21 | 30 | + | + |
| 10 | 60 | 30 | + | + |
| 10 | 90 | 10 | + | + |
| 11 | 90 | 10 | - | - |
| 11 | 90 | 5 | - | o |
| 12 | 21 | 90 | - | + |
| 12 | 60 | 30 | - | - |
| 12 | 60 | 10 | - | o |
| 12 | 90 | 10 | - | - |
| 12 | 90 | 5 | - | o |
实施例IV：在高pH的水溶液中热处理时纯化合物4-乙酰基洛伐他汀的反应
(a)4-乙酰基洛伐他汀的制备
在氮气保护下，将乙酸酐(7ml，0.073mol)一次性加入纯洛伐他汀(25g，0.062mol)及4-二甲氨基吡啶(1.53g，0.013mol，20％)的无水吡啶(120ml，0℃)溶液。将上述混合液在0℃下搅拌6小时。对反应混合物的TLC分析(参见实施例3中对该方法的说明)表明所有的洛伐他汀都已消失，可能变成了4-乙酰基洛伐他汀。
接着蒸发除去吡啶并加入乙酸乙酯(240ml)。用240ml NaCl饱和溶液洗涤上述溶液。分层，用无水硫酸镁干燥有机层，再将有机层过滤，然后蒸发掉乙酸乙酯，得浅黄色油状物。质子NMR检定该油状物是1/1混合的4-乙酰基洛伐他汀及脱氢洛伐他汀混合物。
在氮气中贮存的4-乙酰基洛伐他汀显得不稳定，并发生由4-乙酰基洛伐他汀到脱氢洛伐他汀的进一步转化。
(b)色谱法对4-乙酰基洛伐他汀的纯化
将3g 1/l混合的4-乙酰基洛伐他汀和脱氢洛伐他汀溶于2ml的氯仿/甲醇(40/1)。然后用120g硅胶(Baker533)将此溶液吸收，反过来在压力(0.3巴)下用氯仿/甲醇(比率为40/1)的混合液将其展开。收集4个级分，其中蒸发脱除了溶剂。第3个级分中含4-乙酰基洛伐他汀及痕量的脱氢洛伐他汀(0.28g)，而第4个级分中只含4-乙酰基洛伐他汀(0.3g)。
(c)4-乙酰基洛伐他汀在高pH及较高温度的水溶液中的反应
将0.3g 4-乙酰基洛伐他汀(实施例IVb中的第4个级分)溶于2ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF，Merck)及98ml软化水的混合液，用NaOH将其pH调至12.5，然后在60℃下搅拌此溶液1小时。
接着将该反应混合液冷却至室温，再用硫酸将其pH调至pH＝4，并用60ml甲苯与此水溶液混合达0.5小时以提取反应产物。
待分层后，将甲苯溶液在90℃下加热达6小时；然后蒸发除去甲苯，得少量产物。用质子NMR鉴定该产物主要是脱氢洛伐他汀，但其中一点也不合洛伐他汀。
1 Indicate the date of the original daposit or.where a new deposit or a transfer has been madethe most recent relevant data (date of the new deposit or date of the transfar).2In the cases referred to in Rule 10.2(a)(i1) and (ii)，refer to the most reccnt vlabilicy test.3Mark wltn a cross the applicable box.
4 Fill in if the information has been raguested and if the results of the test were negative.
1 Where Rule 6.4(d) applies.suth date is the date on which the status of internationaldepositary authority was acguired.
Claims (4)
1.改进从发酵液中回收洛伐他汀、普伐他汀或康派定的方法，它包括：
-在培养液中生长能产生洛伐他汀、康派定或普伐他汀的微生物，得到一种产物培养液，
-从产物培养液中除去生物量而得到澄清的发酵液滤液，
-分别分离纯化了的洛伐他汀、康派定或普伐他汀，
其特点在于将澄清的发酵液滤液的pH调节至高于约pH10，将其加热至高于约50℃。
2.按权利要求1的方法，其中的pH在pH＝10和pH＝13之间。
3.按权利要求2的方法，其中的pH在pH＝11和pH＝12.5之间。
4.按权利要求1的方法，其中的温度在60-95℃之间。
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