JPH07170990A - Ｌ−カルニチンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】Ｌ−カルニチンの発酵生産において、工業的に
有利な方法を開発する。 【構成】セファロスポリウム属またはアクレモニウム属
に属し、Ｌ−カルニチンを生産する能力を有する微生物
を培養し、培養物中にＬ−カルニチンを生成蓄積せし
め、これを採取する。 【効果】本発明の発酵法により、Ｌ−カルニチンを有利
に製造でき、また、応用微生物学の領域で通常用いられ
る、生産菌株の変異育種によって、より高い生産量を期
待することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、心臓疾患や脂肪血症の
治療剤として有用であり、また高カロリー輸液として使
用できることが知られているＬ−カルニチンの製造法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｌ−カルニチンは化学合成法などによっ
て製造されることが知られているが、このような化学合
成法によるとラセミ体が生成するためその分割のための
工程が必須となるので製造工程が煩雑となる。一方、エ
メリセラ属（特開昭６０−２１４８９０号公報），リゾ
ップス属（特開平２−１１９７８６号公報），モナスカ
ス属（特開平２−６９１８８号公報），サッカロミセス
属（特開平２−７９９６７号公報）などの微生物を用い
てＬ−カルニチンを醗酵生産する方法が知られている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかし、これらの方法
ではＬ−カルニチンの生産量が低く、工業的にＬ−カル
ニチンを生産することは容易ではなく、さらに有利な製
造法が望まれている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】このような状況下、本発
明者らは、醗酵法によりＬ−カルニチンを有利に製造す
る方法を得る目的で鋭意研究した結果、セファロスポリ
ウム属またはアクレモニウム属に属する微生物が上記の
微生物よりもはるかに多量のＬ−カルニチンを生産する
ことを見いだし、これに基づいてさらに研究した結果、
本発明を完成した。

【０００５】即ち本発明は、（１）セファロスポリウム
属またはアクレモニウム属に属し、Ｌ−カルニチンを生
産する能力を有する微生物を培養し、培養物中にＬ−カ
ルニチンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴
とするＬ−カルニチンの製造法および（２）微生物が、
セファロスポリウム・アクレモニウム（アクレモニウム
・クリソゲナム）である（１）の製造法に関する。

【０００６】本発明に用いる微生物としては、セファロ
スポリウム（Cephalosparium）属またはアクレモニウム
（Acremonium）属に属し、Ｌ−カルニチンを生産する能
力を有するものであればいずれでも用いることができ
る。その例としてはセファロスポリウム・アクレモニウ
ム（Cephalosporium acremonium）〔アクレモニウム・
クリソゲナム（Acremonium chrysogenum）〕などが挙げ
られ、さらに具体的には、セファロスポリウム・アクレ
モニウムＣ−１０（アクレモニウム・クリソゲナムＡＴ
ＣＣ ４８２７２），セファロスポリウム・アクレモニ
ウムＫ−１２１（アクレモニウム・クリソゲナムＡＴＣ
Ｃ ２０４２７）などが挙げられる。上記の微生物はア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Americ
an Type Culture Collection）から入手することができ
る。

【０００７】本発明の培養に用いられる培地は、用いら
れる微生物が利用し得る栄養源を含むものなら、液状で
も固状でもよいが、大量に処理するときには液体培地を
用いるのがより適当である。培地には同化し得る炭素
源、消化し得る窒素源，無機物質，微量栄養素が適宜配
合される。炭素源としては、たとえばブドウ糖，乳糖，
ショ糖，麦芽糖，デキストリン，でん粉，マニトール，
ソルビトール，グリセロール，油脂類（例、大豆油，オ
リーブ油，ヌカ油，ごま油，ラード油，チキン油な
ど），各種脂肪酸（例、ラウリン酸，ミリスチン酸，パ
ルミチン酸，ステアリン酸，オレイン酸など），窒素源
としては、たとえば肉エキス，酵母エキス，乾燥酵母，
大豆粉，脱脂大豆粉，コーン・スチープ・リカー，ペプ
トン，綿実粉，癈糖蜜，尿素，チオ尿素，アンモニウム
塩類（例、硫酸アンモニウム，塩化アンモニウム，硝酸
アンモニウム，酢酸アンモニウムなど）その他が用いら
れる。さらにナトリウム，カリウム，カルシウム，マグ
ネシウムなどを含む塩類，鉄，マンガン，亜鉛，コバル
ト，ニッケルなどの金属塩類，リン酸，ホウ酸などの塩
類や酢酸，プロピオン酸などの有機酸の塩類が適宜用い
られる。その他、アミノ酸（例、グルタミン酸，アスパ
ラギン酸，アラニン，リジン，バリン，メチオニン，プ
ロリン等），ペプチド（例、ジペプチド，トリペプチド
等），ビタミン類（例、Ｂ₁，Ｂ₂，ニコチン酸，Ｂ₁₂，
Ｃ等），核酸類（例、プリン，ピリミジンおよびその誘
導体）等を含有させてもよい。もちろん培地のpＨを調
節する目的で無機または有機の酸、アルカリ類等を加
え、あるいは消泡の目的で油脂類，表面活性剤等の適量
が添加される。培地のpＨは４〜１０であり、とくに６
〜９が好ましい。

【０００８】培養の手段としては静置培養，振とう培
養，通気撹拌培養のいずれでもよいが、大量の培養には
通気撹拌培養が望ましい。培養の温度は１５℃〜３７℃
であるが、とくに２２℃〜３０℃が望ましい。培養時間
としては培養条件によって異なるが３〜２４日であり、
とくに６〜１８日が望ましい。

【０００９】上記の方法で微生物を培養し、培養物中に
Ｌ−カルニチンを生成蓄積させる。次にこの培養物から
Ｌ−カルニチンを採取する。生成したＬ−カルニチンは
主として培養ろ液中に存在するので、培養物をろ過また
は遠心分離によってろ液と菌体とに分離し、そのろ液か
ら精製するのが有利である。しかし培養物から、直接に
精製することも可能である。

【００１０】Ｌ−カルニチンを採取するには微生物が生
産する代謝産物を採取するのに通常用いられている手段
を適宜利用することができる。たとえばろ過または遠心
分離によって菌体を除去したのち、そのろ液から一般に
有効物質を分離，精製する方法を用いる。

【００１１】すなわち適当な溶媒に対する溶解性および
溶解度の差、溶液からの析出法および析出速度の差、種
々の吸収親和力の差、イオン交換体によるイオン交換ク
ロマトグラフィーあるいは減圧濃縮，凍結乾燥，結晶
化，再結晶，乾燥などの手段が単独あるいは任意の順序
に組合わせて、または反復して利用される。

【００１２】本発明で生産されたＬ−カルニチンは例え
ばＮ−アシルエメリアミン（特開昭５８−９６０４９号
公報）およびキャンディダ・ウチリス（Candia utili
s）ＩＦＯ ０６１９を用いる微生物定量法（特開平１
−２２５５００号公報）などによって定量することが出
来る。

【００１３】

【作用】このようにして得られたＬ−カルニチンは、心
臓疾患の治療剤〔循環器科，１４巻５号３８６ページ及
び３９４ページ（１９８３年）；ジャーナル・オブ・ア
プライド・ビオケミストリー（Journal of Applied Bio
chemistry）３巻３２８ページ（１９８１年）参照〕，
脂肪血症の治療剤〔ドラッグ・アンダー・エクスペリメ
ンタル・アンド・クリニカル・リサーチ（Drug under e
xperimental andclinical research）９巻１２号９２５
ページ（１９８３年）参照〕として用いられ、また、高
カロリー輸液〔外科と代謝・栄養 １７巻１号８２ペー
ジ（１９８３年）；特開昭５４−１５４５１２号公報参
照〕として用いられることが知られている。

【００１４】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明する。 実施例１ セファロスポリウム・アクレモニウムＣ−１０を０.１
％硫安，３％コーン・スティープ・リカー，４％コーン
スターチ，０.８％脱脂大豆粉（ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅ
ａｌ），５％糖蜜，２．４％オレイン酸メチル，０.３
％炭酸カルシウム，pＨ７.０からなる１０mlの培地（１
００ml容三角フラスコ中）に接種し、２８℃で３日間振
とう培養した。得られた培養液の１.５mlを２％ショ
糖，１.２５％硫酸カルシウム，０.８％コーン・スティ
ープ・リカー，５％糖蜜，６％脱脂大豆粉，３％オレ
イン酸メチル，０.５％炭酸カルシウム，pＨ６.４から
なる１５mlの培地（２０ ０ml容三角フラスコ中）に移
し、２３.５℃で８，１２，１６日間振とう培養し た。
この培養液を遠心分離し、上清を得た。

【００１５】実施例２ 実施例１で得られた培養上清の中のＬ−カルニチンをＮ
−アシルエメリアミン（特開昭５８−９６０４９号公
報）およびキャンディダ・ウチリスＩＦＯ ０６１９を
用いる微生物定量法（特開平１−２２５５００号公報）
で定量した結果を〔表１〕に示す。

【表１】 上記の１６日培養の培養上清（１μl）をセルロースの
薄層クロマトグラフィー用スポットフィルム（東京化
成）にスポットし、ｎ−プロパノール−２８％アンモニ
ア水−水（７０：２：２８）の溶媒系で展開したのち、
キャンディダ・ウチリスＩＦＯ ０１６９およびＮ−ア
シルエメリアミンを含むＬ−カルニチン定量用寒天平板
でバイオオートグラフィー（特開平１−２２５５００号
公報）を行った。その結果は、図−１に示すように、上
記の培養上清（１μl：１）及びＬ−カルニチン標準品
（０.５μg：２）のＲf値はほぼ一致した。

【００１６】実施例３ 実施例１と同様にして得られた培養液３０００mlを濾過
助剤（ハイフロスーパーセル，ジョーンズ・マンビル・
プロダクト社製，米国）を用いて濾過し、除菌した培養
濾液２０００mlを得た。これをイオン交換樹脂アンバー
ライトＩＲＡ−４０２（ＯＨ型）（ローム・アンド・ハ
ース社製，米国）（１６００ml）、アンバーライトＩＲ
Ｃ−５０（Ｈ型）（ローム・アンド・ハース社製，米
国）（１６００ml）及びアンバーライトＩＲ−１２０
（Ｈ型）（ローム・アンド・ハース社製，米国）（１６
００ml）の３本のカラムに順に通液し、９６００mlの水
で全カラムを洗浄した。ＩＲ−１２０のカラムのみをさ
らに４８００mlの水で洗浄し、このカラムより４８００
mlの２Ｎアンモニア水で溶出を行ない、１６００mlから
４８００mlまでの溶出画分をあつめて６７０mlまで減圧
濃縮した。この濃縮液をアンバーライトＩＲＡ−４０２
（ＯＨ型，６４０ml）のカラムに再度通し、１９２０ml
の水でカラムを洗浄後、通過液と洗液を合せて８０mlま
で減圧濃縮した。この濃縮液を活性炭（ＬＨ₂Ｃ炭，武
田薬品工業社製）に通し、８０mlの水でカラムを洗浄
後、１６０mlの１０％メタノール水で溶出を行ない４０
mlから１５２mlまでの溶出画分をあつめて減圧濃縮し
た。得られた残留物を２mlの水に溶解して、イオン交換
樹脂ＰＡ−３０６Ｓ（ＯＨ型）（三菱化成工業株式会社
製）（８０ml）のカラムに通した後、水１００mlで溶出
を行ない、６０mlから８８mlまでの溶出画分をあつめて
減圧濃縮し、２６０mgの油状物を得た。これに１.６ml
の１Ｎ塩酸を加えて減圧濃縮し、残留物をエタノール−
アセトンから結晶化して２２０mgのＬ−カルニチン塩酸
塩を得た。得られた結晶の主な理化学データを以下に示
す。 比旋光度＝−２３.６゜（Ｄ線，ｃ＝０.５，水，２６
℃） 元素分析（Ｃ₇Ｈ₁₆ＮＯ₃Ｃl）として 計算値：Ｃ，42.54； Ｈ，8.16； Ｎ，7.09； Ｃl，
17.94 ％ 実測値：Ｃ，42.25； Ｈ，8.55； Ｎ，7.06； Ｃl，
17.72 ％ 質量分析 （Ｍ＋１）⁺＝１６２¹ Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨz，重水中） δ：２.６４，３.２２，３.４７，４.６７¹³ Ｃ−ＮＭＲ（３００ＭＨz，重水中） δ：４２.９，５７.１，６５.７，７２.５，１７７.０ 赤外吸収スペクトル ν_max（ＫＢr）cm^-1：3400, 2950, 1720, 1480, 1440,
1290, 1190, 1090, 980, 930, 880, 830, 610

【００１７】実施例４ セファロスポリウム・アクレモニウムＫ−１２１を実施
例１で記載した方法と同様の方法で培養し、その培養上
清中のＬ−カルニチンを実施例２で記載した方法と同様
の方法で定量したところ、培地中に２１μg／mlのＬ−
カルニチンが生産されていることがわかった。

【００１８】

【発明の効果】本発明は、従来、化学合成で製造されて
いたＬ−カルニチンを醗酵法で多量に製造する方法に関
するものである。本発明によると、通常の合成法によっ
て生じる光学異性体のＤ体の関与を問題にしなくても良
く、又光学活性のＬ体のみを合成するための技術的煩雑
さを避けることができる利点がある。また、Ｌ−カルニ
チンを培養液中より直接採取しうる利点がある。又、醗
酵法による製造においては、応用微生物学の領域で通常
用いられる生産菌株の変異育種によって、より高い生産
量を期待することもできる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例２で行なったバイオオートグラフィーに
おける各試料の生育円を模式的に示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】セファロスポリウム属またはアクレモニウ
   ム属に属し、Ｌ−カルニチンを生産する能力を有する微
   生物を培養し、培養物中にＬ−カルニチンを生成蓄積せ
   しめ、これを採取することを特徴とするＬ−カルニチン
   の製造法。
2. 【請求項２】微生物が、セファロスポリウム・アクレモ
   ニウム（アクレモニウム・クリソゲナム）である請求項
   （１）の製造法。